Laboratoř experimentální medicíny (LEM)

Laboratoř experimentální medicíny (LEM) Mgr. Jitka Berkovcová, Ph.D. Mgr. Marta Dziechciarková, Ph.D. MUDr. Petr Džubák MUDr. Josef Srovnal RNDr. Radek Trojanec, Ph.D. MUDr. David Vydra

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE


Muž ? Žena ?


Význam i v onkologii: RFC gen (Reduced Folate Carrier Gene)


Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) Metodou fluorescenční in situ hybridizace lze lokalizovat cílové nukleotidové sekvence přímo v buňkách (in situ). Metoda FISH je založena na schopnosti jednořetězcové DNA sondy vázat komplementární úsek cílové DNA fixované na mikroskopickém skle.


LABORATOŘ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY

CEP 17 Her-2/neu

Nepravá amplifikace

Jádro s normálním počtem kopií genu a chromozomu

Amplifikace



t(9;22)(q34;q11) Philadelphia (Ph) chromozom (Nowell, Hungerford,1962)

BCR-ABL CML, ALL, AML, ST STI-571 (Glivec)

t(15;17)(q22;q11-21) PML-RARA AML M3 (PML) ATRA

Comparative Genomic Hybridisation (Kallioniemi, 1992)




Mnohobarevná FISH

Microarrays – analyza tisice genu soucasne


Molekularni diagnostika v onkologii • Detekce molekularnich markeru – Geny, jejichz proteinove produkty se podileji na maligni transformaci bunky – Geny s prognostickym vyznamem – Geny s diagnostickym vyznamem

• Naroky na molekularne-biolgicke metody – Citlivost – Specifita – Rychlost

Některé další geny, účastnící se maligní transformace buňky, jejichž význam pro cílenou léčbu je nejasný či není zcela potvrzen • Protoonkogeny

rodiny MYC (c-myc, n-myc, l-myc aj.)

• Geny účastnící se regulace buněčného cyklu a n apotózy (geny pro CDK, CDK-I, cykliny) • Tumor-supresorové geny (TP53, RB1) • Protoonkogeny rodiny RAS • BCL-2 a příbuzné protoonkogeny • TOP2A, RARA a jiné

LABORATOŘ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY

Her-2/neu (c-erbB-2)

•Receptor EGF •Nejčastěji amplifikovaný onkogen u ca prsu (10-34%) •Protein p185HER-2 – souvisí s maligní transformací a agresivitou choroby •Pacientky s overexpresí proteinu a/nebo amplifikací genu indikovány k terapii monoklonální protilátkou trastuzumab (Herceptin) •Různé metody vyšetření

Vyšetření Her-2/neu (c-erbB-2): IHC x FISH IHC:0 FISH: normální Her-2/neu CEP 17

IHC: 1+ až 2+ FISH: normální nepravá amp. amplifikace

IHC: 3+ FISH: amplifikace

IHC fotografie byly získány ve spolupráci s Ústavem patologie LF UP


CEP 17 LSI Her-2/neu


Her-/neu (c-erbB-2): amplifikované případy: ¾

senzitivita na antracykliny

¾

aplikace Herceptinu

TOP2A: Topoizomeráza II α = cíl pro některé typy cytostatik: inhibitory topoizomeráz II tj. senzitivita na antracykliny RARA: Citlivost k léčbě retinoidy?

MTT test: (Mihál et al, Klin Onkol 2000;2:39-42)


PROCENTO PŘEŽÍVAJÍCÍCH BUNĚK V ZÁVISLOSTI NA KONCENTRACI CYTOSTATIKA

100 50 0

Podíl žívých buněk (v %)

%

C max

C min

Koncentrace cytostatika (v přísl. jednotce)


Exprese MDR proteinů u karcinomu plic.

MRP-1

p53

TopoIIα

Pgp


Mnohočetná léková rezistence (MDR)

• P- glykoprotein (Pgp, P170) • Multidrug resistance related protein (MRP 1-7)

• Breast cancer resistance protein (BCRP, MXR, ABCP)

• Lung resistance related protein (LRP, MVP)

transport přes cytoplazmatickou membránu ABC transportní proteiny nukleocytoplazmatický transport

• Glutathion (GSH) a glutathion-S-transferáza π (GST-π)

detoxifikační systém buňky

• DNA topoizomerázy

replikace DNA


Látky transportované proteiny MDR

Pgp Antracykliny, Vinca alkaloidy, deriváty Camptotecinu, epipodofylotoxiny, taxany, chromopeptidové antibiotika, HIV-1 proteázové inhibitory, flurofory kortikoidy (Dexametazon) MRP Organické anionty, glutathionové konjugáty, leukotrien LTC4, antagonisté leukotrienových receptorů LTsR, deriváty Pt, glukuronidy. BCRP Mitoxantron, topotecan, flavopyridol, prazosin a řada dalších hydrofobních a amfifilních látek. LRP Antracykliny, Vinka alkaloidy, VP-16, deriváty platiny.


VÝSKYT MNOHOČETNÉ LÉKOVÉ REZISTENCE U NĚKTERÝCH CYTOSTATIK

MDR častá

MDR vzácná

aktinomycin D doxorubicin daunorubicin vepesid mitoxantron taxol vinkristin

bleomycin cisplatina cyklofosfamid cytosin arabinosid 5-fluorouracil ifosfamid metotrexát topotekan


Používané inhibitory MDR Pgp Verapamil 6-10 μM, Nifedipin 35μM, CyA 0.8-2μM, PSC 833 0.1μM

MRP CyA 0.8-2μM Probenecid 2mM,

BCRP Fumitremorgin C 1μM

Metody používané k hodnocení exprese a funkce MDR. Exprese: Western blott, Imunoprecipitace Imunohistochemie Flow cytometrie Funkce: flow cytometrické stanovení akumulace, či efluxu fluorescenčních substrátů ( DNR, Rhodamin123) za použití specifických či nespecifických inhibitorů (CyA, PSC833). scintigrafie - in vivo hodnocení akumulace 99mTc-MIBI v nádorové tkáni cytotoxické testy - MTT


Exprese Pgp - přímá imunofluorescence (FACS)


Funkční aktivita Pgp Hodnocen eflux DNR(1μM) 1. Prekultivace v čistém médiu s a bez inhibitorů 1 hodinu. 2. Přidání DNR, kultivace 1 hod. 3. Odmytí a kultivace v čistém médiu s a bez inhibitorů 2hod. CyA(1μM), Probenecid(2mM).

Hodnocení BC pomocí průtokové cytometrie.

Vztah procenta S fáze k prognóze nádorů. Vyšší % S fáze znamená

Druh nádoru

prognózu

Horší

Kolorektální karcinom, karcinom močového měchýře, astrocytomy vyššího stupně, velkobuněčný nonHodgkinský lymfom, karcinomy děložního čípku, germinální nádory varlat, non-Hodgkinské lymfomy, myelodysplastický syndrom.

Lepší

nefroblastom

Hodnocení ploidity pomocí průtokové cytometrie. Hodnotíme změnu vůči „normální“ diploidní populaci. Pro hodnocení používáme DNA index (DI). Haploidní DI = 0,5 Hypoploidní DI < 1 Diploidní (Euploidní) DI = 1 Hyperploidní DI > 1 Tetraploidní DI = 2 (1,85 –2,1) Aneuploidní – DI jiný než 0,5, 1 a2 Multiploidní - více populací s různým DI.

Vztah DNA-ploidie k prognóze nádorů. Aneuploidie znamená prognózu

Druh nádoru

Horší

Karcinom močového měchýře, karcinom ledviny, karcinom žaludku, karcinom prsu, kolorektální karcinom, karcinom jícnu, maligní melanom, ovariální karcinomy, nazofaryngeální karcinom, karcinom žaludku, mnohočetný myelom, gliální nádory CNS, germinální nádory varlat i extragonadální, nemalobuněčný karcinom plic, adrenokoritíkální karcinom, endometriální karcinom, karcinom děložního čípku, karcinom prostaty, karcinom uretry, mycosis fungoides, sarkomy měkkých tkání u dospělých, papilární a medulární karcinom štítné žlázy, maligní ependymom, myelodysplastický syndrom, non-Hodgkinské lymfomy, condrosarkom, thymom, leiomyosarkom dělohy

Lepší

Neuroblastom, meduloblastom, akutní lymfoblastická leukemie pre – B typu dětského věku, karcinom dutiny ústní, hydatiformní mola.

Hmotnostní spektrometrie: Jak vypadá hmotnostní hmotnostní spektrometr? Analytický instrument, který přeměňuje složky vzorku na ionty v plynné fázi a měří jejich hmotnost. ● Vstup: vstup vzorků (tělní tekutiny, kondenzát, extrahovaná tkáň) do systému –a to jako pevná fáze, kapalina nebo plyn ● Zdroj: přeměna složek vzorku na ionty - bombardování fotony, elektrony, ionty, atomy... ● Analyzátor: separace iontů dle m/z - el. pole, mag. pole, čas na dráze. ● Detektor: detekce separovaných iontů – fotonásobič, supercitlivý magnet. ● Data processor: příjem a zpracování dat - obrovské množství dat. ● Vakuum: eliminace okolních atomů - výkonné vakuové pumpy.

U nás v laboratoři MALDI-TOF MS/MS

Co je to MALDI? ● Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - typ zdroje. ● Metoda umožňující odpaření a ionizaci (měkkou) netěkavých biologických vzorků z pevné fáze přímo do plynné. ● Vzorek je smíchán s tzv. matricí (~1000× molární přebytek) a ozářen pulsním laserem (UV nebo IR) - odpaření a ionizace. ● Vhodné pro peptidy, proteiny, DNA, polysacharidy i některé synth. polymery. ● 2002 - Nobelova cena.

Co je to TOF? Time-Of-Flight - typ analyzátoru. ● Ionty jsou ze zdroje urychleny vysokým napětím do letové trubice bez el. pole. ● Separace dle doby letu k detektoru - závislá na m/z. ● Ep = Ekin = U × z = ˝mv2 ... m/z ~ t2 ● Nutná kalibrace na známé hmotnosti.

K čemu to celé je? Hmotnostní spektrometr umí pouze měřit molekulové hmotnosti – na nás je, jak toho využijem. ● Stanovení MW ● Identifikace proteinů - "protein mass fingerprint". ● Identifikace posttranslačních modifikací. ● Identifikace "single nucleotide polymorfism". ● Ověřování sekvence peptidů. ● Ověřování čistoty vzorků.

Určení MW – MALDI

Luminex xMAP® technologie

http://www.luminexcorp.com





LUMINEX vs. ELISA Multiplexní kvantifikace až 100 různých analytů v jednom vzorku. Flexibilní – je možné jednoduše rozšířit stávající vyšetření o další analyty. Je požadován pouze malý objem vzorku. (25 μl) Je rychlejší. Jsou kratší inkubační časy, někdy není třeba použít promývání. Srovnatelná sensitivita. Může detekovat cytokiny až k ~1 pg/ml.

Screening: LUMINEX analyty Panel I

Panel II

Panel III

Cytokiny: IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p40, IL-13, IL-15, IL-17, IL18, TNFα, TNFR I, TNFR II, IFNγ , GM-CSF, G-CSF, Chemokiny: RANTES, MIP-1a, MIP-1b, MCP-1, Eotaxin, MIG Růstové a angiogení faktory: EGF, EGFR, VEGF, bFGF, HGF, VEGF, NGF Nádorové antigeny: CA 125, CA 15-3, CEA, AFP, CA 19-9 Apoptotické proteiny: sFas and sFasL Růstové faktory, onkogeny: EGFR, Her2/neu Proteázy: PSA free, kallikrein 8, MMP-2,3,7,9, TIMP-1, TIMP-2, Další markery: Cyfra 21-1, TPA, M-CSF, HMGB-1, S-100, LDH, CRP Cirkulující protilátky: Cytokiny: IL-6, IL-8; Růstové faktory, receptory: EGF, EGFR, VEGF, Her2/neu, PDGF, PDGFR; Nádorové antigeny: CA 125, 15-3, 19-9, 72-4, CEA,MUC-1, PSA; Diferenciační molekuly: AFP, bhCG; Apoptotické moleculy: survivin, Fas, FasL; transglutamináza; Onkogeny: c-myc, N-Ras, K-Ras, Akt1, p53; Molekuly zasahující do budněčného cyklu: cyklin B, cyklin D

Luminex xMAP® sérové koncentrace cytokinů u pacientů s časným stádiem karcinomu ovária a zdravých kontrol.

70

IL-8, pg/ml

9.1±2.51 (0-64.1) 100

*

10.6±1.67 (2.3-51.4)

50 40 30 20 10

Control

0

OvCA

Control

700

400 300 200

***

400 300 200 100

0

0

OvCA

49.2±11.90 (0-290.8) 17.9±7.86 (0-257.6)

*

200

100

0

Control

450

230.9±20.18 (23.4-560.0)

500

100

Control

0

OvCA

189.4±21.05 (45.0-620.1)

600

VEGF, pg/ml

MCP-1, pg/ml

210.3±20.30 (17.1-502.3)

500

300

Control

OvCA

OvCA

223.7±11.46 (29.0-402.6)

348.4±20.88 (135.5-695.7) 700 600

250

EGF, pg/ml

0

209.8±16.90 (52.3-500.0) 170.0±13.22 (20.0-400.0)

500

Control

OvCA

110.6±15.4 (0-396.9)

400 350 300 250 200 150 100 50 0

***

Control

OvCA

114.4±22.67 (0-592.0)

600 500

CA 125, IU/ml

IL-6, pg/ml

60 200

24.0±5.91 (2.0-180.6)

80

G-CSF, pg/ml

***

IL-12p40, pg/ml

64.2±12.57 (0-280)

300

400 300 200

9.7±2.31 (0-87.0)

100 0

Control

OvCA

***


LASEROVÁ MIKRODISEKCE (LCM) LCM je metoda která umožňuje isolaci buněk z komplexu tkáně.

Přístroj VERITAS pro LCM od firmy ARCTURUS.


PRINCIP LASEROVÉ MIKRODISEKCE

• inverzní mikroskop se zabudovaným nízko výkonnostním infračerveným laserem a UV laserem • nad dehydratovaný preparát je umístěno víčko s termoplastickou membránou • vyřezávání buněk pomocí laseru • vyřezané buňky jsou uchyceny na víčko


TECHNIKA LASEROVÉ MIKRODISEKCE

Cytologický preparát adenokarcinomu plic

Parafinový/kryořez nádorové tkáně

Cytospin, buněčná linie K562


LINEÁRNÍ AMPLIFIKACE DNA

PK-trávení

MseI štěpení

Annealing a ligace adaptérů

PCR - amplifikace


Výsledek CGH po LCM – idiogramy

K 562 – směsná populace

Cytogenetický nález: REV ISH ENH (3q29qter; 5p12-13.3; 5p15.2pter; 6p25.1pter; 12p11.1pter; 16p11.2-12; 18q21.3qter) REV ISH DIM (9q34.1qter; 12q21.1-21.3; 13q11.1qter; 16q12.1-13; 17p11.1-11.2; 18q11.2-12.1; 19p13.3pter)

K 562 - 1 buňka po LCM

Cytogenetický nález: REV ISH ENH (1p36.2pter; 3q26.3qter; 4p11.1pter; 4q35qter; 6p11.1-12.1; 9q13-21; 12p11pter; 15q11.2-24.1; 16p11.2.-12; 17p12.1pter; 17q22qter; 18q22qter) REV ISH DIM (5q11.2-15; 5q34.0-35.1; 7q11.2-21.1; 9p12-21; 9q21.3qter; 10q22.1-22.3; 10q26.1qter; 12q21.1-21.3; 13q11.1qter; 16q12.1.-22; 19p13.3pter)


VYUŽITÍ LCM A LINEÁRNÍ AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN PRO ÚČELY GENETICKÝCH A CYTOGENETICKÝCH ANALÝZ

• • • • •

Zvýšení detekčního limitu genetických, cytogenetických a expresních změn v nádorech a tkáních s minimálním zastoupením cílových buněk (< 50%) Genetická a cytogenetická diagnostika z minimálního množství biologického materiálu. Studium heterogenity nádorové populace na jednobuněčné úrovni Studium expresních profilů a genetických charakteristik v různých buněčných populacích (např. stromální versus nádorové buňky) Materiál po LCM je technicky použitelný pro studium pomocí prakticky všech PCR technik, mikroarray technologií, sekvenování DNA i pro proteomické studie založené na principu hmotnostní spektrometrie.

Metoda PCR denaturace a následný anealing primerů denaturace a následný anealing primerů

denaturace a následný anealing primerů

syntéza nové řetězce

dvoušřoubovice DNA

denaturace a následný anealing primerů




Rozdělení DNA a vizualizace na agarózovém gelu

1 2 3 4

5 6

7 8 9 X 1 2

3

4

5 6

7 8

9 10 11 12

Sekvenace DNA ATCCACGGCTG

ATCCACGGCTG

Množení DNA pomocí baktérií

Příklad praktického výstupu analýzy DNA - detekce bodových mutací v sekvenci

Příklad praktického výstupu analýzy DNA - delece části genu

produkt částečně deletovaného genu

produkt odpovídající nedeletovanému genu

Detekce minimální reziduální choroby • Detekujeme přítomnost izolovaných nádorových buněk v krvi, kostní dřeni a lymfatickém systému – možné prekurzory mikrometastáz • Metoda spadá na základě citlivosti do oblasti ultrastagingu; běžné zobrazovací metody sloužící v oblasti onkologie spadají do oblasti stagingu Detekce MRD (minimal residual disease) - detekce znaků epiteliálních buněk v kompartmentech mesenchymálního původu • • • •

Imunohistochemie – citlivost 1:10 000 Průtoková cytometrie – citlivost 1: 100 000 PCR – citlivost 1: 1 000 000 V naší laboratoři zavedená metoda Real time RT-PCR– citlivost až 1: 10 000 000 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction)

Princip detekce mimimální reziduální choroby metodou RT-PCR – studium genové exprese Epiteliální (nádorová) buňka

Mezenchymální (nenádorová) buňka

DNA hledaný mRNA znak mRNA cDNA DNA amplikon

Izolace RNA–možná jen ze živých buněk Reverzní transkripce s náhodnými (random) primery PCR reakce se specifickými primery

detekce amplikonu na gelu Real time RT-PCR, detekce fluorescenčně označeného amplikonu v reálném čase v průběhu PCR reakce, fluorescenční značení je buď nespecifické (DNA interkalátory) nebo specifické (sondy), díky standardům je detekce kvantitativní

Příklad real-time RT-PCR záznamu

Využití detekce minimální reziduální choroby v klinické onkologii

• • • • • •

Detekce MRD a rozhodnutí o adjuvantní léčbě Monitoring MRD v čase – relaps vs. remise Včasný záchyt recidivy Hodnocení léčebné odpovědi Diferenciální diagnostika Autologní transplantace při HD chemoterapii

Markery zavedené v naší laboratoři pro detekci minimální reziduální choroby 1. Mamaglobin 1 – MGB1 - patří do rodiny uteroglobinů - malých epiteliálních sekrečních proteinů; známe 6 lidských mamaglobinů - vysoce specifický pro prsní tkáň, v prsní nádorové tkáni až 10-ti násobná overexprese - není exprimován v buňkách mezenchymálního původu 2. Karcinoembryonální antigen - CEA - glykoprotein patřící do velké rodiny CEA, blízké imunoglobulinům - gen je zvýšeně exprimován u karcinomů trávicí trubice a fetálních tkání - nízká exprese i v leukocytech zdravých dárců 3. Glyceraldehydfosfátdehydrogenáza – GAPDH - kontrolní gen - kontrola kvality zpracovaných vzorků (degradace RNA, úspěšnost transkripce) Další možné dosud nezavedené markery-EGFR, cytokeratiny, EpCAM, mucin, tyrozináza

Detekce minimální reziduální choroby u pacientů s kolorektálním karcinomem – hledaný znak CEA • • • • • •

V den operace - detekce karcinoembryonálního antigenu (CEA) v nádorové tkáni, popř. v metastáze, v systémové a portální krvi před i po operaci. Následné odběry kostní dřeně a systémové krve v čase – 1 měsíc po operaci a u vytipovaných pacientů i v dalších časových intervalech Stanovená Cut-off hodnota na základě vyšetření 58 zdravých dárců 250 kopií CEA / µg RNA K září 2005 vyšetřeno cca 250 pacientů Pro dosažení větší specifity a senzitivity je nutné zavádění dalších znakůvytvoření multipanelu Příklady vyšetření MRD u pacientů s různým rozsahem onemocnění

Počet kopií CEA v jednotlivých vzorcích na množství 1µg RNA Pacient Tumor Meta PK před PK po SK před SK po SK II.od. KD MRD 69 98 280 320 ND 25 155 332 478 618 MRD 70 5 655 150 ND 55 5 355 260 20 360 MRD 72 9 220 ND 170 77 140 100 40 50 MRD 74 64 459 440 ND 82 60 ND 970 292 MRD 94 195 213 570 ND 205 0 125 5 430 MRD 97 206 063 270 ND 30 380 ND 520 280 MRD 106 108 918 050 ND 0 90 150 223 260 MRD 34 166 363 370 57 178 380 183 979 2 782 0 30 430

LU Staging KD II.od. pozit. v % TNM Dukes Stad. 0 pT1N0MX A 0 583 420 220 10 100 pT4N3MX D 4 165 0 pT3N0 B 2 260 150 ND 40 pT3N1M1 D 4 15 10 pT3N1 C1 3 265 5 17 pT2N1 C1 2 400 0 pT2N0MX A 1 340 1 022 100 pT3N1M1 D 4 410 ND

MRD u karcinomu prsu – sentinelová uzlina

•

Sentinelová „strážní“ uzlina – drénující nádor – přítomnost nádorového postižení sentinelové uzliny značí postižení axillárních uzlin ve více jak 95% • Vyšetření sentinelové uzliny – dvě skupiny pacientů – rozdílná léčba • Výhody real-time RT-PCR: 1. Vysoká senzitivita 2. Zpracování celého vzorku • Markery – mammaglobin MGB1 a karcinoembryonální antigen

Laboratoř experimentální medicíny (LEM)

Recommend Documents