Tudományos Diákköri Dolgozat
DRAVETZKY KATALIN
Komplex polimer monorétegek elıállítása és fehérjével való kölcsönhatásuk vizsgálata
Témavezetı: Dr. Kiss Éva ELTE Kémiai Intézet, Fizikai Kémiai Tanszék Határfelületi- és Nanoszerkezetek Laboratóriuma
Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2007
Tartalomjegyzék 1 Bevezetés............................................................................................................................. 3 2 Irodalmi áttekintés............................................................................................................... 4 2.1 Programozott hatóanyag leadású rendszerek ............................................................... 4 2.2 Polimerek hatása a diszperziók stabilitására ................................................................ 5 2.3 Biodegradábilis polimerek ........................................................................................... 6 2.4 Mikrokapszulázás......................................................................................................... 7 2.5 Gyógyszerhordozók ..................................................................................................... 8 2.6 Polimer nanorészecskék felületmódosítása .................................................................. 8 2.7 Langmuir - filmek ........................................................................................................ 9 2.7.1 Általános jellemzés ............................................................................................... 9 2.7.2 Polimerek Langmuir - filmjei.............................................................................. 11 2.8 Fehérjeadszorpció....................................................................................................... 12 2.8.1 Fehérjék fluid határfelületi adszorpciója............................................................. 13 2.9 Határfelületi rétegek morfológiai vizsgálatának módszere ........................................ 13 3 Célkitőzés .......................................................................................................................... 15 4 Kísérleti rész...................................................................................................................... 16 4.1 Felhasznált anyagok: .................................................................................................. 16 4.2 Kísérleti eszközök ...................................................................................................... 16 4.3 Mérési módszerek ...................................................................................................... 17 4.3.1 Izotermák felvétele .............................................................................................. 17 4.3.2 Penetráció ............................................................................................................ 18 4.3.3 Langmuir - Blodgett filmhúzás ........................................................................... 18 4.3.4 AFM vizsgálat ..................................................................................................... 19 5 Eredmények és értelmezésük ............................................................................................ 20 5.1 A tiszta polimerek és keverékeik monorétegeinek izotermái..................................... 20 5.2 Intermolekuláris kölcsönhatások a keverékfilmekben ............................................... 24 5.3 A Pluronicadalékok hatása a PLA fehérjeadszorpciójára ........................................ 27 5.4 Felületi borítottság...................................................................................................... 30 5.5 A határfelületi rétegek morfológiája .......................................................................... 33 5.5.1 Általános jellemzés ............................................................................................. 33 5.5.2 Érdességvizsgálat ................................................................................................ 35 6 Összefoglalás..................................................................................................................... 39 7 Irodalomjegyzék................................................................................................................ 40
2
1 Bevezetés Bár az egészséges életmód hirdetése ma már megszokott dolog és önálló iparágakat hozott létre, mégis az urbanizáció és a mozgásszegény életmód maga után vonja a megbetegedések számának növekedését. A szervi panaszok kezelésének hagyományos gyakran egyetlen módja a gyógyszeres terápia alkalmazása. A gyógyszerek hatóanyagai azonban csak akkor tudják hatásukat kifejteni, ha a szervezetben, a szükséges mennyiségben, kellı ideig a megfelelı helyen találhatóak. A gyógyszerek jelentıs része enyhébb vagy súlyosabb mellékhatásokat is okozhat, ezért használatuk során elkerülhetetlen a korrekt diagnózis felállítása, majd a megfelelı hatóanyagú gyógyszer kiválasztása és annak helyes dózisban történı alkalmazása. Ez utóbbit megfelelı gyógyszerbevitellel lehet biztosítani, amit a páciensnek be kell tartania. A kiszerelési forma (pl. tabletta, injekció, tapasz, implantátum) is befolyásolja a hatékonyságot, ezért is irányulnak a gyógyszerkutatások az utóbbi évtizedekben az új hatóanyagok kifejlesztése mellett a hagyományos hatóanyagok új formában való elıállítása és a biológiailag összeférhetı (biokompatibilis), valamint lebomló (biodegradábilis) polimertartalmú, gyógyszervivı anyagok kifejlesztése felé. A gyógyszerhordozó szer alkalmazásának feltétele, hogy nem lehet toxikus, nem roncsolhatja a szöveteket, melyekkel érintkezik, és nem léphet reakcióba a környezı testnedvekkel. Biológiai összeférhetıség, biokompatibilitás alatt a biológia rendszerbe helyezett technikai rendszer zavartalan mőködését értjük, és az összeférhetıségnek ki kell terjednie a technikai rendszer szerkezetére és felületére is. Vagyis mindezen tulajdonságok befolyásolhatják, hogy a biológiai alkalmazásban megfelelı befogadási reakciót vált - e ki az adott szer vagy sem. A polimerek gyógyszerhordozóként való alkalmazásuk során befolyásolják, vagy megváltoztatják a hatóanyag felszívódást. Ez igaz a biológiailag aktív polimerek, polimer gyógyszer konjugátumok, polimer micellák, nanogömböcskék és polimer bevonatú liposzómák esetén is. Filmként, vagy nanogömböcskeként való alkalmazásuk során problémát jelent, hogy hidrofób felületi tulajdonságaik miatt ezek a polimerek nem biokompatibilisek, vagyis a szervezet védekezı mechanizmusát beindítva nemkívánatos reakciókat (kilökıdés, korlátozott hatóanyag felszabadulás) hoznak létre. Ha megváltoztatjuk a polimer gyógyszerhordozók hidrofób felületének tulajdonságait, vissza tudjuk szorítani a szervezet nemkívánatos reakciót, miáltal megvalósítható a szabályozott gyógyszerleadás. Jelen dolgozatban a felületmódosítás egy olyan formáját mutatom be, melynek során biokompatibilis polimerbıl és blokkos kopolimerbıl, keverékképzéssel létrehozott Langmuir - filmmel modelleztem a gyógyszerhordózó felszínét és molekuláris szinten vizsgáltam felületi tulajdonságait. A munkám során összefüggést kerestem az összetett felületi réteg felépítése és a tulajdonságai (fehérjével való kölcsönhatása) között. Ez azért fontos, mert a hidrofilizált gyógyszerhordozó polimerek biokompatibilisa nı, visszaszorítják a legtöbb sejtes kölcsönhatást és használatuk során megvalósítható a programozott gyógyszerleadás. Ilyen módon a kezelés nem igényel nagy mennyiségő hatóanyagot, vagyis csökkenteni lehet a gyógyszer mellékhatásait, ezáltal a beteg számára biztonságosabb terápiát tudunk biztosítani.
3
2 Irodalmi áttekintés 2.1 Programozott hatóanyag leadású rendszerek (1.táblázat) Az 1. ábra a terápiás szer egyszeri alkalommal bejuttatott adagjának véráramban eltöltött idejét mutatja. Az ábráról jól leolvasható, hogy a gyógyszer hatóanyag koncentrációja hirtelen megnı, majd exponenciálisan lecsökken, ahogy a szer kiürül, vagy lebomlik. A toxikussági (halálos adag) és minimálisan hatásos (effektív dózis) szint közti különbséget nevezzük terápiás indexnek.
1.ábra Gyógyszerhatóanyagok abszorpciójának idıfüggése [1] ( biztonságos dózis, - - - - nem biztonságos dózis, - . - . - . - kontrollált leadás) Megjegyzés: A halálos adag (LD50) a lethalis dosis (=halálos adag) kifejezésbıl származik. Értelmezése: a kísérleti állatok egységnyi testtömegére vonatkozó azon anyagmennyiség, amely egyszeri adagolás mellett az állatok 50% -nak elhullását okozza. Mértékegysége: [mg/kg]. Az értékek viszonylagosak, csak az anyagok egymás közötti összehasonlítására alkalmas. Az effektív dózis (ED50) hasonlóan oldható fel: az az anyagmennyiség, amelynél 50% -ban létrejön a kívánt hatás. A hosszas toxikus hatást elkerülhetjük a programozott gyógyszerleadással, mely hosszan fenntartja a vérplazmában a szükséges hatóanyag szintet anélkül, hogy elérnénk a toxikussági határt. A programozott gyógyszerleadás megvalósítható különbözı burkoló/ fedırétegek alkalmazásával, melyek vastagságával befolyásolhatjuk a felszívódás idejét és meghosszabbíthatjuk a terápiás szer véráramban töltött idejét [2].
4
Programozott hatóanyag leadású rendszerek osztályozása Rendszer típusa
Hatóanyag leadás mechanizmusa
Diffúzió kontrollált tároló egység tömb egység
diffúzió membránon keresztül diffúzió a tömb polimeren keresztül
Víz behatolás által szabályozott ozmotikus rendszer
víz ozmotikus transzportja a szemipermeábilis hártyán keresztül víz behatolás a szilárd polimerbe
duzzadó rendszer Kémiailag kontrollált tömb rendszer
egyszerő polimer lebomlás (felületi lebomlás) vagy lebomlás és diffúzió az oldalcsoport hidrolízise és diffúziója a tömb polimerbıl
oldal láncok rendszere
Szabályozó rendszerek mágneses vagy ultrahangos
külsı mágneses tér vagy ultrahang alkalmazása versengı deszorpció vagy enzim szubsztrát reakció. Az eszközbe épített sebesség szabályozás
kémiai
1. táblázat Programozott hatóanyag leadású rendszerek [2] A gyógyszerek szervezetbe juttatása és hatásuk kifejtése során a kutatások egyre inkább a kolloidális rendszerek alkalmazása felé fordul, mert alkalmazásuk elınyös a programozott gyógyszerleadás szempontjából. Diszperzió formájú gyógyszer lehet például szuszpenzió, emulzió vagy szolubilizátum. A makromolekulát tartalmazó gyógyszerkészítmények pl. a kapszulák. 2.2 Polimerek hatása a diszperziók stabilitására Diszperz rendszerek tulajdonságait, stabilitását erısen befolyásolják az adszorpciós réteget viselı diszpergált részecskék közti kölcsönhatások [3]. Kitüntetett szerepe van a részecske - közeg kölcsönhatás eredményeképpen a határfelületen kialakuló adszorpciós réteg szerkezetének, amit a diszperzióközeg összetételén kívül döntıen a részecskék felületi sajátosságai határoznak meg. A diszpergált részecskék felületén adszorbeálódó természetes vagy szintetikus eredető makromolekulák jelentısen megváltoztatják a részecske/közeg határfelület tulajdonságait és ezáltal a diszperzió stabilitását is. Kis koncentrációkban, ahol a részecskék kis hányadát borítják be az adszorbeálódott makromolekulák és szabad (borítatlan) részecskefelületek is vannak, a polimerek csökkentik az állandóságot, vagyis érzékenyítı, flokkuláltató hatást fejtenek ki a diszperzióra. Nagyobb mennyiségben adszorbeálódott polimer mennyiségek pedig általában növelik a diszperziók stabilitását.
5
A stabilizálást sztérikusan stabilizáló polimerek felületre való rögzítésével, ojtással – grafting - is növelhetjük. Ez a gyakorlatban kétféle módszerrel valósul meg: kémiai reakcióval, melynek során makromolekula a felület reaktív csoportjával reagál. A láncvégen kapcsolt polimerek - és így a felületi polimer réteg - konformációja függ az ojtás sőrőségétıl. Ha a láncok ritkábban kötıdnek és a szomszédos láncok között nagyobb a távolság, mint az eredeti gombolyag méret, akkor mushroom („gomba”) állapotról beszélhetünk. Ha azonban a szomszédos láncok között nagy az átfedés, akkor azt brush („kefe”) állapotnak hívjuk [4]. A stabilizálás másik folyamata szerint blokkos kopolimerek fiziszorpciójával stabilizálják a diszperziót. A blokkos kopolimerek nem oldható része erısen adszorbeálódik, ezáltal rögzíti az oldékony, nem adszorbeálódó, oldatba nyúló blokkot, mely által biztosítja a stabilitást. 2.3 Biodegradábilis polimerek A biodegradábilis polimereket – melyek általában poliészterek (2. táblázat) - a gyógyászatban elsısorban a sebészek használják (pl. sebészeti varrófonalak) vagy a gyógyszerészetben, mint hordozóanyagok szerepelnek a szabályozott gyógyszerleadású rendszerekben. Az elsı gyógyászatban alkalmazott biodegradábilis polimer a poli(glikolsav) (PGA) volt, melybıl felszívódó sebészfonalat (Dexon) készítettek. Rövidítés
Polimer
Képlet O
Poli(glikolsav)
PGA
Poli(tejsav)
PLA
O
H
C H2
n
OH
O O H C
H
n
OH
CH 3
Poli(ε kaprolakton)
O
PCL
O
H
C H2
n OH
m
m=5 H O C C H3C H2
H
Poli(β hidroxibutirát)
PHB H
Poli(p - dioxanon)
POS
H
n
O H2 O O C C C H2 H2
O
Polianhidrid
O
O
n
OH
O C H2
m
2. táblázat Biológiailag lebomló alifás poliészterek 6
OH
n
OH
Lebomlásuk esetén követelmény, hogy illeszkedjenek a szervezet metabolizmusába, valamint, hogy természetes úton kiválasztódhassanak, molekulatömegük nem lehet nagyobb 40 - 50 ezernél. A tejsav és glikolsav poli - észtereit homo és kopolimerként (PLA, PLGA) már a 60 as évektıl alkalmazzák a gyógyszerészetben (3.táblázat), többek között, mint szabályozott gyógyszerleadású rendszerek hordozóanyagait, injektálható formában, mint üreges mikrogömböket. A tejsav és glikolsav poli - észterek alifás poliészterek, és a poli(α hidroxisavak) csoportjába tartoznak. A laktid és glikolid részek variálásával különbözı fizikai, mechanikai tulajdonságú kopolimerek állíthatók elı. Polimer
Hatóanyag
Hordozó alakja
Terápiás felhasználás
poli(L - tejsav) levonorgesztrol film fogamzásgátló poli(D,L - tejsav) progeszteron mikrokapszula fogamzásgátló poli(D,L - tejsav) retinoilsav mikrokapszula májvédı poli(D,L - tejsav) ciklofoszfamid mikrokapszula antidiabetikum poli(D,L - tejsavglikolsav) goserelinum rudacska antineoplasztikum poli(D,L - tejsavglikolsav) 2,4 - diamin - 6 finom részecskék antimalarikum (2 - naftil - szulfonil) - (porlasztásos szárítás) kinozolin 3. táblázat PLA és PLGA polimerekbıl készült gyógyszerhordozók [5,6] Gyógyszerhordozó polimerekkel szemben az alábbi követelményeket támaszthatjuk: 1. Implantáláskor csak minimális szöveti reakciót válthatnak ki. 2. A szervezetben jól meghatározott ütemben, nem toxikus bomlástermékké kell alakulniuk. 3. Az érintett polimereknek toxikus szennyezıdésektıl menteseknek kell lenniük. 2.4 Mikrokapszulázás A biodegradábilis polimerekbıl képzett, injektálható mikrokapszulák elıállítására az oldószer elpárologtatásán alapuló módszert alkalmazzák. A folyamat elsı lépése a biodegradábilis polimer oldása, hogy a hatóanyag kapszulázható legyen egy illékony, de vízzel nem elegyíthetı oldószerben. A keletkezı oldatot, mely a hatóanyagot is tartalmazza, emulgeátor - tartalmú vizes fázisban emulgeálják. Ezután az oldószert állandó keverés mellett vákuumban elpárologtatják, és az így keletkezı szilárd kapszulákat izolálják. Az elsıdlegesen használt oldószer a diklór - metán, emulgeátorként poli(vinil - alkohol)t, nátrium - dodecil szulfátot illetve nátrium - oleátot alkalmaznak. Ez a folyamat akkor lesz a leghatékonyabb, ha a hatóanyag elsısorban a vízzel nem elegyedı fázisban tartózkodik. Amennyiben a hatóanyag hidrofil jellegő (pl. egyes peptidek), akkor kettıs emulziós, (víz - olaj) - víz rendszert alkalmaznak. A hatóanyagot elıször egy vizes fázisban feloldják, majd a biodegradábilis polimert is tartalmazó szerves fázisban emulgeálják. Ezután ezt az emulziót egy újabb vizes fázisban emulgeálják, és állandó keverés mellett vákuumban a szerves oldószert elpárologtatják [7]. Ez a módszer poli(tejsav), poli(ε - kaprolakton), poli(β hidroxiburát) és tejsavban gazdag poli(tejsav - glikolsav) kopolimer kapszulák elıállítására kiválóan alkalmas.
7
2.5 Gyógyszerhordozók Az utóbbi években sok kutatás foglalkozott újszerő kolloidális gyógyszerhordozók kifejlesztésével. Feladatuk a hatóanyag szervezetbe juttatása, specifikus hatás elérése, a célba juttatás hatékonyságának növelése, valamint, hogy csökkentsék a mellékhatásokat a dózis csökkentése esetén. A gyógyszerhordozó nanorészecskék fontosabb jellemzıi a méret, a hatóanyagfelvevı kapacitás, és a hatóanyag leadás jellege. A gyógyszerhordozó polimerek (biológiailag aktív polimerek, polimer - gyógyszer konjugátumok, polimer micellák nanorészecskék és polimer bevonatú liposzómák) befolyásolják, vagy megváltoztatják a hatóanyag felszívódást. A szilárd biodegradábilis polimer nanorészecskék nagyobb stabilitásuk és kontorollált hatóanyagleadásuk miatt elınyösebbek a liposzómák segítségével elıállított nanomérető gyógyszerhordozó rendszereknél. A gyógyszer elhelyezkedhet a polimer mátrixban eloszlatva, a nanorészecske magjába zárva, polimer membránnal körülvéve, a polimerhez kémiailag kötve, ill a részecske felületéhez adszorpcióval kötve. A gyógyszerhordozó kolloid rendszerek jellemzı képviselıi a polimer nano - illetve mikrogömböcskék. A belsejükbe zárt hatóanyag diffúzió útján vagy a polimer folyamatos lebomlása, biodegradációja során kerül a szervezetbe, megfelelı polimer alkalmazásával ún. programozott gyógyszerleadás valósítható meg. A nanorészecskék elınye a mikrorészecskékkel szemben, hogy alkalmasabbak az intravénás gyógyszerbevitelre. Mivel a hajszálerek átmérıje 5 - 6 mikron nagyságú, így a vérben szétoszlatott részecskéknek ettıl kisebb méretőnek kell lenniük és nem aggregálódhatnak, mert az embóliát okozna. A megfelelıen kialakított nanorészecskék alkalmasak tehát hidrofil, hidrofób hatóanyagok, fehérjék, vakcinák, biológiai molekulák intravénás szállítására [8]. Tiszta polimerek (poli(tejsav) PLA, poli(glikolsav) PLGA) gyógyszerhordozóként való alkalmazását azonban korlátozza, hogy a szervezetben nem teljes mértékő a felszívódásuk, illetve, hogy beindíthatnak olyan sejtes kölcsönhatásokat, melyek a hordozó kilökıdéséhez vezethetnek. In vivo kísérletekben azt tapasztalták, hogy a hidrofób felülető részecskék kiürülése gyorsabb [9 - 15]. 2.6 Polimer nanorészecskék felületmódosítása A kutatások során a biológiai rendszerekkel kölcsönható felületet módosították, hogy visszaszorítsák a nemkívánatos sejtes kölcsönhatásokat. A felületmódosítás során annak hidrofilitás és biokompatibilitás növelésében fontos szerepet kapott a poli(etilén - oxid) (PEO) felületmódosító polimer, mely nem ionos jellegő, és molekulái vizes közegben erısen hidratáltak, valamint flexibilisek. Ezen tulajdonságainak köszönhetıen a biológiai környezetben visszaszorítja a fehérjeadszorpciót és a legtöbb sejtes kölcsönhatást; és alkalmazásával megnövelhetı a gyógyszerhordozó véráramban töltött ideje. [9,16 - 19]. A PEO alkalmazását gyógyszerhordozó kolloidokban indokolja továbbá, hogy a mikrokapszulázás során gátolja a peptidek denaturációját vagyis a biológiai aktivitás elveszítését; valamint, hogy alkalmazásával szabályozhatóvá válik a gyógyszerhordozó polimer degradációja, a hatóanyag felszabadulás sebessége is [20]. A PEO - t nemionos, vízoldható blokkos kopolimerjei formájában alkalmazzák, melyek hidrofób magból (mely rögzül a felszínen) és hidrofil láncokból állnak és makromolekulás felületaktív tulajdonságaik alkalmassá teszik felhasználásukat a gyógyszerek transzportjának szabályozásában [20 - 25]. Ezek a blokk kopolimerek poli(propilén - oxid) - ból és poli(etilén - oxid) - ból, /PEO - PPO PEO/ állnak, kereskedelmi nevük Pluronic(2. a - b ábra) (BASF).
8
2. a - b ábra Pluronic általános képlete (a) és vázlatos ábrája (b)
Gyógyszerhordozó rendszerben a felületmódosítás során a molekulát hidrofób PPO része rögzíti a polimer hordozóhoz, míg a hidrofil PEO - láncok a diszperziós közegbe nyúlnak és hidrofil jellegővé változtatják a felületet [26]. A Pluronic -kok gyógyszerhordozókban felületmódosító szerként való alkalmazását indokolja, hogy kopolimerként kevéssé toxikusak, mint ahogy a 4. táblázatban látható.
Pluronic®
Polimer 6400 6800 10500 12700
Toxicitás (g/testtömeg kg) Intravénás (egér) Orális Dermális 0,35 >5 >15 >20 3 2,25 >15 >2
Irritáció szemen bırön 21,3 0,7 13 0,6
4. táblázat Pluronic - ok toxicitási adatai [20] 2.7 Langmuir - filmek 2.7.1 Általános jellemzés Folyadékfelületen kétféle módon alakulhat ki monomolekulás réteg. Vagy adszorpcióval, melynek során a tömbfázisban oldott anyag molekulái kötıdnek meg a folyadék/gáz határfelületen; vagy terítéssel, melynek során amfipatikus anyagot a szubfázisban nem oldódó, illékony oldószerben oldunk, a folyadékfelületre cseppentjük, majd hagyjuk az oldószert elpárologni. Elpárolgás után egy unimolekulás réteg marad vissza, mely a folyadék felületi feszültségét csökkenti és oldalnyomást fejt ki. Ezeket a folyadékfelszínen létrehozott oldhatatlan, unimolekulás filmeket nevezzük Langmuir - filmeknek, mivel Irving Langmuir (1881 - 1957) volt az elsı, aki ezen anyagok szerkezetének molekuláris szinten modern értelmezést adott. Szintén Langmuir mutatott rá elsıként arra, hogy a monorétegek a levegı - folyadék fázishatárról, további tanulmányozás céljából, szilárd hordozóra vihetık át. Katherine Burr Blodgett - tel (1898 - 1979) együtt megmutatta, hogy több monoréteget is fel lehet vinni ugyanarra a hordozóra, amelyen így tetszıleges vastagságú, többrétegő film alakítható ki [27,28]. Ezeket az egyenletes vastagságú, molekulárisán rendezett rétegeket hívjuk ma Langmuir Blodgett - filmeknek. Az oldalnyomás közvetlen mérésére Agnes Pockels (1862 - 1935) szerkesztett elıször berendezést, az ı terveit használta fel és fejlesztette tovább Langmuir. A mai mőszer egy lapos, hidrofilizált felülető, színültig folyadékkal töltött kádból áll, melyen mozgatható gáttal jól meghatározott felületet tudunk elkülöníteni. Pockels kezdetleges kísérletei során ónkádat használt, melyben különbözı szerves anyagok által a vízfelületen képzett filmeket vizsgált.
9
A felszíni hártyákat úgy hozta létre, hogy a vízben oldhatatlan vagy kevéssé oldható anyag ismert mennyiségét szerves, illékony oldószerben feloldotta, majd jól meghatározott mennyiséget vitt fel a vízfelszínre. Amikor az oldószer elpárolgott, egy vékony hártya maradt vissza. Pockels fedezte fel, hogy, ha a hártyára merıleges, szilárd akadályt mozgat, a hártyát el tudja tolni és ezáltal szabad vízfelület jön létre. Így a hártyát meghatározott, tetszés szerint választható nagyságú területre lehetett összenyomni és lehetett mérni felületi feszültség változást [29]. A mozgó gát módszerénél az oldalnyomást közvetlenül, vagy Wilhelmy - lemezzel mért felületi feszültségbıl határozzuk meg. A filmek oldalnyomása (π) a szubfázis (γ0) és a film jelenléte miatt lecsökkent felületi feszültség (γ) különbségébıl adódik, vagyis: π=γ0−γ Fontos megjegyezni, hogy az oldalnyomás függ a felületi koncentrációtól és a hımérséklettıl is. Ha ismerjük a felületre juttatott molekulák számát, úgy feltüntethetjük a molekulák által elfoglalt terület függvényében az oldalnyomást, ezáltal az oldalnyomás (π) – területegység (A) izotermát kapjuk (3. ábra). Az izoterma alakja jellemzı a filmet alkotó molekulákra és ezek kölcsönhatására.
3. ábra Langmuir - monomolekulás réteg oldalnyomás (π) – terület (A) izotermájának általános alakja Az egyes izoterma szakaszokat a tömbfázisbeli halmazállapotok kétdimenziós analógjai segítségével értelmezhetjük. A terítı oldattal a szubfázisra juttatott amfipatikus molekulák, az oldószer elpárolgása után, kétdimenziós, gáz állapotú (G szakasz az izotermán) filmet alkotnak, ekkor a molekulák közötti távolság nagy. Ha a gát mozgatásával csökkentjük a film területét, csökken a molekulák közti távolság is, ezzel egyidejőleg nı az oldalnyomás. Az izotermán a gáz állapotból az expandált folyadék állapotba (LE) való átmenetkor plató – konstans oldalnyomással jellemezhetı szakasz – jelenik meg. A gáttal tovább csökkentve a film területét, újabb átmenet (C+LE) következik be, expandált folyadék állapotból szilárd vagy kondenzált folyadék állapotba (C) kerül a film. Expandált folyadék állapotban a molekulák illeszkedése kevésbé szoros, míg kondenzált folyadék állapotban a molekulák szoros illeszkedéső, rendezett filmet alkotnak. A monoréteget alkotó molekulák méretérıl, alakjáról és orientációjáról a felületi rétegben, az izoterma segítségével kvantitatív információ nyerhetı.
10
Az izotermán a szilárd (kondenzált folyadék) állapotot meredek és általában lineáris szakasz jellemzi, melynek zéró oldalnyomásra való extrapolációja révén meghatározható a felületen egyetlen molekula által, kölcsönhatásmentes állapotban elfoglalt terület. A gát mozgatásával tovább komprimálva a réteget, irreverzibilis változás –kollapszus– következik be, amit az oldalnyomás hirtelen csökkenése jelez. A kollapszus nyomást (πc) meghaladva a film elveszti monomolekulás jellegét, a monoréteg összegyőrıdik, illetve összetörik. Bár a kollapszus nem egyenletesen következik be a film egész felületén, πc reprodukálható, és az adott filmre jellemzı értékek [30]. Ez a leírás és a jellegzetes izoterma szakaszok szemléletes értelmezése az amfipatikus kismolekulák filmjeire érvényes, polimerek esetén a helyzet kissé más. 2.7.2 Polimerek Langmuir - filmjei Nem sok olyan polimer létezik, amely monomolekuláris filmet képez víz/levegı felületen, egy részük azonban - meglepı módon még a vízoldhatók is - vízfelszínre terítve stabil monoréteget képeznek. Ezek a homo - illetve kopolimerek minden ismétlıdı egységükben amfifil jellegőek (pl.: PVAc, PDMS, PEO, PLGA, PLA) [31]. A nagyszámú monomer miatt az egy molekulára jutó moláris szabadentalpia elegendıen nagy lehet ahhoz, hogy a lineáris polimer olyan konformációt vegyen fel a felszínen, hogy a lánc a határfelületen helyezkedik el, és az esetleges oldalláncok a polaritásuknak megfelelıen az oldat belseje fele orientálódnak. Összenyomáskor az egyensúly a felületbıl kiszoruló szegmensek javára tolódik el. Ennek eredményeképpen a polimerek oldalnyomás – terület izotermái a kis oldalnyomású tartományban viszonylag nagy kompresszibilitást mutatnak. Közepes oldalnyomásnál a polimer láncok tömör illeszkedéső réteget alkotnak, csekély kompresszibilitást mutatva. Nagyobb oldalnyomásnál újra nı a kompresszibilitás, mert újabb szegmensek szorulnak ki a határfelületbıl [32]. Izotermáik alakja alapján a polimerek filmjei két csoportba sorolhatók. Az expandált típusú monorétegekben a molekulák kis és közepes oldalnyomáshoz tartozó helyigénye nagyobb, mint a kondenzált - típusúakban, de nagy oldalnyomáson a helyigény már közel azonos [33]. Másik fontos eltérés a két típus között a kompressziós – expanziós görbén mutatkozik, ugyanis míg a kondenzálttípusúak görbéjén egyáltalán nem, vagy csupán csekély hiszterézis tapasztalható, addig az expandált - típusúakén nagymértékő a hiszterézis. Egyazon polimer alkothat expandált - és kondenzált - típusú filmet is, a terítı oldószertıl függıen. Jó oldószerekben a polimerláncok kigombolyodnak, és a belılük terített monorétegekben a molekulák „elfekszenek” a felületen, azonban a Θ - oldószerekbıl terített polimerfilmekben a molekulák felgombolyodott állapotban maradnak, így kevesebb szegmenssel kötıdnek a felülethez [34]. A PLA molekulákból terített film izotermája is a polimer Langmuir - filmek általános viselkedésének felel meg, azzal a sajátossággal, hogy az expandált folyadék és kondenzált folyadék állapotok között egy fázisátmenetnek megfelelı plató jelenik meg [35,36]. Az izoterma különbözı szakaszai a polimer lánc különbözı konformációi, illetve konformációs átmenetei segítségével jellemezhetık. Az ojtott polimerekre alkalmazott elmélet a palacsinta (pancake) (4. ábra),
4. ábra Háromblokkos kopolimerek felületi rétegeinek palacsinta elrendezıdése
11
a kvázi - kefe (quasi - brush) vagy gomba (mushroom) (5. ábra)
5. ábra Háromblokkos kopolimerek felületi rétegeinek gomba elrendezıdése és a kefe (brush) (6. ábra)
6. ábra Háromblokkos kopolimerek felületi rétegeinek kefe elrendezıdése konformációs állapotokat különbözteti meg [37]. Kis oldalnyomású tartományban a polimerláncok teljes hosszukban a határfelületi rétegben helyezkednek el, palacsinta - szerő, lapos konformációt véve fel. Az oldalnyomás növekedésével egyre több hidrofil szegmens szorul ki a felületi rétegbıl és hatol a vizes szubfázisba, míg a szorosan illeszkedı PEO - láncok kefére emlékeztetı alakzatot nem alkotnak. Az SFG (sum frequency generation) spektroszkópiás mérések is azt mutatják, hogy jellemzıen a hidrofób blokk van jelen a víz - levegı felületen [38] valamint, hogy a középsı hidrofób blokk rendezett szerkezetet mutat a kompresszió növelésével, amely rendezıdést csak a relatíve hosszú PEO - láncok befolyásolják [39]. 2.8 Fehérjeadszorpció A biológiai környezettel való kölcsönhatásnak számos esetben a fehérjeadszorpció az elsı részfolyamata, mely befolyással van a további reakciókra [40]. Fehérjék felületen való megkötıdése a felelıs a véralvadás beindulásáért, és a védekezı falósejtek aktiválásáért is, ezért van kiemelt jelentısége a biokompatibilitási vizsgálatokban az illetı bioanyag fehérjeadszorpciós viselkedésének. Vagyis a biokompatibilitás elsıdleges (de nem elégséges) feltétele, hogy visszaszorítsuk az adszopciót, azaz olyan felület hozzunk létre, amely nem, vagy igen kevéssé hajlamos a fehérjeadszorpcióra. A kísérleti tapasztalatokból származik az az általános megfogalmazás, hogy a fehérjék adszorpciója a felületen gyakorlatilag irreverzibilis, deszorpció nem, csak leszorítás következik be. A mérhetı deszorpció aránya több nagyságrenddel kisebb, mint egyéb felületaktív anyagoké [41]. A fehérjék elektrosztatikus, hidrofób és H - hidas kötésekre egyaránt képesek szerkezetükbıl adódóan, adszorpciójuk során ezek a kölcsönhatások játszanak szerepet, így a biokompatibilitás során e kölcsönhatások szerepét kell csökkenteni. A fehérjeadszorpció visszaszorítása megnöveli a gyógyszerhordozó részecskék véráramban való tartózkodási idejét, és ezáltal van mód a gyógyszerhordozók által lehetıvé tett, programozott, fokozatos, a kívántnak megfelelıen elhúzódó gyógyszerleadásra [13]. A Langmuir - technika a felületi adszorpció tanulmányozására egy sajátos lehetıséget kínál. A polimerek vagy ezek komplex rendszerébıl vízfelszínen felületi réteget hozunk létre. A víz/polimer határfelületen bekövetkezı felületi adszorpciót, olyan módon detektálhatjuk, hogy a fehérjének az oldatba juttatása után mérjük a film oldalnyomás változását az idıben.
12
2.8.1 Fehérjék fluid határfelületi adszorpciója Fluid határfelületen igen nagy jelentısége van a fehérjeadszorpciónak. A fehérjeadszorpció szabályozásán keresztül beavatkozhatunk a molekuláris felismerés folyamatába, ehhez azonban ismernünk kell a fehérje számos tulajdonságát. Fıképpen azokat, melyek az adszorpciót befolyásolják (aminosav - összetétel, a fehérje térszerkezete, mérete, alakja, töltése, oldhatósága), valamint a fehérjét körülvevı közeg tulajdonságait. A fehérjék általában nem teljes hosszukban, hanem néhány szegmensükkel kötıdnek a felülethez [43,3]. A megkötıdött szegmensek idıben cserélıdnek a felületen, változik a molekula konformációja. Elıfordul, hogy a fehérje a natív szerkezetét megırizve, felgombolyodott állapotban kötıdik a felülethez. Ez leginkább a merev, globuláris fehérjékre jellemzı. Ilyen esetben jóval több molekula megkötıdésére van lehetıség, mivel egy molekula nem foglal el nagy helyet, az adszorpciós réteg vastagsága viszont nagyobb. Az is elıfordulhat, – és flexibilis makromolekulák esetén ez a gyakoribb – hogy a molekula kitekeredett állapotban, több szegmensével kötıdik egyidejőleg a határfelülethez, korlátozva ezzel a többi molekula kötıdési lehetıségeit [40]. Közvetve a felületi feszültség mérésével (penetráció) követhetjük nyomon az adszorpciót, mivel a felületi feszültség csökkenése az adott felületre esı fehérjeszegmensek számának növekedésével van összefüggésben. Tehát, a felületi feszültség csökkenhet a fehérje adszorpciója miatt, illetve amiatt, hogy megváltozik a konformációja, és több szegmens kerül a határfelületbe egy molekulából [44,45]. 2.9 Határfelületi rétegek morfológiai vizsgálatának módszere AFM (atomic force microscopy - atomi erı mikroszkóp) (7. ábra) alkalmazásával vizsgálható a Langmuir - típusú filmek szerkezete, ha azokat elızetesen, Langmuir - Blodgett technikával szilárd hordozóra visszük.
7. ábra Az AFM készülék vázlatos rajza
13
Az atomi erı mikroszkóp érzékelıje egy ismert erıállandóval rendelkezı kis laprugóra (cantilever) rögzített apró, hegyes tő, mellyel a minta felületét végigpásztázzák. A tő és a minta között vonzó vagy taszító erı ébred a távolságtól függıen, amely a laprugó lehajlásával mérhetı. A tő mozgásának követésére a fénymutatós módszer a legelterjedtebb. Egy lézer dióda fényét a laprugó hátoldalára fókuszálják, és a visszavert fénynyalábot egy négy egyenlı részre osztott fényérzékelıbe vezetik. Az AFM 10 - 8, 10 - 11 N erıt is képes érzékelni, illetve az érzékelı elmozdulása akár 0,1 nm is lehet. A laprugó bármilyen alakváltozása megváltoztatja az érzékelı négy szegmensére érkezı jelet: a csavarodás a jobb - bal párok között okoz különbséget, a lehajlás pedig az alsó - felsı párok között. Kontakt üzemmódban a tő és a minta súrlódásából adódó rugótorzió mérhetı. Állandó erı üzemmódban a laprugó lehajlása a pásztázás során állandó, míg a minta és a tő egymáshoz képest Z irányban mozoghat. Lehajlás üzemmódban a minta és a tő egymáshoz képest Z irányban nem mozoghat, a laprugó lehajlását és jobbra - balra csavarodását, illetve az ebbıl származó fényjelek különbségét rögzítik az adott (x,y) képpontban. Ennek mértéke a minta felületének egyenetlenségével arányos, így a mérés során olyan háromdimenziós képhez jutunk, mely a mintánk felszíni, „domborzati térképének" felel meg. A laprugó teszi lehetıvé továbbá, hogy a minta pásztázása során ébredı laterális, a minta felületével párhuzamos erıt is feltérképezhetjük, mivel a laprugó torziója ezzel az erıvel arányos. A laterális erı két komponensbıl tevıdik össze: a nyomóerı következtében a minta ferde felületein ébredı laterális komponensbıl és a tő mozgásából adódó súrlódási erıbıl. Az elıre - hátra pásztázott ilyen un. „Lateral Force” képek összegén a domborzat meredekségét jellemzı laterális komponens megmarad, így a súrlódási komponens kioltódik, a képek különbségén éppen fordítva, a súrlódási komponens marad meg, és a domborzat kioltódik. A párhuzamos irányú erıvel mért területet, és így a felbontást véges határok között változtathatjuk. A függıleges irányú felbontás 10 - 10 - 10 - 11 m tartományba esik.
14
3 Célkitőzés A tanszéken a korábbi munkák során a PLA és glikolsavval alkotott kopolimerje (PLGA) hidrofobicitásának csökkentését vizsgálták, mely feltétele a gyógyszerhordozóként való alkalmazásnak. A PLA különbözı összetételő Pluronic - okkal készített keverékeibıl hoztak létre filmet szilárd hordozón, melyeket azután nedvesedési és felületanalitikai méréseknek vetettek alá [46]. Az eltérı felépítéső és különbözı koncentrációkban alkalmazott Pluronic - kokkal elérték a PLA felületi hidrofobicitásának csökkenését. Mivel ebben az esetben a felületi réteg összetételére csak átlagos értéket adó XPS módszerrel lehetett következtetni, a vizsgálatokat Langmuir - filmekre terjesztettük ki. Ekkor, a gyógyszerhordozó felületét modellezzük, vagyis egy vékony, hidrofilizáló anyag és biokompatibilis polimer keverékképzéssel készült filmjét hozzuk létre folyadékfelületen és vizsgáljuk felületi tulajdonságait. Ha a vékony folyadék - levegı határfelületen kialakított filmek felületi tulajdonságait Langmuir - mérleg alkalmazásával vizsgáljuk, közvetlen információt kapunk a film molekuláris szerkezetérıl és tulajdonságairól. Munkám során a célom különbözı Pluronicadalékokkal módosított PLA filmek létrehozása vízfelületen és azok fehérjeadszorpciójának vizsgálata. Választ keresek arra a kérdésre, hogy a víz/levegı felszínen terített PLA monoréteg tulajdonságait hogyan befolyásolja az adalékanyagként alkalmazott Pluronicés, hogy mennyire csökkenti annak hidrofób jellegét, mely a fehérjeadszorpcióért felel. Ez azért igen fontos, mert a gyógyászatban alkalmazott nanogömböcskék felületi biokompatibilitását növeli a fehérjeadszorpció visszaszorítása. A különbözı összetételő Pluronic - kok közül leginkább a Pluronic6800 rendszert fogom vizsgálni, mely nagyobb PEO tartalmú, így várhatóan hatásosabb, mint az eddig vizsgált Pluronic6400. A felvett oldalnyomás - terület izotermák elemzése és azoknak a tiszta polimerek izotermáival való összehasonlítása révén információt kaphatunk a kétkomponenső Langmuir réteg felületi viselkedésérıl. Az izotermákból kiszámítható a komponensek additivitási értékei, a Flory – Huggins - féle paraméterei [40], majd ezen értékek összehasonlíthatók, így információt kaphatunk a Pluronic -nak a PLA film szerkezeti jellemzıire gyakorolt hatásáról. A fehérjeadszorpció során Pluronic6800 (EO:PO:EO = 56:30:56) rendszer tulajdonságait vizsgálom és hasonlítom össze hosszabb PEO - láncot tartalmazó Pluronic kokkal. A fehérjepenetráció után létrehozott Langmuir - Blodgett filmek AFM vizsgálataiból következtethetünk a filmfelszínhez adszorbeálódó fehérje PLA - Pluronicfilmekre gyakorolt felületmódosító hatásáról.
15
4 Kísérleti rész 4.1 Felhasznált anyagok: Kísérleteim során poli(D,L - tejsav) - at, DL - PLA - t (Sigma - Aldrich, Germany), poli(etilénoxid) - poli(propilén - oxid) - poli(etilén - oxid), PEO - PPO - PEO blokkos kopolimereket, Pluronic - okat (BASF Hungaria Kft.), valamint marha szérum albumint, BSA - t (Sigma - Aldrich Kft.) használtam. A polimerek fontosabb adatat a 5. táblázatban tüntettem fel. Terítı oldószerként diklór - metánt (p.a., ACS, Merck Kft.) alkalmaztam, mely felület aktív szennyezéstıl mentes. A szubfázis kétszer desztillált víz volt, melynek elektromos vezetıképességét (<5 µS) és felületi feszültségét (> 72,0 mN/m 23ºC - on) a mérés elıtt ellenıriztem.
Pluronic
Anyag megnevezése és rövidítése: 6400 6800 10500 12700 Poli(D,L) D,L - tejsav PLA
EO/PO/EO arány
Mw (g/mol)
Tg/ °C
Tolv/°C
HLB*
13/30/13 56/30/56 37/56/37 97/63/97
2870 6710 6500 12200
-
16 52 35 56
15 29 15 22
-
106000
55
173 - 230
-
*BASF által közzétett HLB (hydrophile - lipophile balance) adatok.
5. táblázat A felhasznált polimerek legfontosabb tulajdonságai A fehérje fontosabb paraméterei [47]: Neve és rövidítése: Mw (g/mol): Izoelektromos pont (IEP): Töltés (1/molekula; pH = 7): Alak: Dimenziói (nm): Szerkezete: Diffúziós együttható (m2/s):
marha szérum albumin, BSA 69000 5,01 –18 szivar alakú 14 × 4 × 4 kevéssé merev 6 × 10–11
4.2 Kísérleti eszközök A mérések során két Wilhelmy - típusú felületi feszültségmérıvel felszerelt, számítógép vezérelt Langmuir - mérleget (8. ábra) használtam.
16
8. .ábra Langmuir - mérleg A két erımérı annak ellenırzésére szolgál, hogy a vízfelszínre jutatott polimer keverék valóban a felszín elkülönített részén marad - e. Ha 35 mN/m -nél nem alkalmazunk nagyobb oldalnyomást, akkor a keverékfilmek is megfelelı stabilitásúnak bizonyultak. A kísérleteket két, különbözı nagyságú kádban végeztem el. A kisebbet (továbbiakban kis kád) a fehérjeadszorpció vizsgálatához, a nagyobbat (továbbiakban nagy kád) pedig az izotermák felvételéhez alkalmaztam. A két kád tulajdonságait a 6. táblázat tünteti fel.
18 6 0,3 108
nagy kád 55 15 0,5 825
87,6
762
>70
>600
kis kád Hosszúság/ cm Szélesség/ cm Mélység/ cm Teljes terület/ cm2 Hasznos terület/ cm2 Őrmérték/ cm3
6. táblázat A mérésekhez használt kádak méretei 4.3 Mérési módszerek 4.3.1 Izotermák felvétele A PLA, a Pluronic - kok és a PLA - Pluronicrendszer oldalnyomás izotermáit a nagy kádban vettem fel. Oldószerként diklór - metánt alkalmazva készítettem el a tiszta polimerek 1 g/dm3 koncentrációjú mintaoldatait. A PLA - Pluronicrendszer oldatai a következı tömegarányokban készültek el: 100:1, 100:4, 100:10, 100:20, 100:60, a PLA koncentrációját végig 1 g/dm3 - nek tartva. A filmet terítéssel alakítottam ki, az oldatokat Hamilton - mikrofecskendıvel vittem fel cseppenként a vízfelszínre, majd 10 percet vártam az oldószer elpárolgásáig. A kezdetben 760 cm2 területő felületi réteget 60 cm2/min gátsebességgel kb. 100 cm2 - re nyomtam össze, majd a gát mozgási irányát megfordítva ugyanezzel a sebességgel hagytam a filmet kiterjedni.
17
4.3.2 Penetráció A fehérjeadszorpció vizsgálatát a takarékos fehérje felhasználás érdekében a kis kádban végeztem el. A kádat feltöltöttem 78 cm3 kétszer desztillált vízzel; a monoréteget terítéssel alakítottam ki, a 30 µl PLA - Pluronic rendszer oldatát Hamilton mikrofecskendıvel vittem fel cseppenként a víz felszínére, majd 10 percet vártam az oldószer elpárolgásáig. A monoréteget a gát segítségével a kívánt oldalnyomásig összenyomtam, majd 5 percet hagytam a film relaxációjára. Ezután egy üvegfecskendı és egy hosszú tő segítségével 2 cm3, 2 g/dm3 koncentrációjú BSA - oldatot juttattam a szubfázisba, és 30 percen keresztül mértem az oldalnyomás változást. Egy 5 – 10 perces indukciós periódust követıen a gát mögötti tiszta víz/levegı felületen a fehérje - adszorpció következtében az oldalnyomás hirtelen növekedni kezdett – hamar elérte az egyensúlyi oldalnyomást. Ez az indukciós jelenség egyrészt a fehérje diffúziójával, másrészt a felületi adszorpciót közvetlen megelızı konformáció - változással magyarázható. Az izotermák felvétele és a fehérjeadszorpció vizsgálata során az oldalnyomást a gát mindkét oldalán folyamatosan mértem egy - egy erımérıhöz kapcsolt Wilhelmy - lemezzel, mely 0,05 mN/m pontosságú mérést tett lehetıvé. A méréseket 22,5 ± 0,5 ºC hımérsékleten végeztem. Az izotermák és penetrációs adatok legalább 3 mérés eredményeinek átlaga alapján kerültek a dolgozatba. 4.3.3 Langmuir - Blodgett filmhúzás A fehérjepentráció után a fimeket szilárd hordozóra Langmuir - Blodgett technikával vittem fel. A módszer lényege jelen esetben, hogy a víz felületén kialakult komprimált, keverékfilmréteget szilárd hordozóra visszük, jelen esetben úgy, hogy a hidrofil lapot, a szubfázisban egyenletesen eloszlatott BSA oldatból, a filmen keresztül, arra merıleges emeljük ki.
9. ábra Langmuir - Blodgett technika A: expandált réteg B: komprimált réteg létrehozása C: filmhúzás Fontos, hogy az oldalnyomás értéket - a filmhúzás során állandó - értéken tartottam, mert ezáltal biztosítottam, hogy a filmet alkotó molekulák felületi koncentrációja, és így várhatóan az illeszkedése, rendezettsége az átvitel során nem változott meg. Hogy a film tartsa az oldalnyomását, a filmhúzás sebességéhez mérten csökkentettem a gáttal a film felszínét. A lapok 12 - 24 órát száradtak vákuumban, ezután került sor az AFM mérésekre.
18
4.3.4 AFM vizsgálat Az elızetesen elıállított Langmuir - Blodgett lapok felületi jellemzésére, száradás után, AFM (PSIA Inc. XE - 100) készülékkel (7. ábra) kontakt módban, levegın, készítettünk felvételeket. A mérés során a pásztázó Si3N4 tőre adott erı 22 nN volt, a pásztázó frekvencia 0,25 - 0,5 Hz. Egy - egy mintáról azonos pásztázási méretben 8 - 10 felvételt készítettünk. A képeket XEI programmal értékeltem.
19
5 Eredmények és értelmezésük Az eredményeket öt részben mutatom be és értelmezem: • a tiszta polimerek és keverékek filmjeinek tulajdonságai az izotermák alapján, • a kísérletileg meghatározott adatok egybevetése az ideális elegyedés esetére számolt adatokkal • elemzem a Pluronicadalékok hatását a PLA fehérjeadszorpciójára • felületi borítottság adatokból következtetést vonok le az adalékanyag konformációváltozásáról • elemzem az AFM képeket morfológiai szempontok és érdesség alapján. 5.1 A tiszta polimerek és keverékeik monorétegeinek izotermái A tiszta PLA illetve a tiszta Pluronic - kok izotermáit a 10. és 11. ábra mutatja. 35 30 25
π mN/m
20 15 10 5 0 0
5
10
15
20
25
30
2
A A /mon.unit
10. ábra Tiszta PLA oldalnyomás (π) - terület (A) izotermája
20
35
35 6400 6800 10500 12700
30
π (mN/m)
25
20
15
10
5
0 0
5
10
15
20
25
30
35
2
A (A /monomer egység)
11. ábra Tiszta Pluronic oldalnyomás (π) - terület (A) izotermái
35
35
30
30
25
25
20
20
π (mN/m)
π (mN/m)
A PLA izotermájának általános alakja a korábban mértekkel megegyezik [31,32]. A kompressziós görbe három szakaszra osztható, melyek az expandált folyadék és a kondenzált folyadék állapotoknak, illetve a köztük végbemenı – plató – elsırendő fázisátmenetnek felelnek meg.
15
15
10
10
5
5
0
0 0
5
10
15
20
25
30
35
0
5
10
15
20
25
30
35
2
2
A (A /monomer egység)
A (A /monomer egység)
12. a - b ábra Tiszta Pluronic 6400 (a) és tiszta Pluronic6800 (b) izoterma
A Pluronic6400 más típusú izoterma. Az oldalnyomás emelkedése egyenletesebb egy kevésbé karakteres fázisátmenettel, ami a polimer réteg expandáltabb jellegére utal. A 17,5 és 13,0 Å2/monomer egység közötti szakaszon egy rövid szemiplató figyelhetı meg. A nagy felületi koncentrációnál megjelenı meredek emelkedés kondenzált - szerő állapotot jelez. Bár a skálázási szabály csak hosszú láncú polimerekre vonatkozik [48], a terített Pluronic6400 monorétegének izotermája a fentebb leírt konformációs változásokat feltételezve, kvalitatíve tárgyalható.
21
Kis oldalnyomás mellett a film tipikus expandált folyadék állapotú a molekulák lapos, palacsinta -szerő konformációt vesznek fel. Ha a monoréteget összébb nyomjuk, egy pszeudoplatót látunk, mely konformáció - változást jelez, vélhetıen a PEO - láncok részleges behatolását a vízfázisba. Ennek az átmeneti szakasznak a kezdete 17,5 Å2/monomer egységnél van, ahol a palacsinta - szerő molekulák a határfelületi rétegben már átfednek. Mindez jó egyezést mutat egyetlen etilén - oxid monomer által elfoglalt terület nagyságával (16 - 20 Å2) [49]. A másik átmenet (gombából kefébe) 13,0 Å2/monomer egység helyigénynél kezdıdik. További komprimálás során egy fokozatosan emelkedı oldalnyomással jelzett köztes állapothoz érünk. Nagy felületi koncentrációjú – kondenzált folyadék – tartományban a PEO blokkok a nyomás hatására benyúlnak az alsó vizes fázisba, és sőrő kefe konformációt vesznek fel. Bár ezek a konformációs változások a Pluronic6800 esetében is végbemennek, izotermája mégis nagyon különbözik a Pluronic6400 -étıl. A Pluronic6800 izotermája két különbözı meredekségő, egyenletesen növekvı és egy átmeneti szakaszra osztható. A molekulák a kis oldalnyomású tartományban sem fekszenek el teljes hosszukban a felületi rétegben, mivel a hosszú PEO - blokkok egy része, nagyfokú hidrofilicitásuknak köszönhetıen, valószínőleg már eleve a vizes szubfázisba nyúlik. A 10 mN/m - es oldalnyomásig tartó szakaszon a vizes fázisba nyúló PEO - blokkok száma növekszik; majd a 12 mN/m - es oldalnyomás fölötti szakaszon a már vízbe nyúló PEO - blokkok közelednek egymáshoz, elérve a kefe konformációt. 35
35
30
30
25
20
20
π (mN/m)
π (mN/m)
25
15
15
10
10
5
5
0
0 0
5
10
15
20
25
30
0
35
2
5
10
15
20
25
30
2
A (A /monomer egység)
A (A /monomer egység)
13. a - b ábra Tiszta Pluronic 10500 (a) és tiszta Pluronic12700 (b) izoterma
A Pluronic10500 és 12700 rendszerek izotermái igen hasonlóak a Pluronic6800 rendszerhez, két különbözı meredekségő szakaszból és az azokat összekötı átmeneti szakaszból állnak. A film igen hosszú ideig van expandált állapotban, majd rövid átmenet után hirtelen (Pluronic10500 rendszer esetén kb. 10mN/m oldalnyomásnál, Pluronic12700 rendszer esetén kb. 7 mN/m oldalnyomásnál) kondenzált állapotba kerül, vagyis kevéssé éles a palacsinta → gomba átmenet, a PEO - láncok a nagy hidrofilitásuk miatt gyorsan rendezıdnek a szubfázis felé, felvéve a kefe formációt. A PLA és Pluronickompatibilitását - a filmet alkotó rétegben - az additivitás elemzése alapján határozhatjuk meg.
22
Kísérleteim során additivitást a Pluronic6800 rendszer esetében vizsgáltam, az 5 különbözı összetételő (Pluronic -ra nézve 1, 4, 10, 20, 60 tömegszázalékos) rendszert π - A izotermáját az 14. ábra jeleníti meg, ahol A, a komponensek adott arányát figyelembe véve, egyetlen monomer egységre számított átlagos terület. 35
30
1 2 3 4 5
π / mN/m
25
20
15
10
5
0 0
5
10
15
20
25
30
35
2
A(A /Megység)
14. ábra A PLA - Pluronic6800 keverékek izotermái 100:1(1), 100:4(2), 100:10(3), 100:20(4) és 100:60(5) tömegarányú összetételeknél 35
35
30
30
25
25
π / mN/m
π (mN/m)
3 20
15
20
15
2 10
10
1
3 1
5
5 2
0
0 0
5
10
15
20
25
30
35
0
5
10
15
20
25
30
35
2
2
A(A / monomer egység)
A (A /monomer egység)
15. a - b ábra A PLA - Pluronic 6400 (a) és PLA - Pluronic6800 (b) keverékek izotermái 100:1(1), 100:10(2), és 100:60(3) tömegarányú összetételeknél
A Pluronic6400 jelenléte a filmben (15.a ábra) különösen az átmeneti tartományokban van hatással a felületi viselkedésre, az izoterma alakjára. A PLA -ra jellemzı típusú izoterma egész a PLA - Pluronic6400 100:10 tömegarányú összetételig megmarad.
23
A Pluronic6400 -at nagyobb koncentrációban tartalmazó keverékek izotermáin a legjellegzetesebb változás a plató szakaszának megrövidülése, illetve a plató és a kondenzált folyadék szakaszok között megjelenı átmeneti tartomány. A Pluronic6800 jelenléte (15. b ábra) esetén az izotermák minden összetétel esetén igen hasonlatosak a tiszta PLA izotermához, ez leginkább a 100:10 tömegarány esetén figyelhetı meg. Nagyobb Pluronickoncentráció esetén a plató szakasz meghosszabbodik, vagyis a Pluronic6800 rendszer esetén a PEO - láncok hosszabb ideig tartják a gomba konformációt, mint a Pluronic6400 rendszer esetén. 5.2 Intermolekuláris kölcsönhatások a keverékfilmekben A keverékek monorétegében kialakuló intermolekuláris kölcsönhatásokat vizsgálhatjuk a komponensek elegyedése szempontjából. Egy egyszerő, kétkomponenső keverékfilmben, adott oldalnyomáson, ideális esetben a monomerek által elfoglalt átlagos terület (Aid) az alábbi összefüggéssel adható meg [50,51]. Aid=A1x1+A2x2 ahol x1 és x2 a monomerek móltörtje a keverékben, A1 és A2 pedig a monomerek átlagos helyigénye a tiszta polimerek filmjeiben. Amennyiben ez a két komponens ideális elegyet alkot, vagy nem elegyedik egymással, a keverékfilmben a monomerek által aktuálisan elfoglalt átlagos terület (A12) meg fog egyezni az ideális esetre számolt (Aid) értékkel (A12 = Aid). Ha a monomerek kísérletileg meghatározott helyigénye eltér az ideális elegyedés esetén adódó értéktıl (∆A = A12 – Aid), az a molekuláris keveredés jele, és ennek az eltérésnek az értéke a komponensek közt fellépı intermolekuláris kölcsönhatások mértékétıl függ [52]. Az additivitástól való eltérés pozitív és negatív is lehet, melyet okozhat a molekulák szorosabb illeszkedése (kontrakció), illetve fordított esetben éppen a kevésbé szoros illeszkedés miatt a film kiterjed (expanzió) [53]. A vonzó és taszító kölcsönhatások elengedhetetlen feltétele a molekuláris keveredés. A PLA - Pluronic6800 keverékfilmek additivitástól való eltérésének relatív értékeit (∆A/Aid) [52] a 16. ábrán mutatom be; az értékek az izotermák leolvasásának bizonytalansága miatt, kb. ±5% -os hibával vannak feltüntetve.
24
1 2 3 4 5
100 90 80 70
100*∆A/Aid %
60 50 40 30 20 10 0 -10 -20 -30 0
5
10
15
20
25
π mN/m
16. ábra Az additivitástól való eltérés relatív értéke az oldalnyomás függvényében a 100:1(1),100:4(2),100:10(3),100:20(4),100:60(5) PLA - Pluronic6800 tömegarányú összetételeknél Az additivitástól való eltérés kis tömegszázalékos összetétel esetén is csak az 1% - os illetve a 10% - os rendszer esetén volt negatív, vagyis a molekulák szorosan illeszkednek egymáshoz expandált esetben. A filmek összenyomott állapotában az additivitástól való relatív eltérés nagy és pozitív, mely a nagy oldalnyomású PLA rétegben a Pluronic6800 adalék erıs expanziós hatását jelzi. Ez az expanziós hatás az adalék mennyiségével a PLA Pluronic6800 100:10 tömegarányú összetételig nı, a Pluronic6800 nagyobb koncentrációinál ez a hatás megmarad, de már kisebb mértékő. A PLA - Pluronickeverék oldatok kompatibilitását (a teljes molekuláris keveredés értelmében) a Flory – Huggins elméletbıl becsülhetı értékkel is jellemezhetjük, ha ismertek a Hildebrand - féle oldhatósági paraméterek [54,55]. Az eredeti és módosított polimervegyületek molekuláris adatait a 7. táblázat tartalmazza. Az oldhatósági paraméterek, δ, melyek a polimer polaritását fejezik ki, a Hildebrand egyenletbıl számíthatók[54,55]: δ= ρpMo- 1∑ Fi ahol ρp a polimer sőrősége, Mo az ismétlıdı monomeregység molekulatömege, ∑ Fi a polimer monomeregységében az összes kémiai csoportra vonatkozó szerkezeti kölcsönhatási paraméter összege. Kopolimerek esetében (mint amilyenek a PLA - Pluronicrendszerek is) a monomeregységek molekulatömegének az összetétel szerinti, vagyis a homopolimer szakaszok oldhatósági paramétereinek súlyozott átlagát lehet használni. Ez a számolási mód némiképp figyelembe veszi a Pluronic -kok blokkos jellegét, így jobban tükrözi a keveredéskor érvényesülı kölcsönhatásokat.
25
Pluronic®
Anyag megnevezése és rövidítése: 6400 6800 10500 12700 Poli(D,L) D,L tejsav PLA poli(etilén PEO oxid) poli(propilén PPO - oxid)
V δ cm /mol (J/cm3)1/2 49,90 18,85 41,18 20,21 45,86 19,29 41,90 20,07
Mo
M
ρ g/cm3
52,4 47 50,03 47,43
2870 6710 6500 12200
1,05 1,06 1,05 1,05
72
106000
1,24*
58,06
19,7
44
-
1,20¤
36,67
21,1
58
-
1,00¤
50,00
16,9
3
*mért, ¤ Merck index
7. táblázat A polimerek és Pluronic - vegyületek molekuláris adatai (a polimerek, M, illetve a monomeregységek molekulatömege, Mo, a sőrőség, ρp, a monomer móltérfogata,V), valamint a számított oldhatósági paraméterek, δ. Az oldhatósági paraméterekbıl megállapítható, hogy a Pluronic6800 és a Pluronic12700 rendszerek kompatibilitása igen hasonló lesz. Két keveredı polimer között érvényesülı Flory - Huggins - féle paraméter, χ az oldhatósági paraméterekbıl, δ, és az átlagos monomeregységtérfogatból, V, az alábbi képlettel számítható[55] : χ=V/RT(δ1 - δ2)2 A keverékekre számított értékeket a 8. táblázat tartalmazza. Anyag megnevezése és rövidítése:
PLA+
Pluronic® 6400 6800 10500 12700 PEO
χ
0,0283 0,0043 0,0023 0,0031 0,0374
χsp (s%) Pluronickoncentrációnál 1 4 10 20 60 0,7654 0,3039 0,3299 0,1670
0,1987 0,0791 0,0858 0,0436
0,0490 0,0340 0,0368 0,0188 -
0,0471 0,0190 0,0205 0,0106
0,0221 0,0091 0,0099 0,0053
Azon PLA+Pluronic rendszert, melyben Χsp<Χ félkövér Χsp számmal jelöltem.
8. táblázat PLA - Pluronic rendszerekre szamított Flory - Huggins χ, és a spinodiális pontnál érvényes χsp kölcsönhatási paraméterek a mért (1 - 60 s%) koncentrációtartományban.
Az adatokból következik, hogy a kompatibilitás (melyet a kis χ érték jelez) nı a Pluronicvegyületek PEO tartalmával, azaz Pluronic6400 - tól Pluronic12700 fele. Vagyis egyre kompatibilisebbek a PLA - val, jó adalékanyagok a felületmódosításához. Az adatokból következik, hogy pusztán PEO hozzáadása (még igen kis százalékban sem) nem megfelelı. Van egy optimális PPO/PEO arány, amelynél a kompatibilitás kedvezıbb.
26
5.3 A Pluronicadalékok hatása a PLA fehérjeadszorpciójára A vízfelszínre terített polimer filmek fehérjeadszorpcióját illetve a fehérje penetrációját a polimer monorétegekbe, az oldalnyomás mérésével követtem nyomon. Adott (5, 10 és kb. 12 mN/m) oldalnyomású filmek alá, a szubfázisba fecskendeztem 2 cm3, 2 g/dm3 koncentrációjú BSA - oldatot, és az oldalnyomás változását az idı függvényében mértem, míg a területet állandó értéken tartottam. Bizonyos idı elteltével a polimer filmek elérték az egyensúlyi oldalnyomásukat. A keverékfilmek fehérje - oldat penetráció utáni egyensúlyi oldalnyomását a tiszta PLA fehérje - oldat penetráció utáni egyensúlyi oldalnyomásával vetettem egybe, hogy a Pluronicadalékok fehérjeadszorpcióra és –penetrációra gyakorolt hatását jellemezhessem. A fehérjeadszorpciós vizsgálatok rámutattak, hogy a BSA és a polimerek közötti kölcsönhatás mértéke függ a polimer film állapotától. A PLA felületi koncentrációjának növelésével az adszorbeált illetve penetrált fehérje mennyisége csökkent. A fehérjeadszorpció és –penetráció szignifikáns mértékben csökkent, amikor a PLA - hoz Pluronic6800 adalékot adtam. Az eredmények alapján kijelenthetı, hogy a fehérje és a polimer film közötti kölcsönhatásban a felületmódosító adalék PEO blokkjainak hosszúsága fontos szerepet játszik. A jelenség széles körben elfogadott magyarázata, hogy a hosszú PEO blokkok, nagyobb fokú flexibilitásuk és mobilitásuk révén, a felületi rétegbıl jobban benyúlnak a szubfázisba, és így sztérikusan gátolják a fehérje molekulák közeledését – és ezáltal kötıdését is – a felülethez [56] A 17 - 18. ábrán egy - egy penetrációs grafikont láthatunk a Pluronic6800 rendszerrıl (a grafikonokon szürke színnel a gát mögötti, azaz a fehérje - oldat/levegı felületen kialakuló oldalnyomást is feltüntetem, melyen a fehérje diffúziójának és az indukciós periódusnak az idıigénye jól kivehetı), 19 - 22. ábrán bemutatom a fehérjepenetráció során mért oldalnyomás - változását a különbözı Pluronicadalékok esetén.
20
15
π / mN/m
10
5
0
-5 0
600
1200
1800
2400
Idı / s
17. ábra PLA - Pluronic6800 100:10 tömegarányú keverékfilm fehérje - oldat feletti oldalnyomásának változása 5 mN/m kezdeti oldalnyomásról
27
20
15
π / mN/m
10
5
0
-5 0
600
1200
1800
2400
Idı / s
18. ábra PLA - Pluronic6800 100:10 tömegarányú keverékfilm fehérje - oldat feletti oldalnyomásának változása 10 mN/m kezdeti oldalnyomásról
14 12
∆π mN/m
10 8 6 4 2 0 0
2
4
6
8
10
π (mN/m)
12
14
16
19. ábra A tiszta PLA (■) és a PLA - Pluronic6400 100:10 (□), 100:20 (○) és 100:60 (∆) tömegarányú keverékfilmek oldalnyomás - változása a kezdeti oldalnyomás függvényében
28
14 12
∆π (mN/m)
10 8 6 4 2 0 0
2
4
6
8
10
12
14
16
π (mN/m) 20. ábra A tiszta PLA (■) és a PLA - Pluronic6800 100:10 (□), 100:20 (○) és 100:60 (∆) tömegarányú keverékfilmek oldalnyomás - változása a kezdeti oldalnyomás függvényében 14 12
∆π (mN/m)
10 8 6 4 2 0 0
2
4
6
8
10
12
14
16
π (mN/m) 21. ábra A tiszta PLA (■) és a PLA - Pluronic10500 100:10 (□), 100:20 (○) és 100:60 (∆) tömegarányú keverékfilmek oldalnyomás - változása a kezdeti oldalnyomás függvényében
29
14 12
∆π (mN/m)
10 8 6 4 2 0 0
2
4
6
8
10
12
14
16
π (mN/m) 22. ábra A tiszta PLA (■) és a PLA - Pluronic12700 100:10 (□), 100:20 (○) és 100:60 (∆) tömegarányú keverékfilmek oldalnyomás - változása a kezdeti oldalnyomás függvényében A grafikonokról jól leolvasható, hogy Pluronic6400 alkalmazásával a fehérjeadszorpció nem szorul vissza jelentıs mértékben, míg Pluronic6800 és Pluronic12700 alkalmazásakor jelentısebb a fehérjeadszorpció visszaszorulása. A Pluronic10500 rendszer esetén a hatás nem értelmezhetı, bár a PEO egységek hosszabbak, mint a Pluronic6400 esetén, a fehérjeadszorpciót mégsem szorítja vissza ez az adalék. 5.4 Felületi borítottság A Langmuir - filmek esetén a felszínre juttatott anyag mennyiségének és a film területének ismeretében a pontos információnk van a felületi sőrőségrıl. A Pluronic® molekulák PEO - láncait tekintve meghatározhatjuk a felületi réteg PEO - val való borítottságát egy bizonyos polimer sőrőség felett, amikor feltételezhetı, hogy a PEO - láncok zömében a vizes fázisban foglalnak helyet. Filmek kialakításakor a molekulák szorosan illeszkednek egymáshoz, a hidrofil láncok beburkolják a központi hidrofób magot. Ezeket a molekulákat statisztikus gombolyagként a Flory - rádiusz (RFL) segítségével egyszerően jellemezhetjük [57]: RFL= aN3/5 Ahol RFL a Flory - rádiusz, a az átlagos molekulahossz, N a PEO - láncok darabszáma az egyes Pluronic - kokban. A 9. táblázat tünteti fel az egyes Pluronicrendszerek Flory rádiuszát és a teljes PEO - lánc hosszát:
30
Pluronic®
Mw (g/mol)
RFL/nm
Teljes PEO hossz/nm
6400 6800 10500 12700
2870 6710 6500 12200
1,63 3,92 3,05 5,45
2,6 11,2 7,4 19,4
9.táblázat Pluronic - ok Flory - rádiusza és a teljesen kinyúlt láncok hossza Ha a Flory - rádiusz négyzetének, Π -nek és a PEO - láncok darabszámának szorzatát képezzük, megkapjuk az egyes láncok területigényét (10. táblázat). ®
Pluronic 6400 6800 10500 12700
A 1,05E+14 2,58E+14 1,62E+14 2,75E+14
Elfoglalt terület/nm2 B C D 4,19E+14 1,05E+15 2,09E+15 1,03E+15 2,59E+15 5,17E+15 6,49E+14 1,62E+15 3,25E+15 1,10E+15 2,75E+15 5,50E+15
E 6,29E+15 1,55E+16 9,74E+15 1,65E+16
10. táblázat Pluronic rendszerek területigénye
Ha a kinyúlt lánchossz négyzetének és Π - nek szorzatát képezzük, megkapjuk az egyes láncok területigényét teljesen kinyúlt állapotban, mely független a PEO darabszámától az egyes rendszerekben, vagyis minden esetben 0,38 nm2. Ezek alapján már ki tudjuk számolni, hogy a felvitt mennyiségő polimer - keverékben a Pluronic -kot alkotó adalékanyag a kád területének mekkora százalékát foglalja el. Ez azért fontos, mert a penetráció során a csökkenı felület helyminimumra kényszeríti a molekulát, vagyis hogy a palacsinta állapotból - fokozatosan a vizes fázis fele fordítva hidrofil láncait gomba illetve kefe - állapotba kerüljön. A sőrőn álló hidrofil láncok esetén a molekula x - y irányban kisebb helyet foglal el, míg z irányban megnı a hidrofil réteg vastagsága, így a fehérje kevésbé tud kötıdni a felülethez. A 11 - 14. táblázatokban a teljes kis kád felületére számolt felületi borítottságot foglalom össze az egyes rendszerek esetén, melybıl kiderül, hogy gombolyagként az egyes rendszerek igen nagy területet igényelnek (ez a 100% -os borítottságnál nagyobb értékekbıl látszik). A kiemelt számok a PEO rétegek vastagodásának kezdetét jelentik, amikor a PEO láncok elkezdenek megnyúlni, vagyis a Pluronickonformációt vált gombából kefébe.
31
cm2 100 90 80 70 60 50 40 30
Százalékban elfoglalt hely Pluronic 64 nm2 A B C D 1,0E+16 1,05 4,19 10,47 20,95 9,0E+15 1,16 4,66 11,64 23,27 8,0E+15 1,31 5,24 13,09 26,18 7,0E+15 1,50 5,99 14,96 29,92 6,0E+15 1,75 6,98 17,46 34,91 5,0E+15 2,09 8,38 20,95 41,89 4,0E+15 2,62 10,48 26,18 52,37 3,0E+15 3,49 13,97 34,91 69,82
E 62,86 69,84 78,57 89,80 104,76 125,72 157,15 209,53
11. táblázat Pluronic 6400 felületi borítottsága a kis kádban
cm2 100 90 80 70 60 50 40 30
Százalékban elfoglalt hely Pluronic6800 nm2 A B C D E 1,0E+16 2,58 10,34 25,85 51,70 155,10 9,0E+15 2,87 11,49 28,72 57,44 172,33 8,0E+15 3,23 12,93 32,31 64,63 193,88 7,0E+15 3,69 14,77 36,93 73,86 221,57 6,0E+15 4,30 17,23 43,08 86,17 258,50 5,0E+15 5,17 20,68 51,70 103,40 310,20 4,0E+15 6,46 25,85 64,63 129,25 387,75 3,0E+15 8,61 34,47 86,17 172,33 517,00
12. táblázat Pluronic 6800 felületi borítottsága a kis kádban
cm2 100 90 80 70 60 50 40 30
Százalékban elfoglalt hely Pluronic10500 nm2 A B C D E 1E+16 1,62 6,49 16,23 32,46 97,37 9E+15 1,80 7,21 18,03 36,06 108,19 8E+15 2,03 8,11 20,28 40,57 121,72 7E+15 2,32 9,27 23,18 46,37 139,10 6E+15 2,70 10,82 27,05 54,10 162,29 5E+15 3,25 12,98 32,46 64,92 194,75 4E+15 4,06 16,23 40,57 81,15 243,43 3E+15 5,41 21,64 54,09 108,19 324,58
13.táblázat Pluronic 10500 felületi borítottsága a kis kádban
32
cm2 100 90 80 70 60 50 40 30
Százalékban elfoglalt hely Pluronic12700 nm2 A B C D E 1,0E+16 2,75 10,99 27,49 54,97 164,88 9,0E+15 3,05 12,22 30,54 61,08 183,20 8,0E+15 3,43 13,74 34,36 68,71 206,10 7,0E+15 3,93 15,71 39,27 78,53 235,54 6,0E+15 4,58 18,32 45,82 91,61 274,80 5,0E+15 5,50 21,99 54,98 109,94 329,76 4,0E+15 6,87 27,49 68,72 137,42 412,20 3,0E+15 9,16 36,65 91,63 183,23 549,60
14.táblázat Pluronic 12700 felületi borítottsága a kis kádban
5.5 A határfelületi rétegek morfológiája 5.5.1 Általános jellemzés A tiszta PLA oldat BSA penetrációjából húzott Langmuir - Blodgett film -mel hasonlítom össze a Pluronic6800 oldat BSA penetrációja után készült és a vele azonos mólarányú Pluronic6400 oldat BSA penetrációja után készített Langmuir – Blodgett filmrıl készült AFM képeket. Elsıként a PLA - Pluronicpolimerkeverék monorétegének AFM képét mutatom be (23. ábra). Ezek a rétegek viszonylag simának és homogénnek látsszanak. A következı ábrákon a BSA adszorpciót/penetrációt figyelhetjük meg a PLA, illetve a Pluronic -kal módosított PLA rétegekbe (24,25,26. ábra) 3 dimenziós megjelenítésben. Szembetőnı a nagyfokú heterogenitás, elsınek a PLA és a Pluronic6400 -al kevert PLA filmbe épülı BSA -nak köszönhetıen.
23 a - b. ábra Pluronic 6400 (a) és Pluronic6800 (b) monoréteg AFM képe
33
24. ábra BSA penetráció adalékanyagmentes PLA - filmbe, egyrétegő Langmuir - Blodgett film AFM képe
25. ábra BSA penetráció adalékanyagmentes PLA - Pluronic6400 filmbe, egyrétegő Langmuir - Blodgett film AFM képe
34
26. ábra BSA penetráció adalékanyagmentes PLA - Pluronic6800 filmbe, egyrétegő Langmuir - Blodgett film AFM képe A képek alapján megállapíthatjuk, hogy a tiszta Pluronicoldatok üveglapon kb. 2 nm vastagságú filmet alkotnak, ami nagyjából megfelel a monoréteg vastagságának. A BSA penetrációt követıen a filmek vastagsága megváltozik a filmhez kötödı BSA molekuláknak köszönhetıen. Ezen filmek vastagsága körülbelül 4 - 6nm, ami megfelel a vártnak, hiszen a monoréteghez kötödı BSA mérete 4 nm. Fontos megjegyezni, hogy a BSA nem önálló molekulák formájában kötıdik a filmhez, hanem aggregátumok formájában, ezért nem láthatunk önálló BSA molekulát. Ezek az aggregátumok a felvételek szerint laposak és nagy kiterjedésőek, tulajdonképpen szigetes - adszorpciót láthatunk. 5.5.2 Érdességvizsgálat Hasonló BSA penetrációt (lipidfilmbe) szintén AFM képek segítségével mutatott be Souza és munkatársai [58]. A felületek által mutatott heterogenitást számszerően is kifejezhetjük az érdesség meghatározásával. Egy adott felvételen tetszılegesen elhelyezett vonal vagy tartományok mentén kiszámolható az érdesség értéke a relatív magasságpontok alapján. Ennek az analízisnek a menetét tüntetik fel a 27 - 31. ábrák.
35
27. ábra Pluronic 6400 film érdessége
28. ábra
Pluronic 6800 film érdessége
36
29. ábra PLA BSA penetráció utáni filmjének érdessége
30. ábra PLA - Pluronic 6400 rendszer BSA penetráció utáni filmjének érdessége
37
31. ábra PLA - Pluronic 6800 rendszer BSA penetráció utáni filmjének érdessége
A 15. táblázat az összes mérés érdességi adatainak átlagát tartalmazza pm - ben kifejezve. A PLA - Pluronic –filmek valóban kismértékő érdességgel jellemezhetık, míg a BSA penetráció növeli az érdességi paraméter értékét. Az adatokból kiderül, hogy a vártnak megfelelı a fehérjetaszítás mértéke, vagyis, hogy a PLA -hoz még erısen kötıdik a fehérje, az adalékanyagokként alkalmazott Pluronic - ok esetén a Pluronic6400 kissé visszaszorítja, míg a Pluronic6800 nagymértékben szorítja vissza az adszorpciót. Átlag érdesség (Ra)/pm Pluronic 6400
PLA+BSA
6800
Pluronic+BSA 6400
6800
49,44±10,46 68,67±8,69 501,25±394,22 359,06±320,23 148,09±87,72 15. táblázat A Langmuir - Blodgett filmek átlag érdessége
38
6 Összefoglalás Poli(tejsav) - ból, és Pluronic6800 blokkos kopolimerbıl, valamint ezek különbözı arányú keverékébıl, vízfelszínen Langmuir - filmet állítottam elı. Az egyedi polimerek oldalnyomás – terület izotermáit a polimer keverékbıl készített filmek izotermáival hasonlítottam össze. Az izoterma alakváltozásából arra lehetett következtetni, hogy a PLA Pluronic 100:10 tömegarányú összetételéig a PLA film határfelületi tulajdonságai alig változnak, míg az efölötti koncentrációkban a Pluronic vegyület hatása egyre jelentısebbé válik. A kétkomponenső filmekben a komponensek additivitásának vizsgálata arra mutatott, hogy a polimerek keverednek, és a keveredés kissé eltér az ideálistól. Kis oldalnyomás tartományban a negatív eltérés a komponensek közötti vonzó kölcsönhatásnak tulajdonítható kontrakcióra utal, míg a pozitív eltérés a nagy oldalnyomás tartományban bizonyára dinamikus hatásból is következhet. A vízfelszínre terített PLA - Pluronicpolimer filmek vizsgálatának eredménye szerint a Pluronicadalékok beépíthetık a PLA monomolekulás filmjébe. A komponensek kompatibilitása arra utal, hogy a Pluronic6800 és a Pluronic12700 rendszert elınyösen lehetne alkalmazni a gyógyszerhordozó PLA mikrogömböcskék felületmódosítására. A Langmuir - mérleggel végzett BSA penetrációt vizsgálatok azt mutatták, hogy a BSA adszorpció/penetráció mértéke a PLA monorétegbe bizonyos összetételő Pluronic adalékkal szignifikánsan csökkenthetı. Az AFM vizsgálat alapján kijelenthetjük, hogy a PLA - Pluronic6800 keverékfilmhez a vártnak megfelelıen kevésbé kötıdött a fehérje, mint a PLA - Pluronic6400 keverékfilm esetén. A fehérjeadszorpciós vizsgálatok szerint, a megfelelı Pluronicadalék és összetétel megválasztásával a fehérjék adszorpciója, és azzal együtt a sejtes kölcsönhatások mértéke csökkenthetı, ami nagyban növeli a poli(tejsav) alapú gyógyszerhordozók alkalmazhatóságát. Az általam vizsgált rendszerek közül a PLA - Pluronic12700 100:20 tömegarányú keverék mutatta a legkisebb mértékő fehérjeadszorpciót.
Köszönetnyilvánítás: Köszönettel tartozom Dr. Baranyai Andrásnak, hogy lehetıvé tette munkámat a tanszéken, Dr. Kiss Évának, témavezetımnek, a szakmai segítségért, tanácsokért és fıleg türelméért, Kutnyánszky Editnek az AFM vizsgálatokért, valamint Hill Katalinnak és Hórvölgyi Zoltánnénak önzetlen segítségükért.
39
7 Irodalomjegyzék [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17]
[18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29]
T.J. Roseman, S.H. Yalkonsky Cont. Release Polímeric Formulations; D.R. Paul, F.W. Harriseds. ACS Symphosium Series 33, Am. Chem. Soc. 33 - 52 (1976) B.D. Ratner, A. S. Hoffman. F. J. Schoen, J.E. Lemons, An Introduction to Materials in Medicine, Biomaterials Science, Academic Press, San Diego 346 - 347 (1996) Csempesz F., Kolloidika, szerk. Rohrsetzer S., Tankönyvkiadó, Budapest, 200 - 207 (1991) O. Borisov, P. Auvray: Stabilisation of colloidal dispersions by grafted polimers CRC, Boca Raton, (1994) C. S. Cho, J. Control Release, 77, 1 - 7 (2001) Tz. Ivanova, I. Panaïotov, F. Boury, J. E. Proust, J. P. Beniot, R. Verger, Colloids Surf. B, 8, 217 – 225 (1997) F. Boury, Tz. Ivanova, I. Panaïotov, J. E. Proust, A. Bois, J. Richou, Langmuir, 11, 1636 – 1644 (1995) Bertóti I, Marosi Gy, Tóth A : Mőszaki felülettudomány és orvosbiológiai alkalmazásai B+V (medical& technical) Lap és Könykiadó kft. 225 - 233 (2003) K. D. Caldwell, Chemistry and Biological Applications of Poly(ethylene glycol), ed. J. M. Harris, S. Zalipsky, ACS Symp. Ser. 680, Am. Chem. Soc.,Washington DC, 1997, K. Lee, J. A. Gardella Jr., Langmuir, 16, 3401 – 3406 (2000) M. Morlock, T. Kissel, Y. X. Li, H. Koll, G. Winter, J. Controlled Release, 56, 105 – 115 (1998) R. Zange, Y. Li, T. Kissel, J. Controlled Release, 56, 249 – 258 (1998) J. M. Harris (ed), Poly(ethylene glycol) Chemistry, Plenum Press, New York, (1992) D. A. Norris, N. Puri, M. E. Labib, P.J. Sinko, J. Contr. Release, 59,173 (1999) Quirk, M. C. Davies, S. J. B. Tendler, W. C. Chan, K. M. Shakesheff, Langmuir, 17, 2817 – 2820 (2001) M. Malmsten (ed), Biopolymers at Interfaces, M. Dekker, New York, 561 – 596 (1998) S. Nagaoka, Y. Mori, H. Takiuchi, K. Yokota, H. Tanzawa, S. Nishiumi, Polymers as Biomaterials, ed. S. W. Shalaby, A. S. Hoffman, B. D. Ratner, T. A. Horbett, Plenum Press, New York, 361, (1984) C. - G. Gölander, É. Kiss, Journal of Colloid and Interface Science 121, 240, (1988) P. Bouillot, A. Petit, E. Dellacherie, Journal of Applied Polymer Science 68, 1695, (1998) Tz. Ivanova, P. Saulnier, A. Malzert, F. Boury, J. E. Proust, I. Panaïotov, Colloids Surf. B,23, 7 - 21, (2002) V. M. Nace (ed), Nonionic surfactants, M. Dekker, New York, (1996) G. P. H. Schroen, M. A. Cohen Stuart, K. van der Voort Maarschalk, van der Pad, K. van’t Riet, Langmuir, 11, 3068 – 3074 (1995) J. T. Li, K. D. Caldwell, Colloids Surf. B, 7, 9 – 22 (1996) P. Alexandridis, B. Lindman (ed.), Amphiphilic Block Copolymers: Self - Assembly and Applications, Elsevier, Amsterdam, (1999) P. Alexandridis, T. A. Hatton, Colloids Surf. A, 96, 1 – 46 (1995) C.G.P.H., Schroen, M.A. Cohen Stuart, A van der Padt, K. Van t Riet, Colloids Surfaces A, 90, 235 (1994) K. B. Blodgett J. Am. Chem. Soc, 57, 1007 (1935) K. B. Blodgett sng I.Langmuir Phys. Rev, 51, 964 (1937) Inzelt Gy. Kalandozások a kémia múltjában és jelenében, Vince kiadó, Budapest, 158 – 159 (2003) 40
[30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58]
F. MacRitchie Chemistry at Interfaces, Academic press, San Diego, (1990) F. Boury, A. Gulik, J. C. Didieu, J. E. Proust, Langmuir, 10, 1654 – 1656 (1994) F. Boury, E. Olivier, J. E. Proust, J. P. Benoit, J. Coll. Interf. Sci, 160, 1 – 9 (1993) J. Crisp, Surface Phenomena in Chemistry and Biology, Pergamon Press, 23 – 54 (1958) Ringard - Lefebvre, A. Baszkin, Langmuir, 10, 2376 – 2381, (1994) F. Boury, P. Saulnier, J. E. Proust, I. Panaïotov, Tz. Ivanova, C. Postel, O. Abillon, Colloids Surf. A, 155, 117 – 129 (1999) M. Kawaguchi, S. Komatsu, M. Matsuzumi, A. Takahashi, J. Coll. Interf. Sci., 102, 356 – 360 (1984) R. W. Richards, M. R. Taylor, J. Chem. Soc. Faraday Trans, 92, 601 – 610 (1996) C. Chen, M. A. Even, Z. Chen, Macromolecules , 36, 4478 – 4484 (2003) É. Kiss, T. Keszthelyi, G. Kormány, O. Hakkel, Macromolecules 39, 9375 - 9384 (2006) Kiss É., Idei M., Válogatott fejezetek a mőszaki felülettudományból, szerk. Bertóti I., Marosi Gy., Tóth A., Mőegyetemi Kiadó, Budapest, 231 – 252 (1998) R. Miller, D. O. Grigoriev, J. Krage, Food Hidr. Colls., 19, 479 – 483 (2005) J. M. Harris (ed), Poly(ethylene glycol) Chemistry, Plenum Press, New York, (1992) A. Prins, M. A. Bos, F. J. G. Boerboom, H. K. A. I. van Kalsbeek, Proteins at Liquid Interfaces, ed. D. Möbius, R. Miller, Elseiver, Amsterdam, (1998) B. S. Murray, Langmuir, 13, 1850 – 1852 (1997) B. S. Murray, Colloids Surf. A, 125, 73 – 83 (1997) É. Kiss, I. Bertóti, E. I. Vargha - Butler, J. Coll. Interf. Sci. , 245, 91 – 98 (2002) J. Benjamins, Static and Dynamic Properties of Proteins Adsorbed at Liquid Interfaces, PhD Thesis, Wageningen University, (2003) J. Lyklema, Fundamentals of Interface and Colloid Science, Academic Press, San Diego, Vol III. 3.233 (2000) J. Kuzmenka, S. Granick, Macromolecules, 21, 779 – 782, (1988) L. Gaines Jr., Insoluble Monolayers at Liquid - Gas Interfaces, Wiley - Interscience, New York, (1966) P. Dynarowicz - Latka, K. Kita, Adv. Colloid Interf. Sci., 79, 1 – 17 (1999) T - H. Chou, I - M. Chu, Colloids Surf. B, 27, 333 – 344 (2003) M. S. Aston, T. M. Herrington, T. F. Tadros, Colloids Surf., , 62, 31 – 39 (1992) S. Krause „Polimer Blends” (D.R. Paul, S. Newman, Eds.) 15.old., Academic Press, New York (1978) Halász L., Zrínyi M.: Bevezetés a polimerfizikába, Mőszaki Könyvkiadó, Budapest, (1989) J. R. Charron, R. D. Tilton, Langmuir, 13, 5524 – 5527 (1997) A. Roosjen, H. C. van der Mei, H.J Busscher, W. Norde, Langmuir, 20, 10949 – 10955, (2004) N.C. de Souza, W. Caetano, R. Itri,C. A. Rodrigues, O. N. Oliveira Jr., J. A. Giacometti, M. Ferreira Journal of Colloid and Interface Science 297, 546–553, (2006)
41
