ISSN 0853
- 7240
Bi%gi, Vol.4, No.6, Desember 2005
KULTIVASI CURAB Chryseobacterium indologenes ID 6016 PADA MEDIA YANG MENGANDUNG ASAM SULFANILAT DAN ANILIN V.I. Meitiniarti, V.J.l,z,E.S. Soetarto2, K.B. Timotius1, C. Juliana1, N. Vitian1,D.A. Subarkahl
INTISARI Meitiniarti,~I., E.S. Soetarto, K.H. Timotius, C. Juliana, N. Vivien,dan D.A. Subarkah. 2005. Kultivasi curah Chryseobacterium indologenes 106016 pada media yang mengandung asam sulfanilat dan anilin. Biologi 4 (6) : 373-384. Asam sulfanilat dan anilin merup?.kanproduk degradasi pewama azo. Chryseobacterium ind%genes ID 6016 diduga mampu mendegradasi amina aromatik ini karena bersamasarna dengan EnterococcusJaeca/isID6016dilaporkanmampumelakukandekolorisasibeberapa pewama azo. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan C. ind%genes ID6016 untuk menggunakan dan tumbuh pada media yang mengandung asam sulfanilat atau anilin. Penelitian dilakukan dalam dua tahap, yaitu (i) C. ind%genes ID60 16 ditumbuhkanpada media dasar yang mengandung asam sulfanilat atau anilin untuk menentukan kemampuan tumbuhnya, dan (ii) C. ind%genes ID60 16ditumbuhkan pada media minimal (sumber C selain amina aromatik dibatasi) yang mengandung asam sulfanilat atau anilin untuk menentukan kecepatanpertumbuhanspesiftkdankemampuannyamenggunakanamina aromatik.Pertumbuhan diamati berdasarkan pertambahan kekeruhan kultur menggunakan spektrofotometer, sedangkan konsentrasi arninaaromatikdianalisis dengan KromatograftCair Kinerja Tinggi (KCKT). Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa C. ind%genes ID6016 dapat tumbuh pada media yang mengandung asam sulfanilat atau anilin hampir sarna baiknya dengan pada media tanpa amina aromatik. Demikian juga dengan pertumbuhan pada media minimal, walaupun pertumbuhan pada media tanpa amina aromatik lebih baik. Hasil analisis KCKT menunjukkan bahwa selama pertumbuhan terjadi degradasi asam sulfanilat dan anilin sehingga di akhir pertumbuhan tidak terdeteksi adanya amina aromatik lagi. Kata kunci: pertumbuhan, Chryseobacterium ind%genes ID60 16,asam sulfanilat, anilin
ABSTRACT Meitiniarti, V.L,B.S. Soetarto, K.H. Timotius, C.Juliana, N. Vivien,and D.A. Subarkah. 2005. Bacth culture ofChrvseobacterium indoloeenes ID6016 in the sulfanilic acid and aniline containing media. Biologi 4 (6) : 359-384.
I Fak. Biologi, Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga Fak. Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
2
373
Meitiniarti, V.L, et al. - Kultivasi curah Chrvseobacterium
indoloflenes ID60160
Sulfanilic acid and aniline are intermediate products of azo dyes degradation. Chrvseobacterium indoloflenes ID 6016 was supposed to have aromatic amine degradability since in mixed culture with Enterococcus faeca/is ID60 16 it could decolorize various azo dyes. The aim of this research was to determine capacity of e. indoloflenes ID60 16 to use and grow in the sulfanilic acid and aniline containing media. This research was done in two stages, i.e. (i) e. indoloflenes ID6016 was grown in the basal media contained sulfanilic acid or aniline to determine its growth ability, and (ii) e. indoloflenes ID6016 was grown in the minimal media (limitation C sources except aromatic amine) contained sulfanilic acid or aniline to determine its specific growth rate and ability to use aromatic amine. The bacterial growth was observed by its increasing of culture density, and aromatic amine concentration was analyzed by HPLe. Conclusion of this research is that e. indoloflenes ID6016 could grow in the basal media contained or without sulfanilic acid or aniline. C. indologenes ID6016 could grow in the minimal media contained sulfanilic acid or aniline, but its specific growth rate was slower than in the control media. HPLC analysis for aromatic amine indicated that e. indoloflenes ID60 16 could degrade both aromatic amine, due sulfanilic acid and aniline was negligible (not detected) in the supernatant culture ofe. indoloflenes ID6016 in the end of culture. Keywords: growth, Chrvseobacterium
indoloflenes ID60 16, sulfanilic acid, aniline.
PENDAHULUAN Senyawaamina aromatikmerupakan bahankimiaxenobioticyangsering dijumpai dalam limbah cair industriindustri yang melakukan proses pewarnaan. Senyawa ini dihasilkan sebagai produk pemutusan ikatan azo dalam pengolahan limbah yang mengandungpewamaazo(pewamaazo banyakdipakaidalamprosespencelupan danpengecapandiindustritekstil)(RazoFlores et al., 1997 dalam Wallace, 2001; Pinheiroet aI., 2004).Walaupun tidakberwama,senyawainibelumlayak dilepas ke lingkungan karena bersifat toksik, karsinogenik dan mutagenik (Groveret al., 1996dalamTan& Field, 2000). Oleh karena itu, penelitian 374
mengenai mikroorganismeyang dapat menggunakansenyawaaminaaromatik, diperlukanuntukmemberikankontribusi pengetahuandalampengolahanlimbah yangmengandungpewamaazo. Menurut Perei et al. (2001), senyawa amina aromatik merupakan strukturyangjarangterdapatdi alamatau merupakanbahan asing (xenobiotic)di alam,sehinggaumumnyasulitmengalami prosesbiodegradasidanbersifattoksik. Dalam peruraiannya senyawa ini akan mengalami proses pemutusan gugus amina (deaminasi)dan cincin aromatik (Pinheiro et al., 2004; Tan & Field, 2000). Degradasi senyawa amina aromatikdapatdilakukansecarafisikawi, kimiawi(Caseroet al., 1997;LechKos,
-
ISSN 0853 7240
Biologi, Vol. 4, No.6, Desember 2005
2002) maupun biologis. Namun asam sulfanilat, dapat diuraikan oleh degradasi secara fisikawi dan kimiawi Sphingomonas sp. strain 1CX dan memerlukanbiaya lebihbanyak dalam SAD4i. Perei et al. (2001) melaporkan aplikasinya (Aplin & Waite,2000,), di bahwa kultur tunggal Pseudomonas sampingitusenyawa-senyawakimia yang paucimobilisdapattumbuhdalamsubstrat digunakanpundapatberpengaruhnegatif yang mengandung asam sulfanilat dan terhadap lingkungan. Oleh karena itu, menggunakannyasebagaisumberkarbon degradasi senyawa amina aromatik
375
Meitiniarti. v.I.. et al. - Kultivasi curah Chrvseobacterium
r I.
---i
indoloeenes ID60 160
.,. .. ~,~
Gambar 1.Sel C. indologenesID6016dalam pengecatan negatif dalamlumpuraktif,dan daripenelitianpenelitansebelumnya,didugabakteriini dapat tumbuh dan melakukan proses biodegradasi dalam medium yang mengandungsenyawaasamsulfanilatdan anilin.Olehkarenaitu,daripenelitianini diharapkandapatdiketahuikemampuan C. indologenes ID60 16 untuk menggunakandan tumbuh pada media yang mengandungasam sulfanilatatau anilin
nrinirnal,komposisisarnadenganmedium dasar kecuali untuk ekstrak khamir digunakan0,125gIl. Kultur tunggal C. indologenes ID60 16 diperoleh dari Laboratorium MikrobiologiFakultasBiologiUniversitas Kristen Saty~WacanaSalatiga. Asamsulfanilat(112739)dananilin (133310) diperoleh dari Aldrich dan digunakan sebanyak 63 mg/l (untuk mediaminimal,digunakan100mgll)dan 100mgll,berturut-turut.
BAHAN DAN CARA KERJA Medium Pertumbuhan, Kultur Bakteri dan Senyawa Amina Aromatikyang Digunakan Komposisi medium dasar yang digunakan adalah sebagai berTh.'Ut(gIl):
MgS04.7H20 0,25; (NH4)2S041,98; KHl04 2,13; ~HP04 5,55; ekstrak khamir 0,250 (dimodifikasi dari Setiabudi,1997).Sedanguntukmedium
376
Kondisi Pertumbuhan Pertumbuhan bakteri dilakukan pada kondisi curah (batch) dengan menggunakanbotolpertmnbuhan500mI. Prekultur dibuat dengan menginokulasikanbiakmiringC.indologenes ID6016 usia 48 jam ke dalam media sesuai perlakuan dan diinkubasi pada penggojok dengan kecepatan 150rpm, suhu kamar (28-30°C) selama 24jam.
ISSN 0853
- 7240
Biologi, Vol.4, No.6, Desember 2005
Selanjutnya,prekulturdieampurkanke pada 275 nm. Eluen yang digunakan dalam 200 ml medium tanpa amina adalahcampuranmetanol:Hl04:akuades (50:0,3:49,7) dan dialirkan dengan aromatik sebagai kontrol dan pada mediumyangmengandungasamsulfanilat kecepatan0,5 ml/menit.Volumeinjeksi atau anilin sampai kerapatan optis sel adalah IOIll. (A,6OOnm) pada awal pertumbuhan
sekitar
0,03-0,04 dan diinkubasi pada suhu kamar dalam penggojok dengan kecepatan 150rpm. Pengambilan sampel dilakukan setiap 1 jam selama fase logaritma, kemudian dilanjutkan setiap 2 jam sampai kerapatan optis (A,6OOnm) sel konstan.
Analisis Sampel Sampel yang diperoleh pada tiap waktupengambilandiukurberat kering selnya seeara tidak langsung dengan metode turbidimetri menggunakan spektrofotometer(ShimadzuUV-1201) padapanjanggelombang600nm. Kandungan amina aromatik dianalisis pada awal dan akhir pertumbuhan.Sampeldiekstrakdenganetil asetatdalamvolumeyangsarnasetelah diasamkan hingga pH 2-3 dengan 6 N HCl. Ekstrak dikeringkan dengan Na2S04dan dipekatkan dalam rotary evaporator,kemudiandilarutkandalam sedikit metanol (Supaka et ai., 2004). Amina aromatik dianalisis dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (Shimadzu IC lOa) kolom Liehospher @ 100 RP C18, diameter 0,5em,panjang10em,dandetektorUV
HASIL DAN PEMBAHASAN Chryseobacterium indoiogenes ID6016ternyatamamputumbuh dalam mediayangmengandungsenyawaasam sulfanilat dan anilin, baik pada media dasar maupun pada media minimal (Gambar2.). Asam sulfanilatdan anilin dengan konsentrasi yang diberikan (63 dan 100mgll)tampaktidakberpengaruh terhadap pertumbuhan C. indoiogenes, terbuktidaripertumbuhannyayangtidak berbedajauh d~gan kontrol.Padamedia dasardenganasam sulfanilat,keeepatan pertumbuhannyabahkanlebihtinggidibandingkontrol (Tabell.). Keberadaan aminaaromatikyangtidakberpengaruh terhadap pertumbuhan kemungkinan disebabkan konsentrasiyang diberikan masihdibawahambangbataskonsentrasi yang dapat ditoleransi oleh bakteri. Pseudomonas paucimobilis dapat mendegradasi asam sulfanilat hingga konsentrasi 100 mM, walaupun keeepatan degradasi tertinggi dieapai pada konsentrasi 5 mM (Perei et ai., 2001). Jika dibandingkan keeepatan pertumbuhanpadamediadasardanminimal tampakbahwa keberadaan ekstrak
, J.
377
Meitiniarti, V.L, et al. - Kultivasi curah Chrvseobacterium
indologenes ID60160
a) 80
-
::::: C)
60
E
G)
UI C) C
40
"t:
G)
-cu...
.¥
20
G)
m T 0
3
9 6 WaktuInkubasi (jam)
12
b)
E
105 11 '
i
!-
I
7°1
cu 35 ... I)
m -----,
I
0
3
6
9
12
WaktuInkubasi (jam)
Gambar2. PertumbuhanC.indologenespadamediadasar(a)danmediaminimal
.
(b) tanpa amina aromatik ( ), dengan asam sulfanilat (0 ), dan dengan anilin (l::,.).
378
ISSN 0853
- 7240
Biologi. Vol.4. No.6. Desember 2005
Tabell. Perbandingan kecepatan pertumbuhan spesifik ().l)C. indologenespada berbagaimediaperlakuan. No
Perlakuan Me
2
p. (jam -I)
Tanpa anrina aromatik
(ekstrak khamir 250 mb Media minimal
Dengan asam sulfanilat Dengan anilin
(ekstrak khamir 125 m
Dengan as am sulfanilat Dem!an anilin
Tanpa anrina aromatik
khamir tampaknya berpengaruh meningkatkankecepatanpertumbuhan (Tabel 1.). Kecepatan pertumbuhan C. indologenes pada medium dasar (tanpadandenganaminaaromatik)lebih besar 2-2,5 kali dibanding kecepatan pertumbuhan pada media minimal (kandunganekstrakkhamimyasetengah daripada media dasar). Hal ini terbukti juga dari perbandingan produksi biornassapadamediadasardanminimal (Gambar3.).Dengankata lain,daridata di atas tampak bahwa C. indologenes masih menggunakan ekstrak khamir untukpertumbuhannyadan keberadaan aminaaromatikdengankonsentrasiyang diberikan tidak menghambat pertumbuhanC. indologenes. Jika dilihat nilai kecepatan pertumbuhan spesifik C. indologenes padamedia(dasarmaupunminimal)yang mengandung amina aromatik, tampak bahwa kecepatan pertumbuhan C. indologenes lebih tinggi dibanding
0,43 :!:0,045 0,45 :!:0,035 0,41 :!:0,035 0,19:1::0,055 0,17:1::0,026 0,16:1::0,069
kecepatanpertumbuhanbakterilainpada mediayangmengandwlgaminaaromatik. KecepatanpertumbuhanPseudomonas acidovorans dan kultur campur Hydrogenophaga palleronii S1 dan Agrobacterium radiobacter S2 pada mediayangmengandungasamsulfanilat berturut-turut adalah 0,06 dan 0,096 jam-I
(Locher et al., 1989;Dangmann et aI., 1996).Dengankecepatanpertumbuhan dankemampuanproduksibiomassayang cukup besar walaupun pada media minimal, sangat menjanjikan jika C. indologenes dapat menggunakan amina aromatik yang ada pada media. Dalam beberapa penelitian dilaporkan bakteri Sphingomonas sp., Pseudomonas sp.,Pseudomonaspaucimobilis dan C.indologenesdapatmenggunakan asam sulfanilatdan anilin sebagaisatusatunyasumberkarbon (Coughlinet aI., 2002; Murakami et al., 1998; Perei et al., 2001; Radianingtyaset al., 2003). Asam sulfanilat dan anilin dapat
379
Meitiniarti, V.L, et al. - Kultivasi curah Chrvseobacterium
_
50
§.
40
c::: CI
indolof!enes ID60160
lIS I/) XI
E o
30
:s 20 'iij ~
.g 10 o... Q.
0 SA Perlakuan
Gambar
ANILIN
~
Media Dasar
§
Media Minimal
3. Perbandinganproduksibiomassapada media dasardan minimaltanpa dan dengan amina aromatik
dideteksi dengan KCKT dengan earn membandingkan kromatogram media denganaminaaromatikdantanpaamina aromatik. Asam sulfanilat dan anilin terdeteksipadawakturetensi4,0 dan4,2 menit (Gambar 4. dan 5.). Dengan membandingkanketinggianpuncakpada wakturetensiyangsesuaiantaraekstrak mediapadaawaldanakhirpertumbuhan tampak bahwa terjadi pengurangan ketinggian puneak (mengindikasikan konsentrasi) amina aromatik dan komponen media di akhir fase pertumbuhan(Gambar4. dan 5.). Puneak asam sulfanilat dan anilin tidak dijumpai pada akhir fase pertumbuhan yang mengindikasikan bahwa C. ind%genes ID6016mampu mendegmdasiaminaaromatikyangada pada media. Belum jelas diketahui 380
apakah amina aromatik terse but digunakan sebagai sumber C, N, atau energiatauhanyadioksidasisaja.Masih diperlukan penelitian lanjut tentang pertumbuhan C. indologenes ID60 16 pada media yang mengandung amina aromatiksebagaisatu-satunyasumberC atau N untuk menjawab pertanyaan tersebut. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan C. indologenes ID 6016 dapat tumbuhdalammediumyangmengandung asamsulfanilatatauanilin.Pertumbuhan pada media yang mengandung amina aromatik tidak berbeda dengan pada media tanpa amina aromatik. Selama pertumbuhan ter:iadi degradasi asam sulfanilatdananilinsehinggadiakhir
-
ISSN0853 7240
Biologi, Vol.4, No.6, Desember 2005
90
Asaro suIfanilat
90 40
90 .. .c c(
.§. OJ 40 c: 01 .c
2
0..
2
.c c(
I 0
4
Waktu retensi
, 2
4
Waktu retensi
6
6
4
Waktu retensi
6
(men it)
c
(menit)
b
(menit)
a Gambar4. Kromatogram media dengan asam sulfanilat di awal (a) dan akhir pertumbuhan(b),sertamediatanpa aminaaromatik(c) 90
250 1 200
Anilin
250
40
150 100
.. .c
~ 150 OJ c: 01 -e o .. .c c(
b
50 2
50
o
t
0
2
4
6
6
Waktu retensi (menit) 4
2
Waktu re1ensi (menit)
o
4
6
c
b
Waktu re1ensi (menit)
a Gambar5. Kromatogrammedia dengananilin di awal (a) dan akhirpertumbuhan (b), serta mediatanpaamina aromatik(c)
381
-
ISSN 0853 7240
oleh Isolat SWCU 96-103 pada Kondisi Anaerob. Seri Penelitian Fak. Biologi 4 (1): 8-15. Meitiniarti, V. I., dan K. H. Timotius. 2003. Kemampuan Dekolorisasi Beberapa Pewama Oleh Kultur Bakteri SWCU 96-103 dan Identifikasi Penyusunnya. Simposium Nasional Hasi/-hasi/ Penelitian.Unika Soegijapranata, Semarang. Mendez-Paz, D. F. Omil, and J. M. Lema.2005.AnaerobicTreatment of Azo Dye Acid Orange 7 Under Batch Conditions. Enzyme and Microbial Technology 36 : 264272. Murakami, S., Y. Nakanishi, N. Kodama, S. Takenaka,R. Shinke, and K. Aoki. 1998. Purification, Charasterization, andGeneAnalysis ofCatechoI2,3-Dioxygenasefrom theAniline-Assimilating Bacterium Pseudomonas Species Aw-2. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 62(4):747-752. Oei, I., dan V.I. Meitiniarti. 1999. Pengaruh Penambahan Glukosa dan Pengocokan Media terhadap Pertumbuhan Brevibacterium sp. SWCU-96-103dan Kemampuannya dalam Menurunkan Wama Amaranth. Seri Penelitian Fak. Biologi 2 (2):115-122. Pinheiro, H. M., E. Touraud, and O. Thomas. 2004. AromaticAmines
Bi%gi. Vol.4. No.6, Desember 2005
from Azo Dye Reduction: Status ReviewwithEmphasisonDirectUV Spectrophotometric Detection in TextileIndustryWastewater.Dyes and Pigment 61: 121-139. Perei,K, G Rakhely,I. Kiss, B. Polyak, and K.L. Kovacs. 2001. Biodegradation of Sulfanilic acid by Pseudomonas paucimobilis. Applied Microbiology and Biotechnology 55: 101-107. Radianingtyas,H; Gary K. R, and Alan T.Bull.2003.Characterizationof a Soil-derivedBacterialConsortium Degrading4-Chloroaniline.Microbiology 149:3279-3287. Setiabudi, A. B. 1997. Isolasi Bakteri yang Mampu Menurunkan KekeruhanAmaranthdanKromium dalamKonsentrasiTinggipadaSuhu antara 34-45°C. Skripsi.Fakultas Biologi. UniversitasKristen Satya Wacana.Salatiga. Supaka, N., K. Juntongjin, S. Damronglerd, M. L. Delia, and P. Strehaiano. 2004. Microbial Decolorization of Reactive Azo Dyes in a Sequential AnaerobicAerobic System. Chemical Engineering Journal 99(2):169176. Tan,N.C.G, and J.A. Field. 2000. Biodegradation of Sulfonated Aromatic Compounds. In: EnvironmentalTechnologies toTreat Sulfur Pollution. Principles and 383
Meitiniarti, v./., et al. - Kultivasi curah Chryseobacterium
Engineering,LensP.andHulshoffPol L. (Eds). IWA Publishing. London. Wallace, T.H. 2001. Biological Treatment of a Synthetic Dye Water and an Industrial Textile Wastewater Containing Azo Dye Compounds. Master Thesis. Faculty of Virginia Polytechnic Institute.Vtrginia.
384
indoloflenes ID60160
