Laboratorní analytické metody Petr Tůma
Rozdělení analytických metod Metody separační • Chromatografie – kapalinová – plynová
• Elektroforéza Metody spektrální • absorpční spektrometrie v UV/VIS Metody elektrochemické Odměrná analýza - Titrace
Princip kapalinové chromatografie • objev – ruský botanik M.Cvět – 90.léta 19.stol. – skleněná kolona naplněná CaCO3 – izolace fotosyntetických barviv
• znovuobjevení – Martin a Synge 1941 (1952 Nobelova cena) • separace v kapalné fázi • mobilní fáze – acetonitril, methanol • stacionární fáze – částice – silikagel – oktadecylsilica • afinita – slabé vazebné interakce
Chromatogram • chromatografická vlna = pík • retenční čas – kvalitativní faktor – chemická struktura – porovnání se standardy
• výška a plocha píku – kvantita – množství látky ve vzorku
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie - HPLC
Planární chromatografie • rychlá identifikace čistoty látek • stacionární fáze nanesena v tenké vrstvě - tenkovrstvá chromatografie • papírová chromatografie • kvalita - retardační faktor R, 𝑹 =
𝒗𝒛𝒅á𝒍𝒆𝒏𝒐𝒔𝒕 𝒗𝒛𝒐𝒓𝒌𝒖 𝒐𝒅 𝒔𝒕𝒂𝒓𝒕𝒖 𝒗𝒛𝒅á𝒍𝒆𝒏𝒐𝒔𝒕 𝒓𝒐𝒛𝒑𝒐𝒖š𝒕ě𝒅𝒍𝒂 𝒐𝒅 𝒔𝒕𝒂𝒓𝒕𝒖
=
𝒃 𝒂
Vypočti hodnoty R pro azobenzen a dimethylžluť na tenké vrstvě. Po vyvinutí vrstvy byly naměřeny tyto vzdálenosti: 7,5 cm pro azobenzen, 4,2 cm pro dimethylžluť. Rozpouštědlo (toluen) vystoupal 10 cm.
Plynová chromatografie dávkovač
• mobilní fáze
detektor
– inertní plyny – He, N2, Ar
• kapilární kolony • analýza těkavých látek – lipidy
počítač kapilární kolona
zdroj nosného plynu
termostatovaný prostor
2 34 678
Analýza benzínu:
5
21
16
14 9
18
10
19 1517
1112 13
20
22
1
0
24 23 25
10
20
30
40
50
60
70 80 t [min]
Elektroforéza • založena na pohybu nabité částice v elektrickém poli • pohyb proteinů v trubicích tvaru U – Arne Tiselius – 1948 Nobelova cena
• rychlost pohybu částice v 𝒏á𝒃𝒐𝒋 čá𝒔𝒕𝒊𝒄𝒆
– 𝒗 ≈ 𝒗𝒆𝒍𝒊𝒌𝒐𝒔𝒕 čá𝒔𝒕𝒊𝒄𝒆 ∙ 𝒊𝒏𝒕𝒆𝒏𝒛𝒊𝒕𝒂 𝒆𝒍. 𝒑𝒐𝒍𝒆
• elektroforetická mobilita u
Kapilární zónová elektroforéza • tenké kapiláry naplněné roztokem pufru • vysoké separační napětí • vysoká rychlost analýzy • separace analytů do diskrétních zón oddělených separačním elektrolytem mobilita 10-9 m2.V-1.s-1 Cs+
80,1
K+
76,2
Ca2+
61,7
Mg2+
55
Spektrofotometrie – elektromagnetické vlnění rychlost c frekvence f vlnová délka λ=c/f energie E= h·f (h=6,6·10-34 J·s) RTG
NMR
Energetické hladiny v atomech a molekulách
Elektronové hladiny
• • • •
Absorpce vlnění látkou •
transmitance T - propustnost záření
•
𝑻=
•
absorbance A , A = -log T
𝒕𝒐𝒌 𝒛ář𝒆𝒏í 𝒗𝒚𝒔𝒕𝒖𝒑𝒖𝒋í𝒄í 𝒕𝒐𝒌 𝒛ář𝒆𝒏í 𝒗𝒔𝒕𝒖𝒑𝒖𝒋í𝒄í
=
Kyveta se vzorkem
𝑰 𝑰𝟎
Lambertův – Beerův zákon • 𝑨 = 𝒌𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒆 ∙ 𝒐𝒑𝒕𝒊𝒄𝒌á 𝒅𝒓á𝒉𝒂 ∙ 𝒆𝒙𝒕𝒊𝒏𝒌č𝒏í 𝒌𝒐𝒆𝒇. = 𝐜 ∙ 𝒍 ∙ 𝒌 • pro monochromatické záření
Schéma spektrofotometru Jaká je koncentrace ATP ve vzorku, který při vlnové délce 260 nm vykazuje v 1 cm kyvetě absorbanci 0,2. Molární absorpční koeficient ATP je 20·103 L mol-1 cm-1.
Elektrochemické metody • založeny na měření napětí nebo proudu v elektrochemickém článku • •
M. Faraday – zákony elektrolýzy J. Heyrovský – Nobelova cena 1959
elektrody • •
katoda: redukce anoda: oxidace
elektrodový potenciál E standardní elektrodový potenciál E0 Nernstova rovnice pro E •
𝑬 = 𝑬𝟎 +
𝑹∙𝑻 𝒏∙𝑭
∙ 𝒍𝒏(𝒌𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒆)
voltmetr
Rovnovážná potenciometrie • • •
indikační elektroda - měrná referentní elektroda – konstantní potenciál – argentchloridová, kalomelová referentní měříme napětí voltmetrem elektroda
indikační elektroda měřený roztok
Elektrochemický článek • Zn (s) + Cu2+ (aq) → Zn2+ (aq) + Cu (s) • anoda (oxidace): Zn (s) → Zn2+(aq) + 2e• katoda (redukce): Cu2+(aq) + 2e- → Cu (s)
Redoxní systém K / K+ Na / Na+ Zn / Zn2+ Pb / Pb2+ H / H+ Cu / Cu2+ Ag / Ag+ Cl- / Cl2 Mn2+ / MnO4F- / F2
E0, [V] -2,92 -2,71 -0,76 -0,13 0,00 0,34 0,81 1,36 1,52 2,85
Měření pH a membránový potenciál • membránový potenciál v buňce – rozdílná distribuce K+ 𝑈𝑚𝑒𝑚
𝑅∙𝑇 𝐾𝑖𝑛 59𝑚𝑉 155𝑚𝑀 = ∙ 𝑙𝑛 = ∙ 𝑙𝑜𝑔 𝑛∙𝐹 𝐾𝑒𝑥𝑡 +1 4𝑚𝑀 = 94𝑚𝑉
• měření pH pomocí skleněné elektrody – skleněná membrána popouštějící H3O+ ionty – vnější a vnitřní elektroda 𝑈𝑚𝑒𝑚
𝑅∙𝑇 𝐻3 𝑂𝑒𝑥𝑡 59𝑚𝑉 = ∙ 𝑙𝑛 =− ∙ 𝑝𝐻 𝑛∙𝐹 +1 𝐻3 𝑂𝑖𝑛𝑡
• podobně se měří koncentrace Na+, K+ a Ca2+ pomocí potenciometrie s iontověselektivními elektrodami
Odměrná analýza - Titrace Princip – k roztoku analytu se přidává byreta s odměrným roztokem činidla činidlo (odměrný roztok) o známé koncentraci, které s analytem reaguje. Činidla se přidá takové množství, které je při reakci právě ekvivalentní titrační křivka množství analytu. 𝑯𝑪𝒍 𝒂𝒏𝒂𝒍𝒚𝒕 + 𝑵𝒂𝑶𝑯 č𝒊𝒏𝒊𝒅𝒍𝒐 → 𝑵𝒂𝑪𝒍 + 𝑯𝟐 𝑶 Jaká je koncentrace HCl v žaludeční šťávě, když na titraci 10,0 mL vzorku bylo spotřebováno 6,5 mL 0,2 M NaOH? titrační baňka s analytem
