Laboratorní vyšetřovací metody Mikrobiologie, cytologie “Tento výukový materiál vznikl za přispění Evropské unie, státního rozpočtu ČR a Středočeského kraje“
Duben 2010
Mgr. Helena Kollátorová
MIKROBIOLOGIE je věda studující mikroorganismy.
MIKROBILOLOGICKÁ LABORATOŘ zajišťuje vyšetření: Bakteriologické, mykologické ( plísně ), virologické a sérologické vyšetření ( stanovení hladiny některých protilátek,které vznikají jako odpověď na působení mikrobů např. BWR, HbsAg, Anti HIV )
Lékařská mikrobiologie se zabývá převážně mikroby, které vyvolávají u člověka nějaké onemocnění (tzv. patogeny). Mikrobiologické vyšetření Při mikrobiologickém vyšetření hledáme patogenního činitele ze skupiny mikroorganismů - Viry, bakterie, houby, kvasinky, plísně, parazité / červi, roztoči … /
Bakterie mají buněčnou stěnu a metabolismus. Některé tvoří toxiny / jedy / a některé se uzavírají do ochranných obalů = spór. Mají různé tvary např.: Řetízky = streptokoky, angína, spála, růže Hrozny = stafylokoky – hnisavé procesy Tyčinky – střevní bakterie Spirály – syfilis, borelióza atd. Některé bakterie potřebují kyslík = aerobní a některé ne = anaerobní / tetanus, botulismus … /
Viry jsou nebuněčné organismy, obsahují nukleové kyseliny a bílkoviny. Nevznikají reprodukcí, ale jsou syntetizovány hostitelskou buňkou, jsou to nitrobuněční parazité. Po vniknutí do buňky změní její metabolismus a postupně ji zničí. Zabuduje svoji NK do napadené buňky. Virus se množí pouze v cizí buňce a umí žít také jenom v ní.
Základní bakteriologické vyšetření Bakteriologická diagnostika se opírá o vyšetření: Mikroskopické Kultivační Biochemické Pokus na zvířeti
Biologický materiál ve zdravotnictví = jakýkoli materiál obsahující genetickou informaci a schopný samoreprodukce nebo reprodukce v biologickém systému
Krev, moč, stolice, pot, sliny, slzy, ejakulát, vypadlé vlasy a chlupy, nosní sekret, poševní sekret, zvratky, menstruační krev, plodová voda, tkáně, orgány, vlasy, kosti, placenta TENTO MATERIÁL JE VŽDY INFEKČNÍ!!!
Technika odběru biologického materiálu: •Výtěry •Odběr moči
•Odběr stolice •Punktáty, exudáty, hnis •Sputum •Krev
Výtěry – sterilní tampon, štětička ve sterilní nádobě, obalu s nebo bez živné půdy. Odběr moči – technika středního proudu nebo cévkováním do sterilní nádoby. Odběr stolice – skleněnou lopatičkou ve sterilní zkumavce nebo štětičkou napuštěnou živnou půdou ve sterilním obalu.
Punktáty, exsudáty, hnis – odkapat do sterilní zkumavky nebo sterilní tampon a obal.
Sputum – sterilní nádobka nejlépe se širokým hrdlem, sterilní zkumavka nebo laryngeální výtěr. Krev na kultivaci – hemokultura – speciální nádobky, které dodá laboratoř.
Hemokultura Odebírají se do lahviček Bact/Alert.
Postup při odběru: lahvičky nechat vytemperovat na pokojovou teplotu a označit štítkem. Při jeho lepení je nutné se vyhnout strhávacímu čárovému kódu na lahvičce, slouží pro laboratorní účely, odstranit plastikové víčko a lahvičku dezinfikovat alkoholem, kůži pacienta odmastit alkoholem a následně dezinfikovat, dezinfekci nechat zaschnout. Odebrat 5 -10 ml krve, která se sterilně přenese do lahvičky propíchnutím gumové zátky.
Doporučený interval mezi jednotlivými odběry je asi 15 minut. Lepší je poslat více vzorků současně, ideální je 1 anaerobní lahvička - fialová a 2 aerobní-modré. Nejlépe je odebírat krev při vzestupu teploty, před zahájením antibiotické terapie, pokud je možno, tak z periferie z různých míst. Na žádance je dobré označit místo odběru (periferie, centrální žilní katetr). Hemokultury se uchovávají po nezbytnou dobu v termostatu při 37 °C, není-li to jinak možné, tak při pokojové teplotě. Do těchto lahviček lze odebírat i jiné tekuté materiály, ale z těchto vzorků nelze zhotovit mikroskopický preparát.
Virologické vyšetření
Virus je vázán na buňky hostitele a jeho pochycení je velmi obtížné. Biologický materiál je velmi choulostivý a tak je dopravován ve speciálních nádobkách a po konzultaci s laboratoří.
Virová diagnostika Materiál – stěr z nosu, rinofaryngeální sekret, stěr z hltanu, výplach z hltanu, průduškový sekret, tekutina z puchýřků, eroze, moč, stolice, likvor, tkáně, krev ….. Odběr a zásilka k izolaci viru – některé odběry musí být odebrány do VTR = virové transportní médium a nebo musí být použit speciální vyplachovací roztok, který dodá provádějící laboratoř. Techniku odběru a způsob transportru je vhodné vždy konzultovat s provádějící laboratoří!
Sérologické vyšetření
Prokazujeme protilátky vzniklé v organismu jako odpověď na působení mikroorganismů. Při sérologické diagnostice infekčních chorob ve vzorku krve odebraného pacientovi prokazujeme přítomnost specifických protilátek proti danému mikrobu. Z přítomnosti těchto protilátek, jejich množství a třídy protilátek usuzujeme na infekci organismu příslušným mikrobem a někdy je možné odhadnout i stadium infekce.
Většina mikroorganismů je po vniknutí do hostitele identifikována imunitním systémem. Tzv. antigen prezentující buňky (APC) mikroba fagocytují a jeho antigeny nabídnou dalším buňkám imunitního systému. Pro proces tvorby protilátek jsou důležité T pomocné lymfocyty (T-helpery, Th), které (zjednodušeně řečeno) stimulují B-lymfocyty. Jedna část B-lymfocytů se transformuje v plasmatické buňky, které jsou vlastními producenty protilátek, druhá část B-lymfocytů přetrvává ve formě tzv. paměťových Blymfocytů.
Produkované protilátky se dělí do pěti tříd, z nichž pro sérologickou diagnostiku mají největší význam třídy IgA, IgG a IgM. Kromě rozdílů v jejich chemické struktuře je pro diagnostiku podstatný rozdíl v síle jejich vazby na antigen. a/při prvním setkání organismu s mikrobem se protilátky tvoří po určité době latence. Z podrobnějšího rozboru procesu tvorby protilátek vyplývá, že zpočátku se budou tvořit protilátky s nižší afinitou k antigenu.
b) při dalším setkání organismu s mikrobem je nástup tvorby protilátek podstatně rychlejší (přítomnost paměťových Blymfocytů) c)Další možností je protilátková odpověď u mikrobů, které samy napadají buňky imunitního systému (cytomegalovirus, EB virus, virus hepatitidy C). d) pro diagnostiku vrozených infekcí je podstatné, že protilátky třídy IgG mohou procházet placentou a v oběhu novorozence lze prokázat i mateřské protilátky. Protilátky jiných tříd placentou procházet nemohou, a pokud je u novorozence prokážeme, jedná se vždy o jeho vlastní protilátky.
Metody sérologické diagnostiky Metod sérologické diagnostiky je celá řada: a) aglutinační reakce: Principem je aglutinace těl bakterií či antigenu navázaného na erytrocyty (hemaglutinace) nebo latexové částice (latexaglutinace). Aglutinaci způsobují protilátky tříd IgG a IgM.
b) komplement-fixační reakce (reakce konsumpce komplementu): Principem je vazba komplementu na komplexy antigenprotilátka. Je středně citlivá a nelze rozlišit jednotlivé třídy protilátek. Reakce prokazuje protilátky tříd IgM a některé podtřídy IgG (IgG1 a IgG3).
c) reakce se značenou protilátkou: Do této skupiny patří reakce typu ELISA (různé modifikace) a tzv. nepřímá imunofluorescence. Principem je vazba značené protilátky na protilátku ze séra pacienta již dříve navázanou na antigen. Metoda je v principu jednoduchá, je však dražší a vyžaduje odpovídající vybavení laboratoře včetně techniky pro vyhodnocování. Je vysoce citlivá a specifická, lze rozlišit jednotlivé třídy protilátek. d) reakce inhibiční: Principem je blokování některých biologických vlastností antigenu
Cytologie
CYTOLOGIE je věda zabývající se studiem buněk. CYTOLOGICKÁ LABORATOŘ zkoumá: anatomii buněk, jejich fyziologii, vlastnosti a chování ve vztahu k životním funkcím organismu jemuž náleží a především pak buněčný cyklus, dělení a smrt buňky. Cytologie je jen jedním z biologických podoborů a je úzce teoreticky i experimentálně provázána s histologií.
HISTOLOGICKÁ LABORATOŘ se zabývá zkoumáním mikroskopické struktury živočišných tkání (rostlinné tkáně – pletiva – jsou také zkoumány histologicky) a orgánů mnohobuněčných organismů.
Obory cytologie morfologická cytologie (zkoumá tvar a strukturu buněk) cytofyziologie (zabývá se mechanismy fungování buněk a jejich části) klinická cytologie (obor zabývající se cytologickými vyšetřeními pro potřeby lékařství), úzce souvisí s cytopatologií cytopatologie (zkoumá změny na buňkách způsobené onemocněním či vnějšími vlivy molekulární cytologie (v podstatě cytologická část molekulární biologie)
Onkomarkery (tumormarkery) pomáhají diagnostikovat rakovinu některých orgánů a tkání již v prvních stádiích. Nádorové markery mohou být molekuly produkované nádorem, nebo jsou to onkoplacentární antigeny, enzymy, hormony, metabolity, nebo faktory, doprovázející maligní proces.
Pokud je na rakovinu podezření, nechá vzít lékař pacientovi krev a dle výsledku (hodnot) těchto markerů může určit, zda se jedná skutečně o nádorové onemocnění (nebo i sekundární metastázy např. do jater nebo plic) a nebo je příčina potíží z jiného zdroje. Cíl laboratorního vyšetření: Diagnóza choroby, odhad stadia choroby, odhad průběhu choroby, monitorování kvality terapie choroby
Onkomarkery - obecné dělení 1) Markery jako hormonální receptory, metodicky jde o izolaci receptorů po biopticky získaném vzorku 2) Markery vázané na buněčných membránách (CEA, Ca-Ag) 3) Markery vznikající v cytosolu a secernující se do plasmy (AFP)
Ferritin Alfa-fetoprotein (AFP) Choriogonadotropin (hCG) Karcinoembryonální antigen (CEA) CA 15-3 CA 72-4 CA 125 CA 19-9 CYFRA 21-1 Neuronspecifická enoláza (NSE) Prostatický specifický antigen (PSA) PSA volný (freePSA) Tkáňový polypeptidový antigen - specifický (TPA-S) Tymidinkináza (TK) Beta-2-mikroglobulin
Fyziologicky zvýšené markery
Gravidita Menstruační cyklus Kouření Ethylismus Léčba železem Krevní transfuze Katetrizace moč. měch.
AFP, hCG, Ca125, TPS, TG Ca125 CEA, TPS, TG CEA, TPS ferritin ferritin PAP, PSA
Nezhoubné zvýšení markerů u jiných chorob Chron. onemocnění jater Hepatitida Chronická bronchopneumonie Ascites Pleurální výpotek Endometrióza Pankreatitida Onemocnění štítnice Hypertrofie prostaty Retence moči Cukrovka - diabetes mellitus
CEA, TPS, ferritin, Ca15-3, Ca19-9, Ca125 CEA, TPS, ferritin, Ca19-9 CEA, TPS Ca 125 Ca 125 Ca 125 Ca 19-9, Ca 125 TG PAP, PSA Ca 19-9 Ca 19-9
http://www.google.cz/imgres?imgurl=http://loschmidt.chemi.muni.cz/peg/publi city/internet/01/ zdravotni.blog.cz/0612/fyzikalni-a-chemicke-vlastnosti-krve http://www.vseprozdravi.cz/nemoci/zvyseny-cholesterol.html http://www.zbynekmlcoch.cz/info http://olm.nemstbk.cz/olm/soubsys/onkomark.htm http://kmil.trios.cz/kmil07012c.htm http://cs.wikipedia.org/wiki/Cytologie
