Korelační funkce dělohy u hrachu (Pisum sativum L.)

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

Korelační funkce dělohy u hrachu (Pisum sativum L.)

Brno 2010

Vypracovala:

Ing. Zuzana Kubíková (Mikušová)

Vedoucí disertační práce:

Prof. RNDr. Jan Hradilík, CSc.

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma „Korelační funkce dělohy u hrachu (Pisum sativum L.)” vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu citované literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.

V Brně 25.6.2010 Podpis ...................................

Poděkování Děkuji svému školiteli Prof. RNDr. Janu Hradilíkovi, CSc. za odborné vedení. Děkuji rovněž Ing. Heleně Fišerové, PhD., RNDr. Ing. Marku Klemšovi, PhD., Ing. Zdeňce Slámové a Ing. Kalouskovi za pomoc a rady při praktické realizaci některých experimentů. Osivo experimentální odrůdy Viktoria 75 pocházelo z kolekce genových zdrojů rodu Pisum, vedené ve společnosti Agritec Šumperk. Osivo odrůdy Baryton bylo věnováno firmou Saaten-Union.

Summary The aim of this work was to study influence of different factors on growth of the pea (Pisum sativum L.) seedlings cotyledonary buds. The influence of variety and different treatments of cotyledon were observed. The changes in ethylene, ethane and CO2 production and changes in cytokinin, abscisic acid and 1-aminocyclopropane-1carboxylic acid content in cotyledonary buds and their connection with cotyledon treatment were studied. The graft experiments and experiments aimed at growth activity of detached cotyledons were realized too. Some knowledge about cotyledon morphology was completed. Four days old seedlings were used in experiments. They were planted on seed germinator in dark, in 20°C±2°C temperature and 90% air humidity. The growth of cotylars and roots was evaluated seven days after cotyledon treatment. The samples for cytokinin (zeatin, dihydrozeatin, isopentenyladenine, benzyladenine and meta-topolin), abscisic acid and 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid content assays were taken away three days after cotyledon treatment. Ethylene, ethane and CO2 production was established by gas chromatography 1, 2, 3, 4, 24, 48 and 72 ours after treatment. For assessment of cytokinin content was used ELISA (Ensyme Linked ImmunoSorbent Assay). For assessment of abscisic acid content was used RIA (Radioimmunoassy). For assessment of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid content was used gas chromatography method. It was shown, that influence of the variety on percentage portion of the cotylars growing in the axil kept or removed cotyledon or at the both cotyledons is not considerable, but the influence on root and cotylars length was confirmed. The influence of the cotyledon reduction was confirmed too. It was found, that the influence of the cotyledon growing above removing cotyledon is changed for the benefit of the cotylars growing above keeping cotyledon with size of keeping part of the cotyledon. Frequency of the cotyledonary buds growth was changed in plants with the cut in cotyledon closely below a petiole. The graft experiments showed that both epicotyl and cotyledon grafted into cotyledon inhibit their cotylars, but mechanism of inhibition is probably different. The growth activity of cotyledons was relatively high and depended on the time of axe removal. The cotyledon treatment (reduction or cutting) did not influence CO2 production. The cotyledon reduction markedly influenced ethylene and ethane production, which was increased. Cuts in cotyledons did not have high influence

to ethylene and ethane production. The ACC content in cotylars was not significantly influenced by cotyledon reduction. The total cytokinin content was the highest in decapitated seedlings with intact cotyledon. The total cytokinin content was constricted by influence of cotyledon reduction. The most marked reduction of cytokinin content occurred in bud above kept cotyledon of seedling with removed cotyledon. The ABA content was not very high in buds of plants with intact cotyledons, bud increased in both buds of plants

Obsah Summary ...................................................................................................... 4 1. Úvod.......................................................................................................... 8 2. Literární přehled................................................................................... 10 2.1. Vývoj a morfologie klíční rostliny hrachu........................................................ 10 2.1.1. Vývoj semene hrachu..................................................................................... 10 2.1.2. Klíčení a vývoj klíční rostliny........................................................................ 13 2.2. Růstové korelace ................................................................................................. 18 2.2.1. Růstové regulátory ......................................................................................... 18 2.2.1.1. Etylén....................................................................................................................19 2.2.1.2. Cytokininy ............................................................................................................24 2.2.1.3. Kyselina abscisová ...............................................................................................28

2.2.2. Další látky ovlivňující růst ............................................................................. 32 2.2.3. Apikální dominance u hrachu ........................................................................ 33 2.2.4. Korelace mezi dělohou a jejími úžlabními pupeny........................................ 36

3. Cíl práce ................................................................................................. 39 4. Materiál a metodika .............................................................................. 40 4.1. Materiál ............................................................................................................... 40 4.2. Podmínky pěstování etiolovaných klíčních rostlin hrachu............................. 40 4.3. Způsoby ošetření klíčních rostlin hrachu......................................................... 42 4.4. Podmínky kultivace izolovaných děloh ............................................................ 46 4.5. Stanovení růstových regulátorů a dalších látek............................................... 46 4.5.1. Odběry vzorků................................................................................................ 46 4.5.2. Stanovení produkce etylénu, etanu a CO2 klíčními rostlinami hrachu........... 47 4.5.3. Stanovení obsahu ACC .................................................................................. 48 4.5.4. Stanovení obsahu cytokininů ......................................................................... 49 4.5.5. Stanovení obsahu ABA .................................................................................. 50 4.6. Příprava mikroskopických preparátů .............................................................. 51 4.6.1. Odběr a příprava rostlinného materiálu.......................................................... 51 4.6.2. Převod do parafínu ......................................................................................... 51 4.6.3. Řezání............................................................................................................. 51 4.6.4. Odparafínování řezů, barvení a uzavření ....................................................... 52

5. Výsledky ................................................................................................. 53 5.1. Morfologie dělohy hrachu.................................................................................. 53 5.2. Korelace mezi dělohou a jejím úžlabním pupenem......................................... 55 5.2.1. Vliv odrůdy .................................................................................................... 55 5.2.1.1. Ovlivnění délky kotylárů a kořene........................................................................55 5.2.1.2. Ovlivnění frekvence prorůstání kotylárů..............................................................58

5.2.2. Vliv zásahů do klíční rostliny hrachu............................................................. 59 5.2.2.1. Vliv redukce dělohy ..............................................................................................59 5.2.2.2. Vliv zářezů do dělohy ...........................................................................................62

5.2.3. Vliv transplantací různých částí rostlin do dělohy......................................... 64

5.2.3.1. Vliv transplantace epikotylu.................................................................................64 5.2.3.2. Vliv transplantace dělohy.....................................................................................66

5.3. Růstová aktivita izolovaných děloh .................................................................. 66 5.4. Změny v obsahu a produkci růstových a jiných látek v souvislosti se zásahy do klíční rostliny................................................................................................ 67 5.4.1. Změny v produkci etylénu, etanu a CO2 ........................................................ 67 5.4.2. Rozložení ACC ve čtyřdenní rostlině hrachu................................................. 72 5.4.3. Změny v obsahu ACC v děložních pupenech ................................................ 73 5.4.4. Rozložení cytokininů ve čtyřdenní rostlině hrachu........................................ 74 5.4.5. Změny v obsahu cytokininů v děložních pupenech ....................................... 77 5.4.6. Rozdělení ABA ve čtyřdenní rostlině hrachu ................................................ 80 5.4.7. Změny v obsahu ABA v děložních pupenech................................................ 81

6. Závěry..................................................................................................... 83 7. Literární přehled................................................................................... 86 Seznam zkratek ....................................................................................... 101 Anotace..................................................................................................... 103

1. Úvod Rostliny jsou klíčovými organismy pro celý ekosystém naší planety. I když možná nebyly prvními organismy, který se na Zemi vyvinul, od jejich vzniku se odvíjel vývoj takového „života“, jak jej známe dnes. Dokážou přeměňovat energii slunečního záření do makroenergetických chemických vazeb, dokážou z minerálních látek vytvářet látky organické, produkují kyslík a podílejí se na vzniku půdy. Tvoří základnu pyramidy potravního řetězce a jsou tak zprostředkovaně zdrojem potravy pro téměř všechny ostatní živé organismy. Je proto velmi důležité získávat o rostlinách stále nové a nové poznatky, které by následně umožnily lepší poznání jejich morfologie a pochopení jejich životních procesů, zejména pak procesu růstu a vývoje. Jednotlivé části intaktních rostlin jsou ve specifických vzájemných vztazích, které nazýváme korelace rostlinného růstu. Jsou základním projevem celistvosti (integrity) rostlin. Rostoucí části rostliny jsou na sobě závislé a změna jedné části působí na jinou část rostliny. Jedním z přístupů ke studiu celistvosti rostlin je experimentální morfologie rostlin, disciplína zabývající se studiem tvaru rostlin pomocí pokusů, jejímž cílem je určit všechny faktory ovlivňující tvar rostliny. V této disciplíně nejde ani tak o přímé zemědělské využití (například výzkum vlivu poškozené dělohy na výnos apod.), ale o prohloubení znalostí o celistvosti rostlin. Nejpodrobněji studovaná růstová korelace je, vzhledem ke svému významu pro regulaci větvení rostlin, apikální dominance tj. růstová nadvláda vrcholu lodyhy nad postranními

pupeny,

popř.

nadvláda

kořene

nad

postranními

kořeny.

K nejvýznamnějším modelům pro výzkum apikální dominance patří klíční rostliny hrachu setého (Pisum sativum L.). U těch však do korelací vstupuje také vliv děloh – hypogeické dělohy hrachu mají na růst svých úžlabních pupenů inhibiční vliv, jak v roce 1908 zjistil prof. Dostál. To znamená, že u klíčních rostlin hrachu zbavených epikotylu (růstového vrcholu) a jedné dělohy dochází k iniciaci růstu úžlabního pupene odstraněné dělohy. Příčiny tohoto jevu byly zkoumány v mnoha pracích (Šebánek 1971, 1972, Hradilík 1976, Šebánek a kol. 1988, Tan 1980, Klíčová a kol. 2004), avšak zatím nebyly uspokojivě objasněny. Předpokládá se, že korelačně zábranný vliv dělohy souvisí s obsahem inhibitorů v dělohách. V této práci byly na rozšířeném Dostálově modelu (intaktní rostlina - dekapitovaná rostlina - dekapitovaná rostlina s částečně redukovanou dělohou - dekapitovaná rostlina s téměř úplně odstraněnou dělohou) studovány růstové korelace mezi dělohou a jejím

8

úžlabním pupenem. Pro lepší pochopení vlivu dělohy na růst úžlabních pupenů bylo nutné doplnit některé poznatky o její morfologii, zejména vedení svazků cévních uvnitř dělohy. Pomocí metod experimentální morfologie pak byl zkoumán vliv různých faktorů na růst děložních pupenů: vliv odrůdy, vliv různého poškození dělohy (vliv redukce dělohy a vliv různě směrovaných zářezů do dělohy) a vliv transplantací různých částí rostlin do dělohy. Byly sledovány nejen morfologické projevy rostliny, ale také změny v obsahu a produkci fytohormonů (etylénu, cytokininů a kyseliny abscisové) některých jiných látek ovlivňujících růst (CO2, etan) v souvislosti s těmito zásahy.

9

2. Literární přehled 2.1. Vývoj a morfologie klíční rostliny hrachu 2.1.1. Vývoj semene hrachu Podle Maheshwariova třídění (Maheshwari 1950) se vývoj embrya hrachu řadí k typu Solanad. První dělení začíná v zygotě, která se příčně rozdělí na dvě buňky. Apikální buňka je menší a dává vznik klíčním listům, plumule a hypokotylu. Z bazální buňky vzniká suspenzor, který navazuje na stěnu zárodečného vaku a v prvních fázích vývoje embrya zprostředkovává jeho výživu. Při vývoji embrya lze rozlišit několik vývojových fází. V lineární fázi se diferencuje suspenzor. V globulární a srdčité fázi dochází k organogenezi a morfogenezi. A další fáze (torpédovitá, kotyledonární) zahrnují ranný až pozdní vývoj děloh. Jako mnoho druhů leguminóz má hrách semena bez endospermu. Dělohy během vývoje zcela absorbují zásoby endospermu a ve zralém semeni je proto embryo obaleno pouze testou (Finch-Savage a Leubner-Metzger 2006). Embryo hrachu má, podobně jako embryo živočichů, pouze jedinou rovinu souměrnosti a proto byl pro popis jeho morfologie přijat dorzo-ventrální koncept z embryologie živočichů (Liu a kol. 1999). Ventrální strana je ta, kde je situován apikální meristém a dorzální strana ta, kde jsou situovány dělohy. Osa souměrnosti potom probíhá napříč spojením těchto dvou děloh a napříč stonkovým apexem (Obrázek č. 1). V embryích luskovin, jako jsou bob nebo hrách, jsou dělohy přeměněny na vysoce specializované zásobní orgány. K diferenciaci dochází postupně. Začíná ve vnitřní adaxiální části a postupuje k vnějším vrstvám. Protože diferenciace postupuje ve vlnách, představují dělohy po většinu svého vývoje heterogenní populaci buněk různého fyziologického věku. Vývoj děloh začíná v pozdní globulární fázi ze dvou shluků buněk v horní části globulárního embrya. Protoderm hrachu vzniká až po iniciaci děloh a vytváří jednu vrstvu buněk epidermis pokrývající nově vzniklé dělohy (Liu a kol. 1999). Kořenový meristém se zakládá později v srdčité fázi. Během dokončení morfogeneze a organogeneze se adaxiální epidermální buňky také mění na transferové buňky, které se od běžných epidermálních buněk obdélníkového tvaru liší charakteristickými prstovitými výběžky, které zvětšují povrch plazmatické membrány a zprostředkovávají efektivní transport roztoků na krátké vzdálenosti a také chrání semeno před vniknutím patogenů (Thompson a kol. 2001). Mladé dělohy jsou vysoce mitoticky aktivní. Později se vnitřní buňky zvětšují, ale ve vnějších buňkách pod epidermálními transferovými

10

buňkami je stále udržována mitotická aktivita a přidávají dovnitř další buňky (Hauxwell a kol. 1990, Borisjuk a kol. 1995). Vývoj semen leguminóz je úzce spjat s metabolismem a transportem živin. Rostoucí embrya se na počátku dozrávání stávají silným sinkem aktivně importujícím asimiláty z podpůrných mateřských pletiv přes apoplast. Jejich vývoj je velkou měrou kontrolován na metabolické úrovni. Hlavními živinami importovanými do vyvíjejících se děloh jsou cukry, hlavně sacharóza, která se zřejmě také významně podílí na regulaci jejich vývoje (Wobus a Weber 1999a, b). Přítomnost sacharózy je nezbytná pro indukci diferenciace spojené s tvorbou zásobních orgánů. Hladinou sacharózy a dalších cukrů je regulována diferenciace transferových buněk (Wardini a kol. 2007) a také představuje signál, který aktivuje ukončení mitózy a zvětšování buněk před dozráním. Přechod do fáze dozrávání je doprovázeno ukládáním škrobu a snížením koncentrace cukrů (Borisjuk a kol. 1998). Během vývoje semen leguminóz je v dělohách akumulováno také velké množství proteinů, a proto jsou dalšími důležitými transportovanými látkami aminokyseliny. Jsou importovány přes svazky floému přes poutko a testu. K vydávání aminokyselin z testy dochází mechanismem usnadněného membránového transportu pravděpodobně přes neselektivní póry (De Jong a kol. 1997) a uvolněné živiny jsou vyvíjejícími se embryi odebírány z apoplastu. V testě a dělohách, zejména v transferových buňkách epidermis, jsou také přítomny přenašeče aminokyselin a peptidů, což svědčí o jejich aktivním transportu (Tegeder a kol. 2000, Miranda a kol. 2003). Hlavními zásobními proteiny akumulovanými v dělohách hrachu jsou legumin a dvě frakce vicilinu (vicilin a convicilin). Jsou syntetizovány v endoplazmatickém retikulu a golgiho aparátu a ukládány v proteinových zásobních vakuolách (Hoh a kol. 1995), které vytváří proteinová tělíska. Vicilinové frakce se ve srovnání s leguminem akumulují rychleji v rannějších fázích vývoje a úrovně mRNA pro legumin a vicilin se snižují a zvyšují v souladu s rychlostí syntézy příslušných proteinů, což naznačuje regulaci této syntézy na transkripční úrovni (Gatehouse a kol. 1982). Během vývoje jsou syntetizovány také látky regulační povahy, které jsou důležitými vnitřními faktory embryogeneze. Auxiny mají velký význam pro polaritu embrya (Vogler a Kuhlemeier 2003). Exogenně aplikované cytokininy napomáhají zakládání plodů a podporují jejich ranný vývoj. Vyšší hladiny cytokininů se v semeni vyskytují během ranné endospermální fáze. V nejrannějších fázích vývoje jsou přítomny hlavně v suspenzoru a teprve později (kotyledonární fáze) se začínají vytvářet také v embryu (Lorenzi a kol. 1978). V semenech lupiny se obsah cytokininů v semeni 11

zvyšuje hlavně v endopermu a v testě (Emery a kol. 2000), kde jsou pravděpodobně syntetizovány. S vývojem děloh obsah cytokininů v semenech postupně klesá. Hladina cytokininů v semeni může kolísat vlivem různých faktorů (zásobování rostlin vodou ap.), ale složení se výrazně nemění a převažují cis-formy cytokininů (Emery a kol. 1998a), což je pravděpodobně spojeno s jejich schopností zvyšovat sílu sinku. ABA reguluje dozrávání embrya a ukládání zásobních látek. Během počátečního vývoje semen hrachu je hladina ABA zřejmě regulována gibereliny, a její přílišné zvýšení může vést k aborci semen (Batge a kol. 1999). V pozdějších fázích vývoje dochází v semeni fazolu k nárůstu obsahu ABA v embryu, a to zejména v dělohách (Prévost a Le Page-Degivry 1985). U hrachu se během embryogeneze obsah ABA zvyšuje ve dvou vlnách, nejprve v období rozvoje testy a následně pak v období rychlého růstu embrya a zvětšování děloh (Wang a kol. 1987). V semenech bobu ABA kontroluje aktivitu invertáz a tím ovlivňuje koncentraci a složení sacharidů v pletivech. Předpokládá se, že má také velký význam pro ukládání zásobních proteinů v semeni (Solnická 2008). Může zvyšovat příjem cukrů dělohami embrya (Shussler a kol. 1984). Během dozrávání semen se akumuluje ACC jako zásoba pro tvorbu etylénu, který významně ovlivňuje klíčení semen. U Brassica napus se podílí na regulaci tvaru a velikosti děloh (Hays a kol. 2000). Ukládání zásobních látek a syntetické procesy končí v období desikace semene, kdy dochází k vysušení semene a k přípravě na ukončení životního cyklu rostliny. Pro desikační toleranci (schopnost pletiv přežít vysušení) mají velký význam tzv. LEA proteiny (late embryogenesis abundant) (Grelet a kol. 2005) a také ABA, která reguluje expresi genů těchto proteinů a dalších genů, kódujících proteiny významné pro dehydrataci (Siejo a Ramos 1999).

Obrázek č. 1. Znázornění embrya hrachu (kotyledonární fáze) z ventrální strany (nalevo) a z hora (napravo) (upraveno Liu a kol.1999) 12

2.1.2. Klíčení a vývoj klíční rostliny Morfologie dělohy a vývoj cévních svazků Smith (1983) rozlišil tři hlavní typy anatomie děloh u Leguminosae: listový, přechodný a zásobní. Dělohy hrachu patří k typu zásobnímu. Zralá děloha se skládá z několika rozdílných typů pletiv. Na povrchu je ohraničená epidermis. Pod epidermis je jedna vrstva buněk tvořících hypodermis. Zásobní parenchym vyplňuje dělohu a zahrnuje dvě odlišné zóny, které se liší tvarem a velikostí buněk. Buňky vnější zóny, která leží pod abaxiálním povrchem a odpovídá houbovitému parenchymu listu, jsou větší a mají protáhlý nepravidelný tvar. Buňky vnitřní zóny, která leží pod adaxiálním povrchem a odpovídá palisádovému parenchymu, jsou menší a mají okrouhlý tvar. Buňky

obou

pletiv

jsou

hustě,

ale

nepravidelně

uspořádány,

s malými

trojúhelníkovitými mezibuněčnými prostory. Během klíčení se velikost mezibuněčných prostor zvětšuje a spojením malých zpočátku přítomných mezibuněčných prostorů vznikají větší nepravidelné mezibuněčné prostory. Tím vzniká složitá síť více méně tubulárních prostorů, které prostupují celé pletivo. Buněčné stěny jsou tenké a nelignifikované. Jádra obou typů buněk jsou rozostřená a více méně kulovitá s viditelnými jadérky. Všechny buňky obsahují velká škrobová zrna a malá proteinová tělíska (Smith a Flinn 1967). V zásobních

pletivech

jsou

roztroušeny

buňky,

které

se

od

většiny

parenchymatických buněk odlišují tím že mají matnou, jemně granulární cytoplasmu a obsahují více cytoplasmatické RNA. Jejich četnost stoupá směrem k okraji, kde pod hypodermis vytvářejí téměř souvislou vrstvu (Smith a Flinn 1967). Podobné buňky v dělohách P. sativum popsali Bain a Mercer (1966a). Dělohy mají velmi dobře vyvinutý vaskulární systém, který probíhá více méně na hranicích mezi vnější a vnitřní zónou. Dva vaskulární pruhy vstupují na bázi dělohy z embryonální osy. Větší z nich se v řapíku větví a obě větve se dále ještě rozdvojují, takže se vytvářejí čtyři hlavní žilky. Menší cévní svazek vstupující do dělohy vytváří pátou žilku. Větvení a anastomózy vytváří z těchto pěti žilek síťnatou žilnatinu (Obrázek č. 2). Dospělé embryo obsahuje výhradně prokambium a nebyly v něm detekovány žádné dospělé elementy xylému nebo floému. K diferenciaci vodivých pletiv z prokambia dochází během prvních dvou dní klíčení. První se (asi po 12 hodinách) diferencují buňky protofloému hlavní žilky v bazální oblasti dělohy a krátce poté se

13

diferencují i buňky menší žilky. K diferenciaci floému dochází přísně akropetálně od bazální oblasti dělohy. Protoxylém se začíná vyvíjet asi o čtyři hodiny později. Diferenciace xylému v hlavních žilkách je také akropetální, ale přinejmenším v některých větvích protoxylém dozrával v určité malé vzdálenosti od hlavní žilky a následně docházelo k diferenciaci ve směru jak od tak ke hlavní žilce. Po dvou dnech klíčení jsou cévní svazky plně diferencovány. Elementů xylému bývá v cévním svazku méně než elementů floému a celý svazek je obklopen parenchymatickou pochvou (Smith a Flinn 1967).

Obrázek č. 2. Žilnatina v dělohách hrachu (Smith a Flinn 1967).

Změny v dělohách během klíčení a počátečního růstu Klíčení začíná intenzivním příjmem vody a za ukončené jej považujeme v okamžiku, kdy radikula prorazí testu, a kdy také začíná růst klíční rostliny. Během klíčení a počátečního růstu dochází k mnoha změnám. Jádra čtyř hlavních zón pletiv vykazují značné změny ve velikosti a tvaru. Jádra epidermálních buněk jsou zpočátku podlouhlá nebo vejčitá a postupně se mírně zvětšují a stávají se vejčitá nebo kulovitá. V hypodermis jsou kulovitá mírně nepravidelná a mají výrazně ohraničená kulovitá jadérka, která během klíčení postupně vymizí (Smith 1971). Velikost jader v zásobních pletivech je úměrná velikosti buněk. Ve vnější zóně zásobních pletiv jsou menší a méně nepravidelná než ve vnitřní zóně. V obou zónách se jádra parenchymatických buněk silně zvětšují a stávají výrazně laločnatými, což souvisí s tím že se v prvních několika

14

dnech výrazně zvyšuje ploidie jader a tím i obsah DNA a to více ve vnitřní zóně (Smith 1971, Marks a da Vies 1979). Poté dochází k postupnému poklesu obsahu DNA. Změny v obsahu histonů kopírují změny v obsahu DNA. Změny v obsahu jaderné RNA úzce korelují se zahájením čerpání zásobních látek, kdy je v dané buňce obsah RNA nejvyšší a pak se postupně s vyčerpáváním zásob snižuje. Obsah cytoplasmatické RNA se v dělohách od začátku klíčení snižuje (Smith 1971). Proteinová tělíska náleží k systému vakuol a jsou v nich uloženy zásobní proteiny (Müntz 1998). V zásobním parenchymu buněk se během prvních dvou dní klíčení zvětšují přinejmenším na dvojnásobek původní velikosti, následně se spojují a vytváří větší shluky proteinových tělísek (Smith a Flinn 1967, Diaz a kol. 1993). Nakonec se velké shluky tělísek rozpadají a vytváří malá, nepravidelná tělíska, která posléze mizí. Na úrovni pletiv proteiny nejdříve mizí z okrajových buněk a z buněk v bazální oblasti dělohy. Není to kvůli nižšímu obsahu proteinů ve vnějších buňkách ale proto, že odbourávání začíná ve vnějších buňkách a postupuje směrem dovnitř. Nejdříve se tedy zásobní látky odčerpávají z vývojově nejmladších buněk (Borisjuk a kol. 2003). Asi po 12 dnech je zásobní parenchym téměř kompletně bez proteinů (Smith a Flinn 1967). Po začátku klíčení se v dělohách rychle zvyšuje aktivita proteáz. Jejich inaktivní prekurzory jsou syntetizovány v ribozomech na endoplazmatických retikulích odkud jsou transportovány do proteinových tělísek. Zde se enzymy aktivují a je zahájeno odbourávání proteinů (Müntz 1996). Mezi 4. a 10. dnem klíčení dosahuje aktivita proteáz asi čtyřnásobku původní hodnoty a je zde silná korelace s odbouráváním zásobních proteinů. Aktivita proteáz je spojena s obsahem volných aminokyselin v dělohách (Yomo a Varner 1973). Dochází k degradaci hlavních zásobních proteinů vicilinu a leguminu (Derbyshirea a kol. 1976) a během prvních sedmi dní klíčení klesá v dělohách také obsah feritinu, který se akumuluje v dělohách semen hrachu jako zásoba železa (Lobreaux a Briat 1991, Marentes a Grusak 1998). K akumulaci a mobilizaci zásobních proteinů nedochází pouze v zásobních pletivech, ale také v orgánech osy – radikule a plumule (Tiedemann a kol. 2000). Škrob je zpočátku přítomen ve všech buňkách s výjimkou epidermis a potenciálních vodivých buněk prokambia. Ve velkém množství je přítomný v zásobním parenchymu, zejména ve vnitřní zóně. Hypodermis a prokambium (později parenchym svazkové pochvy) obsahují pouze velmi malá škrobová zrna, která vymizí během prvních tří dní. Vzor degradace škrobu v zásobním parenchymu je podobný degradaci proteinů: začíná na okrajích a postupuje ve vlně směrem do středu. Během prvních 15

sedmi dní jsou vnější zásobní buňky vyčerpány a po 12 dnech nezůstávají ani ve středu žádná škrobová zrna (Smith a Flinn 1967). Aktivita α- a β-amyláz se během klíčení od 4. do 10. dne rychle zvyšuje a pak se jejich aktivita ustálí nebo v určitém rozsahu klesá (Yomo a Varner 1973). Aktivita amyláz je kontrolována obsahem rozpustných cukrů, které se v dělohách akumulují (Monerri a kol. 1985), a kyselina giberelová rozkládání škrobů v dělohách nezvyšuje (Garcia-Luis a Guardiola 1978). Varner a kol. (1963) ukázal, že mnoho metabolických jevů, ke kterým dochází v dělohách hrachu, je spouštěno a kontrolováno pomocí stimulů z embryonální osy. Pokud jsou dělohy odděleny během prvních 24 až 48 hodin pak dochází k rychlému poklesu respirace a k selhání vývoje charakteristických enzymatických aktivit. Vzhledem k tomu, že přechod stimulů z osy do děloh by měl být alespoň částečně závislý na vodivém systému, prochází iniciační faktor z osy do děloh asi po 18 hodinách, kdy začíná diferenciace xylému. Suchá semena osahují nedovyvinuté mitochondrie s velmi nízkou respirační aktivitou a ke zvýšení respirační činnosti a dokončení vývoje mitochondrií, včetně zvýšení enzymatické aktivity dochází až po příjmu vody (Nawa a Asahi 1971). Bain a Mercer (1966b) ukázali že k dokončení mitochondrií a vývoji endoplazmatického retikula zásobních buněk, ke kterým dochází v období mezi 24 až 48 hodinami, může dojít pouze v přítomnosti pletiv osy. Morohashi a Bewley (1980) popsali vývoj mitochondriální

aktivity v dělohách hrachu při klíčení. K prvnímu vzestupu

mitochondriální aktivity dochází ihned na začátku klíčení a je indukován dodáním vody. V období mezi 8 a 12 hodinou dochází k dalšímu vzestupu mitochondriální aktivity. Pro tento vzestup je nezbytná přítomnost osy.

Transport látek z děloh Během klíčení semen leguminóz jsou zásobní látky degradovány a přemístěny k podpoře růstu semenáčků (Schlereth a kol. 2000). Podle Guardiola a Sutcliffa (1972) dochází k pohybu látek z děloh do pletiv osy zejména ve floému. Export děložních zásob suché hmoty, N, K, P a Mg má podobný charakter. Nejdříve zde během prvních 6-7 dní dochází k pomalému zvyšování rychlosti transportu z děloh. Maximální rychlost exportu pak přetrvává po dalších 5 dní a je následována poklesem úrovně pohybu od 12.-14. dne dále. Na konci třetího týdne je pohyb látek z děloh velmi pomalý a předpokládá se že po 28 dnech jsou všechny látky dostupné pro transport exportovány. Zbytek látek je pravděpodobně spojen hlavně s materiálem buněčných stěn v dělohách. 16

Existuje úzký lineární vztah mezi suchou hmotou a obsahem minerálních prvků v dělohách během počátečního růstu klíčních rostlin a je zřejmé, že pro dané množství exportované suché hmoty bude stálé množství každého prvku transportovaného z děloh (Collins a Sutcliffe 1977). V dělohách je méně vápníku než ostatních prvků (Mg, K, P), ale relativní distribuce vápníku mezi dělohami a osou je podobná. Velká část vápníku je v dělohách vázána a vápník schopný transportu (asi 30 % celkového Ca) se z děloh vyčerpává dříve než ostatní prvky, a proto je růst rostlin klíčících pouze ve vodě limitován právě dodáním vápníku (Ferguson a Bollard 1976). V dělohách leguminóz začíná významná mobilizace proteinů poté, co kořínek prorazí testu, tj. na počátku intenzivního růstu klíční rostliny. Od 24 hodin po vyklíčení se začíná zvyšovat obsah proteinů v ose a snižuje se jejich obsah v dělohách (Schlereth a kol. 2000). U bobu se během ranného klíčení v dělohách také aktivují přenašeče aminokyselin a peptidů, a později během růstu semenáčků se tyto přenašeče aktivují také v pletivech osy a kořene (Miranda a kol. 2003). U vikve jsou přenašeče pro transport peptidů iniciovány už před vyklíčením a proto tento transport začíná dříve než transport AK, který je iniciován až později po vyklíčení (Schlereth a kol. 2000). Peptidové přenašeče mohou být důležité pro transport produktů degradace proteinů v zásobním parenchymu a do osy a epikotylu, když jsou tato pletiva ještě symplasticky izolována. V šupinách a cévních svazcích klíčních rostlin hrají roli také v plnění floému a zásobování rostoucích pletiv N. Jejich přítomnost v kořenech naznačuje funkci při získávání malých peptidů z půdy (Miranda a kol. 2003). U dubu, který má podobně jako hrách hypogeické dělohy, byla studována redistribuce zásob uhlohydrátů během klíčení. Od vyvinutí kořínku byla větší část zásob ze semene transportována nejprve do kořene, kde se akumulovala a teprve později byla využita k výživě stonku a listů (Kabey a Sakai 2003).

Zapojení fytohormonů Cytokininy detekované v klíčících semenech cizrny jsou zpočátku přítomny v embryonální ose, ale po hodinách klíčení se objevují také v dělohách. Cytokininy v dělohách pocházejí z embryonální osy. Přepokládá se, že role, kterou embryonální osa hraje v mobilizaci zásobních látek je významně ovlivňována právě těmito cytokininy, které hrají významnou roli při regulaci hydrolýzy proteinů a vápníku (Villalobos a Martin 1992). Gibereliny podporují transport cukrů z děloh a jeho akumulaci v epikotylu (Miyamoto a Kamisaka 1988). 17

Produkce etylénu závisí na životnosti a klíčivosti semen, které zdá se etylén pozitivně ovlivňuje. Například při snížení produkce etylénu u semen skladovaných při vyšších teplotách (30-35°C), může být účinek vyšších teplot na klíčení zmírněn dodáním etylénu (Gallardo a kol. 1991). V klíční rostlině hrachu je nejintenzivnější syntéza etylénu lokalizována do prodlužovací a diferenciační zóny radikuly, kde reguluje růst kořenů (Ma a kol. 2003) a podporuje tvorbu kořenových vlásků (Pitts a kol. 1998). Etylén se v klíčícím semeni podílí na regulaci aktivity glukanáz a chitináz (Petruzzelli a kol. 1999), které se pravděpodobně účastní ochrany semene před napadením patogeny. Snížení produkce etylénu, zvyšuje aktivitu arginin dekarboxylázy, enzymu účastnícího se při biosyntéze polyaminů, a tím urychluje buněčné dělení a následný růst (Apelbaum a kol. 1985). Kyselina abscisová (ABA) reguluje klíčení a růst embryonální osy (Iglesias a Babiano 1997). U klíčních rostlin okurky ovlivňuje metabolismus sacharidů (Meng a kol. 2008) Nejvyšší úroveň ABA dosahuje v ose klíčních rostlin po 18 hodinách klíčení a její hladina kolísá závislosti na vnějších podmínkách. Při nedostatku vody může snižovat růstový potenciál buněk radikuly, ale nepředpokládá se že hraje významnou roli v zabránění klíčení při nedostatku vody.

2.2. Růstové korelace Jednotlivá pletiva a orgány intaktních rostlin jsou ve specifických vzájemných vztazích, které nazýváme korelace rostlinného růstu. Jsou základním projevem celistvosti (integrity) rostlin. Růstové korelace u rostlin jsou studovány již od počátku minulého století. Poznání mechanizmů jejich realizace a dále pak jejich využití například při řezu ovocných dřevin nebo při šlechtění obilnin na určitou úroveň odnožování je významným aspektem zemědělské výroby.

2.2.1. Růstové regulátory Růstové korelace jsou významně ovlivňovány nejrůznějšími látkami, které regulují růstové a vývojové procesy u rostlin. Obecně je nazýváme růstové regulátory. Rozlišujeme je na přirozené, které si rostlina sama tvoří k regulaci svého růstu a vývoje, a syntetické. Nejdůležitější růstové regulátory tzv. fytohormony dělíme do 5 skupin: auxiny, cytokininy, gibereliny, abscisiny a etylén. Kromě fytohormonů se v rostlinách

18

vyskytuje a působí ještě mnoho dalších látek s regulační povahou, které však z různých důvodů nejsou označovány jako fytohormony. Při svém studiu korelací mezi dělohou a kotyláry jsem se podrobněji zaměřila na tyto růstové regulátory: etylén, kyselinu abscisovou, cytokininy (zeatin, dihydrozeatin, benzyladenin, isopentenyladenin, metatopolin, jejich ribosidy), CO2 a etan.

2.2.1.1. Etylén Hormonální aktivitu etylénu objevil ruský fyziolog D. N. Neljubov při studiu účinků (trojitá odezva) svítiplynu na růst rostlin v roce 1901. Později v roce 1934 zjistil Gane při analýze plynů uvolňovaných jablky, že etylén je rostlinami také produkován. Etylén je nejjednodušší uhlovodík s nepolární dvojnou vazbou (CH2=CH2). Za normální teploty a tlaku se nachází v plynném stavu a je to tedy jediný plynný hormon. Slučováním s dalšími látkami (halogeny, hydrogenhalogenidy, kyselina sírová aj.) vytváří substituované nasycené i nenasycené uhlovodíky. S kyslíkem oxiduje za vzniku etylenoxidu, etylenglykolu nebo formaldehydu. Při vysokých teplotách se rozkládá na metan nebo vodík, a na acetylen. K plnému pochopení jeho účinků, je důležité vylíčit jak probíhá a je regulována jeho biosyntéza.

Biosyntéza etylénu Téměř všechna rostlinná pletiva mají schopnost vytvářet etylén, ačkoli množství vyprodukovaného etylénu je ve většině případů poměrně nízké. Nejvíce etylénu se vytváří v rostoucích pletivech a dozrávajících plodech. Jeho produkce se zpravidla zvyšuje během různých vývojových procesů nebo vlivem stresu a je regulována celou řadou faktorů. U mnoha rostlin produkce etylénu kolísá v denním rytmu v závislosti na světle (Macháčková a kol. 1997, Jasoni a kol. 2002) a teplotě (El-Abd a kol. 1999). Je ovlivňována gravitací (Andersson-Gunneras 2003), CO2 (Dong a kol. 1992, CharvezFranco a Kader 1993) a působením různých abiotických (Apelbaum a Yang 1981) či biotických stresů, například patogenů a chorob (Lund a kol. 1998, Hoffmann a kol. 1999) nebo škůdců (Kahl a kol. 2000). Vedle působení vnějších vlivů ji významně ovlivňují faktory vnitřní, zejména fytohormony. V pletivech bohatých na auxin se zvyšuje tvorba etylénu a bylo prokázáno, že auxin podporuje tvorbu ACS (Yu a kol. 1979, Hansen a Grossmann 2000), jeho tvorba může být zvýšena také cytokininy (Fišerová a kol. 2006) nebo ABA (Zhang a kol. 2009). Etylén sám může regulovat svou

19

vlastní biosyntézu, a to jak pozitivně (autokatalýza) (Petruzzelli a kol. 2000) tak negativně (autoinhibice) (Riov a Yang 1982). Pozitivní i negativní vnitřní regulace etylénu souvisí s rovnováhou mezi etylénem rozpuštěným a vázaným v buňce a etylénem v mezibuněčných prostorech, a také se zpětnou vazbou která zahrnuje geny ACO a ACS. Za prekurzor etylénu je uznáván L-metionin, ze kterého se etylén tvoří přes meziprodukty

S-adenosylmetionin

(SAM

nebo

AdoMet)

a

kyselinu

1-

aminocyklopropan-1-karboxylovou (ACC) (Adams a Yang 1979), vznikající ze SAM spolu s 5‘-metyltioadenosinem (MTA). SAM je z L-metioninu syntetizován v reakci katalyzované enzymem SAM-syntetázou (AdoMet syntetázou nebo ATP:L-metionin S-adenosyl transferázou, EC 2.5.1.6). Touto reakcí se na SAM přemění až 80 % buněčného metioninu (Ravanel a kol. 1998). V pletivech ho bývá poměrně dostatek a v rostlině má mnoho funkcí. Slouží jako kofaktor v mnoha reakcích, je donorem metylových skupin a je nejen prekurzorem hormonu etylénu ale také dalších látek ovlivňujících růst rostlin, např. spermidinu, sperminu nebo putrescinu (Thu-Hang a kol. 2002). Ovlivňuje také syntézu metioninu, tím že zpětnou vazbou inhibuje SAMsyntetázu. Jeho syntézu ovlivňuje také MTA, který se může ukládat do zásoby a metionin se z něj v tzv. yangově cyklu recykluje přes metylribózu odštěpením adenosinu (Miyazaki a Yang 1987), což umožňuje tvorbu etylénu i při poměrně malé zásobě L-metioninu (Bleecker a Kende 2000). Vznik ACC ze SAM zprostředkovává enzym ACC-syntetáza (ACS, S-adenosylL-metionin metyltioadenosinlyáza, EC 4.4.1.14), která náleží ke skupině enzymů závislých na pyridoxal-5‘-fosfátu. Její struktura je dost podobná aminotransferázám (Capitani a kol. 1999) a výsledky Taruna a Teologise (1998) naznačují, že funguje jako heterodimer. Produkce ACC pomocí ACS je krokem limitujícím rychlost biosyntézy etylénu. ACC se za přístupu kyslíku štěpí na etylén, oxid uhličitý a kyanovodík, který je detoxikován pomocí β-kyanoalanin syntázy (β-CAS, L-3-kyanoalanin syntázy, EC 4.4.1.9) na β-kyanoalanin a dále na asparagin (Yip a Yang 1988), aby se zabránilo toxickým účinkům hromadícího se kyanidu. Přeměnu ACC na etylén katalyzuje enzym ACC-oxidáza (ACO). Aktivita ACO je zcela závislá na přítomnosti CO2 (Dong a kol. 1992), ale jeho funkce zatím nebyla plně vysvětlena. Na rozdíl od ACS, která byla velmi brzy rozpoznána jako enzym limitující a řídící biosyntézu etylénu, bylo u ACO teprve nedávno zjištěno, že její snížená aktivita u některých rostlin inhibuje syntézu etylénu (Ketsa a kol. 1999). 20

Obrázek č. 3. Biosyntéza etylénu (Chae a Kieber 2005) MET: L-metionin, AdoMet: S-adenosyl-L-metionin, ACS: ACC-syntetáza, MTA: 5‘-metyltioadenosin, ACO: ACC-oxidáza, ACC: kys. 1-aminocyklopropan-1-karboxylová

Transport a signalizace etylénu a jeho prekurzorů v rostlinách Etylén je 14x rozpustnější v tucích než ve vodě a dalších roztocích přítomných ve vodní fázi (v cytoplazmě), ale na rozdíl od ostatních fytohormonů se, vzhledem k tomu že je to plyn, z rostliny jednoduše uvolňuje do jejího okolí. Do okolního prostředí je plynný etylén uvolňován z mezibuněčných prostorů, kde je jeho koncentrace v rovnováze s množstvím etylénu rozpuštěným v cytoplazmě. Mimo plynné prostředí se u něj předpokládá lokální působení (Dolan 1997). Etylén volně prochází přes membránu z buňky do buňky. Ačkoli k transportu etylénu dochází (Woltering 1990), je přímý bazipetální transport tohoto hormonu omezený (Zeroni a kol. 1977). Bezprostřední prekurzor etylénu, ACC, je rozpustný ve vodě a pohybuje se apoplastem na velké vzdálenosti (z kořenů do stonků) (Bradford a Yang 1980) a může být transportován cévním systémem. ACC může být transportována jak xylémem tak floémem, kde jí bylo zjištěno více (Woltering 1990). Velká část ACC v rostlinách je přeměňována na Nmalonyl-ACC (MACC) (Matilla a Gómez-Jiménez 2001), která je jejím hlavním konjugátem (Peiser a Yang 1998). Většina vytvořené MACC je pak ukládána do vakuol (Bouzayen a kol. 1989). Ve stonku byla zjištěna nižší hladina ACC než MACC. Jak ACC tak MACC byly přítomny v xylémové míze (Finlayson a kol. 1991), ale ACC tam bylo nesrovnatelně častěji, takže může být považováno za zcela přirozenou součást xylémové mízy. Vliv etylénu závisí také na schopnosti buněk zaznamenávat změny v koncentraci etylénu a převést tuto informaci na fyziologickou odpověď přiměřenou typu buňky. Rychlost reakce na etylén kolísá v rozmezí od 10 až 15 minut (inhibice růstu klíčních rostlin) po několik hodin (zvýšení enzymové aktivity) až dní (podpora stárnutí). Etylén je vnímán pomocí speciálních receptorů lokalizovaných v membránách buněk, které jsou nejlépe prozkoumány u Arabidopsis thaliana, kde bylo objeveno pět takových

21

receptorů pro etylén (Chang a Stadler 2001). Těchto pět receptorových proteinů přenáší signál na CTR1 (constitutive triple response) proteinkinázu (Chang a Stadler 2001). Mezi receptory a CTR1 proteinkinázou zatím nebyl identifikován žádný mezičlánek. Spíše se zdá, že spolu reagují přímo. V nepřítomnosti etylénu zůstává CTR1 v aktivním stavu a potlačuje odezvu na etylén, ale vazba etylénu inaktivuje receptory a tím i CTR1. Následkem vazby se aktivuje protein EIN1 (ethylene insensitive) a tím se iniciuje transkripční kaskáda zahrnující transkripční faktory EIN3/EIL a ERF (ethylene response factor), které se podílejí na regulaci reakcí na etylén. Přenos signálu, by vzhledem k podobnosti CTR1 ke známým MAP-kinázám (mitogen-activated protein kinase) mohl být zajišťován také MAP-kinázovou kaskádou (Chen a kol. 2005, Etheridge a kol. 2006).

Obrázek č. 4. Schéma signalizace etylénu (Etheridge a kol.2006) V nepřítomnosti etylénu se aktivuje negativní regulátor CTR1, který potlačuje další signalizaci. E3-komplex se účastní degradace EIN3. Přítomnost etylénu vede k inaktivaci CTR1 a zabraňuje degradaci EIN3, což aktivuje signalizační dráhu . MAPKKK: mitogen-activated protein kinase kinase kinase, Nramp: rodina přenašečů kovových iontů podobná Nramp (natural resistance-associated macrophage protein)

Funkce etylénu a jeho vliv na růst rostlin Vzhledem ke svému plynnému stavu působí etylén nejen na svého producenta, ale také na jedince v blízkém okolí. Nejvýznamnější účinky etylénu jsou podpora stárnutí, vliv na růst rostlin a různé morfogenetické účinky. Důležitá je také jeho funkce stresového hormonu během biotických a abiotických stresů. Téměř všechny biotické i abiotické stresy podporují produkci etylénu v rostlinách a v některých případech se etylén zdá být zapojen do zprostředkování reakce na stres. Zdá se, že při reakci na 22

patogena může regulovat akumulaci kyseliny salicylové (O’Donnell a kol. 2001), která může vyvolávat tzv. hypersenzitivní reakci. Etylén může zesilovat reakci na patogena či onemocnění, ale také ji u jiného patogena nemusí ovlivňovat nebo ji může dokonce zeslabovat (Hoffman a kol. 1999). Jeho produkce se zvyšuje také při mechanickém poškození

pletiv a předpokládá se, že je zapojen do signalizační dráhy

zprostředkovávající reakci na poranění (Kato a kol. 2000). Významně ovlivňuje dozrávání a stárnutí (Nishiyama a kol. 2007, Johnston a kol. 2009), zejména u tzv. klimaktérických plodů, kde je dozrávání spojeno se zvýšenou respirací a produkcí etylénu (Huber 2008). Současně podporuje stárnutí a opad listů a květů (Van Doorn 2002). Tyto procesy souvisí s podporou aktivity celuláz (Tucker a kol. 1988) a dalších enzymů (Awad a Young 1979, Paull a Chen 1983) podílejících se na rozkladu celulóz, hemicelulóz a pektinů, a tím i na depolymerizaci buněčné stěny, odbourávání chlorofylu (Knee 1991) a tvorbě žlutých a červených pigmentů, a dalších degradačních procesech. Na růst rostlin a morfogenezi má vliv zejména etylénem způsobované narušení gravitropismu a omezení prodlužovacího růstu vegetativních pletiv (Binder a kol. 2004), což jsou základní projevy při tzv. trojné odezvě. Utlumení prodlužovacího růstu a zesílení tloustnutí souvisí s ovlivněním polárního toku auxinu. Etylén může bazipetální transport auxinu inhibovat nebo indukovat, regulací zpětnovazebního mechanismu řízení hladiny auxinu, kdy vysoká hladina auxinu stimuluje produkci etylénu, který ale způsobuje snížení jeho obsahu v pletivech. Zprostředkováním inhibice prodlužování buněk na vnitřní straně apikálního háčku etylén ovlivňuje jeho tvorbu při klíčení dvouděložných rostlin (Ecker 1995; Bleecker a Schaller 1996). Mohou zde působit různé mechanismy: vyšší lokální koncentrace etylénu na vnitřní straně háčku, nebo jsou buňky na vnitřní straně k etylénu citlivější, než na vnější straně (Peck a kol. 1998). U vodních rostlin s plovoucími listy etylén dlouživý růst naopak podporuje, ovlivněním uvolňování protonů a snížením pH buněčných stěn (Ridge a Osborne 2006). Prostřednictvím ovlivnění biosyntézy a transportu auxinů reguluje růst kořenů (Růžička a kol. 2007) a také může podporovat tvorbu adventivních kořenů a zprostředkovávat vliv zakořeňovacích faktorů. U leguminóz se podílí také na regulaci infekce hlízkovitými baktériemi a počtu hlízek (Oldroyd a kol. 2001). U některých druhů rostlin indukuje kvetení, podporuje proliferaci pletiv a zeslabuje dormanci pupenů pravděpodobně tím, že zvyšuje hladinu giberelinů (GA).

23

2.2.1.2. Cytokininy První nativní cytokinin byl v 60. letech izolován z endospermu nezralých obilek kukuřice a nazván zeatin. V současné době známe okolo 40 nativních cytokininů. Jejich struktura je podobná, jedná se o deriváty adeninu s isoprenovým nebo aromatickým postranním řetězcem na aminoskupině v poloze N-6 (Strnad 1997, Mok a Mok 2001).

Obrázek č. 5. Strukturní vzorce cytokininů (Sakakibara 2006) Izoprenoidní cytokininy - A: N6-(∆2-izopentenyl)adenin, B: trans-zeatin, C: cis-zeatin, D: dihydrozeatin Aromatické cytokininy - E: ortho-topolin, F: meta-topolin, G: benzyladenin, H: ortho-metoxytopolin, I: meta-metoxytopolin

Podle druhu postranního řetězce je lze rozdělit na izoprenoidní (zeatin, dihydrozeatin,

isopentenyladenin

)

a

aromatické

(N6-benzyladenin,

topoliny,

metoxytopoliny). Chemickou povahou jsou to báze podléhající disociaci. Při velmi nízkém pH (pod 2) nesou kladný náboj, při pH 6 až 8 jsou neutrální a při pH nad 12 nesou záporný náboj. Cytokininové báze jsou hydrofobní, ale navázáním hydrofilních cukrů vznikají amfipatické konjugáty.

Biosyntéza cytokininů Cytokininy jsou v rostlinách syntetizovány na různých místech, nejčastěji v mladých, aktivně se dělících pletivech, zejména v kořenech, respektive kořenových špičkách. Dále mohou být cytokininy syntetizovány v listech, apikálních meristémech a nezralých semenech, častěji jsou však tyto orgány zásobovány cytokininy z kořenů. Důležitým místem biosyntézy cytokininů jsou také plastidy (Kasahara a kol. 2004). Biosyntéza cytokininů může být ovlivněna různými vnějšími vlivy, např. působením různých mikroorganismů (Ashby 2000) a je nezávisle regulována samotnými cytokininy

24

a dalšími fytohormony např. auxinem (Nördstrom a kol. 2004) nebo ABA, a také dostupností NO3-, který ovlivňuje expresi některých genů pro IPT (Takei a kol. 2004).

Obrázek č. 6. Biosyntéza izoprenoidních cytokininů (Sakakibara 2006) Isoprenoidní postranní řetězec iP a tZ vychází převážně z MEP dráhy, zatímco postranní řetězec cZ je odvozen z MVA dráhy. CK: cytokininy, iP: N6-(∆2-isopentenyl)adenin, tZ: trans- zeatin, cZ: cis-zeatin, MEP pathway: MEP dráha, MVA pathway: MVA dráha, IPT: adenosinfosfát-izopentenyl transferáza, iPRTP: iP ribosid-5‘-trifosfát, iPRDP: iP ribosid-5‘-difosfát, iPRMP: iP ribosid-5‘-monofosfát, AK: adenosin kináza, APPT: adenin fosforibosyl transferáza, CYP735A: cytochrom P450 monooxygenáza, Ade: adenin, Ado: adenosin, CKX: cytokinin oxidáza/dehydrogenáza, DMAPP: dimetylalyl difosfát, HMBDP: hydroxymetylbutylenyl difosfát, ZOGT: zeatin O-glukosyl transferáza, βGlc: β-glukosidáza, CKN-GT: CK N-glukosyltransferáza, tZDP: tZ ribosid-5‘-difosfát, tZTP: tZ ribosid-5‘-trifosfát, 1: fosfatáza, 2: 5‘-ribonukleotid fosforyláza, 3: adenosin nukleosidáza, 4: purin nukleosid fosforyláza, 6: zeatin reduktáza, 7: CK cis-hydroxyláza

Isoprenoidní

cytokininy

jsou

syntetizovány

ethylerytriolfosfátovou

nebo

mevalonovou cestou (Rohdich a kol. 2002, Eisenreich a kol. 2004). Prvním krokem pro syntézu isoprenoidních cytokininů je reakce adenosin-5‘-monofosfátu (AMP), popřípadě difosfátu (ADP) nebo trifosfátu (ATP) a dimetylalyl difosfátu (DMAPP) nebo hydroxymetylbutenyl difosfátu (HMBDP). Tato reakce je katalyzována adenozin fosfátizopentenyltransferázou (IPT, EC 2.5.1.27) (Takei a kol. 2001, Sun a kol. 2003), která je substrátově specifická a preferuje ADP nebo ATP před AMP. DAMPP je syntetizován oběmi cestami a obvykle se vyskytuje v cytosolu rostlin (Rohmer 1999), zatímco HMBDP je meziproduktem v metylerytriolfosfátové cestě a vyskytuje se u 25

bakterií a plastidů (Hecht a kol. 2001). Nedávno byla objevena cesta, kterou se realizuje přímé uvolnění cytokininů z nukleotidů. Reakce je katalyzována cytokininnukleosid-5‘monofosfát-fosforibohydrolázou (Kurakawa a kol. 2007). Aromatické cytokininy byly identifikovány v mnoha druzích rostlin (Strnad a kol. 1997, Baroja-Fernández a kol. 2002, Sáenz a kol. 2003), ale cesty jejich biosyntézy a degradace zatím zůstávají neobjasněny.

Transport a signalizace cytokininů v rostlinách Cytokininy mohou v rostlině působit jak lokálně tak na dlouhé vzdálenosti. Vzhledem k tomu, že biosyntéza cytokininů je specifická pro určité buňky a pletiva, musí být k cílovým buňkám transportovány difúzí nebo transportními systémy. Cytokininy se mohou pohybovat xylémem (Beck a Wagner 1994) i floémem (Komor a kol. 1993). Předpokládá se, že v intaktních rostlinách jsou cytokininy translokovány z kořene ke zdroji auxinu v lodyžním vrcholu, ale povaha jejich transportu není zdaleka tak objasněná jako např. u auxinů. Oproti auxinům je transport cytokininů daleko méně specifický. Z kořenových vrcholů jsou do lodyh (listů) transportovány převážně xylémem. V listech mohou přecházet do floému odkud jsou rozváděny do dalších orgánů. Pravděpodobně se jedná o transport pasivní, přestože jeho dynamika se v průběhu vývoje liší např. od dynamiky transportu sacharózy. Cytokininy jsou transportovány buď ve formě bází nebo, podle některých autorů (Letham a Palni 1983, Beveridge a kol. 1997a), jsou transportními formami cytokininů ribotidy a ribosidy. Transport cytokininů může být za účasti fytochromu regulován fotoperiodou (Macháčková a kol. 1996) nebo, pokud jde o xylémový transport, koncentrací NO3v kořenovém substrátu. Pro příjem cytokininů buňkami je důležitá jejich molekulární forma. Dobře jsou přijímány lipofilní cytokininové báze, zatímco pro polární glykosidy a zejména ribosidy není buněčná membrána prostupná. Ribosidy a O-glykosidy, které v buňce vznikají, ji nemohou opustit a jsou v ní akumulovány. Vzhledem k tomu, že mohou být přeměněny zpátky na báze představují zásobní formu cytokininů. Působení hormonu zahrnuje jeho percepci, spuštění specifické reakce, která bývá nezávislá na transkripci a translaci, a konečně konkrétní reakci např. na změněné růstové podmínky. Receptory cytokininů ve vyšších rostlinách jsou kódovány malou genovou rodinou (Inoue a kol. 2001). Každý receptor má specifické spektrum upřednostňování ligandů (Spíchal a kol. 2004, Romanov a kol. 2006) a postranní řetězce a modifikace adeninu vykazují odlišné 26

interakce s receptory cytokininů. Signální dráha cytokininů byla nejlépe prostudována u Arabidopsis, kde je podobná dvousložkovým signálním drahám baktérií a kvasinek (Ferreira a Kieber 2005). Podle současného modelu je cytokinin vázán na membráně lokalizovanou receptorovou kinázou, která obsahuje mimobuněčnou vazebnou doménu tzv. CHASE doménu (cyclases/histidine kinases associated sensory extra-cellular domain) (Anantharaman a Aravind 2001). Vazba ligandu vede k autofosforylaci receptorů

a

signál

je

přenesen

fosforylací

tzv.

HP

proteinů

(histidine-

phosphotransmiter), které jsou přenášeny do jádra, kde aktivují tzv. RR regulátory (response regulators) patřící do třídy Myb-transkripčních faktorů. Transkripční faktory regulují transkripci svých cílových genů. Dochází k iniciaci expresní kaskády, ovlivnění vnímavosti k cytokininům a změnám v udržování jejich homeostáze a nakonec ke konečné reakci.

Funkce cytokininů a jejich vliv na růst rostlin Cytokininy hrají klíčovou roli při regulaci dělení a diferenciaci rostlinných buněk. Při regulaci buněčného cyklu cytokininy působí na kinázy závislé na cyklinech (cyclin dependent kinases CDK), enzymy které fosforylují některé proteiny (transkripční faktory, proteiny cytoskeletu, jaderné membrány apod.), a tím ovlivňují spouštění popř. průběh jednotlivých fází cyklu (Huntley a Murray 1999, Yang a kol. 2002). Také kontrolují různé procesy růstu a vývoje rostlin, jako je stárnutí (Wingler a kol. 1998), transdukce nutričních signálů (Rahayu a kol. 2005) nebo rovnováha mezi kořenem a stonkem. Aktivita cytokininů je důležitá pro udržování nediferencovaných buněk a jejich dělení ve stonkovém apikálním meristému (SAM) a k podpoře diferenciace buněk v kořenovém apikálním meristému (RAM) (Werner a kol. 2003, Kyozuka 2007). V interakci s auxiny pak cytokininy ovlivňují diferenciaci pupenů a kořenů. Vyvolávají zakládání pupenů a podporují embryonální fázi růstu, ale brzdí zakládání postranních kořenů, i když podporují jejich prodlužování. U kořenů bobovitých také regulují interakce s hlízkovitými bakteriemi a nodulaci (Lorteau a kol. 2001, Gonzalez-Rizzo a kol. 2006). U stonků stimulují větvení a odnožování, a podílejí se na vymanění postranních pupenů z apikální dominance (Pillay a Railton 1983, Li a kol. 1995, Li a Bangerth 2003), tzn. že zeslabují apikální dominanci. Cytokininy a ABA jsou považovány za signály sloužící ke komunikaci mezi kořenem a stonkem a naopak (Jackson 1993, Rahayu a kol. 2005) a ovlivňují transport látek v rostlině, např. působí na přitahování a zadržování rozpustných dusíkatých látek a fosforu, metabolismus 27

nukleových kyselin, bílkovin, lipidů, škrobu a cukrů, a syntézu chlorofylů a fotosyntézu. Podílejí se na vytváření sinku tím, že orgány s vyšší hladinou cytokininů jsou přednostně zásobovány látkami rozváděnými v lýku. Iniciují tvorbu semen a jsou schopny rušit dormanci některých hlíz, semen a pupenů a stimulovat jejich rašení. Mohou zvyšovat rezistenci rostlin k podmínkám prostředí (Cheikh a Jones 1994, Yang a kol. 2002, Zhang a Ervin 2004). V nepříznivých podmínkách by mohly být také faktorem, který u hrachu působí na časné nasazení poupat a květů (Atanassova a kol. 1996).

2.2.1.3. Kyselina abscisová Kyselina abscisová (ABA) byla poprvé identifikována v 60. letech 20. století a její název byl odvozen z termínu pro opad listů (abscise). ABA je sesquiterpenoid (C15H20O4) s jedním symetrickým, opticky aktivním uhlíkovým atomem v C-1‘ pozici a chemicky lze její strukturní vzorec vyjádřit jako kyselina (+)-(1‘S,2Z,4E)-5-(1‘hydroxy-2‘,6‘,6‘-trimetyl-4-oxo-2‘-cyklohexenyl)-3-metyl-2,4-pentadienová. Přirozeně se vyskytující forma je S-(+)-ABA, kdy je postranní řetězec ABA definován jako 2-cis, 4-trans. Trans, trans-ABA je biologicky neaktivní. R-(-)-ABA je biologicky aktivní (Zeevaart a Creelman 1988, Toorop a kol. 1999), ale v přírodě se běžně nevyskytuje (Zaharia a kol. 2005). Je to slabá kyselina (pH 4,8), která při nízkém pH téměř nedisociuje a snadno se rozpouští v některých organických rozpouštědlech. Vzhledem k bodu tání při 160-161°C je při vyšších teplotách je relativně nestabilní (Milborrow a kol. 1974).

Obrázek č. 7. Struktura a izomery ABA (Zaharia a kol.2005), A: (+)-(S)-ABA, B: (-)-(R)-ABA, C: 2-trans-ABA

Biosyntéza kyseliny abscisové ABA je syntetizována zejména v dospělých listech (Zeevaart a Boyer 1984, Munns a Cramer 1996), ale může být syntetizována také v kořenech je ABA, především v reakci na stres způsobený nedostatkem vody v půdě (Parry a Horgan 1992, Parry a kol. 1992) a bylo naznačeno, že kořen je přinejmenším částečným zdrojem ABA akumulované v listech při stresu (Kefu a kol. 1991). Pravděpodobně si ABA mohou 28

vytvářet také všechny ostatní orgány rostliny vystavené stresu např. vlivem nedostatku vody. Další významné místo syntézy ABA je v plodech a vyvíjejících se semenech. Biosyntéza může být ovlivněna vnějšími podmínkami, zejména stresem z nedostatku vody nebo živin, zasolení nebo nadbytku amonných iontů v médiu (Zdunek-Zastocka a kol. 2004), ale pravděpodobně také teplotním režimem (El-Abd a kol. 1999). Důležité jsou také vnitřní faktory jako je turgor listů nebo ostatní fytohormony, např. auxiny (Hansen a Grossmann 2000) nebo etylén, který je schopen podněcovat biosyntézu ABA (Grossmann a Hansen 2001, Grossmann 2007). Až donedávna se mělo za to, že všechny isoprenoidy v rostlinách, kterých je desítky tisíc, a zahrnují fotosyntetické pigmenty (chlorofyly, tokoferoly, karotenoidy), hormony (ABA, gibereliny, cytokininy a brasinosteroidy) a antibakteriální látky (fytoalexiny) jsou syntetizovány pomocí acetátové/mevalonátové dráhy v cytoplazmě, společné také houbám a živočichům. Ale podle novějších poznatků (Hirai a kol. 2000) existuje kromě tzv. přímé cesty vycházející z kyseliny mevalonové (MVA), která je přes C15-sloučeninu (farnesylpyrofosfát) zabudovávána do ABA, ještě druhá cesta, která vychází z 1-Deoxy-D-xylulóza 5-fostátu (DOXP) (Arigoni a kol. 1997, Lichrenthaler a kol. 1997) a probíhá v chloroplastech. Tato cesta se označuje také jako MEP dráha, podle názvu první vytvářené molekuly (2C-metyl-D-erytriol-4-fosfátu) a byla objevena nejen u vyšších rostlin, ale také u prvoků, baktérií a řas (Lichtenthaler 1999). V obou cestách biosyntézy je zapojen isopentenylpyrofosfát, ale při MVA dráze v cytoplazmě

dráze

se

vytváří

z kys.

mevalonové,

přes

fosfomevalonát

a

difosfomevalonát, zatímco při MEP dráze se v plastidech isopentenylpyrofosfát vytváří z glyceraldehyd-3-fosfátu a pyruvátu a slouží k biosyntéze isoprenů, monoterpenů a diterpenů, karotenoidů, plastochinonů a fytolových konjugátů, jako jsou chlorofyly a tokoferoly. Vznik ABA v plastidech je výsledkem štěpení C40 karotenoidu specifickou dioxygenázou vytvářející C25 reakční produkt a C15 sloučeninu xantoxin, která je následně v cytosolu přeměňována na ABA-aldehyd a nakonec na ABA (Taylor a kol. 2000). Biosyntéza ABA je řízena dostupností substrátu, aktivitou 9-cis-epoxykarotenoid dioxygenázy (NCED) a rychlostí reakcí vedoucích k utváření ABA z xantoxinu. Vznik ABA z xantoxinu katalyzuje ABA2, unikátní krátkořetězcová dehydrogenáza/reduktáza, která u Arabidopsis přeměňuje xantoxin na ABA-aldehyd v cytosolu. Konverze ABAaldehydu (ABAld) na ABA, poslední krok syntézy ABA je zřejmě katalyzován ABAaldehyd oxidázou (AAO, EC 1.2.3.1) (Walker-Simmons a kol. 1989). AAO vyžaduje 29

k vytváření ABA molybdenový kofaktor, k jehož aktivaci je vyžadována enzymatická aktivita ABA3 (Bittner a kol. 2001). AAO je pravděpodobně také zapojena v biosyntéze jiných rostlinných hormonů, například u IAA při oxidaci indol-3-acetaldehydu (IAAld) na IAA (Koshiba a kol. 1996).

Obrázek č. 8. Biosyntéza ABA (upraveno Oritani a Kiyota (2003) MVA: kys. mevalonová, MEP: 2C-metyl-D-erytriol-4-fosfát, DOXP: 1-Deoxy-D-xylulóza 5fostátu, HMG-CoA: β-hydroxy-β-merhylguararyl CoA, MECOP: 2-metyl-D-erytritol 2,4cyklodifosfát, IPP: izopentenyl pyrofosfát, FPP: farnesyl pyrofosfát, GGPP: geranyl geranyl pyrofosfát

Transport a signalizace kyseliny abscisové v rostlinách Regulace fyziologických procesů řízených ABA je primárně na úrovni biosyntézy ABA de novo a na její přeměně. To vyžaduje de novo syntézu příslušných enzymů, spíše než přerozdělování stávajících poolů (pools) ABA, ačkoli xylémový transport ABA je signálem z kořenů do stonku při nedostatku vody (Milborrow 2001; Hartung a kol. 2002). ABA může být transportována xylémem i floémem (Wolf a kol. 1990) i parenchymatickými pletivy. V kořenech je ABA do xylému transportována hlavně apoplastem. Její transport je převážně nepolární, ale může být polarizován jinými růstovými regulátory, např. IAA (Procházka a Borkovec 1981, 1984). Vzhledem k tomu že ABA je slabá kyselina závisí její distribuce v buňkách na pH buněčných struktur. Regulace transportu ABA vlivem pH byla také pozorována i mezi různými buňkami a částmi rostlin, např. mezi buňkami testy a embrya u hrachu. Předpokládá se, že ABA

30

může být transportována také ve formě konjugátů. Zatím byly objeveny dva konjugáty, glukózaester ABA a O-1‘-glykosid ABA, které by mohly být těmito transportními (nebo i zásobními) formami neboť jsou schopny ABA nejen vázat, ale i zpětně uvolňovat. Zejména glukózaester ABA se zdá být vhodným konjugátem pro dálkový transport neboť se v xylému vyskytuje a jeho koncentrace zůstávají poměrně stálé i při sníženém pH (Sauter a Hartung 2002). V listech rostlin ječmene stresovaných zasolením se také významně zvyšují specifické β-glukosidázy (Dietz a kol. 2000). Signalizace ABA v rostlinách zahrnuje buněčné dění iniciované ABA, které má za následek specifické reakce zahrnující např. regulaci turgoru nebo rozdílnou genovou expresi. ABA působí na úrovni transkripční (Busk a Pagès 1998), a pravděpodobně také translační. Signalizace ABA je charakterizována úžasným množstvím druhých poslů, kteří jsou součástí dráhy nebo upravují specifické hormonální odpovědi ovlivněním dalších signálů transdukčních řetězců. Ve svěracích buňkách může být rychlá dráha regulující turgor spouštěná ABA odlišena od pomalé signalizační dráhy vedoucí k jádru (Webb a kol. 2001). Rychlá dráha je charakterizována změnami v obsahu K+ a aktivitě iontových kanálů zprostředkované pomocí ABA indukovaného kolísání obsahu Ca2+ (Schroeder a Hagiwara 1990). Při velmi rychlém procesu uzavírání průduchů ABA aktivuje cyklickou adenosindifosforibózu (c-ADPR) (Leckie a kol. 1998). Jaderná signalizační dráha zahrnuje změny ve stavu fosforylace signalizačních komponent zahrnujících transkripční regulátory, a tím přesměrování genové exprese. Turgorově a jaderně cílené kroky signalizační kaskády ABA jsou v určitém rozsahu sdíleny společnými složkami. Ve skutečnosti není signalizace ABA isolována, ale je začleněna ve společných transdukčních řetězcích, které signál, stejně jako v dalších signálních drahách, nejprve vytvářejí, a poté ho upravují a zprostředkovávají. V práci Beaudoin a kol. (2000) byla naznačena souvislost mezi signální dráhou ABA a etylénu. Rostliny reagují na problémy životního prostředí jako je sucho a zasolení změnami v dostupnosti ABA, buď prostřednictvím redistribuce signálu (Slovik a kol. 1995, Wilkinson a Davies 1997) nebo zvýšenou biosyntézou (Zeevaart a Creelman 1988), a eventuelně změnami vnímavosti k hormonálnímu signálu (Kadlecová 1999).

Funkce kyseliny abscisové a její vliv na růst rostlin Kyselina abscisová (ABA) je rostlinný hormon podílející se svými funkcemi při reakci na nepříznivé podmínky prostředí. ABA je podobně jako cytokininy považována za signál sloužící ke komunikaci mezi kořenem a stonkem a naopak (Jackson 1993). 31

Významně se jako signál uplatňuje při kontrole vodní bilance rostliny. Při nedostatku vody stoupá biosyntéza ABA v kořenech a zvyšuje se její transport xylémem do ostatních částí rostliny, zejména do listů kde způsobuje uzavírání průduchů (Yang a kol. 2002, Christmann a kol. 2007). ABA ovlivňuje metabolismus a vývojové programy, nejen při reakci rostlin na sucho, ale také při reakci na zasolení (Wolf a kol. 1990, Zhang a kol. 2006), chlad (Gusta a kol. 2005) nebo naopak vysoké teploty (Liu a kol. 2006). Není to ale jen ‚stresový hormon‘, který integruje omezení spojené se změnami životního prostředí, ale také endogenní signál vyžadovaný pro správný vývoj. V nepřítomnosti entvironmentálního stresu dolaďuje základní úroveň ABA optimální růst rostlin (Cheng a kol. 2002), pravděpodobně omezením uvolňování růstově inhibičního etylénu (Sharp 2002). ABA se účastní regulace embryogeneze a zrání semen, kdy má velký význam pro syntézu a akumulaci zásobních proteinů (Solnická 2008). V průběhu desikace (vysychání) indukuje tvorbu proteinů LEA (late embryogenesis abundant), které mají v buňce stabilizační funkci (Grelet a kol. 2005). V průběhu vývoje se ABA může v semenech, hlízách nebo pupenech akumulovat a regulovat dormanci (Nicolás a kol. 2006, Destefano-Beltrán a kol. 2006, Gubler a kol. 2008). Také se podílí na řízení metabolismu rostliny a u klíčních rostlin okurky ovlivňuje metabolismus sacharidů (Meng a kol. 2008). Růst listů je zpravidla za nepříznivých podmínek (sucho, zasolení, nedostatek živin apod.) omezován více než růst kořenů. Omezení růstu listů je v mnoha případech spojeno se značnou akumulací ABA (Palmer a kol. 1996, Montero a kol. 1997). ABA zvyšuje odolnost cytoplazmy vůči ztrátě vody při suchu, zasolení, mrazu či jiném poškození tím, že indukuje specifické proteiny, které se vážou na životně důležité proteiny a chrání je před poškozením. Přestože růst nadzemní části rostliny ABA inhibuje, podporuje růst postranních kořenů a tím i tvorbu mohutnější kořenové soustavy. Účinek ABA je zde tedy opačný než u giberelinů.

2.2.2. Další látky ovlivňující růst Etan a CO2 Produkce etanu rostlinami byla zkoumána převážně v souvislosti se stresem. Etan vzniká v rostlinách při oxidaci lipidů (Riley a kol. 1974) peroxidací nenasycených masných kyselin (linolenové) (John a Curtis 1977) volnými radikály a je uváděn jako indikátor peroxidázy (Celikel a Vandoorn 1995). Jako nejstabilnější specifický konečný

32

produkt peroxidace lipidů je detekce etanu považována za vhodnou metodu k jejímu studiu. Množství etanu produkovaného rostlinami je obvykle poměrně nízké, ale zvyšuje se působením různých stresových faktorů, kdy dochází k poranění nebo poškození pletiv (Konze a Elstner 1978, Kimmerer a Kozlowski 1982). Jeho produkce se zvyšuje při dekompartmentaci buněk (Konze a Elstner 1978). Nepříznivé podmínky prostředí jako je nízká teplota nebo nedostatek kyslíku při zaplavení (Blokhina a kol. 2001) snižují aktivitu antioxidantů, což vede ke zvýšení peroxidace lipidů a tím i zvýšení produkce etanu (Wise a Naylor 1987). Také snižování životnosti semen během skladování souvisí s peroxidací lipidů (Sung a Chiu 1995) a může být doprovázeno uvolňováním etanu. Starší semena pak uvolňují méně etanu. Peiser a Yang (1979) uvádí, že produkce etanu se narozdíl od etylénu na světle zvyšuje. Produkce CO2 u rostlin závisí na dvou procesech: na fotosyntéze, při které se CO2 spotřebovává, a na respiraci (dýchání), při které se CO2 produkuje. Vliv CO2 na růst rostlin byl zkoumán převážně v souvislosti se zvyšováním koncentrace CO2 v atmosféře. Zvýšená koncentrace CO2 u vigny podporuje délku hlavního stonku i postranních větví, počet listů a větví a velikost listové plochy (Bhattacharya a kol. 1985). Ovlivňuje vývoj primárních i sekundárních meristémů stonků i kořenů, anatomii a velikost listů, podporuje, tloustnutí stonků a kořenů, prodlužování internodií a větvení, tzn. že zeslabuje apikální dominanci (Pritchard a kol. 1999). CO2 zvyšuje aktivitu ACC oxidázy a tím i na ACC závislou produkci etylénu (Dong a kol. 1992).

2.2.3. Apikální dominance u hrachu Nejpodrobněji studovaná růstová korelace je, vzhledem ke svému významu pro regulaci větvení rostlin, apikální dominance, tj. růstová nadvláda vrcholu lodyhy nad postranními pupeny, popř. nadvláda kořene nad postranními kořeny. Jak příčiny inhibice růstu laterálního (děložního) pupenu růstovým vrcholem, tak i příčiny iniciace pupenu k růstu byly zkoumány v mnoha pracích a existuje řada teorií vysvětlujících tuto korelaci. Rozšířené používání termínu apikální dominance vede ke zdůrazňování skutečnosti, že apikální pupen je primárním zdrojem kontroly apikální dominance a k opomínání vlivu ostatních orgánů (kořenů, stonků nebo listů) při regulaci větvení stonku (Hosokawa a kol. 1990, Booker a kol. 2003). Například roubovací studie s rms (ramousus) mutanty hrachu poukazují na významný regulační vliv kořene a stonku (Beveridge a kol. 1994, 1996, 1997a, 1997b, Foo a kol. 2007). Při odstranění růstového

33

vrcholu je pro uvolnění nebo inhibici daného pupenu rozhodující stav ostatních pupenů (Stafstrom a kol. 1998, Shimazo-Sato a Mori 2001). To předpokládá komunikaci nejen mezi stonkovým vrcholem a jednotlivými pupeny, ale také komunikaci mezi pupeny navzájem. Jako slabě se větvící monopodiální rostlina vykazuje hrách poměrně silnou apikální dominanci a je vhodný pro výzkum vzdálené signalizace a vývoje pupenů. Postranní větve pocházejí ze sekundárních meristémů zakládaných v úžlabí listových primordií, tzv. úžlabních meristémů. Původ úžlabních meristémů zatím nebyl zcela objasněn, a proto není jisté zda se vyvíjejí ze skupin buněk odvozených od primárního apikálního meristému hlavního stonku (Grbič a Bleecker 2000) nebo jsou zakládány de novo (McConnell a Barton 1998). U hrachu se axilární meristémy vyvíjí ve většině nodů podél stonku a jejich vývoj obvykle nebývá ovlivněn do fáze dormantního pupenu, který obsahuje několik nevyvinutých listů a internodií. Vývoj úžlabního meristému je ovlivňován interakcí genotypu, vnějších podmínek prostředí a endogenních regulačních signálů. U hrachu je vývoj úžlabních meristémů a větví ovlivněn například fotoperiodou (Napoli a kol. 1999). Tvorbu postranních větví zde podporuje krátký den. Gravitace také může regulovat růst úžlabních pupenů (Prasad a Cline 1987), ale zdá se že princip regulace růstu pupenů se poněkud odlišuje od uvolnění pupenů při dekapitaci (Kitazawa a kol. 2008). Charakter větvení závisí i na věku rostliny. Starší rostliny obecně vykazují slabší apikální dominanci vedoucí k vyššímu větvení (Cline 1991). Na apikální dominanci má vliv také výživa rostliny (Li a kol. 2001), kdy deficience některých prvků způsobují restrikci růstu apexu a tím oslabují apikální dominanci. Endogenní regulace apikální dominance pravděpodobně spočívá hlavně na interferenci různých růstových regulátorů (Cline 1991, 1994; Chaudhry a Rasheed 2003), zejména na vzájemném poměru cytokininů a auxinů, který je považován za hlavní faktor ovlivňující větvení. K rychlému vyrůstání úžlabních pupenů dochází u hrachu po dekapitaci růstového vrcholu, což rostlině umožňuje udržení růstu a nahrazení míst případného reproduktivního vývoje. V pupenu uvolňovaném z apikální dominance se aktivují cytokininy (Hradilík 1975, Li a kol. 1995, Turnbull a kol. 1997). Podle Procházky a Jacobse (1984) jsou pro zvýšení obsahu cytokininů v pupenu uvolňovaném z inhibice důležité nejen cytokininy z kořene, ale také cytokininy přítomné v dělohách a v pletivech v bezprostřední blízkosti pupenů. Tento názor podporují také výsledky práce Madera a kol. (2003a), který zkoumal růst laterálních pupenů u klíčních rostlin cizrny. Pravděpodobně zde také hrají vliv cytokininy 34

syntetizované přímo v pupenu (Tanaka a kol. 2006). Hladina IAA se v těchto pupenech snižuje (Šebánek a Hradilík 1974, Šebánek a kol. 1982, Blažková a kol. 1999) a výhon, který v převládne v růstu a stane se dominujícím, exportuje více IAA (Li a Bangerth 1999). Inhibiční vliv vrcholu lze napodobit kyselinou indolyl-3-octovou (IAA) (Klíčová a Šebánek 1994, Cline 1996, Blažková a kol. 1999). Na význam IAA pro inhibici laterálních pupenů poukazuje také práce Symonse a kol. (2002) zabývající se mutací u hrachu způsobenou dominantní alelou Bsh, která způsobuje zvýšené větvení. U tohoto mutantu bylo zjištěno výrazné snížení obsahu volné IAA. Iniciace zainhibovaného pupenu k růstu lze dosáhnout aplikací cytokininu k tomuto pupenu (Pillay a Railton 1983, Li a Bangerth 2003). IAA a cytokininy jsou významnými faktory kontrolujícími apikální dominanci a její obnovu na dekapitované rostlině (Klee a Estelle 1991, Cline 1994, Blažková a kol. 1999, Wilson 2000, Cline a Sadeski 2002). Není však pravděpodobné, že poměr cytokininů a auxinů je jediným regulačním faktorem. Ačkoli například u rms1 a rms2 mutantních rostlin hrachu dochází ke zvýšenému větvení, bazipetální transport auxinu ani obsah volné IAA u nich není omezen, což naznačuje, že geny Rms1 a Rms2 působí v podnožích a ve stoncích na hladinu nějaké mobilní látky (nebo látek), která působí společně s auxinem. Přinejmenším u mutantu rms1 se nezdá pravděpodobné, že by zde auxin ovlivňoval hladinu cytokininu, která je u mutantních rostlin velmi nízká (Beveridge a kol. 1997b, 2000). Na inhibici růstu pupenů či na jejich uvolňování se však podílejí i další látky, jejichž vliv nelze zanedbat. Především je to ABA, která inhibuje růst pupenu. Cline a Oh (2006) uvádějí, že bazálně aplikovaná ABA je tranportována akropetálně a je schopna částečně obnovit apikální dominanci, což naznačuje interakce mezi auxinem, ABA a pravděpodobně nějakým dalším růstovým inhibitorem. V pupenech hrachu uvolňovaných z inhibice byl zaznamenán pokles kyseliny abscisové (ABA) (Šebánek a Hradilík 1978). Pokles ABA v uvolněných pupenech zaznamenali také Everat-Bourbouloux a Charnay (1982) u bobu, Gocal a kol. (1991) u fazolu a Mader a kol. (2003b) u cizrny. Další významnou látkou regulující růst je etylén, který je schopen inhibovat růst úžlabních pupenů (Burg a Burg 1968, Blake a kol. 1983). Etylén však může také oslabovat apikální dominanci a podporovat růst úžlabních pupenů svým inhibičním vlivem na růstový vrchol (Prasad a Cline 1987) nebo, u klíčních rostlin petúnie, snížením poměru mezi auxinem a cytokininem (Haver a kol. 2003). Z dalších látek například Nakajina a kol. (2002) uvádí, že indol-3-aldehyd inhibuje růst pupenů. Nedávno byly identifikovány tzv. strigolaktony, skupina 35

terpenoidních laktonů, které se zdá se podílejí na regulaci větvení (Hayward a kol. 2009, Brewer a kol. 2009).

2.2.4. Korelace mezi dělohou a jejími úžlabními pupeny Jak je vidět z předchozí kapitoly bylo zpracováno mnoho recentních prací věnujících se

fytohormonální podstatě nadvlády vrcholu nad postraními pupeny.

V případě, že klíční rostlině odstraníme apex, je možné sledovat korelační vztahy mezi dělohami a jejich úžlabními pupeny. V roce 1908 profesor Dostál, který se zabýval studiem apikální dominance, objevil a popsal jev, kdy pokud u klíčních rostlin hrachu odstraníme apex a jednu dělohu, bude převažovat růst pupenu nad dělohou odstraněnou (Dostál 1908, Dostál 1959b, Hradilík 1975). Inhibiční vliv dělohy na úžlabní pupen se více méně projevuje u všech zkoumaných odrůd hrachu (Dostál 1959a, Šebánek a kol. 1982, Procházka a Jacobs 1984) a závisí na věku klíční rostliny. Po čtrnácti dnech se začíná postupně snižovat. Podrobně se korelacemi mezi dělohou a úžlabními pupeny zabýval Hradilík (1994), který ve své práci shrnul vliv nejrůznějších zásahů do dělohy a jejich vliv na frekvenci růstu kotylárů. Byl zde zmíněn též vliv částečné redukce dělohy, která podporovala růst kotylárů v úžlabí redukované dělohy. V práci Labourové (2003) byl zkoumán vliv transplantací epikotylu do dělohy ve sterilních podmínkách. Bylo prokázáno, že transplantace epikotylu do dělohy má vliv na úžlabní pupen dělohy, do které je transplantován. Kotylár dělohy s transplantovaným epikotylem byl inhibován a byla vyslovena domněnka, že by to mohlo být způsobeno inhibičním vlivem auxinu obsaženém v epikotylu. Také byl studován vliv extraktu z děloh hrachu a ukázalo se, že má při aplikaci na dělohu v podobě agarového bločku na růst děložních pupenů negativní vliv. Kořen významně ovlivňuje růst klíční rostliny hrachu (Fišerová a kol. 2006a) a jeho přítomnost má vliv také na růst pupenů v úžlabí dělohy. Když u hrachu s dekapitovaným vrcholem a jednou dělohou, odstraníme dominující kotylár (u dělohy odstraněné), vyrůstá kotylár dělohy ponechané. Je-li však rostlině odstraněn také kořen, vyrůstá opět pupen u dělohy odstraněné (Dostál 1967). Vliv kořene je možné nahradit giberelinem (Šebánek 1972) nebo BA (Tan a kol. 1979, Tan 1980). Vliv fytohormonů (IAA, GA, BA a ABA) a dalších látek na regeneraci děložních pupenů u hrachu byl zkoumán pomocí aplikace těchto látek na dělohy nebo děložní pupeny (Šebánek 1971, 1972, Tan 1980, Klíčová a kol. 2004). Z výsledků aplikačních

36

experimentů vyplývá, že IAA působí stimulačně pouze ve velmi nízkých koncentracích a podporuje zvyšování hmotnosti i délky kotylárů. Ve fyziologických koncentracích nemá na podporu zainhibovaného děložního pupenu vliv a při vyšších koncentracích působí inhibičně. Podpora růstu zainhibovaného kotyláru se projevuje pouze u GA a BA (Klíčová a kol. 2004). GA působí stimulačně na hmotnost i délku kotyláru úměrně použité koncentraci. BA zvyšuje zejména hmotnost kotyláru, ale pouze ve vyšších koncentracích. Cytokininy jsou schopny vymanit pupen z inhibice dělohy (Hradilík 1975). Brasinosteroidy nemají vliv na růst děložních pupenů při aplikaci na dělohu, ale při aplikaci na pahýl uříznuté dělohy jsou schopny inhibovat růst jejího pupenu. Aplikace aminoetoxyvinylglycinu (AVG), který inhibuje produkci etylénu, nemá na uvolnění kotylárů z inhibice vliv (Labourová 2003). L-glutamin může u intaktních rostlin zesilovat apikální dominanci a při nanesení na pahýl odstraněné dělohy dekapitovaných rostlin způsobuje tzv. korelační zvrat, tj. zvyšuje růst kotylárů u dělohy ponechané. Pokud byl L-glutamin aplikován společně s 0,1% IAA, ke korelačnímu zvratu nedošlo (Hřibová 1994). Při aplikaci k pupenu jedné dělohy je ABA schopna brzdit jeho růst úměrně koncentraci a je-li dodána k pupenu dělohy odříznuté, dochází u vyšších koncentrací ABA k silnějšímu růstu pupenu ponechané dělohy (Šebánek a Zelinka 1971). K podpoře růstu kotyláru dělohy ponechané dochází i při nanesení ABA na pahýl řapíku dělohy odstraněné (Šebánek 1971, Vřešťálová-Nováková 1992). Model klíční rostliny hrachu s odstraněnou dělohou byl také využíván ke studiu změn obsahu fytohormonů v zainhibovaném nebo uvolňovaném pupenu. Hradilík (1975) zjistil vzestup hladiny cytokininů při uvolňování pupenů z korelativní inhibice dělohy. Pokud je odstraněn dominující děložní pupen, inhibovaný děložní pupen je uvolněn z inhibice a začíná růst. Toto uvolnění pupenu z inhibice je také doprovázeno výrazným zvýšením obsahu cytokininů a giberelinů v pupenu. V uvolňovaném pupenu současně dochází k poklesu v obsahu endogenního IAA (Hradilík 1976, Šebánek a kol. 1988). V pupenu amputované dělohy byl zjištěn pokles kyseliny abscisové (Šebánek a Hradilík 1978) a také zvýšení produkce etylénu, které souvisí se zvýšením aktivity peroxidázy v pupenu a se snížením obsahu IAA (Hradilík 1976). Produkce etylénu klíčními rostlinami hrachu ve vztahu k uvolnění děložních pupenů z inhibice byla studována v práci Fišerové a kol. (2006b), kdy autoři zkoumali produkci etylénu. Bylo zjištěno, že v prvních hodinách po iniciaci růstu děložních výhonů produkce etylénu prudce stoupá, po šesté hodině klesá a po 24 hodině se již udržuje na poměrně nízké úrovni. Intaktní, dekapitované a děloh zbavené rostliny byly co do produkce etylénu 37

sledovány v práci Hradilíka a kol. (1986), bylo zjištěno že produkce etylénu intaktních rostlin je nejprve nízká, a pak se zvyšuje, kdežto u dekapitovaných rostlin se produkce etylénu zpočátku prudce zvýší a později klesá a je nižší než u intaktních rostlin. Amputace děloh nevedla k výrazným změnám v produkci etylénu, ale vyvolávala zvýšení produkce etanu. Růstové korelace klíčních rostlin hrachu jsou ovlivněny nejen vnitřními faktory, ale také vnějšími podmínkami, zejména výživou a světlem. U minerální výživy se na světle projevil negativní vliv nedostatku vápníku u kotyláru dělohy amputované. Ve tmě působil na růst kotyláru negativně nejen nedostatek vápníku, ale také dusíku a hořčíku. Nedostatek dusíku naopak podporoval růst kořenového systému, podobně jako nedostatek fosforu (Jelonková 1997). Na růst obou kotylárů působí ve tmě negativně nedostatek dusíku, vápníku, železa a fosforu (Vřešťálová-Nováková 1992). Při použití bodového světla a přímém při nasvícení kotyláru (ne jen dělohy) je možné uvolnit jej z inhibice. Nasvícením zainhibovaného kotyláru bodovým světlem však není možné navodit korelační zvrat (Hřibová 1994).

38

3. Cíl práce Cílem disertační práce bylo prohloubit vědecké poznatky a přispět k pochopení růstových korelací mezi dělohou a jejími úžlabními pupeny u hrachu setého (Pisum sativum L.). Konkrétně byly řešeny následující problémy: 1. morfologie dělohy s ohledem na vedení cévních svazků, 2. genetické vlivy na korelace mezi dělohou a jejími úžlabními pupeny, 3. vliv zásahů do klíční rostliny hrachu, 4. změny v obsahu endogenních hladin vybraných růstových regulátorů a jiných látek v souvislosti se zásahy do klíční rostliny hrachu.

39

4. Materiál a metodika 4.1. Materiál V experimentu zaměřeném na vliv odrůdy na růst děložních pupenů byly použity odrůdy: Algera, Andrea, Citrina, HM6, Oskar, Moravan, Olivín, Herold, Menhir, Solara, Tolar (osivo získáno z Agritec s. r. o., Šumperk), Kamelot, Tempra, Jackpot, Sponzor, Terno, Gotik, Power, Canis, Baryton (osivo získáno ze zásob ÚKZÚZ, Brno a osivo odrůdy Baryton také od Saaten-Union, Brno), Viktorie 75 (osivo získáno z kolekce genových zdrojů rodu Pisum, Agritec s. r. o., Šumperk), Torsdag a jeho rms4mutant (osivo získáno na MZLU). Součástí tohoto experimentu bylo také ověření vhodnosti odrůd pro výzkum apikální dominance a růstu děložních pupenů na modelu klíční rostliny hrachu. Nejvhodnější se pro tento výzkum ukázala být odrůda Baryton. Pro srovnání byly experimenty prováděny na dvou odrůdách s rozdílnými vlastnostmi: odrůdě Baryton (polní odrůda, hladká žlutá semena, slabší apikální dominance – častější prorůstání obou děložních pupenů při odstranění růstového vrcholu, inhibice zainhibovaného koryláru není tak výrazná) a odrůdě Oskar (zahradní odrůda, svrasklá zelená semena, silnější apikální dominance – po odstranění růstového vrcholu je jeden z prorůstajících kotylárů velmi rychle inhibován druhým, který v růstu převládá). U části experimentů náročnějších na čas, přípravu a provedení, a pro odběry materiálu pro rozbory apod. byla používána pouze odrůda Baryton.

4.2. Podmínky pěstování etiolovaných klíčních rostlin hrachu Semena hrachu byla nejprve po dobu 16 hodin zbobtnána ve vodě, a poté pěstována buďto v nádobách s perlitem nebo na klíčidlech, ve tmě při teplotě 20°C ± 2°C a 90% vlhkosti. Ve všech pokusech byly používány čtyřdenní etiolované klíční rostliny s 0,5 – 1 cm dlouhým epikotylem a 5 – 6 cm dlouhým kořenem. Čtyřdenní klíční rostliny hrachu byly různými způsoby ošetřovány a dále pěstovány v kultivačních nádobách s perforovanými víčky (Obrázek č. 9), tak že kořínek byl prostrčen do vody a nadzemní část rostliny zůstala ležet na víčku (Obrázek č. 10a), při stejné teplotě a vlhkosti i světelných podmínkách jako při počátečním pěstování. V těchto nádobách byly v závislosti na druhu pokusu pěstovány buď v destilované vodě po dobu 3 nebo 7 dní, nebo v Richterově roztoku po dobu 14 dní.

40

V Richterově roztoku byly rostliny pěstovány v případě transplantačních pokusů, které trvaly delší dobu, takže v destilované vodě by docházelo k odumírání vegetačních vrcholů vlivem nedostatku některých živin, zejména vápníku, který se v dělohách velmi rychle vyčerpává (Fergusson a Bollard 1976) a jeho nedostatek způsobuje zastavení růstu a černání vegetačních vrcholů, což by mělo nežádoucí vliv na interpretovatelnost výsledků pokusu.

Obrázek č. 9. Kultivační nádoba s hráškem

Obrázek č. 10. Nákres kultivační nádoby: a – boční řez, b – víčko

Optimalizace počtu rostlin na nádobu Klíční rostliny rostoucí ve společné nádobě se mohou vzájemně ovlivňovat, jednak produkcí různých plynů, zejména plynného hormonu etylénu, který má vliv na morfogenezi a růst rostlin (Peck a kol. 1998, Binder a kol. 2004) a jednak vylučováním různých kořenových výměšků do roztoku (alelopatie), či případnou konkurencí o živiny (u rostlin pěstovaných v Richterově roztoku). Pro ověření vlivu hustoty rostlin v nádobě byly dekapitované rostliny (2D), dekapitované rostliny s dělohou úplně odstraněnou (1D) a dekapitované rostliny s dělohou redukovanou na polovinu (1/2D) odrůdy Power pěstovány po 32, 55 nebo 80 rostlinách na nádobu o objemu 0,74 l. Po sedmi dnech byla změřena délka kotylárů a kořenů u 50 rostlin. U všech variant byl u 3×50 rostlin

41

vyhodnocen také podíl (%) kotylárů rostoucích u dělohy ponechané (pravé), u dělohy redukované (levé) a u obou děloh. Mezi jednotlivými variantami byly zjištěny rozdíly v intenzitě růstu (délce) dominantního pupene u 1/2D rostlin, kde při střední hustotě růstu docházelo k mírné depresi růstu dominantního pupene, a u 2D rostlin, kde nejvyšší hustota rostlin výrazně stimulovala růst dominantního pupene, a v intenzitě růstu (délce) kořene u 1D rostlin, kde při střední hustotě růstu docházelo k mírné depresi růstu kořene, a 1/2D rostlin, kde zvyšování hustoty rostlin stimulovalo růst kořene (Graf č. 1). V podílu (%) kotylárů nebyly mezi nádobami s 32, 55 a 80 rostlinami významné rozdíly. Aby se vliv hustoty rostlin v nádobě naprosto vyloučil byla pro pěstování rostlin v dalších pokusech zvolena jednotná hustota 55 rostlin na nádobu. Pro transplantační pokusy byla z důvodu lepší manipulovatelnosti s jednotlivými rostlinami zvolena nižší hustota (32 rostlin na nádobu) a z tohoto důvodu a také z důvodu odlišné výživy u nich následně nebyla vyhodnocována intenzita růstu kotylárů ani kořenů, které jsou změněnými podmínkami pokusu významně ovlivňovány a proto by získané výsledky nebyly srovnatelné s výsledky ostatních pokusů. 60 50

mm

40 30 20 10 0 Z

D

K

Power 2D 32 rostlin

Z

D

K

Power 1D 55 rostlin

Z

D

K

Power 1/2D

80 rostlin

Graf. č. 1. Vliv hustoty rostlin na růst kotylárů a kořene

4.3. Způsoby ošetření klíčních rostlin hrachu Růstové korelace zkoumáme zpravidla tak, že určitý orgán nebo složku rostlinného těla odřízneme nebo zasádrujeme, případně zatemníme nebo jinak inaktivujeme, načež pozorujeme morfogenetickou reakci ve zbývajících částech rostliny

42

(Šebánek 1963). V této práci byly rostliny hrachu zpravidla kvůli odstranění vlivu růstového vrcholu nejprve dekapitovány, a poté byly prováděny zásahy do děloh. Klíční rostlina hrachu má podobně jako embryo hrachu pouze jednu osu souměrnosti. Proto byl pro její popis použit dorzo-ventrální koncept z embryologie živočichů, který je používán i pro popis morfologie embrya hrachu (Liu a kol. 1999). Ventrální (přední) strana klíční rostliny je ta, kam směřuje apex, a dorzální (zadní) strana ta, kam směřuje kořínek. Jediná osa souměrnosti prochází mezi dělohami napříč kořínkem a apexem, podobně jak je znázorněno u embrya na Obrázku č. 1. U klíční rostliny je potom možné rozeznat také pravou a levou stranu a pravou a levou dělohu (Obrázek č. 11). U všech klíčních rostlin byly veškeré zásahy prováděny do stejné, a to levé, dělohy. Také u rostlin s neošetřenými dělohami byl růst děložních pupenů vyhodnocován s ohledem na levou a pravou stranu, což umožnilo spolehlivě ověřit zda k prorůstání kotylárů dochází skutečně rovnoměrně u jedné nebo druhé dělohy. Dělohy byly redukovány na jednu čtvrtinu (varianta 1/4D), polovinu (varianta 1/2D), tři čtvrtiny (varianta 3/4D) nebo úplně (varianta 1D) (Obrázek č. 12), nebo do nich byly vytvářeny různé zářezy (varianty Z1 až Z4) (Obrázek č. 13), popřípadě byly do rostlin implantovány různé části rostlin (epikotyly, dělohy). Po sedmi dnech pěstování byla vyhodnocena délka dominantního a zainhibovaného kotyláru a kořene a podíl (%) kotylárů rostoucích u dělohy neošetřené (pravé), u dělohy ošetřené (levé) a u obou děloh.

Obrázek č. 12. (Vlevo). Znázornění použitých variant klíčních rostlin (redukce dělohy) Obrázek č. 13. (Vpravo). Znázornění umístění zářezů do dělohy

43

Obrázek č. 11. Znázornění klíčních rostlin hrachu A: klíční rostlina z boku, B: klíční rostlina ze zadu, C: klíční rostlina ze předu, P: pravá děloha, L: levá děloha, d: dorzální (přední) strana, v: ventrální (zadní) strana

Metodika transplantace Semena hrachu byla zbobtnána ve vodě po 16 hodin, poté byla naklíčena na klíčidlech ve tmě, při teplotě 20°C ± 2°C a relativní vlhkosti 90 % po 4 dny. Do jedné dělohy čtyřdenních klíčních rostlin byl transplantován buď epikotyl nebo děloha. Dělohy a epikotyly pro transplantaci byly odebírány taktéž ze čtyřdenních rostlin. Pro transplantaci byly vybírány dostatečně dlouhé epikotyly, které byly zakráceny na jednotnou délku 1,7 cm a bazálním konci seříznuty do špičky, aby se vytvořila dostatečná kontaktní plocha s dělohou. Do dělohy byl pomocí jehly o průměru 1,5 mm vytvořen okrouhlý otvor o průměru cca 2 mm a hloubce cca 5 mm, do kterého byl zasunut patřičně upravený epikotyl (Obrázek č. 14). Dělohy byly před transplantací zbaveny řapíku a v místě jeho napojení k děloze byly seříznuty do špičky (Obrázek č. 15). Touto seříznutou stanou byly zasunuty do připraveného zářezu v děloze, do které byly transplantovány.

Obrázek č. 14. Transplantace epikotylu

Obrázek č. 15. Transplantace dělohy, K: kalus

Takto ošetřené rostliny byly pěstovány ve stejných kultivačních nádobách jako při jiných ošetřeních, ale tyto nádoby byly přiklopeny další nádobou a obaleny potravinářskou fólií, aby se vytvořilo vhodné mikroklima s vyšší vlhkostí a zabránilo se

44

usychání transplantovaných částí rostlin. Části rostlin byl ihned po transplantaci dekapitován vlastní epikotyl a část byla ponechána s intaktním růstovým vrcholem po další čtyři dny a teprve pak dekapitována. Po deseti dnech byla hodnocena frekvence prorůstání kotylárů a délkový přírůstek u transplantovaných epikotylů. Úspěšnost transplantací byla při této metodice poměrně vysoká. Při transplantaci epikotylů docházelo k zajímavému jevu, kdy část (28 – 53 %) epikotylů k děloze přirůstalo (tvorba kalusového pletiva) a část (19 – 44 %) do dělohy zakořeňovala (tvorba kořenů). Délkový přírůstek transplantovaných epikotylů dosahoval 2-5 mm za 10 dní. Nebyly zjištěny průkazné rozdíly mezi přírůstkem přirostlých a zakořeněných epikotylů. Jak u přirostlých tak u zakořeněných epikotylů se na ráně vytvářelo kalusové pletivo. Dělohy při transplantaci nezakořeňovaly, ale pouze přirůstaly (31 – 47 %). V místě srůstu se vytvářelo kalusové pletivo (Obrázek č. 15). V jednom z pokusů v této práci bylo dokázáno, že izolované dělohy čtyřdenních rostlin jsou schopny do určité míry zakořeňovat, i když jejich zakořeňovací, schopnost je pravděpodobně mnohem nižší než u epikotylů. To že dělohy nezakořeňovaly při transplantaci mohlo být způsobeno odstraněním řapíku, který je u děloh hlavním místem tvorby kořenů. Také zde možná pozorování nebylo dostatečně dlouhé, aby se případné zakořeňování děloh zachytilo, protože dělohy zakořeňují až po delší době (po 7 až 14 dnech). Při transplantaci epikotylů se projevil vliv intaktního růstového vrcholu, pokud byly rostliny dekapitovány až po čtyřech dnech významně se zvýšilo přirůstání a snížilo zakořeňování epikotylů. Koukourikou-Petridou a Bangerth (1997) uvádí, že zakořeňování řízku u hrachu je podporováno omezením produkce etylénu, která se při dekapitaci rostlin zvyšuje. Na množství odumřelých epikotylů neměla doba dekapitace průkazný vliv (Graf č. 2). 70 60 50

%

40 30 20 10 0 Dekapitované Dekapitované Dekapitované Dekapitované ihned po 4 dnech ihned po 4 dnech Transplantace epikotylu Odumřelo

Transplantace dělohy

Přirostlo

Graf č. 2. Úspěšnost transplantací 45

Zakořenilo

4.4. Podmínky kultivace izolovaných děloh Pro ověření růstové aktivity dělohy, její inhibiční funkce a vlivu přítomnosti osy byly provedeny pokusy s kultivací izolovaných děloh odebraných z různě starých rostlin. Izolované dělohy byly kultivovány v nesterilních podmínkách na klíčidlech (v počtu 3×50 děloh na klíčidlo) s destilovanou vodou po dobu 21 dní. Klíčidla byla uložena ve tmě při teplotě 20°C ± 2°C a 80% vlhkosti. Po 7, 14 a 21 dnech byl vyhodnocován podíl (%) zakořeněných děloh u 3×50 děloh na variantu a po 21 dnech byla zjišťována také navážka kořenů odebraných z 5×25 děloh.

Metodika pěstování rostlin a odběru děloh Pro pokus byla použita semena novošlechtění HM6 od firmy Agritec s. r. o. Bylo odebráno osm variant děloh z různě starých klíčních rostlin. U všech variant byly dělohy odříznuty od klíční rostliny nebo zbobtnalého semene, tak aby na řapíku nezůstal děložní pupen. Takto upravené dělohy byly položeny na klíčidlo na dvojitou vrstvu filtračního papíru plochou (vnitřní, adaxiální) stranou dolů. U první (HM6 6), druhé (HM6 24) a třetí (HM6 48) varianty byla před odběrem děloh semena zbobtnána v destilované vodě po 6, 24 a 48 hodin. U čtvrté varianty (HM6 4) byla semena zbobtnána ve vodě po dobu 16 hodin a poté 4 dny pěstována na klíčidle. U páté varianty (HM6 10) byly klíční rostliny napěstované na klíčidle stejným způsobem jako u varianty čtvrté dopěstovány v krabičkách s destilovanou vodou, za stejných podmínek jako v ostatních pokusech, po dalších šest dní. U šesté, sedmé a osmé varianty byly klíční rostliny napěstované na klíčidle stejným způsobem jako u varianty čtvrté dekapitovány a pěstovány v krabičkách s destilovanou vodou po dobu 24 hodin (HM6 4-24), 48 hodin (HM6 4-48) a 5 dní (HM6 4-5).

4.5. Stanovení růstových regulátorů a dalších látek 4.5.1. Odběry vzorků Vzorky materiálu pro stanovení CK, ABA A ACC byly odebírány pouze ze tří variant a to z dekapitovaných rostlin (2D), z dekapitovaných rostlin s jednou dělohou zmenšenou na polovinu (1/2D) a z dekapitovaných rostlin s jednou dělohou úplně odstraněnou (1D). Tyto rostliny byly pěstovány stejným způsobem jako v ostatních pokusech s redukcí dělohy a po 72 hodinách od ošetření byly děložní pupeny odebírány

46

do ependorfek nachlazených v tekutém dusíku. Pupeny od pravé a levé dělohy byly odebírány odděleně. Pro stanovení ABA byly odebrané vzorky uschovány v mrazícím boxu při –20°C. Pro stanovení CK a ACC byly lyofylizovány a uskladněny v exsikátoru. Pro stanovení rozložení obsahu růstových regulátorů v rostlině byly u intaktních čtyřdenních rostlin odebírány odděleně dělohy, epikotyly, hypokotyly a kořeny.

4.5.2. Stanovení produkce etylénu, etanu a CO2 klíčními rostlinami hrachu Produkce etylénu, etanu a CO2 byla sledována pouze u odrůdy Baryton u všech variant ošetření dělohy s výjimkou transplantací. Do skelněných nádob o objemu 260 ml s 90 ml destilované vody bylo do plastových stojánků (Obrázek č. 16) umístěno vždy po pěti rostlinách hrachu. Nádoby byly uzavřeny kovovým uzávěrem se septem umožňujícím odběr plynného prostředí vpichem injekční stříkačky a uloženy ve tmě při 20°C ± 2°C. Vždy po jedné hodině kultivace v uzavřené nádobě byly injekčními stříkačkami o objemu 2 ml (Obrázek č. 16) provedeny dva odběry cca 1,5 ml ovzduší z každé nádoby, jeden pro zjištění obsahu etylénu a etanu a jeden pro zjištění obsahu CO2. Poté byly nádoby otevřeny, odvětrány a znovu uzavřeny pro další odběr. Produkce etylénu, etanu a CO2 byla měřena po 1, 2, 3, 4, 5, 24, 48 a 72 hodinách po ošetření. Etan a etylén byl stanoven v 1 ml sledovaného ovzduší odebraného injekční stříkačkou na plynovém chromatografu firmy FISSONS INSTRUMENT s kapilární kolonou HP-PLOT/Al2O3. Teplota detektoru byla 200°C, nástřiku 230°C a kolony 40°C (Fišerová a kol. 2001). Obsah CO2 byl stanoven také v 1 ml sledovaného ovzduší na plynovém chromatografu CHROM 5 s katharometrem s 1,5 m dlouhou náplňovou kolonou plněnou PORAPAKem Q.

Obrázek č. 16. Injekční stříkačky v pryžové zátce a stojánek 47

Statistické hodnocení bylo provedeno po přepočtu na standard etylénu a CO2 v 1 ml ovzduší z prostoru, ze kterého byl standard odebrán (koncentrace v nádobě). Pro určení produkce plynů rostlinným pletivem byla koncentrace plynů přepočtena na hmotnost rostlinného materiálu v nádobě a na objem nádoby (260 ml). Výsledky byly po statistickém zhodnocení zpracovány graficky.

4.5.3. Stanovení obsahu ACC Extrakce ACC probíhá v 70% etanolu. Po odstranění pevných částí se etanol odpaří a ve vodné fázi vzorku se vymrazí chlorofyl (Petruzzelli a kol. 2000). Účinnost extrakce se dosahuje nad 80 %. Postup: Rostlinný materiál zhomogenizovaný v 70% ethanolu (5 ml na g čerstvé hmoty) se ponechá 12 hod. při -20°C a po rozpuštění následuje centrifugace při 10 000 g po dobu 10 minut. Supernatant se slije a usazeniny se rehomogenizují v 70% etanolu a znovu následuje centrifugace. Spojené supernatanty se odpaří při 40°C na vodnou fázi (do objemu cca 1 ml), následuje sonikace v ultrazvukové lázni a obsah odpařovací baňky se převede (pipetou) do zkumavky (ependorfky), nechá se zamrazit (vymražení chlorofylu) a opět zcentrifugue.

Oxidace ACC na etylén Pro převedení ACC na etylén se používá metoda podle Lizady a Yanga (1979). V tomto kroku se ACC v přítomnosti HgCl2 oxiduje chlornanem sodným (NaOCl) na etylén, podle rovnice:

ACC

HgCl2

Cl- + H2O + CH2=CH2 + NaC-CO2-

NaOCl, NaOH

Účinnost oxidace se dosahuje nad 80%. Postup: Vyčištěný vzorek se převede do 10 ml tuby s těsněním umožňujícím odběr plynů, přidá se 0,5 ml 10 mM HgCl2 na 1 ml (vzorky je nutné uchovávat na ledu) a 250 ml vychlazené směsi 5% NaOCl : saturovaný NaOH (2 : 1). Obsah tuby se krátce zamíchá (na vortexu) a uloží do ledu na 60 minut a po promíchání se z tuby injekční stříkačkou odebere 1 ml plynů a změří se na plynovém chromatografu. Podrobná metodika zpracována v článku Fišerové a kol. (2008).

48

4.5.4. Stanovení obsahu cytokininů Extrakce a čištění vzorků Zlyofylizované vzorky byly zhomogenizovány v 70% metanolu, tři hodiny vytřepány v chladu a poté ponechány přes noc při -20°C. Po odpaření metanolu na vodnou

fázi

následovalo

rozštěpení

ribotidů

cytokininů

kyselou

fosfatázou

v acetátamonném pufru a čištění pomocí iontoměničové chromatografie (P-celulóza) a chromatografie na reverzní fázi (DEAE-celulóza, Sep-Pak) (Macháčková a kol. 1993). Po eluci předčištěné cytokininové frakce metanolem se provádí zkoncentrování vzorků odpařením metanolu a filtrace.

Obrázek č. 17. Homogenizace vzorků

Obrázek č. 18. Iontoměničová chromatografie

HPLC separace HPLC separace (přístroj firmy Ecom) cytokininových bází a jejich ribosidů probíhá na koloně Nucloeosil 5 s C18 sorbentem s 250 x 4,6 µm I. D. s velikostí pórů 5 µm a průtokem mobilní fáze 1000 µl/minutu se složením mobilní fáze A: metanol, B: 0,05 % TFA (gradient: 0 – 3 minuty 15 % A, 3 – 11 minut 40 % A, 11 – 16 minut 60 % A). UV signál je detekován při 260 nm a jednotlivé frakce po sobě následujících cytokininů se sbírají dle příslušných retenčních časů. Frakce se odpařují do sucha a pro ELISA kvantifikaci se rozpouští v TBS pufru (900 µl).

ELISA a vyhodnocení Ke stanovení cytokininů se používají polyklonální protilátky vůči jednotlivým frakcím cytokininů (STRNAD 1996). Do jamek mikrotitrační destičky se pipetuje protilátka (150 µl) v roztoku uhličitanového pufru (5 µl MAb v 15 ml uhličitanového pufru na 1 desku) a nechá se inkubovat přes noc. Po promytí destičky destilovanou

49

vodou se stěny potáhnou roztokem BSA v TBS pufru a následuje hodinová inkubace při laboratorní teplotě a po promytí destilovanou vodou se do jamek pipetuje TBS pufr (50 µl), standardy a vzorky (50 µl), dále do všech jamek s výjimkou blanku konjugát alkalické fosfatázy a stanovovaného cytokininu v BSA. Na závěr se pipetuje substrát (para-nitrofenylfosfát rozpuštěný v uhličitanovém pufru: 1 mg/ml). Po hodinové inkubaci se barevná reakce zastaví 5M KOH. ELISA se vyhodnocuje fotometricky při vlnové délce 405 nm: obsah cytokininů je nepřímo úměrný absorbanci naměřené v roztocích jednotlivých jamek mikrotitrační destičky v porovnání s řadou standardů, minimální a maximální vazbou protilátky. Příslušné absorbance vzorků se odečtou z kalibrační křivky. Zjištěné hodnoty byly v programu Excel přepočítány na gram čerstvé hmotnosti a byly z nich vypočítány průměry a střední chyby, které byly vyneseny do grafů.

4.5.5. Stanovení obsahu ABA Příprava vzorků a stanovení ABA Vzorky byly zhomogenizovány pomocí mořského písku v desetinásobném množství vody než byla jejich navážka. Poté byly po 14 dní uchovávány při -20°C, během této doby byly třikrát rozmraženy a po 7 dnech byly po 12 hodin vytřepány na třepačce při teplotě 5°C. Obsah kyseliny abscisové (ABA) byl stanoven vysoce citlivou kvantitativní (detekční limit v pg) metodou RIA (radioimunoanalytické stanovení), která využívá schopnosti rozpoznání molekuly ABA monoklonální protilátkou MAC 252 (Quarrie a kol. 1988). Extrakt byl zcentrifugován 5 minut při 5000 otáčkách za minutu a pro stanovení byl používán čistý extrakt bez sedimentu obsahujícího mořský písek, části buněk apod. Do ependorfek byl napipetován vzorek, 3H-ABA, protilátka MAC a PBS (fosfátový pufr), a nechaly se inkubovat po dobu jedné hodiny při teplotě 4°C. Poté byl přidán 100% síran amonný, následovala inkubace půl hodiny a centrifugace 10 minut při 12500 otáčkách za minutu. Po odsátí supernatantu se k sedimentu přidal 50% síran amonný a roztřepal se na vortexu. Následovala další centrifugace a získaný sediment se rozpustil v destilované vodě a byl přidán dioxanový scintilátor. Radioaktivita byla měřena na přístroji Packard TRI-CARB 2900TR. Získané hodnoty byly přepočítány na ng v jednom gramu čerstvé hmotnosti, byly z nich vypočítány průměry a střední chyby, které byly vyneseny do grafů v programu EXCEL.

50

4.6. Příprava mikroskopických preparátů Pro lepší pochopení dějů, probíhajících v děloze, byly z ultratenkých řezů děloh vytvářeny preparáty a podle jejich fotografických snímků pak bylo ověřeno vedení cévních svazků v dělohách. Ultratenké řezy dělohami byly vytvářeny v různých směrech. Část děloh byla řezána podélně (podél adaxiálního povrchu) ve směru od řapíku, část příčně (od abaxiálního povrchu k adaxiálnímu) ve směru od řapíku a část příčně ve směru kolmo na řapík.

4.6.1. Odběr a příprava rostlinného materiálu Požadované části rostlin (orgány, rostlinná pletiva) byly opatrně odděleny ostrým skalpelem a ponořeny do nádobky s fixačním roztokem o složení: Navanšin A (1,5 g CrO3 a 10 ml ledové kyseliny octové v 90 ml vody) + Navanšin B (40 ml 4% kyseliny mravenčí v 60 ml vody) 1:1, která byla vzduchotěsně uzavřena. Po 24 hodinách byly části rostlin z fixačního roztoku vyjmuty a dalších 24 hodin promývány pod tekoucí vodou. Po promytí byly odvodněny ve vzestupné etanolové řadě: destilovaná voda > 10% etanol > 30% etanol > 50% etanol > 70% etanol > 90% etanol > 96% etanol > 96% etanol. V každém z těchto roztoků byly ponechány po dobu 15 minut. V 70% etanolu je možné části rostlin krátkodobě uskladnit.

4.6.2. Převod do parafínu Odvodněná pletiva byla dále ve vzestupné xylémové řadě: etanol : xylém (3:1) > etanol : xylém (1:1) > etanol : xylém (1:3) > 100% xylém > 100% xylém, nasycena xylémem. V každém z těchto roztoků byly ponechány po dobu 15 minut. Při teplotě 60°C byly do xylému s částmi rostlin přidávány šupinky parafínu. Postupně (v 6 až 12 hodinových intervalech) byla odlévána směs xylému s parafínem a nahrazována čistým parafínem, až zůstal pouze čistý parafín. Parafínované části rostlin byly jednotlivě umístěny do papírových krabiček a zality do parafínu.

4.6.3. Řezání Získané parafínové bločky byly upevněny na dřevěné špalíčky a upraveny do tvaru krychle (popřípadě kvádru). Na mikrotomu z nich byly řezány řezy o tloušťce 12

51

µm, které byly nanášeny na polylyzínovaná podložní sklíčka, umístěná na topné desce při teplotě asi 40°C. Podložní sklíčka s nanesenými řezy se přes noc nechaly vyschnout.

4.6.4. Odparafínování řezů, barvení a uzavření Řezy přilepené na podložních sklíčcích byly odparafínovány a zavodněny v sestupné řadě: 100% xylém > 100% xylém > etanol : xylém (1:3) > etanol : xylém (1:1) > etanol : xylém (3:1) > 96% etanol > 96% etanol > 90% etanol > 70% etanol > 50% etanol > 30% etanol > 10% etanol > destilovaná voda > cestilovaná voda. V každém z těchto roztoků byly ponechány po dobu 3 minut. Řezy byly barveny podle Cojala a Brožka v bazickém fuchsínu po 15 – 25 minut a v pikroindigokarmínu 15 – 20 minut. Mezi jednotlivými barveními i po barvení byly důkladně opláchnuty destilovanou vodou. Po obarvení a opláchnutí byly opět odvodněny ve vzestupné etanolové řadě a po oschnutí byly pomocí solakrylu uzavřeny pod krycí sklíčko, tak aby byly všechny objekty zality solakrylem.

52

5. Výsledky a diskuse 5.1. Morfologie dělohy hrachu Za účelem ověření morfologie dělohy hrachu a zejména vedení cévních svazků v děloze byly vyhodnoceny fotografie mikroskopických preparátů ultratenkých řezů děloh vedených v různých směrech (viz. metodika kapitola 4.6.). Podrobná práce na téma morfologie dělohy hrachu byla zpracována u Pisum arvense L. (Smith a Flinn 1967). Vzhledem k tomu, že podle současné taxonomické nomenklatury není Pisum arvense L. samostatným druhem, ale jen podruhem Pisum sativum L. ssp. arvense Poir. (Bisby 1994), nebyly předpokládány zásadní rozdíly v morfologii dělohy. Na mikroskopických preparátech děloh čtyřdenních rostlin hrachu odrůdy Baryton byly pozorovány všechny čtyři druhy pletiv zmiňované Smithem a Flinnem (1967). Na povrchu dělohy je epidermis, pod ní je jedna vrstva malých hranatých buněk přiléhajících k sobě (hypodermis) a pod nimi zásobní parenchym ve kterém probíhají dobře vyvinuté cévní svazky. Zásobní parenchym je rozdělen na dvě zóny vnitřní (adaxiální) a vnější (abaxiální). Podobné rozdělení pletiv na dvě zóny je patrné již ve vyvíjejícím se semeni (Borisjuk a kol. 2003). Získané mikroskopické preparáty naznačují, že ve vedení cévních svazků se významně neliší od údajů uváděných u pelušky (Smith a Flinn 1967). Do děložního řapíku vstupují dva cévní svazky. Tyto cévní svazky se postupně dělí tak, že zhruba na úrovni vstupu do zásobního pletiva lze zaznamenat šest cévních svazků, které se dále postupně dělí. Na příčných řezech dělohou (od řapíku směrem ke spodní straně dělohy) bylo zjištěno, že žilnatina od řapíku ubíhá směrem k abaxiální straně dělohy a tvoří oblouk (Obrázek č. 21), který probíhá zhruba na rozhraní mezi vnější a vnitřní vrstvou zásobního parenchymu, podobně jako v lupenitém listu probíhají cévní svazky na rozhraní houbovitého a palisádového parenchymu. Na podélném řezu dělohou lze vidět jak žilnatina ubíhá od řapíku směrem k povrchu a vede ve vzdálenosti cca 500 až 1000 µm od povrchu dělohy (Obrázek č. 19) tak, že uprostřed zůstává přibližně polokulovitá oblast zásobního parenchymu bez cévních svazků - podle Smitha a Flinna (1967) se jedná o vnitřní zásobní parenchym. Buňky této vrstvy jsou více okrouhlé, než buňky ve vnější vrstvě. V zásobním pletivu, převážně ve vnitřní vrstvě, bylo zjištěno poměrně velké množství nepravidelných mezibuněčných prostorů různé velikosti. Zásobní látky v buňkách jsou již částečně vyčerpány (Obrázek č. 20), ale v rozporu s údaji uváděnými v práci Smitha a Flinna

53

(1967) se zdá, že odbourávání zásobních látek je ve vnitřní vrstvě v pokročilejším stádiu, než ve vnější vrstvě.

Obrázek č. 19. Podélný řez dělohou, šipkami označeno vedení žilnatiny

Obrázek č. 20. Detailní řez dělohou, 1: epidermis, 2: hypodermis, 3: buňka vnějšího zásobního parenchymu, 4: buňka vnitřního zásobního parenchymu, 5: vodivá pletiva, 6: mezibuněčné prostory, 7: buněčná stěna

54

Obrázek č. 21. Příčný řez dělohou, šipkami označeno vedení žilnatiny, Ab.: abaxiální strana dělohy, Ad.: adaxiální strana dělohy

5.2. Korelace mezi dělohou a jejím úžlabním pupenem 5.2.1. Vliv odrůdy Protože v průběhu řešení problematiky apikální dominance a korelační funkce dělohy u hrachu byla různými autory nezávisle na sobě použita celá řada odrůd, například Victoria (Dostál 1939, 1941), Raman (Hradilík a Šebánek 1970, Tan a Šebánek 1982), Bohatýr (Hradilík a kol. 1985), Smaragd (Hradilík a kol. 1986, Hradilík a Fišerová 1993) nebo Vladan (Blažková a kol. 1999), ke kterým se v posledních letech přidávají ještě různí mutanti s geneticky pozměněnými vlastnostmi, např. se zvýšeným větvením, jako jsou ramousus (rms) mutanti (Beveridge a kol. 1994, 1996, 2000, Foo a kol. 2005, Johnson a kol. 2006, Hayward a kol. 2009) nebo bushy mutanti (Symons a kol. 2002), bylo jedním z cílů této práce studovat vliv různých genotypů hrachu na růst kotylárních pupenů.

5.2.1.1. Ovlivnění délky kotylárů a kořene Rozdíly v růstu děložních pupenů a kořenů byly hodnoceny u 23 odrůd hrachu. Mezi odrůdami byly zaznamenány průkazné rozdíly jak v délce kotylárů tak i kořenů u dekapitovaných rostlin (2D) a dekapitovaných rostlin s jednou dělohou odstraněnou (1D). Růst kotylárů u intaktních rostlin nebyl po sedmi dnech zaznamenán u žádné odrůdy, ani u rms4-mutanta, což vzhledem k tomu že tento mutant se zpravidla větví až ve vyšších nodech odpovídalo výsledkům Beveridge a kol. (1996). Navíc nebyly rostliny pěstovány na světle, ale ve tmě, což vedlo k posílení apikální dominace a omezení růstu postranních pupenů (Cline 1996, Snowden a Napoli 2003). U rostlin 2D dorůstal zainhibovaný pupen největší délky u rms4-mutanta (průměrně 20 mm), odrůdy 55

Torsdag (13 mm), Baryton (4,7 mm) a Viktorie 75 (4,5 mm), a nejkratší byl u Algery (1,1 mm). Dominující pupen byl nejdelší u odrůdy Torsdag (70 mm), rms4-mutantu (59 mm), Sponzoru (34 mm) a Algery (33 mm), a nejkratší byl u Heroldu (6 mm) (Graf č. 3). Nejdelší kořen měla odrůda Torsdag (119 mm) a nejkratší Canis (44 mm) (Graf č. 5). Odstranění dělohy se u většiny odrůd projevilo zkrácením kořene, které bylo průkazné u 12 odrůd (Graf č. 5), a zainhibovaného pupene, které bylo průkazné u 10 odrůd (Graf č. 3 a 4). Čím byl zainhibovaný pupen u 2D rostlin delší, tím výraznější bylo jeho zkrácení u 1D rostlin (u rms4-mutantu došlo ke zkrácení o 13,5 mm, u Torsdagu o 9,8 mm a u Barytonu o 3,4 mm). Také zpravidla docházelo k prodloužení dominantního pupene, které bylo průkazné u 8 odrůd. U 4 odrůd (Moravan, Canis, Viktorie 75 a Baryton) naopak došlo k průkaznému zkrácení dominantního pupene po redukci dělohy. 80 70 60

mm

50 40 30 20 10

2D Zainhibovaný

rms-4

Baryton

Torsdag

Canis

Victorie 75

Olivín

Power

Gotik

Terno

Sponzor

Moravan

Tempra

Jackpot

Solara

Kamelot

HM6

Oskar

Tolar

Menhir

Herold

Citrina

Andrea

Algera

0

2D Dominující

Graf č. 3. Srovnání růstu kotylárů dekapitovaných rostlin (2D) u 23 odrůd hrachu 80 70 60

mm

50 40 30 20 10

rms-4

Baryton

Torsdag

Canis

Victorie 75

Olivín

Power

Gotik

Terno

Sponzor

Moravan

Tempra

Jackpot

Solara

1D Zainhibovaný

Kamelot

HM6

Oskar

Tolar

Menhir

Herold

Citrina

Andrea

Algera

0

1D Dominující

Graf č. 4. Srovnání růstu kotylárů dekapitovaných rostlin s jednou dělohou odstraněnou (1D) u 23 odrůd hrachu 56

130 120 110 100 90

mm

80 70 60 50 40 30 20 10 rms-4

Torsdag

Baryton

Canis

Olivín

Power

Gotik

Kořen 1D

Victorie 75

Kořen 2D

Terno

Sponzor

Moravan

Tempra

Jackpot

Kamelot

Oskar

Solara

Tolar

HM6

Herold

Menhir

Citrina

Algera

Andrea

0

Graf č. 5. Srovnání růstu kořenů u 23 odrůd hrachu

Výsledky získané v pokusech s dekapitovanými rostlinami s ponechanými dělohami jsou poněkud v rozporu výsledky uváděnými v některých pracích. Dostál (1908, 1959a,b) a po něm také jiní autoři (Šebánek 1971, Hradilík 1994) uvádí, že nejprve po určitou dobu rostou oba kotyláry a pak teprve jeden převládne v růstu (Obrázek č. 22). U odrůd použitých v této práci dominující kotylár inhiboval druhý (zainhibovaný) kotylár tak sině, že zpravidla dorostl délky jen 1 až 3 mm, jak znázorňuje Obrázek č. 23. Což vede k domněnce že v průběhu šlechtění dochází u novějších odrůd k zesílení apikální dominance.

Obrázek č. 22. Apikální dominance a korelační vliv dělohy u hrachu (podle Dostála 1908, 1959b). A: intaktní rostlina, oba děložní pupeny inhibovány lodyžním vrcholem, B: po dekapitaci rostou určitou dobu současně oba děložní pupeny, C: po dekapitaci a odstranění jedné dělohy roste pouze pupen u dělohy odstraněné

57

Obrázek č. 23. Růst kotylárů u klíčních rostlin hrachu. A, B: po dekapitaci roste děložní pupen u jedné nebo u druhé dělohy, C: po dekapitaci a odstranění jedné dělohy roste pouze pupen u dělohy odstraněné

K poměrně rychlému zainhibování jednoho z kotylárů však překvapivě docházelo dokonce i u staré odrůdy Viktorie 75, která je příbuzná odrůdě používané v některých starších pracích (Dostál 1939, 1941), a byla proto vybrána pro srovnání. Zde by mohlo jít o vliv pěstebních podmínek a technologií, které se také postupně měnily. Odstranění jedné dělohy mělo za následek zesílení nadvlády dominujícího pupenu, což odpovídá výsledkům dřívějších prací zabývajících se korelačním vlivem dělohy (Dostál 1959b, Šebánek 1971, Hradilík 1994). Vzhledem k oslabení růstu kořene vlivem odstranění dělohy se zdá pravděpodobné, že děloha růst kořene podporuje. V práci Veierskova a kol. (1975) odstranění dělohy u klíčních rostlin hrachu omezovalo zakořeňování řízků. Podobně byl u dubu studován vliv odstranění děloh na produkci kořenové hmoty a u rostlin s odstraněnými dělohami bylo zjištěno snížení hmotnosti kořenů (Bonfil 1998).

5.2.1.2. Ovlivnění frekvence prorůstání kotylárů Frekvence prorůstání kotylárů po odstranění dělohy byla sledována u 18 odrůd. Nejvyšší podíl (%) pupenů rostoucích na straně ponechané dělohy byl u odrůdy Tempra (17%) a Jackpot (15%) a nejnižší u odrůdy Gotik a Moravan (0%). Nejvíce pupenů rostoucích u obou děloh bylo u Olivínu (7,4%) a Tempry (7%), nejméně u Poweru a Terna (0%). Nejvíce pupenů rostoucích u dělohy odstraněné bylo u odrůd Moravan a Gotik (99%) a nejméně u Tempry (76%), Jackpotu (82%) a Olivínu (87%) (Graf č. 6). Z uvedených výsledků vyplývá, že odrůda může mít určitý vliv na frekvenci prorůstání kotylárů u dělohy ponechané. K zásadnímu korelačnímu zvratu, kdy by se kotyláry rostoucí u dělohy ponechané vyrovnaly nebo dokonce převážily nad pupeny rostoucími u dělohy odstraněné, však u žádné odrůdy nedošlo. Proto lze konstatovat, že charakter růstu děložních pupenů se v závislosti na genotypu zásadně nemění a je společný všem sledovaným odrůdám. 110 100 90 80 70

50 40 30 20

frekvence růstu kotylárů dělohy ošetřené - L frekvence růstu obou kotylárů - O

Moravan

Gotik

Citrina

HM6

Kamelot

Baryton

Terno

Algera

Power

Oskar

Sponzor

Canis

Torsdag

rms-4

Victorie 75

Olivín

0

Jackpot

10 Tempra

%

60

frekvence růstu kotylárů dělohy neošetřené - P

58

Graf č. 6. Frekvence prorůstání kotylárů u odrůd hrachu

5.2.2. Vliv zásahů do klíční rostliny hrachu 5.2.2.1. Vliv redukce dělohy Ovlivnění délky kotylárů a kořene Pro hodnocení vlivu redukce dělohy byly vybrány dvě odrůdy, Baryton a Oskar. U odrůdy Baryton byl růst dominantního kotyláru méně intenzivní a délka kotylárů se pohybovala v rozmezí od 10 do 65 mm. Rozdíly v růstu pupenů vykazovaly více méně sestupnou tendenci (od varianty 2D k 1D) a u variant 2D a 3/4D dosahovaly průkazně větších průměrných hodnot než u variant 1/4D a 1D (Graf č. 7). Délka zainhibovaných kotylárů se pohybovala v rozmezí od 1 do 34 mm a jejich růst také vykazoval sestupnou tendenci jako u dominantního kotyláru. Růst kořenů byl oproti růstu pupenů poměrně intenzivní a délka se pohybovala v rozmezí od 45 do 203 mm. U varianty 1D a u intaktních rostlin byl kořen průkazně kratší než u variant 2D, 1/2D a 1/4D (Graf č. 9). 140

70

120

60

100

50 40

cm

cm

80

30 60

20 40

10 20

0 2D 3/4D 1/2D 1/4D 1D Zainhibovaný pupen Dominující pupen

0 2D 3/4D 1/2D 1/4D

1D intakt

Graf č. 7. Vliv redukce dělohy na růst kotylárů u odrůdy Baryton

Graf č. 9. Vliv redukce dělohy na růst kořenů u odrůd Baryton

U odrůdy Oskar délka dominantních kotylárů výrazně kolísala, a to v rozmezí od 2 do 110 mm, ale v průměru dosahovala vyšších hodnot než u odrůdy Baryton, s výjimkou u varianty 1/2D, kde byla průměrná délka kotylárů přibližně stejná. Změny v délce nevykazovaly rovnoměrnou klesající tendenci jako u Barytonu. U variant 2D a 3/4D sice byly kotyláry delší než u ostatních variant, ale nejkratší kotyláry byly u varianty 1/2D. Růst zainhibovaných kotylárů byl u všech variant zhruba stejný, kromě varianty 1D, kde došlo k průkazně větší inhibici než u ostatních variant (Graf č. 8). Délka zainhibovaných kotylárů se pohybovala v rozmezí od 1 do 17 mm. Růst kořenů

59

byl naopak méně intenzivní než u odrůdy Baryton a jejich délky se pohybovaly v rozmezí od 30 do 120 mm. Mezi průměrnými délkami kořenů u jednotlivých variant nebyly průkazné rozdíly (Graf č. 10). 140

70

120

60

100

50 40

cm

cm

80

30 60

20 40

10 20

0 2D 3/4D 1/2D 1/4D 1D Zainhibovaný pupen Dominující pupen

0 2D 3/4D 1/2D 1/4D 1D Intakt

Graf č. 8. Vliv redukce dělohy na růst kotylárů u odrůdy Oskar

Graf č. 10. Vliv redukce dělohy na růst kořenů u odrůd Oskar

Jak bylo ukázáno v předchozím pokusu věnovaném vlivu odrůdy není působení redukce dělohy na délku dominujícího kotyláru zcela jednoznačné. Jak Baryton, tak Oskar zdá se patří do menšinové skupiny a reagují na redukci dělohy inhibicí růstu dominantního kotyláru. Podle výsledků získaných u hrachu (Killeen a Larson 1968) a u dubu (Bonfil 1998) a dalších rostlin s velkými semeny (Milberc a Lamont 1997) dochází často při odstranění děloh k redukci vytvořené biomasy nejen u kořenů, ale i u nadzemních částí rostlin. Inhibici růstu klíčních rostlin po odstranění děloh v ranné fázi vývoje (do 14 dní poté co se objeví epikotyl) u dubu uvádějí také García-Cebrián a kol. 2003. Produkce kořenové a nadzemní biomasy je u těchto odrůd odlišná. U Barytonu je růst kotylárů (nadzemní biomasy) méně intenzivní než u Oskaru, ale naopak růst kořenů je u něj mnohem intenzivnější. V některých pracích (Dostál 1941, 1959b, Rahman 1977) zabývajících se studiem růstových korelací je uváděn inhibiční vliv kořene (radikuly) na růst prýtu (plumuly) v počátečních fázích růstu klíční rostliny. Inhibiční vliv kořene na růst výhonů u explantátů podzemnice olejné byl zmíněn v práci Li a kol. 1994. Také je známo, že různé růstově regulační vlivy mohou měnit poměr mezi intenzitou růstu prýtu a kořene (Kruger a Reich 1993, Ericsson 1995, Jelonková 1997,

60

Fišerová a kol. 2006a). Vzhledem ke stejné metodice pěstování zde však není předpoklad ovlivnění růstu změněnými pěstebními podmínkami klíčních rostlin, bohužel však nelze zcela vyloučit ovlivnění kvalitou a původem použitého osiva.

Ovlivnění frekvence prorůstání kotylárů U obou odrůd (Baryton, Oskar) byl nejvyšší podíl kotylárů rostoucích u dělohy redukované (levé) u rostlin 1D (93 až 95 %) a nejmenší u 2D (47 až 49 %). Nejvyšší podíl kotylárů rostoucích u dělohy ponechané (neredukované, pravé) byl u 2D (47 až 49 %) a nejnižší u 1D (3 až 5 %) (Grafy č. 11 a 12). U obou odrůd byly z bodového diagramu zjišťovány závislosti mezi redukcí dělohy a četností kotylárů rostoucích u dělohy odstraněné a mezi redukcí dělohy s růstem kotylárů u dělohy ponechané.

90

90

80

80

70

70

60

60

%

100

%

100

50

50

40

40

30

30

20

20

10

10 0

0 2D

3/4D

1/2D

1/4D

2D

1D

frekvence růstu kotylárů dělohy redukované (levé) - LK

3/4D

1/2D

1/4D

1D

frekvence růstu kotylárů dělohy redukované (levé) - LK frekvence růstu kotylárů dělohy ponechané (pravé) - PK frekvence růstu obou kotylárů - OK

frekvence růstu kotylárů dělohy ponechané (pravé) - PK frekvence růstu obou kotylárů - OK

Graf č. 11. Vliv redukce dělohy na frekvenci prorůstání kotylárů u odrůdy Baryton

Graf č. 12. Vliv redukce dělohy na frekvenci prorůstání kotylárů u odrůdy Oskar

Mezi redukcí dělohy a četností kotylárů rostoucích u dělohy redukované se jedná o pozitivní lineární závislost vyjádřenou pro odrůdu Baryton funkcí y=11,333x+39,067 (R2=0,9668; R=0,9832) a pro odrůdu Oskar funkcí y=10,85x+35,85 (R2=0,8787; R=0,9374). Naopak mezi redukcí dělohy a růstem kotylárů u dělohy ponechané byla zjištěna negativní lineární závislost, která byla pro odrůdu Baryton vyjádřena funkcí y=10,533x+54 (R2=0,9612; R=-0,9804) a pro odrůdu Oskar funkcí y=-10,35x+66,45 (R2=0,7838, R=0,8853). Vzhledem k tomu, že korelační koeficienty (R) se zde pohybují

61

blízko hodnoty 1 (nebo -1), jedná se zde o silné pozitivní a negativní závislosti (Grafy č. 13 a 14). Z uvedených výsledků tedy vyplývá, že zde existuje silná pozitivní závislost mezi redukcí dělohy a růstem kotylárů u dělohy redukované a silná negativní závislost mezi redukcí dělohy a růstem kotylárů u dělohy ponechané. Lze tedy říci že, děloha úměrně své velikosti (velikost redukce dělohy) ovlivňuje růst svého děložního pupenu. Vliv dělohy je rozhodující pro inhibici růstu pupenu nebo jeho uvolnění z inhibice. Vliv na další růst pupenů (dosaženou délku) po jejich uvolnění již zdaleka není tak významný. Většina autorů (Dostál 1908, 1959b, Hradilík 1975, Šebánek a kol. 1982, Procházka a Jacobs 1984, Vřešťálová-Nováková 1992, Labourová 2003) zabývajících se vlivem redukce dělohy se ve svých pracích zaměřovala pouze na vliv úplného (nebo téměř úplného) odstranění dělohy. Hradilík (1994) ve své práci sledoval také vliv částečné redukce a zjistil, že i částečná redukce dělohy často indukuje růst děložního pupenu, což výsledky této práce potvrzují. 100

100

y = 11,333x + 39,067 2

R = 0,9668 80

60

60

%

%

80

y = 10,85x + 30,85 2 R = 0,8787

40

40

20

20 y = -10,533x + 54 2 R = 0,9612

y = -10,35x + 66,45 2

R = 0,7838 0

0 2D

3/4D

1/2D

1/4D

2D

1D

3/4D

1/2D

1/4D

1D

Lineární závislost mezi růstem korylárů u dělohy redukované a redukcí dělohy Lineární závislost mezi růstem kotylárů u dělohy ponechané a redukcí dělohy

Lineární závislost mezi růstem kotylárů u dělohy redukované a redukcí dělohy Lineární závislost mezi růstem kotylárů u dělohy ponechané a redukcí dělohy

Graf č. 13. Závislost mezi růstem kotylárů a redukcí dělohy u odrůdy Baryton

Graf č. 14. Závislost mezi růstem kotylárů a redukcí dělohy u odrůdy Oskar

5.2.2.2. Vliv zářezů do dělohy Ovlivnění délky kotylárů a kořenů Vliv zářezů do dělohy byl sledován pouze u odrůdy Baryton. Průměrná délka dominantních kotylárů se pohybovala od 27,6 mm (u 1D) do 55,9 mm (u 2D). U rostlin se zářezy do dělohy a u rostlin s odstraněnou dělohou (1D) byly dominantní kotyláry

62

výrazně kratší než u rostlin pouze dekapitovaných (2D). Mezi variantou 1D a rostlinami se zářezy nebyly průkazné rozdíly, pouze u rostlin se zářezem Z4 (podrobnosti viz. metodika Obrázek 13) byl růst dominantního kotyláru mírně intenzivnější. Délka zainhibovaného kotyláru byla u rostlin se zářezy mírně větší než u varianty 1D (1,6 mm), ale menší než u kotylárů u varianty 2D (4,1 mm). U varianty Z4 byla průměrná délka zainhibovaného pupene 3,8 mm, a téměř dosahovala délky zaihibovaného pupene u varianty 2D (Graf č. 15). Kořeny byly u rostlin se zářezy mírně kratší, než u varianty 1D a výrazně kratší oproti variantě 2D, a mezi jednotlivými typy zářezů nebyly v délce kořenů průkazné rozdíly (Graf č. 16). Vliv zářezů do dělohy na délku kotylárů a kořenů tedy nevykazuje žádný jednoznačný trend. 80

140 130

70

120 110

60

100 90 mm

mm

50 40

80 70 60

30

50

20

40 30

10

20

0

10

1D

Z4

Z3

Zainhibovaný pupen

Z2

Z1

2D

0

Dominující pupen

1D

Z4

Z3

Z2

Z1

2D

Graf č. 16. Vliv zářezů na růst kořenů

Graf č. 15. Vliv zářezů na růst kotylárů

Ovlivnění frekvence prorůstání kotylárů Zářezy do dělohy ovlivňovaly frekvenci růstu kotylárů pouze v případě, že byly těsně pod děložním řapíkem (varianta Z4). V tomto případě byl výrazně vyšší podíl kotylárů rostoucích u dělohy se zářezem (levé) a dosahoval až 82 %, což odpovídá redukci dělohy zhruba na polovinu. U ostatních typů zářezů nebyl významný rozdíl mezi rostlinami se zářezem a rostlinami 2D (Graf č. 17). Tyto výsledky naznačují, že orientace zářezu má významný vliv na frekvenci růstu kotylárů. Jak lze vidět na znázornění děložní žilnatiny (Obrázek č. 2, Smith a Flinn 1967), zářez těsně pod řapíkem (vzhledem k postavení dělohy na obrázku by se jednalo o zářez vedený shora), který frekvenci růstu kotylárů nejvíce ovlivňuje, zřejmě způsobuje velmi výrazné narušení děložní žilnatiny a tím i vaskulárního propojení dělohy s řapíkem a ostatními

63

částmi rostliny. S vysokou pravděpodobností je tím narušen také transport látek z dělohy do řapíku a tím i do děložního pupenu. To podporuje domněnku, že korelační vliv dělohy na její úžlabní pupeny je zprostředkován látkou, která je vodivými pletivy transportována z dělohy do děložních pupenů. Také Hradilík (1994) zkoušel vliv tří typů zářezů do dělohy, které však byly vedeny poněkud odlišným způsobem než v této práci, takže přinejmenším u dvou typů těchto zářezů s vysokou pravděpodobností docházelo ke značnému narušení děložní žilnatiny, a zjistil, že všechny typy zářezů mají vliv na růst děložních pupenů. 100 90 80 70

%

60 50 40 30 20 10 0 1D

Z4

Z3

Z2

Z1

2D

frekvence růstu kotylárů u dělohy ošetřené - LK frekvence růstu kotylárů u dělohy neošetřené - PK frekvence růstu obou kotylárů - OK Graf č. 17. Vliv zářezů na frekvenci prorůstání kotylárů

5.2.3. Vliv transplantací různých částí rostlin do dělohy 5.2.3.1. Vliv transplantace epikotylu Při transplantaci epikotylu docházelo buďto k jeho přirůstání k děloze tvorbou kalusového pletiva nebo k jeho zakořeňování do dělohy. V obou případech, ať už děloha zakořenila nebo přirostla, měla transplantace epikotylu vliv pouze pokud byl epikotyl (vlastní růstový vrchol klíční rostliny do jejíž dělohy byly části rostlin transplantovány) dekapitován ihned po transplantaci. V tomto případě byla frekvence růstu kotylárů u dělohy, do které byla provedena transplantace významně nižší než u

64

dělohy neošetřené. Pokud byl dekapitován až čtyři dny po transplantaci neměla transplantace epikotylu významný vliv (Graf č. 18). U všech variant byl zaznamenán poměrně vysoký růst obou kotylárů (průměrně 11 až 16 %). Na rozdíl od předchozích prací (Hradilík 1994, Labourová 2003), které se zabývaly transplantacemi epikotylu do dělohy, nebyly v tomto pokusu rostliny pěstovány ve sterilních podmínkách. Výsledky těchto prací byly poněkud rozporuplné, neboť Hradílík (1994) uvádí, že transplantace epikotylu do dělohy podporuje růst děložního pupene a Labourová (2003) naopak zjistila, že transplantovaný epikotyl má na děložní pupen inhibiční vliv, což výsledky tohoto pokusu potvrdily. Labourová (2003) se domnívá, že inhibiční vliv transplantovaného epikotylu je způsoben nějakou látkou (pravděpodobně auxinem) transportovanou z epikotylu do dělohy. Vzhledem k tomu, že v přítomnosti intaktního vrcholu se inhibiční vliv transplantovaného epikotylu neprojevil, lze u uvažovaného inhibičního faktoru z epikotylu předpokládat následující možnosti: 1) translokuje se z epikotylu do dělohy pouze po krátkou dobu (méně než čtyři dny); 2) působí jen krátce (méně než čtyři dny) po transplantaci; a 3) nepůsobí na růst děložních pupenů pokud nejsou v době jeho působení vymaněny z apikální dominance. 100,0 90,0 80,0 70,0

%

60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 Dekapitace Dekapitace Dekapitace Dekapitace Dekapitace Dekapitace ihned po 4 dnech ihned po 4 dnech ihned po 4 dnech Přirostlé epikotyly

Zakořeněné epikotyly

Transplantace epikotylu

Přirostlé dělohy Transplantace dělohy

frekvence růstu kotylárů u dělohy ošetřené - LK frekvence růstu kotylárů u dělohy neošetřené - PK frekvence růstu obou kotylárů - OK Graf č. 18. Vliv transplantací na frekvenci prorůstání kotylárů

65

5.2.3.2. Vliv transplantace dělohy Při transplantaci dělohy k zakořeňování nedocházelo. Transplantace dělohy měla na frekvenci růstu kotylárů významný vliv bez ohledu na to, kdy byl dekapitován vlastní růstový vrchol klíční rostliny do jejíž dělohy byly části rostlin transplantovány. Transplantace dělohy vždy významně omezovala frekvenci růstu kotylárů u dělohy ošetřené (s transplantovanou dělohou) (Graf č. 18). Výsledky Hradilíka (1994), který popisuje stimulační vliv transplantované dělohy na růst děložního pupenu, se tudíž nepotvrdily. Na rozdíl od inhibice způsobené epikotylem není inhibiční vliv dělohy ovlivněn ani přítomností intaktního vrcholu ještě další čtyři dny po transplantaci, což znamená, že buď se zde jedná o stejný inhibiční faktor, který se z transplantované dělohy transportuje nebo působí jinak než v případě epikotylu, nebo se u dělohy jedná o jiný inhibiční faktor působící na děložní pupeny i v přítomnosti intaktního vrcholu. V obou případech to znamená, že působení dělohy je odlišné od působení epikotylu.

5.3. Růstová aktivita izolovaných děloh K doplnění poznatků o korelační funkci dělohy a osy rostliny byla sledována růstová aktivita u děloh odebraných z osmi variant různě starých klíčních rostlin (viz. metodika). Pro přežívání děloh byla rozhodující doba oddělení dělohy od klíční rostliny. Dělohy odebrané po šesti hodinách bobtnání nezakořeňovaly a docházelo k poměrně vysokému procentu odumírání děloh před dokončením pokusu (43 – 76 %). Varner a kol. (1968) zjistil, že u děloh oddělených do 24 až 48 hodin dochází k rychlému poklesu respirace a enzymatické aktivity a předpokládá, že pro zahájení normální růstové aktivity dělohy je potřeba alespoň částečný vývoj vaskulárního systému, který umožní transport signálů z děložní osy. Také Morohashi a Bewley (1980) ukázali, že pro charakteristický vývoj mitochondriální aktivity na počátku klíčení je přítomnost osy nezbytná. U děloh odebraných po 24 a více hodinách, bylo odumírání děloh minimální (0 – 3 %). Tyto dělohy vždy tvořily na řapíku kalusové pletivo a část jich pak po určité době zakořeňovala. Tvorba kořenů u děloh začínala u všech variant mezi 7 a 14 dnem. Po čtrnácti dnech již byly u všech variant (mimo první varianty) vytvořeny kořeny. Délka těchto kořenů se pohybovala od dvou do deseti mm. Nejnižší počet děloh zakořeněných po 14 dnech (9 %) byl u varianty HM6 4-48 a nejvyšší (49 %) u varianty HM6 4-5. Po 21 dnech byl počet zakořeněných rostlin nejnižší (27 %) u varianty HM6 4-24 a nejvyšší (65 %) u varianty HM6 4-5 (Graf č. 19). U nedekapitovaných rostlin

66

více zakořeňovala varianta nejmladší (HM6 24), která měla po 21 dnech největší produkci kořenů (Tabulka č. 1), a pak varianta nejstarší (HM6 10). U dekapitovaných rostlin bylo při odběru děloh po 24 a 48 hodinách po dekapitaci zakořeňování zpomaleno, ale při odběru po pěti dnech po dekapitaci je naopak zakořeňování ze všech variant nejintenzivnější (Graf č. 19), což pravděpodobně souvisí s růstem děložních pupenů. Zakořeňováním izolovaných děloh se ve své práci zabýval Hradilík (1994), který zjistil že dělohy odebrané z bobtnajících semen i dělohy odebrané z pětidenních rostlin vykazují růstovou aktivitu buď tvorbou kalusu nebo, u děloh odebraných z pětidenních rostlin, tvorbou kořenů. Tvorbu kořenů u starších rostlin vysvětluje obsahem auxinu, který je do děloh transportován z růstového vrcholu. V tomto experimentu však dělohy z nabobtnaných semen nezakořeňovaly pouze pokud byly odebrány již po 6 hodinách, ale to pak také vykazovaly poměrně nízkou růstovou aktivitu. 7 dní

14 dní

21 dní

105 90

%

75 60 45 30 15 0 kořeny

kalus

HM6 24

kořeny

kalus

HM6 48

kořeny

kalus

kořeny

HM6 4

kalus

HM6 10

kořeny

kalus

kořeny

HM6 4-24

kalus

kořeny

HM6 4-48

kalus

HM6 4-5

Graf č. 19. Vliv transplantací na frekvenci prorůstání kotylárů Tabulka č. 1. Průměrná motnost kořenů odebraných z 25 děloh

Navážka kořenů v gramech po 21 dnech Průměr Střední chyba

0,879 0,110

0,345 0,071

0,368 0,041

0,620 0,087

0,323 0,028

0,224 0,032

0,709 0,045

5.4. Změny v obsahu a produkci vybraných látek v souvislosti se zásahy do klíční rostliny 5.4.1. Změny v produkci etylénu, etanu a CO2 U intaktních rostlin se produkce etylénu průběhu pokusu postupně mírně zvyšovala, což může souviset s jejich pěstováním ve vyšších poměrně úzkých nádobách, kde mohlo v průběhu pokusu i přes průběžné odvětrávání, docházet

67

k určitému hromadění etylénu. Na rozdíl od výsledků uváděných v práci Hradilíka a kol. (1986), se produkce etylénu dekapitovanými rostlinami oproti intaktním rostlinám nesnižovala, ale naopak zvyšovala, i když rozdíly nebyly průkazné. Výraznější zvyšování produkce etylénu u 2D rostlin začalo až po páté hodině, kdy již u rostlin s redukovanou dělohou docházelo k poklesu. Redukce dělohy významně ovlivnila produkci etylénu. U rostlin s redukovanou nebo odstraněnou dělohou došlo v prvních čtyřech hodinách po ošetření k výraznému vzestupu produkce etylénu oproti intaktním a pouze dekapitovaným rostlinám. Od čtvrté hodiny se pak produkce etylénu postupně snižovala. U rostlin s redukovanou dělohou byl zaznamenán výraznější vzestup produkce etylénu než u rostlin se zcela odstraněnou dělohou, ale rozdíly nebyly průkazné (Graf č. 20). Zářezy do dělohy nezvyšovaly produkci etylénu oproti intaktním a dekapitovaným rostlinám. U rostlin s některými typy zářezů (Z1, Z2) byla produkce etylénu dokonce nižší než u rostlin intaktních a dekapitovaných (Graf č. 23). Produkce etylénu se zvyšuje při poranění a předpokládá se, že je zapojen do signalizační dráhy zprostředkovávající reakci na toto poranění (Kato a kol. 2000). Zvýšení produkce etylénu v počátečních hodinách po redukci dělohy by proto mohlo být způsobeno právě mechanickým poškozením, které je při redukci dělohy rozsáhlejší, než při pouhé dekapitaci nebo vytváření zářezů. Takto zvýšená hladina etylénu v rostlině i jejím okolí by se pak mohla podílet na omezení dlouživého růstu (Binder a kol. 2004) a podílet se na zkrácení dominantního pupene, které bylo zaznamenáno u rostlin s redukovanou dělohou. Tato teorie však není podporována skutečností, že k podobnému zkrácení dominantního pupene došlo také u rostlin se zářezy, u kterých ke zvýšení produkce etylénu nedošlo. Zvýšená hladina etylénu se nezdá být zapojena ani do změny frekvence prorůstání kotylárů, protože k této změně dochází také u rostlin se zářezem Z4, u kterých se produkce etylénu významně nezvýšila. Pokud je etylén zapojen do korelace mezi dělohou a jejím úžlabním pupenem, pak pravděpodobně to není spojeno se zvýšením jeho produkce, ale spíše s nějakou změnou v signalizační dráze nebo se změnou citlivosti pletiv k etylénu (Peck a kol. 1998). Produkce etanu se u intaktních rostlin po dobu pokusu udržovala na podobné úrovni, jen po 24 hodinách došlo k určitému vzestupu. Vlivem dekapitace došlo k mírnému zvyšování produkce etanu v prvních čtyřech hodinách. Po pěti hodinách produkce klesla na stejnou úroveň jako u intaktních rostlin. I zde došlo po 24 hodinách k mírnému zvýšení produkce. Redukce dělohy vyvolala zvýšení produkce etanu, které ale bylo pravděpodobně velmi rychlé, takže nejvyšší hodnoty byly naměřeny po první 68

hodině a v průběhu pokusu se produkce postupně snižuje na úroveň intaktních a dekapitovaných rostlin (Graf č. 21). U rostlin s dělohou redukovanou na ¾ a na ¼ došlo ještě k dalšímu zvýšení produkce etanu po 4 hodinách. U rostlin se zářezy nedošlo k významnému zvýšení produkce etanu v první hodině a jeho produkce byla podobná jako u rostlin intaktních a dekapitovaných (Graf č. 24). Zvýšení produkce etanu u rostlin s redukovanou dělohou je pravděpodobně spojeno s reakcí rostliny na poranění. Zvýšení produkce etanu zaznamenali ve své práci u rostlin s odstraněnými dělohami Hradilík a kol. (1986). Částečné zvýšení produkce etanu bylo v této práci zaznamenáno také u rostlin dekapitovaných. V práci Hradilíka (1976) je uváděno zvýšení aktivity peroxidázy vlivem redukce dělohy. Vzhledem k tomu, že etan bývá uváděn jako indikátor peroxidázy (Celikel a Vandoorn 1995), jejíž aktivita se může při poranění zvyšovat (Angelini a kol. 1990, Lehner a Cardemil 2003), mohl by vzestup produkce etanu v rostlinách s redukovanou dělohou, kde došlo k největšímu poranění, souviset aktivitou peroxidázy a oxidací lipidů, buď přímo na ráně a v okolních pletivech, nebo v nejbližších orgánech (děložní pupen). Křivka znázorňující produkci CO2 měla u většiny variant podobný průběh. Nejvyšší produkce byla zaznamenána po první hodině a potom dochází k postupnému poklesu produkce CO2. Po 24 hodinách byl zaznamenán další vzestup produkce, který byl méně výrazný u intaktních rostlin, dekapitovaných rostlin a dekapitovaných rostlin se zářezy, než u rostlin s redukovanou dělohou (Grafy č. 22 a 25). 1,4000 1,2000

nl/g/ml

1,0000 0,8000 0,6000 0,4000 0,2000 0,0000 1h

2h

3h

4h

5h

24h

48h

Intakt

2D

3/4D

1/2D

1/4D

1D

Graf č. 20. Vliv redukce dělohy na produkci etylénu 69

72h

2,0000 1,8000 1,6000

nl/g/ml

1,4000 1,2000 1,0000 0,8000 0,6000 0,4000 0,2000 0,0000 1h

2h

3h

4h

5h

24h

48h

Intakt

2D

3/4D

1/2D

1/4D

1D

72h

Graf č. 21. Vliv redukce dělohy na produkci etanu

2,2000 2,0000 1,8000 1,6000

ug/g/ml

1,4000 1,2000 1,0000 0,8000 0,6000 0,4000 0,2000 0,0000 1h

2h

3h

4h

5h

24h

48h

72h

Intakt

2D

3/4D

1/2D

1/4D

1D

Graf č. 22. Vliv redukce dělohy na produkci CO2

70

1,4000 1,2000

nl/g/ml

1,0000 0,8000 0,6000 0,4000 0,2000 0,0000 1h

2h

3h

4h

5h

24h

Intakt

2D

1D

Z3

Z2

Z1

48h

72h Z4

Graf č. 23. Vliv zářezů na produkci etylénu

2,0000 1,8000 1,6000 1,4000

nl/g/ml

1,2000 1,0000 0,8000 0,6000 0,4000 0,2000 0,0000 1h

2h

3h

4h

5h

24h

Intakt

2D

1D

Z3

Z2

Z1

Graf č. 24. Vliv zářezů na produkci etanu

71

48h

72h Z4

2,2000 2,0000 1,8000 1,6000

ug/g/ml

1,4000 1,2000 1,0000 0,8000 0,6000 0,4000 0,2000 0,0000 1h

2h

3h

4h

5h

24h

Intakt

2D

1D

Z3

Z2

Z1

48h

72h Z4

Graf č. 25. Vliv zářezů na produkci CO2

5.4.2. Rozložení ACC ve čtyřdenní rostlině hrachu K doplnění poznatků o produkci etylénu rostlinami hrachu byly zjišťovány obsahy jeho bezprostředního prekurzoru, kyseliny 1-aminocyklopropan-1-karboxylové (ACC), v jednotlivých částech klíční rostliny (kořeni, epikotylu, dělohách a hypokotylu). Nejnižší obsah ACC byl zjištěn v epikotylu, vyšší pak v hypokotylu a v dělohách, a nejvyšší v kořeni. Průkazný rozdíl byl pouze mezi hodnotami v epikotylu a v kořenu a dělohách (Graf č. 26). Obsahy ACC v klíční rostlině hrachu sledovali Fuhrer a FuhrerFries (1985) a zjistili, že se akumuluje převážně v kořenech, ve kterých byla u klíčních rostlin hrachu také v prodlužovací a diferenciační zóně lokalizována nejintenzivnější syntéza etylénu (Ma a kol. 2003). Vyšší obsah ACC v kořenech než v nadzemní části zaznamenali také Sarquis a kol. (1992) u klíčních rostlin kukuřice. Nižší obsah ACC v epikotylu by mohl být způsoben vyšší produkcí etylénu spojenou s přítomností auxinu nebo, vzhledem k tomu že zvýšení produkce etylénu vlivem auxinu je pravděpodobně spojena s podporou aktivity ACC-syntázy (Hansen a Grossmann 2000), spíše s bazipetálním transportem do kořenů kde, se ACC akumuluje (Fuhrer a Fuhrer-Fries 1985).

72

0,018

nmol/g čerstvé hmoty

0,016 0,014 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 0,000 Kořen

Epikotyl

Dělohy

Hypokotyl

Graf č. 26. Obsah ACC ve čtyřdenní rostlině hrachu

5.4.3. Změny v obsahu ACC v děložních pupenech Vlivem redukce dělohy došlo v pupenech nad ošetřenou dělohou k mírnému snížení obsahu ACC, oproti pupenům nad dělohou neošetřenou, kde k poklesu obsahu ACC nedošlo (Graf č. 27). Toto snížení obsahu ACC však nebylo průkazné. Sice nelze předpokládat, že by etylén vyprodukovaný klíčními rostlinami, pocházel pouze z ACC z pupenů, ale největší rozdíl v obsahu ACC mezi pupeny byl právě u rostlin s částečně redukovanou dělohou, u kterých byla nejvyšší produkce etylénu. V práci Fuhrera a Fuhrer-Friese (1985) bylo zjištěno, že po dekapitaci se ACC formuje blízko povrchu řezu a akumuluje se v nodu pod řezem, kde může inhibovat růst úžlabních pupenů. Z nodu je transportována bazipetálně a později (po 7 dnech) se akumuluje v kořenech. Výsledky podporují domněnku, že zvýšení produkce etylénu souvisí spíše se stresem spojeným s poraněním dělohy. Při stresu je často ACC akumulovaná v kořenech transportována do nadzemních částí rostliny, kde podporuje tvorbu stresového etylénu (Tudela a Primo-Millo 1992, Else a Jackson 1998). 0,018

nmol/g čerstvé hmoty

0,016 0,014 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 0,000 2D L-

2D P+

1/2D L-

1/2D P+

1D L-

1D P+

Graf č. 27. Vliv redukce dělohy na obsah ACC v děložních pupenech 73

5.4.4. Rozložení cytokininů ve čtyřdenní rostlině hrachu Celkový obsah cytokininů byl nejvyšší v kořenech a v hypokotylu a nejnižší v epikotylu (Graf č. 28). Nejvíce zastoupenými cytokininy byly benzyladenin a zeatin a jejich ribosidy. Nejvíce benzyladeninu (12,5 ng/g čerstvé hmoty) bylo v kořeni. V ostatních orgánech byl jeho obsah podstatně nižší (od 2,8 ng/g čerstvé hmoty v epikotylu až po 1,6 ng/g čerstvé hmoty v hypokotylu, kde ho bylo nejméně). Obsah benzyladenin ribosidu se v jednotlivých orgánech pohyboval v rozmezí od 5,6 ng/g čerstvé hmoty u hypokotylu po 3,8 ng/g čerstvé hmoty u epikotylu a mezi zjištěnými hodnotami nebyly statisticky průkazné rozdíly (Graf č. 31). Zeatin byl ve sledovaných orgánech také zastoupen poměrně rovnoměrně. Nejvíce ho bylo obsaženo v hypokotylu (4,1 ng/g čerstvé hmoty) a nejméně v epikotylu (2 ng/g čerstvé hmoty), rozdíly však nebyly statisticky průkazné. Obsah zeatin ribosidu se zvyšoval v pořadí kořen (pod detekčním limitem), epikotyl (1,4 ng/g čerstvé hmoty), dělohy (3,5 ng/g čerstvé hmoty) a hypokotyl (5,1 ng/g čerstvé hmoty) (Graf č. 29). Ve všech orgánech byly zjištěny ještě ribosidy meta-topolinu a dihydrozeatinu. Méně meta-topolin ribosidu bylo zjištěno v kořeni (1,3 ng/g čerstvé hmoty) a v epikotylu (1,4 ng/g čerstvé hmoty) a více v dělohách (2,5 ng/g čerstvé hmoty) a v hypokotylu (3,5 ng/g čerstvé hmoty). Metatopolin byl obsažen pouze v kořeni (1,1 ng/g čerstvé hmoty) a v nepatrném množství v epikotylu (Graf. č. 33). Dihydrozeatin ribosidu bylo nejvíce v kořeni (0,9 ng/g čerstvé hmoty) a v ostatních orgánech se vyskytoval v množství okolo 0,3 ng/g čerstvé hmoty (Graf č. 30). Isopentenyladenin a jeho ribosid se vyskytovaly pouze v kořeni a hypokotylu (Graf. č. 32). 35

ng/g čerstvé hmoty

30 25 20 15 10 5 0 Kořen

Epikotyl

Dělohy

Graf č. 28. Obsah cytokininů ve čtyřdenní rostlině hrachu 74

Hypokotyl

Rozložení obsahu cytokininů v podstatě odpovídá předpokladu. Vyšší obsah cytokininů v kořenech a hypokotylu je v souladu s domněnkou, že kořeny jsou významným místem biosyntézy cytokininů (Chen a kol. 1985, Aloni a kol. 2005), které jsou pak z kořenů transportovány bazipetálně do nadzemních částí rostliny. V klíčících semenech byly cytokininy detekovány převážně v pletivech osy (radikule a plumule), odkud jsou ale také transportovány do děloh, kde se podílejí na mobilizaci zásobních látek (Villalobos a Martin 1992). 14 Z

ZR

ng/g čerstvé hmoty

12 10 8 6 4 2 0 Kořen

Epikotyl

Dělohy

Hypokotyl

Graf č. 29. Obsah Z a ZR ve čtyřdenní rostlině hrachu

14

ng/g čerstvé hmoty

12

DHZ

DHZR

10 8 6 4 2 0 Kořen

Epikotyl

Dělohy

Graf č. 30. Obsah DHZ a DHZR ve čtyřdenní rostlině hrachu

75

Hypokotyl

14 BA

BAR

ng/g čerstvé hmoty

12 10 8 6 4 2 0 Kořen

Epikotyl

Dělohy

Hypokotyl

Graf č. 31. Obsah BA a BAR ve čtyřdenní rostlině hrachu

14 IP

IPR

ng/g čerstvé hmoty

12 10 8 6 4 2 0 Kořen

Epikotyl

Dělohy

Hypokotyl

Graf č. 32. Obsah iP a iPR ve čtyřdenní rostlině hrachu

14 mT

mTR

ng/g čerstvé hmoty

12 10 8 6 4 2 0 Kořen

Epikotyl

Dělohy

Graf č. 33. Obsah mT a mTR ve čtyřdenní rostlině hrachu 76

Hypokotyl

5.4.5. Změny v obsahu cytokininů v děložních pupenech V děložních pupenech hrachu bylo celkově nejvíce cytokininů (v průměru 12,5 ng/g čerstvé hmoty) u dekapitovaných rostlin (2D). U této varianty nebyl zjištěn rozdíl v obsahu cytokininů mezi levým a pravým pupenem. U ostatních sledovaných variant rostlin (1/2D, 1D) byl obsah celkových cytokininů výrazně nižší. K nápadnějšímu poklesu docházelo v pupenu dělohy neošetřené (pravé), kdy v pupenu rostlin s odstraněnou dělohou (1D) bylo průkazně méně cytokininů (0,7 ng/g čerstvé hmoty) než u varianty s dělohou zredukovanou na polovinu (1/2D) (2,4 ng/g čerstvé hmoty). U pupenu dělohy ošetřené (levé) byl celkový obsah cytokininů také vyšší u varianty 1/2D (3,9 ng/g čerstvé hmoty) než u varianty 1D (3 ng/g čerstvé hmoty), rozdíl však nebyl průkazný (Graf č. 34).

ng/g čerstvé hmoty

14 12 10 8 6 4 2 0 2D L-

2D P+

1/2D L-

1/2D P+

1D L-

1D P+

Graf č. 34. Změny v celkovém obsahu cytokininů v děložních pupenech

Velký rozdíl mezi obsahem cytokininů v pupenech dekapitovaných rostlin a pupenech rostlin s redukovanou dělohou (1D, 1/2D) byl způsoben obsahem zeatinu (1,2 a 1,3 ng/g čerstvé hmoty) a hlavně pak jeho ribosidu (5,2 a 4,4 ng/g čerstvé hmoty), které se u rostlin s redukovanou dělohou vyskytovaly jen v malém množství často pod detekčním limitem použité metody (Graf č. 35). U varianty 2D bylo také vyšší množství benzyladeninu (1,8 a 2,2 ng/g čerstvé hmoty) (Graf č. 37), dihydrozeatinu (0,4 a 0,6 ng/g čerstvé hmoty) (Graf č. 36), meta-topolinu (0,7 a 0,6 ng/g čerstvé hmoty) a jeho ribosidu (0,8 a 1 ng/g čerstvé hmoty) (Graf č. 39), než u ostatních variant. V pupenech byl také docela hojně zastoupen isopentenyladenin a jeho ribosid (Graf č. 38). Nejnižší hodnoty byly u všech druhů cytokininů zjištěny u varianty 1D. U šestidenních

77

dekapitovaných rostlin byl pak pomocí plynové chromatografie zjišťován obsah transzeatinu v dominujícím a zainhibovaném pupenu a byl zjištěn určitý rozdíl ve prospěch zainhibovaného pupenu a byl zde jištěn rozdíl ve prospěch zainhibovaného pupenu. Po uvolnění zainhibovaného pupenu z inhibice v něm dochází k vzestupu obsahu transzeatinu.

ng/g čerstvé hmoty

6 5 4 3 2 1 0 2D L-

Z 2D P+

1/2D L-

ZR 1D L-

1D P+

DHZR 1/2D P+ 1D L-

1D P+

1/2D P+

Graf č. 35. Změny v obsahu Z a ZR v děložních pupenech

ng/g čerstvé hmoty

6 5 4 3 2 1 0 2D L-

DHZ 2D P+

1/2D L-

Graf č. 36. Změny v obsahu DHZ a DHZR v děložních pupenech

78

ng/g čerstvé hmoty

6 5 4 3 2 1 0 BA 2D L-

2D P+

BAR 1/2D L-

1/2D P+

1D L-

1D P+

Graf č. 37. Změny v obsahu BA a BAR v děložních pupenech

ng/g čerstvé hmoty

6 5 4 3 2 1 0 iP 2D L-

2D P+

iPR 1/2D L-

1/2D P+

1D L-

1D P+

Graf č. 38. Změny v obsahu iP a iPR v děložních pupenech

ng/g čerstvé hmoty

6 5 4 3 2 1 0 mT 2D L-

2D P+

mTR 1/2D L-

1/2D P+

Graf č. 39. Změny v obsahu mT a mTR v děložních pupenech 79

1D L-

1D P+

Vyšší obsah cytokininů v pupenech dekapitovaných rostlin odpovídá výsledkům Li a kol. (1995), Turnbulla a kol. (1997), Emeryho a kol. (1998b) a Madera a kol. (2003b), kteří po dekapitaci rostlin uvádí zvýšení obsahu cytokininů (zeatinu, dihydrozeatinu a isopentenyladeninu) v pupenech, které je spojené se změnami v transportu, biosyntéze a metabolismu cytokininů. Turnbull a kol. (1997) předpokládají, že cytokininy akumulované v pupenech pochází z kořenů, ale podle Tanaky a kol. (2006) se po dekapitaci také zvyšuje biosyntéza cytokininů ve stonku. Vzhledem ke zjištěnému složení cytokininů v kořenech, epikotylu, dělohách, hypokotylu a v pupenech je pravděpodobné, že přinejmenším v pupenech nejvíce zastoupený zeatin ribosid, nepochází z kořenů, které ho vůbec neobsahovaly, ale spíše z hypokotylu nebo děloh. Zvýšení vlastní biosyntézy cytokininů pupenech naznačuje přítomnost isopentenyladeninu, který se v kořeni ani jiné části rostliny téměř nevyskytoval. Redukce dělohy způsobuje snížení celkového obsahu cytokininů v pupenech oproti rostlinám s intaktními dělohami. Toto snížení obsahu cytokininů vlivem redukce dělohy může souviset se značným zvýšením obsahu ABA, která ovlivňuje metabolismus cytokininů (Tao a kol. 1991). Redukce dělohy způsobuje také diferenci mezi obsahem cytokininů v pravém a levém pupenu ve prospěch pupenu u dělohy redukované. Nižší obsah cytokininů je tudíž v pupenech, které zůstaly zainhibovány. To naznačuje význam cytokininů pro uvolnění pupenů z inhibice a podporuje výsledky některých dřívějších prací, které uvádějí že cytokininy podporují růst úžlabních pupenů u hrachu (Procházka a Truksa 1999, Li a Bangerth 2003, Klíčová a kol. 2004).

5.4.6. Rozdělení ABA ve čtyřdenní rostlině hrachu Bylo zjištěno, že koncentrace ABA v pletivech čtyřdenních rostlin hrachu není vysoká. Nejvíce ABA bylo obsaženo v kořenech (13 ng/g čerstvé hmoty) a dělohách (15,5 ng/g čerstvé hmoty), méně v hypokotylu (6,8 ng/g čerstvé hmoty) a nejméně v epikotylu (3,6 ng/g čerstvé hmoty) (Graf č. 40). Vyšší obsah ABA dělohách je zřejmě následkem její syntézy a akumulace v posledních fázích vývoje semene (Wang a kol. 1987). Kořen je pak u etiolovaných klíčních rostlin, které nemají žádné dospělé listy, možné považovat za důležité místo biosyntézy ABA.

80

20

ng/g čerstvé hmoty

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Kořen

Epikotyl

Dělohy

Hypokotyl

Graf č. 40. Obsah ABA ve čtyřdenní rostlině hrachu

5.4.7. Změny v obsahu ABA v děložních pupenech V děložních pupenech pouze dekapitovaných rostlin (varianta 2D) byl obsah ABA poměrně nízký (6,1 a 9 ng/g čerstvé hmoty) a nebyl zjištěn významný rozdíl mezi obsahem ABA v levém a pravém pupenu. Vlivem redukce dělohy na polovinu doházelo ke značnému zvýšení obsahu ABA v obou děložních pupenech (24,5 a 27,3 ng/g čerstvé hmoty), ale mezi obsahem ABA v levém (u dělohy redukované) a pravém (u dělohy ponechané) pupenu také nebyl průkazný rozdíl. Při odstranění dělohy došlo ke zvýšení ABA pouze v pupenu dělohy ponechané (24,7 ng/g čerstvé hmoty), kdežto v pupenu redukované dělohy zůstal obsah ABA na nízké úrovni (4,6 ng/g čerstvé hmoty). Mezi obsahem ABA v obou děložních pupenech byl zaznamenán velmi významný rozdíl (Graf č. 41). 35

ng/g čerstvé hmoty

30 25 20 15 10 5 0 2D L-

2D P+

1/2D L-

1/2D P+

Graf č. 41. Změny v obsahu ABA v děložních pupenech 81

1D L-

1D P+

Z výsledků vyplývá, že redukce dělohy způsobuje značné zvýšení obsahu ABA v děložních pupenech, a to buď v obou pupenech zároveň při částečné redukci, nebo, při odstranění dělohy, pouze v pupenu dělohy ponechané, který zůstane zainhibován. Zvýšení obsahu ABA v děložních pupenech by mohlo být spojeno se zvýšením obsahu ABA v dělohách v souvislosti s poraněním a následným transportem do děložních pupenů. Zvyšování ABA následkem mechanického poškození rostlinných pletiv bylo pozorováno u rajčete (Dammann a kol. 1996) a Arabidopsis (Reymond a kol. 2000), a je pravděpodobně spojeno s jejich vysycháním. Vzhledem ke zvýšené produkci etylénu v počátečních hodinách po poranění, také mohlo dojít ke zvýšení biosyntézy ABA vlivem etylénu (Grossmann a Hansen 2001, Grossmann 2007), buď přímo v děložních pupenech, nebo v kořenech, hypokotylu či v dělohách. Zdá se, že obsah ABA také do určité míry koreluje s inhibicí růstu děložních pupenů. Zejména u varianty 1D významné

zvýšení

obsahu

ABA

v pupenu

dělohy

ponechané,

s velkou

pravděpodobností souvisí se zainhibováním růstu tohoto pupenu. K podobným závěrům, kdy se obsah ABA při uvolnění pupenů z inhibice snižoval dospěli také Šebánek a Hradilík (1978) nebo Mader a kol. (2003b). Snížení ABA v uvolňovaném pupenu je shodné s myšlenkou, že podporuje inhibici úžlabních pupenů (Emery a kol. 1998b, Shimizu-Sato a Mori 2001).

82

6. Závěry První část pokusů byla zaměřena na optimalizaci metodiky pěstování rostlin a výběr vhodné odrůdy pro další experimenty. Výsledky ukázaly, že vliv hustoty rostlin na růst kotylárů není nijak výrazný, avšak nelze jej zcela vyloučit. Proto bylo doporučeno používat pro všechny pokusy stejný počet rostlin na nádobu. Ve druhém experimentu bylo potvrzeno, že odrůda může mít určitý vliv jak na délku kotylárů, tak i na podíl (%) kotylárů rostoucích na straně dělohy ponechané, odstraněné nebo u obou děloh, avšak u žádné odrůdy nedošlo k zásadnímu korelačnímu zvratu, a proto lze konstatovat, že charakter růstu děložních pupenů pro všechny sledované odrůdy společný. Bylo zjištěno, že i v případě kdy jsou ponechány obě dělohy, jeden z kotylárů velmi rychle převládne v růstu a inhibuje růst druhého kotyláru, takže zainhibovaný kotylár dorůstá zpravidla délky jen 1 až 3 mm. Pokud byla ponechána pouze jedna děloha byla tato inhibice jednoho kotyláru druhým ještě zesílena. Pomocí mikroskopických preparátů byla zkoumána také morfologie dělohy a bylo zjištěno, že jak redukce dělohy, tak zářez Z4 vedený pod děložním řapíkem, které mají vliv na frekvenci prorůstání kotylárů, závažně narušují děložní žilnatinu. V dalším experimentu, kdy byl zkoumán vliv redukce dělohy a vliv zářezů do dělohy, byl prokázán vliv redukce dělohy. Ukázalo se, že čím větší je redukce dělohy, tím více rostou kotyláry nad dělohou redukovanou a méně rostou nad dělohou ponechanou. Dále byl zjištěn vliv orientace zářezů na frekvenci růstu kotylárů, na kterou má významný vliv pouze zářez těsně pod řapíkem (Z4). V transplantačních experimentech byl sledován vliv transplantace dělohy nebo epikotylu do dělohy klíční rostliny na frekvenci prorůstání děložních pupenů. Ukázalo se, že jak transplantovaná děloha, tak i epikotyl mají na růst pupenu takto ošetřené dělohy inhibiční vliv. Tato inhibice však byla různě ovlivněna přítomností apikálního vrcholu v době transplantace, což naznačuje, že inhibiční působení epikotylu a dělohy je pravděpodobně založeno na poněkud odlišných mechanismech. V posledním experimentálně morfologickém experimentu byla hodnocena růstová aktivita dělohy, která podle výsledků závisí na věku klíční rostliny (zbobtnalého semene). Pokud je doba bobtnání 24 hodin a více, pak je růstová aktivita dělohy poměrně vysoká, a dochází buď pouze k tvorbě kalusu (u většiny variant převažuje) nebo z něj posléze vyrůstají kořeny.

83

V souvislosti s redukcí dělohy byly sledovány změny v produkci etylénu, etanu a CO2 a rozdíly v obsahu ABA, ACC a cytokininů v děložních pupenech. Produkce etylénu se zvyšovala zejména vlivem redukce dělohy. Nelze však potvrdit vliv etylénu na charakter růstu děložních pupenů a zdá se, že zvýšení produkce etylénu je nejspíše spojeno s poraněním dělohy při redukci. Podobné závěry lze vyvodit také v případě etanu. Na produkci CO2 neměla redukce ani zářezy výrazný vliv. Z analýz obsahu ABA v děložních pupenech po 72 hodinách kultivace vyplývá, že redukce dělohy způsobuje zvýšení obsahu ABA v těchto pupenech. Při částečné redukci dělohy dochází ke zvýšení obsahu ABA u obou pupenů, ale při úplné redukci dělohy se obsah ABA zvyšuje pouze v pupenu dělohy ponechané. Z tohoto důvodu je obsah ABA v pravém (více inhibovaném) pupenu výrazně vyšší než v pupenu levém (více dominujícím). Tyto výsledky naznačují, že ABA se sice pravděpodobně podílí na inhibičním působení dělohy, ale její vliv není rozhodující. Z analýz obsahu cytokininů v děložních pupenech po 72 hodinách kultivace vyplývá, že redukce dělohy způsobuje pokles obsahu cytokininů v těchto pupenech. S velikostí této redukce však roste rozdíl v obsahu cytokininů v pravém a v levém pupenu ve prospěch pupenu u dělohy redukované (levé), kde oproti pupenu dělohy neredukované (pravé) nedochází v obsahu cytokininů k tak výraznému poklesu. Cytokininy tedy mají pravděpodobně pro inhibici děložního pupenu větší význam než ABA. Výsledky této práce naznačují, že korelační vliv dělohy není totožný s korelačním vlivem epikotylu, kterému je podřízen. Děložní pupeny jsou v první řadě inhibovány růstovým vrcholem a korelační vliv děloh se může projevit až po jeho odstranění. Jedná se zde pravděpodobně o inhibiční látku, která vychází z děloh a inhibuje růst. Tato látka pravděpodobně působí i na růst epikotylu intaktních rostlin, což se projevuje vytvářením apikálního háčku. Pokud jsou přítomny obě dělohy, působí tato inhibiční látka na oba pupeny stejně – inhibuje jejich růst, ale není schopna mu zabránit. Pravděpodobnost uvolnění jednoho nebo druhého pupenu na začátku jejich růstu je zhruba stejná. Jakmile se jeden z pupenů uvolní dojde k obnovení apikální dominance a k inhibici růstu druhého pupenu. Růstu druhého pupenu tedy nezabraňuje děloha, ale dominující pupen, který se první uvolnil z inhibice. Při odstranění epikotylu a jedné z děloh působí tato inhibiční látka pouze (nebo více) na pupen dělohy ponechané, což maximálně zvyšuje pravděpodobnost, že dojde k uvolnění a růstu pupenu dělohy odstraněné. Inhibiční vliv dělohy způsobuje změny v obsahu ABA a cytokininů v děložních pupenech, ale nebylo prokázáno, že by ovlivňoval obsah ACC nebo 84

produkci etylénu, etanu či CO2, což potvrzuje domněnku, že pokud v korelační funkci dělohy dochází k zapojení etylénu děje se to spíše na principu změny v signalizační dráze nebo citlivosti pletiv k etylénu.

85

7. Literární přehled Adams D. O., Yang S. F. (1979): Ethylene biosynthesis: Identification of 1-aminocyclopropane1-carboxylic acid as an intermediate in the conversion of methionine to ethylene. Proc. Natl. Acad. Sci. 76 (1):170–174 Aloni R., Langhans M., Aloni E., Dreieicher E., Ullrich C. I. (2005): Root-synthesized cytokinin in Arabidopsis is distributed in the shoot by the transpiration stream. J. Exp. Bot. 56 (416): 1535-1544 Anantharaman V., Aravind L. (2001): The CHASE domain: a predicted ligand-binding module in plant cytokinin receptors and other eukaryotic and bacterial receptors. Trends Bioch. Sci. 26 (10): 579-582 Andersson-Gunneras S., Hellgren J. M., Björklund S., Regan S., Moritz T. (2003): Asymmetric expression of poplar ACC oxidase controls ethylene production during gravitational induction of tension wood. Plant J. 34: 339-349 Angelini R., Manes F., Federico R. (1990): Spatial and functional correlation between diamine-oxidase and peroxidase activities and their dependence upon de-etiolation and wounding in chick-pea stems. Planta 182 (1): 89-96 Apelbaum A., Goldlust A., Icekson I. (1985): Control by ethylene of arginine decarboxylase activity in pea seedlings and its implication for hormonal regulation of plant growth. Plant Physiol. 79: 635-640 Apelbaum A., Yang F. S. (1981): Biosynthesis of stress ethylene induced by water deficit. Plant. Physiol. 68: 594-596 Arigoni D., Sagner S., Latzel C., Eisenreich W., Bacher A., Zenk M. H. (1997): Terpenoid biosynthesis from 1-deoxy-D-xylulose in higher plants by intramolecular skeletal rearrangement. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 10600-10605 Ashby A. M. (2000): Biotrophy and the cytokinin conundrum. Physiol. Mol. Plant Pathol. 57: 147-158 Atanassova L., Pissarska M., Stoyanov I. (1996): Cytokinins and growth responses of maize and pea plants to salt stress. Bulg. J. Plant Physiol. 22 (1): 22-31 Awad M., Young R. E. (1979): Postharvest variation in cellulase, polygalacturonase, and pectinmethylesterase in avocado (Persea americana Mill, cv. Fuerte) fruits in relation to respiration and ethylene production. Plant Physiol. 64: 306-308 Bain J. M., Mercer F. V. (1966a): Subcelular organization of the developing cotyledons of Pisum sativum L. Aust. J. biol. Sci. 19: 49-67 Bain J. M., Mercer F. V. (1966b): The relationship of the axis and the cotyledons in germinating seeds and seedlings of Pisum sativum L. Aust. J. biol. Sci. 19: 85-96 Barák J., Brouzdal P. (2004): Proč se to nepovedlo tak, jak jsme doufali. Plant Soil Environ. 40 (8): 253256. Baroja-Fernández E., Aguirreole J., Martínková H., Hanuš J., Strnad M. (2002): Aromatic cytokinins in micropropagated potato plants. Plant Physiol. Biochem. 40 (3): 217-224 Batge S. L., Ross J. J., Reid J. B. (1999): Abscisic acid levels in seeds for the gibberellin-deficient mutant lh-2 of pea (Pisum sativum). Physiol. Plant. 105: 485-490 Beaudoin N., Serizet C., Gosti F., Giraudat J. (2000): Interaction between abscisic acid and ethylene signaling cascades. Plant Cell 12: 1103-1115 Beck E., Wagner B. M. (1994): Quantification of the daily cytokinin transport from root to the shoot of Urtica dioica L. Bot. Acta 107: 342-348 Beveridge C. A., Murfet I. C., Kerhoas L., Sotta B., Miginiac E., Rameau C. (1997a): The shot controls zeatin riboside export from pea roots. Evidence from the branching mutant rms4. Plant J. 11: 339-345 Beveridge C. A., Ross J. J., Murfet I. C. (1994): Branching mutant rms2 in Pisum sativum. Grafting studies and endogenous indole-3-acetic acid levels. Plant Physiol. 104: 953-959 Beveridge C. A., Ross J. J., Murfet I. C. (1996): Branching in pea. Action of genes Rms3 a Rms4. Plant Physiol. 110: 859-865

86

Beveridge C. A., Symons G. M., Murfet I. C., Ross J. J., Rameau C. (1997b): The rms1 mutant of pea has elevated indole-3-acetic acid levels and reduced root-sap zeatin riboside content but increased branching controlled by graft-transmissible signal(s). Plant Physiol. 115: 1251-1258 Beveridge C. A., Symons G. M., Turnbull C. G. N. (2000): Auxin inhibition of decapitation induced branching is dependent on graft-transmissible signals regulated by genes Rms1 a Rms2. Plant Physiol. 123: 689-697. Bhattacharya S., Bhattacharya N. C., Biswas P. K., Strain B. R (1985): Response of cow pea (Vigna unguiculata L.) to CO2 enrichment environment on growth, dry-matter production and yield components at different stages of vegetative and reproductive growth. J. Agric. Sci. 105: 527-534 Binder B. M., O´Malley R. C., Wang W., Moore J. M., Parks B. M., Spalding E. P., Bleecker A. B. (2004): Arabidopsis seedling growth response and recovery to ethylene. A kinetic analysis. Plant Physiol. 136: 2913-2920 Bisby F. A. (1994): Plant names in botanical databases. International Working Group on Taxonomic Databases for Plant Sciences (TDWG). Pittsburgh. ISBN 0-913196-62-2 Bitter F., Oreb M., Mendel R. R. (2001): ABA3 is molybdenum cofactor sulfurase required for activation of aldehyde oxidase and xanthine dehydrogenase in Arabidopsis thaliana. J Biol. Chem. 276: 4038140384 Blake T. J., Reid D. M., Rood S. B. (1983): Ethylene, indoleacetic acid and apical dominance in peas: A reappraisal. Physiol. Plant. 59 (3): 481-487 Blažková, J., Krekule, J., Macháčková, I., Procházka, S. (1999): Auxin and cytokinins in the control of apical dominance in pea - a differential response due to bud position. J. Plant Physiol. 154: 691-696 Bleecker A. B., Kende H. (2000): Ethylene: A gaseous signal molecule in plants. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 16: 1–18 Bleecker A. B., Schaller G. E. (1996): The mechanism of ethylene perception. Plant Physiol. 111: 653660 Blokhina O. B., Chirkova T. V., Fagerstat K. V. (2001): Anoxic stress leads to hydrogen peroxide formation and lipid peroxidation in plant cells. J. Exp. Bot. 52: 1179-1190 Bonfil C. (1998): The effect of seed size, cotyledon reserves and herbivory on seedling survival and growth in Quercus rugosa and Q. laurina (Fagaceae). Am. J. Bot. 85 (1): 79–87 Booker J., Chatfield S., Leyser O. (2003): Auxin act in xylem- associated of medullary cells to mediate apical dominance. Plant cell 15: 495-507 Borisjuk L., Rolletschek H., Wobus U., Weber H. (2003): Differentiation of legume cotyledons as related to metabolic gradients and assimilate transport into seeds. J. Exp. Bot. 54: 503-512 Borisjuk L., Walenta S., Weber, H., Mueller-Klieser W., Wobus U. (1998): High-resolution histographical mapping of glucose concentrations in developing cotyledons of Vicia faba in relation to mitotic activity and storage processes: glucose as a possible developmental trigger. Plant J. 15 (4): 583-591 Borisjuk L., Weber H., Panitz R., Manteuffel R., Wobus U. (1995): Embryogenesis of Vicia faba L.: histodifferentiation in elation to starch and storage protein synthesis. J. .Plant Physiol. 147: 203-218 Bouzayen M., Latche A., Pech., J.-C., Marigo G. (1989): Carrier-mediated uptake of 1(malonylamino)cyclopropane-1-carboxylic acid in vacuoles isolated from Catharanthus roseus cells. Plant Physiol. 91: 1317-1322 Bradford K. J., Yang S. F. (1980): Xylem transport of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, an ethylene precursor, in waterlogged tomato plants. Plant Physiol. 65: 322-326 Brewer P. B., Dun E. A., Ferguson B. J., Rameau C., Beveridge C. A. (2009): Strigolactone acts downstream of auxin to regulate bud outgrowth in pea and Arabidopsis. Plant Physiol. 150: 482-493 Burg S. P., Burg E. A. (1968): Ethylene formation in pea seedlings. Its relation to the inhibition of bud growth caused by indole-3-acetic acid. Plant Physiol. 43: 1069–1074 Busk P. K., Pagès M. (1998): Regulation of abscisic acid-induced transcription. Plant Mol. Biol. 37: 425435

87

Capitani G., Hohenester E., Feng L., Storici P., Kirsch J. F., Jansonius J. N. (1999): Structure of 1aminocyclopropane-1-carboxylate synthase, a key enzyme in the biosynthesis of the plant hormone ethylene. J. Mol. Biol. 294: 745-756 Celikel F. G., Vandoorn W. G. (1995): Solute leakage, lipid peroxidation and protein degradation during the senescence of Iris petals. Physiol. Plant. 94: 515-521 Cline M. G. (1991): Apical dominance. Bot. Rev. 57: 318-385 Cline M. G. (1994): The role of hormones in apical dominance. New approaches to an old problem in plant development. Physiol. Plant. 90: 230-237 Cline M. G. (1996): Exogenous auxin effects on lateral bud outgrowth in decapitated shoots. Ann. Bot. 78: 255-266 Cline M. G., Oh Ch. (2006): A reappraisal of the role of abscisic acid and its interaction with auxin in apical dominance. Ann. Bot. 98: 891-897 Cline M. G., Sadeski K. (2002): Is auxin the repressor signal of branch growth in apical control? Am. J. Bot. 89 (11): 1764-1771 Collins O. D. G., Sutcliffe J. F. (1977): The relationship between transport of individual elements and dry matter from the cotyledons of Pisum sativum L. Ann. Bot. 41: 163-171 Dammann Ch., Rojo E., Sánghez-Serrano J. J. (1996): Abscisic acid and jasmonic acid activate woundinducible genes in potato through separate, organ-specific signal transduction pathways. Plant J. 11 (4): 773-782 De Jong A., Koerselman-Kooij J. W., Schuurmans J. A. M. J., Borstlap A. C. (1997): The mechanisms of amino acid efflux from seed coats of developing pea seeds as revealed by uptake experiments. Plant Physiol. 114: 731–736 Derbyshirea E., Wright D. J., Boulter D. (1976): Legumin and vicilin, storage proteins of legume seeds. Phytochemistry. 15 (1): 3-24 Destefano-Beltrán L., Knauber D., Huckle L., Suttle J. C. (2006): Effects of postharvest storage and dormancy status on ABA content, metabolism, and expression of genes involved in ABA biosynthesis and metabolism in potato tuber tissues. Plant Mol. Biol. 61: 687-697 Diaz P., Wilson K. A., Tan-Wilson A. L. (1993): Immunocytochemical analysis of proteolysis in germinating soybean. Phytochemistry 33 (5): 961-968 Dietz K. J., Sauter A., Wichert K., Messdaghi D., Hartung W. (2000): Extracelular β-glucosidase activity in barley involved in the hydrolysis of ABA glucose conjugate in leaves. J. Exp. Bot. 51: 937-944 Dolan L. (1997): The role of ethylene in the development of plant form. J. Exp. Botany 48 (307): 201-210 Dong J. G., Fernández-Maculet J. C., Yang S. F. (1992): Purification and characterization of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase from apple fruit. Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 9789-9793 Dostál R. (1908): Korelační vztahy u klíčních rostlin Papilionaceí. Rozpr. Čes. Akad. tř. II. 17:1-44 Dostál R. (1939): Über die Auslösung der Korrelation zwischen den Kotylaren von Pisum sativum. Sonderabdruck aus den Betrichten der Deustchn Botanichen Gesellschaft, Band LVII, Heft 6 Dostál R. (1941): Wuchsstoffstudien betrefend die Korrelationen zwischen Wurzel und Stroß bei Pisum sativum. Práce Mor. přírod. spol. 13: 1-31 Dostál R. (1959a): Další experimentálně morfologické studie. Práce Brněnské zákl. ČSAV, 31: 1-76 Dostál R. (1959b): O celistvosti rostliny. SZN Praha, 166 s. Dostál R. (1967): On lateral growth correlations exemplified by petioles and axillaries of Pisum cotyledons. Biol. Plant. 9: 330-339 Ecker J. R. (1995): The Ethylene signal transduction pathway in plants. Science 268: 667-675 Eisenreich W., Bacher A., Arigoni D., Rohdich F. (2004): Biosynthesis of isoprenoids via the nonmevalonate pathway. Cell. Mol. Life Sci. 61 (12): 1401-1426

88

El-Abd S. O., EL-Beltagy M. S., Abou-Hadid A. F. (1999): Effect of different temperature regimes on ethylene production and endogenous levels of IAA, ABA, ACC of tomato. Cah. Opt. Méditerran. 31: 161166 Else M. A., Jackson M. B. (1998): Transport of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) in the transpiration stream of tomato (Lycopersicon esculentum) in relation to foliar ethylene production and petiole epinasty. Austr. J. Plant Physiol. 25 (4): 453-458 Emery R. J. N., Leport L., Barton J. E., Turner N. C., Atkins C. A. (1998a): cis-Isomers of cytokinins predominate in chickpea seeds throughout their development Plant Physiol. 117: 1515-1523 Emery R. J. N., Longnecker N. E., Atkins C. A. (1998b): Branch development in Lupinus angustifolius L. II Relationships with endogenous ABA, IAA and cytokinins in axillary and main stem buds. J. Exp. Bot. 49: 555-562 Emery R. J. N., Ma Q., Atkins C. A. (2000): The form and sources of cytokinins in developing white lupine seeds and fruits. Plant Physiol. 123: 1593-1604 Ericsson T: (1995): Growth and shoot: root ratio of seedlings in relation to nutrient availability. Plant Soil 168-169 (1): 205-214 Etheridge N., Hall B. P., Shaller G. F. (2006): Progress report: ethylene signaling and responses. Plants 221: 387-391 Everat-Bourbouloux A., Charnay D. (1982): Endogenous abscisic acid levels in stems and axillary buds of intact or decapitated broad-bean plants (Vicia faba L.). Physiol. Plant. 54 (4): 440 - 445 Ferguson I. B., Bollard E. G. (1976): The movement of calcium in germinating pea seeds. Ann. Bot. 40: 1047-1055 Ferreira F. J., Kieber J. J. (2005): Cytokinin signaling. Cur. Opi. Plant Biol. 8: 518-525 Finch-Savage W. E., Leubner-Metzger G. (2006): Seed dormancy and the control of germination. New Phyt. 47 (7): 864-877 Finlayson S. A., Foster K. R., Reid D. M. (1991): Transport and metabolism of 1-aminocyclopropane-1carboxylic acid in sunflower (Helianthus annuus L.) seedlings. Plant Physiol. 96: 1360-1367 Fišerová H., Kula E., Klemš M., Reinöhl V. (2001): Phytohormones as indicators of the degree of damage in birch (Betula pendula). Biológia (Bratislava) 56: 405-409 Fišerová H., Mikušová Z., Klemš M. (2008): Estimation of ethylene production and 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid content in plants by means of gas chromatography. Plant Soil Environ. 54 (2): 55-60 Fišerová H., Šebánek J., Hradilík J., Procházka S. (2006b): The effect of quercetine on leaf abscission of apple tree (Malus domestica Borkh.), growth of flax (Linum usitatissimum L.) and pea (Pisum sativum L.), and ethylene production. Plant Soil Environ. 52 (4): 559-563 Fišerová H., Šebánek J., Hradilík P., Doležel H., Vítková H. (2006a): Role of cytokinins in growth correlations between roots and stems in pea (Pisum sativum L.) seedlings. Plant Soil Environ. 52 (4): 159-163 Foo E., Bullier E., Goussot M., Foucher F., Rameau C., Beveridge C. A. (2005): The branching gene RAMOUSUS1 mediates interactions among two novel signals and auxin in pea. Plant Cell 17: 464-474 Foo E., Morris S. E., Parmenter K., Young N., Wang H., Jones A., Rameau C., Turnbul C. G. N. Beveridge C. A. (2007): Feedback regulation of xylem cytokinin content is conserved in pea and Arabidopsis. Plant. Physiol. 143: 1418-1428 Fuhrer J., Fuhrer-Fries Ch. B. (1985): Formation and transport of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid in pea plants. Phytochemistry 24 (1): 19-22 Gallardo M., del Mar Delgado M., Sánchez-Calle I. M., Matilla A. J. (1991): Ethylene production and 1aminocyclopropane-1-carboxylic acid conjugation in thermoinhibited Cicer arietinum L. seeds. Plant Physiol. 97: 122-127 Gane R. (1934): Production ethylene by some fruits. Nature 134: 1008

89

García-Cebrián F., Esteso-Martínez J., Gil-Pelegrín E. (2003): Influence of cotyledon removal on early seedling growth in Quercus robur L. Ann. For. Sci. 60: 69–73 Garcia-Luis A., Guardiola J. L. (1978): Gibberellic acid and starch breakdown in pea cotyledons. Ann. Bot. 42: 337-344 Gatehouse J. A., Evans I. M., Brown D., Croy R. R. D., Boulter D. (1982): Control of storage-protein synthesis during seed development in pea (Pisum sativum L.). Biochem J. 208: 119-127 Gocal G. F. W., Pharis R. P., Yeung E. C., Pearce D. (1991): Changes after decapitation in concentrations of indole-3-acetic acid and abscisic acid in the larger axillary bud of Phaseolus vulgaris L. cv Tender Green. Plant Physiol. 95: 344-350 Gonzalez-Rizzo S., Crespi M., Frugier F. (2006): The Medicago truncatula CRE1 Cytokinin receptor regulates lateral root development and early symbiotic interaction with Sinorhizobium meliloti. Plant Cell 18: 2680-2693 Grbič V., Bleecker A. B. (2000): Axillary meristem development in Arabidopsis thaliana. Plant J. 21: 215-223 Grelet J., Benamar A., Teyssier E., Avelange-Macherel M-H., Grunwald D., Macherel D. (2005): Identification in pea seed mitochondria of a late-embryogenesis abundant protein able to protect enzymes from drying. Plant Physiol. 137: 157-167 Grossmann K. (2007): Auxin herbicide action: Lifting the veil step by step. Plant Signal Beahv. 2: 420422 Grossmann K., Hansen H. (2001): Ethylene triggered abscisic acid: a principle in plant growth regulation? Physiol. Plant. 113: 9-14 Guardiola J. L., Sutcliffe J. F. (1972): Transport of materials from the cotyledons during germination of seed of the garden pea (Pisum sativum L.). J. exp. Bot. 2: 322-337 Gubler F., Hughes T., Waterhouse P., Jacobsen J. (2008): Regulation of Dormancy in Barley by Blue Light and After-Ripening: Effects on Abscisic Acid and Gibberellin Metabolism. Plant Physiol. 147: 886896 Gusta L. V., Trischuk R., Weiser C. J. (2005): Plant cold acclimation: the role of abscisic acid. J. Plant Growth Regul. 24: 308-318 Hansen H., Grossmann K. (2000): Auxin-induced ethylene triggers abscisic acid biosynthesis and growth inhibition. Plant Physiol. 124: 1437-1448 Hartung W., Sauter A., Hose E. (2002): Abscisic acid in the xylem: where does it come from, where does it go to? J. Exp. Bot. 53: 27-32 Hauxwell A. J., Corke F. M. K., Hedley C. W., Wang T. L. (1990): Storage protein gene expression is localized to regions lacking mitotic activity in developing pea embryos. An analysis of seed development in Pisum sativum. XIV. Development 110: 283-289. Haver D. L., Schuch U. K., Lovatt C. J. (2003): Exposure of petunia seedlings to ethylene decreased apical dominance by reducing the ratio of auxin to cytokinin. Plant Growth Regul. 21 (4): 459-468 Hays D. B., Reid D. M., Yeung E. C., Pharis R. P. (2000): Role of ethylene in cotyledon development of microspore-derived embryos of Brassica napus. J. Exp. Bot. 352: 1851-1859 Hayward A., Stirnberg P., Beveridge Ch., Leyser O. (2009): Interactions between auxin and strigolactone in shoot branching control. Plant Physiol. 151: 400-412 Hecht S., Eisenreich W., Adam P., Amslinger S., Kis K., Bacher A., Arigoni D., Rohdich F. (2001): Studies on the nonmevalonate pathway to terpenes: The role of the GcpE (IspG) protein. Proc. Natl. Acad. Sci. 26: 14837-14842 Hirai N., Yoshida R., Todoroki Y., Oshigashi H. (2000): Biosynthesis of abscisic acid by the nonmevalonat pathway in plants, and by the mevalonate pathway in fungi. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64: 1448-1458 Hoffman T., Schmidt J. S., Zheng X., Bent A. F. (1999): Isolation of ethylene-insensitive soybean mutants that are altered in pathogen susceptibility and gene-for-gene distance resistance. Plant Physiol. 119: 935-949

90

Hoh B., Hinz G., Jeong B. K., Robinson D. G. (1995): Protein storage vacuoles form de novo during pea cotyledon development. J. Cell Sci. 108 (1): 299-310 Hosokawa Z., Shi L., Prasad T. K., Cline M. G. (1990): Apical dominance control in Ipomoea nil: the influence of the shoot apex, leaves and stem. Ann. Bot. 65: 547-556 Hradilík J. (1975): Estimation of substances with the cytokinin activity in studies on the correlation between the cotyledon and its axillary bud in pea (Pisum sativum L.). Biol. Plant. 17: 147-149 Hradilík J. (1976): Effects of auxin, cytokinin, etherel and cotyledon excision on the peroxidase activity in cotylar buds of decapitated pea (Pisum sativum L.) plants. Biol. Plant. (Praha) 18 (2): 93-98 Hradilík J. (1994): Pea (Pisum sativum L.) seedlings as a model for studies on plant integrity. Biol. plant. (Suppl.) 36: 69 Hradilík J., Fišerová H. (1993): Vliv syntetických regulátorů na růstové korelace u klíčních rostlin hrachu (Pisum sativum L.). Acta univ. agric. A 1-2: 88-102. Hradilík J., Fišerová H., Šalanský I. (1985): Correlation between the axillary bud and the cotyledon of pea (Pisum sativum L.) seedlings and values of tissue impedance. Acta univ. agric. A 3: 607-613. Hradilík J., Fišerová H., Vejrosta J. (1986): Stanovení etylénu produkovaného klíčními rostlinami hrachu po jejich dekapitaci. Acta univ. agric. A 3: 15-26. Hradilík J., Šebánek J. (1970): Effect of b-indolacetic acid on the level of 2-chloretyl trimetyl-amonium chloride in epicotyls of pea seedlings. Biochem. Physiol. Pflanzen 161: 178-182. Hřibová M. (1994): Korelační vliv dělohy hrachu na růst kotyláru. Diplomová práce MZLU Brno, 55 s. Huber D. J. (2008): Suppression of ethylene responses through application of 1-methylcyclopropene: a powerful tool for elucidating ripening and senescence mechanisms in climacteric and nonclimacteric fruits and vegetables. Hort. Sci 43 (1): 108-111 Huntley R. P., Murray J. A. H. (1999): The plant cell cycle. Cur. Opi. Plant Biol. 2: 440-446 Chae H. S., Kieber J. J. (2005): Eto brute? Role of ACS turnover in regulating ethylene biosynthesis. Trends Plant Sci. 10 (6): 291-296 Chang C., Stadler R. (2001): Ethylene hormone receptor action in Arabidopsis. BioEssays 23: 619-627 Charvez-Franco S. H., Kader A. A. (1993): Effect CO2 on ethylene biosynthesis in ‘Bartlet’ pears. Postharvest Biol. Technol. 3: 183-190 Chaudhry N. Y., Rasheed S. (2003): Study of the external and internal morphology of Pisum sativum L., with growth hormones i.e., indole-3-acetic acid and kinetin and heavy metal i.e., lead nitrate. Pakistan J. of Biol. Sci. 6 (4): 407-412 Cheikh N., Jones R. J. (1994): Disruption of maize kernel growth and development by heat stress (role of cytokinin/abscisic acid balance). Plant Physiol. 106: 45-51 Chen Ch.-M., Ertl J. R., Leisner S. M., Chang Ch.-Ch. (1985): Localization of cytokinin biosynthetic sites in pea plants and carrot roots. Plant Physiol. 78: 510-513 Chen Y., Etheridge N., Schaller G. E. (2005): Ethylene signal transduction. Ann. Bot. 95: 901-915 Cheng W. H., Endo A., Zhou L., Penney J., Chen H. C., Anoyo A., Leon P., Nambara E., Asami T., Seo M., Koshiba T., Sheen J. (2002): A unique short-chain dehydrogenase/reductase in Arabidopsis glucose signaling and abscisic acid biosynthesis and functions. Plant Cell 14: 2723-2743 Christmann A., Weiler E. W., Sterdle E., Grill E. (2007): A hydraulic signal in root-to-shoot signaling of water shortage. Plant J. 52: 167-174 Iglesias R. G., Babiano M. J. (1997): Endogenous abscisic acid during the germination of chick-pea seeds. Physiol. Plant. 100 (3): 500 – 504 Inoue T., Higuchi M., Hashimoto Y., Seki M., Kobayashi M., Kato T., Tabata S., Shinozaki K., Kakimoto T. (2001): Identification of CRE1 as a cytokinin receptor from Arabidopsis. Nature 409: 1060-1063 Jackson M. B. (1993): Are plant hormones involved in root to shoot communication? Adv. Bot. Res. 19: 103-187

91

Jasoni, R. L., Cothren, J. T., Morgan, P. W., Sohan, D. E. (2002): Circadian ethylene production in cotton. Plant Growth Regul. 36: 127-133 Jelonková J. (1997): Některé korelativní vztahy u klíčních rostlin hrachu. Diplomová práce MZLU Brno, 57 s. John W. W., Curtis R. W. (1977): Isolation and identification of the precursor of ethane in Phaseolus vulgaris L. Plant Physiol. 59: 521-522 Johnson X, Brcich T., Dun E. A., Coussot M., Haurogné K., Beveridge Ch. A., Rameau C. (2006): Branching genes are conserved across species. Genes controlling a novel signal in pea are coregulated by other long-distance signals. Plant Physiol. 142: 1014-1026 Johnston J. W., Gunaseelan K., Pidakala P., Wang M., Schaffer R. J. (2009): Co-ordination of early and late ripening events in apples is regulated through differential sensitivities to ethylene. J. Exp. Bot. 60 (9): 2689-2699 Kabey D., Sakai S. (2003): The role of roots and cotyledons as storage organs in early stages of establishment in Quercus crispula: a quantitative analysis of the nonstructural carbohydrate in cotyledons and roots. Ann. Bot. 92: 537-545 Kadlecová Z. (1999): Kyselina abscisová-stresový hormon. Biologické listy. 64 (1): 1-17 Kahl J., Siemens D. H., Aerts R. J., Gabler R., Kuhnemann F., Preston C. A., Baldwin I. T. (2000): Herbivore-induced ethylene suppresses a direct defense but not a putative indirect defense against and adapted herbivores. Planta 210: 336-342 Kasahara H., Takei K., Ueda N., Hishiyama S., Yamaya T., Kamiya Y., Yamaguchi S., Hitoshi S. (2004): Distinct isoprenoid origins of cis- and trans-zeatin biosynthesis in Arabidopsis. J. Biol. Chem. 279: 14049-14054 Kato M., Hayakawa Y., Hyodo H., Ikoma Y., Yano M. (2000): Wound-induced ethylene synthesis and expression and formation of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) synthase, ACC oxidase, phenylalanine ammonia-lyase, and peroxidase in wounded mesocarp tissue of Cucurbita maxima. Plant Cell Physiol. 41 (4): 440-447 Kefu Z., Munns R., King R. W. (1991): Abscisic acid levels in NaCl-treated barley, cotton and saltbush. Austr. J. Plant Physiol. 18: 17-24 Ketsa S., Chidtragool S., Klein J.D., Lurie S. (1999): Ethylene synthesis in mango fruit following heat treatment. Postharvest Biol. Technol. 15: 65-72 Killeen L. A., Larson L. A. (1968): The effect of cotyledon excision on the growth of pea seedlings. Am. J. Bot. . 55 (8): 961-965 Kimmerer T. W., Kozlowski T. T. (1982): Ethylene, ethane, acetaldehyde and ethanol production by plants under stress. Plant Physiol. 69: 840-847 Kitazawa D., Miyazawa Y., Fujii N., Hoshino A., Ida S., Nitasaka E., Takahashi H. (2008): The gravity regulated growth of axillary buds is mediated by a mechanism different from decapitation-induced release. Plant Cell Physiol. 49: 891-900 Klee H., Estelle D. (1991): Molecular genetic approaches to plant hormone biology. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 42: 529-551 Klíčová Š., Šebánek J. (1994): The role of benzolinon in the apical dominance of pea (Pisum sativum L.). Biol. Plant. (Suppl.) 36: 69 Klíčová Š., Šebánek J., Vlašic T. (2004): The effect of cytokinins and other plant hormones on the growth of cotyledonary axillars of flax (Linum usitatissimum), sunflower (Helianthus annuus) and pea (Pisum sativum). Plant Soil Environ. 50 (4): 182-187 Knee M. (1991): Role of ethylene in chlorophyll degradation in radish cotyledons. J. Plant Growth Regul. 10: 157-162 Komor E., Liegl I., Schobert Ch. (1993): Loading and translocation of various cytokinins in phloem and xylem of the seedlings of Ricinus communis L. Planta 191 (2): 252-255 Konze J. R., Elstner E. F. (1978): Ethane and ethylene formation by mitochondria as indication of aerobic lipid degradation in response to wounding of plant tissue. Biochem. Biophys. Acta 528: 213-221

92

Koshiba T., Saito E., Ono N., Yamamoto N., Sato M. (1996): Purification and properties of flavin- and molybdenum-containing aldehyde oxidase from coleoptiles of maize. Plant Physiol. 110: 781-789 Koukourikou-Petridou M. A., Bangerth F. (1997): Effect of changing the endogenous concentration of auxins and cytokinins and the production of ethylene in pea stem cuttings on adventitious root formation. Plant Growth Regul. 22 (2): 101-108 Kruger E. L., Reich P. B. (1993): Coppicing affects growth, root:shoot relations and ecophysiology of potted Quercus rubra seedlings. Physiol. Plant. 89 (4): 751-760 Kurakawa T., Ueda N., Maekawa M., Kobayashi K., Kojima M., Nagato Y., Sakakibara H., Kyozuka J. (2007): Direct control of shoot meristem activity by cytokinin-activating enzyme. Nature 445: 652-655 Kyozuka J. (2007): Control of shoot and root meristem function by cytokinin. Cur. Opi. Plant Biol. 10: 442-446 Labourová P. (2003): Korelace „in vitro“ u klíčních rostlin hrachu. Diplomová práce MZLU Brno, 65 s. Leckie C. P., McAinsh M. R., Allen G. J., Sanders D., Hetherington A. M. (1998): Abscisic acid-induced stomatal closure mediated by cyclic ADP-ribose. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (26): 15837-15842 Lehner G., Cardemil L. (2003): Differences in wound-induced changes in cell-wall peroxidase activities and isoform patterns between seedlings of Prosopis tamarugo and Prosopis chilensis. Tree Physiol. 23 (7): 443-452 Letham D. S., Palni L. M. S. (1983): The biosynthesis and metabolism of cytokinins. Annu. Rev. Plant Physiol. 34: 163-197 Li C.-J., Guevara E., Herrera J., Bangerth F. (1995): Effect of apex excision and replacement by 1-naphthylacetic acid on cytokinin concentration and apical dominance in pea plants. Physiol. Plant. 94 (3): 465-469 Li C., Pfeffer H., Dannel F., Römheld V., Bangerth F. (2001): Effects of boron starvation on boron compartmentation, and possibly hormone-mediated elongation growth and apical dominance of pea (Pisum sativum) plants. Physiol. Plant. 111: 212-219 Li C-J., Bangerth F. (1999): Autoinhibition of indoleacetic acid transport in the shoots of two-branched pea (Pisum sativum) plants and its relationship to correlative dominance. Physiol. Plant. 106: 415-420 Li C-J., Bangerth F. (2003): Stimulatory effect of cytokinins and interaction with IAA on the release of lateral buds of pea plants from apical dominance. J. Plant Physiol. 160: 1059-1063. Li Z., Jarret R. L., Pittman R. N., Demski J. W. (1994): Shoot organogenesis from cultured seed explants of peanut (Arachis hypogaea L.) using thidiazuron. In Vitro Cell. Dev. Biol. 30 (4): 187-191 Lichtenthaler H. K. (1999): The 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: 47-65 Lichtenthaler H. K., Schwender J., Disch A., Rohmer M. (1997): Biosynthesis of isoprenoids in higher plant chloroplasts proceeds via mevalonate-independent pathway. FEBS Lett. 400: 271-274 Liu C., Johnson S., Di Gregorio S., Wang T. (1999): single cotyledon (sic) mutants significance in understanding plant embryo development. Develop. Genetics 25: 11-22 Liu H.-T., Liu Y.-Y., Pan Q.-H., Yang H.-R., Zhan J.-C., Huang W.-D. (2006): Novel interrelationship between salicylic acid, abscisic acid, and PIP2-specific phospholipase C in heat acclimation-induced thermotolerance in pea leaves. Physiol. Plant. 57 (12): 3337-3347 Lobreaux S. Briat J. (1991): Ferritin accumulation and degradation in different organs of pea (Pisum sativum) during development. Biochem. J. 274: 601-606 Lorenzi R., Bennici A., Cionini P. G., Alpi A. D'Amato F. (1978): Embryo-suspensor relations in Phaseolus coccineus: cytokinins during seed development. Planta 143 (1): 59-62 Lorteau M.-A., Ferguson B. J., Guinel F. C. (2001): Effect of cytokinin on ethylene production and nodulation in pea (Pisum sativum) cv. Sparkle. Physiol. Plant. 112: 421-428 Lund S. T., Stall R. E., Klee H. J. (1998): Ethylene regulates the susceptible response to pathogen infection in tomato. Plant Cell 10: 371-382

93

Ma Z., Baskin T. I., Brown K. M., Lynch J. P. (2003): Regulation of root elongation under phosphorus stress involves changes in ethylene responsiveness. Plant Physiol. 131: 1381-1390 Mader J. C., Emery R. J. N., Turnbull C. G. N. (2003b): Spatial and temporal changes in multiple hormone groups during lateral bud release shortly following apex decapitation of chickpea (Cicer arietinum) seedlings. Physiol. Plant. 119: 295-308. Mader J.C., Turnbull C. G. N., Emery R. J. N. (2003a): Transport a metabolism of xylem cytokinins during lateral bud release in decapitated chickpea (Cicer arietinum) seedlings. Phys. Plant. 117:118-129. Maheshwari P. (1950): An introduction to the embryology of angiosperm. McGraw-Hill. New York Macháčková I., Eder J., Motyka V., Hanuš J., Krekule J. (1996): Photoperiodic control of cytokinin transport and metabolism in Chenopodium rubrum. Physiol. Plant. 98: 564-570 Macháčková I., Chauvaux N., Dewitte W., van Onckelen H. (1997): Diurnal fluctuations in ethylene formation in Chenopodium rubrum. Plant Physiol. 113: 981-985 Macháčková I., Krekule J., Eder J., Seidlová F., Strnad M. (1993): Cytokinins in photoperiodic induction of flowering in Chenopodium species. Physiol. Plant. 87: 160-166 Marentes E., Grusak M. A. (1998): Iron transport and storage within the seed coat and embryo of developing seeds of pea (Pisum sativum L.). Seed Sci. Res. 8: 367-375 Marks G. E. and da Vies, D. R., (1979): The cytology of cotyledon cells and the induction of giant polytene chromosomes in Pisum sativum. Protoplasma 101: 73-80 Matilla A. J., Gómez-Jiménez M. C. (2001): Metabolism of malonyl-ACC in higher plants. Recent Res. Devel. Phytochem. 5: 87-94 McConnell J. R., Barton M. K. (1998): Leaf polarity and meristem formation in Arabidopsis. Development 125: 2935-2942 Meng F.-Z., Hu L.-P., Wang S.-H., Sui X.-L., Wei L., Wei Y.-X., Sun J.-L., Zhang Z.-X. (2008): Effects of exogenous abscisic acid (ABA) on cucumber seedling leaf carbohydrate metabolism under low temperature. Plant Growth Regul. 56: 233-244 Milberc P., Lamont B. B. (1997): Seed/cotyledon size and nutrient content play a major role in early performance of species on nutrient-poor soils. Milborrow B. V. (1974): The chemistry and physiology of abscisic acid. Ann. Rev. Plant Physiol. 25: 259307 Milborrow B. V. (2001): The pathway of biosynthesis of abscisic acid in vascular plants: a review of the present state of knowledge of ABA biosynthesis. J. Exp. Bot. 52 (359): 1145-1164 Miranda M., Borisjuk L., Tewes A., Dietrich D., Rentsch D., Weber H., Wobus U. (2003): Peptide and amino acid transporters are differentially regulated during seed development and germination in faba bean. Plant Physiol. 132: 1950-1960 Miyamoto K., Kamisaka S. (1988): Growth and osmoregulation in Pisum sativum subhooks as affected by gibberellic acid and cotyledon excision. Physiol. Plant. 74 (4): 669-674 Miyazaki J. H., Yang S. F. (1987): Metabolism of 5-methylthioribose to methionine. Plant Physiol. 84: 277-281 Mok D. W., Mok M. C. (2001): Cytokinin metabolism and action. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 52: 89-118 Monerri C., Garcia-Luis A., Guardiola J. L. (1985): Sugar and starch changes in pea cotyledons during germination. Physiol. Plant. 67 (1): 49-54 Montero E., Cabot C., Barceló J., Poschenrieder C. (1997): Endogenous abscisic acid levels are linked to decreased growth of bush bean plants treated with NaCl. Plant Physiol. 101: 17-22 Morohashi Y., Bewley J. D. (1980): Development of mitochondrial activities in pea cotyledons during and following germination of the axis. Plant Physiol. 66: 70-73 Munns R., Cramer G. R. (1996): Is co-ordination of leaf and root growth mediated by abscisic acid? Opi. Plant Soil 185: 33-49

94

Müntz K. (1996): Proteases and proteolytic cleavage of storage proteins in developing and germinating dicotyledonous seeds. J. Exp. Bot. 296 (47): 605-622 Müntz K. (1998): Deposition of storage proteins. Plant Mol. Biol. 38: 77-99 Nakajima E., Nakano H., Yamada K., Shigemori H., Hasegawa K. (2002): Isolation and identification of lateral bud growth inhibitor, indole-3aldehyde, involved in apical dominance of pea seedlings. Phytocheminstry 61: 863-865 Napoli C. A., Beveridge C. A., Snowden K. C. (1999) Reevaluating concepts of apical dominance and the control of axillary bud outgrowth. Curr. Topics Dev. Biol. 44: 127-169 Nawa Y., Asahi T. (1971): Rapid development of mitochondria in pea cotyledons during the early stage of germination. Plant Physiol. 48: 671-674 Nicolás C., Nicolás G., Rodríguez D. (2006): Antagonistic effects of abscisic acid and gibberellic acid on the breaking of dormancy of Fagus sylvatica seeds. Physiol. Plant. 96 (2): 244 – 250 Nishiyama K., Guis M., Rose J. K. C., Kubo Y., Bennett K. A., Wangjin L., Kato K., Ushijima K., Nakano R., Inaba A., Bouzayen M., Latche A., Pech J.-C., Bennett A. B. (2007): Ethylene regulation of fruit softening and cell wall disassembly in Charentais melon. J. Exp. Bot. 58 (6): 1281-1290 Nordström A., Tarkowski P., Tarkowska D., Norbaek R., Astot C., Dolezal K., Sandberg G. (2004): Auxin regulation of cytokinin biosynthesis in Arabidopsis thaliana: A factor of potential importance for auxincytokinin-regulated development. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (21): 8039-8044 O’Donnell P. J., Jones J. B., Antoine F. R., Ciardi J., Klee H. J. (2001): Ethylene-dependent salicylic acid regulates an expanded cell death response to a plant pathogen. Plant J.: 25 (3): 315-323 Oldroyd G. E. D., Engstrom E. M., Long S. R. (2001): Ethylene Inhibits the nod factor signal transduction pathway of Medicago trucatula. Plant Cell 13: 1835-1849 Oritani T., Kiyota H. (2003): Biosynthesis and metabolism of abscisic acid and related compounds. Nat. Prod. Rep. 20: 414-425 Palmer S. J., Berridge D. M., McDonald A. J. S., Davies W. J. (1996): Control of leaf expansion in sunflower (Helianthus annuus L.) by nitrogen nutrition. J. Exp. Bot. 47: 359-368 Parry A. D., Griffiths A., Horgan R. (1992): Abscisic Acid biosynthesis in roots II. The effects of waterstress in wild-type Lycopersicon exculentum Mill. Planta 187: 192-197 Parry A. D., Horgan R. (1992): Abscisic acid biosynthesis in roots I. The identification of potential abscisic acid precursors, and other carotenoids. Planta 187: 185-191 Paull R. E., Chen N. J. (1983): Postharvest variation in cell wall-degrading enzymes of papaya (Carica papaya L.) during fruit ripening. Plant Physiol. 72: 382-385 Peck S. C., Pawlowski K., Kende H. (1998): Asymmetric responsiveness to ethylene mediates cell elongation in the apical hook of peas. Plant Cell 10: 713-719 Peiser G. D., Yang S. F. (1979): Ethylene and ethane production from sulfur dioxide-injured plants. Plant Physiol. 63: 142-145 Peiser G., Yang S. F. (1998): Evidence for 1-(malonylamino) cyclopropane-1-carboxylic acid being the major conjugate of aminocyclopropane-1-carboxylic acid in tomato fruit. Plant Physiol. 116: 1527-1532 Petruzzelli L., Coraggio I., Leubner-Metzger G. (2000): Ethylene promotes ethylene biosynthesis during pea seed germination by positive feedback regulation of 1-aminocyclo-propane-1-carboxylic acid oxidase. Planta 211: 144-149 Petruzzelli L., Kunz C., Waldvogel R., Meins F., Leubner-Metzger G. (1999): Distinct ethylene- and tissue-specific regulation of β-1,3-glucanases and chitinases during pea seed germination. Planta 209 (2): 195-201 Pillay I., Railton I. D. (1983): Complete release of axillary buds from apical dominance in intact, lightgrown seedlings of Pisum sativum L. following a single application of cytokinin. Plant Physiol. 71: 972974 Pitts R. J., Cernac A., Estelle M. (1998): Auxin and ethylene promote root hair elongation in Arabidopsis. Plant J. 16 (5): 553–560

95

Prasad T. K., Cline M. G. (1987): The role of gravity in apical dominance. effects of clinostating on shoot inversion-induced ethylene production, shoot elongation, and lateral bud growth. Plant Physiol. 83: 505509 Prévost I., le Page-Degivry M. Th. (1985): Inverse correlation between ABA content and germinality throughout the maturation and the in vitro culture of embryo of Phaseolus vulgaris. J. Exp. Bot. 36 (170): 1457-1464 Pritchard S. G., Rogers H. H., Prior S. A., Petershon C. M. (1999): Elevated CO2 and plant structure: a review. Global Change Biol. 5: 807-837 Procházka S., Borkovec V. (1981): Stimulation of 14C-ABA transport by IAA and sucrose in pea epicotyls. Biochem. Physiol. Pflanzen 176: 852-858 Procházka S., Borkovec V. (1984): Influence of auxin-like substances upon the transport of 14C-ABA in long pea epicotyl segments. 3. transport and regulative properties of phenylacetic acid. Biol. Plant. 26: 358-363 Procházka S., Jacobs W. P. (1984): Role of growth regulators in relation to correlation between cotyledon and its axillar bud in pea seedlings. Plant Physiol. 76: 224-227. Procházka S., Truksa M. (1999): Phytohormones and shoot apical dominance. Advances in regulation of plant growth and development. Peres Publ. Praha: 221-231 Quarrie S. A., Whitford P. N., Appleford N. E. J., Wang T. L., Cook S. K., Henson I. E., Loveys B. R. (1988): A monoclonal-antibody to (S)-abscisic acid: its characterization and use in a radioimmunoassay for measuring abscisic acid in crude extracts of cereal and lupin leaves. Planta 173: 330–339 Rahayu Y. S., Walch-Liu P., Neumann G., Römheld V., von Wirén N., Bangerth F. (2005): Water deficit and abscisic acid cause differential inhibition of shoot versus root growth in soybean seedlings. J. Exp. Bot. 56 (414): 1143-1152 Rahman M. M. (1977): Studies on growth correlations of pea seedlings (Pisum sativum) in relation to some growth regulators. Kandidátská disertační práce. VŠZ Brno, 174 s. Ravanel S., Gakière B., Job D., Douce R. (1998): The specific features of methionine biosynthesis and metabolism in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 7805-7812 Reymond P., Weber H., Damond M., Farmer E. E. (2000): Differential gene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis. Plant Cell 12: 707-719 Ridge I., Osborne D. J. (2006): Wall extensibility, wall pH and tissue osmolality: significance for auxin and ethylene-enhanced petiole growth in semi-aquatic plants. Plant Cell Environ. 12: 383-393 Riley C. A., Cohen G. (1974): Ethane evolution: a new index of lipid peroxidation. Science 183: 208-212 Riov J., Yang S. F. (1982): Autoinhibition of ethylene production in citrus peel discs. Suppression of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthesis. Plant Physiol. 69: 687-690 Rohdich F., Hecht S., Gärtner K., Adam P., Krieger C., Amslinger S., Arigoni D., Bacher A., Eisenreich W. (2002): Studies on the nonmevalonate terpene biosynthetic pathway: Metabolic role of IspH (LytB) protein. Proc. Nat. Acad. Sci. 99 (3): 1158-1163 Rohmer M. (1999): The discovery of a mevalonate-independent pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria, algae and higher plants. Nat. Prod. Rep. 16: 565-574 Romanov G. A., Lomin S. N., Schmülling T. (2006): Biochemical characteristics and ligand-binding properties of Arabidopsis cytokinin receptor AHK3 compared to CRE1/AHK4 as revealed by a direct binding assay. J. Exp. Bot. 57 (15): 4051-4058 Růžička K., Ljung K., Vanneste S., Podhorská R., Beeckman T., Frim J., Benková E. (2007): Ethylene regulates root growth through effects on auxin biosynthesis and transport-dependent auxin distribution. Plant Cell 19: 2197-2212 Sáenz L., Jones L. H., Oropeza C., Vláil D., Strnad M. (2003): Endogenous isoprenoid and aromatic cytokinins in different plant parts of Cocos nucifera (L.). Plant Growth Regul. 39 (3): 205-215 Sakakibara H. (2006): Cytokinins: Activity, biosynthesis and translocation. Annu. rev. Plant Biol. 57: 431-449

96

Sarquis J. I., Morgan P. W., Jordan W. R. (1992): Metabolism of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid in etiolated maize seedlings grown under mechanical impedance. Plant Physiol. 98: 1342-1348 Sauter A., Hartung W. (2002): The contribution of internode and mesocotyl tissues to root-to-shoot signaling of abscisic acid. J. Exp. Bot. 53: 297-302 Seijo G., Ramos A. L. (1999): Freezing tolerance acquisition during seed development of Pisum sativum L. Rev. Bras. Fisiol. Veg. 11 (1): 1-5 Sharp R. E. (2002): Interaction with ethylene: changing views on the role of abscisic acid in root and soot growth responses to water stress. Plant Cell Environ. 25: 211-222 Shimizu-Sato S., Mori H. (2001): Control of outgrowth and dormancy in axillary buds. Plant. Physiol. 127: 1405-1413 Schlereth A, Becker C, Horstmann C Tiedemann J, Müntz K (2000): Comparison of globulin and cysteine proteinases in embryonic axes and cotyledons during germination and seedling growth of vetch (Vicia sativa L.). J. Exp. Bot. 51: 1423–1433 Schroeder J. I., Hagiwara S. (1990): Repetitive increases in cytosolic Ca2+ of guard cells by abscisic acid activation of nonselective Ca2+ permeable channels. Proc. Nat. Acad. Sci. 87 (23): 9305-9309 Schussler J. R., Brenner M. L., Brun W. A. (1984): Abscisic acid and its relationship to seed filling in soybeans. Plant Physiol. 76: 301-306 Slovik S., Daeter W., Harting W. (1995): Compartmental redistribution and Long-distance transport of abscisic acid (ABA) in plants as influenced by environmental changes in the rhisosphere - a biomathematical model. J. Exp. Bot. 46: 881-894 Smith D. L. (1971): Nuclear changes in the cotyledons Pisum arvense L. during germination. Ann. Bot. 35: 511-521 Smith D. L. (1983): Cotyledon anatomy in the Leguminosae. The Linnean Society 86: 325-355 Smith D. L., Flinn A. M. (1967): Histology and histochemistry of the cotyledons Pisum arvense L. during germination. Planta (Berl.) 74: 72-75 Snowden K. C., Napoli C. A. (2003): A quantitative study of lateral branching in petunia. Funct. Plant Biol. 30: 987–994 Solnická P. (2008): Vztah kyseliny abscisové a exprese zásobních proteinů v zygotické embryogenezi hrachu setého (Pisum sativum L.). Diplomová práce, MENDELU Brno, 82 s. Spíchal L., Rakova N. Y., Riefler1 M., Mizuno T., Romanov G. A., Strnad M., Schmülling T. (2004): Two cytokinin receptors of Arabidopsis thaliana, CRE1/AHK4 and AHK3, Differ in their ligand specificity in a bacterial assay. Plant Cell Physiol. 45 (9): 1299-1305 Stafstrom J. P., Ripley B. D., Devitt M. L., Drake B. (1998): Dormancy-associated gene expression in pea axillary buds: cloning and expression PsDRM1 a PsDRM2. Planta 205: 547-552 Strnad M. (1996): Enzyme immunoassays of N6-benzyladenine and N6-(meta-hydroxybenzyl)adenine cytokinins. J. Plant Growth Regul. 15: 179-188 Strnad M. (1997): The aromatic cytokinins. Physiol. Plant. 101: 674-688 Strnad M., Hanuš J., Vaněk T., Kamínek M., Ballantinee J. A., Fusselle B., Hanke D. E. (1997): Metatopolin, a highly active aromatic cytokinin from poplar leaves (Populus × canadensis Moench., cv. Robusta). Phytochemistry 45 (2): 213-218 Sun J., Niu Q.-W., Tarkowski P., Zheng B., Tarkowska D., Sandberg G., Chua N.-H., Zuo J. (2003): The Arabidopsis AtIPT8/PGA22 gene encodes an isopentenyl transferase that is involved in de novo cytokinin biosynthesis. Plant Physiol. 131: 167-176 Sung J. M., Chiu C. C. (1995): Lipid peroxidation and peroxide scatinging enzymes of naturally aged soybean seed. Plant Sci. 110: 45-52 Symons G. M., Ross J. J., Murfet I. C. (2002): The bushy pea mutant is IAA-deficient. Physiol. Plant. 116: 386-397 Šebánek J. (1963): O vztahu giberelinu a auxinu se zřetelem k využití giberelinu v rostlinné výrobě. Acta Univ. Agr. A 2:171-181

97

Šebánek J. (1971): Výklad vrcholové dominance v rostlině na podkladě studia korelace mezi dělohami a kotylárními pupeny hrachu. Acta Univ. Agr. A 4: 393-418. Šebánek J. (1972): The effect of exogenous gibberellin and auxin on the dominance between the axillary buds of pea (Pisum sativum). Acta Univ. Agr. A 3: 183-191. Šebánek J., Hradilík J. (1974): On the role of endogenous substances of the auxin group in the correlation between the cotyledon and its axillar bud in pea (Pisum sativum L.). Acta Univ. Agric., Brno, A, 22(3): 421-426. Šebánek J., Hradilík J. (1978): The Role of Endogenous Abscisic Acid in the Correlation Between the Cotyledon and Its Axillary Bud in Pea Pisum sativum L. Biol. Plant. 20 (4): 299-302 Šebánek J., Kutáček M., Tan Hoang Minh-Ahmad H. U. (1982): Changes in the content of endogenous IAA a cytokinins in cotyledons of etiolated pea seedlings during their ontogenesis. Biol. Plant. 24: 231234. Šebánek J., Vítková H., Klíčová Š., Psota V. (1988): The release of the cotyledonary shoot of Pisum sativum from inhibition in relation to changes in the levels of endogenous auxins, cytokinins, and gibberellins. Biol. Plant. 30 (5): 351-356 Šebánek J., Zelinka B. (1971): O roli kyseliny abscisové (ABA) v korelaci mezi dělohou a jejím úžlabním pupenem na dekapitovaných rostlinách hrachu. Rostlinná výroba 17 (5): 451-456 Takei K., Sakakibara H., Sugiyama T. (2001): Identification of genes encoding adenylate isopentyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 276: 2640526410 Takei K., Ueda N., Aoki K., Kuromori T., Hirayama T., Shinozaki K., Yamaya T., Sakakibara H. (2004): AtIPT3 is a key determinant of nitrate-dependent cytokinin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 45 (8): 1053-1062 Tan H. M. (1980): Příspěvek ke studiu celistvosti klíčních rostlin lnu (Linum usitatissimum) a hrachu (Pisum sativum) ve vztahu k růstovým regulátorům. Kandidátská disertační práce. Brno 180 s. Tan H. M., Šebánek J., Klíčová Š. (1979): The role of gibberellins and cytokinins in the growth correlative effect of cotyledons in flax and pea. Biol. Plant. 21 (5): 376-382 Tan H. M., Šebánek, J. (1980): Interakce růstových regulátorů v růstu děložních axilátorů na klíčních rostlinách hrachu (Pisum sativum L.). Rostl. výr. 26 (5): 533-539. Tanaka M., Takei K., Kojima M., Sakakibara H., Mori H. (2006): Auxin controls local cytokinin biosynthesis in the nodal stem in apical dominance. Plant J. 45: 1028-1036 Tao G. O., Letham D. S., Hocart C. H., Symmons R. E. (1991): Inhibitors of cytokinin metabolism. III The inhibition of cytokinin N-glucosylation in radish cotyledons. J. Plant Growth Regul. 10: 179-186 Tarun A. S., Theologis A. (1998): Complementation analysis of mutants of 1-aminocyclopropane-1carboxylate synthase reveals the enzyme is a dimer with sared active site. J. Biol. Chemistry 273 (20): 12509-12514 Taylor I. B., Burbidge A., Thompson A. J. (2000): Control of abscisic acid synthesis. J. Exp. Bot. 51: 1563-1574 Tegeder M., Offler C. E., Frommer W. B., Patrick J. W. (2000): Amino acid transporters are localized to transfer cells of developing pea seeds. Plant Physiol. 122: 319-325 Thompson R. D., Heros G., Becker H. A., Maiz M. (2001): Development and functions of seed transfer cells. Plant Sci. 160 (5): 775-783 Thu-Hang P., Bassie L., Safwat G., Trung-Nghia P., Christou P., Capell T. (2002): Expression of a heterologous S-adenosylmethionine decarboxylase cDNA in plants demonstrates that changes in SAMDC activity determine levels of the higher polyamines spermidine and spermine. Plant Physiol. 129: 17441754 Tiedemann J., Neubohn B., Müntz K. (2000): Different functions of vicilin and legumin are reflected in the histopattern of globulin mobilization during germination of vetch (Vicia sativa L.). Planta 211: 1-12

98

Toorop P. E., Bewley J. D., Abrams S. R., Hilhorst H. W. M. (1999): Structure-activity studies with ABA analogs no germination and endo-B-mananase activity in tomato and lettuce seeds. J. Plant Physiol. 154: 79-685 Tucker M. L., Sexton R., del Campillo E., Lewis L. N. (1988): Bean abscission celulase. characterization of a cDNA clone and regulation of gene expression by ethylene and auxin. Plant Physiology 88: 12571262 Tudela D., Primo-Millo E. (1992): 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid transported from roots to shoots promotes leaf abscission in Cleopatra mandarin (Citrus reshni Hort. ex Tan.) seedlings rehydrated after water stress. Plant Physiol. 100: 131-137 Turnbull C. G. N., Raymond M. A. A., Dodd I. C., Morris S. E. (1997): Rapid increases in cytokinin concentration in lateral buds of chickpea (Cicer arietanum L.) during release of apical dominance. Planta 202: 271-276 Van Doorn W. G. (2002): Effect of ethylene on flower abscission: a survey. Ann. Bot. 89: 689-693 Varner J. E., Balce L. V., Huang R. C. (1963): Senescence of cotyledons of germinating peas. Influence of axis tissue. Plant. Physiol. 38: 88-92 Veierskov B., Hansen J., Andersen A. S. (1975): Influence of cotyledon excision and sucrose on root formation in pea cuttings. Physiol. Plant. 36 (2): 105-109 Villalobos N., Martin L. (1992): Involvement of cytokinins in the germination of chickpea seeds. Plant Growth Regul. 11 (3): 277-291 Vogler H., Kuhlemeier C. (2003): Simple hormones but complex signaling. Curr. Opi. Plant Biol. 6: 5156 Vřešťálová - Nováková D. (1992): Příspěvek k poznání korelace mezi dělohou a jejím úžlabním pupenem u hrachu. Diplomová práce MZLU Brno, 70 s. Walker-Simmons M., Kudrna D. A., Warner R. L. (1989): Reduced accumulation of ABA during water stress in a molybdenum cofactor mutant of barley. Plant Physiol. 90: 728-733 Wang T. L., Cook S. K., Freancis R. J., Ambrose M., J., Hedley C. L. (1987): An analysis of seed development in Pisum sativum. J. Exp. Bot. 196 (38): 1921-1932 Wardini T., Talbot M. J., Offler C. E., Patrick J. W. (2007): Role of sugars in regulating transfer cell development in cotyledons of developing Vicia faba seeds. Protoplasma 230: 75-88 Webb A. A., Larman M. G., Montgomery L. T., Taylor J. E., Hetherington A. M. (2001): The role of calcium in ABA-induced gene expression and stomatal movements. Plant J. 26: 351-362 Werner T., Motyka V., Laucou V., Smets R., Van Onckelen H., Schmülling T. (2003): Cytokinin-deficient transgenic Arabidopsis plants show multiple developmental alterations indicating opposite functions of cytokinins in the regulation of shoot and root meristem activity. Plant Cell 15: 2532-2550 Wilkinson S., Davies W. J. (1997): Xylem sap pH increase a drought signal received at the apoplastic face of guard cell that involves the suppression of saturable abscisic acid uptake by epidermal symplast. Plant Physiol. 113: 559-573 Wilson B. F. (2000): Apical control of branch growth and angle in woody plants. Am. J. Bot. 87 (5): 601607 Wingler A., von Schaewen A., Leegood R. C., Lea P. J., Quick W. P. (1998): Regulation of leaf senescence by cytokinin, sugars, and light. Effects on NADH-dependent hydroxypyruvate reductase. Plant Physiol. 116: 329-335 Wise R. R., Naylor A. W. (1987): Chilling-enhanced photooxidation. The peroxidative destruction of lipids during chilling injury to photosynthesis and ultrasturucture. Plant Physiol. 83: 272-277 Wobus U., Weber H. (1999a): Seed maturation: genetic programs and control signals. Curr. opi. plant biol. 2: 33-38. Wobus U., Weber H. (1999b): Sugars as signal molecules in plant seed development. J. Biol. Chemistry 380: 937-944.

99

Wolf O., Jeschke D. J., Hartung W. (1990): Long distance transport of abscisic acid in NaCl-treated intact plants of Lupinus albus. J. Exp. Bot. 226 (41): 593-600 Woltering E. J. (1990): Interorgan translocation of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid and ethylene coordinates senescence in emasculated cymbidium flowers. Plant Physiol. 92: 837-845 Yang J., Zhang J., Wang Z., Zhu Q., Liu L. (2002): Abscisic acid and cytokinins in the root exudates and leaves and their relationship to senescence and remobilization of carbon reserves in rice subjected to water stress during grain filling. Planta 215 (4): 645-652 Yip W.-K., Yang S. F. (1988): Cyanide metabolism in relation to ethylene production in plant tissues. Plant Physiol. 88: 473-476 Yomo H., Varner J. E. (1973): Control of the Formation of amylases and proteases in the cotyledons of germinating peas.. Plant Physiol. 51: 708-713 Yu Y.-B., Adams D. O., Yang S. F. (1979): Regulation of auxin-induced ethylene production in mungo bean hypocotyls. Role of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid. Plant Physiol. 63: 589-590 Zaharia L. I., Walker-Simmon M. K., Rodríguez C. N., Abrams S. R. (2005): Chemistry of abscisic acid, abscisic acid catabolites and analogs. J. Plant Growth Regul. 24: 274–284 Zdunek-Zastocka E., Omarov R. T., Koshilba T., Lips H. S. (2004): Activity and protein level of AO isoforms in pea plants (Pisum sativum L.) during vegetative development and in response to stress conditions. J. Exp. Bot. 401 (55): 1361-1369 Zeevaart J. A. D., Boyer G. L. (1984): Accumulation and transport of abscisic acid and its metabolites in Ricinus and Xanthium. Plant Physiol. 74: 934-939 Zeevaart J. A. D., Creelman R. A. (1988): Metabolism and physiology of abscisic acid. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 39: 439-473 Zeroni M., Jerie P. H., Hall M. A. (1977): Studies on the movement and distribution of ethylene in Vicia faba L. Planta 134 (2): 119-125 Zhang J., Jia W., Yang J., Ismail A. M. (2006): Role of ABA in integrating plant responses to drought and salt stresses. Field Crops Res. 97: 111-119 Zhang M., Yuan B., Leng P. (2009): The role of ABA in triggering ethylene biosynthesis and ripening of tomato fruit. J. Exp. Bot. 60 (6): 1579-1588 Zhang X., Ervin E. H. (2004): Cytokinin-containing seaweed and humic acid extracts associated with creeping bentgrass leaf cytokinins and drought resistance. Crop Sci. 44: 1737-1745

100

Seznam zkratek 2,4-D ABA ACC ACO ACS Ade Ado AdoMet AK APPT CK CK-N-GT CKX CTR CYP735A DMAPP DNA EIN ELISA ERF GA GC HMBDP HPLC IAA IBA iP IP3 iPRDP iPRMP iPRTP IPT MACC MAP-kináza MAPKKK: MET MTA Nramp:

PIP2 RIA SAM tZ tZDP tZTP ZOGT

2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina kyselina abscisová kyselina 1-aminocyklopropan-1-karboxylová ACC-oxidáza ACC-syntetáza adenin adenosin S-adenosyl-L-metionin adenosin kináza adenin fosforibosyl transferáza cytokininy CK N-glukosyltransferáza cytokinin oxidáza/dehydrogenáza constitutive triple response cytochrom P450 monooxygenáza dimetylalyl difosfát deoxyribonukleová kyselina ethylene insensitive Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ethylene response factor gibereliny Gas Chromatography (plynová chromatografie) hydroxymetylbutylenyl difosfát vysokoúčinná kapalinová chromatografie kyselina indolyl-3-octová kyselina indolyl-3-máselná N6-(∆2-isopentenyl)adenin inozitol-1,4,5-trifosfát iP ribosid-5‘-difosfát iP ribosid-5‘-monofosfát iP ribosid-5‘-trifosfát adenosinfosfát-izopentenyl transferáza N-malonyl-ACC mitogen-activated protein kinase mitogen-activated protein kinase kinase kinase L-metionin 5‘-metyltioadenosin rodina přenašečů kovových iontů podobná Nramp (natural resistance-associated macrophage protein) fosfatidylinozitol-4,5-bisfosfát Radioimmunoassay S-adenosyl-L-metionin trans- zeatin, cZ: cis-zeatin tZ ribosid-5‘-difosfát tZ ribosid-5‘-trifosfát zeatin O-glukosyl transferáza

101

β-CAS βGlc

β-kyanoalanin syntáza β-glukosidáza

102

Anotace Cílem práce bylo studovat vliv různých faktorů na růst děložních pupenů klíčních rostlin hrachu. Byl sledován vliv odrůdy, vliv různých zásahů do dělohy a jejich souvislost s růstem děložních pupenů a se změnami v produkci etylénu, etanu a CO2 klíčními rostlinami a v obsahu cytokininů, kyseliny abscisové (ABA) a kyseliny 1aminocyklopropan-1-karboxylové (ACC) v děložních pupenech. Pro doplnění byly provedeny transplantační pokusy a pokusy zaměřené na růstovou aktivitu izolované dělohy. Také byly doplněny některé poznatky o morfologii dělohy. V pokusech byly použity čtyřdenní rostliny hrachu vypěstované na klíčidlech, ve tmě při teplotě 20°C±2°C. Po sedmi dnech od ošetření dělohy byl vyhodnocován růst kotylárů a po třech dnech byly odebírány vzorky děložních pupenů pro stanovení cytokininů (zeatinu, dihydrozeatinu, isopentenyladeninu, benzyladeninu, meta-topolinu a jejich ribosidů), ABA a ACC. Produkce etylénu, etanu a CO2 byla stanovena po 1, 2, 3, 4, 24, 48 a 72 hodinách po ošetření. Pro stanovení obsahu cytokininů byla použita metoda ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay). Stanovení obsahu ABA bylo provedeno metodou RIA (Radioimmunoassay) a pro stanovení produkce etylénu, etanu a CO2 a obsahu ACC byla použita metoda GC (Gas Chromatography). Z výsledků vyplývá, že odrůda má vliv na délku kořene a kotylárů i na frekvenci růstu kotylárů. Redukce dělohy výrazně ovlivnila růst kotylárů. Byla zjištěna silná pozitivní závislost mezi redukcí dělohy a frekvencí růstu kotylárů u dělohy redukované a silná negativní závislost mezi redukcí dělohy a růstem kotylárů u dělohy ponechané. Frekvenci prorůstání kotylárů ovlivnil také zářez vedený pod děložním řapíkem a transplantace epikotylu nebo dělohy. Na produkci CO2 neměly zásahy do dělohy velký vliv. Výrazněji byla ovlivněna produkce etylénu a etanu. Celkový obsah cytokininů byl nejvyšší v pupenech dekapitovaných rostlin s neporušenými dělohami. S redukcí dělohy se obsah cytokininů v děložních pupenech snižoval a to více v pupenu dělohy neredukované.

Obsah

ABA

v děložních

pupenech

dekapitovaných

rostlin

s

neporušenými dělohami byl poměrně nízký. Vlivem částečné redukce dělohy na polovinu docházelo ke zvýšení obsahu ABA v obou děložních pupenech a při úplném odstranění dělohy se obsah ABA zvýšil pouze v pupenu dělohy odstraněné. Růstová aktivita izolovaných děloh se ukázala být poměrně vysoká, rozhodující byl termín oddělení dělohy od osy rostliny.

103