Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez

1


Kozma Péter

Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez - Doktori (PhD) értekezés -

Pannon Egyetem – Molekuláris- és Nanotechnológiák Doktori Iskola 1 valamint Magyar Tudományos Akadémia Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Kutatóintézete 2

Témavezetők: 2

Dr. Horváth Róbert és Dr. Petrik Péter

Budapest, 2011.

2

2


Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez - Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében -

Írta: Kozma Péter

Készült a Pannon Egyetem – Molekuláris- és Nanotechnológiák Doktori Iskolájában Témavezetők: Dr. Horváth Róbert és Dr. Petrik Péter

Az értekezést témavezetőként elfogadásra javaslom: Dr. Horváth Róbert:

igen / nem

………………………….. (aláírás)

Dr. Petrik Péter:

igen / nem

………………………….. (aláírás)

A jelölt a doktori szigorlaton ……… %-ot ért el.

Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: ………………………. igen / nem

………………………….. (aláírás)

Bíráló neve: ………………………. igen / nem

…………………………… (aláírás)

A jelölt az értekezés nyilvános vitáján ……… %-ot ért el.

…………………………… A Bíráló Bizottság elnöke

A doktori (PhD) oklevél minősítése ………………………………

…………………………… Az EDT elnöke Veszprém,………………………..

3


Előszó Az „Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez” című doktori értekezés alapjául szolgáló kutatásokat, mint a Pannon Egyetem Molekuláris- és Nanotechnológiák Doktori Iskolájának állami ösztöndíjas diákja a Magyar Tudományos Akadémia Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Kutatóintézetének Nanotechnológia, Optika és Fotonika laboratóriumaiban végeztem. Hálásan köszönöm mindkét intézet, s a Magyar Állam támogatását, mely nélkül e munka nem születhetett volna meg.

A fent megnevezett intézményekben fejlesztés alatt áll a flagelláris filamentum felismerő elemeket alkalmazó, kisméretű, jelölésmentes optikai hullámvezető bioszenzor, az ún. rácscsatolt interferométer jelátalakító. Ezzel az eszközzel reményeink szerint pár év múlva költséghatékony

módon,

akár

laboratóriumi

körülményeken

kívül

is,

kiemelkedő

érzékenységgel, specifikusan detektálhatunk majd különféle célmolekulákat. Doktori munkám során ezen interdiszciplináris kutatás módszer- és műszerfejlesztéssel kapcsolatos, eddig felmerült kérdéseire próbáltam egy-egy megoldást találni. Eredményeimet e disszertációban foglalom össze.

Mivel a fenti kutatás több párhuzamos fejlesztési eredmény együtteséből áll majd össze egyetlen egésszé, – melyekkel több intézmény kutatóinak egyidőben kell előrehaladniuk – a világos mondanivaló háttérbe szorítása nélkül e disszertáció sem tárgyalhatja e párhuzamos szálakat egyetlen egységként. Következésképp a dolgozat felépítése is kénytelen kissé eltérni a hagyományos tárgyalásmódtól. Az olvasó tehát joggal érezheti úgy, hogy rendre váltják egymást a bevezetéshez, az anyagok és módszerek, eredmények és az eredmények megvitatása alfejezetekhez illőrészek. Ám, ha úgy fogja kezébe e munkát, hogy az érdemi, 6os, 7-8-as és 9-es fejezeteket, mint önálló egységeket olvassa, a megszokott didaktikai rend megváltozása miatt szerkezetében kevésbé hagyománytisztelőnek tűnő dolgozat talán könnyebben megmutatja a maga sajátos rendszerét.

4


Tartalomjegyzék Előszó

4

Tartalomjegyzék

5

1. Bevezetés

7

2. A doktori munkát motiváló tényezők

9

3. A dolgozat rövid kivonata három nyelven

10

3.1. Kivonat

10

3.2. Abstract

10

3.3. Zusammenfassung

11

4. A disszertációban használatos fontosabb jelölések

12

5. Bioérzékelés alapjai

13

5. 1. Jelölésmentes bioérzékelők felismerőelemei

13

5. 1. 1. Receptorok

14

5. 1. 2. Enzimek

14

5. 1. 3. Antitestek

15

5. 1. 4. Nukleinsavak

15

5. 1. 5. Flagelláris filamentumok

16

5. 2. Jelölésmentes érzékelők jelátalakítói

19

5. 2. 1. Tömegérzékeny jelátalakítók

19

5. 2. 2. Hőmennyiségmérőjelátalakítók

21

5. 2. 3. Elektrokémiai jelátalakítók

21

5. 2. 4. Optikai jelátalakítók

22

6. Flagelláris filamentum alapú érzékelőrétegek minősítése

28

6. 1. Ex situ felületanalízis

29

6. 1. 1. Mintakészítés

30

6. 1. 2. Modellalkotás és spektrum kiértékelés

32

6. 2. In situ felületanalízis

38

6. 2. 1. Előkészületek az in situ kísérletekhez

39

6. 2. 2. In situ kísérletek

43

6. 2. 3. A fehérjeréteg szerkezetanalízise – egy lehetséges megoldás

48

6. 3. Összefoglalás és kitekintés

53

5

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez 7. Rácscsatolt interferométer - refraktometria

55

7. 1. Az elsőmérési összeállítás

57

7. 2. Integrált optikai egység

59

7. 3. Folyadékkristály modulátor

60

7. 4. A szenzorműködés elve

61

7. 5. A mérés menete

62

7. 6. Az első, működést igazoló kísérletek

63

7. 7. Összegzés

66

8. Rácscsatolt interferométer bioszenzorikai kísérletekhez

67

8. 1. A válaszjel kiértékelés új formája

67

8. 2. A valós idejűvezérlőés kiértékelőalgoritmus

72

8. 3. A zaj hatásának csökkentése referencia alkalmazásával

74

8. 4. Nagy felbontású kísérletek rácscsatolt interferométerrel

76

8. 4. 1. Refraktometria és fehérje adszorpció vizsgálat

76

8. 4. 2. Felismerőelem - célmolekula típusú érzékelés

80

8. 5. Összegezés és kitekintés

84

9. Rácscsatolt interferométer - spektroszkópiai ellipszométer kombinált összeállítás

85

9. 1. A mérési összeállítás

86

9. 2. Az elsőmérési eredmény

88

9. 3. Összegzés és kitekintés

90

10. Összefoglalás

92

11. Tézispontok – Conclusions

93

12. Köszönetnyilvánítás

100

13. Függelék - Fényterjedés közegben és közeghatáron

101

13. 1. Síkhullámok homogén közegben

101

13. 2. Interferencia

103

13. 3. Síkhullámok közegek határán

104

13. 4. Az ellipszometria

106

13. 4. 1. Az ellipszometriai modellek alapjai

108

13. 4. 2. Fontosabb ellipszometriai rétegmodellek

112

13. 5. Hullámvezetés izotróp közegben

113

13. 6. Nematikus folyadékkristály modulátor

119

14. Irodalomjegyzék

123

6


1. Bevezetés A nanotechnológia területén az évtized egyik főkutatási iránya olyan érzékelők, érzékelőrendszerek megalkotása és fejlesztése, melyek képesek mind nagyobb és nagyobb érzékenységgel, gyors és költséghatékony módon detektálni akár kisebb molekulák, sőt akár önálló atomok valamilyen felismerőelemhez történőkötődését is. Az ilyen irányú törekvések eredményeit főként a gyógyszerkutatásban hasznosítják, ahol fontos szerepet töltenek be a molekuláris kölcsönhatások kutatásában, mint például a gyógyszer, toxicitás és hatékonyság vizsgálatok [1, 2], új orvos-diagnosztikai és terápiás eljárások fejlesztése [3, 4] területén. Az orvosi, biológiai kutatásokon túl az igazságügy (drog, dopping vizsgálatok, stb.) és az ipar (víz- és ételminőség ellenőrzés, stb.) is széles körben alkalmaz ilyen eszközöket [5, 6]. Ezek a vizsgálatok jellemzően rendkívül parányi, 500 Da-nál kisebb molekulatömeggel rendelkező, ~ pg/ml (esetenként ~ fg/ml) koncentrációban jelen lévőcélmolekulák érzékeny és specifikus kimutatását kívánják olyan oldatokban, ahol egy időben és nagy mennyiségben más molekulák is megtalálhatók [7]. Napjainkban a felismerőelem - célmolekula típusú kísérleteket többnyire úgy végezik, hogy a vizsgálandó molekulákat radioaktív, fluoreszcens vagy mágnesezhetőanyagokkal megjelölik, majd a megfelelőeljárással a jelölők által szolgáltatott jelet keresik a vizsgált térfogatban vagy felületen [2, 8]. Az ilyen eljárásokkal érhetőel ma a legnagyobb érzékenység, hiszen a jelölőt követve akár egyetlen apró molekula bekötődése is megfigyelhető. E kétségtelen előnyük mellett azonban számos hátránnyal rendelkeznek. A detektálandó molekulák megjelölése nem csupán rendkívül idő-, laboratórium- és költségigényes, de maga a jelölés is kihatással lehet a vizsgált folyamat mérési eredményeire [1]. Ennek okán az ilyen irányú kutatások az elmúlt években mind inkább a jelölésmentes alkalmazások felé fordultak. A legígéretesebb jelölésmentes mérési eljárások, ún. jelátalakítók közé tartoznak az optikai hullámvezető alapú érzékelők, melyek kihasználva a fény határfelületről való teljes visszaverődés képességét, a terjedőmódus ún. evaneszcens mezejének segítségével vizsgálják a hullámvezető réteg felültén végbemenő folyamatokat [9, 10, 11]. Ilyen eszközök alkalmazásával oldatok törésmutatójának (kivitelezéstől függően) ötödik - hatodik - hetedik tizedesjegyében történőváltozása detektálható, illetve az érzékelő felületre leválasztott fehérjerétegek vastagsága akár nanométer alatti pontossággal meghatározható [7, 12, 13, 14, 15, 16]. Indokolt tehát a felismerőelemeket hullámvezetőstruktúrákra, chipekre rögzíteni. Ekkor lehetőség nyílik arra, hogy az általuk megkötött célmolekulák nem csupán kvalitatív, 7

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez hanem kvantitatív analízise is megvalósítható legyen. A szenzorchipet folyadékcellával felszerelt mérőkészülékbe helyezve in situ (latin, folyamat közben) és valós időben mérhetjük a célmolekulák kötődését [10, 11, 12, 17]. További előnye a látható tartománybeli optikai módszerek alkalmazásának, hogy az ilyen típusú folyamatokat nagy érzékenységgel követhetjük anélkül, hogy a vizsgált rendszer bármiféle károsodást szenvedne, illetve, hogy jelentékeny módon beavatkoznánk a kísérlet menetébe.

8


2. A doktori munkát motiváló tényezők Számos, különféle elven alapuló bioérzékelővált mára hatékony és új eredményekre mutató mérési eljárássá, azonban egyedi hibáikon kívül, főés közös hátrányuk a magas piaci áruk. A jövőbioérzékelőinek azonban költséghatékony módon kell biztosítaniuk a lehetőséget arra, hogy akár analitikai laboratóriumokon kívül is, gyors és megbízható méréseket végezhessünk. A felismerő elemek és jelátalakítók fejlesztői számára a jelen kihívása, hogy e célt megvalósítsák. A veszprémi Pannon Egyetemen (PE) folyó kutatások közül a legígéretesebbek közé tartoznak a Nanotechnológia tanszék, Prof. Vonderviszt Ferenc csoportjának azon kísérletei, melyek módosított baktérium ostorok, ún. flagelláris filamentumok felismerőelemekként történőalkalmazását célozzák. Bíztató eredményeik alapján várható, hogy hamarosan olyan in vivo (latin, az élőszervezetben) sokszorosítható, mutáns filamentumokat hozzanak létre, melyekkel specifikus, jó hatásfokú és olcsó detektálás valósítható meg. E kísérletekkel párhuzamosan, az egyetemmel munkakapcsolatban álló Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Kutatóintézet (MFA) Fotonika osztályán végezett kutatások – az ún. vad (módosítatlan, detektálásra még képtelen) flagelláris filamentumok felhasználásával – a közeli jövőben megvalósításra kerülőfelismerőelemek megfelelőjelátalakítóba történőintegrálását készítik elő. Az ilyen irányú fejlesztések alapvetően két részre, módszer- és műszerfejlesztési egységekre bonthatók. Az előbbi esetében nem csupán a felismerőelemek érzékelőfelületére történőrögzítésének technikáját kell megoldani, hanem egy olyan mérési eljárást is ki kell fejleszteni, mellyel a felületre leválasztott fehérjeréteg minősége, opto-geometriai tulajdonságai meghatározhatók, illetve ellenőrizhetők. Egy ilyen eljárás kifejlesztése a minőségi bioérzékelők gyártásának egyik kulcsa. A sikeresen előállított flagelláris filamentum felismerőelemek kisebb molekulák, vagy akár atomok jelenlétét detektálják majd a kívánt oldatban. Az ilyen apró célmolekulák bekötődése csupán

a

legérzékenyebb

mérési

eljárásokkal

követhetők

nyomon.

Az

e

célra

legalkalmasabbnak ígérkezőhullámvezetőalapú módszerek közül, számos előnye miatt, az MFA és a PE közös nanoszenzorikai laboratóriumában fejlesztés alatt álló rácscsatolt interferométerre esett a választás, hogy az érzékelő felületére immobilizált flagelláris filamentum felismerőelemekkel korszerű, költséghatékony és nagy érzékenységűdetektálást valósítson majd meg.

9


3. A dolgozat rövid kivonata három nyelven 3.1. Kivonat Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Doktori munkám elsőrészében javaslatot teszek egy gyors, érzékeny, roncsolásmentes és költséghatékony optikai eljárás, a spektroszkópiai ellipszometria alkalmazására, mellyel az összetett rétegszerkezetű hordozókra leválasztott flagelláris filamentum rétegek optogeometriai paraméterei meghatározhatók. Folyadékcellás kísérletekkel bemutatom, hogy a mérési módszer jól használható e fehérjék felületre történőleválasztásának in situ és valós idejű nyomon követésére, sőt minősítésére is. Megmutatom, hogy spektroszkópiai ellipszométerrel a fehérjeréteg tömegsűrűségének mélységbeli eloszlása is meghatározható, melynek alapján a filamentumokból felépülőréteg háromdimenziós struktúrája kutatható. Doktori munkám második részében, egy olyan jelölésmentes, optikai érzékelő, ún. rácscsatolt interferométer (ang. Grating Coupled Interferometer – GCI) jelátalakító prototípus megépítéséről és fejlesztéséről számolok be, mely egyszerű és olcsó optikai elemeket alkalmazva minden tekintetben felveszi a versenyt napjaink csúcskészülékeivel. Egyszerre érvényesíti az interferometria-alapú hullámvezetőmódszerek által biztosított tág mérési tartományokon belüli rendkívüli érzékenységet [18, 19, 20, 21, 22] a rácscsatolók egyszerűségével [9]. Mivel mozgó alkatrészeket nem tartalmaz, potenciális lehetőséget biztosít kézi-műszer gyártásra, továbbá más eljárásokkal való összeházasításra. Amennyiben a készülék érzékelő felületét felismerő elemekkel látjuk el, kitűnően alkalmazható akár bioszenzorikai kutatásokra is.

3.2. Abstract Optical Waveguide Interferometer for label-free Biosensing In the first part of the present thesis, a fast, sensitive, non-destructive and cost-effective optical method, the spectroscopic ellipsometry (SE) is proposed for the characterization of the opto-geometrical parameters of the flagellar filament protein layers deposited on complex multilayer substrates. By introducing a flow-cell, SE can be successfully applied for in situ and real quantitative monitoring of the protein deposition from aqueous solutions. It is also demonstrated that SE is able to reveal the in-depth mass density profile of the protein layers. Based on the obtained in-depth information, the three-dimensional structure of the filamentous layer can be investigated. 10

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez The second part of the thesis deals with the development of the Grating Coupled Interferometer (GCI) label-free optical sensor prototype, built of simple and low-cost components. Combining the wide measurement range and the excellent sensitivity of the interferometry based waveguide methods [18, 19, 20, 21, 22] with the simplicity of grating couplers [9] the device has become a competitor of today's top biosensor devices. Since this instrument does not contain any moving parts, it is a promising candidate for being used in handheld sensing devices. Moreover, it has a great potential in easy combination with other methods. Functionalizing the sensor surface of GCI with appropriate recognition elements the device can be excellently applied in biosensoric research, as well.

3.3. Zusammenfassung Interferometrischer Biosensor basierend auf optischem Wellenleiter zur Detektion ohne Marker Im ersten Teil der vorliegenden Doktorarbeit wird ein schnelles, sensitives, zerstörungsfreies und kostenwirksames Verfahren, die Spektroskopische Ellipsometrie vorgeschlagen, mit deren Hilfe die optischen und geometrischen Parameter der Flagellin-Faserproteinen, die auf ein Substrat mit komplexer Schichtstruktur abgeschieden werden, bestimmt werden können. Anhand von Experimenten mit einer Durchflusszelle wird gezeigt, dass diese Methode gut geeignet ist, um in situ und echtzeitig die Proteinablagerung auf der Oberfläche zu verfolgen und zu bewerten. Außerdem wird gezeigt, dass mit dem Spektoskopischen Ellipsometer das Tiefenprofil

der

Proteinenschichten

gemessen

werden

kann,

anhand

dessen

die

dreidimensionale Oberflächenstruktur der Faserschichten erforscht werden kann. Im zweiten Teil der Arbeit wird zur markierungsfreien optischen Detektion die Entwicklung eines Prototyps eines so genannten Gitterkoppler-Interferometers (eng. Grating Coupled Interferometer - GCI) gezeigt, welcher aus einfachen und günstigen optischen Elementen aufgebaut ist. Dank der Kombination eines grossen Messbereichs und der hervorragenden Empfindlichkeit der Interferometrie-basierten Wellenleitermethoden [18, 19, 20, 21, 22] mit der Einfachheit der Gitterkoppler [9] vermag GCI in jeder Hinsicht im Wettbewerb heutiger Spitzengeräte mitzuhalten. Da er keine beweglichen Teile enthält, ist das Prinzip hervorragend für die Herstellung tragbarer Geräte oder die Integration in andere Messverfahren geeignet. Durch die Funktionalisierung der Oberfläche mit spezifischen Erkennungsmolekülen findet der Sensor eine Anwendung in den biophysikalischen Forschungen.

11


4. A disszertációban használatos fontosabb jelölések t τ r(x,y,z) E(r,t) B(r,t) D(r,t) H(r,t) n no ne N ε μ k λ ω c φ, Φ ΔΦ(t,t 0) A I d (r,t) α ∆, Ψ κ γ m Γ l, L σ S

időkoordináta időállandó helyvektor elektromos térerősség mágneses indukció elektromos eltolás mágneses térerősség törésmutató ordinárius törésmutató extraordinárius törésmutató effektív törésmutató permittivitás permeabilitás hullámszám hullámhossz körfrekvencia fénysebesség fázis relatív fázistolás amplitúdó intenzitás vastagság elfordulás szöge orientációs szög ellipszometriai szögek rugalmassági együttható forgási viszkozitás módus száma tömegsűrűség hosszúság szórás érzékenység

FF GA APTES PBS SE GCI OWLS

flagelláris filamentum glutáraldehid 3-aminopropil-trietoxi-szilán foszfát puffer spektroszkópiai ellipszométer rácscsatolt interferométer optikai hullámvezető fénymódus spektroszkóp dupla polarizációs interferométer felületi plazmon rezonancia spektroszkóp atomerőmikroszkóp pásztázó elektronmikroszkóp

DPI SPR AFM SEM

12


5. Bioérzékelés alapjai 1967-ben Updike és Hicks megalkotta az elsőbioérzékelőt [23]. Azóta már számos hasonló eszköz látott napvilágot [4], fejlesztésük azonban mind egyre nagyobb erőkkel zajlik. Méretük és áruk csökkentése, valamint érzékenységük, stabilitásuk és specifikusságuk növelése újabb és újabb kihívásokat jelentenek a kutatók és az ipar számára. Parányi, olcsó és megbízható eszközök piaci érvényesítése a fejlesztők vágyálma, melyeknek az élet legkülönfélébb területein történő alkalmazása megkönnyítik komfortérzetünket. Gondoljunk csak a vércukorszint ellenőrzőkészülékekre, melyek a cukorbetegek biztonságos inzulinadagolását segítik [4]. A bioérzékelő egyik lehetséges meghatározását Turner adta, aki a következőképpen fogalmazott: „A bioérzékelőkompakt analitikai eszköz vagy egység, melyben biológiai vagy biológiai útón előállított érzékeny felismerőelemet integrálnak fizikai-kémiai jelátalakítóba.” [24] Turner definícióját a 5.-1. ábra szemlélteti, bővebb kifejtése a következőalfejezetekben olvasható.

5.-1. ábra: A bioérzékelő k összefoglaló jellegű vázlata: a vizsgálandó célmolekulát a felismerőelem érzékeli, majd e hatást a jelátalakító erő sített jellé formálja [4].

5. 1. Jelölésmentes bioérzékelők felismerőelemei A molekuláris felismerés az egyik lényegi kutatási iránya a biológiai érzékelés fejlődésének. A felismerőelemeket többnyire még élőszervezetekből nyerik ki, azonban napjainkra már gyakori a laboratóriumi úton előállított ún. szintetikus elemek használata is. Alkalmazva a modern biotechnológia nyújtotta lehetőségeket, ma már tetszőleges DNS szekvenciákat is szintetizálhatunk, megnyitva ezzel a kaput olyan felismerőelemek megalkotása és így olyan célmolekulák detektálása felé, melyekre nincs példa a természetben.

13

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez A következőáttekintés csupán a legfontosabb és legígéretesebb természetes és mesterséges felismerőelemek (receptorok, antitestek, enzimek, nukleinsavak és flagelláris filametumok) rövid bemutatására szorítkozik, a pontos részletekre nem tér ki. Ezek részletgazdag kiegészítése a szövegben megjelölt referenciákban található.

5. 1. 1. Receptorok A receptorok (latin, felfogó szerv) ígéretes felismerőelemek, hiszen a természetben betöltött szerepük is részben a specifikus azonosítás. Különféle méreganyagok és hatóanyagok természetes célpontjai évmilliárdok óta. Mint közvetítő transzmembrán fehérjék a célmolekula

megkötését

valamilyen

biológiai

jelátvitel

segítségével

továbbítják

a

gazdasejtjüknek a sejt felületéről a sejtmembránon át a sejt megfelelőrészébe. A ligandum bekötődése a receptor konformációváltozását eredményezi, mely további csatolt eseménylánc következményeként

kiváltja

a

megfelelő sejtválaszt

(pl.:

sejtmembrán

csatornák

nyitása/zárása, sejtműködés-változás) [25, 26]. A receptor preparátumok nagy lingandum specificitásuk és affinitásuk miatt vonzó felismerő elemek, hátrányuk azonban, hogy kevésbé stabilak, valamint labor- és költségigényes tisztítási folyamatokkal izolálhatók csupán a sejtmembránból. Rekombináns technikák alkalmazásával e hátrány enyhíthető. Mivel az ilyen receptor - ligandum jellegűfelismerés esetén semmilyen jelerősítő hatásról nem beszélhetünk csak a legérzékenyebb jelátalakítók segítségével detektálhatók az ilyen események [27].

5. 1. 2. Enzimek Az enzimek szintén gyakran használt felismerőelemek a bioszenzorikai kutatásokban. Esetükben is, hasonlóan a receptorokhoz, a természetbeni szerepüket használják ki a célmolekulák érzékelésére. Az enzimfehérjék ún. aktív centrumain katalizált, az enzimekre jellemzőkémiai folyamatokhoz szükséges vegyületek, ún. szubsztrát-ok specifikus megkötése és ezek reakciótermékekké, ún. produktum-okká alakítása adja az érzékelés alapját. A keletkező produktumok számát mérve ugyanis választ kaphatunk a detektálni kívánt célmolekulák (esetünkben a szubsztrátok) jelenlétére és azok mennyiségére. Az alloszterikus enzimek egy vagy több olyan szabályzó szerkezeti egységgel rendelkeznek, melyekre az ún. effektor-ok bekötődésükkel hatnak. A bekötődés szerkezeti változásokra kényszeríti az enzimfehérjét, mely következtében alkalmassá, illetve alkalmatlanná válik az általa katalizált folyamat elvégzésére. Az ilyen hatásokat rendre alloszterikus aktivitásnak,

14

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez illetve alloszterikus gátlásnak nevezzük. Amennyiben a detektálandó célmolekula az effektor, az alloszterikus kötőhely és az aktív centrum együtt jelátalakítóval és jelerősítővel ellátott bioérzékelőt alkotnak. A mérendőjel az előállított produktum mennyisége [28]. Az ilyen enzim felismerőelemek hátránya, hogy bonyolult, több doménes, több alkotóelemes szerkezetük miatt nehezebben előállíthatóak. Továbbá, hogy a szubsztrát folytonos produktummá történőkatalízise csökkenti a szubsztrát koncentrációt, mely hatással van a katalízis sebességére, ez pedig megzavarja a valós idejűméréseket. Még annak ellenére is, hogy a világpiacot uraló glükóz szenzor enzim katalízis elven működik, ideálisnak mégsem az ilyen jellegűdetektálást tekintjük [4].

5. 1. 3. Antitestek Az enzim alapú glükóz szenzor kivételével a gyors mérőrendszerek napjainkban főként antitesteket használnak felismerőelemekként a célmolekulák azonosítására és mennyiségi analízisére. Az antitestek népszerűsége 1984-től eredeztethető, mikor Kohler és Milstein javasolt egy később Nobel-díjjal jutalmazott eljárást, mely segítségével már monoklonáris antitestek is nagy mennyiségben izolálhatóak. Az antitest felismerőelemeket tartalmazó bioérzékelők a rendkívül érzékeny és specifikus a biomolekuláris antitest - antigén kölcsönhatásra építenek. Mára már könnyebben előállítható, olcsóbb rekombináns antitestek is elérhetőek, melyek genetikailag, a célmolekulának megfelelően módosított antigén kötőhellyel rendelkeznek [29]. Jelerősítés például ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) és IPCR (immuno-polymerase chain reaction) technikákkal valósítható meg [30].

5. 1. 4. Nukleinsavak Tetszőleges szekvenciájú RNS (ribonukleinsav), illetve egyszálú DNS (dezoxiribonukleinsav) láncokat is használhatunk komplementereik hibridizációval történő detektálására. Ilyen felismerőelemeket alkalmaznak például a világon mára már széles körben elterjedt PCR és IPCR vizsgálatok. Továbbá a jövőben valószínűleg fontos szerepet játszanak majd a gyors, megbízható és költséghatékony DNS szekvenálás, illetve diagnosztika területén is [2, 8, 30, 31]. Kémiailag rendkívül stabilak, a nukleázoknak azonban csak módosított fehérje vázzal rendelkezőnukleinsav (ang. peptid nukleid acid - PNA) változataik állnak ellen [32]. A jövőtalán legígéretesebb felismerőelemei a néhány tíz bázishosszúságú ún. aptamer oligonukleotidok, melyek tipikusan 1015 - 1016 elemszámú RNS, módosított RNS, egyszálú DNS, illetve módosított egyszálú DNS könyvtárakból irányított evolúció elvű SELEX

15

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) eljárással izolálhatóak és szaporíthatóak in vitro [33]. E mesterségesen előállított RNS vagy egyszálú DNS származékok két végén található állandó szekvencia közötti szakasz módosítható mindaddig, míg a kapott aptamer nagy affinitással és specificitással nem köt a kívánt célmolekulához. A felismerés hatékonyságát a célmolekulák színes palettáján a variációk hatalmas száma biztosítja. Nem komplementer nukleinsav típusú detektálás esetén is képes a ligandumot specifikusan megkötni annak térszerkezeti sajátosságai alapján [4]. Alkalmas jelöltjei analitikai és diagnosztikai alkalmazásoknak [34]. Számos előnyük közül néhány, hogy minimális méretűek, így könnyen reprodukálhatók és költséghatékony módon állíthatók elő, valamint végeik állandó szekvenciáinak révén könnyen immobilizálhatók. A célmolekula kötődés hatására jelentős mértékűkonformáció-változáson mennek keresztül, mely nem csupán megkönnyíti, de új lehetőségeket is nyit a jelátalakításra [35].

5. 1. 5. Flagelláris filamentumok A baktériumok mozgásszervei a flagellumok, melyek sejten kívüli részei az 5 - 20 mikrométer hosszúságú, 20 - 25 nanométer átmérőjű, fehérje alegységekből felépülő flagelláris filamentumok [36]. (5.1.5.-1.a. ábra) Minden egyes filamentumot egy-egy, a sejtmembránban található, 50 nanométer széles olyan forgómotor hajt (5.1.5.-1.b. ábra), mely fordulatszáma egyes fajoknál elérheti a hihetetlenül nagy, akár kilencvenezres percenkénti fordulatot is [37, 38]. A forgatáshoz szükséges energiát a sejtmembrán két oldala közötti protongradiens biztosítja, csak úgy, mint számos más biokémiai folyamat esetén. A flagelláris filamentumok a 5.1.5.-2. ábrán látható módon több tízezer flagellin fehérjéből

a.)

b.)

5.1.5.-1. ábra: a.) A baktérium sejtmembránjából kinyúló helikális propellerré szervező dött filamentumok b.) a filamentumot hajtó forgómotor sematikus rajza [36].

16

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez felépülőtubuláris struktúrák. Ezek, a sejtmembránba ágyazott motorokhoz görbült szerkezetű, azonos fehérje alegységekből felépülő ún. kampók segítségével kapcsolódnak, melyek lehetővé teszik, hogy a filamentumok ne a motor tengelye által meghatározott, hanem a haladó mozgás szempontjából optimális forgástengely mentén foroghassanak [39]. E kampót a fehérjeszállal ún. HAP1 és HAP3 fehérjék rögzítik egymáshoz. A motor tengelyét felépítőötféle fehérjét, valamint a kampófehérjét, a flagellint és a HAP fehérjéket együttesen axiális fehérjéknek nevezzük. Ezek a citoplazmában szintetizálódnak, majd a filamentum tubuláris szerkezetéből adódó csatornán keresztül jutnak el beépülési helyükre, a filamentumok végére [39]. Itt az ún. HAP2 sapka szabályozza az érkező alegységek kapcsolódását, valamint ez védi a filamentumot az esetleges depolimerizációtól is. A Salmonella typhimurium törzsből preparált filamentumok és az ezeket felépítőflagellin alegységek szerkezetét röntgendiffrakciós és elektronmikroszkópos analízissel határozták meg. Kiderült, hogy a flagellinek négy lineárisan kapcsolódó doménből állnak, ezeket D0,

5.1.5.-2. ábra: A flagelláris filamentum felépítése: 1. Kampó 2. HAP1, HAP3 3. Flagellin alegységek 4. HAP2 sapka [36].

D1, D2, D3-mal jelölték. (5.1.5.-3.a. ábra) Továbbá, arra is fény derült, hogy körbejárva az ilyen filamentumokat 11 flagellin alegységet számolhatunk össze, melyek kölcsönhatva egymással koncentrikus szerkezetet alakítanak ki a szál hossztengelye körül [36, 38, 39] (5.1.5.-3.b. ábra). Az axiális irányban egymás felett elhelyezkedőalegységek N- és Cterminális régiói egymásba fonódó kötegeket képezve felépítik a 5.1.5.-3.c. ábrán piros színnel kihangsúlyozott, ún. protofilamentumot. Egy híján egy tucat ilyen protofilamentum együttese adja a filamentális (tubuláris) szerkezetet [40]. 17

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez a.)

b.)

c.)

5.1.5.-3. ábra: a.) A Salmonella typhimuriumból származó flagellinmolekulák atomi szerkezete. b.) Flagelláris filamentumokban e flagellin alegységek koncentrikus c) protofilamentális szerkezetbe rendező dnek, úgy hogy a D0 domének befelé, a D3 domének kifelé néznek [40].

A D3 domének a filamentum felszínén találhatók, így nem vesznek részt a szerkezet kialakításában. Éppen ezért, a D3 domén kiváló célpont génsebészeti beavatkozások számára, hiszen aminosavsorrendje szabadon módosítható anélkül, hogy a flagellin polimerizációs képessége sérülne, illetve a filamentális szerkezet módosulna. Ez a figyelemreméltó tulajdonság teszi különösen alkalmassá a flagellinmolekulákat arra, hogy belőlük – meghatározott célmolekulák hatékony felismerésére és megkötésére képes – mesterséges felismerőelemek legyenek előállíthatók [41]. Ennek tervezett menete a következő: A flagellin D3 doménjének felületén található három hurokrégiót kódoló génszakaszokat fehérjetervezés, célzott mutagenezis és irányított evolúciós eljárásokkal [42] módosítják, majd az így kapott mutáns géneket hordozó baktériumokat tenyésztik. Ezek filamentumait már a módosított felismerőflagellinek alkotják. E mutáns fehérjeszálakat – a sejtekről való leválasztásuk után – alkalmas mérőchip felületére rögzítik (ld.: 14. 3. fejezet). Mivel már egyetlen filamentumot is több tízezer felismerőflagellin alkot, és ilyen szálakból hatalmas mennyiséget köthetünk ki a jelátalakítók felületére, rendkívüli érzékenységgel bíró szenzorokat gyárthatunk majd. Megjegyzendő, hogy különbözőfelismerőrégiókkal rendelkező flagellineket kontrollált módon polimerizáltatva elvileg olyan flagelláris érzékelőszálakat – és így olyan nanochipeket – is létrehozhatunk, amelyek nem csupán egyetlen molekula, hanem akár egy vegyületcsalád felismerésére is képesek.

18


5. 2. Jelölésmentes érzékelők jelátalakítói A jelölésmentes bioszenzorokban az érzékelés alapját egy részről a célmolekula és a felismerő elem között létrejövőspecifikus reakció képezi. A felismerés valamilyen fizikai-kémiai változást hoz létre a rendszerben, mely azután egy alkalmas jelátalakító segítségével detektálandó és mérendő. Az előzőfejezetben bemutatott felismerőelemekhez fejlesztett jelátalakítók számos típusa lelhetőfel az irodalomban. Ezeket tömeg-, hőmennyiség-, elektrokémiai- vagy optikai változáson alapuló érzékeléstechnikák csoportjába sorolhatjuk [35, 43]. Terjedelem korlátok miatt, a következőalfejezetekben e csoportokra jellemző alapvető tulajdonságok tárgyalására szorítkozom, csupán a dolgozat szempontjából elengedhetetlenül fontos optikai módszereket részletezem. Az alfejezet végén található 5.2.4.-I. táblázat összegzi napjaink legfejlettebb és legígéretesebb jelátalakítóit megjelölve az egyes eszközökhöz tartozó maximális érzékenységet. 5. 2. 1. Tömegérzékeny jelátalakítók A tömegérzékeny jelátalakítók definíció szerint olyan fizikai mennyiséget mérnek, mely a felismerőelemek által megkötött célmolekulák össztömegének függvénye. Tipikusan egy rezgésbe hozott rendszer sajátfrekvenciájának elhangolódását követik optikai, piezorezisztív vagy kapacitív módszerekkel [44]. Bár ez a legfiatalabb méréstechnika e fejezetben tárgyaltak között, máris figyelemre méltó mérési érzékenységekről számol be az irodalom [45].

b.)

a.)

5.2.1.-1. ábra: a.) A 0,3 mm vastag, 14 mm átmérő jűQCM piezoelektromos jelátalakító egység b.) saját frekvenciája a felületén megkötött célmolekulák össztömegének függvényében megváltozik [46].

19

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez A kvarc-kristály mikromérleg (ang. quartz crystal microballance - QCM) eljárás alapvetően a piezoelektromos kvarc kristályoknak arra a tulajdonságára épül, hogy megfelelőfrekvenciájú váltófeszültséget kapcsolva rájuk rezonanciába hozhatók. E rezonanciafrekvencia értéke érzékeny függvénye a kvarckristály tömegének, így a felületére leváló tömeg elhangolja a rendszert [45]. Amennyiben a detektálni kívánt célmolekulának megfelelőfelismerőelemeket az érzékelők felületére csatolják, a felismerőelemek által megkötött célmolekulák száma tömegük ismeretében meghatározható (5.2.1.-1. ábra) [46]. A hasonló elven működőfelületi akusztikus hullámok (ang. surface acoustic waves - SAW) eljárás esetében egy membrán felületén terjedőmódus sebessége változik a felületére levált célmolekulák össztömegének függvényében [47]. Ide sorolhatók még a mikro- és nanomechanikus erőkarok (ang. micro- and nanomechanical cantilevers - MC) is, melyek a megkötött célmolekulák súlyával arányosan néhány nanométert meghajolnak (5.2.1.-2.a. ábra). A meghajlás mértéke optikai, piezorezisztív, kapacitív elven működőeljárásokkal olvasható ki [44]. Dinamikus módban mérve velük, a QCM-hez hasonlóan, a rezonanciafrekvenciájuk hangolódik el. Mivel a mikro- és nanomechanikus erőkarok könnyen tömbbe rendezhetők, nagyszámú párhuzamos mérés végezhetővelük (5.2.1.-2.b. ábra). E nagyszerűtulajdonság a jövőegyik legígéretesebb jelátalakító eljárásává teszi ezeket [2, 44].

a.)

b.)

5.2.1.-2. ábra. a.) A tömbbe rendezett rugalmas erő karok a rájuk rögzített felismerőelemek által megkötött célmolekulák súlya alatt meghajolnak [8]. b.) Pásztázó elektronmikroszkóp felvétel egy kereskedelmi forgalomban már kapható 8 egységes mikromechanikus erő karról [48].

20

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez 5. 2. 2. Hőmennyiségmérőjelátalakítók A jelátalakítók hőmennyiség mérésén alapuló típusa azt az alapvetőtulajdonságát használja ki a kémiai reakcióknak, hogy az ilyen folyamatokat mindig hőváltozás (hőelnyelés vagy hőfejlődés) kíséri. Ennek oka, hogy a reakcióban résztvevőanyagok átalakulása során belső energiájuk megváltozik, majd környezetükkel újra termikus egyensúlyba kerülnek. Egy rendkívül érzékeny hőmennyiségmérővel – általában termisztorral – mérhetjük a felületére immobilizált felismerőelemek célmolekula megkötéskor fejlődőhőt. Egy kísérlet során mért összes hőmennyiség a felismerési reakcióban résztvevőcélmolekulák számával arányos. A jobb érzékenység érdekében érdemes energiaigényes folyamatokat követnünk, ilyenek például az enzim katalizált reakciók [49]. 5. 2. 3. Elektrokémiai jelátalakítók Az elektrokémiai jelátalakítók a megfigyelt rendszer valamely elektromos tulajdonságának időbeli

megváltozását

követik

nyomon.

Vizsgálhatják

a

rendszerben

ébredő

potenciálkülönbséget (potenciometria), a rajta átfolyó áram mértékét (amperometria) illetve annak vezetőképességét (konduktometria) is [50]. A következőkben mindezekre egy-egy, napjaink kutatásait meghatározó példát olvashatunk.

a.)

b.)

5.2.3.-1. ábra: a.) A térvezérlésűtranzisztor alapú nanovezeték vezető képességét [51] míg b.) a nanopórusok esetén a pórusok átmérő jét, így az átfolyó ionáramot, [52] szabályozzák a felismerőelemek által megkötött célmolekulák.

A töltésérzékeny jelátalakítók vezetőképességét módosíthatja a felismerő elemek által megkötött célmolekulák töltésállapota. Napjaink egyik legígéretesebb, és az irodalomban legtöbbet említett tagja a térvezérlésűtranzisztor (ang. field effect transistor - FET) alapú nanovezeték (ang. nanowire - NW) érzékelők (5.2.3.-1.a. ábra). Nanoméretűkollektorukat és

21

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez emitterüket egy néhány nanométer átmérőjű félvezető szál köti össze, mely vezetési tulajdonságait töltésük révén, a felületéhez csatolt felismerő elemek által megkötött célmolekulák kapuzzák. A módszer olyan érzékeny, hogy segítségével fehérjéket, DNS szálakat, sőt akár önálló vírusokat is detektálhatunk. Tömbökbe rendezve ezeket nagy teljesítményűanalízist és párhuzamos méréseket is végezhetünk velük [51]. Egy másik nagy erőkkel kutatott és rendkívül ígéretesnek tűnő jelátalakító eljárás a nanopórusokkal (ang. nanopore - NP) való érzékelés. Egy néhány nanométer átmérőjű póruson (csatornán) átfolyó ionáramot a pórus belsejébe kémiai úton csatolt felismerőelem által megkötött célmolekula módosíthatja úgy, hogy térfogatával jelentősen csökkenti a csatorna keresztmetszetét, így az átfolyó áram mértékét is (5.2.3.-1.b. ábra) [52]. Kutatók nagy áttörést remélnek az ún. nanopórus jelátalakítóktól a biológiai érzékelés területén. Alkalmazásukkal már a legkisebb molekulák detektálhatók, az áhított cél azonban a jelölésmentes szupergyors és olcsó DNS szekvenálás megvalósítása [31]. A korszerű elektrokémiai érzékelés egy harmadik fontos példája az impedancia spektroszkópia (ang. impedance spectroscopy - IS). Működésének alapja, hogy a felismerő elemek redox-aktív csoportjainak egy mérőelektródhoz képesti elhelyezkedése megszabja a rendszer ellenállását [35]. A célmolekulák a váltóárammal hajtott elektródhoz csatolt felismerő elemek konformációját bekötődésükkel megváltoztatják, mely következtében a mért impedancia spektrum (Nyquist-diagram) módosul. Ezen változás nyomon követése a mérés alapja. 5. 2. 4. Optikai jelátalakítók A jelölésmentes jelátalakítók piaci versenyét tekintve az optikai módszerek lényegesen keresettebbek társaiknál [43]. Ennek oka főként az, hogy ezek a mérési eljárások a fenti módszerek

előnyeit

költséghatékony

módon

egyesítik.

A

célmolekula

bekötődési

eseményeket kis teljesítményű elektromágneses mező segítségével roncsolás- és egyéb mellékhatásmentesen azonnal és nagy mintavételezési frekvencia mellett detektálhatjuk. Az ilyen jelátalakítók felületegységre jutó érzékenysége kiemelkedően jó, továbbá könnyebb tömbbe rendezhetőségük révén számos mérés végezhetővelük párhuzamosan [7], valamint érzékelőfelületeik kialakításának technológia igénye relatíve alacsony. Az optikai jelátalakítók működésének alapja, hogy a magasabb permittivitású célmolekulák bekötődésükkel kiszorítják a jelátalakító felületén elhelyezett felismerőelemeket körülvevő közeg (általában valamilyen puffer oldat) alacsonyabb permittivitású molekuláit, így e fizikai mennyiségek átlagos értékét eltolják a felületközeli rétegben. A permittivitás és a vele arányosságban álló fizikai mennyiségek (a haladó elektromágneses mezőfázissebessége, 22

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez polarizációs állapota, a rendszeren áthaladó fény intenzitása, hullámhossza, stb.) a megkötött célmolekulák mennyiségével arányosan változik. (ld.: „13. Függelék – Fényterjedés közegben és közeghatáron”) Az optikai jelátalakítók e különbséget formálják mérhetőjellé [7, 53]. A következőalfejezetek, terjedelmi korlátok miatt, csupán a legismertebb és legsikeresebb, a fény polarizációs állapotának vagy fázissebességének megváltozását mérő optikai jelátalakítók rövid bemutatására összpontosítanak. A megadott hivatkozásokban további részletezőleírást találhat az olvasó. Spektroszkópiai ellipszométer Az optikai jelátalakítók egyik csoportja a vizsgált, felismerőelemekkel ellátott felületet felülről, lézer, LED, vagy izzólámpa fényével világítja meg, majd a reflektált vagy a transzmittált nyaláb a beesőfénysugárhoz képesti polarizációváltozását méri. (ld.: „13. 4. Az ellipszometria”) E csoport egyik közkedvelt tagja a spektroszkópiai ellipszométer (ang. spectroscopic ellipsometer - SE). Számos típusa közül a legnépszerűbbek a forgó polarizátoros (RPE), a forgó analizátoros (RAE) és a forgó kompenzátoros (RCE) készülékek [54]. E műszer felépítését tekintve két állítható dőlésszögű, azonos síkban fekvőoptikai karból, egy finoman pozícionálható optikai asztalból, valamint a vezérlőés feldolgozó elektronikai elemekből épül fel. Az optikai karok egyike a fényforrást és a polarizátort, a másik pedig az analizátort és a detektort foglalja magában. A fényforrás prizmával monokromatizált fénye a forgó polarizátoron áthaladva az épp aktuális polarizátor azimutszögnek megfelelősíkban lineárisan polarizálttá válik. Ezt követően a mintára vetődik, ahol is a fény-anyag kölcsönhatás következtében polarizációs állapota megváltozik. (Általában elliptikusan polarizálttá válik.) A mintáról a sugár az analizátorra reflektálódik, ahol az ezen áthaladni képes fényhányad végül bejut a detektorba. (5.2.4.-1.)

5.2.4.-1. ábra: Spektroszkópiai ellipszométer sematikus vázlata a vizsgáló fény megfelelő polarizációs állapotainak megjelölésével.

23

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Mach-Zender interferometéter Az interferométerek működési elve, hogy a rendszerébe jutó fényt két egymástól független útvonalon juttatja el a detektorig, ahol azokat interferáltatva a két nyaláb – mérőés referencia ágak – fáziskülönbségéről kaphatunk információt. (ld.: „13. 2. Interferencia”) Interferometria alapú, jelölésmentes bioérzékelésre alkalmas eszközök közül mindenképp a legismertebbek közé tartoznak a Mach-Zender interferométer alapú eljárások [55]. Az ilyen műszerek működésének alapja, hogy a mérőágukban haladó fény a kívánt biológiai oldaton, a mintán halad át, miközben a referencia ágban haladóhoz képest fáziseltolódást szenved (5.2.4.-2.a. ábra). Amennyiben az oldat optikai sűrűsége változik, a detektált interferencia intenzitás is ezzel arányosan módosul.

a.)

b.)

5.2.4.-2. ábra: a.) Mach-Zender interferométer b.) Young interferométer mű ködési vázlata [56].

Young interferométer Számos optikai módszer gyakran kihasználja, hogy szilárd közegben, a teljes visszaverődés következtében csapdában tartott fény az őt fogvatartó közeg környezetével, evaneszcens mezejének segítségével kölcsönhat és az ott végbemenőváltozásokra érzékenyen, fázisának eltolódásával reagál. Mivel az ilyen típusú jelátalakítók érzékelőfelületétől távolodva az evaneszcens mezőintenzitása exponenciálisan csökken (ld.: „13. 5. Hullámvezetés izotróp közegben”), ezért a műszerek tipikusan csupán néhány száz nanométer mélyen képesek „belelátni” a vizsgált felismerőelem - célmolekula rendszer térfogatába. Ennek okán az ilyen jelátalakítók csakis a közvetlen környezet változását detektálják [7]. Ezen elsőpillantásra hátrányosnak tűnőtulajdonságból szakavatott kezekben előnyt kovácsolnak. Horváth et al. [57] például megmutatta, hogy a hullámvezető struktúra paramétereinek megfelelő

24

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez beállításával az evaneszcens mező behatolási mélysége megnövelhető, illetve finoman hangolható sík dielektromos hullámvezetőkben. A Young interferometerek a következőképpen kombinálják az interferencia és a hullámvezetés nyújtotta lehetőségeket. A hordozó felületén kialakított „Y” alakú hullámvezetőstruktúra a becsatolt fényt két párhuzamosan haladó módusra osztja fel. Az egyik, mint mérőág, az érzékelőfelület alatt elhaladva evaneszcens mezejével „letapogatja” azt, miközben fázisa a referenciaágban terjedőéhez képest eltolódik. Ezt követően a hullámvezetőstruktúrából, egymás szomszédságában kilépőmódusok interferálnak, majd az általuk létrehozott interferencia mintázatról CCD kamerával készítünk pillanatfelvételeket. (5.2.4.-2.b. ábra) A szenzorfelületen végbemenőváltozások az alatta terjedőmódus fázisát, így az interferencia mintázat intenzitás minimum és maximum helyeit eltolják, melyből visszakövetkeztethetünk a vizsgált folyamat paramétereire [56]. Dupla polarizációs interferométer Napjaink vezetőjelölésmentes optikai mérési eljárása, a Young interferometria elvén alapuló dupla polarizációs interferometria (ang. dual polarization interferometry - DPI). Működési elve nagyon hasonló a Young interferométerekéhez, különbséget csupán a hullámvezető struktúra elrendezésében mutat. (5.2.4.-3.a. ábra) A lézer fényforrás síkban polarizált fényét két egymásra rétegzett hordozó - hullámvezetőstruktúra oldalára irányítjuk, és így egyszerre mindkettőbe becsatoljuk. Az alsó hullámvezetőt a felette lévőstruktúra a felületi biológiai rétegben történő változásoktól leárnyékolja, így az előbbi referenciaként, utóbbi pedig érzékelőként szolgál. A hullámvezetőszerkezet másik felén kilépőmódusok interferálnak egymással, majd az interferencia mintázatot egy alkalmas CCD detektorral felvesszük. Mivel a felső„érzékelő” hullámvezetőfelszínén végbemenőváltozások a benne terjedőmódus fázisát eltolják, azonban az alsó „referencia” hullámvezetőmódusának fázisa ettől független, az interferencia mintázat minimum és maximum helyei elcsúsznak. E változás mértéke hordozza az információt a vizsgált folyamatról [58]. Optikai hullámvezetőfénymódus spektroszkóp Az elsőhullámvezetésen alapuló érzékelőt Tiefenthaler és Lukosz mutatta be 1984-ben [59]. Azóta már számos más összeállítás is bizonyította, hogy az integrált optikai sík dielektrikum hullámvezetők kiválóan alkalmasak szenzorikai feladatok ellátására. Ezek közül az egyik legismertebb

eljárás,

mely

hatékonyan

használja

ki

a

hullámvezetők

kivételes

felületérzékenységét, az optikai hullámvezető fénymódus spektroszkópia (ang. optical

25

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez waveguide lightmode spectroscopy - OWLS). Elrendezése a következő: Egy sík hullámvezető struktúrát egy rendkívül finoman forgatható goniométer asztalra helyezünk, majd egy lézerfényforrás fényét polarizáció forgatón keresztül a hullámvezetőn található optikai rácsra irányítjuk. A hullámvezetőkét végére egy-egy fotodiódát illesztünk, s ezek segítségével mérjük a beesési szög függvényében a fényintenzitást. (5.2.4.-3.b. ábra) Annál a beesési szögnél, ahol a fény képes a hullámvezetőbe becsatolni, azaz módust indítani, intenzitáscsúcsot mérünk a detektorokkal. Ez a pozíció azonban a beesőfény hullámhosszán és a rács periódusán túl függ a rétegek opto-geometriai paramétereitől, azaz a rendszer effektív törésmutatójától is. (ld.: „13. 5. Hullámvezetés izotróp közegben”) Amennyiben a fedő, film és hordozó közegek optikai sűrűsége állandónak tekinthető, a felületen fejlődő vékonyrétegben végbemenőváltozás a móduscsúcsok pozíciójának folyamatos mérésével követhető[12].

5.2.4.-3. ábra: a.) A dupla polarizációs interferométer (DPI), b.) az optikai hullámvezető fénymódus spektroszkóp (OWLS) és c.) a Kretschmann-féle felületi plazmon rezonancia spektroszkóp (SPR) berendezések vázlata [1, 58, 60].

26

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Felületi plazmon rezonancia spektroszkóp A hivatkozásokat és az eladási statisztikákat tekintve minden idők legsikeresebb optikai jelátalakítói a felületi plazmon rezonanciát (ang. surface plasmon resonance - SPR) kihasználó spektroszkópiai berendezések [53]. E műszerek működési elve, hogy egy vékony aranyréteg felületről teljes visszaverődést szenvedőlézerfény evaneszcens mezeje felületi plazmonokat (hideg elektronplazma rezgésének kvázirészecskéi) gerjeszthet a fémréteg felületén. SPR technológia alkalmazása esetén a fémfelületrő l reflektálódó fény intenzitásának szögfüggését mérik. A 5.2.4.-3.c. ábrán látható, ún. Kretschmann elrendezésben egy prizmához törésmutató illesztőfolyadékkal egy olyan üveghordozót rögzítenek, mely túlsó felületére előzőleg arany vékonyréteget választottak le. A bioérzékelés folyamata az aranyréteg felületén, folyadékcella alatt megy végbe. A fémrétegre fókuszált és innen visszaverődőfény intenzitása egy adott – a felületi plazmonokat gerjesztő– szögnél leesik, melyből meghatározható a vékonyréteg effektív permittivitása. E fizikai paraméter megváltozása kapcsolatba hozható a bekötődő célmolekulák mennyiségével [1]. 5.2.4.-I. táblázat: Legelterjedtebb és legnépszerűbb mérési eljárások érzékenységét összefoglaló táblázat

Eljárás

Maximális érzékenység

Nem optikai jelátalakítók Kvarc-kristály mikromérleg Felületi akusztikus hullámok Mikromechanikus erőkar* Nanovezeték* Nanopórus* Impedancia spektroszkópia*

5 pg/mm2 3 pg felbontás Passzív mód: egyetlen sejt Dinamikus mód: pM DNS Egyetlen vírus Egyetlen DNS Oligopeptid konformáció vált.

Optikai jelátalakítók Spektroszkópiai ellipszométer Young interferométer Dupla polarizációs interferométer Optikai hullámvezetőfénymódus spektroszkóp Felületi plazmon rezonancia spektroszkóp

törésmutató ~10-4 ~10-6 ~10-7 ~10-5 ~10-5

tömeg / felület ~10 pg/mm2 — 0,1 pg/mm2 10 pg/mm2 ~10 pg/mm2

Referencia

[46] [61] [62] [62] [62] [35]

saját mérések [56] [15] [63] [64]

* Ezen eljárások egyetlen sejtet, molekulát, vírust, vagy DNS-t képesek detektálni egyetlen jelátalakító szegmensen, azonban ezen szegmensek kicsiny mérete hátrányt jelent bizonyos gyakorlati alkalmazásokban (pl.: komplex oldatok esetén leárnyékolás, nagy diffúziós időa szenzorfelületre).

27


6. Flagelláris filamentum alapú érzékelőrétegek minősítése A spektroszkópiai ellipszometria, mint roncsolásmentes optikai mérési módszer – ahogyan azt a jelen fejezet bemutatja – alkalmas összetett szerkezetűflagelláris filamentum fehérjerétegek nagyérzékenységűminősítésére akár összetett, a hullámvezetőszenzorikában is használatos multiréteg szerkezeteken is. A megfelelőoptikai modell megkonstruálásával folyadékcellában történőleválasztás közben meghatározható a felületen épülőréteg tömegsűrűségének időbeli változása, sőt a modell tökéletesítésével megmérhetőe paraméter mélységbeli eloszlása is. Kiderül az is, hogy az így kapott információ alapján becslés adható a flagelláris filamentum vékonyrétegek várható háromdimenziós szerkezetére. Ahogy azt az „5. 1. 5. Flagelláris filamentumok” címűfejezetben már tárgyaltuk, a flagelláris filamentumokat alkotó flagellin alegységek külsőrégiója a filamentáris szerkezet károsítása nélkül

módosítható.

E

régiók

fehérjeszerkezetét

mesterségesen

megváltoztatva

a

filamentumok alkalmassá tehetők célmolekulák specifikus megkötésére. Mivel ezek mindegyikét több tízezer flagellin alegység alkotja, rendkívüli felületi felismerő elem sűrűséget érhetünk el úgy, ha e fehérjéket a megfelelőimmobilizációs technikával a választott jelátalakító érzékelő-felületéhez rögzítjük. A flagelláris filamentumok alkotta réteg ugyanis nem kétdimenziós jellegű, hanem a vizsgált oldatba több száz nanométer mélyen benyúló, filamentumokkal sűrűn kitöltött statisztikus elrendeződésű, háromdimenziós rendszer (ld. később). E tulajdonság adja a flagelláris filamentumokkal érzékenyített felületek egyik előnyét a kétdimenziós rétegekkel szemben, hiszen a vizsgált oldat e háromdimenziós szerkezetet térfogatában járhatja át. Hullámvezetőalapú érzékelők ígéretes jelátalakítói az ilyen rendszereknek, tekintve, hogy érzékenységük kiváló, s a felületi réteget vizsgáló evaneszcens mező(ld.: „13. 5. Hullámvezetés izotróp közegben”) karakterisztikus vastagága tág határok között (~ 100 nm-től ~ 1000 nm-ig) hangolható [57, 60], így a filamentáris rétegnek megfelelően optimalizálható. A flagelláris filamentumok előnyös tulajdonsága továbbá, hogy gyorsan és költséghatékony módon termeltethetőek baktériumokkal, melyekről azután a sejtek feltárása nélkül leválaszthatóak. Elkülönítésükhöz nem szükségesek olyan bonyolult tisztítási és szűrési folyamatok, melyek például az antitest felismerőelemek előállítását jellemzik. Fontos előnyös tulajdonságuk – például a mikrotubulus vagy más biopolimer rendszerekkel szemben – a rendkívüli kémiai stabilitásuk. Ennek „évmilliárdos

28

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez oka”, hogy a baktériumok olyan ostorokat, azaz flagellumokat fejlesztettek ki, melyek ellenállnak az őket körülvevőkörnyezet szélsőséges viszonyainak is. Megbízható, gyakorlatban jól használható bioszenzorok előállításának egyik fontos kritériuma, hogy ellenőrzött módon, jó minőségűfelismerőelem vékonyrétegeket hozzunk létre a jelátalakító érzékelőfelületén. Egyedi, ismeretlen minőségűrétegek ugyanis, csak kvalitatív mérésekre alkalmasak, mennyiségi meghatározásra biztosan használhatatlanok. Kiváltképp így van ez az egyszer használatos érzékelőrétegek esetén. Ott ugyanis még az a lehetőségünk sincsen meg, hogy kalibráljuk ezeket. Rendkívül fontos tehát, egy olyan eljárást kifejlesztenünk, mely minősíteni tudja az előállított rétegeket. Amennyiben e feladat ellátására sikerülne egy alkalmas módszert kidolgoznunk, segítségével nem csupán a fehérjeréteg érzékelő felületre való leválasztásának (immobilizációjának) eredményéről mondhatnánk objektív véleményt, hanem mint visszacsatolásnak a felület kémia paramétereinek optimális beállításában is pótolhatatlan szerepe lenne.

6. 1. Ex situ felületanalízis Flagelláris filamentum alapú biológiai érzékelőrétegek fejlesztése során az egyik legfontosabb kérdés az, hogy a fehérjeszálak – az immobilizációt követően – milyen felületi tömegsűrűség mellett helyezkednek el az érzékelőfelületen. Ennek megválaszolására alkalmasak lehetnek olyan lokális méréstechnikák, mint például az atomerőmikroszkópia (ang. atomic force microscopy - AFM) és a pásztázó elektron mikroszkópia (ang. scanning electron microscopy SEM) is. Járható útnak tűnik az a lehetőség, hogy az 6.1.-1. ábrához hasonló SEM illetve

a.)

b.)

6.1.-1. ábra: A flagelláris filamentumokkal beborított felületrő l készült a.) AFM és b.) SEM felvétel. (Az AFM képeket Dr. Osváth Zoltán, a SEM képeket Dr. Tóth Attila készítette.)

29

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez AFM felvételeket képfeldolgozó eljárás alá vessük. Ez esetben a nehézséget nem csupán a képfeldolgozás jelentené, hanem az is, hogy az anyagmennyiség kvantitatív, makroszkopikus felületméretre érvényes meghatározása e mikro-képek alapján problémás. Hátrányuk továbbá, hogy mindkét eljárás rendkívül idő- és költségigényes, illetve, hogy az ex situ vizsgálatokra történőelőkészítés, s maga a mérés is károsítja a mintákat. Önállóan tehát semmiképp sem alkalmasak a fentiekben megfogalmazott feladat rutinszerűellátására. Optikai módszerek alkalmazásával a flagelláris filamentumok alkotta rétegek minősége gyorsan, egyszerűen, rutinszerűen, nagymennyiségűminta esetén is, akár az érzékelőfelületre való immobilizáció közben is, nagy érzékenységgel mérhetőanélkül, hogy azok bármiféle károsodást szenvednének. A spektroszkópiai ellipszometria olyan nagyérzékenységű polarizációs optikai módszer, amely széles hullámhossztartományban globális információt nyújt a felismerőelem vékonyréteg szerkezeti paramétereiről: vastagságáról, sűrűségéről és akár

mélységbeli

és

laterális

homogenitásáról

is.

Ezen

integrális

méréstechnika

alkalmazásával megfelelőfelületanalízist remélünk megvalósítani, mely kulcsa lehet az érzékelők fejlesztésének és megbízható, reproduktív gyártásának. 6. 1. 1. Mintakészítés Immobilizáció A hordozóra porlasztott Ta2O5 film réteget kénsavas fürdőben megtisztítjuk, majd a 2,5 %-os 3-aminopropil-trietoxi-szilán (APTES) - ultratiszta víz oldatba mártva szilanizáljuk (6.1.1.1.a. ábra). Ezt követően szárítósütőbe helyezve 2 órán keresztül, 120°C-on szárítjuk a mintát. A szilanizált felszínt keresztkötővel, 2%-os glutáraldehid (GA) és 20 mM-os, 7.4-es pH-jú nátriumfoszfát puffer (PBS) oldatával kezeljük 20°C-on, ugyancsak 2 órán keresztül. Ennek során vízkilépéssel kovalens kötés jön létre az APTES nitrogénje és a GA egyik láncvégi

6.1.1.-1. ábra: A fehérje immobilizáció reakciólépései

30

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez szénatomja között (6.1.1.-1.b ábra). Ezek után a flagelláris filamentumokat (FF) PBS pufferben feloldva 0,3 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk. Ebben 17 órán keresztül áztatjuk a chipet. Ezalatt – a fentivel megegyezőreakcióban – a GA másik láncvége szintén kovalens kötést alakít ki a rögzíteni kívánt fehérjével (6.1.1.-1.c ábra). Az oldatból kiemelve ultratiszta vízzel leöblítjük a mintát. E vegyi folyamat után a 6.1.-2. ábrán látható vékonyréteg struktúrát kapjuk [65]. Hordozó választás A rácscsatolt interferométerben használatos hullámvezetők hordozó rétege átlátszó dielektrikum, amorf SiO 2, mely kedvezőoptikai és mechanikai tulajdonságai révén alkalmas eleme ezen egységeknek. Az ellipszometria szempontjából azonban kellemetlen választás, hiszen nem tekinthető félvégtelen közegnek. Az erre épített vékonyréteg-rendszer ellipszometriai spektruma, a hátoldali reflexió következtében, a függelék „13. 4. 1. Az ellipszometriai modellek alapjai” alfejezetében bemutatott matematikai módszert alkalmazó algoritmusokkal (csak úgy, mint az általunk használt WVASE 32 v.3.386 programmal) kiértékelhetetlen. E kellemetlenség orvosolható, ha valamilyen módon megszüntetjük a hátoldalról való fényvisszaverődést. Jelen kísérletsorozatban ezt úgy valósítottuk meg, hogy a hullámvezetőrétegszerkezetét módosítottuk: A minták egyik csoportjában az eredeti SiO2 hordozót szilícium hordozóra növesztett, ≈200 nm vastag, termikus SiO2-dal helyettesítettük, a másikban pedig csupán natív oxidréteggel rendelkezőszilícium hordozóra cseréltük. Az új hordozókra, a közönséges hullámvezetők gyártásával analóg módon, elektronsugaras porlasztással ≈200 nm vastagságú Ta2O5 hullámvezetőréteget gőzölünk. Ezt követően 3aminopropil-trietoxi-szilán (APTES) és glutáraldehid keresztkötő (GA) segítségével a flagelláris filamentumokat (FF) a Ta 2O5 film felületéhez rögzítjük. A szilanizálás

6.1.1.-2. ábra: A flagelláris filamentum felismerőelemekkel borított hullámvezetőszenzor vékonyréteg-struktúrája, és ennek szükséges módosítása a spektroszkópiai ellipszometirával történőszerkezetanalízishez.

31

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez idejét optimalizálandó, a két csoport hat-hat mintáját rendre 5, 10, 20, 30, 40, 60 perc szilanizálási időnek vetettük alá. Az eljárás a 6.1.1.-2. ábrán látható rétegszerkezetet eredményezi. A fenti kísérlet elvégzésével a következőkérdésekre kívántunk választ kapni: Alkotható-e optikai modell e rétegszerkezet ellipszometriai elemzéséhez? Ha igen, a modellel kapott értékek, milyen viszonyban állnak az irodalmi referenciaértékekkel? Milyen érzékenyen mérhetjük

e

rétegek

opto-geometriai

paramétereit?

A

kapott

értékekből milyen

következtetéseket vonhatunk le? Hatással van-e a termikus SiO2 réteg a mérés érzékenységére? Jellemzően mennyi az a szilanizálási idő, melynél több már nem növeli a megkötött filamentumok számát? Feladatom egy olyan optikai modell megalkotása volt, mellyel a fentiekben ismertetett vékonyréteg-rendszerről készült ellipszometriai spektrumok egyértelműen kiértékelhetők, illetve, hogy a kapott paraméter értékek megfelelőösszegzésével választ adjak az előbbi kérdésekre. Az eredmények vegyészeti értelmezése nem volt része a feladatkörömnek. 6. 1. 2. Modellalkotás és spektrum kiértékelés A fentiekben ismertetett vékonyréteg-rendszer Sopra ES4G ellipszométerrel, 75°-os beesési szög mellett, 320 - 720 nm-es hullámhossztartományban mért spektrumainak analízisére nem csupán egyetlen optikai modellt gondolhatunk alkalmasnak. Azt, hogy ezek közül mégis melyik a legmegfelelőbb kiértékelési mód, az illesztőprogram által számított paraméterek hibáinak nagysága és az illesztés minőségét megadó MSE* (mean square error – négyzetes középhiba) értékek összehasonlításával dönthetjük el. Az előbbiből elsősorban arra következtethetünk, hogy a modellben szereplőváltozók mennyire korrelálnak. Az utóbbiak főleg a mért ,  spektrumokra való modellillesztés jóságát jellemzik. Mivel minden minta esetén, a gyártási folyamat – a Ta2O5 réteg felületre való porlasztását követő– minden egyes

___________________________________________________________________________ * MSE (mean square error – négyzetes középhiba) N  meas calc meas calc 1  j j j j  MSE     meas meas  N P 1 j 1  j  j 

        

ahol N az ellipszometriai mérés során az adott hullámhosszon vett független leolvasások száma, P a modell ismeretlen paramétereinek mennyisége, meas , meas a mért, ellipszometriai szögek,

calc , calc a modellből számolt

meas pedig a független mérések eredmények szórása. Az 10 alatti MSE értékkel

jellemezhetőillesztést szokás a szakirodalomban kiválónak nevezni.

32

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez fázisa utáni állapotról készült spektroszkópiai felvétel, a kiértékelés során lehetőségem volt lépésről-lépésre haladni. Így tehát először a {Si - termikus/natív SiO2 - Ta2O5} struktúra spektrumait elemeztem, majd a későbbieket már ezek rögzített paraméter értékeinek ismeretében vizsgáltam tovább. A már megkapott részeredményeket előre görgetve segíthető az újabbak biztosabb meghatározása. Ezzel egy sokváltozós rendszer – több független mérés bevonásával – kisebb paraméterbizonytalansággal értékelhetőki. Érdemes a kiértékelést a {Si - natív SiO2 - Ta2O5} mintákról készült spektrumokkal kezdeni. Itt ugyanis a natív oxid réteg vastagságáról jogosan feltehetjük, hogy lényegesen kisebb, mint a Ta 2O5 rétegé, ezért a spektrumot a két szélsőanyag fogja meghatározni. A modell alkotás során először az irodalmi törésmutató adatokra, azaz a tömbi anyagokon végzett referenciamérésekre támaszkodtam, azonban az ezekkel történőillesztés hatalmas MSE értékre vezetett. Ez azt az elképzelést erősíti meg, hogy a gőzölés amorf Ta2 O5 réteget hoz létre a hordozó felszínén, így nem illeszthetők rá az irodalmi, kristályos Ta2O5-ra vonatkozó referencia értékek. Az irodalmi Ta2O5 rétegmodellt egy általános, szilárd, izotróp szigetelőkre vonatkozó Cauchy dielektromos függvénnyel* (ld.: „13. 4. 2. Fontosabb ellipszometriai rétegmodellek”) helyettesítetve az illesztések MSE értékei lezuhantak, míg az illesztett paraméterek érzékenységei nem romlottak (a paraméterillesztés hibája nem növekedett), továbbra is 0,1 - 0,5 % között maradtak. Ezek után következhettek azok a minták, melyek natív helyett termikus oxidréteget tartalmaztak. Az oxidréteg modellezésére az irodalmi SiO 2 referencia értékeket használtam fel, mellyel ennek tipikus vastagságára 216,4 ± 5,9 nm-t kaptam. E mintákon mért átlagos Ta2O5 rétegvastagság és a hullámvezetőtechnikákban érdekes, He-Ne lézer fényforrások 632,8 nm-es hullámhosszán mért átlagos Ta2O5 törésmutató érték a natív oxid alapúakéval egybe esett. Ezen értékek rendre 186,2 ± 2,2 nmnek és 2,136 ± 0,019-nek adódtak. A 6.1.2.-1. ábrán egy-egy tipikus illesztés eredményét láthatjuk. Az imént kapott paraméterek és azok hibái alapján megállapíthatjuk, hogy az elektronsugaras porlasztással történőTa2O5 rétegleválasztás jól kézbentartott, megfelelően precíz eljárás, mely

___________________________________________________________________________ *A függelék 13. 4. 2. alfejezetében részletesen tárgyalt Cauchy függvény elsőhárom tagját tartjuk meg, a többit elhanyagolhatóan kicsinek tekintjük. Ezzel az egyszerű sítéssel a Cauchy dielektromos függvény a következő alakot ölti:

B B n  B0  21  42   Az illesztendőparaméterek: B 0, B1, B2

33


b.)

6.1.2.-1. ábra: A natív (a.) és a termikus (b.) oxidrétegeket tartalmazó minták spektrumai és az illesztett optikai modell. (A szaggatott vonalak a kísérleti, a folytonosak a számított spektrumot jelölik.)

során amorf, magas törésmutatójú vékonyréteg kerül a hordozó felszínére. Mindez a hullámvezetőalapú érzékeléstechnikák szempontjából azért rendkívül fontos eredmény, mert amorf anyagban

nincsenek

kitüntetett irányok,

melyek

esetleg a

módusterjedést

befolyásolhatnák, illetve a magas törésmutató tágabb tartományokban való érzékelést tesz lehetővé (ld.: „7. Rácscsatolt interferométer”). Annak következményeképp pedig, hogy egy, a fényabszorpciót figyelmen kívül hagyó optikai rétegmodellel illeszthetőa mintáról készült spektrum a következőt állíthatjuk: bár amorf anyagban a direktátmenetnél lévőabszorpciós csúcs kiszélesedik, itt fotonenenergiában még mindig annyira távol vagyunk a tiltott sávtól, hogy elhanyagolható az elnyelés. Ilyen hullámvezetőrétegek alkalmazásával tehát kis veszteségűmódusterjedés valósítható meg. A gyártási folyamatban következő, szerves anyagok esetén irodalmi referenciákra nem támaszkodhatunk, így célravezetőnek az látszott, ha ebben az esetben is Cauchy függvényt alkalmazunk a rétegek opto-geometriai paramétereinek meghatározására. Már az első illesztések után világossá vált, hogy az APTES film vastagsága oly kicsi, valamint optikailag annyira összeolvad az alatta található Ta2O5 filmmel, hogy mint önálló réteg nem értékelhető. Ha ezt mégis megpróbáljuk, a modell-paraméterek bizonytalansága olyannyira megnő, hogy bármineműkövetkeztetés értelmetlenné válik. A következőmegoldást választottam tehát: változatlannak feltételezett SiO2 vastagság mellett az előbbi, {Si - SiO2 - Ta2O5} rétegrendszerre alkalmazott modellt illesztettem a soron következő{Si - SiO2 - Ta2O5 APTES} struktúra spektrumára is. A paraméterek hibái így rendre 1% alá kerültek, valamint az illesztés minőségét jellemzőMSE értékek szigorúan mérve is elfogadhatóak maradtak továbbra is. E modellel azonban az APTES réteg vastagságát (csak) úgy becsülhetjük, ha az

34

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez 6.1.2.-I. táblázat: Natív és termikus oxidréteg alapú {Si - SiO2 - Ta 2O5 - APTES} vékonyréteg-szerkezetek

spektrumának

kiértékelésébő l

kapott

átlagos

APTES

rétegvastagságok (dAPTES) , illetve a Cauchy réteg megváltozott törésmutató értékei.

Mintacsoport

dAPTES

n Ta2O5 - APTES (632,8 nm)

MSE

{Si - natív SiO2 - Ta 2O5 - APTES}

0,7 ± 0,1 nm

2,122 ± 0,003

11

{Si - termikus SiO2 - Ta 2O5 - APTES}

-0,2 ± 0,2 nm

2,141 ± 0,005

26

újonnan kapott paraméterértékekből kivonjuk a régieket. A törésmutató esetében azonban csak a teljes Cauchy rétegbeli átlagos megváltozását detektálhatjuk. Mindezek alapján a 6.1.2.-I. táblázatban összefoglalt eredményekre jutottam. Az APTES réteg vastagsága a natív oxidos minták esetén átlagosan 0,7 nm, ami egybe esik a monomolekuláris APTES film irodalmi vastagságával [66] A termikus oxidréteg alapú minták esetén azonban ez az érték negatívnak adódik. Ebből arra következtethetünk, hogy valamilyen ismeretlen oknál fogva, a szilanizálási eljárás következményeként, a termikus oxid réteg tulajdonságai megváltozhatnak, melyet az illesztés a felette lévő réteg vastagságának csökkentésével kompenzál. Dr. Hámori András – hullámvezetőchipeken végzett – OWLS mérései is megerősítették azt az állítást, miszerint a termikusan hőkezelt minták szilanizálása esetén – annak ellenére, hogy a felületen rétegépülés történik – a négyrétegű modell módusegyenletével számolt adlayer vastagságra negatív értéket kapunk. (6.1.2.-2. ábra) E furcsa paradoxon magyarázatára vegyész kollégáim számos teóriát is megvizsgáltak, azonban a jelenség oka mindmáig megválaszolatlan maradt.

a.) 0.2

b.) 0.2

SE mérések:

0.1

OWLS mérések:

0.0

-0.1

d A / nm

d / nm

0.0

-0.2

-0.2 -0.4

-0.3

-0.6

-0.4 -0.5

-0.8 0

10

20

30

40

50

1

60

2

3

4

Mintaszám

Szilanizálás idõtartama / perc

6.1.2.-2. ábra: Termikus oxid alapú minták esetén, az APTES rétegek vastagságára kapott értékek grafikus ábrázolása. a.) SE mérések illetve b.) OWLS mérések alapján.

35

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez A gyártási folyamat következőfázisa, mikor a mintákat GA keresztkötővel kezeljük. Ennek során ugyancsak egy optikailag nehezen elkülöníthető, monomolekuláris réteg épül a felületre, következésképpen a modell és a vele való spektrumkiértékelés menete teljesen megegyezik az előzőlépésben tárgyaltakkal. Az ide vonatkozó eredményeket a 6.1.2.-II. táblázat foglalja össze. Láthatjuk, hogy az átlagos rétegvastagságok a natív és termikus oxidréteg alapú minták esetén ugyan nem egyeznek, de rendre pozitív értéket vesznek fel. Ez az eltérés vélelmezhetően még a fentiekben tárgyalt effektussal függhet össze. Pontos kémiai magyarázatot ez esetben sem kaptunk. 6.1.2.-II. táblázat: Natív és termikus oxidréteg alapú Si - (SiO2 ) - Ta 2O5 - APTES - GA vékonyréteg-szerkezetek spektrumának kiértékelésébő l kapott átlagos GA rétegvastagságok (dGA) illetve a Cauchy réteg megváltozott törésmutató értékei.

Mintacsoport

dGA

n Ta2O5 - APTES - GA (632,8 nm)

MSE

{Si - natív SiO2 - Ta 2O5-APTES - GA}

0,7 ± 0,2 nm

2,120 ± 0,004

18

{Si - termikus SiO 2 - Ta 2O5 - APTES - GA}

0,2 ± 0,1 nm

2,143 ±0,008

25

Elérkeztünk a kiértékelés utolsó szakaszához, a flagelláris filamentumok rögzítése után mért spektrumok

elemzéséhez.

Amennyiben

feltesszük,

hogy

a

fehérjeréteg

optikailag

elválasztható az alatta található rétegektől, érdemes egy újabb Cauchy dielektromos függvényt beépítenünk a fentiekben alkalmazott rétegmodellbe. Amennyiben ezt nem feltételezzük, élhetünk a fentiekben már jól bevált eljárással, mikor ugyanazzal a modellel illesztve a spektrumokat az új és a régi paraméterek összehasonlításából próbálunk következtetéseket levonni. A kiértékelés során mindkét lehetőséget megvizsgáltam, s a következőkre jutottam: A filamentumréteget külön Cauchy függvénnyel modellezve kisebb MSE és jól elkülönülő törésmutató értéket kaptunk. A fentiek eredményeképp levonhatjuk azt az egyértelművégkövetkeztetést, miszerint ezen összetett jelátalakító - felismerőelem rétegszerkezetről készült ellipszometriai spektrumok elemzéséhez Si - SiO2 - Cauchy - Cauchy modellt érdemes használni. A 6.1.2.-3. ábrán e modellel való illesztés egy-egy jellemzőeredményét láthatjuk. Az illesztések tipikus hibáját és a modell paraméterek jellemző bizonytalanságát elemezve arra jutottam, hogy az ellipszometriai mérések a natív oxidos minták esetén érzékenyebbek.

36


b.)

6.1.2.-3. ábra: A {Si - SiO2 - Ta 2O5 - APTES - GA - FF} vékonyréteg-struktúrák esetén a legjobb optikai modellnek a Si - SiO2 - Cauchy - Cauchy rétegmodell-szerkezet bizonyult. Az ezzel történőillesztés egy jellemzőeredményét figyelhetjük meg az ábrákon a.) natív oxid alapú és b.) termikus oxid alapú minták esetére.

A szilanizálási idő, mint fontos technológiai paraméter hatását is vizsgálhatjuk, amennyiben a kapott rétegvastagságokat a kezelés idejének függvényében ábrázoljuk. (6.1.2.-4. ábra) Láthatjuk, hogy egy-egy pont kivételével a rétegvastagságok jó közelítéssel azonosak, tehát nem függnek a szilanizálás időtartamától. Mivel a két sorozatot összevetve a két kiugró pont helyzete nem mutat semmiféle tendenciát, mintakészítési hibának tekinthetjük ezeket. Ezeket elhagyva elmondható, hogy az immobilizációs eljárás során készített érzékelőrétegek – legalábbis azonos típusú hordozók esetén – jól reprodukálhatók, a rétegépítés vastagságbizonytalansága 3% alatt van. Az egyedi vastagság és törésmutató értékek az 6.1.2.-III. táblázatban látható átlagokra vezetnek.

Si - SiO2 - Ta2 O 5 - APTES - GA - FF Si - Ta2O 5 - APTES - GA - FF

FF réteg vastagsága / nm

18

16

14

12

10

8

0

10

20

30

40

50

A szilanizálás idõtartama (perc)

6.1.2.-4. ábra: FF rétegvastagságok a szilanizálási időfüggvényében. Egy-egy kiszóró pont kivételével a vastagságok érzéketlenek a szilanizálás id ő tartamára.

37

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez 6.1.2.-III. táblázat: A 6.1.2.-4. ábrán látható két kiugró pontot elhagyva, a FF rétegek átlagos paraméterei láthatók a lenti táblázatban. Mintacsoport

dFF

n FF (632,8 nm)

MSE

{Si - natív SiO2 - Ta 2O5 - APTES - GA - FF}

14,2 ± 0,4 nm

1,411 ± 0,022

6

{Si - termikus SiO2 - Ta 2O5 - APTES - GA - FF}

10,5 ± 0,2 nm

1,526 ± 0,013

42

A natív oxidréteg alapú minták esetében vastagabb, de kisebb törésmutatójú fehérjeréteg épül a minta felületére, mint a termikusak esetén. Mivel a törésmutató a réteg tömörségével arányos mennyiség, elmondhatjuk, hogy natív oxidos minták esetén ritkább közeget kaptunk. Ennek kémiai magyarázatát még nem sikerült megtalálnunk, azonban feltételezhetjük, hogy ez is visszavezethetőa szilanizálás során bekövetkezőoptikai tulajdonság-változásra. A felületre levált anyag mennyisége arányos rétegvastagságának és törésmutatójának szorzatával [67]. Bár az arányossági tényezőesetünkben nem ismert, a két mintacsoportra jellemzőszorzatok hányadosából meghatározható az anyagmennyiségek aránya, melyre nagyon jó közelítéssel 1-et kapunk. Ennek tükrében kijelenthetjük, hogy a felületre leválasztott anyag mennyisége azonos a kétféle hordozó esetén. Megjegyzendő, hogy Dr. Kurunczi Sándor vizsgálatai arra engedtek következtetni, hogy a filamentumok valóban kovalens kötéssel rögzülnek a felülethez. Ezt úgy sikerült bizonyítania, hogy a kész chipek felszínét detergenses, 0,1 M HCl, illetve 8 M urea oldattal való kezelést követően ellipszométerrel visszamérve, jelentős változást nem tudott kimutatni a fehérjeréteg vastagságában.

6. 2. In situ felületanalízis Az előzőalfejezetben megmutattam, hogy a spektroszkópai ellipszométerrel mért spektrumok a kifejlesztett optikai modellel kiértékelve választ adhatnak számos, a felismerő elem vékonyréteg minőségére vonatkozó kérdésre. Az eddigiek nem hangsúlyozott egyik hiányossága azonban az volt, hogy a fehérjeréteget csupán a leválasztás végeztével, ex situ volt módunk minősíteni. A leválasztás közbeni ellenőrzés azonban lehetőséget adna a fehérje oldatbeli vizsgálatára. Valós idejű mérésekkel pedig tanulmányozhatnánk a rétegépülés kinetikáját, valamint a kívánt felületi tömegsűrűséget elérve azonnal megszakíthatnánk az immobilizációt. Ezzel jelentékeny mértékben csökkenthetnénk a selejtek számát, javíthatnánk az ismételhetőséget és így a megbízhatóságot is. A Sopra ES4G készülék ≈20 perces spektrum mintavételezési ideje azonban nem teszi lehetővé az ilyen jellegűvizsgálatokat.

38

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez A 2009-es év legelején az MFA Fotonika osztályán üzembe helyezték az akkor kereskedelmi forgalomban elérhető, legkorszerű bb spektroszkópiai ellipszométer típusok egyikét, a Woollam cég M2000DI típusú forgó kompenzátoros műszerét [68], mely számos tekintetben felülmúlja az addig használt Sopra ES4G készüléket. Ezek közül csak néhányat említve: A fejlesztő mérnökök az eszköz fényforrás és detektor fejeit automatikus goniométerre rögzítették, így 40°-90°-os beesési szögtartományban az ellipszométer átszerelése nélkül, gyorsan és könnyedén mérhetünk. Automatikus kollimátora segítségével a mintapozicionálás pillanatok műve. Kombinált fényforrása révén sokkal szélesebb, 190 nm - 1700 nm-es hullámhossztartományban vehetünk fel ellipszometriai spektrumokat. A legfontosabbak azonban, hogy nagy mintavételezési sebességének (≈2 másodperc) köszönhetően akár valós idejűvizsgálatokra is alkalmazhatjuk, illetve, hogy forgó kompenzátora révén érzékenyebb mérésekre képes. A készülékhez tervezett 5 ml űrtartalmú folyadékcella segítségével akár in situ folyamatkövetés is végezhetővele. A cella üvegablakainak mérést befolyásoló hatása a gyártó által javasolt CompleteEASE v.3.79 program segítségével kikompenzálható. A szoftver képes továbbá az átlátszó hordozók hátoldaláról való fényvisszaverődést számításba venni, így a jelátalakítókban használt, amorf SiO 2 alapú hullámvezetőkön való trükkös módosítások nélkül is mérhetünk.

6. 2. 1. Előkészületek az in situ kísérletekhez Elsőként fontos volt megvizsgálnom, hogy az új ellipszométer valóban alkalmas-e arra, hogy az átlátszó hordozóra leválasztott film opto-geometriai paramétereit is meghatározza. Új mintákat készítettünk, ezúttal a közönséges hullámvezetőchipekben használatos, amorf SiO2 (Suprasil-1 olvasztott szilika), illetve referenciaként {Si - termikus SiO2} hordozókra gőzöltettünk az előzővel azonos, ≈200 nm vastag Ta2O5 hullámvezetőfilmet. A szilícium hordozókra növesztett termikus SiO2 vastagságát előzetes szimulációk alapján ≈20 nm-nek választottuk meg annak érdekében, hogy a lehetőlegérzékenyebb ellipszometriai méréseket végezhessünk a kapott mintákon. Az öt-öt mintát rendre az ellipszométer tárgyasztalára helyeztem, majd ezekről 65°, 70°, 75°-os beesési szögek mellett spektrumot készítettem. A szilícium alapú hordozók esetére természetesen alkalmazható az előző alfejezetben bemutatott Si - SiO2 - Cauchy modell. Az átlátszó hordozók spektrumainak kiértékeléséhez azonban új modellt kellett keresnem. Mivel az amorf SiO2 dielektrikum, érdemes ismét csak a Cauchy függvénnyel próbálkoznunk. Az így megállapított Cauchy - Cauchy modell segítségével bekapcsolva a program beépített funkcióját, mellyel a hátoldali reflexiót figyelembe vehetjük, kiváló egyezést találtam 360 nm-es hullámhossz érték felett a számolt és 39

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez mért spektrumok között. A későbbiekben olvasható korlátok miatt a méréstartományt mégis 360 - 1000 nm-nek javasoltam. A Woollam ellipszométer nagyobb érzékenységének következtében a minta felszínén található néhány nanométer vastag felületi érdesség is elkülöníthetőoptikailag. Ennek modellbeli figyelembevételével a számolt és mért spektrumok egyezése tovább javítható. Az ily módon felépített optikai modellek alkalmazásával kapott tipikus illesztések a 6.2.1.-1. ábrán láthatók. A szilícium hordozóra növesztett termikus oxid réteg öt mintára vett átlagos vastagságára 16,80 ± 0,45 nm-t kaptam, az amorf SiO2 hordozó átlagos törésmutatóját 1,486 ± 0,006-nak állapítottam meg, melyek jól egyeznek a gyártó által megadott értékekkel. Az egyes paraméterek bizonytalanságát tipikusan legalább egy nagyságrenddel kisebbnek találtam, mint azok átlagérték körüli szórását. Az illesztés hullámvezetőrétegre vonatkozó paramétereit a 6.2.1.-I. táblázat foglalja össze, mely alapján kijelenthető, hogy a két mintatípus esetére kapott vastagság és törésmutató értékek hibahatáron belül egybeesnek. A tipikus MSE értékek jól tükrözik az illesztések kiváló minőségét.

a.)

b.)

6.2.1.-1. ábra: a.) {Si - SiO2 - Ta 2O5} b.) {amorf SiO2 - Ta 2O5} minták mért spektrumai (minden hetedik mért Ψ-t fekete, Δ-át szürke o szimbólumok jelölnek), illetve a Si - SiO2 Cauchy és SiO 2 - Cauchy modellekkel való illesztés eredményei (fekete és szürke vonalak)

6.2.1.-I. táblázat A hullámvezető és a referencia minták spektrumaiból a megadott modellekkel kiértékelt Ta 2O5 filmre vonatkozó átlagos paraméterértékek és ezek szórásai. Az illesztések hibáját az utolsó oszlop tartalmazza. Mintacsoport

dTa2O5

n Ta2O5 - APTES (632,8 nm)

MSE

{Si - termikus SiO 2 - Ta2 O5}

190,27 ± 0.99 nm

2,128 ± 0,002

3,5

{amorf SiO2 - Ta2 O5}

189.34 ± 0.93 nm

2,134 ± 0,005

5,9

40

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Megjegyzendő, hogy a hullámvezetőmodellstruktúrát SiO2 - Cauchy-ra cserélve jelentősen rosszabb egyezést találunk a mért és számított spektrumok között. A megadott beesési szögek helyett 55°, 60°, 65°-nál mérve számottevően kisebb érzékenységgel határozhatjuk meg a paraméterek értékeit. Második lépésben a hordozókat a 75°-os beesési szögre tervezett, 5 ml űrtartalmú Wollam folyadékcella alá helyeztem (6.2.1.-2. ábra), s vizsgáltam a két kvarc ablak mérést befolyásoló hatását. A cella azonban olyan jó minőségűkvarc ablakokat tartalmaz, hogy a kiértékelő programba épített, a folyadékcella hatását kompenzáló funkciót (delta offset) az illesztés minőségének megtartásához nem szükséges bekapcsolnunk.

6.2.1.-2. ábra: Folyadékcella sematikus képe a spektroszkópiai ellipszométer vizsgáló fénynyalábjának megjelölésével [68 ].

A {Si - SiO 2 - Ta2O5} típusú hordozókat a folyadékcellába helyezve, s azt PBS oldattal feltöltve újra felvettem a spektrumokat. A 6.2.1.-3.a. ábrára tekintve láthatjuk, hogy hozzávetőlegesen 1100 nm-es hullámhossz felett a mért spektrum fokozódó amplitúdóval oszcillálni kezd. Ennek oka, hogy a feltöltött cellán áthaladó infra tartománybeli sugarak intenzitása útjuk során a detektor érzékenysége alá csökken. Mivel az ellipszométer két külön detektorral méri a ≈1000 nm felett és alatt a beesőfényintenzitást, a nagyobb megbízhatóság érdekében, a mérési tartományt érdemes 360 - 1000 nm-nek megválasztani. A spektrumok kiértékelésekor feltétlenül figyelembe kell vennünk, hogy a minta felületének környezete levegőről PBS oldatra változott. Mivel a PBS oldat törésmutatója nem azonos a tiszta vízével (ld.: „8. Rácscsatolt interferométer”) nem alkalmazható annak referencia törésmutató sorozata. Ismét csak a kis diszperziójú közegre általánosan használható függvény, a Cauchy modell az, mellyel a feladat kiválóan megoldható. (6.2.1.-3.b. ábra)

41


b.)

6.2.1.-3. ábra: A {Si - SiO 2 - Ta2O5} mintákat PBS-sel feltöltött folyadékcella alá helyezve, majd az ellipszometriai spektrumukat megmérve az a.) ábrán látható görbékhez jutunk. b.) A hullámhossz tartományt a 360 - 1000 nm-es intervallumra korlátozva, a spektrumok kitűnő en illeszthető k.

Azonban átlátszó hordozók esetén a kiértékelés koránt sem ennyire zökkenőmentes. Feltöltött folyadékcella mellett mért spektrumok az előzőesetre alkalmazott modellel nem illeszthetőek. Ennek oka, hogy levegőhelyett PBS oldat határolja a minta felületét, tehát a minta felszín és a környezet törésmutatójának különbsége több mint három tizeddel csökken. Bár optikailag a két közeg továbbra is elkülöníthetőlenne egymástól, a program beépített funkciójával a hátés előoldali reflexiók nem választhatók szét. Kétfajta módszer kínálkozik e probléma megoldására. Az első, mikor a hátoldali reflexió detektorba való bejutását szüntetjük meg: a hordozóra alulról félvégtelennek tekinthetőközeget illesztünk vagy megnöveljük a hordozó vastagságát annyira, hogy a hátoldali reflexió pusztán geometriai okokból ne juthasson a detektorba. Ez utóbbi kivitelezhetőpéldául úgy, ha egy vastagabb üveglemezt – UV-ra keményedő törésmutató illesztő folyadékkal – a hátoldalra illesztünk. Az így mért spektrumokra való (fentiekben bevezetett) Cauchy - Cauchy modell illesztés sikerét a 6.2.1.4.a. ábra mutatja. (Megjegyzendő, hogy természetesen itt is figyelembe kell vennünk a kiértékeléskor, hogy a környezet PBS oldat.) A második módszer, mikor a kiértékeléskor próbáljuk orvosolni a fenti problémát. Erre egy lehetőség, mikor a modellt úgy módosítjuk, hogy a filmet leíró Cauchy függvényt egy megfelelően rugalmas függvényre, például ún. B-Spline függvényre [69] cseréljük. Ez esetben az illesztés a 450 - 1000 nm-es tartományban kiváló MSE érték mellett megtehető. (6.2.1.-4.b. ábra) További, a hullámvezető filmre épülő rétegek paraméterei a modellben új

42


b.)

6.2.1.-4. ábra: Az átlátszó hordozó hátoldaláról visszaverő dőfény kiértékelést nehezítő hatása kiiktatható, ha a.) a hordozó hátoldalára eg y vastagabb üveglapot rögzítünk majd az így mért spektrumot Cauchy - Cauchy modellel illesztjük, illetve, b.) ha B-Spline függvényt alkalmazunk a Ta 2O5-ot modellezőCauchy függvény helyett.

rétegek figyelembevételével bár nem bizonyítottan megbízhatóak, azonban becslésnek mindenképp megfelelőek. E módszerrel lehető ség nyílik átlátszó hordozók esetén is arra, hogy – az optikai modellt továbbfejlesztve – az ellipszometriai spektrumban rejlőinformációt integrálva, származtatott mennyiség(ek) változásaként adjuk meg (pl. fehérje réteg vastagsága, törésmutatója, felületi tömegsűrűsége). Ennek gyakorlati jelentőségét a „9. Rácscsatolt interferométer - spektroszkópiai ellipszométer kombinált összeállítás” című fejezetben láthatjuk majd.

6. 2. 2. In situ kísérletek Ahogy azt már a fentiekben említettem, a Woollam M2000DI ellipszométer nagy mintavételezési sebességének köszönhetően, folyadékcellát alkalmazva lehetőségünk van akár a flagelláris filamentum szálak felületre való leválasztásának in situ és valós idejűnyomon követésére is. Feladatom volt, hogy a mért spektrumok kiértékeléséhez optikai modelleket fejlesszek. Terjedelmi okok miatt azonban a fejlesztés menetét nem részletezem, csupán a legígéretesebb optikai modellt mutatom be a fenti hordozókra leválasztott filamentumok rendszerére. A fentiekben használt {Si - SiO2 - Ta2O5} szeletekből kiválasztottunk két mintát, majd közülük az egyik felületét a „6. 1. 1. Mintakészítés” című alfejezetében leírtaknak megfelelően aktiváltuk. Ezt követően a mintákat rendre folyadékcella alá helyeztem. Állandó pumpafordulat mellett pár percig PBS oldattal öblítettem át a cellát, majd 0,1 mg/ml

43

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez koncentrációjú flagelláris filamentum - PBS oldatra váltva megkezdtem a fehérjék felületre való leválasztását. Hozzávetőlegesen 105 perc elteltével a cellát újra tiszta PBS oldattal öblítettem át. A mért spektrumok kiértékelését az előzőalfejezetben tárgyalt eredményekre építettem. A fehérjeréteget leíró modell megalkotásakor előzetes tapasztalataimat használtam fel. Sopra ES4G készülékkel követett kísérleteink kiértékelésekor megmutattuk, hogy a leválasztott fehérjeréteg oldatban a környezet és a fehérje paramétereinek megfelelő Cauchy függvényeket kombináló effektív közeg közelítést alkalmazó modellel (ang. effective medium approximation - EMA, ld.: „13. 4. 2. Fontosabb ellipszometriai rétegmodellek”) alacsony MSE értékek mellett illeszthetők. Megmutattuk azt is, hogy két EMA rétegmodell egymásra helyezésével kvalitatív becslést tehetünk a flagellin szálak oldatbeli felületi struktúrájára [70]. Az alsó EMA réteg (EMA1) ugyanis egy tömörebb és vékonyabb réteget, míg a felső(EMA2) egy vastagabb és fehérjében ritkább közeget fedett fel. (6.2.2.-1. ábra) E kísérleteket azonban nem tudtuk valós idejűmérésekkel nyomon követni, valamint a két EMA réteg nem adott megfelelőfelbontást a struktúrát illetőmélyebb következtetések levonására.

6.2.2.-1. ábra: A felületre leválasztott flagelláris filamentumok feltételezett oldatbeli struktúrája [70].

Az új Woollam ellipszométer jobb teljesítőképessége (érzékenység, sebesség) következtében lehetőségünk

van arra,

hogy

számos

egymásra

helyezett

EMA

modellt csatolt

vastagságparaméterek mellett illesztve a spektrumokra (6.2.2.-2.a. ábra), rétegrő l-rétegre, in situ és valós időben meghatározzuk az ott érvényes tömegsűrűséget. Ehhez azonban (csak úgy, mint az előbbiekben is) fontos a fehérje törésmutatóját egy becsült értéken rögzítenünk, mivel e paraméter és az EMA modellben kombinált anyagok arányszáma erősen korrelál egymással. Ennek oka egyszerű: egy réteg effektív törésmutatója azonos értékre vezet,

44


6.2.2.-2. ábra a.) A baloldalt látható rétegszerkezet minő sítésére javasolt optikai modell, melyben a felületre leválasztott FF réteget számos EMA alréteg írja le, jobboldalt látható. Ahogy azt a b.) ábra mutatja, az EMA alrétegek számának növelésével javul az illesztés jósága (MSE csökken), illetve a fehérjeréteg számított vastagsága konvergálni látszik.

amennyiben

kisebb

törésmutatójú

közeget

nagyobb

mennyiségben

vagy

nagyobb

törésmutatójút kisebb mennyiségben keverünk az EMA második komponenséhez. A fehérje törésmutatóját az irodalomban javasolt értéknek megfelelően 1,45-nek választottam meg [71]. Mindenek előtt azonban fontos megvizsgálnunk, hogy a 6.2.2.-2.a. ábrán bemutatott optikai modell legfelsőrétegét hány EMA alrétegre érdemes felosztanunk. Ennek érdekében növelve az alrétegek számát a modell független térfogatszázalékait és a (csatolt) vastagság paramétert rendre a mért spektrumokra illesztettem. Az EMA alrétegek számának függvényében ábrázolva a kapott MSE-, illetve fehérjeréteg-vastagság értékeket (6.2.2.-2.b. ábra) láthatjuk, hogy az illesztés jósága javul az alrétegek számának növelésével. Ebből arra következtethetünk, hogy a fehérjeréteg végtelenül finom felosztása lenne egy ideális számítás alapja. Az alrétegek számával azonban csökken a rendszer stabilitása, azaz a paraméterek (kiértékelőprogram által számított) bizonytalansága nő. (Hat alréteg alkalmazásakor ez az érték már elfogadhatatlanul nagy.) E két ellentétes hatás optimumát öt alréteg alkalmazása esetén találtam meg. Mivel a számított fehérjeréteg-vastagság négy-öt alréteg esetén konvergálni látszik, feltételezhető, hogy ennyi már helyesen írja le a rendszerünket. A további kiértékelések során öt EMA alréteget alkalmaztam. A fenti elemzés után az alrétegek csatolt vastagságát érdemes rögzítenünk annak érdekében, hogy a szabad paraméterek számát, vele az eredményül kapott értékek bizonytalanságát tovább csökkentsük. A paraméterérték meghatározásakor azonban körültekintőnek kell

45


6.2.2.-3. ábra Az öt EMA alréteges optikai modellel való illesztés eredményét láthatjuk az a.) ábrán. A FF leválasztás elő tt mért spektrumot ○ jelek, míg az utána mért görbét □ szimbólumok jelölik ki. (Az ábrázolás áttekinthető ségének kedvéért csupán minden 5. mért adatpontot tüntettem fel.) A betétkép 632,8 nm -es hullámhosszon mért Δérték változását mutatja

a

leválasztás

idejének

függvényében.

Az

illesztésbő l

származtatott

paraméterértékekbő l kalkulált tömegsűrűség értékek változását a megjelölt alrétegekben a b.) ábra szemlélteti az időfüggvényében. Látható, hogy a felület közeli rétegekben (1, 2) az anyagmennyiség értéke jóval nagyobb, mint onnan távolodva (3, 4).

lennünk. Annak érdekében, hogy biztosak lehessünk abban, hogy a rendszert helyesen modellezzük, válasszuk meg ezt az értéket úgy, hogy a leválasztás során a legfelsőalrétegben (és csakis itt) mindvégig zérus fehérje térfogatszázalékot mérjünk. Ez az „ellenőrzőalréteg” biztosítéka annak, hogy a modell a fehérjeréteget minden időpillanatban, teljes vastagságában figyelembe veszi. Ennek megfelelően a csatolt vastagságparaméterek értékét 190 nm-nek választottam meg. A 6.2.2.-2.a. ábrán bemutatott, az előzőbekezdésekben vizsgált optikai modell tipikusan 8 alatti MSE érték és 0,06 % alatti paraméter-bizonytalanság mellett értékeli ki a fentiekben bemutatott rendszeren mért ellipszometriai spektrumokat. Az illesztés minőségét a 6.2.2.-3.a. ábra szemlélteti. Láthatjuk, hogy mind a leválasztást megelőzően, mind azt követően a modell kiválóan illeszkedik a mérés eredményeire. A mérés érzékenységéről elmondható, hogy a leválasztás során ∆ellipszometriai szög 632,8 nm-es hullámhosszon ≈20°-ot

változott

(6.2.2.-3.a. ábra betétképe), mely érték két nagyságrenddel nagyobb, mint a mérés azonos hullámhosszon számított zaja (≈0.1°). De Feijter eredményei alapján a felületre leválasztott fehérjék Γ tömegsűrűsége a következőképpen számítható: [67]

46

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez d

n n k dn / dc

,

(6.2.1.)

ahol d a vizsgált réteg vastagsága, n az effektív törésmutatója, nk a környezet törésmutatója, dn/dc pedig a fehérjeoldat törésmutatójának koncentrációra vett gradiense. Ez utóbbi értéke az irodalomból ismert, 0,18 cm3/g (a He-Ne lézer hullámhosszán, azaz 632,8 nm-en mérve) [67]. A tömegsűrűség időbeli változását a hordozó felületéhez közelebb eső, elsőnégy EMA alréteg esetére a 6.2.2.-3.b. ábrán követhetjük nyomon. Az ötödik alrétegben mért tömegsűrűség a mérés bizonytalanságán belül (6 x 10-3 μg/cm3) zérusnak mutatkozott. A könnyebb átláthatóság érdekében ez nem került ábrázolásra. Érdemes a fenti kiértékelést nem aktivált felületen is elvégezni. Ekkor az alrétegekben mérhetőtömegsűrűség értékeket összegezve összehasonlíthatjuk a flagelláris filamentumok különbözőmódon előkezelt felületekhez történőkötődésének kinetikáját. (6.2.2.-4.a. ábra) Látható, hogy az aktivált felület esetén mind a leválasztás sebessége, mind a leválasztott anyag mennyisége jelentős mértékben eltér a nem aktivált felület esetén mérhetőértékektől, mely igazolja, hogy a felületkémiának jelentős szerepe van a flagelláris filamentum alapú érzékelőchipek gyártásában. Ezt a megfigyelést az azonos mintákról készített AFM képek is megerősítették, mivel a felületi fedettség a fentiekkel összecsengőmódon különbözik a két esetben. (6.2.2.-4.b. ábra)

6.2.2.-4. ábra a.) A fentiekben bemutatott modellel számolt össztömegsűrű ség aktivált és nem aktivált felületűminták esetére. b.) Az azonos mintákról készített 1 μm x 1 μm-os eredeti AFM felvételek aktivált s nem aktivált esetekre (felsőkét ábra), illetve ezek Gwyddion v.2.14 programmal feldolgozott, fedettséget jobban szemléltetőváltozatai (alsó két ábra).

47


6. 2. 3. A fehérjeréteg szerkezetanalízise – egy lehetséges megoldás A 6.2.2.-3.b. ábrán bemutatott, a hordozó felületére merőleges (normális) irányú tömegsűrűség inhomogenitás összeegyezethető a 6.2.2.-1. ábrán bemutatott flagelláris filamentumok oldatbeli struktúrájára adott kvalitatív becsléssel, miszerint a felülethez rögzített filamentáris fehérjék orientációjuk szerint valószínűleg két csoportba sorolhatók: az elsőben ezek jó közelítéssel álló helyzetben, míg a másodikban többnyire a fekvőpozícióhoz közeliben találhatók. Érdemes alaposabban megvizsgálnunk, hogy ez a feltételezés valóban magyarázat lehet-e a tömegsűrűség sajátos mélységfüggésére. Ahhoz azonban, hogy az egyes alrétegekben mért tömegsűrűség értékekből a fehérjeréteg felületi struktúráját jellemzőparaméterekhez (fehérjeszálak jellemzőhossza, dőlésszöge, e paraméterek átlag körüli szórása) számadatokat rendeljünk, meg kell találnunk a kapcsolatot e mennyiségek között. Amennyiben sikerülne egy ilyen algoritmust megalkotnunk, nem csupán kvalitatív, hanem kvantitatív becsléseket is tehetnénk a réteget alkotó fehérjeszálak statisztikus elrendeződésére. A fentiekben kijelölt úton elindulva indokolt a 6.2.2.-3.b. ábrán látható görbék két szaggatott vonallal határolt szakaszára exponenciális függvényt illesztenünk, hogy a további számításokból ily módon kiiktassuk a mérést terhelőzajt. (Az illesztés jóságát, R2-et tipikusan 0,999 felettinek találtam.) További egyszerűsítésként, az illesztett exponenciális görbék amplitúdóját érdemes a legnagyobb értékkel, azaz az 1. alréteg amplitúdójával normálni, továbbá az ötödik réteg tömegsűrűség értékeit az előző alfejezet alapján minden időpillanatban egzaktul zérusnak tekinteni. Figyelembe kell vennünk, hogy minden időpillanatban csupán öt független adatpont áll a rendelkezésünkre, következésképpen hatékonyan csak a legegyszerűbb matematikai modelleket alkalmazhatjuk a felületet borító fehérjeréteg statisztikus jellemzésére. Az olyan modellek degenerációja ugyanis szükségszerű, melyek több független paraméterrel rendelkeznek, mint ahány független értéket a mérésünkben meg tudunk határozni. Ahhoz tehát, hogy a hiányzó információt pótoljuk, feltételezésekkel kell élnünk. A vizsgált rendszerünk esetén indokolt a következő közelítésből kiindulnunk: merev, rúd alakú flagelláris filamentumok hosszeloszlása monodiszperz Gaussos jelleget követ. E feltételezés alapja, hogy a flagelláris filamentumok protofilamentáris szerkezetükből adódóan valóban merev, csupán enyhén íves, hosszúkás szerkezetek [70], melyek élőpolimerizációs folyamat [72] során keletkeznek.

48

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Még a fenti közelítéssel élve is számos, a komplexitás széles skálájáról válogatott matematikai modellt építhetünk fel. Ezek közül az egyik legkevésbé összetett az, mely még azt is felteszi, hogy a flagelláris filamentumok a felületre merőlegesen (a z tengellyel párhuzamosan) kötnek ki a hordozóra. Ahhoz, hogy e modell paramétereihez értékeket rendeljünk, Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno (BFGS) optimalizációs módszerrel [73, 74, 75, 76, 77] illesszük a következőelméleti függvényt minden időpillanatban minden i-edik alrétegben (i = 1…5) a mért és normált tömegsűrűség értékre (az ehhez szükséges számítógépes algoritmust testvérem, Kozma Dániel fejlesztette ki):

 1 norm (i , l , , d , c ) c   2 (i  1 )d  2 id



( z l ) 2  2 2

e  z

 dz  dz ,  

(6.2.2.)

ahol l a flagelláris filamentumok hosszának várható értéke, σennek szórása, illetve c arányossági tényezőillesztési paraméterek, d az alrétegek vastagsága. A (6.2.2.) egyenlet meghatározza a tömegsűrűséget egy infinitezimális vastagságú rétegben (belsőintegrál), majd ebből számítja ki az i-edik alrétegre érvényes értéket (külső integrál). A numerikus gyökkeresést végrehajtva nem találtunk fizikai megoldást (negatív l értékeket kapunk vissza). Abban az esetben azonban, ha a (6.2.2.) egyenlet önmagával vett lineárkombinációját vesszük úgy, hogy a tagokat r1 és r2 értékekkel súlyozzuk (ahol r2=1-r1), a kiváló illeszkedés mellet (az illesztés hibája sok nagyságrenddel a spektrumkiértékelés hibája alatt van) fizikailag értelmezhetőeredményekre jutunk. Az illesztett egyenlet – normálva az 1. alrétegre érvényes paraméterezéssel – a következőalakban írható: r1(i, l1 , 1 , d ) (1 r1 )(i, l 2 , 2 , d ) norm (i , l1 ,1 , l 2 , 2 , d , r1 )  , r1 (i 1, l1 , 1 , d ) (1 r1 )(i 1, l 2 ,2 , d )

(6.2.3.)

ahol az illesztendőparaméterek a következők: l1, σ1, l2, σ fejlődését a 2, és r 1, melyek idő 6.2.3.-1.a. ábra mutatja be. Fontos észrevennünk, hogy a normálás során c paraméterrel egyszerűsítettünk, így a (6.2.3.) egyenletben szereplőismeretlenek száma megegyezik az alrétegek, azaz az ismert paraméterek számával. Mindeközben nem szabad megfeledkeznünk arról, hogy a vizsgált rendszert illetően a fentiekben

feltételezéseket

tettünk,

következésképpen

49

a

modellparaméterek

kiváló


6.2.3.-1. ábra Feltételezve, hogy a flagelláris filamentumok hosszeloszlása monodiszperz Gaussos, a mélységbeli tömegsű rű ség eloszlásból következtethetünk a fehérjeréteg statisztikus háromdimenziós struktúrájára. A modell l1, σ 1, l 2 és σ 2 paramétereinek idő fejlő dését az a.) ábrán láthatjuk. Amennyiben feltesszük, hogy az 1. csoport filamentumai fő ként a hordozóra merő leges helyzetben vannak, a 2. csoport flagelláris filamentumainak tipikus dő lésszöge (α) az időfüggvényében a b.) ábrán tekinthetőmeg. A két csoport modellbeli súlyfaktorainak aránya (r2 /r1), illetve a dő lésszög figyelembevételével korrigált valódi számarány (p 2/p1) idő beli változása rendre a c.) és d.) ábrákon követhetőnyomon.

illeszkedése mellett is a levont következtetések csupán becslésnek tekinthetők. Amennyiben azonban a kezdeti feltételezések jól közelítik a valóságot, helyes és fontos következtetéseket vonhatunk le a vizsgált rendszer szerkezetét illetően. Ebből kiindulva a modell elsőés nagyon fontos eredménye, hogy matematikai úton is sikerült alátámasztanunk azt a feltételezést, miszerint az immobilizált filamentumok két karakterisztikus csoportba oszthatók. Az a csoport, melyet kisebb szórás és nagyobb várható érték jellemez (1. csoport, l1, σ1) vélelmezhető, hogy a feltételezett orientációban (a felületre merőlegesen) köt a hordozóhoz. Mivel azonban monodiszperz rendszert feltételeztünk, nem magyarázható a 2. csoportra jellemzőnagyobb szórás (σ2) és jelentősen kisebb várható érték (l2) egyszerűen azzal, hogy

50

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez ezt rövidebb fehérjék alkotják. Az eltérésre az alapfeltevéssel konzekvens módon csupán az adhat magyarázatot, hogy ezek a szálak döntött helyzetben, a felülettel αszöget bezárva helyezkednek el a hordozón. Egyszerűelemi trigonometriai megfontolások alapján az átlagos dőlésszög becsülhető ( sin() l2 / l 1 ). (6.2.3.-1.b. ábra) A két csoporthoz tartozó szórásértékek jelentős különbségéből csupán arra következtethetünk, hogy a 2. csoport filamentumainak αszög szerinti szórása jelentősen nagyobb, mint az 1. csoporté. Ennél precízebb állítást nem tehetünk, hiszen a hosszeloszlás és a szögeloszlás nem választható ketté a fenti számítások alapján. A súlyfaktorok hányadosának ( r2 / r1 ) változását követve kiderül az is, hogy a két csoport aránya csupán enyhén függ az időtől. (6.2.3.-1.c. ábra) Mivel a flagelláris filamentumok hordozóval párhuzamos keresztmetszete nagyobb abban az esetben, ha ezek döntött helyzetben állnak, nagyobb súllyal szerepelnek a fenti kiértékelésben. Ahhoz hogy meghatározhassuk a két csoport valódi populáció arányát, r2 értékét (szintén elemi trigonometriai megfontolások alapján) le kell osztanunk d / cos() -val. Ezt figyelembe véve kapjuk, hogy a két csoport flagelláris filamentumainak valódi számaránya ( p 2 / p1 ) hozzávetőlegesen 1:1. (6.2.3.-1.d. ábra) A fenti illesztési paraméterekből természetesen kiszámítható a folytonos mélységbeli sűrűségprofil, melyet kiegészítve a fentiekben részletezett következtetésekkel lehetővé teszi, hogy a mérés bármely időpillanatában becslést adhassunk a felületi réteg háromdimenziós statisztikus szerkezetére is. A kísérlet 100. percében meghatározott sűrűségprofilt, s a belőle rekonstruált háromdimenziós struktúrát a 6.2.3.-2. ábra mutatja be. Jól látható, amint a

6.2.3.-2. ábra A modell által számított folytonos, normált mélységbeli tömegsű rű ség profil (baloldal), illetve az ennek alapján becsült háromdimenziós felületi struktúra (jobboldal). Az ábra a mérés 100. percében érvényes paraméterértékek figyelembevételével készült. (l1 =620,9 nm, σ1=32,4 nm, l2 = 175,5 nm, σ 2=92,1 nm and p2/p1=1:1,02)

51

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez fehérjeszálak két csoportra különülnek el; egy fekvőpozícióhoz közeli, s egy jellemzően álló filamentumokat tartalmazóra. Ezek az eredmények jól összecsengnek az előzetes SE és OWLS mérésekből levonható következtetésekkel [70, 78]. Annak érdekében, hogy a rétegépülést időben is vizsgáljuk, térjünk vissza a 6.2.3.-1. ábrához. Ahogy azt a 6.2.3.-1.a. és 6.2.3.-1.d. ábra mutatja, egy rövid kezdeti tranziens után a statisztikus paraméterek már csak lassan változnak: p2/p1 nő, míg l 1, σ1, l2, σ2 és αcsökkennek. Egy lehetséges magyarázat lehet a következő: a leválasztás során az 1. csoport flagelláris filamentumainak kis hányada elfekszik, ezalatt vagy emiatt a 2. csoport elemei egyre jobban közelítik a fekvőhelyzetet (6.2.3.-1.c. ábra), mely következtében egyre tömörebb és egyre kisebb σértékkel jellemezhető felületközeli régió jön létre. Pontosabb következtetések levonásához azonban további kísérletek szükségesek. Fontos megjegyezni, hogy pontosan azok a ritka, előnyös tulajdonságok, melyek kitűntetik az ellipszometriát a többi eljárással szemben, nehezítik meg a fenti eredmények más mérési módszerekével való összehasonlítását. Az a műszer ugyanis, mely hasonlóan fontos eredményekre képes mutatni a bemutatott rendszert illetően, a fehérje-leválasztást bizonyára nem csupán in situ tudja nyomon követni, hanem a formálódó rétegről mélységbeli információt is képes szolgáltatni. Bár az előbbi viszonylag könnyen megoldható más eljárások alkalmazásával is, az utóbbi rendszerint nehézségekbe ütközik; kvarc kristály mikromérleg, illetve pásztázó módszerek (pl.: AFM, STM, stb.) alkalmazásával csak körülményesen, vagy egyáltalán nem oldható meg ez a feladat, az evaneszcens módszerek (OWLS, DPI, SPR, stb.) –

eltekintve bizonyos speciális hullámvezető elrendezésektől [57, 60] –

csupán

hozzávetőlegesen 100 - 200 nm behatolási mélységgel, általában egyetlen hullámhosszon képesek vizsgálni a felületi vékonyréteget. Amennyiben pedig a mintánkat ex situ módszerekkel vizsgáljuk (pl.: AFM, STM, XRD, SEM, stb.) felmerül a kérdés, hogy vajon mi a kapcsolat az ex situ és in situ paraméterek között. Németh Andrea trükkös ötlete alapján megkíséreltük a flagelláris filamentumok hosszeloszlását AFM mérésekkel is meghatározni. Az ötlet lényege, hogy amennyiben a leválasztást csupán rövid ideig futtatjuk viszonylag kevés fehérje, egymástól távol köt ki a felületre. Az ilyen mintákról készített AFM képek (6.2.4.-1. ábra) – noha nem problémamentesen, de – kiértékelhetők a megfelelőképfeldolgozó eljárásokkal. Ennek eredménye jelentősen rövidebb várható értékkel és lényegesen nagyobb szórással jellemezhetőhosszeloszlásra mutatott (lAFM ≈400 nm és σAFM ≈210 nm), mint ahogy azt az ellipszometriai mérések alapján várnánk (lSE ≈620 nm és σSE ≈30 nm). Bár a szignifikáns eltérést számos ok indokolhatja, nem szabad megfeledkeznünk a következőeredményt 52

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez befolyásoló tényezőkről sem: az AFM méréseket megelőzően a mintákat ultratiszta vízzel öblítettük le, hogy a PBS oldat sójától (mely később a felületen kristályosodna ki) megszabadítsuk a felszínt, majd nitrogén gáz áramában szárazra fújtuk azt. E kezelés azonban a felületre kötött flagelláris filamentumok töredezésével, depolimerizációjával illetve részleges (esetleg méret függő) lemosódásával jár. Ezen kívül, az egymással átfedő filamentumok nehezítik, pontatlanná teszik a képfeldolgozást. Következésképpen a két mérés disszonanciája nem cáfolhatja az ellipszometriai eredményeket. Ehelyett világosság teszi, hogy milyen fontosak is az in situ és roncsolásmentes módszerek a nanobiológia területén.

6.2.4.-1. ábra Rövid FF leválasztási idő t követő en az ultratiszta vízzel öblített, nitrogén gáz áramában szárított mintáról készült AFM kép. A fehérjék orientációja a lemosási és szárítási fázisok következménye. Az AFM kép mérete: 10 μ m x 10 μm.

6. 3. Összefoglalás és kitekintés Jelen fejezet legjelentősebb eredménye, hogy rámutatott, a felületre leválasztott flagelláris filamentumokat nem csupán egyetlen rétegként tudjuk ex situ vizsgálni, hanem akár in situ és valós időben, felbontva azt számos rögzített vastagságú alrétegre követhetjük nyomon a rétegépülést. Ennek alapján nem csupán kinetikai vizsgálatokat végezhetünk, hanem a felülethez rögzített hosszú flagelláris filamentumok oldatbeli struktúráját is még mélyrehatóbban kutathatjuk. Mindennek jelentősége abban áll, hogy az új ismeretek birtokában az érzékelőfelületek tervezésekor az oldatáram számára elérhetőcélmolekula kötőhelyek számát meghatározhatjuk és tervezhetjük, mellyel segíthetjük a még célorientáltabb felismerőrétegek gyártását. Végül fontos megjegyezni, hogy olyan eljárás, mely képes azonos vagy hasonló rendszer mélységbeli sűrűségprofilját meghatározni, legjobb tudomásom szerint a szakirodalomban mindmáig nem ismert. 53

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Már majdnem elkészült Német Andrea kézirata is, melyben a molekula dinamika jellegű módszerre építő MATLAB algoritmusával kapott első eredményeit foglalja össze. Szimulációi a fentiektől függetlenül alátámasztani látszanak azt a 6.2.3.-2. ábrán bemutatott eredményt, mely szerint a felületközeli régiókban található, fekvőhelyzetű flagelláris filamentumok közül függőleges közeli orientációval jellemezhetőek emelkednek ki. Eredményeit várhatóan pár hónapon belül publikálja.

54


7. Rácscsatolt interferométer - refraktometria Jelen fejezet egy jelölésmentes, optikai érzékelésre alkalmas ún. rácscsatolt interferométer jelátalakító prototípus megvalósításáról, illetve a vele végzett elsőrefraktometriai mérések eredményeiről számol be. Részletezi továbbá a műszerelrendezés felépítését, valamint a jelátalakító válaszjelének előállítására, rögzítésére és kiértékelésére hivatott mérőés vezérlő elektronikák

és

számítógépes

algoritmusok

működésének

elvét

is.

A

rácscsatolt

interferométerrel végzett első, működést igazoló refraktometriai kísérletek bizonyítják, hogy a jelátalakító már e jelen fejezetben bemutatott kezdetleges állapotában is ~10-5-es érzékenységgel képes a törésmutató változásának nyomon követésére. Ahogy az az „5. 2. Jelölésmentes érzékelő k jelátalakítói” címűfejezetben bemutatásra került, a jelölésmentes optikai jelátalakítók számos tekintetben jobb alternatívát nyújtanak célmolekula - felismerőelem típusú folyamatok nyomon követésére és vizsgálatára, mint az egyéb, más elven működőtársaik. Láthattuk, hogy napjaink legsikeresebb és legelterjedtebb optikai jelátalakító eszközei főként a hullámvezetés és/vagy az interferometria rendkívüli érzékenységét kihasználva látják el feladatukat. A jelölésmentes integrált optikai érzékelők elsőbemutatkozása óta, a hozzájuk kapcsolódó tudományterület intenzív kutatás és fejlesztés alatt áll. Mára már alkalmazási területük igen széleskörű; a gáz és páratartalom érzékelőktől, a refraktométereken át, a valós időben követett célmolekula - felismerőelem típusú kísérletekig terjed [9, 10, 11, 17]. Bár számos ilyen elven működő, kiváló érzékenységgel bíró vizsgálati módszerről olvashatunk a szakirodalomban, az igény egy kis költségvonzatú, felhasználóbarát eljárásra továbbra is kielégítetlen maradt. Ennek okai lehetnek, hogy az ilyen típusú érzékelők nagy értékűalkatrészekből épülnek fel, nehezen beállíthatóak, vagy nem biztosítanak lehetőséget a párhuzamos mérésekre. Ezen kívül jellemzőrájuk, hogy, mivel mozgó alkatrészeket tartalmaznak nehezen építhetők össze más mérési eljárásokkal, nem miniatürizálhatók, így nem illeszthetők például a napjainkban egyre inkább előtérbe kerülőlab-on-a-chip alkalmazásokhoz. Előfordul, hogy rendkívül zajérzékenyek, így fejlesztőik hatalmas energiát kell, hogy fordítsanak a környezet kellemetlen hatásaitól való elszigetelésükre. Ez azonban gátja a kézi-műszer kivitelnek is. A spektroszkópiai ellipszométerek előnye, hogy nem szükséges érintéses kapcsolat a jelátalakító és a felismerőelemet hordozó egység között, továbbá, hogy a minta felülete – időben párhuzamosan vagy sorosan – gyakorlatilag tetszőleges pontokban könnyedén

55

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez mérhető. Hátrányai

azonban,

hogy

forgó-mozgó,

robosztus

alkatrészeik

miatt,

miniatürizálhatóságuk nem megoldott. Az esetükben használt folyadékcellák térfogata is nagy, néhány milliliter. Továbbá, mivel a vizsgáló fény áthalad a folyadékfázison, erősen szóró vagy elnyelőoldatok esetén nem alkalmazhatók [53]. Esetenként hátrányt, máskor pedig előnyt jelenthet, hogy e műszerek érzékenysége nem koncentrálódik az érzékelő felületére. Bár az optikai Mach-Zender interferométerek könnyen integrálhatók párhuzamos mérésekre alkalmas eszközökbe, az érzékenységük a mérő- és referenciaág aktuális fáziskülönbségének függvénye. A működésüket leíró (13.2.6.) interferencia egyenlet deriváltja szerint ugyanis a fáziskülönbség szinusza határozza meg a szenzorfelületen történőegységnyi változásra adott válasz mértékét. Így az interferencia egyenlet szélsőértékei közelében az ilyen elven működő eszközök érzékenysége elvész. További hátrányuk, hogy abszolút intenzitást mérnek, így a maximális erősítés és kioltás intenzitásértékeire kalibrálnunk kell e készülékeket. Az optikai hullámvezetőfénymódus spektroszkópok rácscsatolóik révén stabil és abszolút mérést tesznek lehetővé. Hátrányuk azonban, hogy a működésükhöz elengedhetetlen precíziós goniométer asztal jelentősen megemeli az ilyen eszközök árát, továbbá e mozgó alkatrész nem csupán megnehezíti a más eszközökkel való összeépítést, de méretük csökkentésének is gátat szab. A sík dielektromos hullámvezetőalapú módszerek nagy előnye az SPR spektroszkópokkal szemben az, hogy a jelátalakítójuk tervezésekor jóval nagyobb szabadsággal rendelkezünk. Bár mindkét eljárásban az evaneszcens sugár behatolási mélységét a hullámvezetőoptogeometriai paraméterei határozzák meg, az SPR spektroszkópok alkalmazásaiban ez az érték egy erősen korlátok közé szorított szám (hozzávetőlegesen 200 nm) [57]. A hullámvezetők esetében ez a paraméter sokkal tágabb határok között mozoghat. A szenzor opto-geometriai paramétereinek alkalmas megválasztásával az evaneszcens mezőakár ~ μm mélyen is „beleláthat” a vizsgált térfogatba [57]. Az ilyen jellegűrugalmasság előnyt jelenthet például nagyobb méretűbiológiai elemek baktériumok, sejtek vizsgálatánál [17, 57, 60], vagy épp a több száz nanométer hosszú flagelláris filamentum felismerőelemekkel történődetektálás során. A hullámvezetők továbbá – főként a rácscsatolók alkalmazása miatt – könnyebben formálhatók tömbi működésre (párhuzamos mérésekre) képes jelátalakító elemekké [79]. E tulajdonság pedig a jól használható bioszenzorikai alkalmazások kulcsa. Jelen fejezetben egy olyan jelölésmentes optikai jelátalakító eszköz, ún. rácscsatolt interferométer [80] megépítéséről és teszteléséről számolok be, mely egyszerre érvényesíti a fenti eljárások összes előnyét úgy, hogy közben azok felsorolt hátrányaival nem rendelkezik. 56

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Kizárólag alacsony költségigényűalkatrészekből épül fel. Nem tartalmaz forgó elemeket, így nagyobb nehézségek nélkül miniatürizálható és összeépíthető más műszerekkel is. A működését

biztosító

hullámvezetés

és

interferometria,

valamint

az

alkalmazott

folyadékkristály modulátor későbbiekben bemutatásra kerülő ötletes kombinációjának természetes

következményeként,

nagy

mérési

tartományon

át kiváló

és

állandó

érzékenységgel mérhetünk. A rácscsatolt interferométer érzékelő felülete a kísérletnek megfelelően tervezhetőoptikai paraméterekkel bíró sík dielektromos hullámvezető, mely film rétegébe rácscsatolók diffraktálják a polarizált és koherens fényt. Mindez nagyobb alkalmazási szabadságot és stabilitást kölcsönöz a szóban forgó eszköznek. Megfelelő rendszerben elhelyezett rácscsatolók alkalmazásával a későbbiekben párhuzamos mérésekre, lab-on-a-chip alkalmazásokra is nyílhat majd lehetőség.

7. 1. Az elsőmérési összeállítás A rácscsatolt interferométer két főalkotóból, egy Mach-Zender interferométer jellegűszabad fényterjedésűnyalábosztóból és egy integrált optikai egységből felépülőeszköz, ún. hibrid Mach-Zender interferomer, mely a hullámvezetés rendkívüli felületérzékenységét erősíti tovább az interferometria nyújtotta fázisérzékenységgel. Az összeállítás működését a 7.1.-1. ábra szemlélteti.

7.1-1. ábra A Mach-Zender interferométer jellegűtükörrendszerbő l és integrált optikai egységbő l felépülőrácscsatolt interferométer működését illusztráló sematikus ábra.

57

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez A Mach-Zender interferométer jellegűtükörrendszer két féligáteresztőés két hagyományos tükör segítségével két párhuzamos és koherens nyalábra osztja a He-Ne lézer fényforrás fényét. A referencia ág (1. nyaláb, szürke vonal) fázisát egy erre alkalmas folyadék kristály modulátor (ang. liquid crystal modulator - LCM) segítségével, időben folyamatosan, folytonosan és periodikusan változtatjuk, majd az integrált optikai egység monomódusos, sík dielektromos hullámvezetőfilmrétegébe csatoljuk. A mérőág (2. nyaláb, fekete vonal) fénye modulálatlanul, az 1. nyaláb hullámvezető filmbe való becsatolási helyétől néhány milliméterrel arrébb érkezik a csatolórácsra. A vázolt geometria következtében a 2. nyaláb jelentős utat tesz meg az integrált optikai egységben mielőtt találkozna és interferálva egyesülne a referencia ágból érkezőpárjával. A becsatolási pontok közötti területet, az ún. érzékelőfelületet refraktormetriai és bioszenzorikai kísérletek esetén folyadékcellával fedjük le. (7.1.-2. ábra) A hullámvezetővégén kilépőinterferenciajelet egy erre alkalmas detektor, analóg-digitál jelátalakító és számítógép rendszerének segítségével rögzítjük.

7.1.-2. ábra A rácscsatolt hullámvezetőintegrált optikai egységének érzékelőfelületére illesztett

folyadékcella

segítségével

a

rácscsatolt

hullámvezető alkalmassá

tehető

refraktometriai és biológiai vizsgálatokra.

A fentiekben ismertetett rácscsatolt interferometert Newport optikai asztalon építettem meg, melyet nitrogéngázzal feltöltött, Festo elemekkel nyomásszabályzott gumitömlőkre fektettem, hogy az alátámasztás felől érkezőrezgésektől elszigeteljem. Az alkalmazott 15mW-os Melles Griot He-Ne lézer fényforrás (25-LHP-151-230) 632,8 nm hullámhosszú fényét a Tektronix (AFG3022) jelgenerátorral hajtott folyadékkristály modulátoron keresztül, TM polarizációban csatolom a Suprasil-1 kvarchordozóra leválasztott ≈200 nm vastag, monomódusos, Ta2O5 filmréteggel ellátott hullámvezetőbe. Az Ismatec perisztaltikus pumpával áramoltatott oldatok

58


7.1.-3. ábra A megvalósult rácscsatolt interferométerrő l készült fotó.

érzékelőfelületre történőjuttatását folyadékcella alkalmazásával oldottam meg. A műszer elemeinek rögzítését és pozícionálását Magyar Optikai Művek (MOM) és Thorlabs eszközökkel kiviteleztem. Az interferencia jelet Hamamatsu (S22B1-4K-H983) félvezető detektorral Keithley (427) erősítőn keresztül, az általam kifejlesztett C++ környezetben futó program

vezérlésével

Advantech

(USB-4711,

valamint

USB-4716)

analóg-digitál

átalakítókkal rögzítettem, majd ezt egy szintén általam fejlesztett C++ illetve MATLAB programokkal elemeztem. A megépített műszert a 7.1.-3. ábrán láthatjuk.

7. 2. Integrált optikai egység A következőmérésekben használt integrált optikai érzékelőegységek a Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Kutatóintézet Dr. Hámori András nevéhez fűződő, szabadalmaztatott eljárásával készültek. A szabadalmaztatott felületmegmunkálási eljárás menete röviden a következő: A hordozó felületét vékony rezisztréteggel bevonják, majd ezt egy holografikus összeállításban, a kívánt rácsmintázatnak megfelelően megvilágítják. Az alulexponált területekről eltávolítják a felesleges rezisztet, majd az így kapott felületi struktúrán keresztül ion-implantálják a hordozót. Ennek következtében megszületik a törésmutató rács a hordozó felület közeli rétegében. Végül a hordozó felületét megtisztítják, majd elektronsugaras párologtatással hozzávetőlegesen 200 nm vastag Ta2O5 hullámvezetőréteget növesztenek rajta. Az így kapott integrált optikai egység egy jó hatásfokú, temetett rácscsatolóval ellátott monomódusos hullámvezető[81].

59


7. 3. Folyadékkristály modulátor A

rácscsatolt

interferometerek

interferométer klasszikus,

LCM jelen

egység fejezet

nélküli

működtetése

bevezetőjében

a

Mach-Zender

bemutatott

hiányosságait

eredményezné. A rácscsatolt interferométer egyik lényegi újítása az, hogy amennyiben a referencia ág fázisát 2π-nél nagyobb értékkel periodikusan és folytonosan moduláljuk, ennek megfelelő, szintén periodikusan változó, legkevesebb két szélsőértékkel (egy maximális erősítési és egy maximális gyengítési ponttal) rendelkezőinterferenciajelet kapunk. A szélsőértékek intenzitásértéke automatikusan kalibrálja rendszerünket, a folytonos moduláció pedig állandó maximális érzékenységet biztosít. A függvénygenerátorból érkezőlegfeljebb 10V amplitúdójú, néhány Hz frekvenciájú, periodikus négyszögjel hatására bekövetkező folytonosan változó LCM fázismoduláció, azonos frekvenciájú, szintén periodikusan és

7.3.-1. ábra: A folyadékkristály modulátor a jelgenerátorból érkezővezérlő jelre (felső grafikon) adott normált válaszjele (alsó grafikon).

folytonosan változó interferencia jelet eredményez. A kapott válaszjel felbontható egy gyorsan és egy lassan változó szakaszra, melyek rendre megfeleltethetők a függelék „13. 6. Nematikus folyadékkristály modulátor” címűfejezete alapján a folyadékkristály molekuláinak feszültség hatására történőorientálódásának, illetve, a gerjesztőfeszültség megszűnésével, relaxációjának. A gyors és lassú hullámok – időben állandó, periodikus vezérlés esetén – az LCM-re jellemző stabil, állandó karakterisztikával jellemezhető válaszjele, melyeket a [-1; 1] intervallumra normálva (továbbiakban: normálva) a 7.3.-1. ábra szemléltet.

60

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Megjegyzendő, hogy a 7.3.-1. ábrán látható vezérlőjel egymást követőnégyszög alakú feszültségugrásainak váltakozó előjelét (alterálását) az indokolja, hogy előjelváltás nélküli esetben a szabad ion diffúzió következtében a modulátor károsodna, majd működése leállna. A fentiekben bemutatott mérési összeállításban alkalmazott modulátort kitöltőnematikus folyadékkristály-réteg vastagsága, d és az ne extraordinárius, no ordinárius törésmutatók különbsége, Δn a gyártó által meghatározott értékek (bővebben ld.: „13. 6. Nematikus folyadékkristály modulátor”). Méréseim alapján, az ilyen paraméterekkel jellemzett modulátorok gerjesztett egyensúlyi állapotból való relaxációja során a rajtuk áthaladó fény fázisának ≈½ πradián eltolásra képesek mikrométerenként. Számításba kellett vennem, hogy a válaszjel gyors és lassú szakaszainak legelejét, a görbék leggyorsabban változó részét az itt jelentkezőjeltorzító effektusok miatt célszerűfigyelmen kívül hagyni. Így annak érdekében, hogy legalább két szélsőérték biztosan megtalálható legyen a detektált válaszjel torzulásmentes szakaszaiban, jelen fejezetben tárgyalt kísérletekben hozzávetőlegesen 8 μm hasznos folyadékkristály-réteg vastagságot alkalmaztam.

7. 4. A szenzorműködés elve Az előbbiekben ismertetett válaszjel szélsőértékeinek pozícióját két tényezőhatározza meg. Az első– a rendszer beállításból adódó (ideális esetben) időben nem változó mennyiség – a mérőés referencia ágak az integrált optikai egységbe való becsatolásukig megtett úthosszak különbségéből adódó r fázistag. A második, az L hosszú érzékelőfelület alatt terjedőmódus fázisának eltolódásából származó, egyedül a mérőág fázisához hozzáadódó komponens, melyet a függelék „13. 5. Hullámvezetés izotróp közegben” címűfejezete alapján, N effektív törésmutató és k0 vákuumbeli hullámszám segítségével a következőalakban írhatunk fel:

Nk 0 L .

(7.4.1)

E szakaszon, a terjedőmódus evaneszcens mezeje által letapogatott térrészben, a fedőréteg optikai paramétereinek és így a két sugármenet fáziskülönbségének megváltozása révén az interferencia válaszjel szélsőértékeinek helyzete arányosan eltolódik. Az érzékelőfelületre folyadékcellát helyezve, rajta a kívánt oldatokat áthajtva, a minimumok és maximumok helyzetének folyamatos követése egyszerű, elegáns és érzékeny módját adja a detektálásnak. Mivel az interferencia periodikus jelenség, a válaszjel minden 2πfázistolást követően önagába megy át. E tény következménye, hogy az érzékelési tartományt maga a válaszjel

61

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez semmilyen módon nem korlátozza. Ennek felsőhatárát egyedül a hullámvezetőfilmrétegének törésmutatója (≈ 2.1, ld. előző fejezet) szabja meg, hiszen a filmrétegénél magasabb törésmutatóval jellemezhetőfedőréteg esetén a hullámvezetés megszűnik. Jelen és az előzőalfejezetekből levonható, összefoglaló jellegűkövetkeztetés tehát az, hogy a fentiekben ismertetett rácscsatolt interferométerrel a vákuum (levegő) és a hullámvezetőfilm optikai tulajdonságai által korlátozott, refraktometriai és bioszenzorikai kísérletek szempontjából rendkívül széles mérési tartományon keresztül állandó érzékenységgel mérhetünk.

7. 5. A mérés menete A rezgésmentes asztalon megépített rácscsatolt interferométer lézer fényforrásának fényét a Mach-Zender jellegűtükörrendszerbe irányítjuk. A két hagyományos és két féligáteresztő tükör finombeállító csavarjaival a mérőés referencia ágak nyalábjait a kilépőoldalon fedésbe hozzuk egymással úgy, hogy a fényútba helyezett ernyőn az LCM fázismodulációjának hatására interferenciacsík-mentes, vibráló foltot lássunk, majd az ernyőt eltávolítjuk. Ezt követően a modulációt szüneteltetve, a fénynyalábokat a csatolórácsra irányítva, a hullámvezető-folyadékcella rendszer befogójának óvatos forgatásával megkeressük a becsatolási szöghelyzetet. A mérőág kitakarásával a referencia ág sugarát a tükörrendszer megfelelőcsavarjaival párhuzamosan eltoljuk ügyelve arra, hogy a csatolás megmaradjon. A kívánt távolság beállítása után a mérőág kitakarását megszüntetjük, a modulációt újraindítjuk, majd a rácscsatolt interferométer minden beállító csavarját rendkívül óvatosan addig állítgatjuk, míg az elérhetőmaximális amplitúdójú válaszjelet nem detektáljuk. A detektort a hullámvezetővégéhez toljuk, lezárjuk a műszert takaró dobozt, az erősítőn kiválasztjuk a megfelelő erősítési értéket, hozzávetőlegesen 0 V-ra állítjuk a válaszjel egyenáramú komponensét, ellenőrizzük, hogy a szóban forgó jel az analóg-digitál átalakító mérési tartományán belül van-e, majd indítjuk a felvételt vezérlőprogramot. A felvételt vezérlő program C++ környezetben fut, mely működése röviden a következőképpen foglalható össze. A program az általa szabályzott analóg-digitál jelátalakító segítségével nem csupán az interferencia válaszjelet, hanem a LCM vezérlőjelét is rögzíti az időfüggvényében. Ez utóbbi alapján – a lefutó és felfutó éleket követve – a mért interferencia választ gyors és lassú jelekre szeparálja. (Megkülönböztetheti továbbá a lefutó és felfutó élek utáni relaxáció során megfigyelhetőválaszjeleket is.) Az ily módon szétválasztott adatsort külön oszlopokba rendezi, majd a periódus sorszámával jelölt ASCII fájlban eltárolja.

62


7. 6. Az első, működést igazoló kísérletek Az elsőkísérlet célja csupán a szenzoreffektus demonstrálása volt. Az érzékelőfelületre illesztett folyadékcellába először ultratiszta (Milli-Q) vizet áramoltattam, majd a fentiekben részletezett módon, 100 kS/s-os mintavételezési frekvencia mellett felvettem a válaszjelet. Ezt követően a folyadékcellát 0,25 %-os glicerin - ultratiszta víz keverékével öblítettem át. A válaszjelet ebben az esetben is rögzítettem. A lassú jelek intenzitás - időadatsorait Origin Pro 7.5 programmal ábrázoltam. (7.6.-1. ábra) A kapott görbék egyértelműen mutatják a „7. 4. A szenzorműködés elve” címűalfejezetben tárgyalt jelenséget, miszerint az érzékelőfelület környezetében történőoptikai változások a válaszjel szélsőértékeinek eltolását eredményezik. A két oldat törésmutató különbsége 4,6 x 10 -4, melyet a kereskedelemben kapható 5 tizedesjegyre pontos Rudolph Reflakométerrel határoztam meg.

7.6.-1. ábra: A válaszjel eltolódása az érzékelőfelületre áramoltatott oldat 4.6 x 10 -4 -es relatív törésmutató változásának következtében.

A második refraktometriai alapkísérlet a rácscsatolt interferométer stabilitását és a mérés jelzaj viszonyát hivatott bemutatni illetve meghatározni. A folyadékcellát először ultratiszta vízzel, majd rendre 0,25 %-os, 0,5 %-os, 0,8 %-os glicerin - ultratiszta víz oldatokkal töltöttem fel. Minden oldatcserét követően a folyadékcellát ultratiszta vízzel öblítettem át. Ezen oldatok 4,6 x 10-4, 9,1 x 10-4, valamint 1,46 x 10-3-as ultratiszta vízhez viszonyított relatív törésmutató értékekkel jellemezhetőek. Minden egyes állapot stabilizálódott gyors és lassú válaszjelét számítógéppel, hozzávetőlegesen 4 Hz-es LCM vezérlés mellett, 50-szer rögzítettem, majd egy általam fejlesztett szélsőérték keresőC++ algoritmus segítségével meghatároztam minden eltárolt lassú válaszjel elsőintenzitás minimumának pozícióját. Ezt követően, az így kapott adatokat a mérés sorszámának függvényében ábrázoltam. (7.6.-2. ábra) 63


7.6.-2. ábra: A mért válaszjelek első minimumának pozíciója a mérés sorszámának függvényében a cellán átfolyó ultratiszta víz 0,25 %-os, 0,5 %-os, majd 0,8 %-os glicerin ultratiszta víz oldatokra való cseréjének hatására. A felhasznált oldatok ultratiszta vízhez viszonyított relatív törésmutatóit is feltű nteti az ábra.

Megjegyzendő, hogy a gyors válaszjelek főként azért nem képezik a kiértékelés részét, mert azok ≈10-szer rövidebb idejűlefutása következtében a hozzájuk tartozó görbék rosszabb felbontásúak, így pontatlanabb eredményekre vezetnek. Az 7.6.-2. ábrán bemutatott eredmények jól tükrözik a rácscsatolt interferometer kiváló stabilitását és reverzibilitását, ugyanis a cella ultratiszta vízzel történőátöblítése után a mért jel jó közelítéssel rendre kezdeti állapotába tért vissza. Jelen kísérlet alkalmas arra is, hogy a mért értékek segítségével meghatározzuk a rácscsatolt interferométer érzékenységét. A legkisebb még detektálható változást a szakirodalom a rendszer állandó bemenetre adott válaszának zajából számított szórás háromszorosával definiálja [82]. A mért platókon számított szórás értéke 16 μs, mely háromszorosát megszorozva a legnagyobb relatív törésmutató változás (1,46 x 10-3) és a hozzá tartozó intenzitás minimum pozíció ugrás (4,204 ms) hányadosával kapjuk, hogy a rendszer törésmutatóra átszámított érzékenysége ≈2 x 10-5. Mely érték alapján kijelenthető, hogy a jelen fejezetben bemutatott rácscsatolt interferométer máris meghaladja (vagy eléri) számos kereskedelemben kapható, optikai jelátalakító teljesítőképességét. (vö.: 5.2.4.-I. táblázat) Kihasználhatjuk, hogy a rácscsatolt interferométer a több mint 2π-n keresztül tartó fázismodulációjának következtében automatikusan kalibrálja önmagát, így a detektált interferenciajel maximális erősítéséhez és kioltásához tartozó Imax és Imin intenzitásértékek minden ciklusban pontosan ismertek. A válaszjelek lecsengővégeinek stabilizálódott, hosszú szakaszain mért, számos mérési pontra átlagolt intenzitás (Istab ) és az előbbi értékek alapján a

64

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez válaszjelek fázisa a függelék „13. 2. Interferencia” címűalfejezete alapján a következő, interferencia egyenletből származtatott összefüggés alapján meghatározható: I stab  I max I min    arccos   I I .  max min 

(7.6.1.)

Amennyiben a 7.6.-2. ábrán bemutatott kísérleti eredmény első mérési pontjából meghatározott  értékkel minden átszámított fázist eltolunk, a kezdeti állapothoz viszonyított, az érzékelőfelületen történőváltozások következtében kapott relatív fázistolást ( ) ábrázolhatjuk. (7.6.-3.a. ábra) Az egyes platókhoz tartozó átlagos fázisértékeket a hozzájuk tartozó ismert relatív törésmutatók függvényében ábrázolva igazolhatjuk, hogy a rendszer érzékelőfelületével kapcsolatban álló oldat optikai paramétereinek megváltozására a rácscsatolt interferométer lineáris választ ad: a kapott pontokra kiváló jósági tényezőmellett (R2 = 0.99997) illeszthetünk egyenest. (7.6.-3.b. ábra) Bár e rendkívül egyszerű és hatékonynak tűnőkiértékelési mód szemléletes eredménye kellemes befejezését adhatná e fejezetnek, azonban az eljárás szomorú hátránya, hogy újra bevezeti rendszerünkbe a MachZender interferométerek esetén tárgyalt intenzitás szélsőértékek közelében tapasztalható érzékenységvesztést (ld.: jelen fejezet bevezetése).

7.6.-3. ábra: a.) A glicerin - ultratiszta víz oldatsorozat hatására mérhetőrelatív fázistolás értékek b.) relatív törésmutatók függvényében ábrázolt pontjaira illesztett egyenes jól tükrözi a rácscsatolt interferométer linearitását.

65


7. 7. Összegzés A fejezetben ismertetett rácscsatolt interferométer működési elvét és létjogosultságát kísérletekkel igazoltam, megmutattam, hogy a műszer érzékenyen reagál az érzékelő felületének közvetlen környezetében végbemenő törésmutató változásra, illetve egy szisztematikus mérési sorozattal meghatároztam, hogy a jelátalakító már e kezdetleges állapotában is ~10-5-es érzékenységgel képes a törésmutató változásának nyomon követésére. A válaszjel fázisának meghatározásával igazoltam az érzékelés linearitását is. Azonban nem szabad szem elől tévesztenünk, hogy a jelátalakító eszköz még további fejlesztésre szorul: Szükséges egy olyan válaszjel kiértékelési módot találnom, mely az érzékelőfelületen lejátszódó

optikai

változást,

a

hullámvezető rétegben

terjedő fény

fázistolását

érzékenységvesztés nélkül adja vissza eredményül, illetve, mely stabilitása és pontossága a műszer által elérhetőérzékenység alatt van. Fontos megvizsgálnom, hogy a vezérlőjel paraméterei optimalizálhatók-e, a mintavételezési frekvencia növelhető-e, továbbá, hogy integrálható-e a rendszerbe referencia egység, mellyel a rendszert terhelőzaj hatékonyan kiszűrhető. Mindezekre megoldást adva a fentiekben bemutatott eszközzel elérhetőmaximális érzékenység várhatóan legalább egy nagyságrenddel javítható lenne. A következő, „8. Rácscsatolt interferométer bioszenzorikai kísérletekhez” címűfejezet e fenti kérdésekre kíván választ adni.

66


8. Rácscsatolt interferométer bioszenzorikai kísérletekhez A „7. Rácscsatolt interferométer - refraktometria” címűfejezetben bemutatott műszert továbbfejlesztve biológiai kísérletekre is alkalmas eszközt kapunk. Amennyiben a jelátalakító válaszjelének fázisát egy hatékony és stabil modellfüggvény illesztésével határozzuk meg, illetve egy plánparalel üveglemezzel keltett interferencia referencia válaszjel egyidejű monitorozásával a műszer szabad fényterjedési egységéből eredőzajt kiszűrjük, az eszköz törésmutató érzékenysége < 10 -6-ra javítható, mely megfeleltethető hozzávetőlegesen 0,5 pg/mm2-es, illetve néhány 10 Da-os felületi érzékenységnek.

Az előzőfejezetben a bemutatott rácscsatolt interferométer működési elvét refraktometriai kísérletek segítségével bár igazoltam, hangsúlyt fektettem arra is, hogy az összeállítást még jelentős fejlesztésnek kell alávetni ahhoz, hogy a kereskedelemben már kapható jelátalakítók mellett vonzó alternatívát biztosítson. Jelen fejezet célja, hogy bemutassa azokat az újításokat, melyek segítségével a szóban forgó eszköz teljesítőképessége oly mértékben megnövekedett, hogy napjaink legnépszerűbb módszerei közül a legtöbbet maga mögé utasította. Ezen állítás hitelességét a fejezet végén bemutatott, fehérje adszorpciós és a rendkívüli érzékenységet igénylőfelismerőelem - célmolekula megkötési kísérletek eredményeivel bizonyítom.

8. 1. A válaszjel kiértékelés új formája A valódi mérések természete, hogy zajjal terheltek, minek következtében a keresett mérési információt csupán valamilyen véges pontossággal olvashatjuk ki rendszerünkből. A jelfeldolgozó eljárások célja minden esetben az, hogy a lehetőlegrosszabb jel/zaj viszonyok mellett is a lehetőlegkisebb bizonytalansággal vezessenek eredményre. Az egyre fejlődő numerikus módszerek között számos olyan zajszűrőeljárást találhatunk, melyek csábító hatékonysággal simítják vagy szűrik a kívánt jelünket. Az ilyen eljárások nyilvánvaló fogyatékossága azonban minden esetben az, hogy a zajos jelben rejlőinformációt a jel utólagos manipulációjával mindig torzítják [83]. A „Numerical Recepies in C” című, általánosan elismert könyv szerint a lehetőlegjobb eljárás az, ha változatlanul (zajosan) hagyjuk a mért jelünket, s azt, a fenti eljárások helyett, egy alkalmas parametrikus függvénnyel illesztjük, majd a kapott paraméter értékekből meghatározzuk a keresett információt [83]. Ennek előnye nem csupán az, hogy az eredeti, torzulásmentes jelalak képzi a kiértékelés alapját, hanem az is, hogy az összes mért pont része

67

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez a függvényillesztési eljárásnak. (Szélsőérték keresőalgoritmusok általában csak a feltételezett szélsőérték közvetlen környezetében lévőpontokat használják fel.) A mérési pontok száma négyzetgyökével arányosan csökkenti a mérésből származó zajt, javítja a kiértékelés pontosságát. Elegendően nagyszámú mintavételezés esetén kiváló jel/zaj viszony érhetőel még erősen zajjal terhelt válaszjelek esetén is. A fenti érvelés alapján célszerű a rácscsatolt interferométer kimenetén mérhető válaszfüggvényt egy megfelelőparametrikus függvénnyel illeszteni. E függvény kiválasztása azonban nem magától értetődőfeladat. Bonyolult folyamatokat leíró, összetett, nagy számítási kapacitást igénylő, sok paraméterrel rendelkezőmodellek esetén a kiértékelés lassú és bizonytalan lesz. Túl kevés paraméter alkalmazása pedig magában hordozza a veszélyt, hogy modellünk nem illeszkedik majd megfelelően a válaszjelre, melynek következtében a vele kapott eredmény megbízhatatlan lesz. E két eset optimuma adja a legjobb megoldást. A modell függvény megtalálására használjuk fel a függelék „13. 2. Interferencia” és a „13. 6. Nematikus

folyadékristály

modulátor”

című alfejezeteiben

vázolt

ismereteket.

A

folyadékkristály modulátor referenciához viszonyított, a gerjesztőfeszültség megszűnésekor mérhetőfázistolás dinamikáját megkapjuk, ha a (13.6.3.) egyenletbe rendre behelyettesítjük a (13.6.1.) és (13.6.6.) összefüggéseket:     d/ 2   2 n e no   LCM (t mod )   1 dy , t mod t mod 0 d       /2 ne2 sin 2 0 m e  cos    no2 cos 2 0m e  cos  y  y       m m      

ahol ( 2m 1)

  , valamint 2 , d 

(8.1.1.)

ahol a d vastagságú folyadékkristály relaxációja során, a gerjesztőfeszültség megszűnésétől számított időt t mod, a modulátoron áthaladó fény vákuumbeli hullámhosszát λ 0 jelöli,  0m pedig a γforgási viszkozitással és κrugalmassági együtthatóval jellemezhetőfolyadékkristály molekulák tmod = 0 időpillanatban mért, m-edik módusra vett maximális szögkitérése. A cosinus függvén argumentumában szereplőy ( y d / 2...d / 2 ) paraméter térkoordináta. Amennyiben a fázistolásra kapott értéket a (13.2.6.) interferencia egyenletbe írjuk, megkapjuk a modulált és referencia ágakból érkezőnyalábok interferencia válaszjelének időbeli lefutását:

68

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez I (t mod ) I1 I 2 2 I 1 I 2 cos LCM (t mod ) r  ,

(8.1.2.)

ahol I az intenzitás, r pedig egy additív, a rendszerre jellemzőfázistag. A (8.1.2.) egyenlet normált változatát az általam fejlesztett MATLAB algoritmussal a szintén normált válaszjelre illeszthetjük. A program a (8.1.1.) integrál egyenletet minden iterációs ciklusban (az aktuális paraméterértékekkel) numerikusan kiintegrálja és összeveti a kísérleti görbével. Az illesztendőparaméterek , d , r és minden 0 m , melyek r kivételével az LCM egység karakterisztikus jellemzői. A modulátor által generált válaszjelre való m = 1…2, két módusos illesztés eredménye a 8.1.-1. ábrán látható. (A nagyobb módusszám már nem javított számottevően az illesztés jóságán.)

8.1.-1. ábra: A ≈ 4 μ m vastag folyadékkristály-réteggel rendelkezőLCM egység által generált válaszjel idő beli lefutására illesztett elméleti görbe. A betét kép a ΔΦLCM fázistolás idő függését mutatja be. (Az illesztés 270 független adatpontra történt.)

A fenti illesztés d paramétere ≈4,5 μm-nek adódik, ami nagyon jól egyezik a gyártó által megadott 4 μm-es értékkel. A mért pontok elméleti függvényhez képesti szórására csupán 0,036. Mindezek tükrében kijelenthető, hogy az (8.1.1.) és (8.1.2.) összefüggések együttese helyesen és jól írja le a moduláció keltette válaszfüggvényt. Nagy hátránya azonban, hogy mivel e bonyolult egyenlet illesztése rendkívül számolásigényes eljárás, így e modell alkalmazása a gyors kiértékelés gátja. Az 8.1.-1. ábra betét képe azonban egy sokkal egyszerűbb megoldást is sugall számunkra. A szemre exponenciálisan felfutó fázistolás - időfüggvény intuíció arra, hogy a (8.1.1.) egyenlet helyett egy sokkal egyszerűbb formula is jól modellezheti a vizsgált jelenséget. Ezt indokolja az is, hogy amennyiben t mod szerint sorba fejtük a (8.1.1.) egyenletben szereplőintegrál argumentumát, úgy egy – az exponenciális függvény sorfejtéséhez hasonlóan – alteráló 69

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez hatványsort kapunk. (A pontos eredmény terjedelmi okokból nem képzi a dolgozat részét.) A fentiek alapján tehát indokolt lehet a következőválasztás is:





LCM (t mod ) LCM 1 e tmod /  r ,

(8.1.3.)

ahol LCM az a fázistolás, melyet a modulátor a teljesen gerjesztettből a teljesen relaxált állapotából való visszajutása alatt az áthaladó fényen tol,  pedig idődimenziójú állandó. Annak eldöntésére, hogy a két függvény közül melyik az alkalmasabb, rendre illesszük azonos válaszjelre a (8.1.2) egyenlet argumentumába helyettesített elméleti és intuitív úton kapott (8.1.1.) és (8.1.3.) összefüggéseket. Ahogy azt a 8.1.-2. ábra is szemlélteti, az intuitív függvény legalább olyan jól karakterizálja a mért válaszjelet, azonban nagyságrendekkel kisebb számítási időmellett teszi mindezt, mint elméleti társa. Mivel a gyors mintavételezés, így a gyors kiértékelés is, az érzékeny mérések kulcsa, a továbbiakban minden esetben ezt az eljárást alkalmazom.

8.1.-2. ábra: A mért adatokra illesztett elméletei (sötét szürke szaggatott vonal) és intuitív (világos szürke szaggatott vonal) modellek összehasonlítása.

Abban az esetben, ha a nagyobb fázistolás érdekében vastagabb (> 4 μm) hasznos folyadékkristály-réteggel rendelkezőLCM egységet alkalmazunk, a válaszjel teljes lefutását általában már nem illeszthetjük azonnal a (8.1.2.)-be helyettesített (8.1.3.) összefüggéssel. Ilyenkor több, a (8.1.3.)-mal azonos, de független paraméterekkel rendelkezőegyenlet lineárkombinációját kell beírnunk a (8.1.2.) egyenletbe. A 8.1.-3. ábra egy ≈8 μm hasznos folyadékkristály-réteggel rendelkezőLCM egység segítségével keltett válaszfüggvény egy, illetve két exponenciális taggal illesztett eredményét mutatja. Látható, hogy két exponenciális lineárkombinációja már jól fedi a válaszfüggvényt.

70


8.1.-3. ábra: Vastagabb, ≈8 μm hasznos folyadékkristály-réteggel rendelkezőLCM egység válaszfüggvényét egyetlen exponenciális tagot tartalmazó modellel illesztve nem kapunk kielégítő egyezést. Két exponenciális lineárkombinációja azonban már teljesíti ezt a feladatot. (Az illesztés 3822 független adatpontra történt.)

Fontos észrevennünk azonban, hogy ilyen nagy fázistolások alkalmazása felesleges, hiszen a kiértékeléshez elegendőminimálisan két szélső érték megléte is. A válaszjel mintavételezési frekvencia, így a rácscsatolt interferométer érzékenysége is növelhető, ha a vezérlőjel frekvenciáját addig növeljük, míg a válaszjelben mérhetőfázistolás alig több mint 2π-re csökken. A modulátor egység ilyen esetben ugyan nem relaxálódik és gerjesztődik teljes mértékben, azonban ez nem gátja a stabil működésnek, sőt a szabad iondiffúzió károsító hatásait is jobban kivédi a gyorsabb vezérlés. Ezen felül továbbá, elegendőegyetlen exponenciálist tartalmazó egyenlet is a válaszjel illesztéséhez (8.2.-1. ábra), mely – a kisebb számolásigény miatt – gyorsítja, illetve – a kevesebb paraméter okán – stabilizálja a kiértékelést. A fentiekben részletezett fejlesztések eredménye, hogy az intuitív modell alkalmazása esetén r meghatározásának kiértékelési bizonytalansága tipikusan csupán ~ 10 -4 radian. A következőkísérletekben – amennyiben a jelenleg elérhetőmaximális mintavételezési teljesítmény szükséges – a ≈12 μm hasznos folyadékkrisztály-réteggel rendelkezőLCM egységet 25 Hz-es vezérlőjelre kacsolom, majd a 200 kS/s mintavételezési frekvencia mellett detektált válaszjelet egyetlen exponenciálist tartalmazó egyenlettel illesztem a tmod = 2,5 ms – 20 ms-os tartományban. Fontos megjegyezni, hogy mivel a mért adatok analóg-digitál átalakítóból való kiolvasása szintén prioritást igénylőfolyamat, a válaszjel mintavételezési frekvencia 25 Hz-es vezérlőjel esetén ≈20 Hz. A kapott fázisértékeket, ahogy azt a rácscsatolt interferométer legnagyobb vetélytársa, a dupla polarizációs interferométer is teszi, 2 másodperces időablakokra átlagolom.

71


8. 2. A valós idejűvezérlőés kiértékelőalgoritmus Ahhoz, hogy a rácscsatolt interferométer jelátalakító működőképes, kísérletekben jól használható eszköz legyen, nélkülözhetetlen egy felhasználóbarát, valós idejűeredményeket szolgáltató válaszjel kiértékelőalgoritmus kifejlesztése. Bármely mérés során világos igény az, hogy a mért válaszjelek kiértékeléséről és a szenzorfelületen végbemenőfolyamatról pontos és azonnali visszajelzést kapjunk. Ennek érdekében a mérésvezérlőalgoritmus által begyűjtött, fájlokban eltárolt adatait egy gyors és azonnali kiértékelési folyamatnak kell alávetnünk. Az imént kitűzött feladatot egy általam fejlesztett, MATLAB környezetben futó algoritmus segítségével valósítottam meg, mely működési elvének rövid ismertetése jelen alfejezet tárgya. Amennyiben a rácscsatolt interferométer integrált optikai egységét is csatlakoztatjuk a MachZender interferométer jellegűnyalábosztó rendszerhez, a (8.1.2.) egyenlet kiegészítésre szorul. Ennek oka, hogy a válaszjel fázisát nem csupán (az ideális esetben időben változatlan)

r határozza meg, hanem ehhez hozzáadódik még a jelátalakító érzékelőfelület alatt terjedő módus fázisának eltolódásából származó – a mérés célját képezőmennyiség – (t ) érzékelő felületi fázistolás is. Itt t a kísérlethez tartozó időt jelöli. Ezzel az előzőalfejezetben javasolt intuitív modell a következőalakba írható át:

 





I ((t ), t mod ) I 0 A cos LCM 1 e tmod /  r (t ) ,

(8.2.1.)

ahol I 0 I1 I 2 az interferencia válaszjel időben állandó komponense, míg A 2 I1 I 2 az amplitúdója. Amennyiben a mérés során egy t 0 időpillanathoz tartozó fázisértékhez viszonyítjuk az összes további válaszjel fázisát, r

kitranszformálható a (8.2.1.)

összefüggésből: (t , t 0 )  r (t ) r (t 0 ) (t ) (t 0 ) .

(8.2.2.)

Az ily módon előkészített modellel való kiértékelés eredménye a kiválasztott fázisértékhez viszonyított relatív fázistolás. (8.2.-1. ábra) Megjegyzendő, hogy mivel a kiértékelés bármely időpillanatban indítható, t 0 időpont tetszőlegesen megválasztható.

72


8.2.-1. ábra: A lassú válaszjel mért pontjai (fekete „ ”-ek) rövidebb idő intervallumokon kiválóan illeszthető k az egyetlen exponenciálist tartalmazó intuitív modellel. Egy tetsző legesen kiválasztott válaszfüggvény fázisával definiálható (t , t 0 ) relatív fázistolás. A kis betét képek a folyadékkristály modulátor molekuláinak orientálódását szemléltetik. (Az illeszés görbénként 1226 független adatpontra történt, melyek közül a könnyebb áttekinthető ség kedvéért csupán minden tizedik került ábrázolásra.)

8.2.-2. ábra: A második generációs rácscsatolt interferométer kiértékelőprogramja a mérés fontos paramétereit valós idő ben ábrázolja a monitoron.

73

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez A valós idejűkiértékelőalgoritmus elsőlépéseként beolvassa a vezérlőprogram által generált, elsőmérési adatokat tartalmazó fájlt. Ezt követően az elsőfelfutó és lefutó vezérlőfeszültség után mérhetőlassú válaszjelekre, az I 0 , A , LCM ,  és (t 0 ) paraméterek keresésével rendre illeszti az (8.2.1.) egyenletben matematikai formát öltött modellt, majd a folyadékkristályra jellemzőkarakterisztikus paramétereket ( LCM , ) és a t 0 időponthoz tartozó fázisértéket lerögzíti, hogy ezzel – a „8. 1. Válaszjel kiértékelés új formája” címűalfejezetben megadott értékhez képest – tovább csökkentse (t ) meghatározásának bizonytalanságát. Minden újabb ciklus a következőmintavételezés eredményét tartalmazó fájl keletkezésének pillanatában indul. Az algoritmus az első ciklusban szabadon hagyott paraméterek illesztésével meghatározza a relatív fázistolást és az illesztés jóságát (a mért görbék illesztettel számolt szórását), majd az új és addigi eredményeket az időfüggvényében ábrázolja a monitoron. (8.2.-2. ábra)

8. 3. A zaj hatásának csökkentése referencia alkalmazásával Az előzőfejezetben láthattuk, hogy a rácscsatolt interferométer ígéretes, költséghatékony eszköze a refraktometriai kísérleteknek, azonban érzékenysége még messze elmarad a legjobb optikai jelátalakítók ~10-6-os teljesítőképességétől. Ennek egyik oka a Mach-Zender egység kellemetlen mellékhatása, miszerint a mérőés referencia ágakban terjedőnyalábok fázisa a hosszú, szabad terjedésűoptikai utak során, a levegőturbulencia és egyéb mechanikus rezgések hatására egymástól függetlenül, időben véletlenszerűen változik. Nagy jelentőségű lenne tehát egy olyan módszer kidolgozása, mely valamilyen módon kiiktatná az innen eredő mérési bizonytalanság jelentős érzékenység csökkentőhatását. A fenti problémára egy aligha járható út az, ha az interferométer szigetelését minden határon túl megerősítjük. Egy másik lehetőség az, ha a szóban forgó egység méreteit jelentős mértékben csökkentjük, vagy egy alkalmas integrált optikai elemmel helyettesítjük. Ennek megvalósítása egyelőre technikai jellegű korlátokba ütközik. Egy egyszerű, könnyen kivitelezhetőmegoldás ellenben a következő: Egy új mérőágat hozunk létre úgy, hogy az interferométerből kilépőpárhuzamos nyaláb intenzitásának néhány százalékát egy megfelelő vastagságú, az integrált optikai egység közvetlen közelébe helyezett plánparalel üveglemez segítségével visszaverve eltérítjük eredeti útvonalából. Ezt követően az üveglemezt olyan szöghelyzetbe forgatjuk, hogy a határfelületeiről reflektálódó párhuzamos nyalábok közül kettő– az interferométer különbözőágaiból érkező– fedésbe kerüljön egymással, azaz

74


8.3.-1. ábra: Egy elegendő en vastag plánparalel üveglemez segítségével a párhuzamos nyalábok intenzitásának kis hányada kicsatolható és interferáltatható. Az így keletkezett interferencia válaszjel referenciaként szolgál (referencia interferencia válaszjel).

interferáljanak. (8.3.-1. ábra) Ezt a második, referencia interferencia jelet egy második detektorba irányítjuk, majd háromcsatornás méréssel az elsődetektorral mért válaszjellel egyetemben kiértékeljük. A kapott fázisokat egymásból kivonva, a szabad terjedésűszakasz zajhatásainak kiiktatása megvalósítható. (8.3.-2. ábra) Referencia alkalmazásával a rendszert terhelőzaj már főként az integrált optikai egységből és a méréskiértékelés bizonytalanságából adódik. E módszer előnye továbbá az is, hogy az interferométer egységben ébredőnagyfrekvenciás változásokon kívül, a hőmérsékleti hatások alacsonyfrekvenciás jelcsúsztató (ang. drift) hatásait is képes kompenzálni. Referencia alkalmazása ily módon zajjal terhelt környezetben stabilabb és érzékenyebb mérést tesz lehetővé.

75


8.3.-2. ábra: Háromcsatornás méréssel a szabad fényterjedésű szakasz zajhatásai kiiktathatók.

8. 4. Nagy felbontású kísérletek rácscsatolt interferométerrel A jelátalakítók napjaink egyik legfontosabb alkalmazási területe a gyorsan fejlődő, így egyre nagyobb érzékenységet kívánó biológiai felismerőelem - célmolekula típusú kutatások. Az „5. 2. Jelölésmentes érzékelők jelátalakítói” címűalfejezetben bemutatott optikai eljárások törésmutató-, illetve adlayer vastagságváltozásra vett érzékenysége egyetlen kivétellel 10-6, illetve néhány pg/mm 2 felett van. Jelen alfejezet tárgya, hogy refraktometriai és biológiai kísérleteken keresztül megvizsgálja az előző alfejezetekben összefoglalt fejlesztések eredményeképp feljavított, második generációs rácscsatolt interferométer teljesítőképességét. Továbbá választ kíván adni arra is, hogy a szóban forgó eszköz hová sorolható be az 5.2.4.-I. táblázatban felsorolt legnépszerűbb optikai jelátalakítók előkelőtáborában.

8. 4. 1. Refraktometria és fehérje adszorpció vizsgálat Biológiai érzékelőfejlesztésének egyik kulcs mozzanata az összeállítás érzékenységének és biológiai vizsgálatokra való alkalmasságának bemutatása. Minden esetben tehát egy olyan egyszerű, közismert és általánosan elfogadott alapkísérletet kell terveznünk, mely sikeres elvégzésével jól megmutathatók a műszer kivételes tulajdonságai. Kollégáimmal egy vegyes, refraktometriai és biológiai egységekből álló kísérletet láttunk ilyennek. Terveink szerint, először ismert törésmutatójú glicerin oldatot áramoltatva át a folyadékcellán meghatározzuk a rendszer törésmutatóra vonatkoztatott felbontását, majd egy tesztfehérje, esetünkben immunglobulin-G (ang. immunoglobulin-G - IgG) szenzorfelületi adszorpcióját követve visszaszámoljuk az adlayer vastagságát és felületi tömegsűrűségét, majd ezeket összevetjük az irodalmi értékekkel. 76

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez A folyadékcellába tehát folyamatos (nem szakaszos), 0,25 ml/perc sebességűáramoltatás mellett rendre a következőoldatokat fecskendeztem be: 1.) foszfát puffer (ang. phosphate buffered saline - PBS), 2.) 1 %-os glicerin - PBS oldat, 3.) foszfát puffer, 4.) 0,2 mg/ml koncentrációjú IgG oldat, majd 5.) foszfát puffer. A felsorolt oldatok átáramoltatásának hatására a második generációs rácscsatolt interferométerrel a 8.4.1-1. ábrán látható görbét mértem.

8.4.1-1. ábra: A vegyes refraktometriai és biológiai kísérletben a második generációs rácscsatolt interferométerrel mért kísérleti eredmény. (A fenti mérési görbe 5438 válaszjel feldolgozásából született, melyek egyenként 1225 független adatpontot tartalmaztak.)

A kísérlet elsőszakaszában felvett alapvonal meghatározza az interferométer érzékenységét és stabilitását. Az előbbit e szakaszon mérhetőrelatív fázisértékek átlaghoz viszonyított szórásából számolhatjuk, hiszen ennek háromszorosa adja meg a rácscsatolt interferométer (szög)felbontását. Ez az érték 2,7 x 10 -3 radian-nak adódik, mely legalább egy nagyságrenddel meghaladja a válaszjel fázisának kiértékelési bizonytalanságát még abban az esetben is, ha elfeledkezünk arról a tényről, hogy az itt ábrázolt fázisértékek 2 másodperces időablakok átlagai. Megállapítható tehát, hogy a kiértékelési eljárás nem korlátozza az érzékenységet. A

77

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez stabilitást az alapvonalon mérhetőjelcsúszás (drift) mértéke tükrözi, mely egy percre vetített értéke kisebb, mint a rendszer felbontása. A második szakaszban a folyadékcellát 1 %-os glicerin - PBS oldattal öblítettem át, melyre a rácscsatolt interferométer válaszjelének (a fentiekben megadott bizonytalanság mellett) 3,9584 radian eltolódásával reagált. Ezt – az előzőfejezet mintájára – összevetve az oldatok törésmutató különbségével (1,39 x 10-3, meghatározva az 5 tizedesjegyre pontos Rudolph Refractometer-rel) és a mérés felbontásával kapjuk, hogy a rendszer törésmutatóra átszámított érzékenysége jobb, mint 10-6. Az elsőés második szakasz szerepe nem csupán a felbontás és stabilitás meghatározásában rejlik. A későbbi számítások szempontjából egy rendkívül fontos tényező, – mely mindezidáig csak pontatlanul volt meghatározható – az érzékelőfelület hossza is megadható a mérés eddig ismertetett paraméterértékei és a hullámvezető opto-geometriai paraméterei alapján. Spektroszkópiai ellipszometriai méréseimre támaszkodva a kísérletben használt integrált optikai egység hullámvezető filmjének és hordozójának törésmutatója a 632,8 nm-es hullámhosszon rendre 1,472 ± 0,001-nek és 2,146 ± 0,002-nek állapítottam meg. A hullámvezetőréteg vastagságára 196,5 ± 0,1 nm-t kaptam. A differenciálás láncszabályának segítségével a (7.4.1.) egyenletet felhasználva a relatív fázistolás a következőalakba írható át:   N   n k 0  L Sc  nc , N nc c

(8.4.1.)

ahol Sc ≈0,149, a módusegyenlet (ld.: „13. 5. Hullámvezetés izotróp közegben”) segítségével a fentiekben ismertetett hullámvezetőparaméterértékekbő l numerikusan meghatározott, a fedőnc törésmutatójának megváltozására mutatott érzékenység. A (8.4.1.) egyenletbe történő behelyettesítéssel adódik, hogy az érzékelőfelület hossza ≈1,8 mm, mely jól egyezik az egyéb

(terjedelmi

okokból

nem

ismertetett)

jóval

pontatlanabb

mérési

eljárások

eredményeivel. Az 1 %-os glicerin - PBS oldatot visszamosva tiszta PBS oldattal a válaszjel fázisa visszatér eredeti, kezdeti állapotába ezzel bizonyítva az összeállítás kiváló reverzibilitását és új alapvonalat szolgáltatva a mérés következő, biológiai részének. A mérés negyedik szakaszában az IgG-t tartalmazó foszfát puffer oldat árama éri az érzékelő felületet, mely hatására megkezdődik a fehérje adszorpciója. A felületen növekvőfehérje vékonyréteg megváltoztatja a rendszer effektív törésmutatóját, így eltolja a válaszjel fázisát is.

78

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Amennyiben a keletkezővékonyréteg vastagságát dA-val jelöljük, a relatív fázistolást az előző egyenlet mintájára a következőalakban írhatjuk fel:   N   d A k 0  L SA  d A , N d A

(8.4.2.)

ahol SA ≈2,2 x 10-4 nm-1 a hullámvezetőparaméterértékeiből a módusegyenlet segítségével numerikusan meghatározott, a felületen növekvőadlayer dA vastagságának megváltozására adott érzékenység. Érdemes a szóban forgó felfutó szakaszra exponenciálist illesztenünk, mert ekkor a kapott paraméterértékekből könnyedén meghatározhatjuk a fehérje adszorpció telítési értékét. Az illesztés alapján ΔΦ = 27,238 ± 0,046 radian, mely érték hibája vezetőrendben az illesztés bizonytalanságából adódik. A fehérjeréteg törésmutatóját szakirodalmi adatok alapján nA = 1,46-nak feltételezhető [71]. Ezeket az értékeket a (8.4.2.) egyenletbe helyettesítve a felületre adszorbeált (homogén és izotrópnak vélelmezett) IgG vékonyréteg telítődésekor mérhetővastagságára ≈6,8 nm-t kapunk. A felületi tömegsűrűséget a de Feijter formula adja:

d A

n A nc , dn / dc

(8.4.3.)

ahol dn/dc értéke szintén szakirodalmi adatok alapján 0,18 cm 3/g-nak vehető[67]. A megfelelőértékeket a (8.4.3.)-as összefüggésbe helyettesítve a felületre adszorbeálódott fehérjeréteg felületi tömegsűrűsége ≈4,8 ng/mm2. Mind a fehérjeréteg vastagságára, mind a felületi tömegsűrűségére kapott értékek jól egyeznek a tudományos irodalomban feljegyzettekkel [71]. Végül az utóbbiból könnyen meghatározhatjuk a rendszer felületi tömegsűrűségre vett felbontását. Ez az érték a fentiekben már ismertetett, egyszerű matematikai kalkulációból ≈0,5 pg/mm2 -nek adódik. Megjegyzendő, hogy felhasználva a fehérje molekulatömegét (≈ 160 kDa), valamint a fentiekben meghatározott felületi tömegsűrűségét, az egyetlen IgG-re jutó átlagos felületegység ≈55 nm2-nek adódik telítődéskor. Az ötödik szakaszban történőPBS mosást követően ez az érték ≈68 nm2-re nő, azonban ezt összevetve a fehérje méretével (≈7 nm x 10 nm x 2 nm) kijelenthető, hogy még ekkor is egy viszonylag sűrűIgG réteg található a Ta2O5 film felszínen.

79

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Az elsőkísérlet tehát bizonyította, hogy a második generációs rácscsatolt interferométer érzékenységben messze felülmúlja az előzőfejezetben ismertetett elsőprototípust, igazolva ezzel a fejlesztések jelentős, előre mozdító hatását. A mérésből számított, fehérjerétegre vonatkoztatott vastagság és felületi tömegsűrűség értékek az irodalmi adatokkal összecsengenek, mely alapján kijelenthető, hogy a rácscsatolt interferométer ígéretes jelöltje a rendkívüli érzékenységet és hitelességet igénylő felismerő elem - célmolekula típusú kísérletek jelátalakító eszközének. Azt, hogy az „ígéretes” jelző„kiváló”-ra cserélhető, egy második kísérlet eredményeivel igazolom.

8. 4. 2. Felismerőelem - célmolekula típusú érzékelés Napjaink

gyógyszerkutatási

törekvései

olyan

nano-hatóanyag

jelöltek

vizsgálatára

összpontosítanak, melyekre jellemző, hogy néhány tíz- vagy százezer Dalton molekulatömegű felismerőelemekkel kölcsönható, 500 Da-nál kisebb tömegűcélmolekulák. Így tehát az igény jelentős egy olyan jelátalakító eljárásra, mely képes az ilyen parányi célmolekulák hatalmas felismerőelemekhez való specifikus bekötődését is felbontani [58]. Az avidin-biotin rendszerek megkapó tulajdonsága, hogy alkotóik rendkívül erősen kötnek egymáshoz, disszociációs állandójuk hozzávetőlegesen 10-15 M. E tulajdonság és az elmúlt két évtized intenzív kutatása e kölcsönható fehérjékből építkezve hatékony eszközöket hozott létre a biológia, biokémia és biotechnológia tudományterületeit kutatók számára például a különböző lokalizációs, orvos diagnosztikai és rekombináns géntechnológiai eljárások területén [65]. Mivel az avidin-biotin kötés olyan erős, hogy ezzel nem versenyezhet egyetlen más, az oldatból odajutó molekula sem, kiváló tesztfehérjéi az új jelátalakító eljárásoknak. Tekintve, hogy az avidin molekula tömege 66 kDa, ezzel szemben a biotiné ennél ≈270-szer kisebb, csupán 244 Da [84], kutatók gyakran a biotinnal beborított érzékelőfelülethez kötődő avidin jelét mérik, vagy az ún. biotinilált (biotinnal jelölt) molekulák (oligonukleotidek, antitestek, vezikulák) érzékelőfelülethez rögzített (immobilizált) avidinekhez való kötését követik nyomon [7]. Világos, hogy a nagyobb kihívás az, ha a felülethez először az avidint immobilizáljuk, majd az apró biotin bekötődésének jelét mérjük. Az a jelátalakító eljárás, amelyik képes felbontani ezt a parányi effektust, jó eséllyel bármely más biológiai kölcsönhatás vizsgálatának hatékony eszköze lesz. A következőkísérletben a rácscsatolt interferométer kiváló teljesítőképességét kívánom bizonyítani az imént felvezetett kölcsönhatás kimérésével. A kísérlet menete a következővolt: Az érzékelőfelületet Dr. Kurunczi Sándor 3-aminopropiltrietoxi-szilánnal (APTES) előkezelte, majd az így aktivizált integrált optikai egységet 80

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez azonnal a PBS pufferrel feltöltött folyadékcella alá helyeztem. 1.) A puffer 1 ml/perc sebességű, folytonos áramoltatása mellett felvettem az alapvonalat, majd 2.) 2,5%-os glutáraldehid keresztkötő(GA) - PBS oldatot fecskendeztem a folyadékcellába. 3.) A felületet átöblítettem tiszta puffer oldattal, hogy a felesleges GA molekulák távozzanak a rendszerből, és így megfelelőalapvonalat kapjak a 4.) 0,1 mg/ml koncentrációjú puffer oldatban feloldott avidin felületi immobilizációjának kiméréséhez. Az avidin immobilizáció lassú szakaszát megszakítva 5.) hosszan, PBS oldat áramával távolítottam el a felülethez nem megfelelően kötött avidin molekulákat. 6.) A stabilizálódott felületi rétegre 1 μg/ml koncentrációjú biotin oldatot juttattam. A kísérlet eredményét a 8.4.2.-1. ábra szemlélteti. (A fentiekben alkalmazott immobilizációs eljárásról bővebben a „6. 1. 1 Mintakészítés” címűalfejezetben olvashatunk.)

8.4.2.-1. ábra. Az APTES - GA aktivált érzékelőfelületre immobilizált avidin a biotin oldat áramában specifikusan megköti célmolekuláját (betét kép). (A fenti mérési görbe 1. - 5. szakaszában 6340, míg a 6.-ban 7330 válaszjel feldolgozásából született, melyek egyenként 1225 független adatpontot tartalmaztak.)

A továbbiak szempontjából fontos tudnunk, hogy egyetlen avidin molekula négy biotin kötőhellyel rendelkezik [85]. Az immobilizáció során azonban az avidin fehérjék

81

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez véletlenszerűen orientálódva rögzülnek a felszínhez, így nem valószínű, hogy az összes kötőhely szabadon hozzáférhető. Lássuk, milyen értékre következtethetünk a 8.4.2.-1. ábrán látható kísérlet elemzéséből! Mivel előzőleg már igazoltuk a rácscsatolt interferométer linearitását, stabilitását és hitelességét, a harmadik és az ötödik szakaszban mért alapvonalakhoz tartozó fázis értékek különbsége a felületre immobilizált avidin molekulák, biotin oldat beáramlásának pillanatában mérhetőmennyiségével arányos kell legyen. A mérési adatokból kiolvasható relatív fáziskülönbség (természetesen az előzőalfejezetben megállapított mérési hibával terhelve) ≈17,2453 radiannak adódik. A hatodik szakaszban mért fázisugrás a biotin oldat folyadékcellába való beáramlásakor mért jel, melyet a 8.4.2-1. ábra betét képén kinagyított formában is szemügyre vehetünk. Megfigyelhetjük, hogy a kezdeti, hirtelen jelemelkedést egy lassabb csökkenés követi. Egy pillanatra elhalasztva e szokatlan viselkedés magyarázatát illesszünk az f (x ) A1 e x / 1 A2 e x / 2 c

(8.4.4)

alakú függvényt a mért pontokra, hogy a két, egymással átfedőjelenséget szétválaszthassuk. (8.4.2.-2.a. ábra) A1 illetve A2 a különbözőelőjelűváltozások amplitúdója, 1 és 2 ezek karakterisztikus időállandója, c pedig egy konstans additív tag. Az illesztés eredménye szerint az emelkedő szakasz amplitúdója ≈ 9,9 x 10-2 radian, mely hozzávető legesen fele a csökkenőének. A kritikus időállandókra kapjuk, hogy az előbbihez tartozó körülbelül 4 másodperc, míg az utóbbit jellemzőhozzávetőlegesen 5 perc. Egyszerűaránypárokat véve, a biotinhoz és avidinhoz tartozó relatív fázistolás és molekulatömeg értékek arányának hányadosa adja, hogy egyetlen avidin átlagosan 1,55 ± 0,02 biotint kötött meg. A 4 másodperces jelnövekedés pedig jól tükrözi az avidin és biotin molekulák egymáshoz való rendkívüli affinitását. Amennyiben összevetjük az 8.4.2.-2.a. ábrán látható mérési eredményt a 8.4.2.-2.b. ábrán bemutatott, Konopsky és Alieva által kifejlesztett fotonikus kristály felületi hullám (ang. photonic crystal surface wave - PC SW) bioszenzorral hasonló biológiai rendszeren mért eredménnyel [86], a szembeötlő nagyfokú egyezés is alátámasztja a rácscsatolt interferométer mérési eredményeit. Végül a biotin bekötődéshez tartozó relatívfázistolás értékből a szokott módon meghatározható, hogy az interferométer akár már néhány 10 Da molekulatömegűcélmolekulák bekötődését is képes detektálni.

82


8.4.2.-2. ábra: a.) Rácscsatolt interferométerrel, b.) fotonikus kristály felületi hullám bioszenzorral mért, a biotin megkötés hatására kapott jel.

Fontos kitérnünk egy megjegyzés erejéig a következőre is: a fenti kísérletben szereplőbiotin molekulákról nem állítható teljes bizonyossággal, hogy mindegyik, kivétel nélkül valamelyik avidin kötőhelyhez kapcsolódik. Elképzelhetőtehát, hogy vannak köztük olyanok is, melyek máshol találnak maguknak helyet, s mi így a valódi pozitív kötési események mellett álpozitívokat is számításba veszünk. Ezek aránya azonban várhatóan kicsi, a mérési bizonytalanság mellett elhanyagolható érték kell legyen. Ezt három érv is alátámasztja: 1.) E két molekula kölcsönhatása rendkívül erős, így egy avidinnel sűrűn fedett felület esetén a párok kapcsolódása erősen preferált folyamat kell legyen. 2.) Az egyetlen avidin molekulára jutó biotin szám a maximális 4 helyett csupán átlagosan 1,55. 3.) A biotin molekulák érkezésének hatására a jelátalakító válaszjelének fázisa egy nagyon dinamikus, 4 másodperces kritikus időállandóval jellemezhetőugrással válaszol, melyet egy adszorbeálódó réteg esetén aligha tapasztalhatnánk. A biotin molekulák hirtelen bekötődését követőlassabb jelcsökkenés egyértelműmagyarázata e dolgozatban foglaltak alapján nem adható meg. Megfelelően alátámasztott okfejtéshez számos további jól tervezett és jól kivitelezett egyéb mérés szükséges. Érdemes lenne megvizsgálni, hogy a tapasztalt jelenséget esetleg a biotin bekötődésének valamilyen következményeként a felületről leváló avidin molekulák (esetleg avidin - biotin egységek) okozzák-e. Egy másik érdekesnek tűnővizsgálat tárgya lehetne, hogy a biotin bekötődésének hatására az avidin fehérje válaszolhat-e olyan konformációváltozással, mely a válaszjel fázisának a fentiekben bemutatott csökkenését okozza.

83


8. 5. Összegezés és kitekintés A fenti eredményeket összegezve elmondható, hogy a második generációs rácscsatolt interferométer törésmutató felbontása jobb, mint 10 -6, felületi tömegsűrűség érzékenysége hozzávetőlegesen 0,5 pg/mm2, illetve segítségével akár néhány 10 Da molekulatömegű célmolekulák bekötődése is nyomon követhető. Az itt felsorolt paraméterek alapján kijelenthető, hogy e bioszenzor egyetlen kivétellel felülmúlja korunk legnépszerűbb, legelterjedtebb optikai jelátalakítóit. (vö.: 5.2.4.-I. táblázat) Bár a dupla polarizációs interferométerek teljesítőképessége jelenleg még valamivel jobb az általam kifejlesztett műszerénél, azonban a következő bekezdésben összefoglalt fejlesztési tervek mielőbbi megvalósításával a rácscsatolt interferométer érzékenysége várhatóan még legalább egy nagyságrenddel javítható lesz. Mivel az elme gyakran gyorsabb az ötleteket valóra váltani képes kezeknél, számos elméletben már megoldott probléma vár még kivitelezésre. Ezek közül néhány, mely a közeljövőben várhatóan legalább még egy nagyságrenddel javítja a rácscsatolt interferométer felbontását, illetve segíti versenyképességét azok a következők: Hullámvezető rétegek minőségének fejlesztésével jobb nyalábszeparáció érhető el, mellyel egyenes arányban növelhetőa felbontás is. Új, célorientált vezérlőelektronika kifejlesztésével optimalizált mintavételezés lesz majd megvalósítható, melytől szintén érzékenységnövelőhatást várunk. Hőmérsékletstabilizált folyadékcellákkal, (később mikrofluidikával) akár kedvezőtlenebb, nem laboratóriumi körülmények között is mérhetünk majd. Egy új generációs, rácscsatolók rendszerével ellátott integrált optikai chip, ún mikrotitráló lap segítségével nagyszámú mérés lesz majd végezhető egy időben. Egyszerűen használható grafikus felületű vezérlő szoftverekkel kívánjuk majd segíteni az alkalmazás orientált felhasználókat. Végezetül megemlíteném, hogy távlati célunk a két módusos (TE, TM) és a több hullámhosszas mérési összeállítások kifejlesztése is. Egyelőre csupán homályos vágyálom, a 100%-ig integrált optikai rácscsatolt interferométer megalkotása.

84


9. Rácscsatolt interferométer - spektroszkópiai ellipszométer kombinált összeállítás Jelen fejezet a rácscsatolt interferométer és spektroszkópiai ellipszométer integrálásából megszületett kombinált mérőberendezés szerkezeti vázlatát és elsőmérési eredményeit mutatja be. Az eszköz lényege, hogy a kisebb érzékenységű spektroszkópiai ellipszométer folyadékfázison

(folyadékcellán)

keresztül,

széles

hullámhossz-tartományon

mérve

meghatározza a hordozó felületén épülővékonyréteg opto-geometriai paramétereit, míg a kiemelkedőfelbontással jellemezhetőrácscsatolt interferométer a hordozó felől detektálva feltárja a vizsgált folyamat apró változásait. E két eszköz kombinációja tehát érzékenyebb és információban gazdagabb eredményeket szolgáltat, mint tennék azt külön-külön. A fejezetben ismertetett fehérje adszorpciós kísérlet igazolja, hogy már ez az első prototípus is ≈5 pg/ mm2-es felületi és néhány 10 pg/mm2 mélységbeli érzékenységgel képes detektálásra úgy, hogy közben mindkét mérési eljárás előnyei megtarthatók.

Az érzékelők előnyei nem csupán teljesítőképességükkel, árukkal és méretükkel fejezhetők ki. Rendkívül fontos tulajdonságuk lehet a más eszközökkel való kombinálhatóságuk is, hiszen a jól megválasztott műszerek összeépítésével az egyedi hiányosságok kiküszöbölhetők. A szakirodalom számos olyan hibrid műszerről számol be, melyek esetén valamely eljárás jelét erősíti fel egy másik. Ilyen például a felületi plazmon rezonanciával érzékenyített ellipszometria [16], az interferometrikus fázismodulált ellipszometria [87], illetve a rácscsatolt interferometria is. Meglepő azonban, hogy kevesebbet olvashatunk olyan kombinált készülékekről, amelyek azonos pontban, két eljárással való mérést tesznek lehetővé egy időben. Jól kiválasztott technikák ilyen jellegűösszeházasításának előnye minden esetben az, hogy a két eljárás által függetlenül szolgáltatott mérési adatok egymást kiegészítve részletesebb folyamatanalízist tesznek lehető vé. Tekintsük példának a kvarc kristály mikromérleg és az ellipszometria kombinációját [46, 88], mely lehetővé teszi a felületre leváló anyag tömegének és a létrejött vékonyréteg struktúra opto-geometriai paramétereinek egyidejűés érzékeny mérését. A dolgozatban bemutatott rácscsatolt interferométer nem tartalmaz mozgó alkatrészeket, így könnyen összeépíthetőmás eszközökkel. A kérdés tehát az, hogy mely mérési eljárásokkal történőa kombinációja lenne előnyös? A spektroszkópiai ellipszométer számos ok miatt hatékony kiegészítője, komplementere lehet a rácscsatolt interferométernek. Mindkettőgyors

85

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez roncsolásmentes optikai eljárás, így kombinációjuk szintén alkalmas gyors folyamatok nyomon követésére. A kisebb érzékenységűspektroszkópiai ellipszométer folyadékfázison (folyadékcellán) keresztül, széles hullámhossztartományon mérve meghatározza az összetett vékonyréteg-rendszerek

opto-geometriai

paramétereit.

A

kiemelkedő felbontással

jellemezhetőrácscsatolt interferométer hordozó felől detektálva feltárja a vizsgált folyamat apró változásait, azonban összetett rétegrendszerek esetén nem képes feltárni azok részleteit. E két eszköz együttese tehát érzékenyebb és információban gazdagabb eredményeket szolgáltat, mint tennék azt külön-külön. Mivel a rácscsatolt interferométer érzékenysége a felületközeli tartományokra koncentrált, az ellipszometria azonban a teljes fényúton detektál, szellemes kísérletek tervezése esetén elképzelhetőaz is, hogy az eddig elválaszthatatlan folyamatokat alkotóikra bontsunk.

9. 1. A mérési összeállítás Doktori munkám keretében, egy olyan rácscsatolt interferométer - spektroszkópiai ellipszométer kombinált összeállítást építettem, mely segítségével azonos pontban, két különbözőoptikai jelátalakító eljárással követhetőnyomon egy időben a vizsgálni kívánt folyamat. A kísérleteket az előzőfejezetekhez hasonlóan most is a rácscsatolt interferométer integrált optikai egységére illesztett folyadékcellában végeztem. Az egyetlen különbség, hogy az itt alkalmazott cella két kvarc ablakkal is rendelkezik, hogy az ellipszométer vizsgáló fénynyalábja szintén érhesse az érzékelőfelületet, illetve, hogy innen visszaverődve a detektorba juthasson. (9.1.-1. ábra) Fontos megjegyezni, hogy az ellipszométerek folyadékcellái technikai okokból egyetlen fix, azonban (0° és 75° között) szabadon megválasztható beesési szögre tervezhetők. Ennek értékét a későbbiekben használt oldatok és a hullámvezetőoptikai tulajdonságainak ismeretében úgy optimalizálhatjuk, hogy a lehető legnagyobb érzékenység mellett mérhessünk majd a kísérletek során. Szimulációk alapján a beesési szög értékét 55°-ban határoztuk meg. E kombinált műszer megtervezésekor két tényezőt kellett szigorúan figyelembe vennem. Az elsőaz, hogy a forgó alkatrészeket tartalmazó ellipszométer fejek (fényforrás, detektor) semmiképp sem lehetnek direkt mechanikai kapcsolatban az optikai asztallal, mert az ezen megépített rácscsatolt interferométer felbontása – azok rezgést keltőhatása miatt – jelentősen csökkenne még referencia alkalmazása esetén is. A második, hogy a beállíthatóság érdekében, az összeállítás minden eleme finoman, egymástól függetlenül pozícionálható kell legyen a fényutaknak megfelelően, még teljesen összeszerelt állapotban is.

86


9.1.-1. ábra: A rácscsatolt interferométer - spektroszkópiai ellipszométer kombinált mű szer jelátalakító egységének sematikus vázlata.

a.)

b.)

9.1.-2. ábra: A megvalósított rácscsatolt interferométer - spektroszkópiai ellipszométer kombinált műszer kísérleti elrendezése látható az a.) ábrán. A felső , fehér ellipszissel határolt rész nagyított formában a b.) ábrán tekinthetőmeg.

87

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez A fentiek figyelembevételével az ellipszométer fényforrását és detektorát rögzített szögben tartó, horizontális és vertikális irányokban mozgatható vázszerkezetre csavaroztam, majd ezt a gumitömlőkkel rezgésmentesített optikai asztalt tartó alátámasztásra helyeztem. A rácscsatolt interferométer integrált optikai egységét, és rajta az ellipszométer vizsgáló fénynyalábjának megfelelően pozícionált folyadékcellát egy hat szabadsági fokú, finoman szabályható tárgyasztalon rögzítettem. Az optikai asztalon úgy rendeztem el a második generációs rácscsatolt interferométer további elemeit, hogy a szabad terjedésűrészből kilépőpárhuzamos nyalábok becsatoljanak az integrált optikai egységbe. A méréseket két külön számítógép, az előzőfejezetekben ismertetett programokkal vezérelte. A megvalósított összeállítás a 9.1.-2. ábrán látható.

9. 2. Az elsőmérési eredmény A kombinált rendszer működőképességének igazolására egy egyszerűfehérje adszorpciós kísérletet terveztem. Célom az volt, hogy a két eszköz által szolgáltatott jel összehasonlításából következtethessek arra, hogy az összeállítás valóban ígéretes-e a tervezett, összetettebb kísérletek vizsgálatára. Ahhoz, hogy ez az adszorpciós folyamat jól mérhetőlegyen mindkét eljárással, a következőket kellett figyelembe vennem: Egyrészről, a leválasztott fehérjeréteg vastagsága nem érheti el az evaneszcens mezőáltal pásztázott réteg karakterisztikus vastagságát. Ez biztosítja a rácscsatolt interferométer érzékenységét a fehérjevékonyréteg térfogatában. Másrészről, az ellipszométer nagyságrendekkel kisebb felbontását figyelembe véve – hogy vastagabb monoréteget kapjunk – a teszt fehérje molekulatömege relatíve nagy kell, hogy legyen. Megjegyzendő, hogy ezek a megkötések még tág határokat biztosítanak a választásra. Előkísérletek alapján a szakirodalomban jól ismert, 340 kDa molekulatömegű, 45 nm x 9 nm x 6 nm-es bennfoglaló méretű fibrinogén fehérjét választottam [89, 90]. A folyadékcellát 0,5 ml/perces áramlási sebesség mellett folyamatosan addig öblítettem PBS oldattal, míg stabil alapvonalat nem mértem a rácscsatolt interferométerrel is. Ezt követően 0,1 mg/ml koncentrációjú fibrinogén oldatot áramoltattam a cellába. A fehérje felületi adszorpciójának lassú szakaszát megszakítva újra PBS oldattal öblítettem át a cellát. A rácscsatolt interferométer által mért relatív fáziskülönbség értékeket a „8. Rácscsatolt interferométer bioszenzorikai kísérletekhez” című fejezetben leírtaknak megfelelően határoztam meg. A spektroszkópiai ellipszométerrel mért spektrumokból (a „6. 2. In situ felületanalízis” címűalfejezetben felvázolt kiértékelési ismeretek alapján) kapott vastagság és törésmutató értékekre a de Feijter formulát alkalmazva, számoltam ki az adszorbeálódó

88


9.2.-1. ábra: A kombinált kísérleti összeállítással mért fibrinogén fehérje felületi adszorpciójának idő fejlő dése. Az a.) ábrán a rácscsatolt interferométerrel, a b.) ábrán a spektroszkópiai ellipszométerrel kapott kísérleti eredmények láthatók. A c.) ábra a két mérés egymáshoz illesztett görbéi láthatók.

fehérje felületi tömegsűrűségét. A kombinált műszerrel kapott, 6 másodperces időablakokra átlagolt kísérleti eredményeket a 9.2.-1.a. és 9.2.-1.b. ábra szemlélteti. A 9.2.-1.c. ábrán látható, hogy a két független mérésből származó görbe hibahatáron belül egymáshoz illeszthető. Ez

pedig

bizonyítja,

hogy

a

folyadékcellabeli kísérletek egyidejűvizsgálatára.

89

műszer

kombináció

valóban

alkalmas

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Megjegyzendő,

hogy

a

spektroszkópiai

ellipszométer

érzékenysége

a

széles

hullámhossztartományban rögzített spektrumbeli apró változások integrálásából származik. Ennek okán nem képezhette az összehasonlítás alapját egyik, tetszőlegesen kiválasztott hullámhosszon mért ellipszometriai mennyiség sem. Mivel a rácscsatolt interferométer tulajdonképpen az érzékelő felületen végbemenő anyagmennyiség változást méri, a legmegfelelőbb eljárás, ha az ellipszometriai spektrumok kiértékeléséből számított felületi tömegsűrűséget hasonlítjuk össze a relatív fáziskülönbség értékekkel. A rácscsatolt interferométerrel mért görbe alapvonalának átlag körüli szórásából meghatározhatjuk a mérés érzékenységét. Ezt összehasonlítva azzal az értékkel, mely az önálló berendezésre érvényes, becsülhetjük, hogy a rácscsatolt interferométer felbontása még a kombinált állapotban is hozzávetőlegesen 5 pg/mm2. Ennek alapján kijelenthető, hogy a műszeregyüttessel a spektroszkópiai ellipszométer felületi vékonyrétegekben végbemenő változásokra való érzékenységét körülbelül egy nagyságrenddel sikerült javítanom.

9. 3. Összegzés és kitekintés A fentiekben nem csupán azt igazoltam, hogy a két eszköz összeépíthetőés ≈5 pg/ mm2-es felületi és néhány 10 pg/mm2 mélységbeli érzékenység mellett alkalmazható egyidejűleg folyadékcellabeli folyamatok nyomon követésére, hanem azt is, hogy az összeépítés előnyös mindkét műszer számára. Arra azonban nem adtam magyarázatot, hogy a kombináció pillanatnyilag miért jár a rácscsatolt interferométer érzékenységének csökkenésével. Ennek oka, hogy az ellipszométer forrás és detektor fejeiben található forgó alkatrészek durva zajhatásától nem szigetelhetőmegfelelően a rácscsatolt interferométer. Megjegyzendő, hogy a rácscsatolt interferométer rendkívüli stabilitása abban is megmutatkozik, hogy e folyamatos rezgés nem tette lehetetlenné a vele való mérést, sőt csupán kis hatással volt az érzékenységére. A jövőben az összeépítés teljesítőképességét olyan (kereskedelemben már kapható, fotoelasztikus modulátort tartalmazó) ellipszométer fejek alkalmazásával kívánjuk javítani [91], melyek – a rácscsatolt interferométerhez hasonlóan – nem tartalmaznak mozgó alkatrészeket. A két statikus rendszer kombinációjával várhatóan tovább javítható a műszeregyüttes érzékenysége. A közeli jövőben olyan kísérleteket kívánunk majd végrehajtani, melyek során intenzíven kihasználhatók a spektroszkópiai ellipszométer és a rácscsatolt interferométer egymást kiegészítőtulajdonságai: A rácscsatolt interferométer érzékenysége a felületközeli régiókra koncentrált, a spektroszkópiai ellipszométeré azonban alkalmas a felülettől távolabbi, a

90

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez rácscsatolt interferométer evaneszcens mezején kívül esőrétegek részletes vizsgálatára is. Így a kombinált összeállítással kísérletileg tovább vizsgáljuk az érzékelőfelülethez rögzített, hosszú flagelláris filamentumok oldatbeli struktúráját. Az ellipszométer a mért spektrumok révén részletes információt ad a hordozó felületét borító vékonyréteg rendszerről. Így önszerveződővékonyrétegek rétegről-rétegre való leválasztásával (a relatív fáziskülönbség értékekből és az ellipszometriai spektrumokból kiértékelt vastagság adatokból) akár kísérletileg is kimérhetnénk az evaneszcens mezőkarakterisztikus paramétereit. Az alkalmazási lehetőségek sorának csupán a képzelet szabhat határt. Bízunk abban, hogy ez az újonnan bevezetett kombinált mérési eljárás olyan kísérleti eredményekre mutathat, melyek mindezidáig rejtve maradtak a kutatók előtt.

91


10. Összefoglalás A nanotechnológia területén az évtized egyik főkutatási iránya olyan érzékelők, érzékelőrendszerek megalkotása és fejlesztése, melyek képesek mind nagyobb és nagyobb érzékenységgel, gyors és költséghatékony módon detektálni akár kisebb molekulák, sőt akár önálló atomok valamilyen felismerőelemhez történőkötődését is. A Pannon Egyetem Nanotechnológia Tanszékén kifejlesztés alatt álló flagelláris filamentumok ígéretes eszközei a jövőúj eredményekre mutató bioszenzorikai kísérleteinek. Ezek a bakteriális eredetűfehérjeszálak várhatóan parányi molekulák, illetve akár atomok nagy affinitású, specifikus megkötését teszik majd lehetővé tervezhetőmódon. Ahhoz azonban, hogy a kötési eseményeket mérhető jellé formáljuk, számos feladatot kell megoldanunk. A megbízható, hiteles érzékelés egyik kulcsa, hogy a flagelláris filamentumokat reprodukálható és pontosan kézben tartott módon válasszuk le az érzékelőfelületre. Doktori munkámban megmutattam, hogy a spektroszkópiai ellipszometria, mint roncsolásmentes és költséghatékony optikai eljárás, alkalmas összetett szerkezetű, sőt akár átlátszó hordozókra leválasztott flagelláris filamentum rétegek opto-geometriai paramétereinek meghatározására. Folyadékcella alkalmazásával e módszer kiválóan használható e fehérjék felületre való leválasztásának in situ és valós idejűnyomon követésére, sőt akár minősítésére is. A spektroszkópiai ellipszométerrel mért spektrumokból, összetett optikai modellekkel a fehérjeréteg

tömegsűrűségének

mélységbeli

változása

megadható,

mely

alapján

a

filamentumok háromdimenziós felületi struktúrája tovább kutatható. A bioérzékelés másik fontos momentuma, a nagy érzékenységűjelátalakító eszköz, mellyel a felismerőelem - célmolekula megkötési események valós időben és in situ nyomon követhetők. Doktori munkám második részében, egy ún. rácscsatolt interferométer jelátalakító prototípus

megépítéséről és

fejlesztéséről számoltam

be.

Biológiai

kísérletekkel

bebizonyítottam, hogy ez az egyszerűés olcsó optikai elemeket tartalmazó eszköz akár hozzávetőlegesen 0,5 pg/mm 2-es, illetve néhány 10 Da-os érzékenység mellett képes a detektálásra. Összehasonlítva napjaink legnépszerűbb és legelterjedtebb jelátalakítóival kijelenthető, hogy e műszer kiváló teljesítőképességével azok nagy többségét felülmúlja. Végezetül megmutattam, hogy a mozgó alkatrészt nem tartalmazó rácscsatolt interferométer nem csupán összeépíthetőa spektroszkópiai ellipszométerrel, hanem e műszeregyüttes alkalmas azonos pontban való párhuzamos mérésekre is.

92


11. Tézispontok – Conclusions

I.

Megmutattam, hogy a spektroszkópiai ellipszometria, mint roncsolásmentes optikai mérési

módszer,

alkalmas

összetett

szerkezetű flagelláris

filamentum

(FF)

fehérjerétegek nagyérzékenységű, ex situ és in situ minősítésére. I.a. Optikai modellt alkottam a hullámvezetőszenzorikában is használatos multirétegszerkezetek, s a felületükhöz kovalensen rögzített FF vékonyrétegek opto-geometriai tulajdonságainak ex situ meghatározására. [T1, T5] I.b.

A

rácscsatolt

interferométer

-

spektroszkópiai

ellipszométer

kombinált

mérőberendezés megépítésének előkészítéseként megmutattam, hogy az eljárás alkalmazható átlátszó hordozók esetén is. Folyadékcellás kísérletekkel igazoltam, hogy a megfelelőoptikai modell kifejlesztésével nyomon követhetőaz épülőFF rétegek tömegsűrűségének időbeli változása, sőt e paraméter mélységbeli eloszlása is meghatározható in situ. Mint lehetséges megoldást, egy matematikai modellt javasoltam, mellyel a spektrum kiértékelésből nyert adatok alapján becslés adható a FF vékonyrétegek várható háromdimenziós szerkezetére. [T2, T6, T11]

It was demonstrated that spectroscopic ellipsometry, a non-destructive optical measurement method can be applied for highly sensitive, ex situ and in situ characterization of the complex structured flagellar filament (FF) protein layers. I.a. Ex situ optical models were constructed to determine the opto-geometrical parameters of multilayer waveguide sensor structures and of the FF thin films deposited onto these surfaces. [T1, T5] I.b. As an initial step in the construction of the grating coupled interferometer spectroscopic ellipsometer combined sensor tool, it was demonstrated that the method is applicable in case of transparent substrates, as well. By introducing a flow-cell and developing the proper optical model, the time evolution of the mass density of the protein layers being deposited was monitored in situ. Moreover, the in-depth distribution of this parameter was also determined in every measurement point. As a possible solution, a mathematical model was proposed to investigate the three-dimensional structure of the filamentous protein layer based on the information obtained from the spectrum evaluation. [T2, T6, T11]

93


II.

Először valósítottam meg a jelölésmentes, optikai érzékelésre alkalmas ún. rácscsatolt interferométer jelátalakító prototípust, majd ezt elsőként alkalmaztam refraktometriai mérések céljára. Ehhez egy rezgésmentesített optikai asztalon összeállítottam a műszerelrendezést, továbbá eljárást dolgoztam ki az eszköz optikai útjainak, valamint mérőés vezérlőelektronikáinak beállítására. Számítógépes vezérlőalgoritmusokat fejlesztettem a jelátalakító válaszjelének rögzítésére és kiértékelésére. Az első, működést igazoló kísérlettel megmutattam, hogy a műszer érzékenyen reagál az érzékelőfelületen végbemenőtörésmutató változásra, majd egy refraktometriai mérési sorozattal meghatároztam, hogy a jelátalakító ezen elsőprototípusa is már ~10-5-es érzékenységgel képes a törésmutató változását nyomon követni. A válaszjel fázisának meghatározásával igazoltam az érzékelés linearitását is. [T3, T7, T8, T9]

For the first time a label-free optical sensor, the grating coupled interferometer (GCI) signal transducer was realized and applied for refractometry. In the interest of the efficient utilization, the prototype was built up on a vibration isolated optical table. Protocols were elaborated for the adjustment of the optical paths and control electronics and computer algorithms were developed to record and analyze the response signal of the transducer. It was demonstrated in the first “proof of the concept” measurements that the sensor reacts sensitively to the refractive index change on the sensing surface. The results of refractometric measurements proved that already the first prototype of GCI has a sensitivity to refractive index changes up to ~10 -5. Calculating the phase of the response signal the linear behavior of the sensing was also demonstrated. [T3, T7, T8, T9]

94


III. Megmutattam, hogy a II. tézispontban megvalósított rácscsatolt interferométer jelátalakító válaszjelének fázisát egy általam fejlesztett modell illesztésével ~10-4 radian pontossággal hatékonyan és stabilan határozhatjuk meg. Valós idejű vezérlő és kiértékelő algoritmust fejlesztettem, mellyel a vizsgált folyamatról azonnali képet kaphatunk a monitoron. Megmutattam, hogy plánparalel üveglemezzel referencia interferencia válaszjel kelthető, mely egyidejű kiértékelésével a műszer szabad fényterjedési egységéből eredőzaj hatékonyan kiszűrhető, így az eszköz érzékenysége javítható. Biológiai teszt kísérletekkel igazoltam, hogy a rácscsatolt interferométer jelátalakító az irodalommal összecsengőeredményekre mutat, illetve bebizonyítottam, hogy akár hozzávetőlegesen 0,5 pg/mm 2-es, illetve néhány 10 Da-os érzékenységgel képes a felületre leválasztott molekulák detektálásra. Összehasonlítva napjaink legnépszerűbb és legelterjedtebb jelátalakítóival, e műszer kiváló teljesítőképességével azok nagy többségét felülmúlja. [T4, T11]

By fitting a model function, it was demonstrated that the phase of the response signal of GCI can be effectively and stably evaluated with the precision of about 10-4 radian. Improved control and evaluation algorithm were developed in order to the real time monitoring of the experiment. By introducing a plan parallel glass slab, it was also demonstrated that a reference interference signal can be created, whose simultaneous analysis allows the effective elimination of the phase noise and fluctuations occurring within the free space optics part of the sensor, consequently, the sensitivity of the device can be improved. It was confirmed by biological test experiments that the measurement results of GCI are in a good agreement with the literature values. Furthermore, the surface mass sensitivity of the signal transducer was proved to be approximately 0.5 pg/mm2 or a few of 10 Da. Comparing to the most popular and world spread instruments of today’s biotechnology GCI overcomes the most devices. [T4, T11]

95


IV. Először terveztem és építettem kombinált mérőberendezést rácscsatolt interferométer és spektroszkópiai ellipszométer integrálásával. A kisebb érzékenységűspektroszkópiai ellipszométer

folyadékfázison

(folyadékcellán)

keresztül,

széles

hullámhossz-

tartományon mérve meghatározza a hordozó felületén épülő vékonyréteg optogeometriai paramétereit, míg a kiemelkedő felbontással jellemezhető rácscsatolt interferométer hordozó felől egyetlen meghatározott hullámhosszon detektálva feltárja a vizsgált folyamat apró változásait. E két eszköz együttese tehát érzékenyebb és információban gazdagabb eredményeket szolgáltat, mint tennék azt külön-külön. Egy egyszerűfehérjeadszorpciós kísérlettel demonstráltam, hogy e műszeregyüttes alkalmas azonos pontban való párhuzamos mérésekre. Bemutattam, hogy már ez az első prototípus is ≈5 pg/mm2-es felületi és néhány 10 pg/mm2 mélységbeli érzékenységgel képes a detektálásra úgy, hogy közben mindkét mérési eljárás előnyeit megtartja. [T10, T11]

For the first time a grating coupled interferometer - spectroscopic ellipsometer combined instrument was designed and realized. The less sensitive spectroscopic ellipsometer determines the opto-geometrical parameters of the sample measuring in a wide wavelength range through the liquid phase (through a flow cell), while the more sensitive grating coupled interferometer detects the tiny changes in the proximate environment of the sensor surface measuring at a distinct wavelength from the substrate side (through the waveguide). Consequently, the combined sensor tool is able to reveal more detailed and more precise information about the sample of interest, than what could be gained by applying the devices separately. In a simple protein adsorption experiment, it was demonstrated that the combined device is able to measure simultaneously at the same sample area. Furthermore, already this first prototype has a sensitivity up to ≈5 pg/mm 2 near the surface and a few 10 pg/mm2 in the liquid phase, while it keeps the individual advantages of the two techniques. [T10, T11]

96

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez A tézispontokhoz szigorúan kapcsolódó publikációk List of enclosed papers

[T1] P. Kozma, N. Nagy, S. Kurunczi, P. Petrik, A. Hamori, A. Muskotal, F. Vonderviszt, M. Fried, I. Barsony, “Ellipsometric characterization of flagellin films for biosensor applications,” Physica Status Solidi (C), vol. 5, pp. 1427-1430, 2008.

[T2] P. Kozma, D. Kozma, A. Nemeth, H. Jankovics, S. Kurunczi, R. Horvath, F. Vonderviszt, M. Fried, P. Petrik, “In-depth characterization of biosensor protein layer deposition

by

in-situ

spectroscopic

ellipsometry,”

Applied

Surface

Science,

doi: 10.1016/j.apsusc.2011.03.081, 2011.

[T3] P. Kozma, A. Hamori, K. Cottier, S. Kurunczi, R. Horvath, “Grating Coupled Interferometry for Optical Sensing,” Applied Physics B, vol. 97, pp. 5-8, 2009.

[T4] P. Kozma, A. Hamori, S. Kurunczi, K. Cottier, R. Horvath, “Grating Coupled Optical Waveguide Interferometrer for label-free Biosensing,” Sensors and Actuators B, doi: 10.1016/j.snb.2010.12.045, 2011.

A tézispontokhoz szigorúan kapcsolódó konferencia előadások és poszterek List of enclosed conference presentations and posters

[T5] P. Kozma, N. Nagy, S. Kurunczi, P. Petrik, A. Hamori, A. Muskotal, F. Vonderviszt, M. Fried, “Ellipsometric characterization of flagellin films for biosensor applications,” 4th International Conference on Spectroscopic Ellipsometry, Stockholm (Sweden), 11 to 15 June, 2007. Poszter bemutatás - Poster presentation.

[T6] P. Kozma, T. Hulber, A. Nemeth, A. Hamori, R. Horvath, S. Kurunczi, P. Petrik, M. Fried, F. Vonderviszt, I. Bársony, “Protein layers for biosensor applications characterized by ellipsometry and atomic force microscopy,” E-MRS 2009 Spring Meeting, Strasbourg (France), 8 to 12 June, 2009. Szóbeli előadás - Oral presentation.

97

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez [T7] P. Kozma, A. Hamori, K. Cottier, S. Kurunczi, R. Horvath, “Biosensing using Planar Mode Interference,” E-MRS 2009 Spring Meeting, Strasbourg (France), 8 to 12 June, 2009. Szóbeli előadás - Oral presentation.

[T8] P. Kozma, A. Hamori, K. Cottier, S. Kurunczi, R. Horvath, “Biosensing using Planar Mode Interference,” Ukrainian-Hungarian Days, Uzhgorod (Ukraine), 3 to 4 November, 2009. Szóbeli előadás - Oral presentation.

[T9] P. Kozma, A. Hamori, K. Cottier, S. Kurunczi, R. Horvath, “Integrated Optical Interference Sensor,” Conference of Chemical Engineering 2010, Veszprém (Hungary), 27 to 29 April, 2010. Szóbeli előadás - Oral presentation.

[T10]P. Kozma, R. Horvath, A. Hamori, S. Kurunczi, K. Cottier, P. Petrik, M. Fried, “A Combined Tool for Simultaneous Measurements by Spectroscopic Ellipsometry and Grating Coupled Interferometry,” 5th International Conference on Spectroscopic Ellipsometry, Albany (USA), 23 to 28 May, 2010. Poszter bemutás - Poster presentation.

[T11]P. Kozma, F. Fodor, A. Nemeth, D. Kozma, A. Hámori, S. Kurunczi, K. Cottier, H. Jankovics, F. Vonderviszt, R. Horvath, P. Petrik, M. Fried, “In depth characterization of flagellar filament protein layers using spectroscopic ellipsometry,” 3rd Nanocharm workshop, Berlin (Germany), 13 to 15 October, 2010. Szóbeli előadás - Oral presentation.

Az I. és II. tézispontokkal az European Materials Research Society (E-MRS) Fiatal Kutató Díját (Young Scientist Award) nyertem a strasbourgi E-MRS konferencia „L” szekciójában 2009. júniusában. The conclusion I. and II. were awarded by the European Materials Research Society (E-MRS) with the Young Scientist Award in section „L” (Strasbourg, July of 2009)

98

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez A tézisponthoz szigorúan nem kapcsolódó és egyéb publikációk Publications not included in this thesis

[T12]P. Kozma, B. Fodor, A. Deak, P. Petrik, “Optical models for the characterization of silica nanosphere monolayers prepared by Langmuir-Blodgett using ellipsometry in the quasistatic regime”, Langmuir, vol. 26, pp. 16122-16128, 2010.

[T13]A. Nemeth, P. Kozma, T. Hulber, S. Kurunczi, R. Horvath, P. Petrik, A. Muskotal, F. Vonderviszt, C. Hos, M. Fried, J. Gyulai, I. Bársony, “In Situ Spectroscopic Ellipsometry Study of Protein Immobilization on Different Substrates Using Liquid Cells,” Sensor Letters, vol. 8, pp. 730-735, 2010.

[T14]S. Kurunczi, A. Nemet, T. Hulber, P. Kozma, H. Jankovics, A. Sebestyen, F. Vonderviszt, M. Fried, I. Bársony, “In situ ellipsometric study of surface immobilization of flagellar filaments,” Applied Surface Science, vol. 257, pp. 319-324, 2010.

[T15]Peter Petrik, Miklos Fried, Eva Vazsonyi, Peter Basa, Tivadar Lohner, Peter Kozma, Zsolt Makkai, “Nanocrystal characterization by ellipsometry in porous silicon using model dielectric function,” Journal of Applied Physics, vol. 105, 024908, 2009.

[T16]M. Vincze, P. Kozma, “Tólengések a Balatonon, a fjordokban és a laboratoriumban,” Természet Világa, vol. 138, pp. 547-550, 2007.

[T17]M. Vincze, P. Kozma, B. Gyure, I. M. Janosi, G. Szabo, T. Tel, “Amplified internal pulsations on a stratified exchange flow excited by interaction between a thin sill and external seiche,” Physics of Fluids, vol. 19, 108108, 2007.

A tézispontokhoz szigorúan nem kapcsolódó konferencia előadások és poszterek Conference presentations and posters not included in this thesis

[T18]P. Kozma, B. Fodor, A. Deak, Zs. Zolnai, P. Petrik, M. Fried, “Optical Models for Nanosphere Layers,” 5th International Conference on Spectroscopic Ellipsometry, Albany (USA), 23 to 28 May, 2010. Poszter bemutatás - Poster presentation. 99


12. Köszönetnyilvánítás Köszönetemet szeretném kifejezni mindazoknak, akik az elmúlt évek alatt munkámat segítették: Témavezetőmnek, Dr. Horváth Róbertnek, hogy a rácscsatolt interferométer fejlesztését az MFAban elindította és bevont az ilyen irányú bioszenzorikai kutatásokba. Dr. Petrik Péternek hálás köszönettel tartozom, hogy az ellipszometriai méréstechnikába bevezetett, s az ilyen irányú tevékenységeimet nagymértékben segítette és koordinálta. Köszönöm, hogy munkámat mindvégig erőn felül támogatták és, hogy hozzáállásukkal, professzinalizmusukkal példát mutattak, s hogy tanácsaikra, lényeglátó javaslataikra minden pillanatban számíthattam. Hálásan köszönöm, hogy szakmai fejlődésemet konferencia részvételekkel, külföldi kutatóutakkal is támogatták. Professzoraimnak Prof. Bársony Istvánnak (az MFA igazgatójának) és Prof. Vonderviszt Ferencnek (a PE-MNDI doktori iskola elnökének) a lehető séget, hogy intézetük tagja lehettem. Köszönöm továbbá, hogy az elmúlt évek alatt mindvégig jó szívvel gondoltak rám, s hogy rendkívül fontos elfoglaltságaik ellenére is, folyamatosan segítették munkámat. Prof. Vonderviszt Ferencnek és munkatársainak hálás köszönettel tartozom továbbá, hogy a flagelláris filamentumokat a kísérleteimhez biztosították. Osztályvezetőmnek Dr. Fried Miklósnak, ki doktoranduszi éveim alatt minden lehető séget biztosított számomra, hogy munkámat hatékonyan végezhessem. Köszönöm, hogy sokrétű tudását, szakmai tapasztalatait hosszú beszélgetések során megpróbálta átadni nekem. Dr. Hámori Andrásnak, ki zseniális érzékkel állt hozzá minden optikai, elektronikai és egyéb technikai jellegűkérdéshez. Meglátásai és javaslatai, keresztkérdései számtalan esetben mutattak új utat munkámban. Dr. Kaspar Cottiernek, ki mint első sorban munka-, másodsorban versenytárs, kitű nőérzékkel motiválta munkámat. Dr. Kurunczi Sándornak, kihez minden esetben bizalommal fordulhattam vegyészeti kérdéseimmel. Köszönöm továbbá, hogy a munkámhoz szükséges oldatokat elkészítette számomra. Plósz

Bélának,

ki

a

rácscsatolt

interferométer

–

spektroszkópi

ellipszométer

műszerkombinációhoz szükséges mechanikai elemeket elkészítette. Végül, de nem utolsó sorban köszönet illeti önzetlen támogatásukért családom tagjait; szüleimet, Tóth Rékát és Kozma Dánielt, valamint fiatal kollégáimat, Fodor Bálintot, Németh Andreát és Janosov Milánt is.

100


13. Függelék - Fényterjedés közegben és közeghatáron 13. 1. Síkhullámok homogén közegben Az elektromágneses mezőket leíró Maxwell-egyenletek egyik fontos megoldása az energiát szállító, haladó, elektromágneses hullámokat leíró matematikai formulák. Ezek közül a legegyszerűbb és legalapvetőbb a transzverzális síkhullámok természetét megadó síkhullám egyenletek [92]. Homogén (állandó permeabilitású és permittivitású), forrásmentes egyszerű szigetelő anyagokban, a végtelen közegbeli Maxwell-egyenletek a következőalakban írhatók: B E  t D H  , t D 0 B 0

(13.1.1.)

ahol E elektromos térerősség és B mágneses indukció makroszkopikus térmennyiségek, D elektromos eltolás és H mágneses térerősség pedig ezekből származtatott mezők, t az időt jelöli: D E és H 1 B ,

(13.1.2.)

ahol ε , permittivitás és μpermeabilitás általában komplex függvénye ω-nak, melyek anizotróp közegben tenzor alakot öltenek. Veszteségmentes, homogén, izotróp és lineáris közegben ezek valós pozitív számok [92]. A fenti (13.1.1.) egyenletek e it harmonikus időfüggésű megoldását keressük, hiszen ezekből Fourier-szuperpozíció révén tetszőleges megoldás előállítható [92]. Ekkor ez előző egyenletek a következőképp írhatóak át: E iB H iD D 0

.

(13.1.3.)

B 0

101

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez A (13.1.2.) és (13.1.3.) egyenletek megfelelőegymásba helyettesítésével a Helmholtz-féle hullámegyenletet kapjuk:

 E 0 és  B 0 2

2

(13.1.4.)

Keressük a (13.1.4.) egyenlet megoldását egy lehetséges x irányban haladó e ikxit síkhullám alakjában! A Helmholtz-féle hullámegyenlet a k hullámszám és az ω frekvencia között kapcsolatot teremt: [92] k  ,

(13.1.5.)

mely alapján a hullám fázissebességére a következőt kapjuk:

 1 c  1 v   0 , ahol n  és c0  , k 0 0  n 0 0

(13.1.6.)

ahol c0 a vákuumbeli fénysebesség, ε 0 a vákuum permittivitás, valamint μ 0 a vákuum permeabilitás. Az általában frekvenciafüggőn mennyiséget törésmutatónak nevezzük. A Maxwell- és a Helmholtz-egyenletet teljesítőmegoldások a síkhullámbeli mezőkre pedig: E (r, t ) E 0 e ikr t és B( r, t ) B 0 e i kr t ,

(13.1.7.)

ahol E 0, B0 állandó vektorok (síkhullám amplitúdók), φpedig a síkhullám fázisa. Az E0 irányú egységvektort polarizációvektorként említi a szakirodalom. A (13.1.7) alakú megoldások kielégítik a Maxwell-egyenleteket, feltéve, hogy k E 0 0 , k

k B 0 0 , k

(13.1.8.)

azaz az elektromágneses síkhullám transzverzális, illetve k B 0   E 0 , k

(13.1.9.)

102

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez azaz a terjedősíkhullám ily módon összekapcsolható elektromos és mágneses komponensei egymásra, valamint a terjedés irányára merőlegesek [92]. A (13.1.7.) egyenletek segítségével a Helmholtz-féle hullámegyenlet a későbbiek szempontjából sokkal hasznosabb alakra írhatjuk át (az elektromos komponensre felírva): [79]

k  k E  k 2 E 0

(13.1.10.)

13. 2. Interferencia Hullámok lineáris közeg r pontjában történőtérbeli találkozásánál hatásuk a szuperpozíció elve alapján összeadódik. A hullámok által okozott változás (  ) minden t időpillanatban a hullámok által külön-külön okozott változások eredője: [93] ( r, t ) i ( r, t )

(13.2.1.)

i

Homogén és izotróp közegben terjedőkét, azonos polarizációvektorral jellemezhető harmonikus síkhullám esetén az előzőegyenlet a következőalakba írható át: ( r, t ) A1 e i1 A2 e i2 és i k r i it i , i=1,2,

(13.2.2.)

ahol Ai valós amplitúdók, Κa hullám teljes fázisa. Két ilyen hullám találkozásánál ébredő intenzitás az eredőhullám amplitúdójának négyzetével arányos:



I ~ (r , t )(r, t ) A12 A22 A1 A2 e i ( 2 1 ) e i (2 1 )



(13.2.3.)

Megjegyzendő, hogy egyenlőséget egy konstans szorzó, a közeg anyagi paramétereinek figyelembevételével írhatunk fel [94]. Az Euler-tételt alkalmazva az előzőegyenlet a következőalakra hozható: I ~ A12 A22 2 A1 A2 cos 2 1  ,

(13.2.4.)

103

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez mely alapján az intenzitásra a következőegyenletet írhatjuk fel: I I 1 I 2 2 I1 I 2 cos 2 1 

(13.2.5.)

Amennyiben két vagy több, azonos polarizációvektorú síkhullám találkozásánál teljesül az a speciális feltétel (ún. interferencia feltétel), hogy azok teljes fázisának különbsége időben állandó (illetve a megfigyelési időhöz képest csak lassan változik), azaz koherensek, akkor a szuperpozíció speciális esetét interferenciának nevezzük, s az előzőegyenlet a következő alakot ölti: I I 1 I 2 2 I1 I 2 cos 2 1  .

(13.2.6.)

Végezetül fontos megjegyezni, hogy megkülönböztethetjük az interferencia két szélsőséges esetét; mikor a két síkhullám fáziskülönbsége pontosan 2πegész, illetve félegész számú többszöröse. Az előbbi teljesülésekor maximálisan erősíti egymást a két hullám (konstruktív interferencia), míg az utóbbinál maximálisan kioltást figyelhetünk meg (destruktív interferencia).

13. 3. Síkhullámok közegek határán A „13. 1. Síkhullámok homogén közegben” címűalfejezetben láttuk, hogy a Maxwellegyenletek homogén és forrásmentes, egyszerű szigetelő anyagokban síkhullám alakú megoldásokkal kielégíthetőek. Az ilyen megoldások végtelen közegben, a téridőminden egyes pontjában érvényesek. Eltérőközegek rendszerében azonban csak lokális megoldások léteznek, melyeket az ún. határfeltételek figyelembevételével egyeztetnünk kell. Áram és töltésmentes esetben, egy n normálisú, 1.) és 2.) közegeket elválasztó határra a következő feltételek írhatók fel: [92] n ( E 2 E 1 ) 0 n ( H 2 H 1 ) 0 n (D 2 D1 ) 0 n (B 2 B 1 ) 0

 E t , H t folytonosan megy át (13.3.1.)  Dn , B n folytonosan megy át

104

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Ezek megkövetelik, hogy E és H érintőirányú (tangenciális, t), illetve D és B normális irányú (n) komponensei folytonosan menjenek át a közeghatáron. E feltételek kinematikai következménye, hogy a határfelületen az 1.) közegből θ1 szög alatt érkező k 1 beeső, a 2.) közegbe θ2 szög alatt átlépő k 2 megtört és az 1.) közegben maradó (szintén) θ1 szög alatt visszavert k 1 ' síkhullámok hullámszám vektorai közös síkban, ún. beesési síkban fekszenek, illetve hullámszámvektoraik határfelület síkjával párhuzamos komponensei meg kell, hogy egyezzenek:

n k 1 határon  n k 2  n k 1 '  határon  határon k t .

(13.3.2.)

Továbbá, hogy a tangenciális komponensek között a Snellius-Descartes-törvény teremt kapcsolatot [92]. Mindezeket a 13.3.-1. ábra igyekszik szemléltetni.

13.3.-1. ábra Mikor a síkhullám közeghatárhoz érkezik, a határfeltételeknek eleget téve a határfelületen visszaverő dést és törést szenved.

A határfeltételek dinamikai jellegű következményeit a (13.1.2), (13.1.7.) és (13.1.9.) összefüggések segítségével a (13.3.1.) egyenlet új alakba való átírásával fejthetjük meg. Alkalmazzuk a fenti jelölésmódot: n  E 01 E 01 'E 02  0 1 1  n   k 1 E 01 k 1 'E 01 '  k 2 E 02  0 2 1  n  1 ( E 01 E 01 ' ) 2 E 02  0 n k 1 E 01 k 1 'E 01 'k 2 E 02 0

105

(13.3.3.)

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Célszerűe síkhullámokat két ortogonális polarizációvektor által kitüntetett irányú síkhullám komponensek lineárkombinációjaként felírni, s a két esetet külön tárgyalni. Az elsőben a síkhullámok polarizációvektora legyen a beesési síkban, a másodikban pedig legyen erre merőleges. Jelöljük ezeket rendre E 0p -vel és E s0 -sel a német „parallel” (párhuzamos) és „senkrecht” (merőleges) terminológia alapján. p

s

p

E (r, t ) E (r, t ) E ( r, t ) E 0 e



i k r t  p



E 0 e ik r t s  s

(13.3.4.)

Ezekre külön megoldva a (13.3.3.) összefüggéseket a visszavert és a megtört nyalábok beesőhöz viszonyított amplitúdó arányát megadó Fresnel-egyenletekhez jutunk. Kihasználva, hogy az optikai tartományba esőfrekvenciákra a dielektromos közegek permeabilitása általában jó közelítéssel azonosnak vehető, a komplex reflexiós (r) és transzmissziós (t) Fresnel-együtthatók szigetelők esetére a következő, egyszerűbb alakot öltik: [92] E p ' n cos 1  n22 n12 sin 2 (1 ) rp  01p  1 , E01 n1 cos 1  n22 n12 sin 2 (1 ) s 1  n1 n22 n12 sin 2 (1 ) E 01 ' n2 cos rs  s  , E 01 n2 cos 1  n1 n22 n12 sin 2 (1 )

(13.3.5.)

Ep 2n1 cos 1  t p  02p  , E01 n1 cos 1  n 22 n12 sin 2 (1 ) s E 02 2n1n 2 cos 1  ts  s  . 2 E 01 n2 cos 1 n1 n 2 n12 sin 2 (1 )

(6.3.6.)

13. 4. Az ellipszometria Amikor a fény két eltérőtörésmutatójú közeg határfelületéről reflektálódik, polarizációs állapota megváltozik. Ennek mértéke e két közeg anyagi minőségének függvénye. Az ellipszometria ezt a polarizációváltozását méri. Ennek matematikai tárgyalásához haladjunk tovább az előzőalfejeztben megkezdett úton. A határfelületre esőés onnan visszaverődőfény polarizációs állapota úgy tárgyalható könnyedén, ha a nyaláb E elektromos térerősség vektorát az előzőalfejezetben látott módon két független síkhullám komponensre bontjuk. Ekkor a síkhullám polarizációs állapotát a következő paraméterrel, ún. polarizációs együttható-val jellemezhetjük: 106

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez p

E ( r, t )  s E (r , t )

(13.4.1.)

Mivel mindez nem csupán a beeső, hanem a visszavert sugár esetére is felírható, képezhetjük e két sugár polarizációs együtthatójának hányadosát, az ún. reflexiós tényezőt. A XIX. század második felében Paul Karl Ludwig Drude (1867-1906), az első ellipszometriai mérést megvalósítója, a következőjelöléseket vezette be: [95] p s p s ' '   ei (  ' ' ) (   ) tan  ei  

(13.4.2.)

Könnyen megmutatható, hogy ez az arány a Fresnel-féle komplex reflexiós együtthatók hányadosával ( rp , rs ) azonos:

Ep' E p' s p r  E p' E s  p E E ' rs s E Es

(13.4.3.)

Rendkívül figyelemreméltó tulajdonság, hogy sem , sem és így  sem függ a megvilágító fény abszolút intenzitásától, csupán beesési szögétől illetve a határfelületet alkotó közegek anyagi tulajdonságától. Épp ezért nincs szükség semmilyen referenciára. Mivel mind tan , mind  mérhető, így Ψ és  az ellipszometriai mérés két független, a vizsgált mintára jellemzőparamétere. Abban az esetben, ha  és  értékeket nem csupán egyetlen hullámhossz esetén, hanem egy

egész hullámhossztartományon keresztül mérjük,

spektroszkópiai ellipszometriáról beszélünk. A legegyszerűbb esetben, mikor is két izotróp, félvégtelen* közeg határfelületét éri valamilyen  hullámhosszú elektromágneses sugárzás, a Fresnel-egyenletek egyértelmű,

___________________________________________________________________________ * Megjegyzendő , hogy a fenti vonatkozásban akkor tekintünk egy közeget félvégtelennek, ha a határfelületérő l beesőfénysugár elhal benne mielő tt másodlagos vagy magasabb rendűreflexiókat szenvedne. Vastag, és/vagy nagy optikai sű rű séggel bíró közegek esetén mindez jó közelítéssel teljesül.)

107

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez kölcsönös kapcsolatot teremtenek a minta törésmutatója és a mért  mennyiség között. Mivel az ellipszometriai mérésekben a beesési szög és a minta környezetének törésmutatója általában ismert, (13.4.2.) és (13.4.3.) alapján kiszámítható a mintára jellemzőtörésmutató is. Gyakorlatban azonban, a spektroszkópiai ellipszométerrel vizsgálandó mintánk általában nem egyetlen félvégtelennek tekinthetőún. tömbi anyagok, sokkal gyakoribb, hogy egy vastag hordozó

felületére

leválasztott

vékonyréteg-szerkezet

opto-geometriai

tulajdonságait

szeretnénk meghatározni. Ebben az esetben a fentinél jóval bonyolultabb számítások alapozzák meg e méréstechnika hatékonyságát. Erről bővebben a „13. 4. 1. Az ellipszometriai modellek alapjai” és „13. 4. 2. Fontosabb rétegmodellek” címűfejezetekben olvashatunk. A spektroszkópiai ellipszométerrel mért Ψ és  spektrumokból meghatározhatjuk a minta ismeretlen fizikai paramétereit (rétegvastagság, törésmutató, mikroszerkezet). Ennek sikere három feltétel teljesülésén múlik [96]. Az elsőaz, hogy ismernünk kell a mintát alkotó összetevők törésmutatóját (irodalmi adatok vagy tömbi anyagokon végzett referenciamérések alapján). Ennek teljesítése egyáltalán nem triviális, mivel a referencia-törésmutatók meghatározásához ezen anyagokat az ellipszometria felületérzékenysége miatt ideálisan sík felületek által határolt, tömbi vagy vékonyréteg formájában kell tudnunk előállítani. Mintakészítési nehézségekkel állunk tehát szemben. A második feltétel azt követeli meg, hogy a vizsgált mintát alkotó anyagokról és ezek struktúrájáról, azaz mikroszerkezetéről legyen valami előzetes elképzelésünk, mely alapján felépíthetjük a mért spektrumra illesztendőoptikai modellünket. A harmadik kikötés pedig az, hogy e feltételezett modell paramétereit szisztematikus, objektív hibameghatározás mellett illesszük a mért () és () görbékre. E harmadik feltételnek mára már számos, jól használható, hatékony

kiértékelőprogram tesz eleget. Munkám során Woolam V.A.S.E.32 v.3.386 és ComleteEASE v.3.79 szoftvereket használtam.

13. 4. 1. Az ellipszometriai modellek alapjai Az ellipszometria szempontjából fontos, kissé összetettebb elrendezés az, mikor a polarizált síkhullám félvégtelen közegből, ún. környezetből egyetlen vékonyrétegen áthaladva, a szintén félvégtelen szubsztrátról (más néven hordozóról) verődik vissza. Ha e vékonyréteg nem elég vastag ahhoz, hogy benne a fénysugarak elhaljanak, a 13.4.-1. ábrán látható módon többszörös reflexió és transzmisszió során jutnak ki e közegből.

108


13.4.-1. ábra: Három közegbő l álló rendszer esetén a középsővékonyrétegben az ábrán látható módon többszöri visszaverő dés valósul meg.

A reflektált parciális hullámok eredője egy végtelen geometriai sor sorösszege, melyből a teljes reflexiós együttható: r j r j e i R j  01 j 12j i 1 r01 r12 e

(13.4.4.)

ahol j = p, s polarizációs irányokat jelöli, valamint r01j és r12j a 0|1 és 1|2 határfelületeken érvényes Fresnel-féle komplex reflexiós együtthatók. Jelöljük a vékonyréteg vastagságát d1gyel, törésmutatóját n1 -gyel, valamint az itt mérhetőtörésszöget 1 -gyel. Ekkor azt a  fázistolást, amit a sugár szenved el míg a vékonyréteg egyik határfelülettő l a másikig ér, a következőalakban írhatjuk:

d   2 1  n1 cos 1 . 

(13.4.5.)

Kihasználva a Descartes-Snellius törvényt a (13.4.5.) egyenlet a következőformát ölti:

d  2  2 1  n1 n12 n0 sin 0 , 

(13.4.6.)

ahol 0 a 0. számú közegben mérhetőbeesési szög. A (13.4.4.) és (13.4.6.) egyenletek segítségével azonnal kapható a reflexiós tényező. Abban az esetben, ha a szubsztráton nem csupán egyetlen, hanem több egymásra rétegzett izotróp vékonyréteg ül, a fenti sorösszeges tárgyalásmód nehézkessé válik. Mivel a fény terjedését leíró egyenletek lineárisak sokkal egyszerűbb és elegánsabb írásmód az, mikor 109

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez mátrixalgebrát alkalmazunk [97]. Ennek gördülékeny tárgyalásához vezessük be a következő jelöléseket: az egymáson fekvővékonyrétegek száma legyen m, sorszáma i törésmutatója ni, vastagsága pedig di, a környezet sorszáma legyen 0, a hordozóé pedig m+1. Ekkor azt a sugarat, amelyik a kisebb sorszámú réteg felöl a nagyobb felé halad „+”, amelyik pedig ezt fordítva teszi „–” irányúnak tekintjük. Ezeket rendre előrehaladó és hátrahaladó hullámoknak nevezzük Ennek szellemében, tetszőleges z koordináta által meghatározott x-y síkban, a terjedősíkhullám komponensek amplitúdója 21 -es oszlopvektor formájában megadható:   E 0j (z ) E ( z)  j   E 0 ( z )    j 0

(13.4.7.)

A könnyebb átláthatóság érdekében j jelölést a továbbiakban elhagyjuk. A (13.4.7.) egyenletet két különbözőz koordinátára ( zés z  ) felírva, E 0 ( z' ) és E0 (z" ) között egy alkalmas Sˆ 22 szórásmátrix segítségével egyértelműkapcsolat létesíthető:

E0 (z ' ) Sˆ E 0 ( z" ) .

(13.4.8.)

E szórásmátrix tényezőit a következőképp határozhatjuk meg: felbontjuk a fenti összetett struktúrát több, azonban csupán két típusú alrendszerre. Ezek egyike, mikor a síkhullám valamely i-edik közeg anyagában szabadon terjed, míg a másik típus az mikor a (i-1)-edik vékonyrétegből az i-edikbe lép át. Az elsőesetben az ún. Lˆ i rétegmátrix, a másodikban pedig az ún. Iˆ ( i1),i

határmátrix írja le a síkhullám amplitúdójának megváltozását. Ekkor

összetettebb rendszereket úgy jellemzünk, hogy az ezek – a rétegszerkezetnek megfelelő sorrendű– szorzatából képzett (13.4.9.) szórásmátrixot a (13.4.8.) egyenletbe helyettesítjük. ˆˆ ˆ ˆ ˆ ˆˆ 1 ) . SˆIˆ 01 L1 I12 L2  I ( i1) i Li  L m I m (m 

(13.4.9.)

Azzam és Bashara munkái alapján tudjuk, hogy e mátrixok a következőalakban írhatók: [97]

1 Iˆ (i  1) i  t ( i1) i

1  r(i 1 )i 

r(i 1 )i  , 1  

 e ii Lˆ  i  0

110

0  , e  ii

(13.4.10.), (13.4.11.)

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez ahol t(i-1)i a (i-1)-edik és i-edik réteg közötti határátmenetnél megfigyelhetőtranszmittancia, illetve r(i-1)i az ugyanitt mérhetőreflektancia, valamint Φ az a fázistolás, melyet a (13.4.6.) egyenlet alapján számíthatunk ki. A fentiek következtében, ha a környezetet a, a szubsztrátot s indexszel jelöljük, (13.4.7.), (13.4.8.) és (13.4.9.) egyenletek összevonásából a következőre jutunk: Ea  S11 S 12  E s      ,  S 21 S 22  0  E a  

(13.4.12.)

ahol E a-ra, mint a (fényforrásból) beeső, E a-ra pedig mint a mintából a detektorba érkező síkhullámok amplitúdójára kell tekintenünk. Mivel a szubsztrátot félvégtelennek feltételeztük

E le nem érkezik vissza fénysugár. A (13.4.12.)-es összefüggésből, már s = 0, azaz belő könnyen következtethetünk a teljes reflexiós és transzmissziós tényezőkre: E a S 21 R  , S 11 Ea

E s 1 T   . E a S 11

(13.4.13.), (13.4.14.)

A fentiek levezetésénél nem követeltük meg, hogy a beesősugár polarizációja valamilyen kitüntetett irányba essen, így igazak külön-külön is a független s és p irányú polarizációkomponensekre. Ezeket kiszámítva felírható a komplex reflexiós tényező: R  p Rs

(13.4.15.)

Az eddigiekből egyértelműen következik az, hogy több vékonyrétegből álló minta esetén több ismeretlen paraméter meghatározására van szükség. A mérhetőreflexiós tényezőm+2 darab közeg (környezet, szubsztrát és m számú vékonyréteg) esetén a következők függvénye:

(n 0 , n1 , , n m1 , d1 , d 2 , , d m , 0 , )

(13.4.16.)

111

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Ahhoz, hogy e paramétersereghez egyértelműértékeket rendelhessünk, esetenként valamilyen módon növelnünk kell a mért független adatok számát. Ezt többféleképpen megtehetjük például úgy, hogy számos beesési szög mellett végzünk méréseket.

13. 4. 2. Fontosabb ellipszometriai rétegmodellek Ahogy arról a fentiekben már olvashattunk, a spektrumkiértékelés során feltétlenül szükséges, hogy a minta opto-geometriai paramétereit illetően rendelkezzünk valamilyen előzetes információval. Gyakran azonban az ilyen irányú ismereteink hiányosak, esetenként csupán intuíciókra támaszkodhatunk. Ezt tetézi továbbá, hogy, ha még ismerjük is a közegeket alkotó anyagokat,

ezek

sokféleképp

összeállhatnak

létrehozva

a

legkülönfélébb

optikai

tulajdonságokkal bíró vékonyrétegeket. Ezek tükrében talán meglepő, hogy az ellipszometria mégis népszerű, hatékony módszernek bizonyult az anyagtudományt művelőkutatók körében. Ennek oka az, hogy sikerült olyan rétegmodelleket megalkotniuk melyek az ilyen szorult helyzetből is kicsalják a mintára jellemzőparaméterértékeket. Cauchy függvény Előfordulhat, hogy a vizsgált mintánkat valamilyen ismeretlen törésmutatójú közeg (is) alkotja. Ilyenkor célszerűvalamilyen paraméteres, általános esetben használható dielektromos függvényhez nyúlnunk. Az egyik ilyen törésmutató modell Lorentz munkája révén látott napvilágot. Ennek alapja az a feltevés miszerint a szilárd anyag független lineáris oszcillátorok összegéként jellemezhető. E gondolat egyik lehetséges parametrizálását Cauchy – bizonyos közelítésekkel élve – a következőegyszerűsorösszeg alakjában adta meg: [98] B n()  2ii i 

(13.4.17.)

ahol a Bi együtthatók a modell illesztendőparaméterei. Vezetőrendben a sor elsőtagja adja a törésmutatót, a többi ennek diszperzióját határozza meg. A fenti összefüggés az anyagok jelentős részére ultraviola és infravörös tartományokban már érvényét veszti. Az ott is helyes eredményt adó egyenletet Sellmeier ismertette [98]. Fontos megjegyezni, hogy e modell elsősorban dielektrikum típusú rétegek esetében használatos.

112

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Effektív közeg elmélet Abban az esetben, mikor olyan vékonyrétegeket vizsgálunk, melyek makroszkopikusan homogének, azonban mikroszkopikusan heterogének, azaz bennük a vizsgáló fény hullámhosszánál csak kisebb méretűkülönneműterületek figyelhetők meg (polikristályok, amorf, porózus anyagok), a beesőfény által keltett makroszkopikus elektromos és mágneses mezők nem változnak jelentősen az egyes régiókban. Ennek okán elhanyagolhatjuk a heterogenitásokon való szórást és diffrakciót, melyet egyébként makroszkopikusan inhomogén rendszerek esetében dominánsak lennének. Amennyiben feltehető, hogy a réteget alkotó heterogén térfogatok azonban elég nagyok ahhoz, hogy a törésmutatójuk megegyezzen a megfelelő tömbi anyag optikai sűrűségével, a komplex dielektromos függvényének meghatározására egy rendkívül hatékony eljárást jelent az effektív közeg közelítés (effective medium approximation - EMA) [99]. E közelítés a közeget ismert törésmutatójú anyagok keverékének tekinti. Az effektív közeg közelítés elméletének megoldásaként Bruggeman egy i összetevőből álló közeg esetére a következőalakú egyenletet javasolta: [100]

f i

i

i  0 , i d 

(13.4.18.)

ahol i a i-edik, f i súllyal rendelkezőkomponens tömbi állapotára jellemződielektromos függvénye, γ d a depolarizációs faktor (értékét tipikusan 2-nek választjuk [98]). A keresett effektív dielektromos függvény . Az EMA bővebb és részletesebb leírását [98] alatt találhatja meg a tisztelt olvasó.

13. 5. Hullámvezetés izotróp közegben Kísérleti úton John Tyndhall (1820-1893) mutatta ki első ként, hogy a fény határfelülethez érve akár teljes visszaverődésre is képes. Abban az esetben ugyanis, ha egy – a fény számára átjárható – n törésmutatójú közeget egy ettől kisebb törésmutatójúval határolunk, a nagyobb optikai sűrűséggel rendelkezőközeg felöl, a határfelülethez c beesési szög alatt érkező fénysugár teljes mértékben visszaverődik. (c a Descartes - Snellius törvényből kapható határszög [92].) Az előzőalfejezetekben tárgyaltak alapján úgy is fogalmazhatunk, hogy a Fresnel reflexiós együtthatójának abszolút értéke 1-gyel egyenlő. Tyndhall kísérletével megalapozta a hullámvezetőoptika későbbi dinamikus fejlődését, hiszen amennyiben az ilyen 113

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez rendszerek geometriáját és optikai tulajdonságait jól választjuk meg, a fénysugár csapdába ejthető és kiváló hatásfokkal vezethető. Mára már ezt a felfedezést számos területen alkalmazzák sikerrel. Ezek közül csupán néhányat említve, a hullámvezetők a távközlés, különböző mérés- és érzékeléstechnikák valamint egyéb integrált optikai módszerek tudományterületét forradalmasították [101]. A

legegyszerűbben

kivitelezhető, méréstechnikai

szempontokból

kiváló,

valamint

matematikailag a legkönnyebben tárgyalható optikai hullámvezetőelrendezés, az ún. sík dielektromos hullámvezető. Ekkor egy hordozó (substrate - S) és egy fedő(cover - C) között található vékony, dF vastagságú dielektrikum réteg (film - F) adja a hullámvezetőstruktúrát. (13.5.-1. ábra) Ezek törésmutatója rendre n F , nS , n C , melyekre teljesül: n F n S , nC . Az előbbi bekezdés alapján nyilvánvaló, hogy ebben az esetben a hullámvezetőközeg a film lesz. Ezen elrendezés egyik lehetséges interpretációja az ún. zig-zag modell. Eszerint a fény, mint fénysugarak összessége a határfelületek között – a teljes visszaverődés következményeképp – (ideális esetben) energiaveszteség nélkül haladhat a hullámvezetőfilmben, ha a sugarak teljesítik az ún. önkonzisztencia feltételét (ld. később) [101, 102]. Ideális hullámvezetőnek tekintjük azt az időben nem változó homogén, dielektromos, szórásés abszorpciómentes rétegekből felépülő, nem mágneses, töltés- és árammentes rendszert, melyben veszteségmentes hullámterjedés figyelhetőmeg. E fejezet az ideális hullámvezetők elméletének csupán jelen disszertációhoz szorosan kapcsolódó eredményeit tárgyalja, így az ideális és izotróp rétegekből felépülő, sík dielektromos hullámvezetőkön nem lép túl.

13.5.-1. ábra: Sík dielektromos optikai hullámvezetőa.) Amennyiben a határfelületekre eső fény teljes visszaverő dést szenved, bizonyos esetekben megvalósulhat a filmrétegben az optikai hullámvezetés. a.) A határszög alatti beesésekre azonban, a fénysugár terjedőfény formájában behatol a külsőrétegekbe.

114

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Az előzőalfejezetekben láthattuk, hogy a határfeltételek egy érdekes következménye, hogy a hullámvezetőben terjedő síkhullám határfelülekkel párhuzamos kt hullámszámvektor komponense minden rétegben azonos kell legyen. Ez a kritérium egy állandót definiál;

k t -t terjedési konstansnak nevezünk, a belőle származtatott N / k 0 mennyiséget pedig a (13.1.6.) egyenlet analógiájára effektív törésmutatóként említi a szakirodalom. A Maxwell-egyenleteket ideális, sík hullámvezetőkre alkalmazva két független csoportra bonthatjuk szét, melyek egymásra ortogonális és lineárisan polarizált síkhullám megoldásokra vezetnek [53]. A két orientáció a terjedő elektromágneses síkhullám elektromos komponensének irányával definiálható. TE hullám esetén az E elektromos tér a sík hullámvezetőt határoló felületekkel párhuzamosan rezeg, TM módusban H mágneses tér teszi ugyanezt. Mind E, mind H a terjedőhullám terjedési irányára (k) merőlegesen rezeg. (13.5.-2. ábra)

13.5.-2. ábra: TE és TM módusok definíciója: a.) TE módus esetén az E elektromos, b.) TM módus esetén pedig a H mágneses komponens rezeg a hullámvezető t határoló felületekkel párhuzamos síkban.

Megjegyzendő, hogy

TE

(transzverzális

elektromos)

azonos

az

előző alfejezet

terminológiájának megfelelő s (merőleges), míg TM (transzverzális mágneses) a p (párhuzamos) polarizációs irányoknak. Tekintsük a 13.5.-1. ábrán feltüntetett Descartes-féle koordináta rendszert a következő elméleti megfontolások alapjául, ahol z adja a síkhullám terjedési irányát, x és y pedig a hullámvezetőrétegszerkezet normálisával illetve érintőjével egyezőorientáció. TE és TM hullámok definíciójából adódóan az elektromos és mágneses komponensekre illetve a határfeltételekre a következők adódnak:

115


TE:

E x 0, E z 0, H y 0, k y 0

 Ey , H z ,

TM:

E y 0, H x 0, H z 0, k y 0

 Ez , H y ,

E y x H y x

folytonosak folytonosak .

(13.5.1.)

Ezek felhasználásával, a szükséges vektoriális és skaláris szorzásokat elvégezve a (13.1.10.) egyenlet tovább alakítható, mely eredményeképp a hullámszámvektor x irányú komponense kifejezhetőa közeg (film) és a benne terjedőfény optikai paramétereinek segítségével:

k x,F  nF k 0 2

2

2

 k x, F k 0 nF2 N 2 .

2

(13.5.2.)

Megjegyzés: TE és TM esetekre vett megoldás csak izotróp esetben azonos alakú. Anizotróp eset tárgyalását [53] és [79] részletezi. Mivel k x ,F -re két megoldást kapunk (egy pozitív és egy negatív irányba haladót), a filmben terjedőelektromágneses hullám a következőalakban írható fel általánosan:





ik x  x x0  ikx  xx0  iNk 0 z it U ( x , z, t ) U ( x, z, t ) U ( x, z, t ) U  U  e , 0e 0e

(13.5.3.)

ahol U E , H és U 0 E 0 , H 0 . A filmen kívüli (szubsztrát és fedőréteg) hullámok amplitúdója x irányban exponenciálisan lecseng, mivel esetükben a (13.5.2.) egyenletben szereplőgyök alatti kifejezés negatívvá válik (ételemszerűen nS ,C N nF a hullámvezetőmódusokra), k x képzetes számmá változik. Ezt a lecsengőelektromágneses teret nevezzük evaneszcens mezőnek. Megjegyzés: A fentiektől eltérő esetekben sugárzásos, illetve szubsztrát módusokról beszélhetünk [53, 103]. Ekkor nem történik hullámvezetés. Annak érdekében, hogy meghatározzuk a hullámvezetés feltételeit, adjuk meg a (13.5.3.) egyenletet az x x 0 és az x x 0 d F koordináta pozíciókban található, a hullámvezető filmet lezáró szubsztrát-film és fedő-film határfelületekre. Ezek rendre: 











U ( x 0 , z, t ) U ( x 0 , z, t ) U ( x 0 , z, t ) U 0 U 0 e 

iNk 0 z it





 ik x d F

U ( x 0 d F , z , t ) U (x 0 d F , z, t ) U ( x 0 d F , z, t ) U 0 e

 ikx d F

U 0 e

e

iNk 0 z it

.

(13.5.4.) 116

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez A (13.5.4.) egyenletek meghatározzák a szubsztrát-film és fedő-film határfelületekre jellemző Fresnel-féle komplex reflexiós együtthatókat. TE és TM módusra egyaránt: U U e ik x d F rS  0 rS e iS (x = x0) és rC  0 ik d rC e iC , U0 U 0e x F

(13.5.5.)

ahol φS és φC a jelölt határfelületről való visszaverődés okozta fáziseltolódások. E két egyenlet megfelelő egymásba

helyettesítésével

kapjuk

a

hullámvezetés

feltételét,

az

ún.

módusegyenletet:

rS rC e

2ik x d F

rS rC e

i S C 2k x d F 

1 ,

(13.5.6.)

melyből triviálisan következik a klasszikus módusegyenlet: 2d F k x S C 2m ,

(13.5.7.)

ahol m az adott módus sorszámát jelöli. Csak akkor terjedhet tehát egy módus veszteségmentesen a hullámvezető film közegében, ha az őt alkotó fénysugarak önkonzisztensek, más szóval konstruktív módon interferálnak egymással. (13.5.-3. ábra) Ezen állítás egyszerűen átlátható, amennyiben összevetjük az (13.5.7.) egyenlet az (13.2.6.) egyenlettel, illetve az ott leírtakkal. Mivel az (13.5.6.) egyenlet megoldása nem folytonos

13.5.-3. ábra: A hullámvezetőfilmbéli síkhullám megoldások szemléltetése.

117

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez függvény, hanem csupán diszkrét sajátértékek elégítik ki, úgy is fogalmazhatunk, hogy a konstruktív interferencia feltétele kvantálttá teszi βértékét: βm egy adott módushoz tartozó sajátérték. Az (13.5.6.) egyenlet egy másik következménye, hogy megfelelően vékony ( d F 2d F ) hullámvezetőfilmekben egyetlen TE illetve TM módus terjedhet [101]. Az ilyen tulajdonságú rétegekszerkezeteket monomódusos hullámvezetőnek nevezi a szakirodalom. A módusegyenletben szereplő rS és rC reflexiós együtthatók meghatározásához érdemes a (13.3.5.) egyenleteket a hullámvezetésben használatos mennyiségekre átírni: [79, 102]

TE:

TM:

rS ( C )

k 02 nF2 m2  k 02 nS2 ( C) m2 k x ,F k x ,S (C )   2 2 k x, F k x ,S (C ) k 0 nF m2  k 02 n 2S ( C) m2

rS ( C)

n F2 k x, F nS(2C ) k x,S (C ) n 2S ( C) k 02 n 2F m2 nF2 k 02 n 2S ( C) m2  2  . n F k x,F nS2(C ) k x,S ( C) nS2 ( C) k 02 n 2F m2 n 2F k 02 n 2S ( C) m2

(13.5.8.)

A Fresnel-féle reflexiós együtthatók fenti alakban történő felírásából és az (13.5.6.) egyenletből világosan látható, hogy a TE és TM módusok terjedési feltétele nem elégíthetőki egyszerre egy adott geometriájú és optikai paraméterekkel jellemzett ideális hullámvezetőben. Amennyiben vékonyréteg (adlayer) vagy vékonyrétegek borítják a hullámvezetőfelszínét, tehát a film felületével nem közvetlenül határos a félvégtelen közegnek tekintett fedőréteg, az (13.5.6.) egyenlet módosításra szorul. A következőrekurzív formulával megadható az M adlayerből álló rendszer teljes reflexiós együtthatója: rl l 1e

i2 k x ,l d l

Rl  , ahol l M , M 1, ... , 1 és R M 1 rM 1 i 2k d 1 rl l 1 e x , l l

(13.5.9.)

Az (13.5.6.) egyenletben rC tagot R M -re cserélve a többréteges rendszereket is kezelhetjük [104]. E fejezetben feltétlenül fontos megjegyezni, hogy a fény hullámvezetőbe történőbecsatolását rendszerint a filmréteg valamely határfelületén kialakított optikai rács valósítja meg [81, 105]. Amennyiben a fényforrás fényét megfelelőαj szögben e rácsra bocsátjuk, az itt létrejövő fénydiffrakció eredményeként [106] vezetett módus indul a rétegben. A becsatolás szögének

118

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez ismeretében Λ rácsállandójú rács esetén N és αj között a következő egyenlet teremt kapcsolatot, ahol j a diffrakciós rend:

 N n0 sin j  0 j . 

(13.5.10.)

Az optikai rács mellett más módszerek is ismertek az irodalomban a fény hullámvezetőbe való becsatolására. Terjedelmi okokból a disszertáció ezekre nem térhet ki, azonban az olvasó részletes leírást találhat róluk a [101]-es hivatkozásban.

13. 6. Nematikus folyadékkristály modulátor A folyadékkristály elnevezés egy olyan speciális halmazállapotot jelöl, melyben rúd vagy tányér alakú szerves molekulákból álló kristályszerűanyag mechanikai tulajdonságai inkább a folyadékokéra emlékeztetnek, míg optikai, dielektromos és egyéb tulajdonságai a kristályos anyagokra jellemzőanizotrópiát mutatnak. Ennek oka, hogy bennük a molekulák csupán irány szerint rendezettek, tömegközéppontjaik nem alkotnak kristályrácsot. Megjegyzendő, hogy ez a halmazállapot csupán egy jól meghatározott hőmérséklettartományban figyelhetőmeg, ezen kívül az anyag megszilárdul, illetve átalakul izotróp folyadékká. A folyadékkristályok a molekula-tömegközéppontok

rendezetlenségének

mértéke

szerint

három

csoportba

sorolhatók: nematikus, szmektikus és koleszterikus. A nematikus folyadékkristályok állnak a legközelebb a folyadék halmazállapothoz; bennük csupán irány szerint rendeződnek a szerves molekulák, a tömegközéppontok elrendeződésében nem tapasztalható hosszútávú rend. A szilárd halmazállapothoz legközelebbieket, melyeket valamilyen szintűhosszútávú rend is jellemez, szmektikus folyadékkristályokként említjük. A királis molekulákat tartalmazó szmektikus rendszert pedig koleszterikusnak nevezzük [107, 108]. A folyadékkristályok – csak úgy, mint a rendezett anizotróp anyagok – optikai tulajdonsága, hogy a rajta keresztülhaladó fény kettőstörést szenved, azaz egy ordinárius (rendes) és egy extraordinárius (rendellenes) sugárra bomlik. Megfigyelték, hogy a kettőstörést követően mindkét sugár lineárisan polarizálttá válik, rezgéssíkjaik azonban egymásra merőlegesek lesznek. A kettőstörés mértékét a folyadékkristály anizotróp anyagi tulajdonságain túl a beesés iránya is jellemzi [106]. Az egytengelyűfolyadékkristályok esetében egyetlen olyan irány, azaz egyetlen optikai tengely található, melyben a beesősugár nem szenved kettőstörést. Esetükben a törésmutató két független számmal jellemezhető. A folyadékkristályoknak azon csoportját, ahol két ilyen 119

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez irányt is találhatunk, kéttengelyűnek nevezzük, s három független törésmutató paraméter szükséges a leírásukhoz. Fresnel által bevezetett törésmutató-ellipszoidokkal szemléltetve ugyanezt, úgy is fogalmazhatunk, hogy a kéttengelyűkristályok esetére háromtengelyű ellipszoidot kell alkalmaznunk, egytengelyűek esetére azonban e kép forgási ellipszoiddá egyszerűsíthető [106]. A Fresnel-ellipszoid középpontján nyugvó, a beeső fénnyel párhuzamos normálisú sík kis- és nagytengelye a terjedő fény megfelelő irányú polarizációjára érvényes törésmutatót adja [109]. Egytengelyű folyadékkristály

két

független

no

törésmutatója

(ordinárius)

és

ne

(extraordinárius). Amennyiben a beesőfénysugár a forgási ellipszoid optikai tengelyének irányával párhuzamosan érkezik, a rá merőleges ellipszoid metszet egy kör. Ekkor a kis- és a nagytengely hossza azonos, nincsen kettőstörés. Az ebben az irányban terjedőfény által érzékelt törésmutatót szokás ne -nek nevezni, míg az erre merőlegesen haladót no -nak. A kettőstörés jellemzőparamétere kettőjük különbsége n ne n o . Emil

Hällstig

doktori

disszertációjában

az

elektromos

térrel

vezérelt

nematikus

folyadékkristályok dinamikájának jellemzésére a következőkben részletezett tárgyalásmódot mutatta be [108]. A beesőpolarizált fény terjedési irányával kezdetben párhuzamos optikai tengellyel jellemezhetőfolyadékkristály molekulák elektromos tér hatására elfordulnak. Amennyiben az elfordulás szögét -vel jelöljük a beesőfény által érzékelt új törésmutató Fresnel-ellipszoidot leíró egyenlet alapján a következőképpen adható meg:

n() 

ne no

(13.6.1.)

no2 cos 2 ne2 sin 2 

Tekintsük azt a fénysugarat, mely a d vastag folyadékkristály felületére merőlegesen (y tengely mentén) terjed. Ekkor a rendszer effektív törésmutatója integrálással számítható:

d /2

neff

1   n( ( y ))dy . d d / 2

(13.6.2.)

Mivel a folyadékkristályban mérhetőfázissebesség a vákuumbeliénél kisebb, a rajta áthaladó λ0 hullámhosszú fény az ugyanilyen úthosszon, vákuumban terjedőhöz képest ΔΦ fáziseltolódást szenved:

120


13.6.-1. ábra: Folyadékkristályokat alkotó molekulák orientációja a.) relaxált, b.) gerjesztett állapotban [108].

2   (n( ( y )) 1)dy . 0 d /2 d /2

(13.6.3.)

A molekulákat elforgató elektromos tér ki/bekapcsolásának hatására a folyadékkristály egy relaxált/gerjesztett egyensúlyi állapotba igyekszik jutni. (13.6.-1. ábra) Ekkor (y,t) szöget már nem csak térben, hanem időben is változó mennyiségként kell kezelnünk. Figyelembe kell vennünk továbbá, hogy a folyadékkristály molekulák egymással és a rendszert határoló felületekkel is kölcsönhatnak, így forgásuk egymástól nem független. Tekintsük azt a közelítést, melyben olyan kvantált hullámok, módusok szuperpozíciójával írjuk le a molekulák y tengely mentén fennálló szöghelyzet eloszlását, melyek eleget tesznek annak a kényszernek, miszerint a határfelületeken (y,t) el kell tűnjön (ld.: 13.6.-1. ábra):

y  ( y , t ) m (t ) cos  2m 1  , d    m

(13.6.4.)

ahol m (t ) a maximális szögelfordulás jellemzi minden t időpillanatban, melyet y 0 pontban, a folyadékkristály felezősíkjában mérhetünk. Ezzel (y,t)-t felbontottuk egy időtől és egy térbeli pozíciótól függőtag szorzatára. Kisebb kitérések esetére ( (y,t) < 50°) elegendő első rendig végeznünk a felbontást, nagyobbakra azonban további rendek figyelembevétele is szükséges. Egyszerszerűesetben, mikor a folyadékkristályra homogén E elektromos tér hat, illetve a molekulák csupán a tömegközéppontjuk körül az y-z síkban fordulhatnak el, a

121

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez folyadékkristály dinamikája az Ericksen - Leslie egyenlet alapján analitikus alakban tárgyalható, amely zérus elektromos tér mellett a következőalakot ölti: [110] 2     2  , y t

(13.6.5.)

ahol κa rugalmassági együttható, γa forgási viszkozitás. A differenciálegyenlet (y,t) -re vett megoldása a folyadékkristály relaxációjára érvényes dinamikát írja le:

y  1  d2 ( y , t ) 0 m e t /cos  2 m  1  és   ,   2 d  2   2 m 1 m

(13.6.6.)

ahol 0 m a folyadékkristály molekulák t 0 időpillanatban mért, m-edik módusra vett maximális szögkitérése. Jelen doktori értekezés fejezeteiben alkalmazott nematikus folyadékkristály modulátorok tulajdonságait jellemzőparaméterek értékeit a gyártó által küldött adatlapon tekinthetjük meg. (13.6-1. ábra)

13.6.-2. ábra: Jelen doktori értekezésben alkalmazott folyadékkristály modulátorokhoz tartozó specifikációs adatlap.

122


14. Irodalomjegyzék [1]

M. A. Cooper, “Optical biosensors in drug discovery,” Nature Reviews on Drug Discovery, vol. 1, pp. 515–528, 2002.

[2]

K. K. Jain, “Nanotechnology in clinical laboratory diagnostics,” Clinica Chimica Acta, vol. 358, pp. 37–54, 2005.

[3]

K. Y. Kim, “Nanotechnology platforms and physiological challanges for cancer therapeutics,” Nanomedicine, vol. 3, pp. 103–110, 2007.

[4]

J. P. Chambers, B. P. Arulanandam, L. L. Matta, A. Weis, and J. J. Valdes, “Biosensor recognition elements,” Current Issues in Molecular Biology, vol. 10, pp. 1–12, 2008.

[5]

G. Klenkar and B. Liedberg, “A microarray chip for label-free detection of narcotics,” Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol. 391, pp. 1679–1688, 2008.

[6]

E. C. Alocilja and S. M. Radke, “Market analysis of biosensors for food safety,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 18, pp. 841–846, 2003.

[7]

M. A. Cooper, Label-free Biosensors – Techniques and Applications. Camebridge University Press, New York, 2009.

[8]

A. P. Alivisatos, “Less is more in medicine,” Scientific American, vol. September, pp. 67–73, 2001.

[9]

K. Tiefenthaler and W. Lukosz, “Grating couplers as integrated optical humidity and gas sensors,” Thin Solid Films, vol. 126, pp. 205–211, 1985.

[10]

W. Lukosz, “Integrated optical chemical and direct biochemical sensors,” Sensors and Actuators, vol. 29, pp. 37–50, 1995.

[11]

R. Kunz, “Miniature integrated optical modules for chemical and biochemical sensing,” Sensors and Actuators B, vol. 38-39, pp. 13–28, 1997.

[12]

J. Vörös, J. Ramsden, G. Csúcs, I. Szendrő, S. D. Paul, M. Textor, and N. Spencer, “Optical grating coupler biosensors,” Biomaterials, vol. 23, pp. 3699–3710, 2002.

[13]

H. H. K. Nagata, Real-Time Analysis of Biomolecular Interactions: Applications of BIACORE. Springer, Verlag, 2000.

[14]

J. Homola, S. S. Yee, and G. Guaglitz, “Surface plasmon resonance sensors: review,” Sensors and Actuators B, vol. 54, pp. 3–15, 1999.

[15]

“www.farfield-sensors.com.”

[16]

P. Westphal and A. Bornmann, “Biomolecular detection by surface plasmon enhanced ellipsometry,” Sensors and Actuators B, vol. 84, pp. 278–282, 2002.

123

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez [17]

R. Horvath, H. Pedersen, N. Skivesen, D. Selmeczi, and N. Larsen, “Optical waveguide sensor for on-line monitoring of bacteria,” Optics Letters, vol. 28, pp. 1233–1235, 2003.

[18]

K. Schmitt,

B. Schirmer,

C. Hoffmann,

A. Brandenburg,

and

P. Meyrueis,

“Interferometric biosensor based on planar optical waveguide sensor chips for labelfree detection of surface bound bioreactions,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 22, pp. 2591–2597, 2007. [19]

R. Heideman and P. Lambeck, “Remote opto-chemical sensing with extreme sensitivity: design, fabrication and performance of a pigtailed integrated optical phasemodulated mach–zehnder interferometer system,” Sensors and Actuators B, vol. 61, pp. 100–127, 1999.

[20]

W. Lukosz and C. Stamm, “Integrated optical interferometeras relative humidity sensor and differential refractometer,” Sensors and Actuators A, vol. 25, pp. 185–188, 1991.

[21]

G. Cross, A. Brand, J. Popplewell, L. Peel, M. Swann, and N. Freeman, “A new quantitative optical biosensor for protein characterisation,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 19, p. 383, 2003.

[22]

O. Gliko, N. Booth, and P. Vekilov, “Step bunching in a diffusion-controlled system: phase-shifting interferometry investigation of ferritin,” Acta Crystallographica Section D, vol. 58, p. 1622, 2002.

[23]

S. J. Updike and G. P. Hicks, “The enzyme electrode,” Nature, vol. 214, pp. 986–988, 1967.

[24]

A. P. Turner, “Biosensors – sense and sensitivity,” Science, vol. 290, p. 1315–1317, 2000.

[25]

Y. S. Bae, S. W. Kang, M. S. Seo, I. C. Baines, E. Tekle, P. B. Chock, and S. G. Rhee, “Epidermal growth factor (egf)-induced generation of hydrogen peroxide,” Journal of Biological Chemistry, vol. 272, p. 217–221, 1997.

[26]

A. G. Gilman and . .-. . G ProteinsTransducers of Receptor-Generated Signals, Annual Review of Biochemistry, “Transducers of receptor-generated signals,” Annual Review of Biochemistry, vol. 56, pp. 615–649, 1987.

[27]

S. Subrahmanyam, S. A. Piletsky, and A. P. F. Turner, “Application of natural receptors in sensors and assays,” Analalytical Chemistry, vol. 74, p. 3942–3952, 2002.

[28]

P. O’Connell and G. Guilbault, “Future trends in biosensor research,” Analytical Letters, vol. 34, p. 1063–1078, 2001. 124


P. A. Emanuel, J. Dang, J. S. Gebhardt, J. Aldrich, E. A. E. Garber, H. Kulaga, P. Stopa, J. J. Valdes, and A. Dion-Schultz, “Recombinant antibodies: a new reagent for biological agent detection,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 14, p. 751–759, 2000.

[30]

C. M. Niemeyer, M. Adler, and R. Wacker, “Immuno-pcr: high sensitivity detection of proteins by nucleic acid amplification,” TRENDS in Biotechnology, vol. 23, pp. 208– 216, 2005.

[31]

P. K. Gupta, “Single-molecule dna sequencing technologies for future genomics research,” Trends in Biotechnology, vol. 26, pp. 602–611, 2008.

[32]

O. Brandt and J. D. Hoheisel, “Peptide nucleic acids on microarrays and other biosensors,” Trends in Biotechnology, vol. 2, p. 617–622, 2004.

[33]

T. Sampson, “Aptamers and selex: the technology,” World Patent Information, vol. 25, pp. 123–129, 2003.

[34]

E. Luzi, M. Minunni, S. Tombelli, and M. Mascini, “New trends in affinity sensing – aptamers for ligand binding,” Trends in Analytical Chemistry, vol. 22, p. 810–818, 2003.

[35]

S. Song, L. Wang, J. Li, J. Zhao, and C. Fan, “Aptamer-based biosensors,” Trend sin Analitical Chemistry, vol. 27, pp. 108–117, 2008.

[36]

K. Namba and F. Vonderviszt, “Molecular architecture of bacterial flagellum,” Quarterly Review of Biophysics, vol. 30, pp. 1–65, 1997.

[37]

F. A. Samatey, K. Imada, S. Nagasima, F. Vonderviszt, T. Kumasaka, M. Yamamoto, and K. Namba, “Structure of the bacterial flagellar protofilament and implications for a switch for supercoiling,” Nature, vol. 410, pp. 331–337, 2001.

[38]

F. Vonderviszt, H. Uedaira, S. Kidokoro, and K. Namba, “Structural organization of flagellin,” Journal of Molecular Biology, vol. 214, pp. 97–104, 1990.

[39]

I. Yamashita, K. Hasegawa, H. Suzuki, F. Vonderviszt, Y. Mimori-Kiyosue, and K. Namba, “Structure and switching of bacterial flagellar filaments studied by x-ray fiber diffraction,” Nature Structural Biology, vol. 5, pp. 125–132, 1998.

[40]

K. Yonekura, S. Maki-Yonekura, and K. Namba, “Complete atomic modell of the bacterial flagellar filament by electron cryomicroscopy,” Nature, vol. 424, pp. 643– 650, 2003.

[41]

F. Vonderviszt and I. Bársony and Sz. Kamondi and P. Závodszky, PO402683, 2004.

[42]

D. Lipovsek and A. Plückthun, “In-vitro protein evolution by ribosome display and mrna display,” Journal of Immunological Methods, vol. 290, pp. 51–67, 2004. 125


S. O’Malley, Recent Advances in Label-free Biosensors Applications in Protein Biosynthesis and HTS screening. Protein Biosynthesis, Nova Science Publishers Inc., 2008.

[44]

S. K.

Vashist,

“A

review

of

microcantilevers

for

sensing

applications,”

Nanotechnology, p. 10.2240/azojono0115, 2007. [45]

T. Vo-Dinh and B. Cullum, “Biosensors and biochips: advances in biological and medical diagnostics,” Journal of Analytical Chemistry, vol. 366, pp. 540–551, 2000.

[46]

“www.q-sense.com.”

[47]

K. Länge and B. E. Rapp, “Surface acoustic wavce biosensors: a review,” Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol. 391, pp. 1509–1519, 2008.

[48]

“www.micromotive.de.”

[49]

S. P. Mohanty and E. Kougianos, “Biosensors: a tutorial review,” Potentials, IEEE, vol. 25, pp. 35 – 40, 2006.

[50]

Enzimatikus

P. Bárkovits,

érzékelők

alkalmazása

az

orvosbiológiában.

http://www.freeweb.hu/barko/index.htm, 2001. [51]

F. Patolsky and C. M. Lieber, “Nanowire nanosensors,” Materials Today, vol. 8, pp. 20–28, 2005.

[52]

R. E. Gyurcsányi, “Chemically-modified nanopores for sensing,” Trends in Analyitical Chemistry, vol. 27, pp. 627–639, 2008.

[53]

R. Horváth, “Optikai hullámvezető szenzorok biofizikai alkalmazásai, doktori értekezés,” Master’s thesis, Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológiai Fizika Tsz., 2001.

[54]

H. G. Tompkins and E. A. Irene, eds., Handbook of Ellipsometry. William Andrew Pulishing, 2005.

[55]

B. Sepúlveda, J. S. del Río, M. Moreno, F. J. Blanco, K. Mayora, C. Domínguez, and L. M. Lechuga, “Optical biosensor microsystems based on the integration of highly sensitive mach–zehnder interferometer devices,” Journal of Optics A, vol. 8, p. S561, 2006.

[56]

“http://www.infotech.oulu.fi/annual/2005/opme.html.”

[57]

R. Horvath, L. R. Lindvold, and N. B. Larsen, “Reverse-symmetry waveguides: theory and fabrication,” Applied Physics B, vol. 74, pp. 383–393, 2002.

[58]

M. J. Swann, L. L. Peel, S. Carrington, and N. J. Freeman, “Dual-polarization interferometry: an analytical technique to measure changes in protein structure in real time, to determine the stoichiometry of binding events, and to differentiate between 126

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez specific and nonspecific interactions,” Analytical Biochemistry, vol. 329, pp. 190–198, 2004. [59]

K. Tiefenthaler and W. Lukosz, “Integrated optical switches and gas sensors,” Optics Letters, vol. 9, pp. 137–139, 1984.

[60]

R. Horváth, H. C. Pedersen, and N. B. Larsen, “Demonstration of reverse symmetry waveguide sensing in aqueous solutions,” Applied Physics Letter, vol. 81, pp. 2166– 2168, 2002.

[61]

W. Bowers, R. Chuan, and T. Duong, “A 200 mhz surface acoustic wave resonator mass microbalance,” Review of Scientific Instruments, vol. 62, pp. 1624–1629, 1991.

[62]

H. K. Hunt and A. M. Armani, “Label-free biological and chemical sensors,” Nanoscale, vol. 2, pp. 1544–1559, 2010.

[63]

“www.owls-sensors.com.”

[64]

W. Lukosz, “Principles and sensitivities of integrated optical and surface plasmon sensors

for

direct

affinity

sensing

and

immunosensing,”

Biosensors

and

Bioelectronics, vol. 6, pp. 215–225, 1991. [65]

T. Cass and F. S. Ligler, Immobilized Biomolecules in Analysis, A Practical Approach. Oxford University Press, 1998.

[66]

E. T. Vandenberg, L. Bertilsson, B. Liedberg, K. Uvdal, R. Erlandsson, H. Elwing, and I. Lundström, “Structure of 3-aminoprophyl triethoxy silane on silicon oxide,” Journal of Colloid and Interface Science, vol. 147, pp. 103–118, 1991.

[67]

J. A. D. Feijter, J. Benjamins, and F. Veer, “Ellipsometry as a tool to study the adsorption behaviour of synthetic and biopolymers at the air – water interface,” Biopolimers, vol. 17, pp. 1759–1772, 1978.

[68]

“http://www.jawoollam.com/m2000_home.html.”

[69]

“http://en.wikipedia.org/wiki/b-spline.”

[70]

S. Kurunczi,

A. Német,

T. Hülber,

P. Kozma,

H. Jankovics,

A. Sebestyén,

F. Vonderviszt, M. Fried, and I. Bársony, “In situ ellipsometric study of surface immobilization of flagellar filaments,” Applied Surface Science, vol. 257, pp. 319– 324, 2010. [71]

R. Kunz, G. Duveneck, and M. Ehrat, “Sensing pads for hybrid and monolithic integrated optical immunosensors,” Proceedings of SPIE, vol. 2331, pp. 2–17, 1994.

[72]

S. Pekker, Makromolekulák, Egyetemi Jegyzet. Eötvös Loránd Tudományegyetem, 2006.

127


C. G. Broyden, “The convergence of a class of double-rank minimization algorithms,” Journal of the Institute of Mathematics and Its Applications, vol. 6, p. 76–90, 1970.

[74]

R. Fletcher, “A new approach to variable metric algorithms,” Computer Journal, vol. 13, p. 317–322, 1970.

[75]

D. Goldfarb, “A family of variable metric updates derived by variational means,” Mathematics of Computation, vol. 24, p. 23–26, 1970.

[76]

D. F. Shanno, “Conditioning of quasi-newton methods for function minimization,” Mathematics of Computation, vol. 24, p. 647–656, 1970.

[77]

M. Avriel, Nonlinear Programming: Analysis and Methods. Dover Publishing, Portland, Oregon, 2003.

[78]

S. Kurunczi, R. Horvath, Y. P. Yeh, A. Muskotál, A. Sebestyén, F. Vonderviszt, and J. J. Ramsden, “Self-assembly of rodlike receptors from bulk solution,” Journal of Chemical Physics, vol. 130, p. 011101, 2009.

[79]

M. K. Cottier, “Advanced label-free biochemical sensors based on integrated optical waveguide gratings,” Master’s thesis, Universite de Neuchatel, Faculte des Sciences, 2004.

[80]

K. Cottier, WO2008110026, 2008.

[81]

A. Hámori and N. Nagy, “Sub-micrometer period refractive index grating coupler for single mode optical waveguide sensors,” Sensors Proceedings of IEEE, vol. 3, pp. 1333–1336, 2004.

[82]

“http://en.wikipedia.org/wiki/detection_limit_cite_note-0.”

[83]

W. H. Press, S. A. Teukolsky, W. T. Vetterling, and B. P. Flannery, Numerical Recepies in C. Cambridge University Press, Cambridge, 1992.

[84]

N. Green, “Avidin,” Advances in Protein Chemistry, vol. 29, pp. 85–133, 1975.

[85]

M. Wilchek and E. A. Bayer, “The avidin-biotin complex in bioanalytical applications,” Analytical Biochemistry, vol. 171, pp. 1–32, 1988.

[86]

V. N. Konopsky and E. V. Alieva, “A biosensor based on photonic crystal surface waves with an independent registration of the liquid refractive index,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 25, pp. 1212–1216, 2010.

[87]

F. Barroso, S. Bosch, N. Tort, O. Arteaga, J. Sancho-Parramon, E. Jover, E. Bertran, and A. Canillas, “Detection and characterization of single nanoparticles by interferometric

phase

modulated

vol. 10.1016/j.tsf.2010.12.051, 2010.

128

ellipsometry,”

Thin

Solid

Films,


R. A. May, D. W. Flaherty, C. B. Mullins, and K. J. Stevenson, “Hybrid generalized ellipsometry and quartz crystal microballance nanogravimetry for the determination of adsorption on biaxial metal oxide films,” Journal of Physical Chemistry Letters, vol. 1, pp. 1264–1268, 2010.

[89]

J. L. Orgtega-Vinuessa, P. Tengval, and I. Lundstrom, “Molecular packing of hsa, igg, and fibrinogen adsorbed on silicon by afm imaging,” Thin Solid Films, vol. 324, pp. 257–273, 1998.

[90]

J. Kavanaugh, W. Moo-Penn, and A. Arnone, “Accomodation of insertions in helixes: The mutation in hemoglobin catonsville (pro 37alpha-glu-thr 38alpha) generates a 310 - alpha bulge,” Biochemistry, vol. 32, pp. 2509–2513, 1993.

[91]

“www.jobinyvon.com.”

[92]

J. D. Jackson, Klasszikus elektrodinamika. Typotex, 2004.

[93]

“http://goliat.eik.bme.hu/ tothaf/tananyagok/letoltesek/interfer_bk.pdf.”

[94]

J. Giber, A. Sólyom, and L. Kocsányi, Fizika mérnököknek I-II. (A műszaki fizika alapjai). Egyetemi tankönyv, Műegyetem Kiadó, 1999.

[95]

P. Drude, “Ueber oberflächenschichten,” Annalen der Physik, vol. 272, pp. 865–897, 1889.

[96]

D. E. Aspnes, “Optical properties of thin films,” Thin Solid Films, vol. 89, p. 249, 1982.

[97]

R. M. A. Azzam and N. M. Bashara, Ellipsometry and Polarized Light. Elsevier Publications, 1987.

[98]

J. G. E. Jellison, Data Analysis for Spectroscopic Ellipsometry, Handbook of Ellipsometry. William Andrew Publ., Norwich, NY, 2005.

[99]

D. Stroud, Superlattices and Microstructures, The Effective Medium Approximation: Some Recent Developments. Academic Press Limited, 1998.

[100] D. A. G. Bruggeman, “Berechnung verschiedener physikalischer konstanten von heterogenen substanzen i. dielektrizität und leitfehigkaiten der mischkörper aus isotropen substanzen,” Annalen der Physik, vol. 24, p. 636, 1935. [101] B. Saleh and M. C. Teich, Fundamentals of Photonics. John Wiley & Sons, Inc., 1991. [102] R. Horvath, “Optikai hullámvezetók biológiai alkalmazása, diplomamunka,” Master’s thesis, Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológiai Fizika Tsz., 1997. [103] P. K. Tien, “Integrated optics and new wave phenomena,” Review of Modern Physics, vol. 49, pp. 361–420, 1977.

129

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez [104] S. J.

Orfanidis,

Electromagnetic

waves

and

antennas.

http://www.ece.rutgers.edu/ orfanidi/ewa/. [105] K. Tiefenthaler and W. Lukosz, “Sensitivity of grating couplers as integrated-optical chemical sensors,” Journal of the Optical Society of America B, vol. 6, pp. 209–220, 1988. [106] K. Bernolák, D. Szabó, and L. Szilas, A mikroszkóp zsebkönyv. Műszaki Könyvkiadó, 1979. [107] N. Éber and N. Roznoslik, Folyadékkristályok vizsgálata, Modern fizika laboratórium. Egyetemi jegyzet, ELTE Eötvös Kiadó, 1995. [108] E. Hällstig, “Nematic liquid crystal spatial light modulators for laser beam steering,” Master’s thesis, Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Science and Technology, 1048, 2004. [109] “Olympus microscopy research center, fresnel or refractive index ellipsoid, http://www.olympusmicro.com/primer/java/polarizedlight/ellipsoid/index.html.” [110] D. Dayton, S. Browne, J. Gongelwski, and S. Restaino, “Characterization and control of a multielement dual-frequency liquid-crystal device for high speed adaptive optical wave-front correction,” Applied Optics, vol. 40, pp. 2345–2355, 2001.

130

Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez

Recommend Documents