Komplementární metody k použití oxidu siřičitého

Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici

Komplementární metody k použití oxidu siřičitého Diplomová práce

Vedoucí práce

Vypracoval

Ing. Vojtěch Kobliţka

Bc. Marek Malík

Lednice 2014

Čestné prohlášení Prohlašuji, ţe jsem diplomovou práci: Komplementární metody k použití oxidu siřičitého vypracoval samostatně a veškeré pouţité prameny a informace uvádím v seznamu pouţité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom, ţe se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a ţe Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a uţití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, ţe před sepsáním licenční smlouvy o vyuţití díla jinou osobou (subjektem) si vyţádám písemné stanovisko univerzity, ţe předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuje se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to aţ do jejich skutečné výše.

V Lednici dne:

………….................................... Podpis diplomanta

Poděkování Tímto bych rád poděkoval vedoucímu své diplomové práce Ing. Vojtěchu Kobliţkovi, za jeho ochotu se mnou vše konzultovat, za jeho věcné postřehy k mé práci a nesmím opomenout i jeho pomoc a rady s prací v mikrobiologické laboratoři. Můj vděk patří i Ing. Mojmíru Baroňovi, Ph.D., který přispěl svými cennými zkušenostmi s danou problematikou. Zvláštní poděkování patří mé rodině, která mě po celou dobu mého studia plně podporovala – obzvláště má maminka.

OBSAH 1.

ÚVOD............................................................................................................. 9

2.

CÍL PRÁCE .................................................................................................. 10

3.

LITERÁRNÍ PŘEHLED .............................................................................. 11 3.1

Pouţití oxidu siřičitého ve vinařském průmyslu ................................... 11

3.1.1 Oxid siřičitý ....................................................................................... 11 3.1.2 Síření během zpracování hroznů ....................................................... 12 3.1.3 Síření moštu ....................................................................................... 13 3.2

Komplementární metody k pouţití oxidu siřičitého.............................. 14

3.2.1 Technologická metoda pro sníţení potřeby síření – sur lie ............... 14 3.2.2 Fyzikální metody pro omezení dávek SO2 ........................................ 14 3.2.3 Chemické látky pro omezení dávek SO2 – antioxidanty ................... 19 3.2.4 Chemické látky pro omezení dávek SO2 – antimikrobiální látky ..... 21 4.

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ........................................................................ 30 4.1

Materiál ................................................................................................. 30

4.1.1 Odrůda ............................................................................................... 30 4.1.2 Média pro mikroorganismy ............................................................... 30 4.1.3 Kultivované mikroorganismy ............................................................ 31 4.1.4 Pouţité účinné látky .......................................................................... 33 4.1.5 Fyziologický roztok ........................................................................... 33 4.1.6 Laboratorní pomůcky ........................................................................ 33 4.2

Metody měření ...................................................................................... 34

4.2.1 ALPHA analyzátor ............................................................................ 34 4.2.2 Kochova zřeďovací metoda ............................................................... 35 4.2.3 Inokulace na Petriho misky ............................................................... 36

4.2.4 Počítání kolonií .................................................................................. 37 4.3 5.

Postup práce .......................................................................................... 38

VÝSLEDKY................................................................................................. 40 5.1

Kolonie tvořící jednotky ....................................................................... 40

5.2

Vliv inhibičních látek na mikroorganismy ............................................ 41

5.2.1 Zygosaccharomyces rouxii ................................................................ 41 5.2.2 Brettanomyces bruxellensis ............................................................... 43 5.2.3 Zymomonas mobilis ........................................................................... 44 5.2.4 Saccharomyces cerevisiae ................................................................. 46 5.3

Úmrtnost mikroorganismů .................................................................... 47

5.3.1 Vyšší mastné kyseliny - 10 mg.l-1 ..................................................... 47 5.3.2 Vyšší mastné kyseliny - 40 mg.l-1 ..................................................... 48 5.3.3 DMDC - 200 mg.l-1 ........................................................................... 49 6.

DISKUZE ..................................................................................................... 50

7.

ZÁVĚR ......................................................................................................... 54

8.

SOUHRN ...................................................................................................... 56

9.

RESUME ...................................................................................................... 57

10. POUŢITÁ LITERATURA ........................................................................... 58 11. SEZNAM PŘÍLOH ...................................................................................... 63 12. PŘÍLOHY ..................................................................................................... 64

Seznam tabulek: Tab. 1: Doporučené dávkování SO2, dle stavu hroznů, (Zdroj: Steidl, 2010a) .............. 13 Tab. 2: Počet CFU Zygosaccharomyces rouxii vyrostlých na Petriho miskách ............. 40 Tab. 3: Počet CFU Brettanomyces bruxellensis vyrostlých na Petriho miskách ............ 40 Tab. 4: Počet CFU Zymomonas mobilis vyrostlých na Petriho miskách ........................ 41 Tab. 5: Počet CFU Saccharomyces cerevisiae vyrostlých na Petriho miskách .............. 41 Tab. 6: Mezní hodnoty celkového SO2 podle typu vín v ČR (podle nařízení č. 606/2009), (Zdroj: Michlovský, 2012) ............................................................................ 64

Seznam grafů: Graf 1: Efekt různých dávek UV záření na 3 druhy inokulovaných mikroorganismů (Zdroj: Fredericks et al., 2011) ...................................................................................... 18 Graf 2: Srovnání vývoje mléčných bakterií po ošetření SO2 a lysozymem (Zdroj: Michlovský, 2012) ........................................................................................................... 23 Graf 3: Účinek různých koncentrací vyšších mastných kyselin na kvasinky (Zdroj: Baroň, Bábíková, 2011) .................................................................................................. 27 Graf 4: Citlivost Z. rouxii ke 200 mg.l-1 DMDC, 10 mg.l-1 a 40 mg.l-1 HFA................. 42 Graf 5: Růstová křivka Z. rouxii a její ovlivnění inhibičními látkami ........................... 43 Graf 6: Citlivost B. bruxellensis ke 200 mg.l-1 DMDC, 10 mg.l-1 a 40 mg.l-1 HFA....... 43 Graf 7: Růstová křivka B. bruxellensis a její ovlivnění inhibičními látkami ................. 44 Graf 8: Citlivost Z. mobilis ke 200 mg.l-1 DMDC, 10 mg.l-1 a 40 mg.l-1 HFA .............. 45 Graf 9: Růstová křivka Z. mobilis a její ovlivnění inhibičními látkami ......................... 45 Graf 10: Citlivost S. cerevisiae ke 200 mg.l-1 DMDC, 10 mg.l-1 a 40 mg.l-1 HFA ........ 46 Graf 11: Růstová křivka S. cerevisiae a její ovlivnění inhibičními látkami ................... 47 Graf 12: Úmrtnost jednotlivých mikroorganismů vyjádřena v procentech .................... 48 Graf 13: Úmrtnost jednotlivých mikroorganismů vyjádřena v procentech .................... 48 Graf 14: Úmrtnost jednotlivých mikroorganismů v procentech ..................................... 49

Seznam obrázků: Obr. 1: Práce v laminárním boxu (Zdroj: foto vlastní) ................................................... 34 Obr. 2: Práce na přístroji ALPHA (Zdroj: foto vlastní) .................................................. 35 Obr. 3: Kochova zřeďovací metoda (Zdroj: Bábíková, 2010) ........................................ 36 Obr. 4: Očkování moštu přelití agarem na Petriho misky (Zdroj: Bábíková, 2010) ...... 37

Seznam zkratek: 10HFA

10 mg.l-1 vyšších mastných kyselin

40HFA

40 mg.l-1 vyšších mastných kyselin

CFU

Jednotky vytvářející kolonie

CSC

Koloidní stříbro

DMDC

Dimetyldikarbonát

GKCH

Glukozový agar s kvasničným extraktem a chloramfenikolem

MRS

Diagnostická ţivná půda

HFA

Vyšší mastné kyseliny

HPP

Vysoký hydrostatický tlak

JMK

Jablečno-mléčné kvašení

OIV

Mezinárodní organizace pro víno a vinohradnictví

PEF

Pulzní elektrické pole

SO2

Oxid siřičitý

UV

Ultrafialové záření

ÚKZÚZ

Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský

C8

Oktanová kyselina

C10

Dekanová kyselina

C12

Dodekanová kyselina

1.

ÚVOD

„[M]any wine authorities will tell you that it is impossible to make a wine which ages well without using sulphur dioxide. This is just not true. The SO2 drastically inhibits the process of oxidation. The alternative is to control oxidation.― — Félicien Breton — Nápoj či potravina podléhá, při delší době skladování, jistému znehodnocení. Z toho důvodu se v potravinářství pouţívají různé konzervační látky, aby se tomuto přirozenému procesu zabránilo. Při výrobě vína se k tomu účelu pouţívá oxid siřičitý (SO2), a to hned v několika formách (plynná, kapalná, prášková). O jeho účincích se ví jiţ dlouhou dobu, vţdyť jej znali a uţívali jiţ staří Římané, kteří sice nechápali, jak přesně funguje, ale věděli, ţe díky němu zůstává víno svěţí a čerstvé. Uchování vína není jedinou vynikající vlastností této látky. Ve vinařství se pouţívá i k potlačení neţádoucí mikroflóry moštu (respektive vína) nebo k zastavování alkoholového kvašení kvůli zůstatku zbytkového cukru. Takový styl vína je v současné době ţádaný a z toho důvodu je nalezení nějaké komplementární metody k SO2 nesmírně ţádoucí, aby jeho obsah ve víně zbytečně nenarůstal, kvůli nesmyslnému přidávání vinařem na zastavení alkoholového kvašení. Navíc konečná koncentrace SO2 ve víně je omezena předpisy, coţ striktně limituje uţití vyšších dávek. V moderním sklepním hospodářství je přídavek jakékoliv formy SO2 téměř samozřejmostí, neboť je to jeden z nejběţnějších úkonů vinaře a můţe se přidávat v různých fázích výroby vína – od mletí aţ po lahvování. Jeho uţití je tak zaţité, aţ se stalo neodmyslitelným, a to i přes jeho škodlivý vliv na lidské zdraví, který je veřejnosti i odborníkům dobře znám. Tak proč mají vinaři tendenci ho stále pouţívat? Odpověď je vcelku jednoduchá: díky jeho specifickým vlastnostem. Zaprvé SO2 působí antimikrobiálně a to hned na celou řadu mikroorganismů. Saccharomyces cerevisiae, nejdůleţitější kvasinka pro vinaře, je naštěstí proti jeho účinku odolnější neţ neţádoucí apikulátní kvasinky. Zadruhé působí antioxidačně (brání hnědnutí moštu či vína), víno tak zůstane čerstvé a nezkazí se. Z toho plyne, ţe jeho jediným nedostatkem zůstává jeho toxicita. Ve většině případů to nepředstavuje problém, ale najdou se jedinci alergičtí na siřičitany, u nichţ by poţití zasířeného vína mohlo způsobit i smrt. Převáţně z tohoto důvodu se apeluje na upouštění od pouţívání nebo alespoň sniţování maximální aplikační dávky SO2 ve vinařství.

9

2.

CÍL PRÁCE Cílem práce je prozkoumání problematiky oxidu siřičitého ve vinařství a zjištění

jeho moţné náhrady jinými postupy, metodami či přípravky ve vinařské praxi. Součástí práce je experiment, zaměřující se na inhibici mikroorganismů v prostředí moštu takovými prostředky, které vykazují potenciál k omezení pouţívaných dávek SO2.

10

3.

LITERÁRNÍ PŘEHLED

3.1

Použití oxidu siřičitého ve vinařském průmyslu Oxid siřičitý se vyuţívá jako konzervační prostředek k ošetřování vína jiţ několik

tisíciletí. Jeho účinku vyuţívali jiţ Řekové a Římané, kteří zjistili, ţe kdyţ uvnitř prázdné nádoby zapálí sirnou svíčku, zabrání tak vzniku octového pachu a víno navíc zůstane čerstvé. I po 2000 letech tak zůstává oxid siřičitý nepochybně jednou z těch nejdůleţitějších přísad, která se při výrobě vína pouţívá (Priewe, 2001; Henderson, 2009; Steidl, 2010a), je ovšem důleţité si uvědomit, ţe to není přísada, která by se do vína měla bezmyšlenkovitě přidávat, zároveň se však její přídavek nesmí ani zatracovat. Proto záleţí na dávce – aby neuškodila jak vínu, tak člověku (Priewe, 2001). V podstatě se jedná o víceúčelové antiseptikum a mocné redukční činidlo, které chrání víno či mošt před oxidací. Účinnost je závislá na pH a na hladině fenolových sloučenin. Proti růstu mikroorganismů je ale aktivní pouze molekulární SO2. Navíc příliš vysoká koncentrace SO2 poskytuje typický sirný zápach a rovněţ můţe u některých spotřebitelů vyvolat alergické reakce (jiţ při malých dávkách – miligramy). Proto se, v dnešní době ve vinařském průmyslu, hledají způsoby jak pouţívání SO2 alespoň minimalizovat (Renouf et al., 2008; Fredericks et al., 2011; Michlovský, 2012).

3.1.1 Oxid siřičitý „Sulfur dioxide is a miracle chemical, so perfectly suited to wine, and it does so many things at the same time.” — Zack Scott — Oxid siřičitý vzniká spalováním síry: S + O2 → SO2 SO2 je bezbarvý štiplavý plyn, který se ve vodném roztoku mění na kyselinu siřičitou: SO2+ H2O → H2SO3 Tato kyselina má pak v prostředí moštu (později i u vína) tyto účinky: 

Antiseptický účinek – zabránění aktivit apikulátních kvasinek a bakterií (octových a mléčných).

11



Antioxidační účinek – vyvázání kyslíku. Látky obsaţené ve víně jsou tak chráněny před oxidací.



Působení proti oxidázám – deaktivuje enzymy přenášející kyslík a potlačuje hnědnutí vína.



Organoleptické působení – vyvázáním kvasných produktů, např. acetaldehydu, kyseliny pyrohroznové apod., se zlepšuje aroma vína (Ribéreau-Gayon et al., 2006; Steidl, 2010a; Michlovský, 2012). I přesto, ţe při konzumaci nepřiměřených dávek poškozuje kyselina siřitá zdraví,

se bez ní v moderním sklepním hospodářství plně neobejdeme. Veškeré pokusy vyloučit kyselinu siřičitou nevedly k uspokojivému výsledku – bezchybnému vínu (Steidl, 2010a). Jde o jeden z nejúčinnějších prostředků, kterým vinař chrání víno. Sířen by měl být rmut, případně jiţ hrozny. I kdyţ se tím mírně zvyšuje vyluhování tříslovin, můţe se tak zabránit negativnímu oxidativnímu a mikrobiologickému vývoji. Rozhodování o tom, kdy a kolik oxidu siřičitého přidat, závisí na tom, v jaké fázi výroby vína se nacházíme a čeho se snaţíme přídavkem dosáhnout (Henderson, 2009; Steidl, 2010a).

3.1.1.1 Formy SO2 ve víně Analyticky je rozlišován na volný a vázaný oxid siřičitý, jejich součet pak udává veškerý SO2. Vázaný SO2 se váţe na různé produkty kvašení (acetaldehyd, kyselina ketoglutarová, kyselina pyrohroznová apod.) a nepůsobí pak ani antimikrobiálně a ani nedeaktivuje enzymy. Pro lidské tělo je rozhodující obsah veškerého SO2, proto nesmí víno při uvedení do oběhu přesáhnout zákonem dané hodnoty (Steidl, 2010a).

3.1.2 Síření během zpracování hroznů Přídavek SO2 na hrozny má následující účinky: 

útlum oxidačních enzymů



zastavení vývoje neţádoucí mikroflóry



vyvázání vzdušného kyslíku

Čím dříve se tento přídavek uskuteční, tím lépe bude rmut chráněn před účinky vzduchu, zabrání se hnědnutí a podpoří se vývoj buketu a čistých tón (Steidl, 2010a). 12

Síření se nejčastěji provádí pomocí prášku (pyrosulfitu draselného) přímo na hrozny nebo se pouţívá tekutý SO2 do moštu (Steidl, 2010a).

Tab. 1: Doporučené dávkování SO2, dle stavu hroznů, (Zdroj: Steidl, 2010a)

Dávky Zdravé hrozny Nahnilé hrozny Botrytické hrozny

SO2 (mg.l-1) 0 - 50 50 - 75 75 - 100

Niţší dávky jsou moţné při:  zdravých a dobře vyzrálých hroznech s dostatečným celkovým obsahem kyselin a při nepoškození hroznů během přepravy do lisovny 

chladném počasí během sklizně



nenakvášení rmutu (Steidl, 2010a)

3.1.3 Síření moštu Mnoţství by se mělo pohybovat kolem 20–25 mg.l-1 volného SO2 v moštu. Další síření moštu je nutné pouze v případě: 

delší doby stání moštu,



vysoké teploty během sklizně,



sběru příliš nahnilých hroznů (Steidl, 2010a), a to z důvodu potlačení vysokých populací divokých kvasinek a bakterií, které se na nahnilých hroznech vyskytují (Jackson, 2008). Ve víně se vţdy bude nacházet jisté mnoţství SO2, i kdyby se vinař rozhodl

nesířit, protoţe SO2 je syntetizován téměř všemi kmeny Saccharomyces cerevisiae, a vzniká tedy jako vedlejší produkt alkoholového kvašení (Ribéreau-Gayon et al., 2006; Jackson, 2008; König et al., 2009). Ve většině případů je však vázán na organické sloučeniny v kvasícím moštu. Přídavek SO2 podporuje růst kmenů na něj rezistentních a můţe být příčinou pomalého nástupu kvašení. Některé výzkumy dokonce zpochybnily účinnost nebo výhody přídavku SO2, a to zejména u zdravých hroznů a u chlazené macerace při nízkých teplotách. Očkování kvasinkou Saccharomyces cerevisiae můţe

13

být samo o sobě dostačující k potlačení jiných kvasinek (Egli et al., 1998; Jolly et al., 2006; Jackson, 2008).

3.2

Komplementární metody k použití oxidu siřičitého

3.2.1 Technologická metoda pro snížení potřeby síření – sur lie Jednou z metod jak sníţit pouţívání SO2 při výrobě vína je sur lie neboli leţení na kvasnicích.

V dřívějších

dobách,

kdy

nebyly

takové

technické

moţnosti

k urychlenému čiření, jako jsou dnes, byla nevyhnutelná jistá doba k sedimentaci a tím i delší kontakt s kvasnicemi (Steidl, 2010b). V zásadě se pod tímto pojmem rozumí ponechání hotového, prokvašeného vína na kalech, kdy časem dochází k autolýze kvasinek – rozpuštění buněčné stěny a také k přechodu různých látek obsaţených v buňkách kvasinek do vína. Úspora síření spočívá ve vyuţití redukční síly kvasinek. Vína typu sur lie se však nevyrábí jen pro úsporu SO2, ale především kvůli vzniku kulatějších a stabilnějších vín s delší ţivotností. Při vínech sur lie je často poţadováno biologické odbourání kyselin, a tak je mošt či mladé víno sířeno jen minimálním mnoţstvím SO2 (Steidl, 2010b). Ovšem je třeba si uvědomit, ţe ponecháním vína delší dobu na kvasnicích sebou nese i několik rizik, např. vznik „sirky― či podpora kvasinek Brettanomyces sp., a tím i vznik neţádoucí „koňských pachů― (Steidl, 2010b).

3.2.2 Fyzikální metody pro omezení dávek SO2 Fyzikální metody jsou v potravinářství obecně povaţovány za nejbezpečnější, díky minimálním přídavkům aditiv. Zároveň jsou však tyto metody často spojovány se senzorickým ovlivněním určitých komponent dané potraviny (Baroň, 2013a).

3.2.2.1 Pasterizace To, ţe je moţné mikroorganismy inhibovat pomocí tepla, je všeobecně známá věc. U vína se tento způsob inhibice nerozšířil pravděpodobně z důvodu sníţení senzorických vlastností vína. Navíc se víno ošetřuje poměrně snadno, vzhledem k obsahu alkoholu, kyselin a dostatečného mnoţství SO2. I přesto je moţné plněním vína do lahví za tepla docílit lepší stabilizaci konečného produktu (Ribéreau-Gayon et al., 2006; Michlovský, 2012).

14

Využití v praxi Lahvování za tepla lze vyuţít k mikrobiální stabilitě červených vín nebo u bílých vín se zbytkovým cukrem pro zamezení jejich neţádoucímu rozkvašení. Všeobecně se pasterizace pouţívá na vína o průměrné jakosti, která jsou mikrobiálně nestabilní. Ke sterilizaci dochází zahříváním vína a lahví na 45°C nebo 48°C. Moţné oxidaci se předchází přítomností 30 mg.l-1 volného SO2 (Ribéreau-Gayon et al., 2006). Po pasterizaci se musí víno skladovat ve sterilních podmínkách – veškerý materiál, který přijde s vínem do styku, musí být sterilizován párou případně chemicky (Ribéreau-Gayon et al., 2006). Pokud je pouţito vhodné zařízení, mohou se lahvovat sladká vína se stejnou koncentrací volného SO2, jako v případě suchých bílých vín. Díky tomu je celková koncentrace SO2 významně sníţena. Sladká vína s obsahem pouhých 30 mg.l-1 volného SO2 obsahují v průměru o 60 mg.l-1 méně veškerého SO2, neţ takové, které obsahují 50 mg.l-1 volného SO2, coţ je koncentrace nezbytná pro zamezení kvašení nepasterizovaných vín (Ribéreau-Gayon et al., 2006).

3.2.2.2 Pulzní elektrické pole Pulzní elektrické pole (PEF - Pulsed Electric Field) je technologie představující rychlou, „bezohřevnou― a vysoce účinnou techniku pro inhibici patogenních mikroorganismů v potravinách, aniţ by došlo ke kvalitativním změnám (Santos et al., 2012; El Darra et al., 2013). Tuto technologii lze tedy vyuţít ve vinařství jako alternativní systém mikrobiologické kontroly. Při vhodném pouţití vede PEF ke sníţení aţ 99,9 % mikroflóry, která způsobuje znehodnocení moštu a vína, např. Brettanomyces sp. a Lactobacillus sp. (Puértolas et al., 2009; Delsart et al., 2012). Využití v praxi Pouţití PEF dochází i ke zvýšení obsahu a koncentrací uvolněných látek do vína, díky elektroporaci buněčných membrán a zlepšení jejich propustnosti. V důsledku toho pak dochází k rychlejšímu uvolnění intracelulárních sloučenin (El Darra et al., 2013). U bílých hroznů ji lze vyuţít i ke zvýšení výlisnosti (20 aţ 50 %), metoda je účinnější, kdyţ se pouţije před lisováním neţ v jeho průběhu. Navíc mošty ošetřené PEF technologií se prokázaly jako méně náchylné ke zhnědnutí (Delsart et al., 2012). Pozitivní vliv byl zjištěn i při výrobě červených vín, kdy PEF přispělo k lepší extrakci polyfenolů a antokyanů ze slupek. PEF o mírné intenzitě a krátkém trvání zrychlí 15

kinetiku fenolických sloučenin přes buněčné membrány, coţ je pozitivní, protoţe fenolické sloučeniny hrají ve vinařství důleţitou roli (hlavně co se senzorických vlastností vína týče). Oproti ultrazvuku a mírnému ohřevu rmutu je PEF daleko účinnější – můţe zvýšit extrakci fenolů aţ o 50 %. (Delsart et al., 2012; El Darra et al., 2013). Je však nutné brát zřetel na přílišnou intenzitu ošetření, pak by se mohl projevit i negativní vliv na senzoriku, např. zvýšená extrakce hořkých fenolických látek (Delsart et al., 2012).

3.2.2.3 Ultrazvuk V posledních letech se pouţití ultrazvuku povaţuje za alternativní moţnost při zpracování potravinářských výrobků. Inhibice patogenních a znehodnocujících mikroorganismů je způsobena buď fyzikálně (kavitací čí jinými mechanickými vlivy) nebo chemicky (vznik volných radikálů v důsledku sonochemických reakcí) (Santos et al., 2012). Šířením výkonného ultrazvuku v kapalině vznikají, důsledkem tlakových změn, kavitační bubliny. Tyto mikrobubliny se pak násilně hroutí v následných kompresních cyklech ultrazvukových vln. To má za následek vznik lokálních vysokých teplot (více neţ 5500 °C) a tlaků (aţ 50 MPa). Důsledkem toho, vzniká lokální pasterizační efekt. Účinnost ultrazvuku je závislá na druhu a mnoţství mikroorganismů a na frekvenci ultrazvukových vln. Např. rychlost inhibice kvasinky Saccharomyces cerevisiae ultrazvukem závisí na vlnové frekvenci a počátečním počtu buněk. Nejvyšší účinek byl pozorován u vyšších frekvencí a při niţším počátečním buněčném počtu (Santos et al., 2012). Využití v praxi Mimo antimikrobiální vlastnosti lze touto metodou účinně zvýšit i extrakci fenolických látek. Aplikace ultrazvuku o hodnotě 20 aţ 35 kHz zvyšuje extrakt polyfenolů z červených hroznů i semen. Zvýšený extrakt je způsoben narušením buněčných membrán a sníţením velikosti částic kvůli kolapsu kavitačních bublin (El Darra et al., 2013).

3.2.2.4 Ultrafialové záření Ultrafialové záření (UV - Ultraviolet) je pro ţivé organismy zhoubné. Jeho germicidní účinek byl prokázán i proti mikroorganismům přítomných ve víně. Proto

16

je UV záření studováno jako moţná metoda určená na inhibici mikroorganizmů, bez přílišného ovlivnění senzorických vlastností. Má podobnou inhibiční účinnost proti znehodnocujícím mikroorganismům jako SO2, a to bez ovlivnění ostatních kvalitativních parametrů (pH, kyselina vinná, obsah alkoholu). Jeho uţití by však bylo záhodno pouţít v kombinaci s menším mnoţstvím SO2 kvůli moţné oxidaci. Navíc, při testování této metody proběhly jisté barevné změny, takţe by bylo vhodné tento proces více zoptimalizovat (Fredericks et al., 2011; Falguera, 2012). Mikrobiální inhibice způsobená UV zářením (vlnová délka 254 nm) je zaloţena na přeskupení nukleových kyselin, coţ přímo zasahuje do schopnosti mikroorganismů reprodukovat se. Konečná účinnost UV záření závisí na vzhledu a vlastnostech produktu (barva, absorbance, hustota, rozpuštěné a nerozpuštěné látky), které mohou zabránit v proniknutí záření k mikroorganismům (Fredericks et al., 2011). Citlivost k UV záření je mezi mikroorganismy rozdílná (závisí na druhu, kmenu a fázi růstu kultury). Metoda je účinná proti celé řadě mikroorganismů, které se vyskytují ve víně (např. Brettanomyces sp., Saccharomyces sp., Acetobacter sp., Lactobacillus

sp.,

Pediococcus

sp.

a

Oenococcus

sp.).

Citlivost

kvasinky

Saccharomyces cerevisiae je dána kmenem. Některé studie uvádějí, ţe má zvýšenou odolnost vůči UV záření, kterou má zabudovanou přímo v DNA. Oproti bakteriím obsahují kvasinky ve svých DNA řetězcích méně pyrimidinů (thyminu a cytosinu). UV záření se zaměřuje především na změny těchto dvou nukleových bází a mikroorganismy poté nejsou schopny se reprodukovat. Proto se očekává, ţe kvasinky by měly být vůči UV záření odolnější neţ bakterie (Fredericks et al., 2011).

17

Graf 1: Efekt různých dávek UV záření na 3 druhy inokulovaných mikroorganismů (Zdroj: Fredericks et al., 2011)

3.2.2.5 Vysoký hydrostatický tlak Vysoký hydrostatický tlak (HHP - High Hydrostatic Pressure) patří mezi novější mikrobiologickou stabilizační metodu vína či moštu (Delfini et al., 1995). Tato technologie je jiţ nějaký čas součástí potravinářského průmyslu, ale u piva a vína se pouţití teprve pomalu rozšiřuje. Bylo zjištěno, ţe HPP působí destruktivně na mikroorganismy a navíc vylepšuje některé organoleptické vlastnosti jak u piva, tak u vína a to bez nepříznivého ovlivnění důleţitých kvalitativních parametrů (barva, pH a zákal). HHP má tedy obrovský potenciál, co se týká sníţení potřebné koncentrace SO2, kdy by se mohl pouţívat v kombinaci s jinými antimikrobiálními látkami (např. nisin). Tlakové hladiny pouţívané k ošetření vína se pohybují kolem 400 aţ 600 MPa (Takush, Osborne, 2011; Buzrul, 2012). Využití v praxi Pouţití HHP po dobu dvou minut, s tlakem o hodnotě 400 MPa a o počáteční teplotě moštu 20°C, je schopno usmrtit všechny mikroorganismy ve víně, i kdyţ např. kvasinka Schizosaccharomyces pombe, je schopna přeţít i při 600 MPa (Delfini et al., 1995).

18

Další studie uvádí, ţe aplikace 500 MPa po dobu 5 minut má za následek značné sníţení

populace

počáteční

mikroflóry,

jako

je

Saccharomyces

cerevisiae,

Brettanomyces bruxellensis a Oenococcus oeni, aniţ by došlo ke změně chemických nebo organoleptických vlastností vína (Santos et al., 2012). Bylo prokázáno, ţe inhibice mikroorganismů se zvyšuje s navyšujícím se tlakem a časem jeho působení a ţe aerobní bakterie jsou více citlivé neţ kvasinky a mléčné bakterie (Mok, et al., 2006).

3.2.3 Chemické látky pro omezení dávek SO2 – antioxidanty Chemické přípravky stále patří mezi nejrozšířenější metody ke sníţení dávkování SO2 během výroby vína. Z hlediska uţivatelského se chemické metody jeví jako levné a nenáročné, ovšem mnoho z nich zůstává ve finálním produktu v čisté formě či ve formě reziduí, a mohou tak představovat zdravotní či technologické riziko (Baroň, 2013b).

3.2.3.1 Kyselina Askorbová Kyselina askorbová (vitamín C) se nachází hlavně v ovoci, ale v malém mnoţství i v hroznech. V průběhu alkoholového kvašení, a kvůli počátečnímu okysličení, však rychle mizí. Hotové víno pak ţádný vitamín C neobsahuje (Ribéreau-Gayon et al., 2006; Michlovský, 2012). Tato kyselina se ve vinařství vyuţívá jiţ delší dobu jako antioxidant, z důvodu rychlého odstranění molekulárního kyslíku z moštu či vína. Proto se o kyselině askorbové a jejím isomeru, kyselině erythorbové, smýšlí jako o moţné alternativě k pouţití SO2 (Priewe, 2001; Salaha et al., 2008) a někteří vinaři ji běţně pouţívají před lahvováním namísto oxidu siřičitého (Priewe, 2001). V současnosti se pouţívá v koncentračním rozmezí 50 aţ 100 mg.l-1, vţdy v kombinaci s SO2, vyšší přídavek by mohl ovlivnit chuť vína (Ribéreau-Gayon et al., 2006). Oxid siřičitý a kyselina askorbová mají rozdílné antioxidační vlastnosti. SO2 má opoţděný, ale stabilní účinek, který trvá i v přítomnosti následného okysličení. Nedokáţe zabránit ţelezitému zákalu, který vzniká rychle po provzdušnění. Kyselina askorbová má účinek okamţitý: můţe okamţitě nahradit škodu způsobenou náhlým a intenzivním provzdušněním, ale působí pouze tak dlouho, dokud není víno v trvalém kontaktu se vzduchem. Jinak řečeno, díky své vysoké aktivitě chrání víno jen proti krátkému provzdušnění, ale uţ ne proti dlouhodobé oxidaci. Není tedy příliš účinná 19

při dlouhodobém skladování v sudech a tancích (Ribéreau-Gayon et al., 2006; Michlovský, 2012). Při jejím pouţití je nutné brát zřetel i na moţné nebezpečí její oxidace. Ta můţe nastat především v přítomnosti velkého mnoţství kyslíku (v takových podmínkách se z ní vytváří např. peroxid vodíku). Proto je důleţité správné pouţití této kyseliny, aby nebylo docíleno opačného účinku neţ byl zamýšlen. Z toho důvodu by měla být kyselina askorbová pouţita spolu s SO2, který např. peroxid vodíku dokáţe odstranit (Ribéreau-Gayon et al., 2006; Baroň, 2013b). V ideálním případě je dávkování kyseliny askorbové voleno v takové míře, ţe přesně pokryje oxidaci moštu do započetí alkoholového kvašení (Baroň, 2013b), navíc její pouţití je zásadně preventivní, jiţ naoxidované víno se kyselinou askorbovou nenapraví (Michlovský, 2012).

3.2.3.2 Fenolické sloučeniny Vzhledem k antioxidačním a antimikrobiálním vlastnostem byly fenolické sloučeniny zkoumány jako moţná náhrada za SO2. Tyto sloučeniny hrají ve víně důleţitou roli, protoţe ovlivňují jeho barvu a chuť (Santos et al., 2012). Tradiční vyuţití fenolických sloučenin spočívá v usnadnění čiření moštu nebo vína (Sonni et al., 2011), ale jejich struktura jim také umoţňuje neutralizovat volné radikály. Tyto sloučeniny pak oxidují na semichinony a chinony, zatímco kyslík je zredukovaný na hydroperoxylové radikály a peroxid vodíku. Další radikálové meziprodukty pak mohou reagovat s kyslíkem a sniţovat jeho přítomnost ve víně (Santos et al., 2012). Využití v praxi V enologii se fenolické látky pouţívají především ve formě vysokomolárních látek. Přidáním enologických taninů lze ovlivnit oxidační jevy moštů a vín. Přídavek taninů sice neovlivňuje kvasný proces (s porovnáním s víny s SO2 na tom byla vína s enologickými taniny senzoricky lépe), nicméně, při pouţití dvou různých taninů (gallotaniny a prokyanidiny) nedochází ke zlepšení barevnostních ani senzorických vlastností červeného vína. Naopak přídavek způsobil vyšší ţlutou barvu (Santos et al., 2012). Antimikrobiální účinek fenolických sloučenin se projevuje aţ po pouţití vyšších dávek. Proto je třeba zváţit případné změny, které mohou při těchto vysokých koncentracích

nastat,

např.

fyzikálně-chemické 20

(viskozita)

a

organoleptické

(barva, vůně, chuť). Ideální by bylo vyuţít antioxidačních vlastností fenolických sloučenin spolu s jinými látkami (např. nisin, dimetyldikarbonát) nebo metodami (např. UV záření, PEF). Nebo např. přídavek gallotaninu před kvašením spolu s lysozymem, coţ poslouţí jako ochrana proti bakteriím a zároveň potlačí oxidaci moštů a vín. Tímto způsobem ochrany vína navíc dojde i k ovlivnění jeho aroma (např. zvýší se koncentrace vonných esterů) (Sonni et al., 2011). Tyto různé kombinace pak vinaři poskytnou dostatečnou antioxidační a antimikrobiální aktivitu vhodnou pro výrobu vína, bez nutnosti pouţití SO2 (Sonni et al., 2009; Santos et al., 2012).

3.2.4 Chemické látky pro omezení dávek SO2 – antimikrobiální látky 3.2.4.1 Koloidní stříbro Koloidní stříbro (CSC - Colloidal Silver Complex), pro své antimikrobiální vlastnosti, se pouţívalo jiţ ve starověku. S objevem penicilinu začala éra antibiotik a tím pádem došlo k poklesu pouţívání stříbra. Jenţe díky objevu resistentních kmenů bakterií nastal opět zájem o pouţívání CSC (ve formě nanočástic) jako antimikrobiální látky. Bylo zjištěno, ţe nanomateriály s obsahem stříbra, jsou antimikrobiální k širokému spektru gramnegativních a grampozitivních bakterií. CSC má rovněţ jisté antimykotické a antivirové vlastnosti (Izquierdo-Cañas et al., 2012). Mezi nejdůleţitější mechanismy účinku CSC patří: 

příjmem volných iontů stříbra dojde k přerušení tvorby ATP a DNA replikace,



nanočástice a stříbrné ionty tvoří reaktivní formy kyslíku,



přímé poškození buněčných membrán nanočásticemi (Izquierdo-Cañas et al., 2012).

Využití v praxi Bylo dokázáno, ţe aplikace 1 g CSC na 1 kg hroznů funguje jako účinné antiseptikum, které je schopné kontrolovat vývoj octových i mléčných bakterií, zatímco rozvoj kvasinky Saccharomyces cerevisiae není narušen. Při pouţití CSC dochází také k obsahovým změnám, např. vína obsahují méně alkoholu (cukry jsou však zcela prokvašeny) a acetaldehydu při srovnání s víny, která jsou ošetřena SO2. Přítomnost CSC ve víně tedy jistým způsobem modifikuje metabolismus kvasinek, jenţ vede ke sníţené produkci alkoholu oproti vínům ošetřeným SO2, a to bez přílišných odchylek, 21

jak v chemických, tak senzorických vlastnostech (kromě jisté náchylnosti bílých vín k oxidaci) (Izquierdo-Cañas et al., 2012). CSC se ve vinařství jeví jako slibné antiseptikum, jehoţ hlavní nevýhodou je nedostatek antioxidační aktivity, který by měl být brán v potaz při jeho aplikaci (např. pouţít ho spolu s nějakou antioxidační látkou – kyselinou askorbovou nebo taniny) (Izquierdo-Cañas et al., 2012).

3.2.4.2 Kyselina sorbová Kyselina sorbová je nenasycená mastná kyselina s krátkým řetězcem, která můţe být pouţita jako konzervační prostředek, kdy spolu s SO2 ovlivňuje ţivotaschopnost buněk kvasinek a plísní tím, ţe narušuje pH homeostáze. Proti bakteriím (octovým i mléčným) má účinek menší. Dojde-li k nadměrnému nárůstu mléčných bakterií, můţe nastat rozklad kyseliny sorbové na krotonaldehyd, čímţ vzniká vada vína, tzv. vůně po pelargoniích (Divol et al., 2005; Renouf et al., 2008; König et al., 2009; Steidl, 2010a). Inhibující koncentrace pro kvasinky, ve vínech se zbytkovým cukrem, jsou niţší a závisí na obsahu alkoholu a pH. Čím je hladina pH niţší, tím se fungicidní účinnost kyseliny sorbové zvyšuje (Ribéreau-Gayon et al., 2006; Michlovský, 2012). Využití v praxi Kyselina sorbová je schopna zastavit plně kvasící mošt, ale zákonně musí být pouţita výhradně pro ochranu vín s obsahem redukujících cukrů, aby se zabránilo jejich budoucímu rozkvašení. V suchých vínech nemá ţádné vyuţití a v červených vínech můţe vyvolat (pomocí mléčných bakterií) jiţ výše zmiňované pelargoniové tóny (Ribéreau-Gayon et al., 2006). Běţně pouţívaná koncentrace je 200 mg.l-1 (Ribéreau-Gayon et al., 2006; Michlovský, 2012). Ve vínech ošetřených kyselinou sorbovou musí být zajištěna koncentrace volného SO2 mezi 30 a 40 mg.l-1 jako ochrana proti oxidaci a bakteriím. Tato koncentrace SO2 by sama o sobě nemusela být z dlouhodobého hlediska dostačující (Ribéreau-Gayon et al., 2006).

3.2.4.3 Lysozym Jde o přírodní, krystalizovanou látku, jeţ je při nízkých dávkách schopna způsobit lyze bakterií (rozpuštěním jejich buněčných stěn). Tento enzym (netoxický pro člověka) 22

se nachází ve vaječném bílku a ve víně působí zejména proti mléčným (grampozitivním) bakteriím. Na octové bakterie nemá ţádný vliv, protoţe jsou gramnegativní. Bylo zjištěno, ţe dávka vyšší neţ 4 mg.l-1 je schopna zničit téměř všechny mléčné bakterie ve víně, a to během 24 hodin od pouţití (Ribéreau-Gayon et al., 2006; Michlovský, 2012; Santos et al., 2012). Inhibice mléčných bakterií lze vyuţít pro kontrolování jejich spontánního růstu, který většinou způsobuje znehodnocení vína či váznoucí alkoholové kvašení. Navíc víno ošetřené lysozymem nevykazuje ţádnou významnou změnu ve vůni, spíše obsahuje méně těkavých kyselin a biogenních aminů. Nevýhodou můţe být alergie spotřebitelů na slepičí vejce (Santos et al., 2012) a horší stabilita bílých vín vůči bílkovinným zákalům (Michlovský, 2012). Využití v praxi Přidáním lysozymu není ovlivněna kinetika kvašení. Tato vína mají stejné analytické a senzorické parametry, za předpokladu, ţe jsou vhodným způsobem chráněna proti oxidaci – je vyţadováno pouze 30 mg.l-1 veškerého SO2 (Ribéreau-Gayon et al., 2006). Lysozym lze ve vinařském průmyslu vyuţít hlavně v daných situacích: 

ukončení obtíţně kvasícího alkoholového kvašení,



blokování jablečno-mléčného kvašení (JMK) v bílých vínech,



oddálení rozvoje mléčných bakterií a JMK v červených vínech,



mikrobiologická stabilizace vín po JMK (Ribéreau-Gayon et al., 2006; Michlovský, 2012).

Graf 2: Srovnání vývoje mléčných bakterií po ošetření SO2 a lysozymem (Zdroj: Michlovský, 2012)

23

3.2.4.4 Chitosan Chitosan, derivát z chitinu, je důleţitý bioaktivní polymer obsahující vysoké mnoţství aminoskupin. Navíc vykazuje antimykotickou aktivitu a glutamát chitosanu funguje jako účinný konzervační prostředek proti kvasinkám způsobující znehodnocení vín, takţe ho lze pouţit proti kvasinkám rodu Brettanomyces sp. (Gómez-Rivas et al., 2004; Renouf et al., 2008). Výhodou je, ţe přídavkem chitosanu, bylo prokázáno ovlivnění růstu právě kvasinek Brettanomyces sp., a nikoliv S. cerevisiae, tedy aţ na jisté prodlouţení lag-fáze alkoholového kvašení (Gómez-Rivas et al., 2004).

3.2.4.5 Vanilin Vanilin se pouţívá proti kvasinkám způsobujícím znehodnocení v ovocných šťávách a mléčných výrobcích. Inhibuje enzymy, které jsou zapojeny do výroby buněčné energie a zároveň narušuje funkčnost membrán. Citlivost k němu je však druhovou záleţitostí a některé druhy mikroorganismů jsou schopny ho dokonce přeměnit na alkohol a deriváty kyselin. Jedná se zejména o případ kvasinky Brettanomyces sp. Navíc pro efektivní antimikrobiální činnost je nutná koncentrace vanilinu 30 aţ 100 mg.l-1, coţ je 1000x vyšší koncentrace neţ v jaké se běţně vyskytuje ve vínech. Takové koncentrace pak vedou k ovlivnění aroma (Renouf et al., 2008).

3.2.4.6 Nisin Nisin je přírodní produkt získaný z bakterií Lactococcus lactis, jenţ vykazuje antimikrobiální účinnost k celé řadě grampozitivních bakterií tím, ţe tvoří póry v cytoplazmatické membráně a způsobuje tak odtok esenciálních látek. Patří mezi tzv. bakteriociny, malé polypeptidy mající inhibiční vliv na jiné druhy bakterií (Renouf et al., 2008; Santos et al., 2012). Výhoda nisinu spočívá v tom, ţe je bezbarvý, bez zápachu a není toxický – takţe by se dalo říci, ţe jde o ideální konzervační látku proti grampozitivním bakteriím. Jenţe některé kmeny bakterií mají proti jeho účinku vyšší toleranci, takţe jde spíše o okrajovou záleţitost (Renouf et al., 2008; Santos et al., 2012).

3.2.4.7 Dimetyldikarbonát Dimetyldikarbonát (DMDC) je antimikrobiální látka, jejíţ maximální inhibiční účinek nastane jiţ brzy po jejím přidání (Threlfall, Morris, 2002; Renouf et al., 2008), kdy hydrolyzuje na metylkarbonát (Ribéreau-Gayon et al., 2006). Z toho důvodu 24

by se DMDC nemělo pouţívat jako preventivní činidlo, ale pouze jako kurativní prostředek proti neţádoucím populacím, které jsou ve víně uţ přítomny. Zmíněnou vlastnost lze brát jako výhodu, protoţe po přidání DMDC je moţné mošt nebo víno znovu naočkovat ušlechtilým kmenem kvasinek, který provede alkoholové kvašení. Na druhou stranu je důleţité si uvědomit, ţe účinek DMDC je jen přechodný. Proto na zajištění sterility vína nestačí, v průběhu zrání, jen jeden přídavek (Renouf et al., 2008). Maximální povolená dávka v Evropě je 200 mg.l-1 při lahvování vín s obsahem zbytkového cukru vyšším neţ 5 g.l-1 a po přidání do vína se velmi rychle konvertuje na metanol a oxid uhličitý. Svým rozkladem vytváří ve víně netoxické a senzoricky neaktivní látky. Účinnost DMDC je závislá na kmenu mikroorganismu, počáteční koncentraci buněk, teplotě, alkoholu a pH (Threlfall, Morris, 2002; Ribéreau-Gayon et al., 2006; Costa et al., 2008; Santos et al., 2012; Michlovský, 2012; Baroň, 2013c). Využit v praxi U sladkých vín se DMDC často kombinuje za pouţití SO2. V takovém případě sniţuje DMDC potřebu k síření. Bylo zjištěno, ţe 50 mg.l-1 DMDC spolu s 25 mg.l-1 volného SO2, je dostačující pro zajištění účinné mikrobiální stability vína. Nicméně DMDC nemůţe úplně nahradit SO2, který je potřebný i jako antioxidant v moštu a během zrání vína. SO2 by se mělo přidat nejprve do moštu, pak na konci alkoholového kvašení a během zrání. Kdyţ se poté vyskytne větší mnoţství kvasinky Brettanomyces bruxellensis, tak se přidá i DMDC. Jejich vzájemné vyuţití vinařům poskytuje efektivní systém mikrobiální kontroly nad vínem (Renouf et al., 2008). 

Vliv na kvasinky

Bylo zjištěno, ţe DMDC má antimikrobiální vlastnosti a můţe, v různých fázích výroby vína, zastavit rozvoj mikroorganismů např. Brettanomyces bruxellensis, tyto kvasinky mají na svědomí vznik etylfenolů (koňský pach). DMDC ale ovlivňuje i Saccharomyces cerevisiae, čehoţ lze vyuţít, pokud je potřeba zastavit kvašení. Koncentrace 600 mg.l-1 DMDC zabrání růstu velkému mnoţství mikroorganismů, ale ty nejcitlivější kvasinky jsou inhibovány uţ při koncentracích od 50 mg.l-1. Některé divoké kvasinky vykazují vyšší stupeň odolnosti - Pichia anomala a Rhodotorula mucilaginosa, ale obecně platí, ţe odolnější jsou bakterie neţ kvasinky. Na potlačení samotné kvasinky Brettanomyces bruxellensis je dostačující koncentrace 150 mg.l-1 DMDC, na rozdíl od samostatné kvasinky S. cerevisiae, k jejíţ inhibici je potřeba 25

250 mg.l-1 DMDC. Kdyţ je ale kvasinka Saccharomyces cerevisiae naočkována spolu s jinými druhy kvasinek, alkoholové kvašení je při stejné koncentraci jen zpoţděna (Renouf et al., 2008; Santos et al., 2012). Mezi nejcitlivější kmeny kvasinek patří Zygosaccharomyces bailii (Costa et al., 2008). Jak jiţ bylo zmíněno, efekt DMDC není trvalý. Pokud se mošt znovu naočkuje kvasinkami, tak jsou schopny normálně růst. Z toho plyne, ţe jejich mikrobiální růst a fermentační aktivita není ovlivněna předchozím přidáním DMDC (Renouf et al., 2008). 

Vliv na bakterie

Mléčné a octové bakterie nejsou usmrceny ani přidáním 300 mg.l-1 DMDC. Většina divokých kmenů bakterií není tedy ovlivněna dávkou 200 mg.l-1 – coţ je maximální povolená dávka DMDC (Costa et al., 2008). Koncentrace 500 mg.l-1 DMDC je schopna zastavit JMK. V případě 150 mg.l-1 není kinetika JMK ovlivněna. Některé bakterie vykazují vyšší odolnost - Lactobacillus brevis a Lactobacillus collinoides (Costa et al., 2008; Renouf et al., 2008). 

DMDC u botrytických hroznů

Přirozená mikrobiální nestabilita těchto vín nutí vinaře pravidelně přidávat SO2 během jejich zrání, coţ vede k jeho vysokým koncentracím (aţ 400 mg.l-1) v lahvovaném víně. Právě u botrytických vín se ukázalo vhodné pouţití DMDC k zastavení alkoholového kvašení, protoţe DMDC je proti čistým kulturám kvasinek (Saccharomyces cerevisiae, Candida stellata a Zygosaccharomyces bailii) účinnější neţ SO2. Kvasinky po přidání DMDC zemřou, zatímco po přidání SO2 jsou částečně ţivotaschopné (Divol et al., 2005). Při spontánním alkoholovém kvašení botrytických moštů není DMDC tak účinný, jak by bylo potřeba. V koncentraci 200 mg.l-1 DMDC je sice účinnější neţ SO2, ale rovněţ vede k tomu, ţe některé buňky vykazují jistou ţivotaschopnost. DMDC je tedy moţné vyuţít k zastavení alkoholového kvašení, ale nemůţe plně nahradit SO2, jen sníţit potřebu jeho vyuţívání (Threlfall, Morris, 2002; Divol et al., 2005; Baroň, Bábíková, 2011).

3.2.4.8 Vyšší mastné kyseliny Oktanová (C8), dekanová (C10), a dodekanová kyselina (C12) patří do skupiny vyšších monokarboxylových nasycených mastných kyselin (HFA - High Fatty Acids), 26

které se přirozeně vyskytují v ořechu nebo mateřském mléku (Baroň, Bábíková, 2011). Vytvářejí je i kvasinky během alkoholového kvašení a zhoršují tak jeho dokončení – to vedlo k názoru, ţe by mohly být vyuţity při nahrazení či doplnění účinků SO2 ve vinařské praxi (De Felice et al., 1993; Baroň, 2009; Bábíková et al., 2012). Jejich vytvářené mnoţství během alkoholového kvašení je závislé na růstové fázi, kultivačním médiu, teplotě a pH (Garbay et al., 1995). V enologii byly studovány z důvodu jejich inhibičního vlivu na alkoholové a jablečno-mléčné kvašení jiţ před řadou let (De Felice et al., 1993; Baroň, 2009; Baroň, Bábíková, 2011). Některé HFA, především ty s dlouhým řetězcem (C16 a C18), aktivují alkoholové kvašení. Naopak jiné mastné kyseliny (ty s kratším řetězcem), zejména kyseliny C6, C8, C10, působí fungicidně (Baroň, 2009). Mechanismus této inhibice ještě není plně pochopen. Má se za to, ţe jde o pasivní difuzi mastných kyselin skrze plazmatickou membránu kvasinek, kde dochází k fatálním modifikacím speciálního uspořádání membrány. Takto postiţená kvasinka dále není schopna konvertovat glukózu na alkohol a následuje její smrt (Baroň, Bábíková, 2011). Využití v praxi Nabízí se několik moţností pro jejich pouţití, ale celková koncentrace přidaná do vína by neměla překročit 10 mg.l-1. Např. pro zastavení alkoholového kvašení sladkých vín, 150 mg.l-1 SO2 + 9 mg.l-1 mastných kyselin je stejně účinné, jako kdyţ se pouţije 250 mg.l-1 SO2. Úspora SO2 je tedy významná. Mastné kyseliny je třeba přidat 24 hodin před sířením. Za těchto podmínek SO2 způsobí převáţnou (ne-li úplnou) inhibici (Baroň, Bábíková, 2011).

Graf 3: Účinek různých koncentrací vyšších mastných kyselin na kvasinky (Zdroj: Baroň, Bábíková, 2011)

27

Velkou výhodou je, ţe mastné kyseliny přidané do vína jsou absorbovány nebo asimilovány buňkami kvasinek a jen malá část esterifikována. Sloţení mastných kyselin a jejich esterů zůstávají v normálním rozmezí, bez jakéhokoli zvýšení koncentrace těkavých sloučenin. Podíl mastných kyselin je sniţován díky jejich upevnění na těla odumřelých kvasinek. Po tomto ošetření mohou být sladká vína chráněna koncentrací volného SO2 40 mg.l-1 (Baroň, 2009; Bábíková et al., 2012). Směs HFA (C8, C10, C12 v poměru 2:7:1) nabízí optimální kombinaci pro potlačení kvasinek a mléčných bakterií (Baroň, Bábíková, 2011). C10 je toxičtější neţ C8, ale kvůli její niţší rozpustnosti se nakonec jeví jako méně toxická. Pro plazmatickou membránu jsou látky s delšími řetězci méně toxické neţ menší molekuly. Navíc, při nízkých koncentracích, mají mastné kyseliny s delšími řetězci sklon tvořit sraţeniny (Baroň, 2009; Bábíková et al., 2012). Další moţnou kombinací HFA ( C6, C8 a C10) je v dávce 3 mg.l-1od kaţdé z nich, čímţ se rovněţ dosáhne rychlého potlačení kvasinek. Kombinace HFA jsou vlastně toxičtější neţ přidání stejného mnoţství jakéhokoli kyseliny zvlášť. Mnoţství kvasinek poklesne uţ během několika dnů a degradace cukrů je tak zastavena. Po několika týdnech jsou kvasinky schopny znovu navýšit svůj počet a začít kvasit. Toto zpoţdění je pravděpodobně způsobeno jejich adaptací danému prostředí a zejména esterifikací mastných kyselin, protoţe je známo, ţe estery mají mnohem niţší inhibiční účinek neţ samotné kyseliny (Bábíková et al., 2012). Dávkování do kvasícího moštu způsobuje rychle inhibici metabolické aktivity kvasinek, jejich smrt a kompletní zastavení alkoholového kvašení. Dávkování do hotového vína funguje jako prevence proti mléčným bakteriím a sekundárnímu kvašení (Bábíková et al., 2012). Střední řetězce mastných kyselin (zejména C10) produkované kvasinkami během kvašení, působí inhibičně na mléčné bakterie. Na bakterii Oenococcus oeni toxicky nejvíce působí C10 a C12 mastné kyseliny, zejména ve svých esterifikovaných formách (Garbay et al., 1995; Guilloux-Benatier et al., 1998). Přídavek vyšších mastných kyselin můţe výrazně sníţit dávkování jiných konzervačních látek, jako jsou SO2 a kyselina sorbová. Tato metoda můţe účinně sníţit náklady na technologie, podílející se na výrobě vín se zbytkovým cukrem. Zvláště účinné je přidání většího mnoţství mastných kyselin v kombinaci se sníţenou dávkou SO2, především v takových podmínkách, kdy si vinař nemůţe dovolit pouţít drahé

28

operace, pouţívané ve větších vinařství (chlazení, sterilní filtrace). Postup vyuţívání směsí vyšších mastných kyselin sniţuje pracovní náročnost na vína se zbytkovým cukrem nebo tam, kde je potřeba zastavit činnost mléčných bakterií, odpovědných za přeměnu kyseliny jablečné na mléčnou (tento účinek je důleţitý pro udrţení čerstvosti a lepší skladovatelnosti vín hlavně jiţních zemí, kde by mohl být problém s pH). Navíc, HFA mají potenciál vyuţití i v biovinařství, kde jsou větší nároky na pouţívání niţších dávek SO2 (De Felice et al., 1993; Baroň, Bábíková, 2011; Bábíková et al., 2012).

29

4.

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

4.1

Materiál

4.1.1 Odrůda 'Marlen' Pouţitý mošt z této odrůdy pocházel z hroznů ze školní vinice, která se nachází na pozemcích

Mendelovy

univerzity,

Zahradnické

fakulty v

Lednici.

Jedná

se o interspecifickou modrou moštovou odrůdu révy vinné, která byla vyšlechtěna v České republice kříţením odrůd 'Merlan' a 'Fratava'. Odrůda dosud není zapsána ve Státní odrůdové knize, ale podle údajů z ÚKZÚZ je od roku 2001 v registračním řízení. Charakteristika odrůdy Listy: List středně velký, slabě trojlaločnatý, povrch listové čepele hladký. Řapíkový výkrojek otevřený ve tvaru písmene V. Hrozny: Hrozen menší aţ střední, válcovitý, u základu třapiny s křidélky. Uspořádání bobulí středně husté aţ řidší. Bobule: Větší, kulatá, tmavomodrá, s výrazným voskovitým ojíněním. Chuť bobule má „kabernetový― charakter. Odrůda dozrává v 1. polovině října, potřebuje svahovité umístění s dobrou expozicí ke slunečnímu záření. Velmi dobrá odolnost proti plísni révy, padlí a šedé hnilobě. Odrůdu lze pěstovat v reţimu biologického vinohradnictví s vyuţitím pomocných látek pouţívaných v tomto systému hospodaření. Aroma bobulí tvoří methoxypyraziny, které způsobují travnatou vůni (Pavloušek, 2011). Víno má rubínovou barvu, ve vůni a chuti jsou patrné tóny zelené papriky s jemnými podtóny červeného a lesního ovoce (Pavloušek, 2011).

4.1.2 Média pro mikroorganismy 4.1.2.1 Agar Patří mezi nejpouţívanější média při kultivaci mikroorganismů. Jedná se sloţitý polysacharid zhotovený z mořských řas. Dnes je dostupný v předem připravených

30

dehydrovaných médiích, coţ výrazně zkracuje čas potřebný na jeho přípravu (Fugelsang, Edwards, 2007; Bábíková, 2010). GKCH agar Tato půda je vhodná zejména pro stanovení kvasinek a plísní v potravinářských výrobcích. Složení (v 1000 ml): 5 g kvasničného autolyzátu, 20 g glukózy, 0,1 g chloramfenikolu a 11 g agaru.

MRS agar Tato půda se především vyuţívá pro stanovení bakterií, v této práci byla proto pouţita při kultivaci bakterií Zymomonas mobilis. Složení (v 1000 ml): 10 g proteázového peptonu, 10 g hovězího extraktu, 5 g kvasničného extraktu, 20 g glukózy, 1,08 g tween 80, 2 g citrátu amonného, 5 g octanu sodného, 0,2 g síranu hořečnatého, 0,05 g síranu manganatého, 5 g hydrogenfosforečnanu draselného a 15 g bakteriologického agaru.

4.1.3 Kultivované mikroorganismy 4.1.3.1 Bakterie Zymomonas mobilis Bakterie rodu Zymomonas je v mnoha směrech výjimečná. Patří mezi gramnegativní bakterie, které se běţně vyskytují v tropických oblastech, kde byly izolovány z kvasících moštů. Zde se i od pradávna vyuţívala pro přípravu přirozeně kvašených alkoholických nápojů – např. mexický nápoj pulque ze šťávy z agáve. Dnes se fermentační schopnosti této bakterie vyuţívají zejména na průmyslovou produkci alkoholu (jejich tolerance na alkohol je vysoká – aţ 16 % obj.). Stejně jako vinné kvasinky produkují během kvašení alkohol a vyuţívají přitom cukry – glukózu, fruktózu, některé kmeny i sacharózu (Čejková, 2005). Bakterie, které byly v této práci pouţity, pocházejí z České sbírky mikroorganismů z Masarykovy univerzity, Přírodovědecká fakulta – Ústav experimentální biologie.

31

4.1.3.2 Kvasinky Brettanomyces bruxellensis Z

kvasinek

způsobujících

znehodnocení

vín

jsou

Brettanomyces

sp.

pravděpodobně ty nejznámější a zároveň nejspornější. Někteří vinaři mají za to, ţe je lze povaţovat za část terroir. Často se odkazují na kořenité či zakouřené aroma místo na koňský pot či zápach po zmoklém psu. Dle většiny mikrobiologů je to rozhodně znehodnocující organismus a ţádný jeho kmen nemá na kvalitu vína pozitivní vliv (Sandler, Pinder, 2003; Jacobson, 2006; Jackson, 2008). Tato kvasinka je schopna dekarboxylovat hydroxyskořicové kyseliny na vinylfenoly, které jsou následně metabolizovány na etylfenoly. Ty sice v malém mnoţství přispívají k pozitivnímu aroma, avšak při překročení prahové koncentrace způsobují nepříjemné aromatické tóny (koňský pach) (Jacobson, 2006; Jackson, 2008). Navíc se kvasinky Brettanomyces sp. vyznačují zvýšenou odolností vůči oxidu siřičitému, alkoholu i nízké hladině cukru a mohou růst během zrání vína a dokonce i po naplnění do lahví (Grainger, Tattersall, 2005; Jacobson, 2006; Jackson, 2008; Flamini, Traldi, 2010). Kvasinka, se kterou se v této práci pracovalo, byla získána z Chemického ústavu Slovenské akademie věd. Saccharomyces cerevisiae Tato kvasinka je všeobecně uznávána jako hlavní vinná kvasinka. Jednotlivé kmeny jsou komerčně prodávány vinařům jako aktivní suché kultury pro naočkování moštu. Předpokládá se, ţe očkované kmeny S. cerevisiae přemohou a sníţí růst původních kvasinek a ovládnou průběh kvašení (Bae, 2005; Jacobson, 2006; Flamini, 2008). Kvasinka, se kterou se v této práci pracovalo, byla získána ze sbírky Ústavu vinohradnictví a vinařství Mendelovy univerzity. Zygosaccharomyces rouxii Tuto kvasinku lze nalézt i jako součást mikroflóry moštu či vína. Je schopna kvasit glukózu a maltózu za vzniku velkého mnoţství glycerolu, erytritolu, arabitolu a mannitolu. Na rozdíl od mnoha jiných kvasinek má jedinečné fyziologické vlastnosti, díky nimţ způsobuje znehodnocení produktů potravinářské průmyslu (Hühn et al., 1999; Martorell, 2005). Kvasinka Z. rouxii je vysoce osmotoleratní, vyznačuje se vyšší odolností jak proti konzervačním přísadám (např. SO2) tak proti alkoholu (nevadí ji aţ 18% obj.). Kromě toho je schopna růst i při vysokých teplotách a v širokém rozmezí hodnot pH (od pH 1,8 32

aţ 8,0) (Martorell, 2005; Fugelsang, Edwards, 2007; Rojo et al., 2013). Kvasinka, pouţitá v této práci, byla získána z České sbírky mikroorganismů z Masarykovy univerzity, Přírodovědecká fakulta – Ústav experimentální biologie.

4.1.4 Použité účinné látky 

Dimetyldikarbonát od firmy SIGMA – ALDRICH

V práci se pracovalo s maximální povolenou dávkou pro EU – 200 mg.l-1. 

Vyšší mastné kyseliny

C8 (oktanová kyselina) od firmy SIGMA – ALDRICH C10 (dekanová kyselina) od firmy SIGMA – ALDRICH C12 (dodekanová kyselina) od firmy SIGMA – ALDRICH V práci byly pouţity dvě koncentrace HFA: 10 mg.l-1 (10HFA) a 40 mg.l-1 (40HFA). Směs vyšších mastných kyselin byla naředěna v poměru 4,4:14:2 (C8:C10:C12) a byla rozpuštěna ve vodném roztoku hydroxidu draselného čili v alkalickém prostředí, coţ je povaţováno za inovativní metodu, která byla pouţita jen pro účel této diplomové práce. Mnohem běţnější je rozpuštění vyšších mastných kyselin v 96% etanolu.

4.1.5 Fyziologický roztok Byl pouţit sterilní fyziologický roztok, který se skládá z chloridu sodného a vody.

4.1.6 Laboratorní pomůcky Základem úspěšné kultivace mikroorganismů je bezesporu sterilní prostředí. Veškeré uţívané laboratorní sklo (pipety, Petriho misky, zkumavky, aj.) byly sterilizovány horkovzdušným sterilizátorem (záhřev na 180°C po dobu 20 minut). Všechny ţivné půdy byly rovněţ sterilní, toho bylo docíleno vlhkým teplem (121°C po dobu 20 minut). Dále bylo nezbytné dodrţení sterilních postupů i při očkování a práci s kulturami mikroorganismům. K tomu nejvhodněji poslouţil laminární box Biohazard typ BIO 176 (Obr. 1), jehoţ sterilita je udrţována germicidními lampami.

33

Obr. 1: Práce v laminárním boxu (Zdroj: foto vlastní)

Metody měření

4.2

4.2.1 ALPHA analyzátor Přístroj ALPHA je kompaktní FTIR analyzátor vyuţívající vzorkovací techniku ATR, která významně zjednodušuje úpravu vzorku před analýzou. Tento Analyzátor slouţí k rychlému určení mnoha kvalitativních parametrů vína, které automaticky vypočítá daný software. Mezi parametry, které přístroj měří, patří: alkohol, hustota, pH, fruktózu, glukózu, zbytkový cukr, veškeré kyseliny, kyselina octová, pH, glycerol. V práci byl pouţit jen pro orientační stanovení hladiny zbytkového cukru kvasících moštů. Kvasící vzorky moštu byly odstředěny. Před zahájením měření prvního vzorku byl přístroj důkladně propláchnut deionizovanou vodou a byl změřen slepý vzorek = deionizovaná voda. Pro analýzu byl pomocí stříkačky odebrán čirý vzorek, kterým byl systém propláchnut, na dalším odběru téhoţ vzorku jiţ bylo provedeno měření. V závislosti na pouţité kalibraci byla změřená data pomocí softwaru automaticky vyhodnocena.

34

Obr. 2: Práce na přístroji ALPHA (Zdroj: foto vlastní)

4.2.2 Kochova zřeďovací metoda Pouţití tohoto ředění (Obr. 3) je nezbytnou operací, neboť naočkovaný mošt obsahuje velké mnoţství rozmnoţených mikroorganismů a přímým výsevem na Petriho misku by výsledek nešel vyhodnotit. K přípravě jednotlivých zředění byla vţdy pouţita čistá sterilní pipeta. Postup Do nachystaných sterilních zkumavek bylo napipetováno 9 ml sterilního fyziologického roztoku. Z neředěného vzorku moštu byl napipetován 1 ml do první zkumavky. Obsah zkumavky byl dostatečně promíchán, pomocí třepačky Vortex na zkumavky, a novou sterilní pipetou odebrán 1 ml do další zkumavky; stejnou pipetou pak byl naočkován 1 ml suspenze z první zkumavky na sterilní Petriho misku a poté přelit vlaţným agarem, obr č. 4.

35

Obr. 3: Kochova zřeďovací metoda (Zdroj: Bábíková, 2010)

4.2.3 Inokulace na Petriho misky V mikrobiologii existuje několik způsobů jak očkovat na Petriho misky. V této práci se pracovalo s kvasícím moštem, a proto byla zvolena metoda očkování pipetami, kde byl odebrán 1 ml moštu do Petriho misky a následně přelit agarem (agar nesměl být horký, jinak by hrozilo zabití mikroorganismů teplem). Poté byla Petriho miska opatrně promíchána a vzorek uloţen do termostatu.

36

Obr. 4: Očkování moštu přelití agarem na Petriho misky (Zdroj: Bábíková, 2010)

4.2.4 Počítání kolonií Počítání kolonií vyrostlých na agaru je velmi spolehlivá metoda, protoţe jejím výsledkem jsou kolonie tvořící jednotky (CFU - Colony-Forming Unit). Nutné je zvolit

37

vhodné ředění, aby šly narostlé kolonie spočítat. V práci byly tyto kolonie počítány s pomocí počítadla.

4.3

Postup práce Z mrazáku byl odebrán mošt odrůdy 'Marlen' a následně rozmraţen horkou vodou

ve vodní lázni. Odrůda nebyla vybrána cíleně, její mošt byl pouze k dispozici na Ústavu vinohradnictví a vinařství s ohledem na termín pokusu. Poté byl mošt rozdělen do osmi lahviček (pro kaţdý mikroorganismus zvlášť) o objemu 250 ml: 

2x mošt (kontrola – bez přídavku inhibiční látky)



2x mošt (+ pozdější přídavek 200 mg.l-1 DMDC)



2x mošt (+ pozdější přídavek 10 mg.l-1 HFA)



2x mošt (+ pozdější přídavek 40 mg.l-1 HFA)

Bylo pracováno se dvěma opakováními (jejich výsledky pak byly zprůměrovány), aby bylo docíleno většího mnoţství dat a tím pádem i přesnějších výsledků. Do kaţdé lahvičky bylo napipetováno 125 ml moštu a v Papinovém hrnci byly všechny lahvičky vysterilizovány. Průběţně byl připraven zákvas daného mikroorganismu: Zygosaccharomyces rouxii 

kvasinka byla přenesena z lyofilizované kultury na agar GKCH, poté byla naočkována do sterilního moštu. Po rozkvašení bylo po 5 ml odebráno do 8 vysterilizovaných lahviček.

Saccharomyces cerevisiae 

kultura byla kultivována ve zkumavce na šikmém agaru. Sterilní kličkou byla část odebrána na zákvas. Po jeho rozkvašení bylo po 5 ml odebráno do 8 vysterilizovaných lahviček.

Zymomonas mobilis 

kultura byla kultivována ve zkumavce na šikmém agaru. Sterilní kličkou byla část odebrána na zákvas. Po jeho rozkvašení bylo po 5 ml odebráno do 8 vysterilizovaných lahviček.

Brettanomyces bruxellensis 

kvasinku se nedařilo ve sterilním moštu (ani víně či ve směsi moštu a vína) řádně nakultivovat, proto byla (po dohodě s vedoucím práce)

38

suspendována ve fyziologickém roztoku. Následně bylo napipetováno 10 ml fyziologického roztoku s kvasinkou do osmi sterilních zkumavek. Poté byly na přístroji APLHA měřeny cukry. Kvasinka Zygosaccharomyces rouxii kvasila velmi pomalu a ukázala se jako velmi fruktofilní. Zkvasila téměř veškerou fruktózu a poté se kvašení samovolně zastavilo na hodnotách kolem 110–120 g.l-1 zbytkové cukru (kdy zůstala hlavně glukóza). Pokus byl tedy opakován a inhibiční látky tam byly napipetovány ihned, jakmile se mikroorganismus začal mnoţit, aby znovu nedošlo k předčasnému zastavení kvašení. U kvasinky Saccharomyces cerevisiae byly inhibiční látky přidány při naměřených hodnotách 50–60 g.l-1 zbytkového cukru, čili ke konci stacionární fáze růstu, neboť kvašení probíhalo v ideálních podmínkách. Stejně tak bylo postupováno i s bakterií Zymomonas mobilis. Pipetování inhibitorů do fyziologického roztoku s kvasinkou Brettanomyces bruxellensis proběhlo ihned bez předchozí analýzy. Následně po napipetování inhibičních látek byl kaţdý vzorek ponechán 24 hodin při 25°C. Následující den byly jednotlivé lahvičky (či zkumavky, v případě B. bruxellensis) přeneseny do laminárního boxu, kde byly vzorky vhodně naředěny Kochovou zřeďovací metodou (Obr. 3). V ředění bylo pokračováno a z kaţdého ředění byly připraveny 2 Petriho misky, a to z důvodu větší přesnosti měření (v konečném výsledku byl poté z kaţdého ředění vytvořen průměr). Petriho misky s agarem byly označeny hodnotou ředění a datem inokulace. Petriho misky byly inkubovány dnem vzhůru a obaleny potravinovou folií (čímţ dochází k minimalizaci kontaminace agaru mikroorganismy ze vzduchu a navíc dojde k omezení výparu) v termostatu při teplotě 25°C po dobu 3–4 dny. Za tuto dobu vyklíčila z kaţdé ţivotaschopné buňky dobře viditelná kolonie. Tyto jednotlivé kolonie byly spočítány s pomocí elektronického počítadla a získané hodnoty zaznamenány. Poté byl pokus zaloţen znovu v pravidelných intervalech (3–4 dnů), stejným způsobem jak je uvedeno výše, aţ do té doby neţ bylo získáno vyuţitelné mnoţství údajů.

39

5.

VÝSLEDKY

5.1

Kolonie tvořící jednotky Veškeré vyrostlé mikroorganismy, které byly počítány na Petriho miskách, jsou

uvedeny níţe v tabulkách (Tab. 2-5). Tyto tabulky dále slouţily jako výchozí data pro vytvoření grafů.

Tab. 2: Počet CFU Zygosaccharomyces rouxii vyrostlých na Petriho miskách Počet CFU v 1 ml (log10) Inhibiční látka

Datum inokulace Kontrola DMDC 5

10

8

10

4

10

17.5.2013

10

20.5.2013

10

24.5.2013

10

10HFA*

2

10

6

10

3

10

40HFA**

4

10

2

4

10

2

10

2

1

*10HFA = 10 mg.l-1 vyšších mastných kyselin **40HFA = 40 mg.l-1 vyšších mastných kyselin

Tab. 3: Počet CFU Brettanomyces bruxellensis vyrostlých na Petriho miskách Počet CFU v 1 ml (log10) Inhibiční látka

Datum inokulace Kontrola DMDC

10HFA*

3

0

10

4

0

10

6

0

10

4.6.2013

10

7.6.2013

10

10.6.2013

10

*10HFA = 10 mg.l-1 vyšších mastných kyselin **40HFA = 40 mg.l-1 vyšších mastných kyselin

40

40HFA**

2

10

1

2

10

1

0

1

Tab. 4: Počet CFU Zymomonas mobilis vyrostlých na Petriho miskách Počet CFU v 1 ml (log10) Inhibiční látka

Datum inokulace kontrola DMDC 5

10

6

4

7.6.2013

10

10.6.2013

10

13.6.2013

10

10HFA*

2

10

10

1

10

0

10

40HFA**

4

10

2

3

10

2

10

2

1

*10HFA = 10 mg.l-1 vyšších mastných kyselin **40HFA = 40 mg.l-1 vyšších mastných kyselin

Tab. 5: Počet CFU Saccharomyces cerevisiae vyrostlých na Petriho miskách Počet CFU v 1 ml (log10) Inhibiční látka

Datum inokulace kontrola DMDC 7

10

4

1

18.6.2013

10

21.6.2013

10

24.6.2013

10

10HFA*

1

10

10

1

10

0

10

40HFA**

4

10

4

2

10

1

0

1

*10HFA = 10 mg.l-1 vyšších mastných kyselin **40HFA = 40 mg.l-1 vyšších mastných kyselin

5.2

Vliv inhibičních látek na mikroorganismy

5.2.1 Zygosaccharomyces rouxii Citlivost této kvasinky na pouţité inhibiční látky lze vyčíst z grafu 4 dole, kdy pokles ţivotaschopných buněk je znatelný hned po jednom dnu od aplikace inhibiční látky. Nejvíce byl ovlivněn vzorek (v porovnání s kontrolou) se 40 mg.l-1 HFA, téměř srovnatelně s DMDC, kdy počet buněk poklesl z 105 na 102–103. U varianty 10 mg.l-1 HFA byl inhibiční vliv taktéţ patrný i kdyţ ne v takové míře.

41

Mnohem zajímavější je vývoj ze 4. dne pozorování od přidání inhibitorů, kdy zatímco vliv vyšších mastných kyselin stoupal a potlačil další rozmnoţování kvasinky, tak u DMDC tomu bylo naopak. Jeho vliv klesl, protoţe kvasinka Zygosaccharomyces rouxii původní koncentraci zdatně odolala a znovu se rozmnoţila z 103 na 107. I při pohledu na koncentraci 10 mg.l-1 HFA je jasné, ţe jde o vcelku zdatný a odolný mikroorganismus, protoţe i po 4 dnech od aplikace jsou hodnoty srovnatelné s prvním dnem. Sedmý den pozorování od přídavku inhibitorů došlo k rapidnímu sníţení mnoţství i u kontrolního vzorku, z toho lze vyvodit, ţe kvasinka se dostala do své poslední vývojové fáze a pouze „dokvášela―; její růstový cyklus končil. Z grafu 4 je jasné, ţe největší inhibiční vliv měly na kvasinku Zygosaccharomyces rouxii vyšší koncentrace mastných kyselin (40 mg.l-1).

Graf 4: Citlivost Z. rouxii ke 200 mg.l-1 DMDC, 10 mg.l-1 a 40 mg.l-1 HFA

Vývoj této odolné kvasinky lze pozorovat na grafu 5, který je uveden níţe. Na grafu je vidět jasný vliv mastných kyselin na celkový průběh růstové křivky, okamţité potlačení a znatelný pokles mikroorganismu, a tudíţ i zastavení alkoholového kvašení. Oproti tomu je v tomto případě efekt DMDC pouze brzdícího rázu, kdy došlo ke zpomalení rozvoje kvasinky a její vývoj byl jen opoţděn. 42

Graf 5: Růstová křivka Z. rouxii a její ovlivnění inhibičními látkami

5.2.2 Brettanomyces bruxellensis Z grafu 6 je zřejmé, ţe kvasinka Brettanomyces bruxellensis se jeví jako velmi citlivá k DMDC, protoţe celá populace (u kontrolního vzorku činila 103 CFU.ml-1) byla eliminována maximální povolenou dávkou, tj. 200 mg.l-1. I mastné kyseliny (v obou koncentracích) prokazovaly vyšší účinnost proti této kvasince a jejich rozvoj byl potlačen, dalo by se říci, ţe ihned po jejich přidání, jak lze pozorovat na grafu 6. Tyto výsledky mohou být ovlivněny tím, ţe kvasinka B. bruxellensis byla rozmnoţena ve fyziologickém roztoku, místo ve víně a byla testována v malém objemu.

Graf 6: Citlivost B. bruxellensis ke 200 mg.l-1 DMDC, 10 mg.l-1 a 40 mg.l-1 HFA

43

Vývoj této kvasinky probíhal následovně (viz Graf 7) – kontrola exponenciálně rostla (kultuře se ve fyziologickém roztoku bezesporu dařilo), kdeţto veškeré koncentrace inhibičních látek jejich vývoj rapidně utlumily a nakonec i úplně zastavily.

Graf 7: Růstová křivka B. bruxellensis a její ovlivnění inhibičními látkami

5.2.3 Zymomonas mobilis Podobných výsledků bylo dosaţeno i u bakterie Zymomonas mobilis. Kdy DMDC zabralo okamţitě, takţe citlivost bakterie k této látce je zřejmá. U koncentrace 10 mg.l-1 HFA rovněţ došlo k okamţitému potlačení ţivotaschopných buněk, kdyţ inhibiční pokles při jednotlivých pozorováních probíhal exponenciálně. Účinnost vyšší koncentrace mastných kyselin (40 mg.l-1) byla znovu prokázána, a to hned několikanásobným inhibičním efektem oproti niţší koncentraci HFA. Vše je zobrazeno na grafu 8 dole.

44

Graf 8: Citlivost Z. mobilis ke 200 mg.l-1 DMDC, 10 mg.l-1 a 40 mg.l-1 HFA

Z růstové křivky bakterie Zymomonas mobilis (viz Graf 9) vyplývá, ţe veškeré testované inhibiční látky měly značný vliv na vývoj toho mikroorganismu. DMDC vývoj této bakterie okamţitě utlumil (z počtu buněk 106 byl pozorován pokles na 102), nejméně zapůsobil účinek 10 mg.l-1 HFA. Ovšem při porovnání s kontrolou, u které během několika dnů proběhl celý kvasný proces, byl i u této varianty pozorován jednoznačný inhibiční účinek a počet mrtvých buněk neustále narůstal.

Graf 9: Růstová křivka Z. mobilis a její ovlivnění inhibičními látkami

45

5.2.4 Saccharomyces cerevisiae Z grafu 10 lze vypozorovat, ţe inhibiční látky byly přidány ke konci alkoholového kvašení. Vliv DMDC na kvasinku Saccharomyces cerevisiae je zjevný a hned po přidání látky došlo k jejímu velkému poklesu. Takţe k zastavení alkoholového kvašení došlo hned po 1. dnu od přidání. Pokles kvasinky je zřetelný i u přídavku mastných kyselin, i kdyţ ne tak obrovský, jako u DMDC. Účinek těchto látek na kvasinku Saccharomyces cerevisiae je zde ovlivněn i přirozenou smrtí tohoto mikroorganismu, díky vlivu pokročilejší fáze alkoholového kvašení, a tudíţ i vyšší koncentraci alkoholu. I přesto je zřejmé, ţe k zastavení kvašení dochází mnohem dříve, neţ je tomu u přirozeného průběhu alkoholového kvašení.

Graf 10: Citlivost S. cerevisiae ke 200 mg.l-1 DMDC, 10 mg.l-1 a 40 mg.l-1 HFA

Vyšší mastné kyseliny kopírovaly průběh růstové křivky kontrolního vzorku jen s větším počtem umírajících kvasinek – končila stacionární fáze alkoholového kvašení a začala fáze úmrtnosti. Kdyţ bylo v této fázi alkoholového kvašení pouţito DMDC, tak klesl počet ţivotaschopných mikroorganismů na minimum; tento trend byl zachován i po zbytek kvasného procesu, jak je znázorněno dole na grafu 11.

46

Graf 11: Růstová křivka S. cerevisiae a její ovlivnění inhibičními látkami

5.3

Úmrtnost mikroorganismů Úmrtnost jednotlivých mikroorganismů byla vyjádřena v procentech, ve kterých

se vycházelo z toho, ţe 100% je počet mikroorganismů v kontrolním vzorku.

5.3.1 Vyšší mastné kyseliny - 10 mg.l-1 Exponenciální inhibiční vliv je patrný u všech zkoušených mikroorganismů (Graf 12). Čili, kaţdým dnem stoupalo mnoţství mrtvých mikroorganismů. Jako nejvíce citlivé se projevily kvasinky Brettanomyces bruxellensis a Saccharomyces cerevisiae, kdy zahynulo 40–50 % veškeré ţivotaschopné populace hned po prvním dnu od přidání. Jako nejvíce odolná se ukázala kvasinka Zygosaccharomyces rouxii, kdy sedmý zkoumaný den bylo potlačeno téměř stejné mnoţství populace jako první den u kvasinky Brettanomyces bruxellensis.

47

Graf 12: Úmrtnost jednotlivých mikroorganismů vyjádřena v procentech

5.3.2 Vyšší mastné kyseliny - 40 mg.l-1 Vyšší koncentraci mastných kyselin nedokázaly mikroorganismy dlouho odolávat a hned první den od aplikace jich značná část zahynula. Nejvíce odolná se zpočátku jevila kvasinka Saccharomyces cerevisiae, které zahynulo „pouhých― 45 %. Ostatní mikroorganismy byly znatelně citlivější a jejich populace byla sníţena o 65–75 %. O vysokém inhibičním vlivu nebylo pochyb, neboť jiţ třetí den od aplikace byla dosaţena hranice 90 % úmrtnosti téměř u všech testovaných mikroorganismů (viz Graf 13).

Graf 13: Úmrtnost jednotlivých mikroorganismů vyjádřena v procentech

48

5.3.3 DMDC - 200 mg.l-1 Okamţitý účinek této látky lze pozorovat na grafu 14 dole, kde došlo u všech testovaných mikroorganismů k jasnému potlačení ţivotaschopných buněk hned po prvním dnu od aplikace. U tří zkoušených druhů (Brettanomyces bruxellensis, Zymomonas mobilis a Saccharomyces cerevisiae) byly populace znatelně inhibovány, zahynulo jich více neţ 90 %. Jen kvasinka Zygosaccharomyces rouxii prokázala jistou odolnost a zahynulo „pouhých― 50 % populace. Další dny potvrdily stejný trend ve vývoji jako první den od aplikace DMDC, kdy kromě kvasinky Zygosaccharomyces rouxii nebyl ţádný zkoušený mikroorganismus (na maximální povolenou dávku 200 mg.l-1 DMDC) dosti odolný a nevznikly ţádné nové populace. Z grafu 14 je vidět, ţe se kvasinka Zygosaccharomyces rouxii s postupem času začala opět mnoţit.

Graf 14: Úmrtnost jednotlivých mikroorganismů v procentech

49

6.

DISKUZE Tato práce se zabývala jednou z nejdiskutovatelnějších problematik ve vinařském

průmyslu – pouţitím oxidu siřičitého, omezováním jeho dávek a hledáním náhradních metod za něj. Existuje spousta názorů, ţe nejde vytvořit víno bez SO2, tak jako existují názory, ţe SO2 se do vína přidávat nemusí. Práce se zabývala zpracováním dostupné literatury k této problematice a zjištěním náhradních metod k síření. Konkrétně byly v této práci testovány mikroorganismy, ty které lze nalézt v prostředí moštu či vína, a sledovala se jejich odolnost (či citlivost) na dvě chemické látky, jeţ vykazují potenciál minimálně sníţit pouţívaní koncentrace SO2. Jednou ze zkoumaných látek je DMDC. Jejím působením ve víně se zabývali jiţ v minulosti,

jak

uvádí

Ough

(1975),

kdy

se

o

DMDC

uvaţovalo

jako

o moţném inhibitoru kvasinek. S touto myšlenkou jde rozhodně souhlasit, protoţe výsledky provedeného pokusu jasně naznačily inhibiční činnost, jak proti kvasince Saccharomyces cerevisiae, tak Brettanomyces bruxellensis. Účinnost této látky na mikroorganismy byla v minulosti potvrzena nejedním pokusem. Renouf et al. (2008) uvádí, ţe na odstranění kvasinky Brettanomyces bruxellensis je potřeba minimální koncentrace 150 mg.l-1 DMDC. S tímto tvrzením lze souhlasit, neboť v práci byla pouţita dávka 200 mg.l-1 DMDC, a ta okamţitě po pouţití zastavila mnoţení těchto škodlivých kvasinek (viz kapitola Výsledky – Grafy 6, 7 a 14). Costa et al. (2008) dokonce zjistil, ţe na tuto neţádoucí kvasinku postačí koncentrace pouhých 50 aţ 100 mg.l-1 DMDC, ke stejným závěrům došli i Threlfall a Morris (2002). Costa et al. (2008) navíc uvádí, ţe účinnost DMDC na kvasinku Brettanomyces bruxellensis nastupuje během pár hodin po pouţití a jejich populace klesne z 106–107 aţ na 102–103, s tímto tvrzením se lze ztotoţnit, protoţe po 24 hodinách od aplikace DMDC byla veškerá populace (103) úplně zničena. I Baroň (2013c) potvrzuje hypotézu, ţe účinek DMDC je po aplikaci v podstatě okamţitý, ošetřené víno začne po aplikaci rapidně ztrácet zákal a kolonie kvasinek rychle sedimentují na dně nádoby. U kvasinky Saccharomyces cerevisiae Renouf et al. (2008) doporučuje pouţít 100–200 mg.l-1 DMDC dle kmene kvasinky. I toto tvrzení bylo potvrzeno, protoţe pouţitá dávka 200 mg.l-1 sníţila populaci kvasinek na takové mnoţství, ţe po několika dnech od pouţití se přestaly mnoţit. Z toho plyne, ţe při pouţití ke konci alkoholového kvašení lze docílit jeho zastavení a díky tomu vyrobit víno se zbytkovým cukrem, aniţ 50

by se musel pouţít oxid siřičitý (tak jak je tomu ve většině případů běţné, protoţe malovinaři nemají jiné moţnosti jak kvašení zastavit). Ke stejným závěrům dospěli i Baroň a Bábíková (2011), kdy zjistili, ţe při pouţití různých dávek DMDC přestávají kvasinky přeměňovat cukry a z toho vyplývá, ţe dochází k zastavení alkoholového kvašení. Costa el al. (2008) zjistil, ţe 100 mg.l-1 DMDC stačí na inhibici populace 103 kvasinky Saccharomyces cerevisiae, ale při populaci vyšší neţ 106 je třeba aţ 300 mg.l-1. K podobným výsledkům dospěl uţ i Ough (1975) kdy populaci pod 101 inhibuje jiţ 60 mg.l-1 DMDC. V pokusu této práce byla proti kvasince Saccharomyces cerevisiae pouţita dávka 200 mg.l-1 DMDC v poslední růstové fázi kvasinky – fázi umírání. V těchto podmínkách DMDC zaúčinkovalo i na velikost populace 107, kdy alkoholové kvašení bylo zastaveno, neboť došlo k úbytku populace na 103. K tomu došlo i díky tomu, ţe na konci kvašení je jiţ koncentrace vytvořeného alkoholu pro kvasinky toxická a účinek DMDC tak byl ještě podpořen. Je tedy jasné, ţe účinnost DMDC závisí nejenom na velikosti populace mikroorganismu, ale i na momentu přidání DMDC do kvasícího moštu. Při pouţití na začátku nebo na konci kvašení bude mít jiný inhibiční účinek neţ při pouţití „v bouřlivé fázi kvašení―. Kvasinky rodu Zygosaccharomyces sp. prokazují vyšší odolnost a inhibiční vliv na ně má aţ dávka okolo 250 mg.l-1 DMDC, jak tvrdí Renouf et al. (2008). To znamená, ţe maximální povolená dávka 200 mg.l-1 nemusí být k jejich potlačení dostačující. V této práci byl pouţit kmen Zygosaccharomyces rouxii, který se po pouţití této dávky rychle vzpamatoval a poměrně rychle narůstal na počet 107. Rovněţ Divol et al. (2005), jenţ zkoumal DMDC především jako konzervant před lahvováním, tvrdí ţe koncentrace 200 mg.l-1 je dostačující i na kvasinku Zygosaccharomyces bailii, jeţ má na svědomí znovu rozkvašení jiţ nalahvovaných vín, která je jinak k ostatním faktorům dosti odolná (alkohol i SO2). Účinek DMDC na Zygosaccharomyces sp. zkoumal i Costa et al. (2008) a uvádí tuto kvasinku jako velmi citlivou, coţ si odporuje s tvrzením Divol et al. (2005) či Renouf et al. (2008). Costa et al. (2008) totiţ nezdůraznil fakt, ţe pracoval s velikostí populace 103, kde mu stačilo na její potlačení pouhých 25 mg.l-1 DMDC. Ovšem při vyšším populačním počtu (106) je potřeba minimální koncentrace 150– 200 mg.l-1, coţ odpovídá i výsledkům této diplomové práce, kdy sice došlo ke sníţení populace z 105 na 103, ale kvasinka se opět rychle rozmnoţila aţ na populaci téměř 107.

51

Dále byl v práci zkoumán vliv vyšších mastných kyselin na inhibici mikroorganismů. Tyto kyseliny vytváří i kvasinka Saccharomyces cerevisiae během alkoholového kvašení, jak uvádí Guilloux-Benatier (1998). Konkrétně syntetizují C10 a C12 mastné kyseliny a zhoršují tak dokončení alkoholového kvašení. Jejich vytvářené mnoţství je dle Garbay et al. (1995) závislé na růstové fázi, kultivačním médiu, teplotě a pH. Z toho důvodu se o nich začalo uvaţovat jako o inhibitorech tohoto procesu, tvrdí Baroň (2009). Sá-Correia a Van Uden (1983) zjistili, ţe dávky dostatečné k potlačení mikroorganismů se mění v závislosti na druhu kvasinek, např. Kluyveromyces marxianus jsou méně citlivé neţ Saccharomyces cerevisiae. Toto tvrzení lze potvrdit, protoţe výsledky ukázaly rozdílné vlivy na různé mikroorganismy. Např. koncentrace 10 mg.l-1 vyšších mastných kyselin byla účinnější proti kvasince Brettanomyces bruxellensis, v porovnání počtu mrtvých buněk, neţ proti ostatním zkoušeným druhům (viz kapitola Výsledky – Graf 12). Ovšem v souhrnu lze konstatovat, ţe inhibiční efekt byl prokázán u všech zkoušených druhů, jen s tím rozdílem, ţe se kaţdý z nich se bránil proti vlivu mastných kyselin různou dobu. Vyšším dávkám těchto kyselin nedokázal vzdorovat ani jeden zkoušený mikroorganismus (viz kapitola Výsledky – Graf 13). Hned první den od jejich aplikace vykazuje srovnatelný inhibiční účinek jako sedmý den od aplikace niţší dávky. Ovšem je nutno uvést, ţe tyto vysoké dávky (40 mg.l-1), které prokazovaly velmi silný inhibiční účinek, se nedoporučuje pouţívat, neboť Baroň a Bábíková (2011) konstatují, ţe pouţití dávek vyšších neţ 10 mg.l-1 způsobuje negativní senzorické ovlivnění vína. V práci byla pouţita stejná směs vyšších mastných kyselin, se kterou pracovali Baroň a Bábíková (2011) jen s tím rozdílem, ţe jejich směs byla rozpuštěna v etanolu, kdeţto směs v této práci byla rozpuštěna ve vodném roztoku hydroxidu draselného. Účinnost směsi se tak potvrdila, i kdyţ s mírnou odlišností. To bylo dáno především tím, ţe Baroň a Bábíková (2011) pracovali ve větších objemech, kdeţto v této práci se pracovalo s menším mnoţstvím moštu, coţ činilo jeho promíchání s mastnými kyselinami snadnější. Navíc podstatou této práce bylo zaměření se na jednotlivé mikroorganismy (pracovalo se v přísně aseptických podmínkách). Proto se v praxi mohou výsledky mírně lišit, v moštu je totiţ v jeden okamţik vţdycky několik mikroorganismů a je tu tedy i jistý vliv jejich spolupůsobení.

52

Bábíková et al. (2012) tvrdí, ţe přídavek vyšších mastných kyselin můţe výrazně sníţit dávkování jiných konzervačních látek (např. SO2) a podle výsledků této práce s tím nelze nesouhlasit.

53

7.

ZÁVĚR Výsledky DMDC jsou naprosto jednoznačné a jeho inhibiční účinnost je opravdu

vysoká. V práci byl potvrzen jeho destruktivní vliv hned na několik mikroorganismů, ale jeho jedinou komplikací se můţe stát maximální povolená dávka. V práci sice fungovala

nadmíru

uspokojivě

(nedokázala

si

poradit

jen

s kvasinkou

Zygosaccharomyces rouxii, ale tento rod kvasinek je znám svou vysokou odolností téměř ke všemu), ale pracovalo se s menšími objemy (nebyl tedy problém mošt řádně promíchat) a navíc se pracovalo proti kaţdému mikroorganismu zvlášť. V praxi se v moštu vyskytují spletité kombinace různých mikroorganismů a účinnost DMDC by tak mohla být mírně odlišná. Otazník visící nad tím, jestli bude dávka účinná se týká jen Evropské unie, kde je maximální moţný limit ve víně omezen na 200 mg.l-1. Oproti tomu v Americe se tato konzervační látka pouţívá běţně, a to v mnohem vyšších dávkách (aţ 1000 mg.l-1). Tato skutečnost jeho uţívání v EU do jisté míry limituje. Ovšem i přesto si lze DMDC představit jako velmi účinnou pomoc při výrobě vín se zbytkovým cukrem či jeho vyuţití při lahvování jako sterilizátor, především v kombinaci s niţší dávkou SO2, kdy proti nepříznivým oxidačním vlivům by byl chráněn antioxidační činností SO2 a proti neţádoucí mikroflóře DMDC. Další testovou látkou byla směs vyšších mastných kyselin. O jejich inhibičních vlastnostech se ví jiţ řadu let, ale aţ pracovníci na Mendelově univerzitě přišli s konkrétní směsí, která vykazuje skvělé inhibiční vlastnosti. 10 mg.l-1 této směsi (maximální doporučená dávka) stačí na potlačení neţádoucí mikroflóry – lze ji tak vyuţít u neţádoucích kvasinek Brettanomyces bruxellensis či Zygosaccharomyces sp. nebo při zastavování alkoholového kvašení, protoţe přídavek v závěrečné fázi značně zdecimoval kvasinky, jeţ vedly alkoholové kvašení. Při srovnání DMDC (200 mg.l-1) a HFA (10 mg.l-1) mluví ve prospěch DMDC jeho vysoký inhibiční vliv. Na druhou stranu při uţívání HFA je důleţité si uvědomit, ţe jde o směs látek, které se v niţších koncentracích běţně vyskytují v přírodě, kdeţto DMDC je „pouze― další chemikálie vkládaná do vína. Navíc účinek DMDC po čase vyprchá, a kdyţ nebude potlačena značná populace mikroorganismů, tak u nich hrozí nebezpečí, ţe se ve vhodných podmínkách znovu rozmnoţí, kdeţto účinek HFA je mnohem stálejší. Zároveň je nutné uvést, ţe HFA jsou jako konzervační látky pouze ve fázi testování. V běţné vinařské praxi se s nimi není moţné setkat, ale v současnosti se – na Ústavu vinohradnictví

54

a vinařství Mendelovy univerzity – podnikají kroky k uvedení těchto látek mezi povolené přípravky. Z výše uvedených poznatků plyne, ţe částečné nahrazení SO2 je moţné, zvláště v kombinaci s jinými ošetřujícími látkami – na zbavení se neţádoucí mikroflóry. Ovšem plné nahrazení není v dnešní době moc reálné, vzhledem k jeho unikátním vlastnostem v kombinaci s nízkou cenou a zaţitou tradicí jeho aplikace. Z pohledu dalšího testování bylo by zajímavé vyzkoušet vyšší mastné kyseliny ve spolupráci s některou antioxidační látkou, čímţ by se síření v podstatě omezilo na minimum (např. zkoumat kyselinu askorbovou, či fenolické látky v kombinaci s HFA) a následné senzorické zhodnocení takto ošetřených vín.

55

8.

SOUHRN Tato práce byla zaměřena na hledání chemických látek a dalších metod, které jsou

schopny sníţit či nahradit dávky oxidu siřičitého ve vinařském průmyslu. Úvodní část práce byla věnována čistě oxidu siřičitému, jeho specifickým vlastnostem a formám, se kterými se lze setkat ve vinařské praxi či způsobu jeho konkrétní aplikace. Dále bylo zpracováno četné mnoţství literárních zdrojů s různými komplementárními metodami a vytvořen jejich přehled. Jedná se o metody, které uţ byly dříve testovány a které vykazují jistý potenciál ve sniţování dávek síření během výroby vína. Konkrétně se jedná o zajímavé fyzikální metody, ale především byly popsány chemické látky různých vlastností a struktur. Hlavní podstatou práce bylo zpracování experimentu, ve kterém byly zkoumány dvě chemické látky na omezení dávek SO2 – dimetyldikarbonát a vyšší mastné kyseliny. Samotný experiment byl postaven na inhibici čtyř zkoušených mikroorganismů v kvasícím moštu odrůdy 'Marlen' a ve fyziologickém roztoku (jen v případě kvasinky Brettanomyces bruxellensis). Výstupem experimentu bylo počítání vyrostlých kolonií na Petriho miskách a následné grafické znázornění citlivosti těchto mikroorganismů ke dvěma výše zmíněným látkám.

Klíčová slova: oxid siřičitý, mikroorganismy, inhibice, vyšší mastné kyseliny, DMDC

56

9.

RESUME This thesis was focused to finding chemicals an other methods that are able to

reduce or replace the dose of sulfur dioxide in the wine industry. Introductory chapters deal with sulfur dioxide - its specific characteristics and forms which can be used in wine practice and way of its particular application. It was also processed a large number of literary resources with different complementary methods and provide an overview. Methods, described in this thesis, have been previously tested and they had some potential in reducing sulfur dioxide doses during the production of wine. Thesis mainly describes the interesting physical methods but the most important part of this thesis is description of chemicals with different properties and structures. The main essence of this work was experiment which studied two chemicals to reduce the doses of SO2 – dimethyldicarbonate and higher fatty acids. The actual experiment was based on the inhibition of the four tested microorganisms in fermenting must of variety 'Marlen' and in saline (only in the case of Brettanomyces bruxellensis). Its output was counting the colonies grown on Petri dishes followed by consequential graphical demonstration of the sensitivity these microorganisms to dimethyldicarbonate and higher fatty acids.

Keywords: sulfur dioxide, microorganism, inhibition, higher fatty acids, DMDC

57

10. POUŽITÁ LITERATURA BAE, S. S. 2005: Investigation of bacteria associated with Australian wine grapes using cultural and molecular methods. Sydney. pp. 211. Thesis on University of New South Wales. BAROŇ, M. 2009: Možnost rapidního zvýšení účinnosti oxidu siřičitého pomocí C8 a C10 mastných kyselin. Vinařský obzor, vol. 102, no. 11, pp. 509-510. ISSN 12127884. BAROŇ, M. 2013a: Možnosti snížení obsahu oxidu siřičitého ve víně, část II. Vinařský obzor, vol. 106, no. 9, pp. 456-458. ISSN 1212-7884. BAROŇ, M. 2013b: Možnosti snížení obsahu oxidu siřičitého ve víně, část 3. Vinařský obzor, vol. 106, no. 10, pp. 509-511. ISSN 1212-7884. BAROŇ, M. 2013c: Nový pomocník při výrobě vína: Dimetyldikarbonát. Vinařský obzor, vol. 106, no. 11, pp. 570-572. ISSN 1212-7884. BAROŇ, M.; BÁBÍKOVÁ, P. 2011: Saturated higher fatty acids as a means of inhibiting alcoholic fermentation and sulphur dioxide reduction in wine. Mitteilungen Klosterneuburg,. vol. 61, no. 3, pp. 158-166. ISSN 0007-5922. BÁBÍKOVÁ, P. 2010: Vinařská mikrobiologie - pracovní sešit. 1. vyd. Brno: Mendelova univerzita v Brně. 100 s. ISBN 978-80-7375-465-5. BÁBÍKOVÁ, P.; BAROŇ, M.; KUMŠTA, M.; SOTOLÁŘ, R. 2012: Increasing the efficiency of sulphur dioxide in wine by using of saturated higher fatty acids. Acta Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis, vol. 60, no. 1, pp. 17-22. ISSN 1211-8516. BUZRUL, S. 2012: High hydrostatic pressure treatment of beer and wine: A review. Innovative Food Science & Emerging Technologies, vol. 13, pp. 1-12. ISSN 1466-8564. COSTA, A.; BARATA, A.; MALFEITO-FERREIRA, M.; LOUREIRO, V. 2008: Evaluation of the inhibitory effect of dimethyl dicarbonate (DMDC) against wine microorganisms. Food Microbiology, vol. 25, no. 2, pp. 422-427. ISSN 0740-0020. ČEJKOVÁ, A. 2005: Biotechnologické aplikace mikroorganismů [online]. [cit. 201404-01]. Dostupné z: http://www.vscht.cz/kch/download/sylaby/bam-mag.pdf. Sylabus k předmětu. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze. DE FELICE, M.; CINQUANTA, L.; DE LEONARDIS, A. 1993: Free fatty acids inhibiting malolactic fermentation in wine. Industria delle bevande, vol. 22, pp. 126130. ISSN 0390-0541. DELFINI, C.; CONTERNO, L.; CARPI, G.; ROVERE, P.; TABUSSO, A.; COCITO, C.; AMATI, A. 1995: Microbiological stabilisation of grape musts and wines by high hydrostatic pressures. Journal of Wine Research, vol. 6, no. 2, pp. 143–151. ISSN 09571264.

58

DELSART, C.; GHIDOSSI, R.; POUPOT, CH.; CHOLET, C.; GRIMI, N.; VOROBIEV, E.; MILISIC, V.; PEUCHOT, M. M. 2012: Enhanced Extraction of Phenolic Compounds from Merlot Grapes by Pulsed Electric Field Treatment. American Journal of Enology and Viticulture, vol. 63, no. 2, pp. 205-211. ISSN 00029254. DIVOL, B.; STREHAIANOE, P.; LONVAUD-FUNEL, A. 2005: Effectiveness of dimethyldicarbonate to stop alcoholic fermentation in wine. Food Microbiology, vol. 22, no. 2-3, pp. 169–178. ISSN 0740-0020. EGLI, C. M.; EDINGER, W. D.; MITRAKUL, C. M.; HENICK-KLING, T. 1998: Dynamics of indigenous and inoculated yeast populations and their effect on the sensory character of Riesling and Chardonnay wines. Journal of applied microbiology, vol. 85, no. 5, pp. 779-789. ISSN 1365-2672. EL DARRA, N.; GRIMI, N.; MAROUN, R G.; LOUKA, N.; VOROBIEV, E. 2013: Pulsed electric field, ultrasound, and thermal pretreatments for better phenolic extraction during red fermentation. European Food Research and Technology, vol. 236, no. 1, pp. 47-56. ISSN 1438-2385. FALGUERA, V.; FORNS, M.; IBARZ, A. 2012: UV–vis irradiation: An alternative to reduce SO2 in white wines? Food Science and Technology, vol. 51, no. 1, pp. 59-64. ISSN 0023-6438. FLAMINI, R. 2008: Hyphenated Techniques in Grape and Wine Chemistry. Chichester, West Sussex: John Wiley & Sons, Ltd. pp. 368. ISBN 978-0-470-06187-9. FLAMINI, R.; TRALDI, P. 2010: Mass Spectrometry in Grape and Wine Chemistry. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc. pp. 348. ISBN 978-0-470-39247-8. FREDERICKS, I., N.; du TOIT, M.; KRÜGEL, M. 2011: Efficacy of ultraviolet radiation as an alternative technology to inactivate microorganisms in grape juices and wines. Food Microbiology, vol. 28, no. 3, pp. 510–517. ISSN 0740-0020. FUGELSANG, K. C.; EDWARDS, CH. G. 2007: Wine Microbiology: Practical Applications and Procedures. 2. vyd. New York: Springer. pp. 396. ISBN 978-0-38733341-0. GARBAY, S.; ROZES, N.; LONVAUD-FUNEL, A. 1995: Fatty acid composition of Leuconostoc oenos, incidence of growth conditions and relationship with malolactic efficiency. Food Microbiology, vol. 12, pp. 387–395. ISSN 0740-0020. GÓMEZ-RIVAS, L.; ESCUDERO-ABARCA, B. I.; AGUILAR-USCANGA, M. G.; HAYWARD-JONES, P. M.; MENDOZA, P.; RAMÍREZ, M. 2004: Selective antimicrobial action of chitosan against spoilage yeasts in mixed culture fermentations. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, vol. 31, no. 1, pp. 16–22. ISSN 1367-5435. GRAINGER, K.; TATTERSALL, H. 2005: Wine Production: Vine to Bottle. 1. vyd. Oxford: Blackwell Publishing Ltd. pp. 152. ISBN 978-14051-1365-6.

59

GUILLOUX-BENATIER, M.; LE FUR, Y.; FEUILLAT, M. 1998: Influence of fatty acids on the growth of wine microorganisms Saccharomyces cerevisiae and Oenococcus oeni. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, vol. 20, no. 3-4, pp. 144–149. ISSN 1476-5535. HENDERSON, P. 2009: Sulfur dioxide - Science behind the anti-microbial, antioxidant, wine additive. Practical winery and vineyard journal, vol. 160. ISSN 97398077. HÜHN, T.; SPONHOLZ, W. R.; PULVER, D. 1999: The influence of microorganisms in winemaking. Scientific and technical information, Vol. 3, pp. 41–84. ISSN 19348118. IZQUIERDO-CAÑAS, P. M.; GARCÍA-ROMERO, E.; HUERTAS-NEBREDA, B.; GÓMEZ-ALONSO, S. 2012: Colloidal silver complex as an alternative to sulphur dioxide in winemaking. Food Control, vol. 23, no. 1, pp. 73-81. ISSN 0956-7135. JACKSON, R. S. 2008: Wine science Principles and Applications. 3. vyd. London: Elsevier. pp. 776. ISBN 978-0-12-373646-8. JACOBSON, J. L. 2006: Introduction to Wine Laboratory: Practices and Procedures. New York: Springer. pp. 382. ISBN-10 0-387-24377-1. JOLLY, N. P.; AUGUSTYN, O. P. H.; PRETORIUS, I. S. 2006: The Role and Use of Non-Saccharomyces Yeasts in Wine Production. South African Journal for Enology and Viticulture, vol. 27, no. 1, pp. 15-39. ISSN 0253-939X. KÖNIG, H.; UNDEN, G.; FRÖHLICH, J. 2009: Biology of Microorganism on Grapes in Must and in Wine. Berlin: Springer. pp. 516. ISBN 978-3-540-85462-3. MARTORELL, P.; FERNÁNDEZ-ESPINAR, M. T.; QUEROL, A. 2005: Molecular monitoring of spoilage yeasts during the production of candied fruit nougats to determine food contamination sources. International Journal of Food Microbiology, vol. 101, no. 3, pp. 293-302. ISSN 0168-1605. MICHLOVSKÝ, M. 2012: Oxid siřičitý v enologi. 1. vyd. Vinselekt Michlovský, a.s. pp. 151, ISBN 978-80-905319-0-1. MOK, C.; SONG, K. T.; PARK, Y. S.; LIM, S.; RUAN, R.; CHEN, P. 2006: High hydrostatic pressure pasteurization of red wine. Journal of Food, vol. 71, no. 8, pp. 1539. ISSN 1750-3841. OUGH, C. S. 1975. Dimethyldicarbonate as wine sterilant. American Journal of Enology and Viticulture, vol. 26, no. 3, pp. 130-133. ISSN 0002-9254. PAVLOUŠEK, P. 2011: Pěstování révy vinné – Moderní vinohradnictví. Praha: Grada Publishing. pp. 333, ISBN 978-80-247-3314-2. PRIEWE, J. 2001: Wein – Die neue grosse schule. 1. vyd. Munchen: Zabert Sandmann Verlag. pp. 256, ISBN 978-3-89883-137-6.

60

PUÉRTOLAS, E.; LÓPEZ, N.; CONDON, S.; RASO, J.; ÁLVAREZ I. 2009: Pulsed electric fields inactivation of wine spoilage of yeasts and bacteria. International Journal of Food Microbiology, vol. 130, no. 1, pp. 49–55. ISSN 0168-1605. RENOUF, V.; STREHAIANO, P.; LONVAUD-FUNEL, A. 2008: Effectiveness of dimethlydicarbonate to prevent Brettanomyces bruxellensis growth in wine. Food control, vol. 19, no. 2, pp. 208–216. ISSN 0956-7135. RIBÉREAU-GAYON, P.; DUBOURDIEU, D.; DONÉCHE, B.; LONVAUD, A. 2006: Handbook of Enology Volume 1: The Microbiology of Wine and Vinifications. 2. vyd. Chichester, West Sussex: John Wiley & Sons Ltd. pp. 497. ISBN 0-470-01034-7. ROJO, M. C.; ARROYO LÓPEZ, F. N.; LERENA, M. C.; MERCADO, L.; TORRES, A.; COMBINA, M. 2013: Effects of pH and sugar concentration in Zygosaccharomyces rouxii growth and time for spoilage in concentrated grape juice at isothermal and nonisothermal conditions. Food Microbiology, vol. 38, no. 1, pp. 143-150. ISSN 07400020. SALAHA, M.; KALLITHRAKA, S.; MARMARAS, I.; KOUSSISSI, E.; TZOUROU, I. 2008: A natural alternative to sulphur dioxide for red wine production: Influence on colour, antioxidant activity and anthocyanin content. Journal of Food Composition and Analysis, vol. 21, no. 8, pp. 660-666. ISSN 0889-1575. SANDLER, M.; PINDER, R. 2003: Wine: A Scientific Exploration. 1. vyd. London: Taylor & Francis. pp. 336. ISBN 0-415-24734-9. SANTOS, C. M.; NUNES, C.; COIMBRA, A. M.; SARAIVA A. J. 2012: Chemical and physical methodologies for the replacement/reduction of sulfur dioxide use during winemaking: review of their potentialities and limitations. European Food Research and Technology, vol. 234, no. 1, pp. 1-12. ISSN 1438-2385. SÁ-CORREIA, I.; VAN UDEN, N. 1983: Temperature profi les of ethanol tolerance: effects of ethanol on the minimum and the maximum temperatures for growth of the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces fragilis. Biotechnology and Bioengineering, vol. 25, no. 6, pp. 1665–1667. ISSN 1097-0290. SONNI, F.; BASTATNTE, M. J. C.; CHINNICI, F.; NATALI, N.; RIPONI, C. 2009: Replacement of sulfur dioxide by lysozyme and oenological tannins during fermentation: influence on volatile composition of white wines. Journal of the Science of Food and Agriculture, vol. 89, no. 4, pp. 688-696. ISSN 1097-0010. SONNI, F.; CHINNICI, F.; NATALI, N.; RIPONI, C. 2011: Pre-fermentative replacement of sulphur dioxide by lysozyme and oenological tannins: Effect on the formation and evolution of volatile compounds during the bottle storage of white wines. Food Chemistry, vol. 129, no. 3, pp. 1193-1200. ISSN 0308-8146. STEIDL, R. 2010a: Sklepní hospodářství. 2. vyd. Valtice: Národní vinařské centrum. 309 s. ISBN 978-80-903201-9-2. STEIDL, R. 2010b: Po cestách ke špičkovému vínu. 1. vyd. Valtice: Národní vinařské centrum. 64 s. ISBN 978-80-903201-8-5. 61

TAKUSH, D. G.; OSBORNE, J. P. 2011: Investigating High Hydrostatic Pressure Processing as a Tool for Studying Yeast during Red. American Jurnal of Enology and Viticulture, vol. 62, no. 4, pp. 536-541 ISSN 0002-9254. THRELFALL, R. T.; MORRIS, J. R. 2002: Using Dimethyldicarbonate to Minimize Sulfur Dioxide for Prevention of Fermentation from Excessive Yeast Contamination in Juice and Semi-Sweet Wine. Journal of Food Science, vol. 67, no. 7, pp. 2758–2762. ISSN 1750-3841.

62

11. SEZNAM PŘÍLOH Příloha 1: Předpisy pro pouţití SO2

63

12. PŘÍLOHY Příloha 1 Předpisy pro použití SO2 Dnes jsou všechna vína členských států EU podřízena ve věci obsahu SO2 předpisům EU, které postupně sníţily tyto hodnoty na 150 mg.l-1 pro většinu červených vín a na 200 mg.l-1 pro většinu bílých vín. Pouze vína s vyšším obsahem cukru si ponechávají moţnost pouţít vyšší dávky (Michlovský, 2012). Maximální hodnoty SO2 pro celou EU stanovuje nařízení komise (ES) č. 606/2009. Stanovuje se v nich jen hodnota celkového SO2. Národní odchylky proti tomuto nařízení jsou moţné v předpisech jednotlivých států jen směrem dolů pro vína tamní produkce. Maximální moţný obsah volného SO2 tak na úrovni EU předepsán není. V tabulce níţe jsou uvedeny maximální hodnoty celkového oxidu siřičitého v ČR. V praxi jsou však pouţívány niţší dávky. Mezinárodní organizace pro révu vinnou a víno (OIV) doporučuje členským státům o něco vyšší hodnoty, neţ jsou hodnoty EU. Obsah SO2 ve víně od mnoţství 10 mg.l-1 musí být v členských státech podle nařízení Komise (ES) č. 607/2009 uveden na etiketě. V ČR je to formou „obsahuje siřičitany― nebo „obsahuje oxid siřičitý― (Michlovský, 2012). Tab. 6: Mezní hodnoty celkového SO2 podle typu vín v ČR (podle nařízení č. 606/2009), (Zdroj: Michlovský, 2012)

Celkový SO2 (mg.l-1)

Typ vína Červené víno

150

Bílé a růţové víno

200 -1

Červené víno od 5 g.l cukru

200

Bílé a růţové víno od 5 g.l-1 cukru

250

Pozdní sběr

300

Výběr z hroznů Výběr z bobulí, výběr z cibéb, ledové a slámové víno Likérové víno s obsahem cukru pod 5 g.l-1

350

Likérové víno s obsahem cukru od 5 g.l-1

210

Šumivé víno jakostní

185

Šumivé víno ostatní

235

400 150

64