KORELASI KADAR F2-ISOPROSTAN URIN DAN ESTIMASI LAJU FILTRASI GLOMERULUS PADA PASIEN TALASEMIA BETA MAYOR
KARYA AKHIR
Disusun untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan Mencapai Derajat Dokter Spesialis Program Studi Patologi Klinik
Oleh Sri Hadiati S971302002
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS PATOLOGI KLINIK FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2016
i
ii
iii
iv
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, atas berkah dan rahmatNya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya akhir yang berjudul Korelasi Kadar F2-Isoprostan Urin dan Estimasi Laju Filtrasi Glomerulus pada Pasien Talasemia Beta Mayor. Penelitian ini dibuat untuk memenuhi persyaratan mencapai derajat Dokter Spesialis Patologi Klinik pada Universitas Negeri Sebelas Maret (UNS) Surakarta. Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya kepada: 1. Prof. Dr. R. Kasidi, MS selaku Rektor UNS Surakarta 2. Prof. Dr. Hartono dr., M.Si selaku Dekan Fakultas Kedokteran UNS Surakarta 3. Dr. Endang Agustinar, M.Kes selaku Direktur Rumah Sakit Umum Dokter Moewardi (RSDM) di Surakarta, yang telah mendukung dan menyediakan sarana penelitian Program Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Klinik Universitas Sebelas Maret 4. MI Diah P, dr., Sp.PK(K), MSc., selaku Kepala Kelompok Satuan Medik Patologi Klinik RSDM di Surakarta 5. B. Rina A. Sidharta, dr., Sp.PK(K), selaku Kepala Program Studi Patologi Klinik FK UNS dan Kepala Instalasi Patologi Klinik RSDM di Surakarta serta selaku pembimbing I. Terima kasih atas bimbingan, masukan saran, koreksi dan kesabaran dalam membimbing penulisan karya akhir ini 6. Dian Ariningrum, dr., Sp.PK, M.Kes selaku Kepala Bagian Patologi Klinik FK UNS Surakarta dan selaku pembimbing II. Terima kasih atas bimbingan, masukan saran, koreksi dan kesabaran dalam membimbing penulisan karya akhir ini 7. Bapak dan Ibu staf pengajar PPDS Patologi Klinik Fakultas Kedokteran UNS/RSDM di Surakarta, para guru kami: Tahono dr., Sp.PK(K), H. Yuwono, dr., Sp.PK, Tonang Dwi A, dr., Sp.PK, PhD yang telah membimbing dan menjadi guru kami selama pendidikan
v
8. Laboratorium Klinik Prodia Surakarta, Instalasi Patologi Klinik RSDM di Surakarta, Poliklinik dan Bangsal hematologi anak RSDM, serta Persatuan Orang tua Penderita Talasemia Indonesia (POPTI) cabang Solo, yang telah mendukung dan menyediakan sarana penelitian ini 9.
Seluruh subjek penelitian, yang telah berkenan dan ikhlas memberikan pengorbanan demi kemajuan ilmu pengetahuan
10. Seluruh
teman-teman
PPDS
Patologi
Klinik
Fakultas
Kedokteran
UNS/RSDM di Surakarta atas segala bantuan dan dukungan yang telah diberikan selama penelitian ini berlangsung. 11. Kedua orang tuaku Bapak Banani (alm), Ibu Suratmi yang telah membesarkan, mendidik, dan menanamkan rasa tanggung jawab dan disiplin serta memberikan dorongan dan dukungan penuh, sehingga penulis dapat mencapai jenjang pendidikan spesialisasi ini 12. Suami tercinta Firnawan Hendrayanto, ST. MT, terima kasih atas doa, dukungan dan kesabaran selama penulis menjalani pendidikan ini 13. Ananda putri tersayang, Jilan Nabila Firdy dan Hilwa Farhata Imany, terima kasih atas doa, dukungan, kesabaran, pengertian dan jiwa besarnya selama penulis menjalani pendidikan ini. Tak lupa pula terima kasih untuk kakak dan adik tersayang atas doa dan dukungannya Penulis menyadari bahwa karya akhir ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu dengan penuh rendah hati penulis mengharapkan masukan, koreksi dan saran demi perbaikan sehingga bermanfaat bagi perkembangan keilmuan di bidang Patologi Klinik. Akhir kata, penulis berharap semoga karya akhir ini dapat memberikan manfaat yang bagi perkembangan ilmu pengetahuan di bidang Patologi Klinik dan semua pihak yang membutuhkan. Surakarta, 19 Juli 2016
Sri Hadiati
vi
DAFTAR ISI Halaman Judul …………………………………………………................................. Lembar Pengesahan …………………………………………………......................... Halaman Persetujuan.................................................................................................... Pernyataan …………………………………………………..………......................... Prakata.......................................................................................................................... Daftar Isi ……………………………………………………..……............................ Daftar Gambar …………………………………………………..…........................... Daftar Tabel ……………………………………………………..……....................... Daftar Lampiran........................................................................................................... Daftar Singkatan ………………………………………………….............................. Intisari........................................................................................................................... Abstract......................................................................................................................... BAB I. PENDAHULUAN …………………………..………………....................... A. Latar Belakang ………………………………….……….......................... B. Perumusan Masalah ……………………………………........................... C. Tujuan Penelitian ………………………………………........................... D. Manfaat Penelitian ………………………………………......................... E. Keaslian Penelitian ………………………………………......................... BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ……………………..………………...................... A. Kajian Teori ……………………………………………...….................... 1. Talasemia Beta Mayor ………………………………....…................... 2. Stres Oksidatif ………………………………….....……...................... 3. F2-Isoprostan …………………………………...………...................... 4. Mekanisme Gangguan Fungsi Ginjal pada TBM................................... 5. Pemeriksaan Laboratorium Fungsi Ginjal.............................................. a. Kreatinin............................................................................................ b. Laju Filtrasi Glomerulus................................................................... B. Kerangka Pikir ……………………….……………………...................... C. Hipotesis …………………………………...……………...….................. BAB III. METODE DAN CARA PENELITIAN ……………………...…................ A. Rancangan Penelitian ………………………………….....….................... B. Tempat dan Waktu Penelitian …………………………....….................... C. Subjek Penelitian ……………………………………....……................... D. Bahan dan Alat ………………………...…………....………................... E. Cara, Prosedur dan Skema Alur Penelitian …..…….....……..................... 1. Cara Penelitian........................................................................................ 2. Prosedur Penelitian................................................................................. a.F2-Isoprostan ………………………….….…………….................... b.Kreatinin Serum dan Kreatinin Urin.....……………........................ c.Pengukuran Tinggi Badan.................................................................. 3. Skema Alur Penelitian …………………...……………….................... F. Identifikasi Variabel Penelitian ……………....……………….................. G. Definisi operasional Variabel Penelitian …....………………................... H. Kontrol Kualitas Internal …………………..………………..................... I. Analisis Statistik …………………...………...………….…….................. J. Pertimbangan Etik ………………...……………....…………................... BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................................... A. Validitas Uji Analitik.................................................................................
vii
i ii iii iv v vii ix x xi xii xiii xiv 1 4 4 4 4 4 7 7 7 11 13 18 24 24 26 29 29 30 30 30 30 32 33 33 34 35 38 39 40 39 39 41 41 43 44 44
1. Uji Presisi.............................................................................................. 2. Uji Akurasi............................................................................................ B. Karakteristik Subyek Penelitian................................................................. C. Uji Komparasi............................................................................................ D. Uji Korelasi................................................................................................ BAB V. SIMPULAN DAN SARAN........................................................................... Ringkasan..................................................................................................................... Daftar Pustaka....................………………………….……………….….................... Lampiran......................................................................................................................
viii
44 45 45 50 51 54 55 60 66
DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Pembentukan Hidroksi Radikal pada Reaksi Haber-Weiss dan Reaksi Fenton........................................………………….………...…............ Gambar 2. Hasil F2-IsoPs urin metode GCMS dan ELISA..................................... Gambar 3. Pembentukan Radikal Bebas yang diinduksi Oksidasi AA................... Gambar 4. Mekanisme Gangguan Fungsi Ginjal pada TBM. ……….…................ Gambar 5. Perbandingan Formula Schwartz dan Inulin Clearance......................... Gambar 6. Bagan Kerangka Pikir.......................... ..…………………………....... Gambar 7. Skema Pemeriksaan 8-IsoPs secara EIA …………...………................ Gambar 8. Preparasi Larutan-larutan Standar Pemeriksaan 8-IsoPs .……..…...... Gambar 9. Format Plate Pemeriksaan 8-IsoPs ……..………................................. Gambar 10. Skema Alur Penelitian.........….……...................………….………..… Gambar 11. Grafik Korelasi F2-IsoPs urin dan eLFG................................................ Gambar 12. Hubungan antara nilai LFG dengan AER..............................................
ix
12 15 17 20 28 29 35 36 36 40 52 53
DAFTAR TABEL Tabel 1. Tabel 2. Tabel 3. Tabel 4. Tabel 5. Tabel 6 Tabel 7. Tabel 8. Tabel 9. Tabel 10.
Keaslian penelitian................................................................................... Biomarker kerusakan stres oksidatif........................................................ Klasifikasi PGK berdasarkan kategori LFG............................................. Nilai rujukan kreatinin serum menurut usia............................................. Spesifitas 8-IsoPG EIA............................................................................. Hasil uji presisi pemeriksaan kreatinin serum dan F2-IsoPs urin............. Hasil uji akurasi untuk pemeriksaan kreatinin serum............................... Deskripsi karakteristik subjek penelitian.................................................. Hasil uji komparasi................................................................................... Korelasi Spearman F2-IsoPs urin dengan beberapa variabel penelitian pada pasien TBM......................................................................................
x
5 13 21 25 38 42 43 47 50 51
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Data subyek penelitian…....................................................................... Lampiran 2. Hasil Perhitungan statistik..................................................................... Lampiran 3. Hasil pemeriksaan F2-IsoPs urin............................................................ Lampiran 4. Hasil QC kreatinin serum...................................................................... Lampiran 5. Penjelasan penelitian............................................................................. Lampiran 6. Surat pernyataan bersedia menjasi subjek penelitian........................... Lampiran 7. Data isian responden.............................................................................. Lampiran 8. Kelaikan etik ......................................................................................... Lampiran 9. Dokumentasi proses pemeriksaan F2-IsoPs...........................................
xi
66 67 70 72 73 74 75 76 77
DAFTAR SINGKATAN AA AChE AU B0 BHT Blk BM BTM CCl4 CKD COX DM DNA eLFG EIA F2-IsoPs Fe2+ Fe3+ GC-MS GPx H2O2 KV L∙ LOO∙ LOOH MDA mg mL µL NADH NAD NSB O2OH∙ PFOA PG ng PRC PUFA ROS S SB SOD TA TBARS TGF-β U/L
Asam arakidonat Acetylcholinesterase Absorban Unit Maximum binding Butylated hydroxytoluene Blank Bone marrow Beta talasemia mayor Carbon tetrachloride Chronic kidney disease Cyclooxygenase Diabetes mellitus Deoxyribonucleic acid Estimasi laju filtrasi glomerulus Enzyme immunoassay F2-isoprostan Ferrous iron Ferric iron Gas chromatography-mass spectrometry Glutathione peroxidase hidrogen peroksida Koefisien variasi carbon-centered lipid radical peroxy lipid radical hidroperoksida lipid Malondialdehyde miligram mililiter mikroliter Nicotinamide adenine dinucleotide tereduksi Nicotinamide adenine dinucleotide teroksidasi Non-specific binding superoxide Hydroxyl radical Perfluorooctanoic acid Prostaglandin Nanogram Packed red blood cell Polyunsaturated fatty acid Reactive oxygen species Standard Simpang baku Sarkosin oxidase Total activity Thiobarbituric acid-reacting substances Transforming growth factor beta Unit per liter
xii
KORELASI KADAR F2-ISOPROSTAN URIN DAN ESTIMASI LAJU FILTRASI GLOMERULUS PADA PASIEN TALASEMIA BETA MAYOR INTISARI Sri Hadiati1, B. Rina A. Sidharta2, Dian Ariningrum2 Program Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret/Rumah Sakit Umum Daerah Dr. Moewardi di Surakarta 2 Bagian Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret/ Rumah Sakit Umum Daerah Dr. Moewardi di Surakarta 1
Pemberian transfusi darah kronik pada pasien talasemia beta mayor (TBM) dapat menyebabkan kelebihan kadar besi dalam tubuh yang memicu timbulnya reactive oxygen species (ROS) yang diukur dalam bentuk F2-IsoPs urin dan gangguan ginjal yang diukur dengan estimasi laju filtrasi glomerulus (eLFG). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui korelasi kadar F2-IsoPs urin dengan eLFG pada pasien TBM. Penelitian secara potong lintang pada bulan Mei-Juni 2016. Subjek sebanyak 30 pasien TBM yang datang ke Instalasi rawat jalan Bagian Ilmu Kesehatan Anak (IKA) dan Bangsal Talasemia yang dilakukan pemeriksaan di Instalasi Patologi Klinik RSDM di Surakarta. Analisis statistik menggunakan uji korelasi Spearman, kemaknaan statistik ditujukkan dengan nilai p < 0,05 dan interval kepercayaan 95%. Hasil penelitian didapatkan rerata usia 12,2 ± 3,57 tahun, laki-laki 15 orang (50%) dan wanita 15 orang (50%). Rerata kadar F2-IsoPs urin adalah 2,36 ± 1,11 ng/mg kreatinin urin. Hasil eLFG berada pada median 271,3 dengan nilai minimum 199,8 dan nilai maksimum 476,0 mL/menit/1,73m2. Hasil korelasi F2-IsoPs urin dengan eLFG r = 0,740; p = 0,001. Terdapat korelasi positif kuat dan bermakna antara F2-IsoPs urin dengan eLFG menunjukkan bahwa terjadi peningkatan nilai eLFG seiring dengan peningkatan F2-IsoPs urin. Penelitian ini didapatkan nilai eLFG yang lebih tinggi dari normal/cenderung hiperfiltrasi yang merupakan tahap awal penyakit ginjal kronik. eLFG dapat digunakan untuk meramalkan tingkat stres oksidatif pada pasien TBM. Perlu penelitian lanjutan dengan desain yang berbeda untuk mengevaluasi korelasi peningkatan F2-IsoPs urin dan eLFG dengan menentukan marker yang dapat membedakan kerusakan oksidatif pada glomerulus/tubulus ginjal. Kata kunci: TBM, F2-Isoprostan urin, eLFG
xiii
THE CORRELATION OF URINARY F2-ISOPROSTAN AND ESTIMATED GLOMERULOFILTRATION RATE IN BETA THALASSEMIC MAYOR PATIENTS ABSTRACT Sri Hadiati1, B. Rina A. Sidharta2, Dian Ariningrum2 Clinical Pathology Educational Programme, Faculty of Medicine Sebelas Maret University/dr. Moewardi Hospital in Surakarta 2 Departement of Clinical Pathology Faculty of Medicine, Sebelas Maret University/ dr. Moewardi hospital in Surakarta 1
Beta thalassaemia mayor (BTM) characterised by progressive anaemia necessitating regular blood transfusions to sustain life. The advent of effective chelating agents can reduce iron burden and extend patients’survival, renal disease has become more prevalent. Free iron catalyzes formation of highly reactive oxygen species (ROS), measured as Urinary F2-IsoPs and estimated glomerular filtration rate (eGFR). The aim of this study was to determine the correlation between urinary F2-IsoPs and eGFR in BTM patients. This cross sectional study was conducted during May-June 2016. Thirthty patients BTM admitted to departement of Pediatrics Hematology Dr. Moewardi hospital in Surakarta. Spearman’s correlation was used to analyze the data, considered significant when p value < 0.05 with 95% confidence interval. The result showed a mean of age were 12.2 ± 3.57 years, consist of 15 men (50%) and 15 women (50%). The mean of urinary F2-IsoPs was 2.36 ± 1.11 ng/mg creatinine urine. Estimated GFR at median 271.3 mL/min/1,73 m2 with minimum value 199,8 mL/min/1,73 m2 and maximum value 476.0 mL/min/1,73 m2. The correlation between urinary F2-IsoPs and eGFR r = 0.740; p = 0.001. There was a significant strong positive correlation between urinary F2-IsoPs and eGFR indicated the increased of eGFR followed by the increased of urinary F2-IsoPs. Glomerular hiperfiltration was considered as early stage of chronic kidney disease. We concluded that eGFR can be used to predict oxidative stress in BTM patients. Further research is needed to evaluate the correlation between urinary F2-IsoPs and eGFR to determine oxidative damage in glomerulus or tubulus renal.
Keywords: beta thalassemia major, F2-Isoprostan, eGFR
xiv
BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Penelitian Talasemia merupakan kelainan genetik yang hingga saat ini menjadi masalah kesehatan dunia termasuk Indonesia. World Health Organization (WHO) pada tahun 1994 menyatakan bahwa ± 4,5% dari 250 juta penduduk dunia adalah talasemia karier (bentuk heterozigot), 80‒90 juta sebagai karier talasemia beta, sisanya adalah talasemia alfa dan jenis Hb varian seperti Hb E, Hb S, Hb O dan sebagainya (Atmakusumah et al., 2010). Penyebaran penyakit talasemia mulai dari Mediterrania, Timur Tengah, India, Burma, serta daerah sabuk talasemia (Cina bagian selatan, Thailand, Semenanjung Malaysia, Kepulauan pasifik dan Indonesia). Daerah‒daerah tersebut lazim d isebut dengan daerah sabuk talasemia oleh karena prevalensi talasemia sebesar 2,5‒15% (Langlois et al., 2008). Diagnosis penyakit ini sangat penting karena berkaitan dengan tata laksana, diantaranya adalah transfusi darah yang terus menerus dengan segala akibatnya. Talasemia beta mayor (TBM) membutuhkan transfusi darah secara rutin disertai pemberian khelasi besi yang optimal untuk mempertahankan kualitas hidupnya. Namun, pemberian transfusi berulang mempunyai dampak yang kurang baik bagi penderita yaitu dapat terjadi penimbunan besi (iron overload) pada berbagai organ tubuh, seperti hati, jantung, ginjal, pankreas, dan lain lain. Adanya besi bebas dalam bentuk ferrous (Fe2+) akan memicu timbulnya reactive oxygene species (ROS) untuk menghasilkan radikal superoksida yang akan mengoksidasi lipid membran sel dan protein sehingga menyebabkan kerusakan sel dan kematian (Rund dan Rachmilewitz, 2005). Stres oksidatif merupakan salah satu faktor penting yang berperan pada progresivitas TBM. Kelebihan rantai alfa yang bersifat labil dan mudah teroksidasi pada pasien TBM merupakan dasar patogenesis dari penyakit ini yang menimbulkan manifestasi berupa gejala klinis anemia. Hipotesis stres oksidatif injury, menyatakan bahwa iron overload dapat menyebabkan stres
1
2
oksidatif
yang
akan
menyebabkan
peroksidasi
lipid
menghasilkan
pembentukan radikal bebas yang berakibat pada kerusakan sel, membran sel, dan jaringan. Peningkatan lipid peroksidasi tersebut dapat diukur dengan berbagai metode pengukuran lipid peroksidasi dalam darah, urin, liquor cerebrospinalis, dan cairan biokimia lainnya salah satunya menggunakan marker F2-IsoPs. Beberapa produk hasil peroksidasi lipid lainnya adalah malondialdehyde (MDA), 4–hydroxynonenal (HNE), thiobarbituric acidreacting substances (TBARS) dan lain-lain (Vinita et al., 2015). Saat ini F2-IsoPs merupakan marker stres oksidatif atau lipid peroksidasi in vivo yang tergolong baru, paling baik, sangat stabil, dan secara signifikan lebih akurat daripada marker lainnya. F2-IsoProstan telah ditemukan hampir di seluruh cairan biologis, namun darah (plasma ataupun serum) dan urin merupakan sampel penelitian yang paling umum digunakan karena paling mudah didapatkan, paling tidak invasif, dan memberikan hasil yang sama akurat dan presisi dari indeks stres oksidatif. Isomer 8-isoprostan dari F2-IsoPs merupakan isomer F2-IsoPs yang paling banyak dihasilkan dan paling sering diteliti. Dan penelitian menunjukkan bahwa kadar total F2-IsoPs (bebas dan yang terikat dengan fosfolipid) dapat menggambarkan keadaan stres oksidatif yang sebenarnya (Dalle-Donne, 2006; Janicka et al., 2010). Manusia tidak memiliki mekanisme untuk mengekskresi kelebihan besi, sehingga diperlukan terapi khelasi besi. Terapi khelasi besi terbukti sangat efektif menurunkan kandungan besi pada pasien TBM yang mendapat transfusi (Rund dan Rachmilewitz, 2005). Khelasi besi adalah suatu agen yang dapat mengikat kelebihan besi dalam tubuh. Masalah yang timbul pada penggunaan terapi khelasi besi dalam jangka waktu yang lama adalah efek sampingnya berupa toksisitas pada ginjal (Beutler et al., 2003). Penelitian jangka pendek yang melibatkan 11 pasien TBM yang diterapi deferasirox 30 mg/kg/hari hingga 24 minggu, menunjukkan penurunan nilai rerata estimasi laju filtrasi glomerulus (eLFG) hingga 9,2 (9,5%) dan penurunan renal plasma flow (RPF) 105,7 mL/min (17,8%), sedangkan penelitian jangka panjang yang diikuti hingga minggu ke 104, hasilnya terjadi penurunan eLFG hingga 19,1 (17,7%)
3
dan penurunan RPF hingga 155,6 mL/min (26,1%). Penurunan terjadi mulai pada minggu ke 52 (Piga et al., 2015). Keberhasilan terapi penyakit talasemia ternyata menimbulkan masalah baru yaitu munculnya berbagai komplikasi, diantaranya adalah abnormalitas fungsi ginjal. Saat ini dilaporkan sekitar 8% dari 6 juta pasien talasemia di UK (United Kingdom) terjadi komplikasi chronic kidney disease (CKD). Bakr et al., 2014 mengatakan adanya disfungsi tubulus ginjal dan penurunan laju filtrasi glomerulus (LFG) pada pasien TBM yang diterapi khelasi besi. Dari 330 jumlah pasien yang mendapatkan terapi deferoxamine sebagai khelasi besi, 224 (68%) dilaporkan mengalami komplikasi berupa gangguan fungsi ginjal berupa proteinuria dan penurunan LFG (Cunningham et al., 2004). Data di atas menunjukkan bahwa pada pasien talasemia dapat terjadi gangguan fungsi ginjal hingga jatuh ke arah PGK. Kidney Disease Improving Global Outcome (KDIGO) pada tahun 2013 membuat klasifikasi stadium PGK
berdasarkan penurunan fungsi ginjal yang diukur dengan LFG. Tahap awal PGK (G1) adalah kerusakan ginjal dengan fungsi ginjal normal atau meningkat dengan nilai LFG ≥ 90 mL/menit/1,73 m²; tahap 2 (G2) kerusakan ginjal dengan penurunan fungsi ginjal ringan dengan LFG 60-89 mL/menit/1,73 m²; tahap 3 (G3) Penurunan fungsi ginjal ringan-sedang dengan LFG 45-59 mL/menit/1,73 m²; tahap IV merupakan penurunan fungsi ginjal berat dengan LFG 15-29 mL/menit/1,73 m²; dan tahap akhir adalah gagal ginjal dengan LFG < 15 mL/menit/1,7 m². Penelitian mengenai korelasi antara F2-IsoPs urin sebagai penanda stres oksidatif
hasil peroksidasi lipid pada ginjal dengan eLFG belum pernah
dilakukan, oleh karena itu penelitian ini akan menganalisis korelasi antara F2IsoPs urin sebagai penanda stres oksidatif kerusakan ginjal dengan eLFG yang dapat memberikan informasi untuk menilai fungsi ginjal pada pasien TBM. Pengukuran marker stress oksidatif dikorelasikan dengan disfungsi ginjal ini masih merupakan penelitian yang menarik karena berhubungan dengan prediksi, risiko, etiologi, dan intervensi dari tata laksana talasemia. Walaupun F2-IsoPs saat ini telah diakui sebagai marker peroksidasi lipid yang
4
paling baik (Janicka et al., 2010), namun peran F2-IsoPs pada TBM belum banyak diketahui. Penelitian pada TBM yang mengunakan F2-IsoPs urin sebagai marker peroksidasi lipid pun masih terbilang baru dan sedikit dibandingkan marker lainnya. Dengan kemampuan F2-IsoPs sebagai penanda kerusakan jaringan akibat stres oksidatif diduga dapat dipergunakan untuk memprediksi terjadinya penurunan fungsi ginjal lebih awal pada pasien TBM sehingga penanggulangan penyakit akan lebih baik. Pada penelitian ini akan menilai korelasi antara F2-IsoPs urin dengan eLFG dalam mendeteksi kerusakan ginjal. Penelitian ini perlu dilakukan dengan harapan dapat menjawab hasil penelitian yang selama ini masih kontradiktif. B. Rumusan Masalah Apakah terdapat korelasi antara kadar F2-IsoPs urin dengan eLFG pada pasien TBM ? C. Tujuan Penelitian Mengetahui korelasi antara kadar F2-IsoPs urin dengan eLFG pada pasien TBM. D. Manfaat Penelitian 1. Manfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan: Dapat diketahui mengenai korelasi kadar F2-IsoPs urin dengan eLFG pada pasien TBM. Hasil penelitian ini juga dapat digunakan sebagai dasar untuk penelitian selanjutnya. 2. Manfaat praktis: penilaian fungsi ginjal dengan eLFG dapat digunakan untuk menilai stres oksidatif pada pasien TBM . E. Keaslian Penelitian Beberapa penelitian sebelumnya telah meneliti marker stres oksidatif dan marker fungsi ginjal pada pasien TBM. Namun belum ada yang meneliti kadar F2-IsoPs urin pada pasien TBM. Tabel 1 menyajikan beberapa penelitian terkait fungsi ginjal pada TBM yang telah dilakukan.
5
Tabel 1. Keaslian Penelitian No. 1.
Peneliti dan Judul Penelitian Matayatsuk et al.
Jumlah Kasus 17 pasien TBM serta 9 kontrol Elevated F2-isoprostanes in sehat thalassemic patients Free Radic Biol Med. 2007. 43:1649-1655.
69 pasien TBM Terdapat peningkatan serum dan 15 kontrol kreatinin dan penurunan LFG pada pasien TBM yang Renal functions in pediatric sehat mendapat deferoxamine patients with beta(0,55 ± 0,08 vs 0,75 ± 0,18, p thalassemia major: relation < 0,001 dan 119,08 ± 11,13 to chelation therapy: original 2 mL/menit/1,73 m vs 92,67 ± prospective study 25,16 mL/menit/1,73 m2; p < 0,001). Italian Journal of Pediatrics. 2010. 36:1-10.
2.
Hamed E dan Nagla T
3.
Majid et al.
30 pasien TBM
A Prospective study of tubular disfunction in pediatric patient with Beta thalassemia mayor receiving deserafirox Pediatric Haematology and Oncology. 2013. 30:748-754 4.
Hasil Penelitian Kadar F2-IsoPs urin pada pasien talasemia lebih tinggi dibandingkan kontrol dengan rerata 3,38 ± 2,15 ng/mg kreatinin urin vs 0,86 ± 0,55 ng/mg kreatinin urin (p = 0,002). Kadar F2-IsoPs plasma total pada pasien TBM lebih tinggi dibandingkan kontrol dengan rerata 0,39 ± 0,15 ng/mL vs 0,18 ± 0,03 ng/mL (p = 0,0003).
Milo et al.
9 pasien TBM yang di terapi Glomerulofiltration rate in deferasirox. pasien with thalassemia Beta mayor Acta Haematol. 123:148-152.
2015.
Terdapat peningkatan serum kreatinin (0,54 ± 0,08 vs 0,67 ± 0,16) dan penurunan LFG (104,36 mL/menit/1,73 m2 ± 19,62 vs 86,00 mL/menit/1,73 m2 ± 16,92) 6 bulan setelah mendapat terapi deserafirox (p<0,01) .
Laju filtrasi glomerulus pada pasien TBM 76,6 mL/menit/1,73 m2.
6
Tabel 1. Keaslian Penelitian (lanjutan) 5. Wirawan et al. Renal impairment thalassemic major receiving repeated transfusion.
in β patient blood
Med J Indones. 2003. 12:215223.
75 pasien TBM
Terdapat microalbuminuria (4360 mg/dL) dan peningkatan β2-microglobulin urin (260109.500 ng/dL).
BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Kajian Teori 1. Talasemia Beta Mayor Talasemia beta mayor merupakan kelainan genetik dengan kegagalan sintesis globin beta (β0) atau penurunan sintesis globin beta (β+) yang merupakan komponen penting penyusun hemoglobin. Penurunan sintesis hemoglobin ini menyebabkan produksi hemoglobin tidak efektif, dan kerusakan eritrosit atau prekursornya oleh karena ekses akumulasi rantai globin yang tidak mengalami gangguan sintesis. Distribusi talasemia terkonsentrasi pada “thalassemia belt”, yaitu daerah yang mencakup dari mediterania ke timur sampai Asia Tenggara dan ke selatan sampai Afrika Utara (Rodak et al., 2012). Pada TBM, ekses rantai alfa yang tidak berpasangan akan berpresipitasi pada eritrosit yang sedang berkembang dan merusak permukaan eritrosit tersebut. Eritrosit yang rusak ini kemudian akan dihancurkan oleh makrofag pada sumsum tulang atau pada sirkulasi. Kematian prematur dari eritrosit di sumsum tulang ini menyebabkan eritropoisis menjadi tidak efektif. Sebagian sel dapat melewati sumsum tulang, tetapi kemudian mengalami hemolisis ekstravaskuler di lien. Maka pada talasemia beta, anemia disebabkan oleh eritropoisis yang inefektif dan peningkatan destruksi eritrosit (Rahman et al., 2012; Rodak et al., 2012). Gejala klinis talasemia bervariasi. Umumnya individu dengan talasemia beta tidak mempunyai gejala hingga umur 4 atau 6 bulan karena hemoglobin F (α22) masih berperan sebagai hemoglobin sirkulasi dominan. Talasemia dibagi menjadi 4 bentuk sindrom klinis, yaitu talasemia minor (heterozigot) dengan anemia hemolitik hipokromik mikrositik ringan, talasemia mayor (homozigot) dengan anemia berat yang mengakibatkan ketergantungan terhadap transfusi darah, dan talasemia intermedia, dengan gejala diantara minor dan mayor. Sindrom keempat, disebut sebagai silent 7
8
carrier, terdapat pada individu dengan perubahan genetik pada satu atau dua gen tanpa abnormalitas hematologis (Rodak et al., 2012). Transfusi darah adalah pilihan terapi utama pada pasien TBM yang dimulai pada tahun pertama kehidupan untuk mempertahankan kadar hemoglobin diatas 9 g/dL. Transfusi berulang adalah pemberian whole blood (WB)/packed red cell (PRC) yang diberikan berulang kali dalam jangka waktu yang lama (bulan/tahun). Tujuan pemberian transfusi tersebut untuk koreksi anemia dan menekan peningkatan eritropoisis, sehingga tidak terjadi ekspansi pada sumsum tulang, dan deformitas pada tulang dapat dicegah. Anak yang mendapat terapi ini mengalami perbaikan pada tumbuh kembangnya. Pemberian transfusi berulang menyebabkan pasien TBM mempunyai harapan hidup lebih lama. Prognosis kelompok anak yang tidak mendapat transfusi yang adekuat sangat buruk. Tanpa transfusi anak akan meninggal pada usia kurang dari 2 tahun. Bila berhasil mencapai pubertas anak akan mengalami komplikasi akibat penimbunan zat besi sama halnya dengan anak yang cukup mendapat transfusi tetapi kurang mendapatkan terapi pengikat besi. Pemberian transfusi darah yang teratur dapat mengurangi komplikasi yang terjadi akibat anemia kronik, proses eritropoiesis yang tidak efektif, dapat membantu mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan anak, dan memperpanjang kelangsungan hidup anak. Namun transfusi berulang sering menimbulkan komplikasi terutama adalah adanya timbunan besi pada beberapa organ karena kemampuan tubuh untuk mengekskresikan besi terbatas/iron overload. Hal ini disebabkan oleh karena tidak ada jalur fisiologis efektif untuk ekskresi besi dari dalam tubuh, maka besi yang terkandung dalam eritrosit yang ditransfusikan akan terakumulasi di dalam tubuh seperti hati, jantung, ginjal dan kelenjar endokrin yang menyebabkan kerusakan organ tersebut. Setiap 500 mL darah yang ditransfusikan akan menyebabkan sekitar 200 mg besi tersimpan dalam jaringan dan akan terus terakumulasi (Matayatsuk et al., 2007; Rodak et al., 2012).
9
Komplikasi
transfusi
lain
yang
terjadi
adalah
gangguan
pertumbuhan, gangguan endokrin dan infeksi virus Hepatitis B, C, dan infeksi human immunodeficiency syndrome (HIV). Iron overload akumulasi dapat terjadi sekunder karena terapi anemia kronik, dan yang disebabkan oleh transfusi disebut dengan transfusion-related hemosiderosis. Pada talasemia juga terjadi pelepasan besi dari hemolisis intravaskuler yang menambah iron overload (Rodak et al., 2012; Rubin dan Strayer, 2012). Iron overload berkorelasi dengan banyaknya transfusi PRC pada pasien talasemia beta, bahkan pada pasien dengan terapi khelasi besi (Chiou et al., 2006). Komplikasi paling serius dari iron overload adalah kardiotoksisitas, dan gangguan jantung karena iron overload adalah penyebab kematian utama pada pasien TBM (Hosen et al., 2015). Zat besi dikeluarkan dari tubuh dalam jumlah yang relatif sangat rendah, melalui urin (0,1 mg/hari); feses 0,3‒0,5 mg/kg BB; keringat 0,5‒1,0 mg/hari dan deskuamasi kulit (Rodak et al., 2012). Besi sangat penting untuk kehidupan, sebagai komponen penting dari enzim seperti sitokrom oksidase, dan kompleks seperti hemoglobin, myoglobin dan feritin. Namun, jika besi dilepaskan dari kompleks-kompleks ini sebagai bentuk bebas (Fe2+/Fe3+), dapat bereaksi dengan ROS dan membentuk oxyradical melalui reaksi Fenton (Comporti et al., 2008). Iron overload yang terjadi sekunder karena terapi anemia kronik, yang disebabkan oleh transfusi disebut dengan transfusion-related hemosiderosis (Rodak et al., 2012; Rubin dan Strayer, 2012). Besi serum umumnya terikat dengan transferin (Fe3+) yang akan membawa besi ke dalam sel. Feritin adalah protein penyimpan besi dan terdapat di sitoplasma dari semua sel, dan dalam jumlah sedikit juga terdapat di sirkulasi. Saat feritin tersaturasi, terbentuk produk degradasi feritin yang disebut hemosiderin. Tempat penyimpanan besi utama tubuh adalah di hepar dan sumsum tulang. Dari sumber pemasukan besi manapun, reaksi awal tubuh adalah dengan menyimpan kelebihan besi dalam bentuk feritin, dan akhirnya, hemosiderin di dalam sel. Pengatur besi plasma paling penting
10
adalah hepsidin, sebuah hormon yang diproduksi di hepar dan mengatur kadar
besi
dengan
mengikat
feroportin,
yaitu
protein
transport
transmembran pada enterosit duodenum, sel hepar dan makrofag. Feroportin memindahkan besi dari dalam sel ke cairan ekstraseluler, dan saat berikatan dengan hepsidin, feroportin dan besi akan tetap berada di dalam sel. Kadar hepsidin dapat ditingkatkan oleh besi dan keadaan inflamatorik, serta menurun pada defisiensi besi dan hipoksia (Goswami et al., 2005; Chiou et al., 2006; Rodak et al., 2012; Rubin dan Strayer, 2012). Saat kemampuan sel untuk menyimpan besi dalam bentuk hemosiderin sudah tidak mencukupi, dapat terjadi akumulasi besi dalam bentuk bebas (ferrous iron/Fe2+) intraseluler. Dengan adanya oksigen, Fe2+ ini akan menginisiasi pembentukan superoksida dan radikal bebas lainnya, yang menyebabkan peroksidasi membran lipid yang akan merusak tidak hanya membran sel, tetapi juga membran mitokondria, nukleus dan lisosom. Respirasi sel menjadi terganggu dan enzim lisosom menjadi terlepas secara intraseluler, dan berakhir dengan kematian sel karena kerusakan membran ireversibel (Chiou et al., Rodak et al., 2012). Adapun intervensi medis yang diberikan terkait dengan dampak transfusi berulang pada pasien TBM adalah berupa tindakan pengontrolan besi pada pasien talasemia yang rutin mendapatkan transfusi darah yaitu pemberian terapi pengikat besi/khelasi besi. Penggunaan agen khelasi besi bersama antioksidan dapat membantu regulasi status antioksidan pada pasien tersebut (Rahman et al., 2012). Pemberian khelasi besi terbukti dapat memperbaiki survival pasien TBM. Sebuah penelitian di Italia tentang survival pasien talasemia setelah mendapatkan terapi transfusi dan khelasi besi, didapatkan 68% pasien hidup hingga umur 35 tahun, 67% kematian disebabkan oleh penyakit jantung. Infeksi adalah penyebab kematian kedua terbanyak (15%), diikuti oleh penyakit hepar (4%) dan gangguan tromboembolik (4%) (Greer et al., 2014). Terapi khelasi besi ini, misalnya dengan deferoxamine dan deferasirox, dapat mengikat besi yang berlebihan sehingga dapat
11
diekskresikan lewat urin, mencegah akumulasi besi serta komplikasi dari iron overload, sehingga membantu memperpanjang harapan hidup pasien TBM hingga usia tiga puluhan (Rodak et al., 2012). Terapi khelasi besi biasanya dimulai pada saat kadar feritin serum mencapai 1000 mg/dL. Praktisnya, level feritin ini dicapai setelah transfusi ke 10‒15 kali (Piga et al., 2015). Pemberian khelasi besi perlu monitoring fungsi ginjal yang ketat karena efek nefrotoksiknya. Penelitian tentang adanya disfungsi tubulus ginjal dan penurunan LFG pada pasien TBM yang diterapi khelasi besi telah banyak dilaporkan. Dari 330 pasien yang mendapatkan terapi deferoxamine, 224 (68%) dilaporkan mengalami komplikasi berupa gangguan fungsi ginjal berupa proteinuria dan penurunan LFG (Bakr et al., 2014). 2. Stres Oksidatif Stres oksidatif terjadi saat pembentukan radikal bebas, seperti ROS dan intermediat aktifnya melebihi kemampuan tubuh untuk menetralisir dan mengeliminasi radikal bebas tersebut. Radikal bebas terbentuk secara fisiologis dalam jumlah tertentu dari metabolisme aerobik, dan untuk menanganinya, tubuh memiliki sistem antioksidan yang terdiri dari superokside dismutase (SOD), katalase, glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase, dan lain-lain. Namun, sistem antioksidan ini pada kondisi patologis dapat tidak mencukupi, sehingga sebagian dari ROS dapat menghindari destruksi dan membentuk radikal hidroksil yang lebih reaktif (Rahman et al., 2012). Peningkatan ROS dapat menyebabkan kerusakan oksidatif pada biomolekul seperti lipid dan protein, dan mengganggu fungsi normal sel (Montuschi et al., 2004; Rahman et al., 2012). Hydroxyl radical (OH⁻) dibentuk dengan proses (1) radiolisis air, (2) reaksi hydrogene peroxida (H2O2) dengan ferrous iron (Fe2+) yang merupakan reaksi Fenton, (3) reaksi antara anion superoxyde (O2-) dengan H2O2, yang merupakan reaksi Haber-Weiss. Hydroxyl radical adalah molekul ROS paling reaktif dan dapat menyebabkan peroksidasi lipid (Rubin dan Strayer, 2012). Peningkatan ROS dapat menyebabkan kerusakan oksidatif pada biomolekul
12
seperti lipid dan protein, dan mengganggu fungsi normal sel (Montuschi et al., 2004; Rahman et al., 2012).
Gambar 1. Pembentukan hidroksi radikal pada reaksi Haber-Weiss dan reaksi Fenton (Srichairatanakool dan Fucharoen, 2014).
Kerusakan oksidatif, terutama karena iron overload dan deplesi antioksidan, berperan penting pada patogenesis TBM, adanya rantai alfa yang berlebihan adalah sebab utama kerusakan oksidatif seluler pada TBM. Iron overload juga meningkatkan pembentukan ROS dan stres oksidatif, karena besi yang berlebih mengkatalisasi produksi ROS seperti O2- dan OH⁻ melalui reaksi Haber-Weiss dan reaksi Fenton. Stres oksidatif ini akan memicu peroksidasi lipid pada eritrosit dan akhirnya menyebabkan hemolisis (Simsek et al., 2005, Matayatsuk et al., 2007; Srichairatanakool dan Fucharoen, 2014.). Lipid dapat bereaksi dengan radikal bebas, sehingga lipid tersebut mengalami peroksidasi dan membentuk peroksida-peroksida lipid (Rahman et
al.,
2012).
Peroksidasi
yang
dimediasi
radikal
bebas
pada
polyunsaturated fatty acid (PUFA) terjadi dengan lima reaksi: (1) transfer atom hidrogen dari PUFA ke rantai radikal, (2) reaksi lipid radikal dengan molekul oksigen sehingga membentuk lipid peroxyl radical, (3) fragmentasi lipid peroxyl radical sehingga membentuk oksigen dan radikal lipid (kebalikan reaksi sebelumnya), (4) rearrangement dari peroxyl radical, dan (5) cyclization dari peroxyl radical. Reaksi (5) hanya penting pada PUFA yang memiliki lebih dari tiga ikatan ganda, dan tidak terjadi pada oksidasi linoleat (Niki et al., 2005). Peroksidasi lipid membran sel telah dianggap sebagai mekanisme umum dari banyak kondisi patologis. Peroksidasi lipid membran dapat merusak karena menyebabkan perubahan sifat biofisika membran, seperti fluiditas, dan dapat menyebabkan inaktivasi reseptor dan enzim pada membran, sehingga mengganggu fungsi dan integritas sel
13
normal. Pengukuran produk peroksidasi lipid adalah cara yang umum untuk menilai stres oksidatif (Montuschi et al., 2004; Chiou et al., 2006; Comporti et al., 2008). Biomarker untuk menilai stres oksidatif di dalam tubuh dapat dilihat pada tabel 2. Tabel 2. Biomarker untuk kerusakan oksidatif (Niki dan Yoshida, 2005) Biomarker
Sediaan
Metode pemeriksaan
Setiap biomarker memiliki keterbatasan, sehingga terkadang diperlukan lebih dari satu biomarker untuk memastikan kadar stres oksidatif (Niki dan Yoshida, 2005). 3. F2-isoprostan F2-isoprostan terbentuk dari mekanisme katalisis radikal bebas noncyclooxigenase yang melibatkan peroksidasi PUFA dan asam arakidonat (AA) (Milatovic dan Aschener, 2009). F2-isoprostan digunakan sebagai biomarker peroksidasi lipid pada manusia (Cracowski dan Baguet, 2003). F2-isoprostan adalah prostaglandin like compound yang diproduksi dari esterifikasi asam AA di jaringan oleh reaksi katalis non enzimatik radikal bebas in vivo. Pertama kali, isoprostan ditemukan pada tahun 1967 oleh Nugteren, Vonkeman dan Vandrop, 20 tahun kemudian direalisasikan untuk kepentingan biologis (Milne et al., 2005). Pengukuran F2-IsoPs mempunyai beberapa keunggulan dibandingkan marker stres oksidatif lainnya, yaitu (1) stabil secara kimia, (2) merupakan produk spesifik peroksidasi, (3) dibentuk in vivo, (4) dapat diukur pada semua jaringan dan cairan biologis normal, sehingga dapat ditetapkan nilai normalnya, (5) kadarnya meningkat signifikan pada model hewan dengan kerusakan oksidatif, dan (6) tidak
14
terpengaruh kandungan lipid pada diet (Montuschi et al., 2004; Matayatsuk et al., 2007; Comporti et al., 2008). Sifat dari molekul F2-IsoPs lebih stabil, kuat, dan dapat dideteksi melalui berbagai cairan tubuh seperti urin, plasma, atau cairan serebrospinal (Milatovic dan Aschener, 2009). Akan tetapi banyak penelitian menggunakan sampel dari urin karena metode pengambilan sampel sederhana dan non invasif (Cracowski dan Baguet, 2003). Metabolit F2-IsoPs di urin merupakan indikator stres oksidatif yang banyak
digunakan
karena
merupakan
parameter
non-invasif
yang
merefleksikan produksi F2-IsoPs dalam satu kurun waktu, dan merupakan penilaian yang tepat untuk menentukan produksi F2-IsoPs endogen total (Montuschi et al., 2004). Pada kelompok kontrol manusia sehat didapatkan mean kadar 8-IsoPs plasma adalah 33 ± 3,3 pg/mL, sedangkan kadar 8IsoPs urin 1,6 ± 0,6 ng/mg kreatinin (Basu et al., 2001; Milne et al, 2005). Sumber lain mengatakan bahwa kadar 8-IsoPs pada orang normal pada rentang 504 ± 404 pg/mg kreatinin (Vigor et al, 2014). F2-Isoprostan dapat diperiksa menggunakan beberapa metode. Saat ini telah dikembangkan beberapa jenis metode untuk mengukur kadar F2IsoPs seperti metode gas chromatographic/negative
ion
chemical
ionization mass spectrometric (GC/NICI-MS), yang memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi (90% dan 50%) dan dipertimbangkan sebagai “gold standard” untuk pemeriksaan F2-IsoPs (Montine et al., 2001). Pengukuran F2-IsoPs menggunakan metode spektrofotometri massa telah digunakan secara luas sebagai biomarker peroksidasi lipid yang terbaik, namun membutuhkan waktu yang lama, tidak tersedia pada semua instalasi laboratorium, dan membutuhkan preparasi sampel dengan liquid nitrogen. Metode lain adalah liquid chromatographic, tetapi sensitivitas dan reliabilitasnya masih dibawah metode GC/NICI-MS. Metode alternatif yang saat ini dikembangkan menggunakan pendekatan immunologis [seperti radio immunoassay dan enzym immunoassay (EIA)]. Hasil pengukuran secara immunoassay pada plasma memiliki korelasi keakuratan yang sangat baik dengan spektrofotometri massa. Sehingga walaupun “gold standard”-
15
nya metode spektrofotometri massa, namun immunoassay lebih banyak digunakan dalam berbagai penelitian karena keakuratan hasil korelasinya yang sangat baik, sensitivitasnya 80%, relatif mudah digunakan dan biayanya yang lebih rendah. Menurut Carraro et al. (2010), sensitivitas pemeriksaan F2-IsoPs menggunakan EIA didapatkan sebanding dengan GCMS dan didapatkan korelasi yang tinggi (r = 0,99) antara pemeriksaan F2IsoPs dengan EIA dan GC-MS. Immunoassay untuk pengukuran IsoPs telah dikembangkan dan tersedia secara komersial dengan nama 8‒IsoPGF2α (Milne et al., 2005; Dalle-Donne et al., 2006). Gambar 2 menunjukkan perbandingan kesesuaian hasil pemeriksaan F2-IsoPs urin antara metode GCMS dengan ELISA (Tsikas et al., 2003).
Gambar 2. Korelasi keakuratan hasil pemeriksaan F2-IsoPs urin metode GCMS dan ELISA (Tsikas et al., 2003).
Pengukuran secara immunoassay lebih mudah, tetapi dapat memberikan hasil yang lebih tinggi dibandingkan dengan GC-MS, yang mungkin karena reaksi silang dari antibodi poliklonal dengan metabolitmetabolit isoprostan lain (Smith et al., 2011). Reaksi silang antibodi anti F2IsoPs didapatkan < 1% untuk semua isoprostan yang diuji, sehingga pemeriksaan F2-IsoPs secara EIA menunjukkan reaksi silang yang rendah dengan isoprostan lain dan prostaglandin (Schwedhelm dan Boger, 2003). Pengukuran
F2-IsoPs
adalah
cara
paling
reliabel
untuk
menggambarkan status stres oksidatif in vivo, dan sangat berguna dalam mempelajari peran stres oksidatif pada patogenesis penyakit-penyakit manusia. Dalam tubuh manusia, F2-IsoPs mempunyai half life ± 16 menit,
16
karena dikeluarkan secara cepat dari sirkulasi melalui ekskresi dalam urin (Matayatsuk et al., 2007; Kaviarasan et al., 2009). Efek biologis dari F2-IsoPs didapatkan pada 15-F2t-IsoPs, yang dapat menyebabkan vasokonstriksi pada ginjal, arteri pulmonal dan koroner, pembuluh retina dan vena porta, serta diduga bekerja melalui aktivasi reseptor yang analog atau identik dengan reseptor thromboxane A2. 15-F2tIsoPs juga didapatkan merangsang sintesis DNA dan proliferasi sel pada endotel dan sel otot vaskuler (Montuschi et al., 2004; Comporti et al., 2008). Penelitian pada dekade terakhir ini menyatakan bahwa senyawa F2IsoPs akurat dalam mengukur peroksidasi lipid dan memiliki peran dalam mengukur kerusakan akibat oksidan pada penyakit seperti aterosklerosis, penyakit alzeimer dan paru–paru (Pilacik et al., 2002). Peningkatan kadar F2-IsoPs dalam plasma dan urin telah dilaporkan pada alcoholic liver disease, diabetes mellitus (DM), arthritis rheumatoid, aterosklerosis, obesitas, asma, alergi, alzheimer, perokok, dan berbagai kerusakan hepar yang diinduksi karbon tetraklorida (CCl4) dan asetaminofen. Kadar F2-IsoPs yang tinggi juga didapatkan pada kondisi iron overload (Comporti et al., 2008; Matayatsuk et al., 2007). Namun kadarnya menurun pada pasien yang diberi suplemen antioksidan, pengobatan DM, penurunan berat badan, serta berhenti merokok, dan obat golongan inhibitor cyclooxygenase (Cadenas dan Packer, 2002). Pada pasien TBM, terdapat peningkatan TBARS yang signifikan, menunjukkan adanya peningkatan peroksidasi lipid. Meskipun pasien studi ini mendapatkan suplemen vitamin C, antioksidan tersebut gagal untuk mengkompensasi kelebihan radikal bebas. Maka komponen lipid jaringan tidak terlindungi pada iron overload yang berat (Chiou et al., 2006). Studi lain pada talasemia beta intermedia dan TBM didapatkan peningkatan produk peroksidasi lipid yaitu MDA. Temuan ini mendukung pendapat bahwa iron overload pada TBM mengakibatkan peningkatan pembentukan ROS dan stres oksidatif (Simsek et al., 2005). Pada kelompok pasien TBM didapatkan mean F2-IsoPs plasma meningkat signifikan dibandingkan pada
17
individu sehat (0,39 ± 0,15 pg/mL vs 0,18 ± 0,03 ng/mL). Sedangkan rerata kadar F2-IsoPs urin 3,38 ± 2215 ng/mg kreatinin urin vs 0,86 ± 0,55 ng/mg kreatinin urin (Matayatsuk et al., 2007). F2-isoprostan terdiri dari 64 zat yang mempunyai struktur isomer dengan prostaglandin F2α (PGF2α) (Montuschi et al., 2004; Matayatsuk et al., 2007; Comporti et al., 2008). Setelah peroksidasi AA terbentuk tiga radikal arakidonil yang akan mengalami endosiklisasi menjadi empat regioisomer PGH2-like bycyclic endoperoxidase intermediate (H2-IsoPs), kemudian masing-masing tereduksi menjadi regiosiomer cincin F, yang masing-masing terdiri dari 8 diastereoisomer racemic. H2-Isoprostan juga dapat tereduksi menjadi E2 dan D2-IsoPs. Kelanjutan metabolisme dari IsoPs kebanyakan tidak diketahui, kecuali 15-F2t-IsoPs dan 8 F2-IsoPs/8epiPGF2α,, yang metabolit urin utamanya adalah 2,3-Dinor-5,6-dihydro-15F2t-isoprostan (Montuschi et al., 2004; Comporti et al., 2008).
Gambar 3. Pembentukan radikal bebas yang diinduksi oleh oksidasi AA (Yan et al., 2007).
Pada penelitian ini yang akan diperiksa adalah isomer 8 F2-IsoPs atau 8-epiPGF2α,, salah satu isomer dari F2-IsoPs yang diproduksi pada manusia dan diekskresi melalui urin. Isomer ini telah banyak diperiksa dan diteliti, dan di duga dapat mewakili isomer isoprostan lainnya (Larosea et al, 2014).
18
4. Mekanisme Gangguan Fungsi Ginjal Pada TBM Gangguan fungsi ginjal pada TBM disebabkan oleh multifaktorial, tetapi iron overload dan anemia kronik serta efek terapi khelasi besi merupakan faktor penyebab utama. Penelitian eksperimental pada tikus yang diberikan besi dalam jumlah tinggi (iron-loaded rats) memperlihatkan proteinuria dengan deposit besi secara jelas tampak pada glomerulus, tubulus proksimal dan interstisial dengan adanya gejala glomerulosklerosis, atrofi tubulus, dan fibrosis intertisial (Bakr et al., 2014). Ginjal merupakan organ tubuh dengan perfusi paling baik, namun tekanan oksigen jaringan pada parenkim ginjal jauh lebih rendah dibandingkan organ lain dan tekanan terendah ada pada vena ginjal. Medula ginjal merupakan salah satu bagian tubuh dengan tekanan oksigen terendah. Perbedaan ini dijelaskan oleh adanya asupan oksigen yang tinggi dan tekanan oksigen jaringan yang rendah serta arsitektur unik vaskuler ginjal. Pada korteks dan medula ginjal, cabang-cabang arteri dan vena ginjal berjalan secara pararel dan kontak erat antara satu dengan yang lain dalam jarak yang panjang. Hal ini memberikan kesempatan difusi oksigen dari sistem arteri menuju sistem vena sebelum masuk menuju kapiler. Mekanisme ini menjelaskan rendahnya tekanan oksigen di medula dan korteks ginjal (Eckardt et al., 2005). Kerusakan tubulointerstisial akibat hipoksia melalui mekanisme yang multifaktorial. Hipoksia dapat mengaktifasi fibroblas, perubahan metabolisme matriks ekstrasel pada sel-sel ginjal dan fibrogenesis. Aktifasi interstisial fibrosis akibat hipoksia dan peningkatan deposit matriks ekstrasel akan mengakibatkan gangguan aliran darah dan asupan oksigen. Sel tubulus ginjal yang mengalami hipoksia lebih mudah mengalami gangguan fungsi mitokondria dan defisit energi yang menetap. Hipoksia juga menginduksi apoptosis tubulus ginjal dan sel endotel melalui mekanisme mitokondria. Analisis histologis pada model tikus membuktikan apotosis sel tubulus ginjal akibat keadaan hipoksia. Penelitian ini
19
membuktikan peranan iskemia kronik akibat kapiler derangement sebagai mediator PGK (Nangaku, 2006). Hipoksia pada ginjal juga dapat menyebabkan peningkatan aktivasi protein kinase C (PKC) pada sel mesangial ginjal yang merupakan molekul penting untuk pertumbuhan dan diferensiasi sel. Hipoksia ginjal juga akan meningkatkan kadar kalsium (Ca) intraseluler sel mesangial. Sementara stres oksidatif pada ginjal dapat menyebabkan penurunan kadar nitrit oxide (NO), dan peningkatan endotelin (ET) yang menyebabkan vasokontriksi arteri ginjal, peningkatan transforming growth factor β1 (TGF β1) yang dapat memacu sintesis matriks ekstraseluler dan menekan degradasinya sehingga dapat menyebabkan fibrosis glomerulus dan apoptosis sel epitel tubulus ginjal (Tanaka et al., 2004). Kelebihan zat besi pada ginjal dapat dikurangi dengan terapi khelasi besi yang diberikan secara oral maupun lewat infus. Obat khelasi besi selain bermanfaat namun juga berbahaya karena mengandung bahan kimia. Sebagian besar zat besi diekskresikan melalui feses dan < 10 % lewat urin, dengan cara mengeliminasi atau mengurangi ikatan serum non transferin besi. Obat khelasi besi ini diabsorbsi dan bersirkulasi selama beberapa jam. Dalam jangka waktu yang lama maka beban ekskresi ginjal akan bertambah dan mengakibatkan kerusakan ginjal. Ginjal juga berfungsi sebagai pengatur produksi sel darah merah, dengan mensekresikan eritropoitin yang merangsang pembentukan sel darah merah. Hampir 90% dari seluruh eritropoetin dibentuk dalam ginjal. Pembentukan sel darah merah pada TBM lebih cepat sehingga ginjal akan lebih sering mensekresikan eritropoitin untuk pembentukan sel darah merah baru, yang dapat mengakibatkan kerusakan fungsi ginjal (Qodariah, 2006; Fathoni, 2008). Penelitian di Italia yang dilakukan lebih dari 10 tahun lalu dengan melibatkan jumlah sampel penderita talasemia sebanyak 7731 (thalassaemia carriers) dan di Canada yang melibatkan jumlah sampel 216 terdiri dari 188 pasien talasemia beta minor dan 27 pasien talasemia beta Hb H/E, menunjukkan 0,5% dari pasien mengalami disfungsi tubulus ginjal dan
20
3,1% (n=240) dari pasien menjalani terapi dialisis. Studi cross sectional terbaru menunjukkan bahwa pada semua grup talasemia termasuk TBM terjadi gangguan fungsi ginjal 7,8% dan albuminuria hingga 59% dari kasus (Bhandari dan Galanello, 2012). Secara ringkas, mekanisme gangguan fungsi ginjal pada pasien TBM dapat dilihat pada gambar 4.
Gambar 4. Mekanisme gangguan fungsi tubulus dan glomerulus ginjal pada pasien TBM (Bhandari dan Galanello, 2012).
Hasil penelitian Michaelakakis et al. (1997) menunjukkan adanya korelasi antara kadar feritin serum dan penanda kerusakan tubulus ginjal pada penderita TBM. Hal tersebut juga membuktikan adanya kaitan antara kelebihan besi dan toksisitas pada tubulus ginjal. Besi yang berlebihan akan berdisosiasi (dari transferin) dalam suasana asam di tubulus proksimal, memproduksi ROS dengan akibat terjadinya kerusakan pada brush border membran tubulus ginjal. Apabila besi memasuki sel tubulus ginjal masih berikatan dengan transferin, pelepasan besi terjadi dalam lisosom dan memasuki sitoplasma dalam bentuk besi bebas yang reaktif, dapat memproduksi ROS dan jejas sel (Nangaku, 2006). Anemia kronik berkaitan dengan stres oksidatif yang mengakibatkan peroksidasi lipid dan abnormalitas fungsi sel tubulus. Penelitian yang dilakukan oleh Sumboonnanonda et al. (1998) menunjukkan adanya korelasi antara abnormalitas tubulus dengan derajat anemia pada pasien TBM yang diterapi deferasirox dan deferipron. Mekanisme penyebab
21
terjadinya gangguan fungsi ginjal yang berkaitan dengan pemberian deferasirox masih belum diketahui dengan pasti. Beberapa hipotesis mengemukakan hal tersebut berkaitan dengan reaksi alergi berlebihan (hyperergic reaction) dan adanya overkhelasi akibat deferasirox yang menurunkan besi dalam tubuh secara mendadak sehingga mempengaruhi LFG (Maxwell, 2003). Hipoksia
pada
sel
ginjal
mengakibatkan
penekanan
pada
penyimpanan energi, perubahan gradien elektrolit, disrupsi dari actin cytoskeleton, aktivasi fosfolipase dan perubahan ekspresi gen. Hipoksia ginjal menginduksi hilangnya polaritas epitel tubulus proksimal dan induksi selektif fragmentasi dioxyribonucleic acid (DNA) pada gen growthresponse yang memicu apoptosis medula ginjal. Jejas iskemi pada vaskular ginjal mengakibatkan peningkatan aktifitas renovaskular dan menginduksi antigen histokompatibilitas pada sel tubulus ginjal dan intercellular adhesion molecules (ICAM) pada sel endotel menyebabkan agregasi trombosit dan netrofil (Kelly et al., 1994). Kerusakan ginjal yang sudah mencapai batas adaptasinya akan berlanjut secara konsisten dan tidak dapat diperbaiki kembali hingga berlanjut ke arah PGK dengan tahapan sebagai berikut: Tabel 3. Klasifikasi PGK berdasarkan kategori LFG (KDIGO, 2013) Kategori LFG G1 G2 G3a G3b IV V
Keterangan
LFG(mL/menit/1,73 m²)
Kerusakan ginjal dengan fungsi ginjal normal atau meningkat Kerusakan ginjal dengan penurunan fungsi ginjal ringan Penurunan fungsi ginjal ringan-sedang Penurunan fungsi ginjal sedang-berat Penurunan fungsi ginjal berat Gagal ginjal
≥ 90 60-89 45-59 30-44 15-29 <15
Teori hiperfiltrasi oleh Brenner menyatakan bahwa progresifitas penyakit ginjal berawal dari perubahan hemodinamik glomerulus. Kerusakan tubulointerstisial mengakibatkan penurunan LFG melalui
22
berbagai cara sehingga terjadi gangguan aliran darah dan mengakibatkan jejas iskemi pada nefron (Nangaku, 2006). Penelitian tentang gangguan fungsi ginjal pada TBM khususnya yang membahas eLFG telah banyak dilakukan meskipun hasilnya masih kontradiktif. Sebagian besar hasil penelitian terdahulu menyebutkan adanya hiperfiltrasi glomerulus (HG), namun sebagian menunjukkan adanya penurunan eLFG atau normal. Hiperfiltrasi glomerulus diduga sangat berperan penting sebagai penanda awal kerusakan ginjal. Hingga saat ini penyebab HG masih belum diketahui secara jelas mekanismenya, namun adanya tubuloglomerular feedback dan aktivasi mediator vasoaktif seperti nitric oxide (NO), Cox-2 derived prostanoid, sistem renin angiotensin, protein kinase-C (PKC) dan endothelin (ET) terkait dengan HG melalui mekanisme
peningkatan
tekanan
glomerulus,
akan
menyebabkan
peningkatan LFG yang dikenal dengan HG (Sasson dan Cherney, 2012). Patofisiologi penyakit ginjal kronik pada awalnya tergantung pada penyakit yang mendasarinya, tapi dalam perkembangan selanjutnya proses yang terjadi kurang lebih sama. Pengurangan massa ginjal mengakibatkan hipertrofi struktural dan fungsional nefron yang masih tersisa (surviving nephron) sebagai upaya kompensasi, yang diperantarai oleh molekul vasoaktif seperti sitokin dan growth faktor. Hal ini mengakibatkan terjadinya hiperfiltrasi, yang diikuti oleh peningkatan tekanan kapiler dan aliran darah glomerulus. Proses adaptasi ini berlangsung singkat, akhirnya diikuti dengan penurunan fungsi nefron yang progresif, walaupun penyakit dasarnya sudah tidak aktif lagi. Adanya peningkatan aktivitas aksis reninangiotensin aldosteron intrarenal, ikut memberikan kontribusi terhadap terjadinya hiperfiltrasi, sklerosis dan progresifitas tersebut. Aktivasi jangka panjang aksis renin-angiotensin-aldosteron, sebagian diperantarai oleh growth factor seperti transforming growth factor β (TGF-β). Terdapat variabilitas antar individual untuk terjadinya sklerosis dan fibrosis glomerulus maupun tubulointerstitial (Suwitra, 2010).
23
Hiperfiltrasi glomerulus telah dilaporkan dapat terjadi pada pasien DM, sickle cell disease, talasemia, hipertensi, hiperaldosteronisme, kehamilan, dan obesitas/sindrom metabolik. Meski HG berperan penting pada tahap awal PGK, ini hanya merupakan satu dari beberapa mekanisme yang menyebabkan insufisiensi ginjal (Raes et al., 2007). Teori yang paling dapat diterima adalah bahwa hiperfiltrasi pada nefron ginjal yang tersisa setelah terjadi kehilangan nefron akibat lesi. Peningkatan tekanan glomerular menyebabkan hiperfiltrasi ini. Hiperfiltrasi terjadi sebagai konsekuensi adaptif untuk mempertahankan LFG, namun kemudian akan menyebabkan cedera pada glomerulus. Permeabilitas glomerulus yang abnormal umum terjadi pada gangguan glomerular, dengan proteinuria sebagai tanda klinis (Conchol, 2005). Brenner et al. (1996) mengatakan bahwa insufisiensi ginjal pada manusia dapat berkembang ke arah PGK, sebagai kompensasi gangguan hemodinamik glomerulus. Adapun faktor yang berperan utama adalah gangguan hemodinamik pada glomerulus yang berakibat HG. Hiperfiltrasi glomerulus merupakan
gangguan hemodinamik yang dapat di monitor
sebagai penanda awal gangguan fungsi ginjal lebih lanjut. Prognosis dari hiperfiltrasi terkait dengan penyakit yang mendasarinya serta tata laksana serta kepatuhan pasien dalam menjalani terapi. Dalam kurun waktu 3 dekade,
hiperfiltrasi
dapat
berkembang
ke
arah
proteinuria
dan
glomerulosklerosis. Hiperfiltrasi yang berlangsung lama akan menyebabkan renal injury. Hiperfiltrasi dapat terjadi pada kondisi patologi meskipun saat massa renal intact seperti pada DM yang dapat mengakibatkan nefropati. Hipotesis Brenner tersebut dibuktikan oleh Ficociello et al. (2009) yang melakukan penelitian longitudinal tentang hubungan antara HG dengan kejadian mikroalbuminuria pada pasien DM dan menyimpulkan bahwa hiperfiltrasi
tidak
mempunyai
dampak
progresifitas
ke
arah
mikroalbuminuria pada pasien DM tipe I yang di follow up selama 5, 10 atau 15 tahun.
24
Hiperfiltrasi glomerulus dianggap sebagai awal dari mekanisme patogenik dalam laju kerusakan ginjal. Hal ini terjadi pada saat jumlah nefron mengalami pengurangan progresif, glomerulus akan melakukan kompensasi dengan meningkatkan filtrasi nefron yang masih sehat dan pada akhirnya nefron yang sehat menjadi sklerosis. Peningkatan LFG pada TBM kemungkinan disebabkan oleh dilatasi arteriol aferen karena stres oksidatif, yang diperantarai hormon vasoaktif, insulin growth factor-1 (IGF-1), nitric oxide (NO), dan PG. Hiperfiltrasi akan menyebabkan terjadinya filtrasi protein, yang pada keadaan normal tidak terjadi. Bila terjadi reabsorbsi tubulus terhadap protein meningkat, maka akan terjadi akumulasi protein dalam sel epitel tubulus dan menyebabkan pelepasan sitokin inflamasi seperti ET-1, osteopontin, dan monocyte chemoatractant protein-1 (MCP-1). Faktor tersebut akan mengubah ekspresi sitokin pro inflamasi dan infiltrasi sel mononukleus, menyebabkan kerusakan tubulo-interstitial dan terjadi renal scaring/renal injury (Ziyadeh et al., 2012). 5. Pemeriksaan Laboratorium Fungsi Ginjal a. Kreatinin Serum Kreatinin serum hingga saat ini dikenal sebagai penanda awal gangguan fungsi ginjal. Kreatinin adalah produk katabolisme dari kreatin fosfat yang ada di dalam otot. Biosintesis kreatin sendiri juga berasal dari glisin, arginin, dan metionin Hasil katabolisme tersebut memiliki nilai yang konstan dalam tiap individu setiap harinya. Kreatinin sangat bergantung dari masa otot. Proses reaksi dehidratasi dalam otot, kreatin akan diubah menjadi kreatinin yang dapat diperfusi ke seluruh cairan tubuh dan diekskresikan melalui urin (Satriana, 2008). Kreatinin merupakan salah satu substansi yang dikeluarkan lewat urin. Kandungan kreatinin dalam darah dan urin pada dasarnya ditentukan oleh massa otot dan kemampuan ekskresi ginjal. Konsentrasi kreatinin merupakan indikasi penting untuk memantau fungsi ginjal (Scott, 2002).
25
Metode pemeriksaan kreatinin yang sering digunakan adalah metode Jaffe, namun metode ini memiliki banyak kelemahan terkait dengan
efek
kromogenik
sehingga
dikembangkan
pemeriksaan
enzimatik. Mazzachi et al. (2000) melaporkan bahwa teknik secara enzimatik memberikan hasil yang lebih akurat dan lebih spesifik dibandingkan metode Jaffe sehinggga teknik enzimatik sering digunakan untuk praktek klinis dalam rangka menghasilkan estimasi yang layak. Penggunaan
serangkaian
enzim
meningkatkan
selektifitas
untuk
mendeteksi kreatinin, walaupun membutuhkan biaya yang mahal. Metode enzimatik yang telah dimodifikasi adalah metode yang presisi dan akurat, menggunakan sedikit sampel, dan mampu memeriksa sampel pasien dengan cepat (± 20 menit). Mereka menyimpulkan bahwa metode enzimatik cocok sebagai diagnostik laboratorium rutin untuk memeriksa kreatinin plasma, partikel keton pasien diabetes, neonatus, dan pasien yang mendapat terapi sefalosporin (Cirillo, 2010). Tabel berikut adalah kadar normal kreatinin serum menurut usia (Pagana dan Pagana, 2014). Tabel 4. Nilai rujukan kreatinin serum (Pagana dan Pagana, 2014). Usia (tahun) Kadar kreatinin (mg/dl) <2 0,1− 0,4 2−<6 0,2 – 0,5 6 − < 10 0,3 – 0,6 10 − < 18 0,4 – 1,0 18 − < 41 (laki−laki) 0,5 – 1,0 18 − < 41 (perempuan) 0,6 − 1,2
Kadar
kreatinin dalam serum telah digunakan untuk menilai
fungsi ginjal selama kurang-lebih 75 tahun terakhir. Kadar kreatinin serum tergantung pada keseimbangan 2 proses yang berlawanan, yaitu pembentukan dan ekskresi kreatinin. Klirens kreatinin dianggap dapat mewakili LFG, namun karena pengukurannya memerlukan waktu lama dan biaya yang tinggi, pengukuran klirens kreatinin tidak memberikan solusi untuk kemudahan pengukuran fungsi ginjal. Hal tersebut yang mendasari dikembangkannya cara perhitungan untuk memprediksi
26
klirens kreatinin dengan variabel yang mudah didapatkan, yaitu kreatinin serum, jenis kelamin, umur dan berat badan (Cirillo, 2010). b. Laju Filtrasi Glomerulus Laju filtrasi glomerulus merupakan laju filtrasi dari semua nefron yang berfungsi. Glomerulus ginjal sebagai unit filtrasi ginjal menyaring kira kira 180 L/hari (125 mL/menit) dari plasma. Laju filtrasi glomerulus mengukur klirens urin/plasma terhadap marker filtrasi ideal, misalnya inulin, atau marker eksogen seperti iothalamate, diethylene triamine penta acetic acid & iohexol. Pengukuran LFG memerlukan proses yang invasif dan waktu yang lama, sehingga tidak dianjurkan untuk dilakukan dalam praktek klinik (Stevens et al., 2006). Cara terbaik dan teliti untuk mengukur LFG adalah dengan klirens inulin. Namun uji ini jarang dilakukan dalam klinik karena melibatkan proses intravena dengan kecepatan yang konstan, pengumpulan urin pada saat saat tertentu dengan kateter, dan invasif (Price dan Wilson, 2005). Laju filtrasi glomerulus telah diterima secara luas sebagai indeks terbaik untuk menilai fungsi ginjal. Pengukuran LFG merupakan hal yang penting dalam pengelolaan pasien dengan penyakit ginjal. Selain untuk menilai fungsi ginjal secara umum, pengukuran LFG juga untuk mengetahui dosis obat yang tepat yang dapat dibersihkan oleh ginjal, untuk mendeteksi secara dini adanya gangguan ginjal, mencegah gangguan ginjal lebih lanjut, mengelola pasien dengan transplantasi ginjal, dan dalam penggunaan kontras media radiografik yang berpotensi nefrotoksik. Karena itu diperlukan pemeriksaan LFG yang mempunyai nilai akurasi yang tinggi (Stevens dan Levey, 2009). Beberapa metode telah ditemukan untuk mengukur LFG. Bersihan inulin merupakan baku emas untuk mengukur LFG. Beberapa waktu kemudian bersihan dari beberapa bahan radioisotop seperti chromium
51-EDTA,
iothalamate,
dan
iohexol
(nonradioisotop)
mempunyai akurasi yang mendekati sama dengan bersihan inulin. Tetapi berbagai pemeriksaan ini memerlukan waktu, tenaga dan biaya yang
27
besar serta tidak praktis, dan kurang ideal untuk aplikasi rutin atau penggunaan klinik dalam jumlah yang banyak. Saat ini penanda endogen yang paling sering digunakan adalah kreatinin serum, baik secara tunggal maupun dikombinasikan dengan urin tampung 24 jam untuk menentukan bersihan kreatinin. Beberapa faktor dapat berpengaruh terhadap ketepatan penggunaan kreatinin untuk uji fungsi ginjal, seperti ketelitian dalam mengukur jumlah urine 24 jam, pengaruh massa otot terhadap produksi kreatinin endogen, asupan daging, aktivitas fisik, adanya sekresi kreatinin di tubulus ginjal, pengaruh obat-obatan, dan masalah analitik metode pemeriksaan kreatinin (Lamb et al., 2006). Klirens kreatinin sering dipergunakan untuk menentukan besarnya LFG. Pemeriksaan klirens kreatinin dilakukan dengan mengumpulkan urin selama 24 jam, namun kelemahan pemeriksaan klirens kreatinin adalah senantiasa ada bias dalam penampungan urin 24 jam (Martakusumah, 2012). Metode rujukan untuk menentukan nilai LFG pada anak adalah inulin clearance, namun marker eksogen sangatlah mahal dan tidak mudah diterapkan dalam praktek klinik sehingga Pierrat et al. (2003) mencoba membandingkan beberapa metode pengukuran eLFG pada anak menggunakan Cockcroft-Gault, Schwartz, dan Modification of Diet in Renal Disease (MDRD), yang akhirnya pada satu simpulan bahwa Cockcroft-Gault dapat digunakan pada anak usia 12 tahun dan dewasa, pada anak usia < 12 tahun, dan tidak ada formula yang memuaskan untuk menilai eLFG. Sementara Delanghe (2009) merekomendasikan formula Schwartz dan Counahan Barrat untuk menilai eLFG pada anak. Selistre et al. (2012) merekomendasikan formula Schwartz untuk menilai eLFG pada anak-anak (usia < 18 tahun) berdasarkan penelitiannya yang menunjukkan adanya kesesuaian/korelasi yang baik antara formula Schwartz dengan inulin clearance sebagai metode baku emas pengukuran eLFG (gambar 5). A dan C menunjukkan hubungan univariat menggunakan transformasi logaritma. B dan D menunjukkan BlandAltman plot menggunakan rasio eGFR/mGFR terhadap eGFR+mGFR)/2.
28
Gambar 5. Perbandingan antara formula Schwartz dan inulin clearance (Selistre et al., 2012).
Penelitian ini menggunakan formula Schwartz untuk menilai eLFG sebagai salah satu parameter penanda fungsi ginjal pada pasien TBM. Rumus perhitungan eLFG berdasarkan formula Schwartz adalah sebagai berikut (Filler et al., 2002):
eLFG = k x L/Scr
keterangan :
eLFG : estimated LFG (mL/menit/1,73 m2) L
: tinggi badan (cm)
Scr
: serum kreatinin (mg/dL)
K
: konstanta (bayi aterm: 0,45; anak dan remaja putri 0,55; remaja putra: 0,7)
Nilai rujukan laju filtrasi glomerulus untuk usia kurang dari 40 tahun jenis kelamin wanita berkisar antara 107−139 mL/menit/1,73 m², sedangkan untuk laki laki berkisar antara 87−107 mL/menit/1,73 m² (Pagana dan Pagana, 2014).
29
B. Kerangka Pikir Talasemia beta mayor (mutasi rantai globin β)
Anemia kronik
Terapi khelasi besi
Iron overload
Stres oksidatif
Nefrotoksik
Peroksidasi lipid membran sel glomerulus dan tubulus ginjal
Gangguan fungsi ginjal
Pembentukan F2‒IsoPs urin
Glomerulus ginjal
Tubulus ginjal
↑ F2‒IsoPs urin
↑ ROS, ↓ NO ↑ Ca sitosolik pada arteriol aferen
↑ endotelial injury
↑ mediator inflamasi (TNF α, IL 18) Iskemia tubulus
↑ sensitivitas terhadap vasokonstriksi
Korelasi?
↓ NO, ↓ ET
ICAM 1, P selectin endotel ↑ adhesi netrofil ↑ radikal bebas
eLFG
Apoptosis sel epitel tubulus
Gangguan fungsi tubulus
kreatinin serum Keterangan: : Mempengaruhi proses selanjutnya : variabel penelitian
: bukan variabel penelitian
Gambar 6. Bagan kerangka pikir
C. Hipotesis Penelitian Terdapat korelasi antara kadar F2-IsoPs urin dan eLFG pada pasien TBM.
BAB III METODE DAN CARA PENELITIAN A. Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian analitik observasional dengan pendekatan cross sectional untuk menilai korelasi kadar F2-IsoPs urin dengan eLFG pada pasien TBM. B. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Instalasi Patologi Klinik Rumah Sakit Umum Daerah Dr Moewardi (RSDM) di Surakarta. Waktu penelitian mulai bulan Mei-Juni 2016. C. Subjek Penelitian 1. Populasi dan Sampel Penelitian Populasi pada penelitian ini adalah pasien anak‒anak dengan diagnosis TBM yang datang ke Instalasi rawat jalan Bagian Ilmu Kesehatan Anak (IKA) dan Bangsal Talasemia yang dilakukan pemeriksaan laboratorium ke Instalasi Patologi Klinik RSDM. Pemilihan subjek penelitian dilakukan secara consecutive sampling (berurutan), subjek dipilih berdasarkan kriteria inklusi dan eksklusi. Besar sampel yang digunakan untuk penelitian ini berdasarkan rumus untuk besar sampel pada penelitian analitik korelatif (Dahlan, 2010). Perkiraan besar sampel memakai rumus besar sampel untuk penelitian analitik korelatif, yaitu (Dahlan, 2010): Keterangan : 2 Z + Z Zα : deviat baku alfa N= +3 Zβ : deviat baku beta 0,5 ln [(1+r)/(1-r)] r : korelasi (kepustakaan) Kesalahan tipe I 5 %, Zα (deviat baku alfa) 1,64 dengan tingkat keyakinan 95%, dan Zβ (deviat baku beta) 1,28. Penelitian Ilyasofa et al. (2012) yang mengkaji korelasi F2‒IsoPs urin dengan tingkat keparahan pasien diabetes mellitus (DM) tipe 2 dengan jumlah subjek penelitian 138, 30
31
didapatkan korelasi dengan nilai r (koefisien korelasi) = 0,6, sehingga didapatkan jumlah sampel minimal untuk penelitian ini 24 sampel. Untuk mengantisipasi adanya kemungkinan ekslusi maka ditambahkan 10% dari hasil perhitungan sehingga pada penelitian ini didapatkan besar sampel 30. 2. Kriteria Inklusi dan Eksklusi Subjek penelitian adalah populasi terjangkau yang memenuhi kriteria penelitian. Kriteria inklusi dan ekslusi subjek penelitian adalah sebagai berikut: Kriteria inklusi: a. Umur ≤ 18 tahun (Kishore dan Tabor, 2010). b. Diagnosis
TBM
oleh
klinisi
berdasarkan
hasil
laboratorium
(pemeriksaan Hb elektroforesis). c. Riwayat transfusi berulang 10‒15 kali (lebih dari 1 tahun), dinilai dari anamnesis dan rekam medis mengenai adanya terapi transfusi rutin. d. Riwayat terapi khelasi besi dari klinisi, data didapatkan dari anamnesis dan rekam medik. e. Pasien-pasien tanpa gejala dan tanda infeksi saluran kencing (ISK), diketahui dari anamnesis, pemeriksaan fisik, data hasil pemeriksaan laboratorium, rekam medik dan inspeksi urin secara visual dari warna dan kekeruhan urin. Kriteria eksklusi: a. Riwayat penyakit hepar dan ginjal (selain akibat dari terapi TBM), dinilai dari anamnesis, pemeriksaan fisik, data hasil pemeriksaan laboratorium dan rekam medis. b. Pasien infeksi, dinilai dari anamnesis, pemeriksaan fisik, data hasil pemeriksaan laboratorium dan rekam medis. c. Keadaan-keadaan yang meningkatkan stres oksidatif seperti DM, asma, alergi, arthritis rheumatoid, obesitas dan perokok, dinilai dari anamnesis, pemeriksaan fisik dan rekam medis.
32
d. Pasien TBM yang mendapat terapi anti inflamasi non steroid (AINS) golongan inhibitor cyclooxygenase dinilai dari anamnesis dan rekam medis. D. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan a. Kit reagen 8-IsoPs EIA, Cayman Chemical. Sudah termasuk sebuah plate 96 sumuran. b. Sampel darah untuk pemeriksaan kreatinin serum c. Sampel urin untuk pemeriksaan F2‒IsoPs d. Kit pemeriksaan dan reagen (Insert Kit ILab 650, 2010). 1) Konteiner/cup sampel 2) Larutan sistem 3) Kalibrator dan kontrol 4) Reagent container adapters Reagen yang digunakan terdiri dari reagen Creatinin E R1, yang mengandung Creatinase >12 IU/mL, TOOS > 0,07mg/mL, Sarcosine Oxidase (SOD)>4I U/mL dan reagen Creatinin E R2 yang mengandung Creatinase >135 IU/mL, 4-AA > 0,3mg/mL, Peroxidase (POD) >2 U/mL. Semua reagen sudah dalam sediaan siap pakai, namun harus di homogenisasi sebelum digunakan dan pastikan tidak ada gelembung udara. 2. Alat a. Plate reader dengan kemampuan membaca absorbance 405-420 nm b. Bio-Rad 680 Microplate Reader c. ILab 650 d. Micropipette multichannel e. Pipet adjustable f. ‘Ultra Pure’ water (air yang sudah dideionisasi dan bebas kontaminan organik) g. Pipette tip
33
h. Tabung kaca i. Orbital shaker j. Tissue k. Cuvette l. Spuit 5 cc m. Tabung sampel dengan clot activator n. Tabung urin/pot urin o. Tabung aliquot E. Cara, Prosedur dan Skema Alur Penelitian 1.
Cara penelitian Penelitian dilakukan pada subjek yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi, pada pasien TBM yang datang ke Instalasi poliklinik rawat jalan bagian IKA dan Bangsal Talasemia yang dilakukan pemeriksaan laboratorium di Instalasi Patologi Klinik RSDM di Surakarta. Subjek dipilih secara konsekutif, pendataan identitas, anamnesis dan pemberian informed consent dilakukan di tempat. Pada subjek dilakukan pengambilan darah vena secara closed system, ke dalam dua tabung dengan clot activator. Kemudian sampel tersebut disentrifugasi selama 10–15 menit dengan kecepatan 6000 rotations per minute untuk diambil serumnya. Serum tersebut kemudian dipindahkan pada tabung aliquote untuk disimpan pada suhu -20oC hingga dianalisis untuk pemeriksaan kreatinin serum. Pada subjek juga dilakukan pengambilan sampel urin sewaktu untuk pemeriksaan
kreatinin urin dan F2‒IsoPs urin sebanyak 6 ml.
Pisahkan 1 mL urin ke dalam tabung yang telah diberi identitas untuk diperiksa kreatinin urin. Sampel urin untuk pemeriksaan F2‒IsoPs urin dipindahkan padah 2 tabung khusus polypropilene 5 ml yang telah diberi 20 μl butylated hydroxytoluene (BHT) dan 20 μl indometasin masingmasing tepat 2 mL per-tabung. Kemudian sampel dibagi menjadi 4 aliquot @ 0,5 ml, segera disimpan pada suhu -80oC hingga dianalisis. Stabilitas sampel hanya bertahan hingga 3 bulan (Sampson et al., 2002; Anonim,
34
2014). Penyimpanan sampel untuk pemeriksaan F2-IsoPs urin dilakukan di laboratorium yang sudah terstandar internasional di Surakarta. Sampel yang akan dianalisis/diperiksa kadar F2-IsoPs urin dikirim ke laboratorium pusat terstandar internasional di Jakarta. Sampel dikemas dalam aliquote dimasukkan ke dalam wadah styrofoam yang telah diberi gel icepack untuk dikirim ke Jakarta. Setiba di laboratorium pusat sampel disimpan pada suhu -20 oC sampai saat akan analisis. 2.
Prosedur Penelitian a. Metode Pemeriksaan F2-IsoPs urin Pemeriksaan F2-IsoPs urin dengan metode EIA menggunakan Kit reagen 8-IsoPs EIA (Cayman Chemical). Prinsip pemeriksaan ini adalah kompetisi antara F2-IsoPs sampel dengan konjugat F2-IsoPs acetylcholinesterase (AChE) (8-IsoPs tracer) untuk menempati binding site spesifik 8-IsoPs dari antiserum kelinci. Jumlah 8-IsoPs tracer yang dapat mengikat antiserum kelinci akan berbanding terbalik dengan konsentrasi F2-IsoPs pada sampel. Kompleks antiserum
kelinci
dengan
F2-IsoPs
akan
mengikat
antibodi
monoklonal anti kelinci dari tikus yang sudah ditempatkan di permukaan sumuran. Kemudian plate dicuci untuk membuang reagen yang tidak terikat, dan reagen Ellman (yang mengandung substrat yang dapat bereaksi dengan AChE) ditambahkan. Produk reaksi enzimatik ini memberikan warna kuning dan mempunyai absorbance kuat pada panjang gelombang 412 nm. Intensitas warna yang diukur secara spektrofotometris, adalah proporsional dengan jumlah 8-IsoPs tracer yang terikat dengan sumuran, dan berbanding terbalik dengan jumlah F2-IsoPs bebas yang ada di sumuran saat inkubasi (Anonim, 2014). Gambar 7 memperlihatkan skema pemeriksaan F2-IsoPs secara immunoassay.
35
Gambar 7. Skema pemeriksaan F2-IsoPs secara EIA (Anonim, 2014).
Komponen reagent kit pemeriksaan 8-IsoPs yang tersedia terdiri dari (Anonim, 2014): 1) 8-IsoPs EIA antiserum 2) 8-IsoPs AChE tracer 3) 8-IsoPs EIA standard 4) EIA buffer concentrate (10x) 5) Wash buffer concentrate (400x) 6) Polysorbate 20 7) Mouse anti-rabbit imunoglobulin G (IgG) coated plate 8) 96-well cover sheet 9) Ellman’s reagent 10) EIA tracer dye 11) EIA antiserum dye Terdapat beberapa tahapan pemeriksaan kadar F2-IsoPs. Langkah pertama adalah mempersiapkan larutan-larutan standar F2IsoPs dan reagen untuk digunakan pada EIA. Langkah kedua adalah memasukkan reagen dan sampel, langkah ketiga adalah inkubasi plate, langkah keempat adalah plate development dengan reagen Ellman, dan langkah kelima adalah
pembacaan plate. Langkah-langkah
pemeriksaan secara detail adalah sebagai berikut (Anonim, 2014):
36
1. Mempersiapkan larutan standar F2-IsoPs dan reagen. a. Mempersiapkan larutan-larutan standar F2-IsoPs
Gambar 8. Preparasi larutan-larutan standar F2-IsoPs (Anonim, 2014).
b. Rekonstitusi 8-IsoPs AChE tracer dengan cara menambahkan 6 ml EIA buffer dengan satu vial tracer. c. Rekonstitusi 8-IsoPs EIA Antiserum dengan cara menambahkan 6 ml EIA buffer dengan satu vial antiserum.
Blk TA NSB B0 S1-S8 1-24
: Blank : Total Activity : Non Specific Binding : Maximum Binding : Standards 1-8 : Samples
Gambar 9. Format plate sampel (Anonim, 2014).
2. Memasukkan reagen dan sampel. a. Masukkan 100 L EIA buffer ke sumuran-sumuran NSB, dan 50 L EIA buffer ke sumuran-sumuran B0. b. Masukkan 50 L dari tabung standar #8 ke sumuran-sumuran S8. Lalu masukkan 50 L dari tabung standar #7 ke sumuransumuran S7. Lakukan hal serupa pada semua tabung dan sumuran standar. c. Masukkan masing-masing 50 L sampel ke sumuran masingmasing sampel.
37
d. Tambahkan 50 L 8-IsoPs AChE tracer ke semua sumuran kecuali sumuran-sumuran TA dan Blk. e. Tambahkan 50 L 8-IsoPs EIA antiserum ke semua sumuran kecuali sumuran-sumuran TA, NSB, dan Blk. 3. Inkubasi plate: tutup plate dengan 96-well cover sheet kemudian inkubasi selama 18 jam pada suhu 4oC. 4. Plate development a. Lakukan rekonstitusi Ellman’s reagent sesaat sebelum digunakan, dengan cara menambahkan 20 ml air ultra pure dengan tiga vial reagen. b. Kosongkan sumuran-sumuran dan bilas sebanyak lima kali dengan wash buffer. c. Masukkan 200 L Ellman’s reagent ke semua sumuran. d. Tambahkan 5 L EIA tracer dye ke sumuran-sumuran TA. e. Tutup plate dengan film plastik. Development optimal dicapai dengan menggunakan orbital shaker dan plate berada di daerah gelap dengan suhu ruang. Ditunggu selama 90 sampai 120 menit. 5. Pembacaan plate a. Seka bagian bawah plate dengan tissue bersih untuk menghapus sidik jari dan kotoran. b. Buka tutup plate dengan hati-hati sehingga tidak ada Ellman’s reagent yang tumpah/terambil. c. Baca plate dengan panjang gelombang antara 405 sampai 420 nm. Plate dibaca saat absorbansi sumuran-sumuran B0 berada dalam range 0,3 – 1,0 absorbance unit (AU). d. Deteksi limit : 0,027−5 ng/ml. Pemeriksaan 8-IsoPs secara EIA menunjukkan reaksi silang yang rendah dengan isomer isoprostan lain dan prostaglandin (Schwedhelm dan Boger, 2003).
38
Tabel 5. Spesifisitas 8-IsoPs EIA antiserum (Anonim, 2014). Cross Zat Zat reactivity 8-IsoPs 100% 2,3-dinor-6-keto PG F1 100% 8-iso PG F2 8-iso PG F1 ethanolamide 20,6% thromboxane B2 8-iso PG F3 4,00% 11-dehydro 2,3-dinor-8-iso PG F2 thromboxane B2 1,84% 8-iso PG E2 11- PG F2 1,70% PG E2 2,3-dinor-8-iso PG F1 8-iso PG E1 1,56% 8-iso-15(R)- PG F2 0,71% PG F1 8,12 epi iPF2-III 0,66% PG F3 iPF2 -VI PG E1 0,39% 8,12 epi iPF2 -VI 0,14% 13,14-dihydro-15-keto PG F2 PG F2
Cross reactivity 0,09% 0,08% 0,08% 0,07% 0,03% 0,02% 0,02% 0,01% <0,01% <0,01% <0,01%
b. Metode Pemeriksaan kreatinin serum dan kreatinin urin 1.
Prinsip pemeriksaan Pemeriksaan kreatinin serum dan kreatinin urin pada penelitian
ini
menggunakan
metoda
enzimatik.
Metode
pemeriksaan kadar kreatinin secara enzimatik dilakukan dengan mencampur kreatinin dalam sampel dengan enzim creatinine amidohidrolase (CRTNase) membentuk sarkosin dan urea. Sarcosine kemudian akan dikatalisis oleh sarcosine oksidase (SOD) membentuk hydrogen peroksida kemudian hydrogen peroksida oleh enzim peroksidase (POD) dioksidasi dan dengan adanya 3-hydroxy-2,4,6 terbentuk kompleks warna quinone dye. Kompleks warna ini kemudian dibaca pada panjang gelombang 505-570 nm dan 700-750 nm untuk mendapatkan kadar kreatinin. Pada alat ini dibaca pada panjang gelombang 550 nm (Anonim, 2010).
39
2.
Prinsip reaksi : Creatinine + H2O Creatin + H2O
3.
creatininase
creatinase
Creatinin
Sarcosine + Urea
Sarcosine +H2O + O2
SOD
Formaldehyde + Glycine + 2H2O2
2H2O2 + 4 AA + Toos
POD
2H2O + Quinone dye + H2O2
Cara Kerja Hasil konsentrasinya dihitung secara otomatis oleh alat kemudian dibandingkan dengan kalibrator. Untuk mengkonversi mg/dL menjadi satuan SI (µmol/L) kalikan dengan 88,4 (Anonim, 2010).
c. Pengukuran Tinggi Badan Tinggi badan adalah hasil pengukuran maksimum panjang tulang-tulang secara paralel yang membentuk poros tubuh (body axis) yang diukur dari titik tertinggi di kepala (vertex), ke titik terendah dari tulang kalkaneus yang disebut heel. Tinggi badan merupakan salah satu parameter antropometri yang sangat penting (Barasi, 2009). Pengukuran tinggi badan pada anak-anak secara individual dapat digunakan untuk menentukan status gizi, sedangkan data pengukuran tinggi badan pada suatu populasi dapat digunakan untuk
menentukan
standar
pertumbuhan
(Gibson,
2005).
Pengukuran tinggi badan dapat dilakukan dengan alat microtoise, yaitu suatu alat untuk mengukur panjang tubuh dengan ketelitian satu angka di belakang koma. Tinggi badan diukur pada posisi berdiri secara tegak lurus dalam sikap anatomi tanpa alas kaki untuk anak di atas 2 tahun maupun tidur untuk anak usia kurang dari 2 tahun (Wong et al., 2008). Pada penelitian ini, tinggi badan digunakan sebagai salah satu komponen untuk menghitung nilai eLFG dengan formula Schwartz.
40
3. Skema Alur Penelitian Pasien pediatri dengan diagnosis TBM di bangsal khusus talasemia RSUD Dr Moewardi dan wilayah Surakarta dan Sekitarnya Kriteria inklusi Umur 5-18 tahun Diagnosis TBM Riwayat transfusi berulang Riwayat terapi khelasi besi
- Pasien tanpa gejala ISK dan kelainan warna urin
-
Kriteria eksklusi Riwayat penyakit hepar dan ginjal selain karena TBM Infeksi Riwayat keganasan, DM, alergi Terapi Cox inhibitor
secara visual Subjek penelitian
Pengambilan sampel urin, darah vena, pengukuran tinggi badan Pemeriksaan F2-IsoPs urin, kreatinin serum dan urin, menghitung eLFG serum Analisis data statistik: Uji normalitas distribusi data: Saphiro-Wilk test Uji komparatif: Mann Whitney U test Uji korelatif: Spearman correlation test Gambar 10. Skema alur penelitian
F. Identifikasi Variabel Penelitian Variabel bebas
: Kadar F2-IsoPs urin
Variabel terikat
: eLFG
G. Definisi Operasional Variabel Penelitian 1.
Kadar F2‒IsoPs urin adalah peningkatan kadar F2‒IsoPs urin, yaitu tanda kerusakan stres oksidatif pada membran sel yang merupakan hasil peroksidasi lipid AA yang disebabkan oleh radikal bebas, yang diperiksa menggunakan 8‒ Iso‒PGF2α EIA kit dari Cayman Chemical. Pemeriksaan dilakukan di laboratorium riset terstandarisasi di Jakarta. Hasil dinyatakan dalam ng/mg kreatinin urin. Skala pengukuran : rasio. Kadar F2‒IsoPs urin normal < 2 ng/mg kreatinin urin.
41
2.
Estimasi laju filtrasi glomerulus (eLFG) merupakan perkiraan hitungan kecepatan dan jumlah zat yang difiltrasi glomerulus. Laju filtrasi glomerulus merupakan laju filtrasi disemua nefron yang berfungsi. Oleh karena itu, LFG memberikan sebuah ukuran kasar akan jumlah nefron yang berfungsi. Pada penelitian ini penilaian LFG dihitung menggunakan formula Schwartz dengan rumus : eLFG = k x L/Scr keterangan :
eLFG : estimated LFG (mL/menit/ 1,73 m2) L
: tinggi badan (cm)
Scr
: serum kreatinin (mg/dL)
K
: konstanta (bayi aterm: 0,45; anak dan remaja putri 0,55; remaja putra: 0,7)
Untuk menghitung eLFG dengan formula Schwartz maka diperlukan pemeriksaan kadar kreatinin serum dan pengukuran tinggi badan. a. Kreatinin serum Kreatinin adalah produk katabolisme dari kreatin fosfat yang ada di dalam otot (Scott, 2002). Pada penelitian ini kadar kreatinin serum diperiksa dengan metode enzimatik menggunakan alat ILAB 650. Nilai rujukan kreatinin serum adalah 0,2−0,6 mg/dL. Skala pengukuran rasio. b. Tinggi badan Tinggi badan adalah hasil pengukuran maksimum panjang tulangtulang secara paralel yang membentuk poros tubuh (body axis) yang diukur dari titik tertinggi di kepala (vertex), ke titik terendah dari tulang kalkaneus yang disebut heel (Barasi, 2009). Diukur dengan Microtoise yang merupakan alat pengukur tinggi tubuh dengan ketelitian satu angka dibelakang koma dalam posisi berdiri sikap sempurna tanpa alas kaki dinyatakan dengan satuan sentimeter (cm). Skala pengukuran rasio.
42
Nilai rujukan eLFG untuk usia < 40 tahun laki-laki : 87‒107 mL/menit/ 1,73 m2; untuk perempuan 107‒139 mL/menit/ 1,73 m2 (Pagana dan Pagana, 2014). Skala pengukuran rasio. H. Kontrol Kualitas Internal Sebelum dilakukan pemeriksaan kadar F2‒IsoPs urin dan kreatinin serum akan dilakukan kontrol kualitas internal dengan mengukur akurasi dan presisi. Presisi menggambarkan reproduktibilitas metode, dan dilihat dari koefisien variasi (KV). Presisi dapat diukur secara within-run, dan betweenrun. Akurasi adalah kemampuan metode pemeriksan untuk mendapatkan nilai yang sebenarnya. Akurasi dilihat dengan membandingkan hasil yang didapat dari pemeriksaan dengan hasil yang didapat dari metode referensi atau standar (Kaplan dan Pesce, 2010). Presisi pemeriksaan F2-IsoPs dilihat dengan melihat hasil pemeriksaan sampel serum yang sama sebanyak lima kali (within-run). Penilaian akurasi pemeriksaan F2-IsoPs tidak dilakukan karena tidak ada bahan kontrol dengan nilai rujukan, karena analit F2-IsoPs masih terbatas hanya untuk penelitian. Presisi pemeriksaan kreatinin dilihat dari hasil pemeriksaan sampel serum yang sama sebanyak lima kali (within-run) dan melihat hasil pemeriksaan bahan kontrol between-day selama 20 hari. Akurasi pemeriksaan kreatinin dilihat dengan membandingkan hasil pemeriksaan dengan nilai rujukan pada bahan kontrol. I. Analisis Statistik Data karakteristik subjek penelitian disajikan dalam bentuk deskriptif. Data variabel dideskripsikan dalam bentuk rerata + simpang baku (SB) sesuai distribusi. Uji normalitas distribusi data dinilai dengan uji Saphiro-Wilk karena besar sampel ≤ 50. Analisis komparatif
untuk menilai perbedaan antara
kelompok yang dibagi berdasarkan kadar F2-IsoPs urin menggunakan Mann Whitney U test karena data tidak terdistribusi normal. Korelasi antara F2-IsoPs urin dengan eLFG dinilai menggunakan uji korelasi Spearman karena data tidak terdistribusi normal (Dahlan, 2009). Pengolahan data statistik
43
menggunakan bantuan program komputer bermakna bila p < 0,05 dengan interval kepercayaan 95%. J. Pertimbangan Etik Penelitian ini akan meminta persetujuan komisi etika penelitian biomedis di FK UNS/RSDM di Surakarta dan persetujuan pasien/orang tua pasien. Pernyataan bersedia sebagai subjek penelitian akan diperoleh dengan terlebih dahulu menjelaskan secara singkat latar belakang, tujuan, manfaat penelitian, serta teknik pengambilan sampel darah dan urin kepada orang tua pasien. Orang tua pasien menandatangani surat pernyataan bersedia menjadi subjek penelitian yang telah disediakan.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Validitas Uji Analitik Validitas uji analitik dilakukan terlebih dahulu sebelum melakukan pemeriksaan sampel. Uji analitik meliputi uji presisi atau ketelitian dan uji akurasi atau ketepatan. 1. Uji Presisi/Ketelitian Uji presisi melihat konsistensi hasil pemeriksaan yaitu kedekatan hasil beberapa pengukuran pada bahan uji yang sama. Uji presisi meliputi uji presisi sehari (within day) yaitu dengan cara pemeriksaan 1 contoh bahan yang dilakukan 5 kali secara berurutan pada hari yang sama untuk kreatinin dan 3 kali untuk F2-IsoPs. Pemilihan contoh bahan urin dan serum dilakukan secara acak sesuai volume yang tersedia. Uji presisi hari ke hari (day to day) yaitu dengan melihat hasil pemeriksaan kreatinin secara berurutan selama 20 hari. Uji presisi day to day F2-IsoPs tidak dilakukan karena sampel pasien dikumpulkan (pooling) dan diperiksa pada waktu yang sama. Hasil uji presisi masing-masing parameter pemeriksaan dapat dilihat pada tabel 6. Tabel 6. Hasil uji presisi untuk pemeriksaan kreatinin serum dan F2-IsoPs urin KV(%) KV (%) Parameter Rerata SB Maksimum Within day Kreatinin 0,20 mg/dl 0,00 0,00 5,95* Day to day Kreatinin 0,86 mg/dl 0,04 5,00 6,00* Within day F2-IsoPs urin 60,50 pg/ml 4,40 7,20 9,50** (*Depkes, 2008; **Anonim, 2014)
Koefisien variasi yang didapat dari uji presisi within day maupun day to day untuk kreatinin 0% dan 5%. Hasil tersebut masih dibawah nilai KV maksimum parameter pemeriksaan, sehingga dapat disimpulkan hasil uji presisi parameter kreatinin serum adalah baik. Koefisien variasi maksimun parameter F2-IsoPs didapat dari 8-IsoPs EIA kit dari Cayman chemical (2010) adalah 9,5; sehingga dapat 44
45
disimpulkan pemeriksaan parameter F2-IsoPs dengan metode EIA baik/mempunyai KV dibawah ketentuan KV maksimum yang ditetapkan. 2. Uji Akurasi /Ketepatan Akurasi adalah kemampuan metode pemeriksan untuk mendapatkan nilai
yang sebenarnya.
Akurasi dilihat dengan
membandingkan hasil yang didapat dari pemeriksaan dengan hasil yang didapat dari metode referensi atau standar (Kaplan dan Pesce, 2010). Akurasi dinilai dari hasil pemeriksaan bahan kontrol dan dihitung sebagai nilai bias (d%). Rumus d% = [(rerata-NA)/NA], NA= nilai aktual dari bahan kontrol yang dapat positif atau negatif, nilai positif menunjukkan nilai yang lebih tinggi dari seharusnya dan nilai negatif menunjukkan nilai yang lebih rendah dari seharusnya (Depkes, 2008). Tabel 7. Hasil uji akurasi untuk pemeriksaan kreatinin serum (Anonim, 2010) Nilai aktual rujukan Rerata d% Parameter Simpulan [rerata(rentang ± 2SB)] pengukuran Kreatinin 1,08 (0,78-1,38) * 0,86 Masuk rentang 0,20 (mg/dL) (*Anonim, 2010)
B. Karakteristik Subyek Penelitian Penelitian dilakukan di RSDM di Surakarta pada bulan Mei-Juni 2016. Jumlah sampel yang diambil adalah 30 pasien yang dinyatakan menderita TBM dan sesuai kriteria inklusi. Pemeriksaan kadar F2-IsoPs urin dan kreatinin dikerjakan kurang lebih 2 minggu setelah diperoleh 30 spesimen urin dan serum pasien TBM yang telah dipreparasi dengan BHT dan indometasin. Berdasarkan data yang diperoleh, dapat dibuat deskripsi mengenai pasien TBM di RSDM. Uji normalitas data menggunakan Saphiro wilk karena jumlah sampel < 50. Data yang diperoleh dilakukan uji normalitas Shaphiro-Wilk. Nilai p variabel F2-IsoPs urin adalah p = 0,726; umur p = 0,313; tinggi badan p = 0,612; lama menderita TBM dan lama transfusi p = 0,317. Kelima
45
46
variabel tersebut memiliki nilai p > 0,05 atau sebaran data terdistribusi normal, sedangkan variabel eLFG memiliki nilai p = 0,005; kadar kreatinin serum p = 0,001; jenis kelamin p = 0,001; berat badan p =0,022; riwayat splenektomi p = 0,001 atau nilai p < 0,05 atau sebaran data tidak terdistribusi normal. Transformasi data dilakukan terhadap data-data yang terdistribusi tidak normal untuk membuat sebaran data menjadi normal. Setelah dilakukan transformasi log 10 didapatkan hasil variabel-variabel tersebut memiliki nilai p < 0,05 atau sebaran data tidak terdistribusi normal. Karakteristik dasar subyek penelitian didapatkan laki-laki sebanyak 15 orang (50%) dan wanita sebanyak 15 orang (50%). Rerata umur subyek penelitian adalah 12,2 ± 3,57 tahun. Rerata kadar F2-IsoPs urin adalah 2,36 ± 1,11 ng/mg kreatinin urin menunjukkan adanya peningkatan kadar F2IsoPs urin yang merupakan tanda adanya proses oksidatif pada pasien TBM. Studi sebelumnya pada subjek TBM menunjukkan adanya peningkatan biomarker stres oksidatif seperti MDA dan TBARS (Walter et al., 2006). Hasil penelitian ini juga sesuai dengan penelitian Matayatsuk et al. (2007) yang menunjukkan adanya peningkatan kadar F2-IsoPs urin pada pasien TBM dibandingkan kontrol sehat dengan rerata 3,38 ± 2,15 ng/mg kreatinin urin vs 0,86 ± 0,55 ng/mg kreatinin urin. Hasil eLFG berada pada median 271,3 mL/menit/1,73 m2 dengan nilai minimum 199,8 mL/menit/1,73 m2 dan nilai maksimum 476,0 mL/menit/1,73 m2 menunjukkan adanya HG yang merupakan tahap awal dari kerusakan glomerulus ginjal. Pada penelitian ini, nilai eLFG yang dihitung dengan formula Schwartz menunjukkan adanya HG, hasil ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Ziyadeh et al. (2012) tentang adanya gangguan ginjal pada pasien talasemia intermedia yang independent transfusi dan tidak menerima terapi khelasi besi. Dari 50 subyek penelitian, 48% (24) didapatkan nilai eLFG 189 mL/menit/1,73 m2 .
47
Penelitian serupa juga dilakukan oleh Deveci et al. 2016, yang melakukan penelitian tentang kemungkinan adanya gangguan fungsi ginjal baik defek pada glomerulus maupun tubulus ginjal pada 96 pasien talasemia intermedia dan TBM. Hasil penelitian didapatkan adanya defek glomerulus dan tubulus pada 68,8% pasien, 40% pasien mengalami hiperfiltrasi glomerulus (LFG > 130 mL/menit/1,73 m2). Tak satupun dari subyek penelitian mengalami penurunan LFG. Deskripsi karakteristik subyek penelitian secara lengkap dapat dilihat pada tabel 8. Tabel 8. Deskripsi Karakteristik Subjek Penelitian Karakteristik Hasil (n=30) p Jenis kelamin 0,001 Laki-laki 15 (50%) Perempuan 15 (50%) Umur (tahun) 12,2 ± 3,57* 0,313 Tinggi badan (cm) 136 ± 1,47 0,612 Volume transfus (mL) 5950 (3500-15050)** 0,002 Jumlah transfus (kolf) 34 (20-86)** 0,002 Lama menderita TBM 8,2 ± 3,9 0,317 Lama transfusi 8,2 ± 3,9 0,317 Terapi khelasi besi 0,001 Dapat terapi khelasi besi 30 (100%) Tidak dapat terapi khelasi besi 0 (0%) Splenektomi 0,001 Tidak splenektomi 25 (83,3%) Splenektomi 5 (16,7%) Kreatinin serum (mg/dL) 0,3 (0,2-0,5)** 0,001 * : data terdistribusi normal, dinyatakan dalam rerata ± SB ** : data terdistribusi tidak normal, dinyatakan dalam median (minimummaksimum) p : uji Saphiro Wilk signifikan p > 0,05
Sementara Gokce et al. (2014) meneliti 71 pasien TBM yang mendapat transfusi reguler dan khelasi besi deferasirox dan 35 anak sehat sebagai kontrol, untuk mengetahui deteksi dini gangguan fungsi ginjal pada pasien tersebut. Didapatkan hasil serum kreatinin berada pada median 0,4 mg/dL dengan nilai minimum 0,2 dan nilai maksimum 0,7 mg/dL; sementara median LFG adalah 192 mL/menit/1,73 m2 dengan nilai minimum 106 mL/menit/1,73 m2 dan nilai maksimum 308 mL/menit/1,73 m2. Lebih dari 50% subyek penelitian mengalami HG (n = 48). Rerata
48
serum cystatin- C meningkat > 1 mg/L pada grup talasemia dibanding kontrol dengan nilai p = 0,0001. Malaki et al. (2011) juga mengatakan pentingnya monitoring fungsi ginjal pada pasien hereditary hemoglobinopathy yang mendapat transfusi reguler dan terapi khelasi besi dengan melakukan penelitian pada 63 pasien TBM usia 1-29 tahun, di RS anak di Tabriz. Didapatkan peningkatan kadar serum kreatinin yang berada pada median 0,6 mg/dL dengan kadar minimum 0,4 mg/dL dan kadar maksimum 1,0 mg/dL. Hasil penelitian tersebut juga menunjukkan adanya HG dengan nilai eLFG 164225 mL/menit/1,73 m2 pada kelompok usia 16 ± 6,2 tahun. Nilai eLFG dihitung menggunakan 2 formula yaitu formula MDRD dan formula Swarthz. Pada penelitian tersebut, terdapat 19 subjek penelitian menggunakan formula MDRD menunjukkan adanya HG pada 13 subjek penelitian (68%), sementara 44 subjek penelitian menggunakan formula Swarthz dan menunjukkan adanya HG pada 18 subjek penelitian (41%). Dijelaskan dalam penelitian tersebut bahwa LFG berkorelasi dengan usia, namun tidak berkorelasi dengan serum iron, serum feritin, transfusi reguler dan khelasi besi. Hal itu menunjukkan bahwa hiperfiltrasi merupakan gangguan fungsi glomerulus yang dapat berpengaruh terhadap fungsi ginjal secara keseluruhan. Serum kreatinin sendiri tak dapat memberikan informasi untuk mengevaluasi pasien yang mempunyai disfungsi ginjal karena dipengaruhi usia, jenis kelamin, dan massa otot. Pada penelitian ini, efek transfusi, anemia kronik, dan khelasi besi pada ginjal pasien TBM tidak menurunkan LFG namun justru terjadi hiperfiltrasi, meskipun serum kreatinin berkorelasi dengan LFG namun tidak merefleksikan nilai LFG terutama pada pasien yang mempunyai massa otot yang kecil dan gangguan nutrisi. Milo et al. (2015) berpendapat bahwa pasien-pasien TBM mempunyai disfungsi tubulus dan glomerulus terutama adalah HG berdasar dari hitungan nilai LFG. Penilaian LFG menggunakan serum kreatinin seringkali mendapatkan hasil overestimate, oleh karena itu pada
49
penelitian tersebut Milo et al. menggunakan inulin clearance dan membandingkannya dengan creatinin clearance (Ccr) dan formula MDRD, CKD EPI dan Cockcroft–Gault estimation untuk menilai eLFG. Penelitian tersebut dilakukan terhadap 9 pasien TBM, dan didapatkan masing masing nilai eLFG secara berurutan yang dihitung dengan CKD EPI, MDRD dan Cockcroft Gault adalah 143, 151, dan 168 mL/menit/1,73 m2. Hasil creatinin clearance 134,9 mL/menit/1,73 m2; lebih tinggi dari perhitungan eLFG karena rata-rata sekresi kreatinin 30,3 mL/menit/1,73 m2, dan hasil clearance inulin 72 mL/menit, lebih rendah dari clearance inulin pada kontrol sehat 76,6 mL/menit sehingga mereka membuat suatu simpulan bahwa penentuan nilai LFG yang berdasar pada pengukuran kreatinin serum mungkin belum dapat diterima nilai akurasinya. Studi yang serupa dilakukan oleh Quinn et al. (2011) yang menilai fungsi ginjal pada pasien TBM dengan mengukur Ccr, dan membandingkannya dengan formula Swhartz. Didapatkan hasil Ccr yang berada pada rentang normal (126-133 mL/menit/1,73 m2), sementara eLFG dengan formula Swhartz cenderung lebih tinggi dari Ccr (166 mL/menit/1,73 m2). Hasil penelitian ini berbeda dengan penelitian terdahulu yang dilakukan oleh Koliakos et al. 2003, terhadap pasien TBM yang mendapat terapi deferoxamine yang hasilnya menunjukkan adanya serum kreatinin dan LFG yang normal. Hamed dan Elmelegy (2010) melakukan penelitian terhadap 69 pasien TBM usia 1-16 tahun, yang diterapi deferoxamine, dan 15 kontrol sehat usia 3-14 tahun, didapatkan adanya peningkatan serum kreatinin 0,75 ± 0,18 mg/dL dan penurunan LFG < 90 mL/menit/1,73 m2. Hasil penelitian ini juga menunjukkan adanya korelasi negatif serum kreatinin dengan LFG (r = 0,892; p < 0,001), adanya korelasi signifikan antara LFG dengan usia (r = 0,941; p < 0,001). Data tersebut menunjukkan adanya gangguan fungsi ginjal pada pasien TBM, sementara penentuan kadar MDA urin sebagai marker stres oksidatif pada penelitian ini berkorelasi lemah dengan LFG (r = 0,091; p < 0,05).
50
Pada tahun 2014, sebuah penelitian yang dilakukan Ali dan Mahmoud bertujuan untuk melihat frekuensi disfungsi glomerulus pada pasien TBM, dan melibatkan 100 pasien TBM yang dibagi menjadi 2 grup. Hasilnya terdapat peningkatan kadar serum kreatinin (0,9 ± 0,1 mg/dL) dan cystatin-C (1,9 ± 0,2 mg/dL) dan penurunan LFG (77,4 ± 30,4 mL/menit/1,73 m2) dan creatinin clearance (34,2 ± 5,9 mL/menit) pada grup yang mendapat terapi khelasi besi. B. Uji Komparasi Dilakukan analisis komparatif untuk melihat apakah ada perbedaan yang bermakna pada rerata nilai eLFG, kreatinin serum antara kelompok yang mempunyai kadar F2-IsoPs urin normal dan tidak normal. Data F2-IsoPs urin, eLFG dan kreatinin tidak terdistribusi normal, sehingga analisis komparatif menggunakan uji Mann Whitney. Tabel 9 menyajikan hasil uji komparasi pada kelompok kadar F2-IsoPs urin normal dan abnormal. Tabel 9. Hasil uji komparasi dengan Mann Whitney U test F2-IsoPs urin (ng/mg kreatinin urin) # Variabel Normal Abnormal## p* (n = 20) (n=10) Umur (tahun) 10 13 0,06 Jumlah transfusi (kolf) 25 48 0,00 Volume transfusi (mL) 4480 8351 0,00 eLFG(mL/menit/1,73 m2) 225 335 0,00 Kreatinin (mg/dL) 0,33 0,27 0,04 keterangan : *p : Signifikan bila < 0,05 # : Normal jika < 2 ng/mg kreatinin ## : Abnormal jika ≥ 2 ng/mg kreatinin F2-IsoPs : F2-Isoprostan urin eLFG : Estimasi laju filtrasi glomerulus
Didapatkan perbedaan yang bermakna pada rerata nilai eLFG antara kelompok yang mempunyai kadar F2-IsoPs urin normal dan abnormal, namun hal ini belum dapat memberikan informasi atau simpulan bahwa semakin berat tingkat stres oksidatif akan semakin memperburuk fungsi ginjal, oleh karena HG merupakan stadium awal PGK yang dapat bersifat reversibel jika dilakukan penatalaksanaan yang baik ataupun berkembang ke stadium lanjut dari PGK hingga menyebabkan penurunan eLFG (Brenner et al., 1996).
51
Didapatkan perbedaan yang bermakna pada jumlah dan volume transfusi antara kelompok yang mempunyai kadar F2-IsoPs urin normal dan abnormal menunjukkan bahwa semakin banyak jumlah dan volume darah yang diberikan akan semakin memperberat stres oksidatif pada ginjal pasien TBM. Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian Nerpin et al. (2012) yang melaporkan tentang peran inflamasi dan stres oksidatif terhadap gangguan ginjal yang hasilnya menunjukkan adanya korelasi antara F2-IsoPs urin dan eLFG pada pasien geriatri (usia 77 tahun) yang berisiko penyakit kardiovaskuler. Namun, Panut (2012) yang menganalisis hubungan antara kadar MDA sebagai marker stres oksidatif dengan eLFG pada pasien DM tipe 2 di RSUPN dr Cipto Mangunkusumo menyatakan tidak ada korelasi antara keduanya. Hingga saat ini belum didapatkan penelitian yang meneliti korelasi antara F2-IsoPs dengan eLFG. C. Uji Korelasi Uji korelasi menggunakan uji korelasi Spearman untuk melihat derajat kekuatan korelasi antara F2-IsoPs urin dengan beberapa variabel penelitian terkait fungsi ginjal. Terdapat korelasi positif kuat dan bermakna antara F2IsoPs urin dengan eLFG (r = 0,740; p = 0,001), menunjukkan bahwa terjadi peningkatan nilai eLFG seiring dengan peningkatan F2-IsoPs urin. Tabel 10 menampilkan hasil uji korelasi F2-IsoPs urin dengan eLFG pada pasien TBM. Tabel 10. Korelasi Spearman F2-IsoPs urin dengan eLFG pada pasien TBM Rerata ± SB r p F2-IsoPs urin (ng/mg kreatinin urin) 2,3 6 ± 1,11 0,740 0,001* eLFG (mL/menit/1,73 m2) 271,3 (199,8−476,0) keterangan: * korelasi Spearman’s rank signifikan = p < 0,05
52
F2-IsoPs urin
Gambar 11. Grafik korelasi F2-IsoPs dan eLFG
Hiperfiltrasi glomerulus secara umum dapat terjadi pada pasien TBM yang merefleksikan tahap awal PGK, namun perlu studi longitudinal untuk menilai perubahan tahapan PGK selanjutnya karena selama ini penelitian tentang gangguan fungsi ginjal pada pasien TBM hanya terbatas pada terjadinya HG dan tidak membahas progresifitasnya ke arah PGK. Penelitian yang telah ada selama ini terbatas dilakukan pada populasi DM dan hipertensi, sebagaimana penelitian longitudinal yang di follow up selama 4 tahun mengenai terjadinya HG dan progresifitasnya pada pasien DM tipe 2 oleh Ruggenenti et al. (2012). Pada penelitian tersebut didapatkan rerata nilai LFG adalah 132,2 ± 11,5 mL/menit/1,73 m2 dan menunjukkan adanya penurunan LFG 3,37 mL/menit/1,73 m2 setiap tahun. Palatini (2012) juga merekomendasikan pentingnya melakukan monitoring LFG pada pasien pre-diabetes dan pre-hipertensi yang pada penelitiannya di dapatkan nilai LFG ≥ 150 mL/menit/1,73 m2, karena kondisi tersebut dapat berrisiko pada kerusakan ginjal lebih lanjut. Pada studi longitudinal yang di follow up selama 6 tahun tersebut, nilai LFG mengalami penurunan 1,34 mL/menit/1,73
53
m2 dalam setiap tahun. Brenner et al. (1996) berpendapat bahwa kondisi HG jangka panjang ( ≥ 1 tahun) tanpa terapi
penyebab penyakit dasarnya akan
menyebabkan stres podosit dan kerusakan glomerulus ginjal yang mengakibatkan albuminuria, perubahan irreversibel struktur glomerulus, glomerulosklerosis, penurunan LFG hingga berakhir pada PGK. Hubungan antara LFG dan ekskresi albumin dapat dilihat pada gambar 12.
Gambar 12. Hubungan antara nilai LFG dengan AER (Brenner et al., 1996).
Keterbatasan penelitian ini adalah tidak mengukur nilai rujukan kadar F2IsoPs urin pada kelompok umur pediatri sehingga tidak diketahui kadar normal F2-IsoPs urin pada kelompok umur pediatri. Penelitian ini merupakan penelitian lokal di daerah Surakarta dan sekitarnya, sehingga diperlukan penelitian multicenter lanjutan.
BAB V SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan Hasil r = 0,740 dengan p = 0,000 yang menunjukkan ada korelasi positif kuat dan bermakna antara kadar F2-IsoPs urin dengan eLFG pada pasien TBM. B. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan desain yang berbeda untuk mengevaluasi korelasi peningkatan kadar F2-IsoPs urin dan eLFG dengan memperhatikan faktor-faktor yang dapat mempengaruhi penelitian seperti frekuensi dan jumlah transfusi, pengobatan khelasi besi, dan splenektomi. Adanya peningkatan F2-IsoPs sebagai penanda stres oksidatif pada ginjal belum dapat menentukan apakah kerusakan stres oksidatif tersebut berasal dari kerusakan glomerulus/tubulus ginjal sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut pada subjek yang sama menggunakan marker spesifik sebagai penanda kerusakan pada glomerulus/tubulus.
54
RINGKASAN Talasemia beta mayor ditandai dengan anemia yang progresif yang membutuhkan transfusi darah berulang untuk mempertahankan kelangsungan hidupnya. Penimbunan besi dalam tubuh merupakan komplikasi dari transfusi darah terus-menerus dan jangka lama, serta peningkatan absorpsi besi akibat eritropoisis yang tidak efektif. Adanya eritropoisis inefektif, masa hidup eritrosit yang memendek, dan transfusi berulang merupakan penyebab iron overload pada pasien TBM. Khelator besi diberikan sebagai intervensi untuk mencegah iron overload pada berbagai organ tubuh, salah satunya adalah organ ginjal. Namun pemberian terapi khelasi besi tersebut juga mempunyai dampak negatif pada ginjal karena bersifat nefrotoksik pada pemberian jangka panjang. Adanya iron overload, hipoksia pada ginjal karena anemia dan terapi khelasi besi merupakan faktor utama yang mendasari gangguan fungsi ginjal pada pasien TBM. Saat ini, angka kejadian gangguan/penyakit ginjal pada TBM yang dilaporkan berkisar 8% dari 6 juta orang di UK dan 13% di USA. Kerusakan oksidatif, terutama karena iron overload dan deplesi antioksidan, berperan penting pada patogenesis TBM, adanya rantai alfa yang berlebihan adalah sebab utama kerusakan oksidatif seluler pada TBM. Iron overload juga meningkatkan pembentukan ROS dan stres oksidatif, karena adanya besi bebas akan mengkatalisasi produksi ROS seperti O2- dan OH⁻ melalui reaksi Haber-Weiss dan reaksi Fenton. Stres oksidatif ini akan memicu peroksidasi lipid pada eritrosit dan akhirnya menyebabkan hemolisis. Hipoksia kronik karena anemia pada ginjal dapat menyebabkan injury pada glomerulus dan tubulus, yang berakibat glomerulosklerosis dan fibrosis ginjal. Pada penelitian ini akan menilai korelasi kadar F2-IsoPs urin sebagai penanda stres oksidatif pada ginjal dan eLFG sebagai penanda gangguan fungsi ginjal pada pasien TBM. F2-Isoprostan urin merupakan salah satu produk peroksidasi lipid akibat kerusakan stres oksidatif yang terlokalisir pada ginjal. Disfungsi ginjal pada pasien TBM dapat bervariasi mulai dari derajat ringan hingga berat, dapat terjadi pada glomerulus ataupun tubulus ginjal. Beberapa
55
56
penelitian sebelumnya telah melaporkan kejadian HG pada pasien TBM. Hiperfiltrasi glomerulus merupakan tahap awal dari PGK yang dapat disebabkan karena gangguan hemodinamik ginjal. Penurunan resistensi vaskuler sistemik menyebabkan sirkulasi hiperdinamik yang meningkatkan aliran plasma ginjal dan LFG. Perubahan-perubahan tersebut mengakibatkan regangan pada dinding kapiler glomerulus dan injury pada sel endotel glomerulus, terjadi transudasi makromolekul ke dalam mesangium sehingga mengakibatkan disfungsi glomerulus yang dalam waktu lama akan menyebabkan penurunan LFG. Penelitian ini merupakan penelitian analitik observasional dengan pendekatan cross sectional dilakukan di Instalasi Patologi Klinik RSDM di Surakarta. Waktu penelitian mulai bulan Mei hingga bulan Juni 2016. Pemilihan subjek penelitian dilakukan secara konsekutif. Didapatkan 30 subjek yang memenuhi kriteria inklusi dan ekslusi. Kriteria inklusi subjek penelitian meliputi; Umur ≤ 18 tahun; diagnosis TBM oleh klinisi berdasarkan hasil laboratorium (pemeriksaan Hb elektroforesis); riwayat transfusi berulang 10‒15 kali (lebih dari 1 tahun), dinilai dari anamnesis dan rekam medis mengenai adanya terapi transfusi rutin; riwayat terapi khelasi besi dari klinisi, data didapatkan dari anamnesis dan rekam medik; pasien-pasien tanpa gejala dan tanda infeksi saluran kencing (ISK), diketahui dari anamnesis, pemeriksaan fisik, data hasil pemeriksaan laboratorium, rekam medik dan inspeksi urin secara visual dari warna dan kekeruhan urin; menyetujui dan menandatangani surat pernyataan bersedia menjadi subjek penelitian. Pemeriksaan laboratorium didahului dengan uji presisi dan akurasi. Data karakteristik subjek penelitian disajikan dalam bentuk deskriptif. Data variabel dideskripsikan dalam bentuk rerata ± simpang baku (SB) sesuai distribusi. Uji normalitas distribusi data dinilai dengan uji Saphiro-Wilk karena besar sampel ≤ 50. Analisis komparatif untuk menilai perbedaan antara kelompok yang dibagi berdasarkan kadar F2-IsoPs urin menggunakan uji Mann Whitney karena data tidak terdistribusi normal. Korelasi antara F2-IsoPs urin dengan eLFG dinilai menggunakan uji korelasi Spearman karena data tidak terdistribusi normal.
57
Pengolahan data statistik menggunakan bantuan program komputer yang bermakna bila p < 0,05 dengan interval kepercayaan 95%. Hasil uji presisi dan akurasi kreatinin serta uji presisi F2-IsoPs urin baik dan menunjukkan ketelitian pemeriksaan yang konsisten, sedangkan uji akurasi F2-IsoPs tidak dilakukan karena tidak terdapat reagen kontrol (terbatas hanya untuk penelitian). Karakteristik dasar subjek penelitian didapatkan laki-laki sebanyak 15 orang (50%) dan wanita sebanyak 15 orang (50%). Rerata umur subjek penelitian adalah 12,2 ± 3,57 tahun. Rerata kadar F2-IsoPs urin adalah 2,36 ± 1,11 ng/mg kreatinin urin menunjukkan adanya peningkatan yang merupakan adanya proses oksidatif pada pasien TBM. Studi sebelumnya pada subjek TBM menunjukkan adanya peningkatan biomarker stres oksidatif seperti MDA dan TBARS (Walter et al., 2006). Hasil penelitian ini juga sesuai dengan penelitian Matayatsuk et al. (2007) yang menunjukkan adanya peningkatan kadar F2-IsoPs urin pada pasien TBM dibandingkan kontrol sehat dengan rerata 3,38 ± 2,15 ng/mg kreatinin urin vs 0,86 ± 0,55 ng/mg kreatinin urin. Hasil eLFG berada pada median 271,3 mL/menit/1,73 m2 dengan nilai minimum 199,8 mL/menit/1,73 m2 dan nilai maksimum 476,0 mL/menit/1,73 m2 menunjukkan adanya HG yang merupakan tahap awal dari kerusakan glomerulus ginjal. Pada penelitian ini, nilai eLFG yang dihitung dengan formula Schwartz menunjukkan adanya HG, hasil ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Ziyadeh et al. (2012) tentang adanya gangguan ginjal pada pasien talasemia intermedia yang independent transfusi dan tidak menerima terapi khelasi besi. Dari 50 subjek penelitian, 48% (24) didapatkan nilai eLFG > 189 mL/menit/1,73 m2. Hasil uji komparasi didapatkan perbedaan yang bermakna pada rerata nilai eLFG antara kelompok yang mempunyai kadar F2-IsoPs urin normal dan abnormal, namun hal ini belum dapat memberikan informasi atau simpulan bahwa semakin berat tingkat stres oksidatif akan semakin memperburuk fungsi ginjal, oleh karena HG merupakan stadium awal PGK yang dapat bersifat reversibel jika dilakukan intervensi penatalaksanaan yang baik ataupun dapat berkembang ke stadium lanjut dari PGK hingga menyebabkan penurunan eLFG (Brenner et al., 1996). Didapatkan perbedaan yang bermakna pada jumlah dan volume darah
58
transfusi antara kelompok yang mempunyai kadar F2-IsoPs urin normal dan abnormal menunjukkan bahwa semakin banyak jumlah dan volume darah yang diberikan akan semakin memperberat stres oksidatif pada ginjal pasien TBM. Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian Nerpin et al. (2012) yang melaporkan tentang peran inflamasi dan stres oksidatif terhadap gangguan ginjal yang hasilnya menunjukkan adanya korelasi antara F2-IsoPs urin dan eLFG pada pasien geriatri (usia 77 tahun) yang berisiko penyakit kardiovaskuler. Namun, Panut (2012) yang menganalisis hubungan antara kadar MDA sebagai marker stres oksidatif dengan eLFG pada pasien DM tipe 2 di RSUPN dr Cipto Mangunkusumo menyatakan tidak ada korelasi antara keduanya. Hingga saat ini belum didapatkan penelitian tentang korelasi antara F2-IsoPs dengan eLFG pada pasien TBM. Pada uji korelasi Spearman, kadar F2-IsoPs urin memiliki korelasi positif kuat dan bermakna dengan eLFG (r = 0,740 dan p = 0,001), menunjukkan bahwa terjadi peningkatan nilai eLFG seiring dengan peningkatan F2-IsoPs urin. Hiperfiltrasi glomerulus secara umum dapat terjadi pada pasien TBM yang merefleksikan tahap awal PGK, namun perlu studi longitudinal untuk menilai perubahan tahapan PGK selanjutnya karena selama ini penelitian tentang gangguan fungsi ginjal pada pasien TBM hanya terbatas pada terjadinya HG dan tidak membahas progresifitasnya ke arah PGK. Penelitian yang telah ada selama ini terbatas dilakukan pada populasi DM dan hipertensi. Sebagaimana penelitian longitudinal oleh Ruggenenti et al. (2012) yang di follow up selama 4 tahun mengenai terjadinya HG dan progresifitasnya pada pasien DM tipe 2. Pada penelitian tersebut didapatkan rerata nilai LFG adalah 132,2 ± 11,5 mL/menit/1,73 m2 dan menunjukkan adanya penurunan LFG 3,37 mL/menit/1,73 m2 dalam setiap tahun. Palatini (2012) juga merekomendasikan pentingnya melakukan monitoring LFG pada pasien pre-diabetes dan pre-hipertensi. Pada studi longitudinal yang di follow up selama 6 tahun tersebut di dapatkan nilai LFG ≥ 150 mL/menit/1,73 m2, dan nilai LFG tersebut mengalami penurunan 1,34 mL/menit/1,73 m2 dalam setiap tahun. Kondisi tersebut dapat berrisiko pada kerusakan ginjal lebih lanjut atau ke arah PGK. Brenner et al. (1996) berpendapat bahwa kondisi HG jangka panjang (≥ 1 tahun) tanpa terapi penyebab penyakit dasarnya dapat menyebabkan stres
59
podosit dan kerusakan glomerulus ginjal yang mengakibatkan albuminuria, perubahan irreversibel struktur glomerulus, glomerulosklerosis, penurunan LFG hingga berakhir pada PGK. Keterbatasan penelitian ini adalah tidak mengukur nilai rujukan kadar F2IsoPs urin pada kelompok umur pediatri sehingga tidak diketahui kadar normal F2-IsoPs urin pada kelompok umur pediatri. Penelitian ini merupakan penelitian lokal di daerah Surakarta dan sekitarnya, sehingga diperlukan penelitian multicenter lanjutan.
60
DAFTAR PUSTAKA Ali B.A., Mahmoud A.M. 2014. Frequency of glomerular disfunction in children with beta thalassemia major. Sultan Qaboos Univ. Med J. 14(1):88-94. Anonim, 2010. Insert kit kreatinin ILab650. Anonim. 2014. 8-Isoprostane EIA Kit. Ann Arbor. Cayman Chemical. pp:1-36 Atmakusumah T.D., Setyaningsih I. 2009. Dasar-dasar talasemia: salah satu jenis hemoglobinopati. Dalam: Sudoyo A.W., Setiyohadi B., Alwi I., Simadibrata M., Setiati, S. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam. 5th ed. Jakarta, p: 16 Bakr A., Al-Tonbary Y., Osman G., El-Ashry R. 2014. Renal complications of β‒thalassemia major in children. Am J Blood Res. 41:1-6. Barasi M.E. 2009. Ilmu gizi. Jakarta: Penerbit Erlangga, pp:11-18 Basu S., Whiteman M., Mattey D.L., Halliwell B. 2001. Raised levels of F2-isoprostanes and prostaglandin F2 in different rheumatic diseases. Ann Rheum Dis. 60:627-631. Beutler E., Hoffbrand A.V., Cook J.D. 2003. Iron chelation therapy. Am Soc of Haem. pp: 40-61. Bhandari S., Galanello R. 2012. Renal aspects of thalassaemia a changing paradigm. Eur J Haematol. pp: 1‒11. Brenner B.M., Lawyer E.V., Mackenzie H.S. 1996. The hiperfiltration theory: a paradigm shift in nephrology. Kidney Int. 49:1774-1777. Cadenas E., Packer L. 2002. Quantification of Isoprostanes as Indicators of Oxidants Stress In Vivo. Handbook of Antioxidants. 2nd ed. California : Marcel Dekker, Inc, pp: 57-90. Carraro S., Cogo P.E., Isak I., Corradl M., Carniel V.P., Baraldi P. 2010. EIA and GC/MS analysis of 8-isoprostane in EBC of children with problematic asthma. Eur Respir J. 35: 1364–1369. Chiou S.S., Chang T.T., Tsai S.P. Jang R.C., Lin S.K., Lee S.C. Tsai S.M., Tsai L.Y. 2006. Lipid peroxidation and antioxidative status in β-thalassemia major patients with or without hepatitis C virus infection. Clin Chem. 44(10):1226-1233. Cirillo M. 2010. Evaluation of glomerular filtration rate and albuminuria/proteinuria. J Nephrol. 23 (02):125-132. Clajus C., Becker J.U., Stichtenoth D.O., Wortmann J., Schwarz A., Kielstein T. 2008. Acute kidney injury due to deferoxamine in a renal transplant patient. Nephrol Dial Transplant. 23:1061-1064. Cracowski J.K., Baguet J.P. 2003. Isoprostanes: Are they more than physiopathological biomarkers of lipid peroxidation?. Circulation. 107:222‒224. Comporti M., Signorini C., Arezzini B., Vecchio D., Monaco B., Gardi C. 2008. F2isoprostantes are not just markers of oxidative stress. Free Radic Bio Med. 44:247256. Cockcroft D.W. & Gault M.H. 1976. Prediction of creatinine clearance from serum creatinine. Nephrol. 16:31-41. Chonchol, M., Spiegel, D.M., 2005. The Patient with Chronic Kidney Disease. In: Schrier, R.W., 6th ed. Manual of Nephrology. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, pp:177-186. Cunningham M.J., Macklin E.A., Neufeld E.J., Cohen A.R. 2004. Complications of β thalassemia major in North America. Thalassemia Clinical Research Network. Blood. 104: 34‒39. Dahlan S. 2009. Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan. 4thed. Salemba Medika. Jakarta. pp: 195-218.
61
Dahlan M. S. 2010. Besar Sampel dan Cara Pengambilan Sampel dalam Penelitian Kedokteran dan Kesehatan. 3rd ed. Jakarta: Salemba Medika, pp: 68-76. Dalle-Donne I., Rossi R., Colombo R., Giustarini D., Milzani A. 2006. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin Chem. 52(4):601-623. Delanghe J.R., 2009. How to estimate GFR in children. Nephrol Dial Transplant. 24: 714-716. Depkes, 2008. Pedoman Praktik Laboratorium Kesehatan Yang Benar. DirJen Bina Pelayanan Penunjang Medik. Jakarta, pp:1-50. Deveci B., Kurtoglu A., Kurtoglu E., Salim O., Toptas T. 2016. Documentation of renal glomerular and tubular impairment and glomerular hyperfiltration in multitransfused patients with beta thalassemia. Annals of Haem. 95(3):375-381. Eckardt K., Bernhardt W.M., Weidemann A., Wernecke C., Rosenberger C., Wiesener W.S., Willam C. 2005. Role of hypoxia in the pathogenesis of renal disease. Kidney Int. 68: 46-51. Fathoni F, 2008. Studi Kadar SGPT, SGOT dan Total Protein Pada Serum Darah Anjing Kampung (Canis familiaris) Usia 3 dan 6 Bulan. Skripsi. Bogor. Institute Pertanian Bogor. p:33. Ficociello L.H., Bruce A., Bijan R., Janice M., Ann A., James H.,Andrzej S.K. 2009. Renal hyperfiltration and the development of microalbuminuria in type 1 diabetes. Diabetes Care. 32:889–893. Filler G, Priem F, Lepage N, Sinha P, Vollmer I, ClarkH. 2002. β -trace protein, cystatin C, 2 microglobulin, and creatinine compared detecting impaired glomerular filtration rates in children. Clin Chem. 48:729‒736. Gibson R.S. 2005. Principle of Nutritional Assesment. New York: Oxford University Press, pp:251-252. Gokce M., Kup H., Tugcu D., Salcloglu Z., Aydogan G., Akcay A., Akici F. 2014. Insidious renal damage in patients with thalassemia major: is it more serious than appreciated?. J Hematol Thrombo Dis. 2(6):1-4. Goswami K., Ghosh S., Bandyopadhyay M., Mukherjee K.L. 2005. Iron store and free radicals in thalassemia. Indian J Clin Biochem. 20(2):192-194. Greer J.P., Foerster J., Rodgers G.M., Paraskevas F., Glader B., Arber D.A., Means R.T.Jr. 2014. Wintrobe’s Clinical Hematology. 13th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, pp: 1096-1097. Hamed E.A., Elmelegy N.T., 2010. Renal function in pediatric patients with beta thalassemia major: relation to chelation therapy: original prospective study. IJP. 36(39):1-10. Hosen B. M., Karmokar N.C., Karim M.F., Mahmud R.A., Uddin M.M. 2015. Association of AST, ALT, ALB and total protein with beta-thalassemia in Bangladesh population. IJAR. 3(1):991-995. Il’yasofa D., Spasojevic I., Base K., Zhang H., Wang F., Young S.P., Millington D.S., et al. 2012. Urinary F2-Isoprostan as a biomarker of reduced risk of type 2 diabetes. Diabetes Care. 35:173–174. Janicka M., Kot-Wasik A., Kot J., Namieśnik J. 2010. Isoprostane’s biomarkers of lipid peroxidation: their utility in evaluating oxidative stress and analysis. IJMS. 11: 4631-4659. Kaplan L.A., Pesce A.J. 2010. Clinical Chemistry: Theory, Analysis, Correlation. 5th ed. St. Louis: Elsevier Mosby, pp: 597. Kaviarasan S., Muniandy S., Qvist R., Ismail I.S. 2009. F2-isoprostan as novel biomarkers for type 2 diabetes : a review. J. Clin Biochem. 45:1‒8.
62
Kidney Disease Improving Global Outcome (KDIGO), 2013. CKD Work Group. KDIGO 2012 clinical practice guideline for the evaluation and management of chronic kidney disease. Kidney Int Suppl. 3:1-150. Kishore R., Tabor E. 2010. EU regulations for clinical studies in pediatric patients. Regul Focus. 15(11): 39-44. Kelly K.J., Williams W.W. Jr., Colvin R.B., Bonventre J.V. 1994. Antibody to intercellular adhesion molecule 1 protects the kidney against ischemic injury. Proc Natl Acad Sci. 91:812-816. Koliakos G., Papachristou F., Koussi A., Perifanis V., Tsatra I.,Souliou E, et al. 2003. Urine biochemical markers of early renal dysfunction are associated with iron overload in beta thalassaemia. Clin Lab Haematol. 25:105–9. Koren G., Kochavi Y., Bentur Y., Olivieri N.F. 1991. The effect of subcutaneous deferoxamine administration on renal function in thalassemia major. Int J Hematol. 54: 371-375. Lamb E., Newman D.J, Price C.P. 2006. Kidney Function Test in Tietz Of Textbook Clinical Cemistry and Molecular Diagnosis. 4ed. Saunders Elsevier. Philadelpia, pp: 797-835. Langlois S., Jason C., Cithayat D. 2008. Carrier Screening for Thalassemia and Hemoglobinopathies in Canada. SOGC-CCMG Clinical Practice Guidlines. 218: 950-959. Larose J., Jullen P., Greffard K., Fraser W.D., Francois A., Wel S.Q., Bllodeau J.F. 2014. F2-Isoprostanes are correlated with trans fatty acids in the plasma of pregnant woment. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 91(6): 243–249. Levey A.S., Stevens L.A., Schmid C.H., Zhang Y., Castro A.F., Feldman H.I., Kusek J.W. 2009. A new equation to estimate glomerular filtration rate. Ann Int Med. 150:604-12. Malaki M., Sorkhabi R.S., Shoaran M., Shafighe B. 2011. Beta thalassemia Major : The effect of age on glomerular filtration rate. Saudi J Kidney Dis Transplant. 22(5):963-968. Majd Z., Haghpanah S., Ajami G.H., Matin S., Namazi H., Bardestani M., Karimi M. 2015. Serum ferritin level correlation with heart and liver MRI and LIC in patient with transfusion dependent thalassemia. Iran Red Crescent Med J. 17(4):1-4. Majid N., Amin M., Gholamhossein T., Marziyeh H., Narges S., Akbar D., Shadi T. 2013. Prevalence of alloimmunization against RBC antigens in thalassemia major patients in south east of ran. J Blood Disorders Transf. 4(4): 1-5. Martakusumah A.H. 2012. Formula baru untuk mengestimasi laju filtrasi glomerulus pada penderita penyakit ginjal kronik pradialisis [disertasi]. Jakarta: Universitas Indonesia. Matayatsuk C., Lee C.Y.J., Kalpravidh R.W., Sirankapracha P., Wilairat P., Fucharoen S., Halliwell B. 2007. Elevated F2-isoprostanes in thalassemic patients. Free Radic Biol Med. 43:1649-1655. Maxwell P. 2003. HIF-1: an oxygen response system with special relevance to the kidney. J Am Soc Nephrol .14: 2712-2722. Mazzachi B.C., Peake M.J., Ehardt V. 2000. Reference range and method comparison studies for enzymatic and Jaffe creatinine assays in plasma and serum and early morning urine. Clin Lab. 46:53-55. Michelakakis H., Dimitriou E., Georgakis H., Karabatsos F., Fragodimitri C., Saraphidou J. 1997. Iron overload and urinary lysosomal enzyme levels in beta-thalassaemia major. Eur J Pediatr. 156:602-604. Milatovic D., Aschner M. 2009. Measurement of isoprostanes as markers of oxidative
63
stress in neuronal tissue. Curr Protoc Toxicol. 39: 1‒12. Milo G., Nevo R.F., Pazgal I., Gvili A.G., Shpilberg O., Galter U., Erman A., et al. 2015. GFR in patient with β-thalassemia major. Clin J Am Soc Nephrol. 10: 1-7. Milne G.L., Musiek E.S., Morrow J.D. 2005. F2-Isoprostanes as markers of oxidative stress in vivo: An overview. Biomarkers. 10 (1):S10-S23. Montine T.J., Kaye J.A., Kathleen S.M., lynne M., Morrow J.D., Quinn J.F. 2001. Cerebrospinal fluid and F2-Isoprostan concentration in patients with Alzheimer disease, other dementias, and in age‒matched controls. Arch Pathol Lab Med. 125: 510‒512. Montuschi P., Barnes P.J., Roberts L.J. 2004. Isoprostanes: markers and mediators of oxidative stress. FASEB J. 18:1792-1800. Morrow J.D. 2005. Quantification of isoprostanes as indices of oxidant Stress and the risk of atherosclerosis in humans. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25:279-286. Nangaku M. 2006. Mechanism of tubulointerstitial injury in the kidney: final common pathway to end-stage renal failure. J Am Soc Nephrol.17:17-25. Nerpin E., Karlqvist J.H., Riserus U., Sundstrom J., Jobs E., Basu S., Ingelsson E. et al. 2012. Inflammation, oxidative stress, glomerular filtration rate, and albuminuria in elderly men: a cross-sectional study. BMC Research Notes. 5(537): 1−7. Niki E., Yoshida Y., Saito Y., Noguchi N. 2005. Lipid peroxidation: mechanisms, inhibition, and biological effects. Biochem Biophys Res Commun. 338:668-676. Pagana K.D., Pagana T.J. 2014. Mosby’s Manual of Diagnostic and Laboratory Tests. 5th ed. St. Louis: Elsevier Mosby, pp:39-40,47-49,119-121,246-247. Palatini P. 2012. Glomerular hyperfiltration: a marker of early renal damage in prediabetes and pre-hypertension. Nephrol Dial Transplant. 10: 1–7. Panit I. 2012. Hubungan antara Malondealdehyde dan eLFG pada DM tipe 2 di RSUPN dr Ciptomangunkusumo. Skripsi. FMIPA UI. Pierrat A., Gravier E., Saunders C., Caira M.V. 2003. Predicting GFR in children and adults: a comparison of the cockcroft and Gault, Schwartz, and Modification of Diet in RenalDisease formulas. Kidney Int. 58:259-63. Piga A., Fracchia S., Maria E.L., Maria D.C., Raimund H., Antje W., Forni G.L., et al., 2015. Deferasirox effect on renal haemodynamic parameters in patients with transfusion-dependent β thalassaemia. Br J Haematol. 168: 882–890. Pilacik B., Nofer T.W., Wasowics W. 2002. F2-Iisoprostan biomarkers of lipid peroxidation: their utility in evaluation of oxidative stress induced by toxic agent. Int J Occup Med Environ Health. 15(1):19‒27. Prasannan L., Flynn J.T., Levine J.E. 2003. Acute renal failure following deferoxamine overdose. Pediatr Nephrol.18 : 283–285. Price S.A dan Wilson. M.K. 2005. Patofisiologi : Konsep Klinis Proses-Proses Penyakit. (Brahm U, Pendit. Penerjemah). Jakarta. Penerbit Buku Kedokteran EGC, pp:1259‒1273. Qodariah. R.N, 2006. Analisis Fungsi Hati Dan Ginjal Manusia Dengan Photometer. Skripsi. Bogor. Institut Pertanian Bogor, pp: 40 Quinn C.T., Kim H.Y., Vogiatzi M.G., Johnson V.L., Trachtenberg F., Kwiatkowski J.L., Neufeld E.J., et al. 2011. Renal dysfunction in patients with thalassemia. Br J Haematol.153:111–117. Rachmilewitz E, Weizer-Stern O, Adamsky K. 2005. Role of iron inducing oxidative stres in thalassemia: can it be prevented by inhibition of absorption and by antioxidants? Ann N Y Acad Sci. 1054: 118-123. Rahman T., Hosen I., Islam T., Shekhar H.U. 2012. Oxidative stress and human health. Advances Biosci Biotech. 3:997-1019.
64
Raes A., Donckerwolcke R., Craen M., Hussein M.C., Vande Walle J. 2007. Renal hemodynamic changes and renal functional reserve in children with type I diabetes mellitus. Pediatr Nephrol. 22:1903–1909. Rodak B.F., Fritsma G.A., Keohane E.M. 2012. Hematology: Clinical Principles and Applications. 4th ed. Elsevier Saunders. St. Louis, pp:261-263,391-396. Rubin R., Strayer D.S. 2012. Rubin’s Pathology: Clinicopathologic Foundations of Medicine. 6th ed. Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. pp:18, 712-715. Ruggenenti P., Porrini E.L., Gaspari F., MOtterlini N., Cannata A., Carrara F., Cella C., et al. 2012. Glomerular hyperfiltration and renal disease progression in type 2 diabetes. Diabetes Care. 35:2061–2068. Rund D., Rachmilewitz E. 2005. β Thalassemia. N Engl J Med. 353: 1135‒1146. Sampson M.J., Gopaul N., Davies I.R., Hughes D.A., Carrier M.J. 2002. Plasma F2‒isoPs as direct evidence of increased free radical damage during acute hyperglycemia in type 2 diabetes. Diabetes care. 25(3):537-541. Sasson A.N., Cherney D.Z. 2012. Renal hyperfiltration related to diabetes mellitus and obesity in human disease. World J Diabetes. 3: 1–6. Satriana, 2008. Studi Kadar Ureum dan Kreatinin Serum Darah Anjing Kampung (Canis familiaris) Umur 3 dan 6 bulan. Skripsi. Bogor. Institut Pertanian Bogor, p: 23. Schwedhelm E., Boger R., Bartling A., Lenzen H., Tsikas D., Mass R., Brummer J., Gutzki F. M., Berger J., Frolich J. C. 2004. Urinary 8-isoprostaglandin-F2-IsoPs are as a risk marker in patients with coronary heart disease. Circulation. 109:843–848. Scott M.G. 2002. More accurate alternatives to serum creatinine for e valuating glomerular filtration rate. Clin Chem. 48:22-26. Selistre L., Hadj-Aissa A., Beyerle F., De Souza V., Cochat P., Ranchin B., Dolomanova O., et al. 2012. GFR Estimation in adolescents and young adults. J Am Soc Nephrol. 23: 989–996. Simsek F., Ozturk G., Kemahli S., Erbas D., Hasanoglu A. 2005. Oxidant and antioxidant status in beta thalassemia major patients. J Ankara Univ Faculty Med. 58:34-38. Smith K.A., Shepherd J., Wakil A., Kilpatrick E.S. 2011. A comparison of methods for the measurement of 8-isoPGF: a marker of oxidative stress. Ann Clin Biochem. 48:147-154. Srichairatanakool S., Fucharoen S. 2014. Antioxidants as complementary medication in talasemia. Dalam: Atroshi F. Pharmachology and Nutritional Intervention in the Treatment of Disease. Rijeka: InTech, pp:119-124. Stevens L.A., Coresh J., Greene T., Levey A.S. 2006. Assesing kidney function-measured and estimated glomerular filtration rate. N Eng J Med. 354:2473-2483. Stevens L.A, Levey A.S. 2009. Measured GFR as a confirmatory test for estimated GFR .Journal of the American society of nephrology. 20: 2305-2313. Sumboonnanonda A., Malasit P., Tanphaichitr V.S. 1998. Renal tubular function in betathalassemia. Pediatr Nephrol. 12:280–283. Suwitra K. 2010. Penyakit Ginjal Kronik. Dalam: Sudoyo A.W., Setiyohadi B., Alwi I., Simadibrata M., Setiati S. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam Jilid II. 5th ed. Pusat Penerbitan Ilmu Penyakit Dalam FKUI, Jakarta, pp:1035-1040. Tanaka T., Miyata T., Inagi R., Fujita T., Nangaku M. 2004. Hypoxia in renal disease with proteinuria and/or glomerular hypertension. Am J of Pathol. 165(6):19791990. Tsikas D., Schwedhelm E., Suchy M.T., Niemann J., Gutzki F.M., Erpenbeck V.J., Hohlfeld J.M., et al. 2003. Divergence in urinary 8-IsoP7GF2α(iPF2αIII, 15F2t‒IsoP) levels from GC-tandem MS quantification after thin-layer chromatography and immunoaffinity column chromatography reveals
65
heterogeneity of 8-IsoPGF2α. Possible methodological, mechanistic and clinical implications. J Chromatogr B. 794:237–255. Vigor C., Michel J.B., Pinot E., Oger C., Vercauteren J., Galano J.M., Durand T., et al. 2014. Non enzymatic lipid oxidation products in biological system: Assesment of the metabolites from polyunsaturated fatty acids. J of Chromatography B. 964:6578 Vinita B., Hrishikesh B., Sarika M., Sandip L. 2015. Oxidative stress in patients with β thalassemia major. Int J of Recent Trends in Sci Tech. 15(1): 65-67. Walter P.B., Fung E.B., Killilea D.W., Jiang Q., Hudes M., Madden J., Porter J., et al. 2006. Oxidative stress and inflammation in iron-overloaded patients with ßthalassemia or sickle cell disease. Br J. Haematol. 135:254–263. Wirawan R., Kusnandar S., Suherli A., Gatot D. 2003. Renal impairment in β thalassemic major patient receiving repeated blood transfusion. Med J Indones. 12(4): 215-223. Wong D.L., Eaton M.H., Wilson D., Winkelstein M.L., Schwartz P. 2008. Buku Ajar Keperawatan Pediatric. 6th Ed. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC, pp:166184. Yan W., Byrd G.D., Ogden M.D. 2007. Quantitation of isoprostane isomers in human urine from smokers and nonsmokers by LC-MS/MS. J Lipid Res. 48:1607–1617. Ziyadeh F.N., Musallam K.M., Mallat N.S., Mallat S., Jaber F., Mohamed A.A., Koussa S., et al. 2012. Glomerular hiperfiltration and proteinuria in transfusion-inependent patients with β-Thalassemia Intermedia. Nephron Clin Pract. 121: 136-143.
66
LAMPIRAN Lampiran 1. Data subyek penelitian No
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Berat Badan eLFG
F2-Isops Urin ng/mg
Jumlah transfusi (kolf)
0.55
204.8
0.577
20
3500
0.55
238.33
0.721
20
3500
0.70
434
3.468
60
10500
0.55
343.75
4.813
66
11500
0.55
401.5
3.832
86
15050
Nama Annisa Rahmawati
11
Febriana Anggraini
12
Farrel
9
Fihan Arnya Diaz P
15
Wahyu Mardaning
14
Lulu Septiara
11
P
0.2
120 cm
0.55
330
3.014
56
9800
Dimas Eka Prasetya
11
L
0.2
136 cm
27 kg
0.70
476
2.745
33
5775
Sindi Ainun Naimah
15
P
0.2
150 cm
35 kg
0.55
412.5
3.337
66
11500
Firai Galang Saputra
9
0.3
125 cm
19 kg
0.70
291.67
2.537
36
6300
Fatimah Azhari
10
0.3
118 cm
23 kg
0.55
216.33
1.919
24
4200
Alif Andrianto
17
0.5
163 cm
50 kg
0.70
228.2
2.014
34
5950
Habib Salim AS
15
0.4
139 cm
34 kg
0.70
243.2
2.884
38
6650
Zahrah Nur Itsnaini
13
0.3
137 cm
36 kg
0.55
220
1.654
60
10500
Salisah Al Hasanah
11
P
0.3
128 cm
27 kg
0.55
234.6
2.732
40
7000
Luthfia Hanif
17
P
0.2
160 cm
55 kg
0.55
376.75
2.773
34
5950
Yose Andhika Putra Roif Muammar Rizal
9
L
0.4
130 cm
26 kg
0.70
227.5
2.054
24
4200
L
0.3
136 cm
30 kg
0.70
317.33
2.232
40
7000
Iwan Nugroho
12
0.4
127 cm
46 kg
0.70
216.33
1.995
28
4900
Rizky Maulana
16
0.3
151 cm
24 kg
0.70
352.33
2.512
24
4200
Anwar Ramadhani
13
0.4
133 cm
35 kg
0.70
232.75
2.034
24
4200
Heri Joel Ricardo Naya Ailsya Florentina Nirwani Endah Budiani
8
0.4
117 cm
25 kg
0.70
204.75
0.633
20
3500
148 cm
22 kg
0.55
271.33
0.685
20
3500
148 cm
41,5 kg
0.55
271.33
0.331
20
3500
Gustiar Gaza
10
0.4
134 cm
30 kg
0.70
216.33
1.608
20
3500
Christian Aryaputra
6
0.2
109 cm
38 kg
0.70
296.33
2.178
30
5250
Annisa Nur Aini
13
0.3
138 cm
24 kg
0.55
253
3.485
64
11200
Gimda
17
L
0.2
150 cm
27 kg
0.70
469
3.419
68
11900
Muh. Bayu Prasetyo
18
L
0.3
157 cm
23 kg
0.70
366.33
4.186
76
13300
Umaira Dzakiyya
6
P
0.3
109 cm
37 kg
0.55
199.8
1.514
24
4200
Alfin Ulfadiana
15
0.2
154 cm
35 kg
0.55
423.5
2.999
56
9800
11
5 17
Sex P P L P P
L P L L P
L L L L
Kreatinin (mg/dl)
Tinggi Badan
Konstanta
0.3
125 cm
24 kg
0.3
130 cm
27 kg
0.2
124 cm
23 kg
0.2
149 cm
37 kg
0.2
146 cm
35 kg 20 kg
Volume transfusi (cc)
Umur (th)
P
0.3
P
0.3
L L P
P
67
Lampiran 2. Hasil Perhitungan statistik HASIL STATISTIK Data karakteristik subyek penelitian
Hasil Uji Normalitas pada data yang terdistribusi tidak normal setelah dilakukan transformasi log 10.
68
69
70
Lampiran 3. Hasil pemeriksaan F2-IsoPs urin
HASIL PEMERIKSAAN Urine 8-Isoprostane EIA Jakarta, 03 Juni 2016
Nama
8-Isoprostane (pg/mg)
NO
No Lab
1
1604290101
Fihan Anya
481.3
2 3
1604290105
Farel
1604290106
Febriana Anggraini
346.8 72.1
4
1604290109
Wahyu Mardaning
383.2
5
1604290110
Anisa R
6 7
1604290120
Lulu Septiara
1604290123
Luthfia Hanif
301.4 277.3
8
1604290125
Salisah Al Khasanah
273.2
9
1604290130
Zahra Nur I
165.4
10
1604290132
Heri Joel Ricardo
11
1604290135
Habib Salim A.S
288.4
12
Anwar Ramadhani Rizky Maulana
203.4
13
1604290138 1604290140
14
1604290142
Fatimah Azhari
191.9
15
1604290147
Alif Andriyanto
201.4
16
Iwan Nugroho Sindi Ainun
199.5
17
1604290150 1604290153
18
1604290155
Dimas Eko P
274.5
19 20
1604290157
Firai Galang S
21
1604290164 1604290169
Roif Muammar R Yose Andhika P
253.7 223.2
22
1605030155
Gustiar Gaza
23 24
1605030156
Naya Ailsya Florentina
25
1605030159 1605030168
Nirwani Endah Budiarti Ginda Ali Mahmudi
341.9
26
1605030172
Annisa Nur Aini
348.5
27 28
1605030174
Muh. Bayu P
1605030175
Christian A
418.6 217.8
29
1605030178
Umaira D
151.4
30
1605030201
Alfin Ulfadiana
299.9
57.7
63.3
251.2
333.7
205.4 160.8 68.5 33.1
71
Catatan: - Sampel yang digunakan adalah urine manusia. - Reagen kit yang digunakan adalah 8-Isoprostane EIA Cayman (Cayman Chemical Company, MI, USA) Cat: 516351, Lot: 0480107, ED: 23.02.2017. - Pengukuran menggunakan alat Microplate Reader Biorad Model 680 (Bio-Rad Laboratories Inc., CA, USA) dengan software Miroplate Manager ver 5.2.1 (Bio-Rad Laboratories Inc., CA, USA) - Rentang Kalibrasi adalah 0.8 - 500 pg/mL, Limit deteksi : 2.7 pg/mL - Hasil ekstrapolasi adalah hasil di luar rentang standard kalibrasi - Faktor pengenceran:0.5 X. Hasil sudah dikalikan dengan faktor pengenceran. - Kit yang digunakan adalah kit khusus untuk penelitian (for research use only, not for use in diagnostic or therapeutic procedures).
72
Lampiran 4. Hasil QC kreatinin serum
Grafik Levey-Jennings kreatinin serum 1,6 1,4 1,2 1
kreatinin
0,8
2SD+
0,6
2SDrerata
0,4 0,2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920
73
Lampiran 5
PENJELASAN PENELITIAN
Judul Penelitian : Korelasi kadar F2‒Isoprostan urin dengan estimasi laju filtrasi glomerulus pada pasien TBM” Saya Sri Hadiati mahasiswi Program Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Klinik FK UNS/RSDM NIM S931302002, bermaksud melakukan penelitian untuk mengetahui korelasi kadar F2‒Isoprostan urin dengan estimasi laju filtrasi glomerulus pada pasien TBM”. Prosedur penelitian yang akan dilakukan adalah mengisi kuesioner yang akan dilakukan oleh bapak/ibu/ananda, yang berisi pertanyaan mengenai biodata dan pengisian kuesioner kualitas hidup. Hasil dari penelitian ini akan dimanfaatkan untuk meningkatkan mutu pelayanan keperawatan di masa yang akan datang terutama dalam asuhan keperawatan pada pasien talasemia. Peneliti akan menghargai dan menjunjung tinggi hak pasien sebagai responden, penelitian akan dihentikan apabila pasien mengalami penurunan kondisi atau keadaan yang tidak memungkinkan untuk dilanjutkan penelitian. Peneliti juga akan menjamin kerahasiaan identitas dan data yang diberikan. Responden dapat mengundurkan diri sewaktu-waktu apabila menghendakinya. Melalui penjelasan singkat ini peneliti sangat mengharapkan partisipasi bapak/ibu/ananda untuk berperan serta dalam penelitian ini. Atas kesediaan dan partisipasinya, peneliti ucapkan terima kasih.
Surakarta, Mei 2016 Peneliti,
Sri Hadiati
74
Lampiran 6 SURAT PERNYATAAN BERSEDIA BERPARTISIPASI SEBAGAI RESPONDEN PENELITIAN
Yang bertanda tangan di bawah ini saya : Nama
:
Umur
:
Alamat
:
_/ Orang tua/wali dari..................................
Saya telah membaca surat permohonan dan mendapatkan penjelasan tentang penelitian yang akan dilakukan oleh saudara Sri Hadiati, Mahasiswi Program Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Klinik FK UNS/RSDM di Surakarta dengan judul “Korelasi kadar F2‒Isoprostan urin dengan estimasi laju filtrasi glomerulus pada pasien TBM” Saya telah mengerti dan memahami tujuan, manfaat serta dampak yang mungkin terjadi dari penelitian yang akan dilakukan. Saya mengerti dan yakin bahwa peneliti akan menghormati hak-hak saya dan menjaga kerahasiaan saya sebagai responden penelitian, sehingga dengan penuh kesadaran dan tanpa paksaan dari pihak manapun, saya memutuskan untuk besedia : 1. Meluangkan waktu untuk mengisi kuesioner sesuai kebutuhan Penelitian dan memberikan informasi yang jujur dan benar sesuai keadaan demi kelancaran penelitian 2. Memberi ijin dilakukan pengambilan sampel darah dan urin kepada ananda sebagaimana tersebut diatas untuk keperluan penelitian Demikian surat pernyataan sebagaimana mestinya. Mengetahui Peneliti
Sri Hadiati
ini saya
buat,
untuk
dapat
dipergunakan
Surakarta, Mei 2011 Yang membuat pernyataan,
Nama & Tanda tangan
75
Lampiran 7 Data Isian Subyek Penelitian KORELASI KADAR F2‒ISOPROSTAN URIN DENGAN ESTIMASI LAJU FILTRASI GLOMERULUS PADA TBM” Nama Pasien Tanggal Lahir / Umur Pasien Jenis Kelamin Pasien Nomor Rekam Media Alamat Pasien Pendidikan Pasien Pekerjaan Pasien Nama Pemberi Informasi Tinggi / Berat Badan Pasien
: : : : : : : : :
1. Sejak kapan pasien dinyatakan mempunyai penyakit TBM? Tahun? 2. Apakah pasien mempunyai penyakit selain TBM, seperti penyakit hati/liver, ginjal, kencing manis, asma, alergi? 3. Apakah kondisi pasien saat ini sedang sehat?tidak panas/batuk pilek? 4. Sejak kapan pasien mendapat terapi transfusi darah (infus tambah darah)? 5. Seberapa sering mendapat transfusi? (berapa kali sebulan) 6. Pasien anak ke berapa? 7. Apakah ada saudara kandung / keluarga yang mempunyai TBM ? 8. Apakah pasien mendapat terapi khelasi besi / obat untuk kelebihan besi? 9. Apakah pasien mendapat terapi obat golongan AINS seperti ibuprofen, paracetamol, ketoprofen dll? 10. Apakah pasien merasa perutnya sebah / membesar / penuh? 11. Apa saja keluhan/gejala yang dialami pasien? 12. Apakah pernah operasi pengangkatan limpa? 13. Apakah pasien merokok? Tanda Tangan Pemberi Informasi, Surakarta, ………Mei 2016
( Sri Hadiati )
76
Lampiran 8. Kelaikan Etik (Ethical Clearance)
77
Lampiran 9. Dokumentasi penelitian
