Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Szerves Kémia és Technológia Tanszék
Kísérletek egy kéntartalmú nemtermészetes α-aminosav előállítására
Készítette:
Gyűjtő Imre
Témavezetők:
Dr. Nagy József egyetemi docens Kókai Eszter doktoráns
Konzulens:
Dr. Hegedűs László tudományos főmunkatárs
Budapest, 2014
Köszönetnyilvánítás Köszönöm témavezetőmnek, Dr. Nagy Józsefnek, hogy lehetővé tette munkámat a Bioorganikus Kutatócsoportban, valamint hogy bizalommal fordulhattam hozzá a munkám során felmerülő nehézségekkel. Köszönöm témavezetőmnek, Kókai Eszternek, aki végigkísérte munkámat a kutatócsoportban, hogy a preparatív szerves kémiában szerzett széleskörű és nélkülözhetetlen tapasztalataira
mindvégig
alapozhattam.
Példát
mutatott
nekem
szorgalmával
és
emberségességével. Hálás vagyok konzulensemnek, Dr. Hegedűs Lászlónak a katalitikus hidrogénezési reakciókkal kapcsolatos értékes tanácsaiért és segítségéért. Köszönönettel tartozok Dr. Poppe Lászlónak, a Bioorganikus Kutatócsoport vezetőjének, hogy figyelemmel kísérte az enzimekkel kapcsolatos munkámat; Weiser Diának az enzimek rögzítésért és a mérések során nyújtott segítségéért; valamint a Fermentia kft. munkatársainak, különös tekintettel Dr. Sátorhelyi Péternek és Paróczai Beatrixnak, hogy foglalkoztak velem, és részt vehettem a PcPAL fermentációjában. Továbbá köszönöm a laborban dolgozóknak, hogy elméleti és gyakorlati tudásukra számíthattam. Akikre nem csak munkatársakként, hanem mint barátokra tekintek. Külön kiemelném Bell Evelint, akinek segítőkészsége nélkül e dolgozat sem jöhetett volna létre; valamint Komjáti Balázst, aki elméleti szerves kémiai tudásával járult hozzá a szintéziseimhez. Végül, de nem utolsó sorban köszönöm a támogatást és a megértést családomnak és barátaimnak.
2
Tartalom Rövidítésjegyzék ............................................................................................................ 4 Bevezetés, célkitűzés ...................................................................................................... 5 Irodalmi összefoglaló ..................................................................................................... 7 1.
Primer aminok előállítása reduktív aminálással ............................................... 7
2.
Oximok aminokká történő transzformációjára ................................................. 8 2.1.
Katalitikus hidrogénezés ............................................................................... 8
2.2
Amalgámos redukció .................................................................................. 11
2.3
Cink alapú redukciók .................................................................................. 12
2.4
Fém-hidrid komplexek ................................................................................ 15
3.
Enamin és enamid típusú vegyületek redukciója ........................................... 16
4.
Észter hidrolízis .............................................................................................. 17
5.
Az L-fenilalanin ammónia-liáz ....................................................................... 17
Eredmények .................................................................................................................. 20 1.
Reduktív aminálás .......................................................................................... 20
2.
Kísérletek oxim-csoport redukciójára ............................................................ 20 2.1.
Katalitikus hidrogénezés ............................................................................. 21
2.2.
Hidrides redukció ........................................................................................ 25
2.3.
Cinkes redukció .......................................................................................... 26
3.
Kísérlet enamin redukciójára .......................................................................... 27
4.
Oxim-észter hidrolízise................................................................................... 27
5.
Amin-észter hidrolízise................................................................................... 28
6.
Redukciós módszerek összehasonlítása.......................................................... 29
7.
Az enzimatikus átalakítás ............................................................................... 30
Összefoglalás ................................................................................................................ 32 Kísérleti rész ................................................................................................................. 33 Irodalomjegyzék ........................................................................................................... 44 3
Rövidítésjegyzék ammónia-liáz
PAL
L-fenilalanin
PKU
fenilketonúria
PcPAL
Petroselinum crispum L-fenilalanin ammónia-liáz
MeOH
metanol
AcOH
ecetsav
EtOAc
etil-acetát
TEA
trietil-amin
DKM
diklórmetán
ekv.
ekvivalens
spat.
spatulahegynyi
RaNi
Raney®-nikkel
Rf
Retenciós faktor
n.a.
nincs adat
BOC
terc-butoxikarbonil
Bn
benzil
Bz
benzoil
Ac
acil
AR
aril
HAR
heteroaril
atm.
atmoszféra
kat.
katalitikus mennyiségű
VRK
vékonyréteg-kroamtográfia
4
Bevezetés, célkitűzés A nem-természetes aminosavaknak nagyon fontos szerepük van a gyógyszer- és peptidkutatásban.1 Vannak olyan mesterséges aminosavak, amelyeket közvetlenül terápiás célra is használnak, például az L-3,4-dihidroxifenilalanint (levodopa) a Parkinson-kórban szenvedők kezelésére alkalmazzák. Mesterséges aminosavak polipeptidláncba történő beépítésével változatos biokonjugátumok és fehérjék hozhatók létre. Ilyen újszerű molekulák gyógymódot jelenthetnek eddig gyógyíthatatlannak tartott betegségekre. Elemorganikus aminosav analogonok használatával a már létező enzimek szerkezet-aktivitás összefüggéseik felderíthetők és finom-hangolhatók.2 Különleges tulajdonságú szubsztrátumok és inhibitorok tervezhetők ezekhez az új biokatalizátorokhoz. A heteroaromás aminosav-származékoknak különösen nagy jelentőségük lehet metalloenzimekben fém-keláló képességük miatt,3valamint fluoreszcens jelzőmolekulaként is használhatók.4 A kutatócsoportunkban, a kereskedelmi forgalomban olcsón beszerezhető, aktív metilcsoportot tartalmazó kiindulási anyagból, 2-metilbenzotiazolból (1) 2-amino-3(benzotiazol-2-il)propánsav (2) és (E)-3-(benzotiazol-2-il)akrilsav (3) kémiai módszerekkel történő előállítását tűztük ki célul (1. ábra). A kutatócsoportban 2-metilbenzoxazolból már sikeresen előállították a 3-as és az 5-ös intermedier analogonjait. Feladatként kaptam, hogy az optimalizált eljárást reprodukáljam 2-metilbenzotiazolra (1), valamint hogy különböző redukciós módszerekkel kíséreljem meg a célvegyület (2) előállítását az oxim-intermedierből (5), és hasonlítsam össze a redukciós módszereket. Ezt követően pedig vizsgáljam meg, hogy a 2-amino-3-(benzotiazol-2-il)propánsav (2) a Petroselinum crispum L-fenilalanin-ammónialiáz enzim megfelelő szubsztrátja-e.
5
1. ábra 2-Amino-3-(benzotiazol-2-il)propánsav (2) és (E)-3-(benzotiazol-2-il)akrilsav (3) előállítása 2-metilbenzotiazolból (1) Az L-fenilalanin-ammónia-liáz az (E)-fahéjsav–L-fenilalanin átalakulást katalizálja. Az eliminációs reakciót a fenilketonúria kezelésére, míg az addíciós folyamatot az aszpartám előállítás során alkalmazzák. A Petroselinum crispum PAL széles szubsztráttoleranciával rendelkezik, már több heteroaromás vegyület biotranszformációját is végrehajtották vele.
6
Irodalmi összefoglaló 1. Primer aminok előállítása reduktív aminálással Oxovegyületek reduktív aminálását leggyakrabban sztöchiometrikus mennyiségű borohidriddel, enzimekkel, heterogén, illetve homogén katalizátorokkal végrehajtott hidrogénezéssel valósítják meg. Legszélesebb körben alkalmazott amin-forrás az ammónia alkoholos vagy vizes oldata, szervetlen ammónium-sók és ammónium-formiát , ez utóbbi transzferhidrogénező ágens is.5 A borohidrid-komplexek használata igen elterjedt, ugyanis alkalmas aldehidek, ketonok direkt reduktív aminálására. Az in situ keletkező iminium-ion redukciójának sebessége gyorsabb a karbonil-csoporténál semleges (6-8) pH-n. 6 Japán kutatók változatosan szubsztituált aralkilaminokat állítottak elő ketonokból metanolban, ammónium-acetát és natriumcianoborohidrid jelenlétében.7 A Minnesotai Egyetem munkatársai 3-as helyzetben szubsztituált piroszőlősav-származékok (7a-e) reduktív aminálásával aminosavak (8a-e) előállítását valósították meg lítium-cianoborohidrid és ammónium-bromid jelenlétében közepes termeléssel (2. ábra).8 7,8 a b c d e
R H HOOCCH2 p-hidroxifenil indol-3-il benzil
termelés (%) 50 51 46 37 49
2. ábra Piroszőlősavszármazékok (7a-e) reduktív aminálása A ciano-borohidridek alkalmazása veszélyes a toxikus cianid melléktermékek képződése miatt. Más redukálóágensek, például natrium-triacetoxiborohidrid alkalmazása is lehetséges, ám ez a reagens kevésbé reaktív.9 Számos példát találunk az irodalomban homogén katalitikus módszerek alkalmazására primer aminok és nem természetes α-aminosavak aszimmetrikus szintézise során, katalizátorként ciklometallált irídium-10,11 vagy ródium-komplexekkel ammónium -formiát jelenlétében..12 Hagiya és munkatársai ammónia vizes oldatában hidrogén atmoszférában, 5%-os aktív szén hordozóra lecsapott palládium(0)-katalizátoron végzett reduktív aminálással metionint 7
állítottak elő 67%-os termeléssel,13 de már az 1920-as, 30-as években is foglalkoztak α-oxosavak ammónium-formiát vagy ammónia vizes oldatában történő palládium katalizálta reduktív aminálásával.14-18 Az aminotranszferáz enzimek oxovegyületek aminokká történő transzformációját katalizálják, miközben az amin-donor aminosavból ketosav keletkezik. Alkalmazásuknak nagy előnye, hogy az aminovegyület olcsón, enantioszelektíven állítható elő, emellett esetenként az oxosav melléktermék is könnyen értékesíthető (piroszőlősav, α-ketoglutársav). A legtöbb biokatalizátor kofaktora a piridoxál-foszfát.19 Az irodalomban nem enzimatikus transzaminálásra is találunk példát. Kínai kutatók aromás gyűrűn szubsztituált α-oxoészterek (9) trietil-amin katalizálta átalakítását hajtották végre.
Aminforrásként
10-et
használva
85-95%-os
termelést
értek
el,20
továbbá
megállapították, hogy – a természetben előforduló enzimekhez hasonlóan – a piridoxaminanalogonok alkalmázásának hatása van enantioszelektivitásra.
3. ábra α-Aminoészterek (11) előállítása nem enzimatikus transzaminálással 2. Oximok aminokká történő transzformációjára Oxim-csoport aminná történő redukciójára számos példát találhatunk az irodalomban, ezért a publikációk feldolgozása során arra törekedtem, hogy olyan reakciókat mutassak be, amelyek vagy savszármazékok vagy heteroaromás oldalláncú vegyületek redukcióját tárgyalja. 2.1. Katalitikus hidrogénezés Kolars munkatársai 2-es helyzetben szubsztituált nitrogén-tartalmú heteroaromás oldalláncú glicinátokat állítottak elő hidrogénezéssel 10%-os Pd/C katalizátor jelenlétében. 21 A 4. ábrán feltüntetett 12 kinolin-2-il származék redukciója metanolban 94%-ban eredményezte 13 nyers terméket, míg 14 piridin-2-il átalakítása etanolban 64%-os hozammal játszódott le.
8
4. ábra Metil-(kinolin-2-il)glicinát és metil-(piridin-2-il)glicinát előállítása Pd/C katlizátorral A genfi egyetem kutatói22 16 (benzotiazol-2-il)glicint állítottak elő 85%-os termeléssel 17 oxim-sav származékból metanol oldószerben 10%-os Pd/C katalizátor jelenlétében. A publikáció nem tartalmazza a reakció nyomás és hőmérséklet adatait. A 18 oxim-észter típusú vegyület katalitikus hidrogénezését 0,08 mólos sósavas metanolban 60 perc alatt hajtották végre 69%-os hozammal, így 19 hidrokolid-sóhoz jutottak.
5. ábra (Benzotiazol-2-il)glicinátok előállítása (16, 19) Pd/C katalizátor jelenlétében Walter Ried és Heinz Schiller 1953-as publikációjukban23 ß-heterociklusos alaninszármazékok előállításáról írtak. Az α-oxim-észter redukcióját Raney®-Nikkel katalizátor jelenlétében etil-acetát oldószerben 60°C-on 69 bar nyomáson végezték. A 20 kinolin-2-il származék esetében a kívánt 21 terméket 20%-os össztermeléssel tudták előállítani. Emellett 22 tetrahidro-, és 23 diketopiperazin-származék is képződött. A 24 észter típusú köztes termék termelési értékét nem közli a publikáció (6. ábra).
9
6. ábra 20 átalakítása katalitikus hidrogénezéssel Raney®-Nikkel katalizátor jelenlétében Az 5 benzotiazol-2-il oldalláncú vegyület átalakítása során nyomnyi mennyiségben 25 enamin-észter, 26 diketopiperazin (5%), valamint a 27 amin-észter hidrolízisét követően a várt aminosav (29%) keletkezett (7. ábra).
7. ábra (benzotiazol-2-il)alanin (2) előállítása Raney®-Nikkel katalizátor jelenlétében Az 28 vegyületből 29 dilaktám képződött (20%), melynek sósavas hidrolízisét követően jutottak el 30 hidroklorid sóhoz (20%, 8. ábra).
10
8.
ábra 3-(kinoxalin-2-il)alanin (30) előállítása 29 dilaktámon keresztül
Etil[3-(benzooxazol-2-il)-2-(hidroxiimino)propanoát] redukcióját a fentebb alkalmazott módszerekkel nem tudták megvalósítani. 2.2 Amalgámos redukció Crowe és Nord a heteroaromás gyűrű 5-ös helyzetében szubsztituált (tiofén-2il)alaninok (31) nátrium-amalgámos szintézisét írta le (9. ábra). 24 A megfelelő oxim-savból (32) az 5-metil-származék esetében 73%-os termelést értek el. Más szubsztituensek esetében is sikeres reakcióról számoltak be, de a cikk termelési adatokat ezekben az esetekben nem közöl. A 32e 5-bróm-származéknál azt tapasztalták, hogy az oxim-csoport redukciója mellett dehalogéneződés is történt.25,26 Jelzés a b c d e
9.
R1 Me Et Pr Cl Br
R2 Me Et Pr Cl H
ábra A 31a-e (tiofen-2-il)alanin származékok előállítása nátrium-amalgámmal
Ried és Schiller nátrium-amalgám jelenlétében kísérelték meg redukálni 5, 20 és 28 vegyületeket, de csak 2-t tudták ily módon előállítani 32%-os termeléssel (10. ábra).23
10. ábra A 2-amino-3-(benzotiazol-2-il)propánsav (2) előállítása nátrium-amalgámmal Wensbo és Gronowitz27 alumínium-amalgám jelenlétében 33a-c molekulák előállítását valósította meg 77-86%-os termeléssel (11. ábra).
11
11. ábra Triptofán-analóg származékok (33a-c) előállítása alumínium-amalgámmal 2.3 Cink alapú redukciók Egy 2003-ban megjelent publikációban28 indiai kutatók oximok (34a-e) aminokká (35a-e) történő gyors, általános, szelektív és egyszerű átalakításáról számolnak be, cink és ammónium-formiát jelenlétében (12. ábra). Az eljárás nagy előnye a heterogén katalitikus transzferhidrogénezésekkel szemben, hogy nem igényel drága katalizátort és extrém körülményeket. Az amalgámos reakciókhoz viszonyítva környezetbarát. Az oxim csoport redukciója kemoszelektív, hiszen –OH, -OCH3, -COOH, -CN, C = C és CH3 csoportok mellett is elvégezhető. Tanulmányozták a reakció optimális körülményeit is. 2-4 elvivalens ammónium-formiát jelenlétét találták ideálisnak, 1 ekvivalens protondonorral elvégezve a transzferhidrogénezést. Ammónium-formiátot ammónium-kloridra lecserélve azt tapasztalták, hogy a reakció lejátszódásához szükséges idő jelentősen megnőtt, melyhez hozzájárul az ammónium-klorid rosszabb oldhatósága, valamint az is, hogy az ammónium-formiát hidridiont is szolgáltat a redukcióhoz. Az optimális cink-szubsztrátum arányt 2 az1 értékben állapították meg, ugyanis tapasztalatik szerint nagyobb mennyiségű cink csak kis reakcióidő csökkentést eredményezett, míg szignifikánsan lelassult a redukció ennél kevesebb fém használatakor. Vizsgálataik azt is bebizonyították, hogy egyaránt szükséges a reakció kvantitatív lejátszódásához a cink és az ammónium-formiát vagy ammónium-klorid is. Az a. táblázatban néhány általam kiválasztott származékra vonatokozó termelési adat szerepel.
12. ábra Oxim csoport redukciója Zn és HCOONH4 vagy NH4Cl jelenlétében 12
a. táblázat Oxim csoport redukciója Zn és HCOONH4 vagy NH4Cl jelenlétében HCOONH4 Jelzés 34 a b c d e
Egy
R1
R2
Ph p-(OH)C6H4CH2 p-(Cl)C6H4 C2H5 p-(NO2)C6H4
Me Me H COOH H
2012-ben
megjelent
idő [perc] 4 3 3 4 4
publikációban29
termelés [%] 95 94 94 86 91
NH4Cl idő [perc] 162 175 152 143 165
termelés [%] 90 85 87 83 83
N-benzil-2-amino-3-(hetero)aromás
acetamidok (35a-e) cinkes redukcióval történő előállításáról olvashatunk (13. ábra). Például N-Benzil-2-(benzotiofén-2-il)-2-(hidroxiimino)acetamidból (36a) 35a
amin előállítását
metanolban 4-4 ekvivalens cink és ammónium-formiát jelenlétében 70°C-on 2-3 óra alatt végezték 51%-os termeléssel. Hasonló módon állítottak elő 35b-e származékokat is 3-3 ekvivalens Zn és ammónium-formiát jelenlétében 4-6 órán át forralva. A kinoxalin-2-il molekulát nagyobb 73%-os termeléssel tudták előállítani az eredeti recept módosításával, metanol-víz-hangyasav elegyeben 2,5 ekvivalens cinkkel szobahőmérsékleten 18 óra alatt.
13. ábra 2-amino-3-(heteroaril)-N-fenilpropánamidok (35a-e) előállítása Az Osakai Egyetem kutatói30 etil-[2-amino-2-(4-metiltiazol-2-il)acetát] 37 előállításáról számoltak be 38 oximból metanol és 40%-os hangyasav elegyében Zn jelenlétében 5°C-on 5 óra alatt. Az 1973-as publikációban sem százalékos termelési adat, sem szerkezetigazolás nem szerepel.
14. ábra Etil-[2-amino-2-(4-metiltiazol-2-il)acetát](37) előállítása
13
Orosz kutatók (benzooxazol-2-il)-(fenil)metánamint (39) állítottak elő 40 oximból 80°C-on vizes ammónia oldatban cink és ammónium-acetát jelenlétében 67%-os termeléssel (15. ábra).31 Ezeket a körülményeket egy évvel később egy másik orosz kutatócsoport is alkalmazta [piridin-4-il(tiazol-2-il)]metanon-oximra. 32
15. ábra (Benzooxazol-2-il)-fenilmetánamin (39) előállítása Kukolja és munkatársai 4133 és 4234 amino-észterek szintézisét valósították meg heteroaromás oxim-csoportból kiindulva Zn jelenlétében alkohol-hangyasav-víz elegyben 0°Con közepes termeléssel (16. ábra).
16. ábra A 41 és 43 aminoészterek előállítása Japán kutatók35 furán és tiofén alapú 2-amino-3-(heteroaril)propionsavakat (44a-g) állítottak elő oxim-savakból (45a-g) hangyasavban 3 ekvivalens cink és katalítikus mennyiségű vaspor jelenlétében 60-65°C-on 2 óra alatt 51-94%-os termeléssel.
17. ábra 2-Amino-3-(heteroaril)propionsavak (44a-g) előállítása
14
2.4 Fém-hidrid komplexek Kínai kutatók új, általános eljárást fejlesztettek ki C-N többszörös kötés amino-csoporttá történő redukciójára.36 Az új módszer kidolgozását az indokolta, hogy a hagyományos fémhidrides reakciók alkalmazása esetenként nem jár kielégítő eredménnyel. A széleskörűen használt LiAlH4 nagy reakciókészségéből kifolyólag nem szelektív, emellett vízre érzékeny. Ezzel szemben a NaBH4 csökkent reaktivitása miatt gyakran nem bizonyul elégségesnek, bár reaktivitása Lewis-savakkal eredményesen növelhető.37 Az újszerű eljárás előnye, hogy az amorf nikkel alkalmazása heterogén katalizátorként funkcionál, növelve a NaBH4 redukálóerejét lúgos-metanolos elegyekben. Az eljárás további előnyei, hogy méretnövelhető, a Ni0 visszaforgatható, valamint észter- és sav-funkcióscsoportok mellett is alkalmazható. A cikkben számos oxim-, imin-, hidrazon- és nitril-csoport redukciójára találunk példát, melyek közül a kutatási témában érintett oxim-savból (45a,b) oxim-észterből (45c-k) történő aminosav (46ak) előállítást a b. táblázatban foglaltam össze b. táblázat Oxim-csoport redukciója amorf nikkel jelenlétében NaBH4-del
Jelzés a b c d e f g h i j 21
R1 Ph 4-ClPh 4-FPh Bn 4-FBn 4-ClBn 4-BrBn 4-MeOBn 4-PyCH2 2-naftilCH2 2-kinolinil
R2 COOH COOH COOH COOEt COOEt COOEt COOEt COOEt COOEt COOEt COOEt
R3 COOH COOH COOH COOH COOH COOH COOH COOH COOH COOH COOH
Termelés (%) 88 90 89 83 91 90 86 92 84 86 88
A 21 2-kinolinil származék előállítását NaBH4-del különböző Lewis-savak jelenlétében (NiCl2, TiCl3, TiCl4) is megkísérelték, ám ez nem vezetett eredményhez. Zn-AcOH/Ac2O rendszerrel sikerült az N-acilezett amino-észter származékhoz jutni 78%-os termeléssel. Orosz
kutatók
egy
2011-es
cikkükben
kólsav-aminoanalógok
előállításával
foglalkoztak.38 A 47 oxim redukcióját Na(CN)BH3 és TiCl3 jelenlétében, metanolban,
15
szobahőmérsékleten 24 óra alatt hajtották végre, a keletkező amino-csoportot in situ reagáltatták Boc2O-del, mely 59%-ban eredményezte a 48 N-Boc védett terméket (18. ábra).
18. ábra Policiklusos oxim-észter (48) redukciója NaCNBH3-del 3. Enamin és enamid típusú vegyületek redukciója Több példát is találunk katalitikus mennyiségű ródium-komplexek jelenlétében elvégzett S-heterociklusos enamidok asszimmetrikus-hidrogénezésére. Döbler és munkatársai tiofén-2-il- és tiofén-3-il-39, míg francia kutatók (benzotiazol-2-il)alanin-származékokat állítottak elő ily módon.40 Egy 2010-ben megjelent szabadalom 49 3-(benzotiazol-2-il)alanin származék előállítását tárgyalja 50 enamid-észterből kiindulva 99%-os termeléssel (19. ábra).41
19. ábra Metil-[3-(benzotiazol-2-il)-2-(terc-butoxikarbonil-amino)propanoát] előállítása Francia kutatók 51 alapvázú vegyület palládium katalizálta redukciójáról írtak 99%-os hozammal.42
20. ábra (2-arilbenzotiofén-3-il)alaninok (52) előállítása A katalitikus hidrogénezésen kívül az enaminok borohidridekkel is redukálhatók. Fülöp Ferenc és munkatársai 53 ß-amino-észtert állított elő NaCNBH3-del 59%-os termeléssel.43 16
21. ábra Egy ß-imino-észter (54) redukciója NaBH3CN-del 4. Észter hidrolízis Amino-észterek enzimatikus, savas és lúgos hidrolízisére is találunk példát az irodalomban. Ami a keletkezett aminosavak feldolgozását illeti, a következő lehetőségek állnak a rendelkezésünkre: alkohol-víz elegyből való átkristályosítás; kisózás; izoelektromos pontra állítva a vizes közeg pH-ját, az ikerion kicsapódik; ioncserélő gyanták alkalmazása. Fülöp Ferenc munkatársai ß-fenilalanin analogonok enantioszelektív szintézisét valósították meg hidroláz enzimekkel.43 Wartman és Lindel 55 triptofánszármazékot állította elő 56 észter lítium-hidroxiddal történő hidrolízisével tetrahidrofurán oldószerben, 20°C-on, 16 óra alatt (22. ábra).44
22. ábra 55 triptofánszármazék előállítása lúgos hidrolízissel Japán kutatók 58 vegyület savas hidrolízisét végezték el 80°C-on 6 óra alatt (23. ábra).45
23. ábra Az 58 észter sósavas hidrolízise 5. Az L-fenilalanin ammónia-liáz A PAL (EC 4.3.1.24) L-fenilalaninból (58) történő ammónia eliminációt katalizál, ezzel (E)-fahéjsavat (59) eredményezve (24. ábra). A biotranszformáció kulcsszerepet tölt be növényekben, ugyanis a fenilpropanoidok (ligninek, kumarinok, flavonidok) bioszintézisének 17
első lépését katalizálja,46 ezért herbicidek gyakori célpontja.47 Továbbá részt vesz egyes baktériumok és gombák anabolikus életfolyamataiban is.48
24. ábra A PAL katalizálta transzformáció A szubsztráttal a MIO prosztetikus csoport metilidén végződése Friedel-Crafts jellegű addíciós reakcióban vesz részt, melynek eredményeként kialakul a σ-komplex. A stabil intermedierről leszakítható egy ß-helyzetű proton, melyet az ammónia eliminációja, és ezzel együtt az aromás rendszer, illetve az α,ß-telítetlenség kialakulása követ: a mechanizmus E1cB.49 Ennek a transzformációnak a fenilketonúra (PKU) kezelésében van jelentősége. A PKU egy olyan genetikai mutáció következtében létrejövő betegség, mely során a PAH enzim inaktiválódik, így a fenilalanin nem metabolizálódik. A vérben akkumulált aminosav transzaminálással neurotoxikus fenil-piruváttá bomlik.50 Egykor a szigorú diéta jelentette az egyetlen megoldást, PAL-t felhasználták az élelmiszerek
L-fenilalanin
tartalmának
csökkentésére is. Az utóbbi évtizedekben enzim szubsztitúciós terápiában történő alkalmazásának lehetőségeit is vizsgálták, PEG-ret és szilikagélre rögzített rekombináns PAL jelentősen csökkenti a vér fenilalanin szintjét. A keletkező (E)-fahéjsav és ammónia ártalmatlan bomlástermékek, a vizelettel kiüríthetők.51 Megfelelő körülmények megválasztásával az egyensúly az ammónia-addíció irányába eltolható. Az utóbbi évtizedekben megnőtt aszpartám iránti kereslet hatására L-fenilalanin ilyen módú ipari mikrobiológiai előállítását is kidolgozták.52 Az enzim a szerves kémiai szintézisek során is hasznos lehet, továbbá alkalmazható szerves oldószerekben is.53
18
25. ábra PcPAL szerkezete54 Petroselinum crispum PAL (25. ábra) szubsztrát-toleranciája igen széles, így nem csak az L-fenilalanin előállításában, hanem más, nem természetes aminosavak enantioszelektív szintézisében is jelentősége lehet. Heteroaril-alaninok enzimatikus előállítására is találunk példát az irodalomban (26. ábra ).
26. ábra Az 60a,b 55, 60ci-iv56, 60d-k57 heteroarilszármazékok enzimatikus átalakítása
19
Eredmények 1. Reduktív aminálás A kutatócsoportban kidolgozott eljárás alapján 1 aktiv metil-csoportot tartalmazó vegyületből 4 oxoésztert, az eddigi 60%-os termelést javítva, 81%-os hozammal állítottam elő. Kísérleteket tettem 4 α-oxo-észter 27 α-amino-észterré történő átalakítására. A reduktív aminálás nagy előnye, hogy a kialakult imin in situ aminná redukálható, így a feldogozás során kevesebb veszteséggel kell számolnunk. Az általam elvégzett reakciók során nitrogén-donorként ammónium-formiátot vagy ammóniát – metanolban elnyeletve –, míg redukáló ágensként nátrium-cianoborohidridet használtam (27. ábra). Savas körülmények között a keletkező iminium-ion redukciója gyorsabb az oxo-csoporténál. A mellékreakciók visszaszorítását az ammónium-formiát és ammónia felesleg alkalmazásával próbáltam elérni. Sorszám I. II. III.
Körülmények 2 ekv. NH4OOCH 4 ekv.NH4OOCH, spat. KOH 3M MeOH/NH3, spat. KOH
27. ábra Etil-[2-amino-3-(benzotiazol-2-il)propanoát] előállítása reduktív aminálással A reakciók vékonyréteg-kromatográfiás követése során I. és II. reakciók esetében két termék keletkezését tapasztaltam a kiindulási anyag teljes konverziója mellett. Eluensként n-butanol:víz:ecetsav 3:1:1 arányú elegyét használva, majd ninhidrinnel előhívva ibolya színű (Rf1=0,65 és Rf2=0,18) feltételezhetően amin-típusú termékek keletkezését tapasztaltam. Preparatív vékonyrétegkromatográfiás elválasztásukat követően a szilikagélről a termékeket nem tudtam lemosni. A termékelegyek képződése miatt a jövőben jobb eljárást kívánok keresni. III. reakció során ismeretlen összetételű sárgás, olajszerű melléktermék képződött. 2. Kísérletek oxim-csoport redukciójára
28. ábra Etil-[2-amino-3-(benzotiazol-2-il)propanoát] előállítása 5 oximon keresztül 20
A továbbiakban az amin funkcióscsoportot két lépésben próbáltam kiépíteni (28. ábra). Először a nitrogén-atom bevitelét végeztem el: 4 oxovegyületetből előállítottam 5 oximot, a kutatócsoportban kidolgozott eljárást optimálva, a hozamot 88%-ról 94%-ra növeltem. A kiépített oxim funkciós csoport redukcióját katalitikus és kémiai hidrogénezési módszerekkel kíséreltem meg, melyeket eredményeit a következő alfejezetekben ismertetek. 2.1.Katalitikus hidrogénezés Az irodalomban számos példa található kéntartalmú heteroaromás oximok katalitikus körülmények között végrehajtott redukciójára. A modellvegyületként választott etil-[3(benzotiazol-2-il)-2-(hidroxiimino)propionát] (5) esetében a kénatom katalizátorméregként viselkedhet a katalitikus hidrogénezés során, ami megnehezíti a vegyület átalakítását. Feladatom volt, hogy különböző redukciós módszerekkel vizsgáljam a etil-[2-amino-3(benzotiazol-2-il)propanoát] (28) előállítását. A katalitikus hidrogénezési reakció vizsgálata során több paraméter hatását is tanulmányoztam. A modellvegyület katalitikus hidrogénezését először sósavas etanolban kíséreltem meg 10%-os Pd/C katalizátorral, szobahőmérsékleten, légköri nyomáson. A reakciót vékonyrétegkromatográfiásan követve megállapítottam, hogy az ilyen körülmények között nem ment végbe. A redukciót nagyobb nyomáson (3bar, 6 bar) megismételve sem jártam sikerrel, ezért a továbbiakban a reakció más paramétereinek változtatásával kívántam a kiindulási anyag átalakulását elősegíteni. A hidrogénezési reakciók lejátszódásában fontos szerepet játszó hőmérséklet változtatásával – a kezdeti, szobahőmérsékleten végzett reakcióhoz képest – 40, 60, 80, valamint 120 °C-on is elvégeztem a redukciót, Selcat Q (10%-os Pd/C) katalizátor jelenlétében, diklórmetán, etanol vagy sósavas etanol oldószerekben. A katalizátor mennyiségét (katalizátor/szubsztrátum arány=0,5 g·g–1) és minőségét (Selcat Q), valamint a nyomás értékét (10 bar) nem változtattam az elvégzett reakciók során. A hőmérséklet emelése azért tűnt célszerűnek, mert a modellvegyületként választott etil[3-(benzotiazol-2-il)-2-(hidroxiimino)propionát] (5) katalizátorméreg típusú vegyület – ugyanis a kén a nemkötő elektronpárjával datív kötést hoz létre a palládium d-pályájával, így gátolva a további katalitikus folyamatok végbemenetelét –, így az erős kemiszorpciós kölcsönhatás megbontására megoldást jelenthet a hőmérséklet növelése. Az 29. ábrán és a c. táblázatban a hőmérséklet és az oldószer termékképződésre gyakorolt hatását foglaltam össze.
21
29. ábra Etil-[3-(benzotiazol-2-il)-2-(hidroxiimino)propionát] (5) katalitikus hidrogénezése Selcat Q (10%-os Pd/C) katalizátorral. c. táblázat A Selcat Q (10%-os Pd/C) katalizátor jelenlétében végzett katalitikus hidrogénezés reakciókörülményeinek vizsgálata. Jelzés I. II. III: IV. V. VI. VII. VIII.
Oldószer DKM DKM DKM EtOH EtOH/HCl 3M EtOH/HCl 0,5 M DKM/H2O=1/4 EtOH
Hőmérséklet (°C) 40 60 80 60 60 80 80 120
5 8 0 4 24 0 0 5 0
Termelés (%) 25 27 28 16 56 2 43 6 22 7 0 6 0 15 6 0 0 0
62 0 0 0 0 0 0 6 45
Az c. táblázatban feltüntetett termelési értékek egyszeri reakciók adatai, ezeket később nem ismételtem meg. A katalitikus hidrogénezés során használt közeg minősége befolyásolja a reakciósebességet. Jól ismert jelenség, hogy prótikus oldószerekben (pl. etanol) a heterogén katalitikus hidrogénezési reakciók általában gyorsabban játszódnak le, mint diklórmetánban. A hőmérséklet növelése több okból is segítheti a redukció lejátszódását. Egyrészt magasabb hőmérsékleten (>40°C) a diklórmetánból in situ hidrogén-klorid képződik palládium hatására, ami azonban a katalizátort dezaktiválja, viszont savas közegben az oxim hidroxil csoportja nagy valószínűséggel protonálódik, és így a víz eliminációját követően kialakult iminium-ionra történő támadás kedvezőbb. Másrészt a hőmérséklet emelésével a katalizátorméreg típusú vegyület deszorpciója is elősegíthető. Az I., II., III., IV. és VII. reakciók esetében a redukció során a 25-ös jelű, enamintípusú, stabil intermedier képződik. Ez a molekula csaknem teljesen síknak tekinthető, folytonos konjugáció alakul ki a heteroaromás gyűrű, az enamin és a karbonilcsoport között, valamint a molekula szerkezetét intramolekuláris hidrogénkötés is stabilizálja. Ried és Schiller Raney®-kobalt jelenlétében 132 baron, 80 °C-on 50%-os termeléssel állította elő a 25-es jelű vegyületet.23 A II. reakció során diklórmetánban, 60 °C-on, 10%-os Selcat Q (10%-os Pd/C) katalizátoron, 56%-os termeléssel tudtam preparálni ezt a terméket. 22
Az oldószerek hatását 60 °C-on vizsgáltam. A II. és a IV. reakciókat összehasonlítva látható, hogy etanolban 25%-nyi kiindulási anyag változatlan maradt, és emellett csak 22%-ban keletkezett az enamin-típusú köztitermék (25), míg diklórmetánban 56%-os termeléssel sikerült előállítani ezt az intermediert. Utóbbi esetben a reakció teljes konverzióval játszódott le A különbség a II. reakció során keletkező hidrogén-kloridnak tulajdonítható. A továbbiakban a sósav hatását tanulmányoztam. Az I., II., III., IV., VII. és a VIII. reakciók során keletkezett termékek, a katalizátor kiszűrését követően, oszlopkromatográfiásan elválaszthatók voltak hexán/etil-acetát gradiens elúció alkalmazásával. Tapasztalataim alapján a sósavas etanolos elegyek így nem dolgozhatók fel, mert a termékek hidroklorid sói az oszlopról (a szilikagél degradációja nélkül) nem eluálhatóak. Így az V. és a VI. reakcióelegy feldolgozásakor savas extrakciót alkalmaztam, így a hidroklorid típusú termékek a vizes fázisba kerültek át. Ezt követően a vizes fázist lúgosítottam, majd extraháltam etil-acetáttal, hogy a szerves fázisba kerüljön át a deprotonált amin típusú termék. Ilyen körülmények között viszont a rétegek nehezen választhatók el, háromfázisú rendszer jött létre. A szerves és a vizes fázis elválását a kiváló vas(III)-hidroxid is megnehezítette, ami így nagy feldolgozási veszteséget eredményezett. Sajnos magas hőmérsékleten elkerülhetetlen, hogy a sósav megtámadja a katalizátor anyagát, és a vas-ionok az reakcióelegybe kerülnek. A hőmérséklet változtatásával is optimalizálni kívántam a keletkező termékek arányát. Azt tapasztaltam, hogy a hőmérséklet emelése kedvezően hatott a hozamra, mivel feltehetően a katalizátor felületén adszorbeálódott, termékmolekulák – a magasabb hőmérsékletnek köszönhetően – képesek voltak deszorbeálódni. A VII. reakciókörülmények között, 80 °C-on, azonban megjelent egy új melléktermék (62). Ebben az esetben a kiindulási anyag oxim funkciós csoportján nem csak a víz eliminációja játszódott le, hanem dezaminálódás is történt. Mivel ezt a jelenséget először akkor figyeltem meg, amikor 80 °C-on, DKM/H2O=1/4 arányú oldószerelegyben végeztem el a katalitikus hidrogénezést, felmerült a kérdés, hogy sósav jelenléte nélkül, de erélyesebb körülmények között lejátszódik-e a dezaminálódás, vagy csak a korábban is észlelt enamin képződik főtermékként. Ezért a reakciót 120 °C-on, etanolban is elvégeztem (VIII.), a hidrogénezés egyéb körülményeit nem változtatva. A reakcióelegy feldolgozását követően megállapítható, hogy prótikus oldószerben, 120 °C-on már csak a 62es jelű, dezaminálódott termék nyerhető ki, tehát a hőmérséklet emelésének határt szab a dezaminálódás folyamatának lejátszódása. Összegzésül elmondható, hogy az 5-ös jelű, katalizátorméreg típusú vegyület Selcat Q (10%-os Pd/C) katalizátorral, molekuláris hidrogénnel kis részben a 27-es jelű céltermékké 23
redukálható. Magasabb hőmérsékleten (80 °C) a 25-es jelű, enamin típusú, stabil intermedier képződik, melynek továbbalakításával előállítható a 2-amino-3-(benzotiazol-2-il)propionsav, a célvegyület. Az irodalomban található példa N-terc-butoxikarbonil (50) és N-benzoil (51) szubsztituált kéntartalmú heterociklusos oldalláncú α-enamid vegyületek katalitikus hidrogénezésére, így érdemes lehet a későbbiekben vizsgálni e védőcsoportok alkalmazásának lehetőségét is. A feldolgozásnál használt oszlopkromatográfiás tisztítás mellett, a az ioncserélő gyantán történő elválasztás alkalmazása is felmerülhet lehetőségként. Kísérletet tettem az 5-es vegyület redukciójára etanolban, 45 bar nyomáson, 60°C-on, Raney®-nikkel katalizátor jelenlétében, 24 órás reakcióidő mellett (30. ábra). A termékelegyből az 5-ös számú kiindulási anyagot 58%-ban, a 25-öst 4%-ban, míg a 27-est 1%ban tudtam kinyerni. Valószínűleg a nikkel reakcióba lépett a kénnel, elbontva így a kiindulási anyagot, ami magyarázhatja a mintegy 35%-nyi anyagveszteséget.
30. ábra Az 5 katalitikus hidrogénezése Raney®-nikkel katalizátor jelenlétében Ried és Schiller erélyesebb körülmények között (60 bar, 70 °C) hajtotta végre a reakciót, és a 25-öt nyomnyi mennyiségben, a 27-et 29%-os, míg az 26-ös jelű dilaktámot 5%-os termeléssel kapták meg.23 A katalitikus hidrogénezések során a reakciókat a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat mellett a hidrogénnyomás csökkenése alapján is követtem. A 250 ml-es autokláv testhez 24 bar-os nyomásig használható fejet használtam, amelyen biztonságosan be tudtam állítani a 10 bar nyomást. Az elméleti nyomásesés 0,5 bar volt, amit minden esetben megfigyeltem a manométeren. A 24 óra alatt mért hidrogénfogyás közelítőleg megfelelt az elméletileg szükségesnek, kivéve azoknál a reakcióknál, ahol jelentős mennyiségű sósavgáz képződött. Raney®-nikkel
katalizátor
jelenlétében
más
hidrogénforrással,
pl.
nátrium-
borohidriddel, lúgos-metanolos közegben, 20–30 °C között is végrehajtottam a reakciót. Ebben az esetben azonban nem tapasztaltam a fent említett termékek keletkezését.
24
2.2.Hidrides redukció Az 5-ös oxim redukcióját először nátrium-borohidriddel kíséreltem meg, különböző alkohol
típusú
oldószerekben,
Kutatócsoportunkban
az
szobahőmérsékleten,
ám
nem
jártam
eredménnyel.
etil-[3-(3-metilkinoxalin-2-il)-2-(hidroxiimino)propionát]
(63)
redukcióját hasonló módon elvégezve azt tapasztalták, hogy a kiindulási vegyület a refluxáltatást követően az észter-csoport alkohollá történő redukcióját tapasztalták, hogy az észter funkció alkohollá redukálódott, míg az oxim-csoport változatlan maradt (31. ábra).
31. ábra A 63 észter 64 alkohollá történő redukciója A továbbiakban különböző módszerekkel próbáltam a nátrium-borohidrid aktivitását növelni, többek között a hőmérséklet emelésével, oldószercserével, Lewis-sav vagy heterogén katalizátor hozzáadásával, valamint inert atmoszféra biztosításával. A kísérleteim során alkalmazott körülményeket a d. táblázatban foglaltam össze. d. táblázat Kísérletek 5 oxim redukciójára NaBH4-del Jelzés
Oldószer
I. II. III. IV. V. VI. VII. VIII. IX. XI.
EtOH MeOH MeOH EtOH/NaOH MeOH/NaOH EtOH/NaOH MeOH/NaOH MeOH/NaOH MeOH EtOH
A
reakciókat
reakcióidő Hőmérséklet (óra) (°C) 24 RT 24 RT 24 RT 24 RT 24 RT 24 RT 24 RT 24 RT 24 RT 24 RT
NaBH4 (ekv) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
vékonyréteg-kromatográfiával
Egyéb körülmény argon atm. 0,35 ekv. NiCl2 0,35 ekv. NiCl2 kat. Ni0 kat. Ni0 spat. RaNi 2 ekv. NiCl2 kat.Ni0
követtem.
VRK eredménye + + + + + + +
Eluensként
n-butanol:víz:ecetsav 3:1:1 arányú elegyét, a termékként keletkező amin előhívására pedig ninhidrin oldatot alkalmaztam. A reduktív aminálási reakcióimhoz hasonlóan, III-XI. körülmények között Rf1=0,65 és Rf2=0,18 lila színű termékfoltok jelentek meg. Ebből arra következtettem, hogy C=N kettőskötés redukciója végbement.
25
Az I. és II. körülmények között a kiindulási anyag átalakulását nem tapasztaltam. . A III. reakciót argon atmoszférában hajtottam végre, ám ez önmagában a nátrium-borohidrid aktiválásához nem volt elégséges. Ezt követően Liu alapján egy lépésben próbáltam meg az 5 oxim-észtert
2
aminosavvá
átalakítanit.36
Az
in
situ
képződő
nikkel-borid
jó
transzferhidrogénező ágensként szolgált a reakciók során. Nikkel forrásként nikkel(II)-kloridhexahidrát, katalitikus mennyiségű mikroszemcsés amorf nikkel(0) és spatulányi vizes Raney®nikkel is alkalmasnak bizonyult. A reakcióelegy feldolgozása során a következőket tapasztaltam: a IV-VII. reakcióelegyekből (VI. és VII. esetében a Ni0 kiszűrése után) a pH-t 4,5- re állítva fehér színű csapadék vált ki. A csapadék a szokásos oldószerekben nem volt feloldható, infravörös spektrumából arra következtettem, hogy a lúgos közegben a reakció során 26 dilaktám képződött. A diketopiperazin (26) képződését megelőzendő, VIII. reakciót megismételtem lúg hozzáadása nélkül. Savasan extrahálva a termék a vizes fázisban található, míg lúgos körülmények között a kiváló Ni(OH)2 akadályozta meg a termék kinyerését. Lapkromatográfiás elválasztás során a termékek nem tudtam lemosni a szilikagélről. Ioncserélő gyanta alkalmazása megoldást jelenthet a fent említett problémák kiküszöbölésére. 2.3.Cinkes redukció Ried és Schiller kísérletet tettek 5 vegyületet cink-sav rendszerrel történő előállítására, ám nem jártak sikerrel.23 Ennek ellenére én is kísérletet tettem az oxim-csoport ilyen módú redukciójára. Japán kutatók 45d-g kéntartalmú vegyületekre kidolgozott redukciós eljárását (17. ábra) 6 vegyület előállítására is megpróbáltam kiterjeszteni, ám nem jártam sikerrel. Bár a reakció megvalósítása eddigi tapasztalataim alapján nem tűnt egyszerűnek, irodalmi analógiákból ötletet merítve, tovább folytattam 5 oxim átalakítására vonatkozó kísérleteimet.
Kukolja34
és
Hatanaka30
alapján
a
kiindulási
anyagot
feloldottam
hangyasav:etanol:víz 5:5:3 arányú elegyében, majd 0°C-on 40 perc alatt 3,8 ekvivalens cinket adagoltam az oldathoz, további 3 órán át 0°C-on tartottam a hőmérsékletet, majd 20 órán keresztül szobahőmérsékleten kevertettem a reakcióelegyet. A cink kiszűrését követően vákuumdesztillációval eltávolítottam az etanolt, a desztillációs maradékot etil-acetát és 5%-os sósav-oldat1:1 térfogatarányú elegyével extraháltam. Ezek után a vizes fázis pH-ját 1N NaOH oldattal 8-9 közé állítottam, és a kiváló cink(II)-hidroxidot kiszűrtem. Majd az immáron lúgos 26
vizes fázist etil-acetáttal extraháltam, a szerves fázis szárítását és bepárlását követően jutottam a sárgásbarana olajszerű 27 amin-észterhez, 38%-os termeléssel (32. ábra).
32. ábra A 27 előállítása cink-hangyasav rendszerrel A reakció során körülbelül 45%-ban 1H NMR alapján nem beazonosítható melléktermék keletkezik, amely a savas extrakció során átkerült a szerves fázisba. Egy 2003-as kutatás alapján az oxim-csoport redukciója megvalósítható ammóniumformiát és cink jelenlétében, metanolban reflux hőmérsékleten.28 Ezt a módszert amerikai és belga kutatók közelmúltban megjelent publikációja is alátámasztotta. 29A recepteket átültettem 5 vegyület esetére is. Öt órás refluxáltatást követően a termékfoltok megegyezők voltak az előzőekben leírt hangyasav/cink redukció során képződőkkel, így a feldolgozást is hasonlóan végeztem el (szűrés, savas, majd lúgos extrakció). A keletkező barnás olajat acetonitrilből szárazjéggel kikristályosítottam, és 47%-ban kaptam ebben az esetben nem tiszta terméket. 3. Kísérlet enamin redukciójára A katalitikus hidrogénezési reakciók során stabil 25 intermedier keletkezését tapasztaltam, így felvetődött annak a lehetősége, hogy a keletkezett enamin kémiai redukcióját vizsgáljam. Fülöp Ferenc és munkatársai által ß-amino-észterek (20. ábra) előállítására kidolgozott eljárást követtem.43 25 vegyületet etil-acetátban oldottam három ekvivalens ecetsavat és két ekvivalens nátrium-cianoborohidridet adtam a rendszerhez 0°C-on. Három órát jeges hűtés mellett, majd további 12 órán át szobahőmérsékleten kevertettem az elegyet Vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálataim során a kiindulási anyag megléte mellett két melléktermék
keletkezését
tapasztaltam.
A
feldolgozást
követően
a
termékeket
lapkromatográfiával próbáltam szétválasztani . 4. Oxim-észter hidrolízise Az irodalomban nem csak α-oxim-észterek, hanem α-oxim-savak redukciójáról is írnak.35 Így 5 észter hidrolízisének lehetőségeit is vizsgáltam, az eredményekről a 33. és 34. ábrán számolok be. 27
33. ábra Kísérlet 5 hidrolízisére erélyes körülmények között Az 5%-os sósavoldatban két óra alatt reflux hőmérsékleten végzett kísérletem során 64%-ban keletkezett 65 α-oxosav. Az eredmény némileg magyarázatot ad az eddigi savas körülmények között végrehajtott redukciós kísérleteim (32. ábra) lehetséges mellékreakcióira. A
lúgos
hidrolízist
két
ekvivalens
lítium-hidroxiddal
szobahőmérsékleten,
terahidrofurán:víz 5:2 arányú elegyében, intenzív kevertetés mellett, 24 óra alatt hajtottam végre. A rendszert hangyasavval megsavanyítottam, a vizes fázis mennyiségét desztillált víz hozzáadásával megnöveltem, és ezt követően etil-acetáttal extraháltam. A szárítást és a bepárlást követően jutottam 67 oxim-savhoz.
34. ábra Az 5 oxim-észter lúgos hidrolízise Az előállított 67 oxim-sav redukcióját időhiány miatt nem vizsgáltam. 5. Amin-észter hidrolízise 5 vegyület lúgos hidrolízisének körülményeit (35. ábra, I.) alkalmaztam 27 vegyületet hidrolízise során is. A fázisokat választótölcsérben elválasztottam egymástól. A vizes fázis pHját 4-5 közé állítottam 1N sósav-oldat adagolásával, majd etil-acetáttal extraháltam. Az extrakció során fehér színű kristály vált ki, amit infralámpa alatt szárítottam. 1H NMR-rel igazoltam, hogy a várt 2-es jelű aminosav 16%-ban keletkezett. A tetrahidrofurános fázis bepárlásából sárga olajat kaptam, amelyből dietil-éterrel történő szárazjeges dörzsölés során szobahőmérsékleten stabil (feltehetően az előzőekben kinyerttel ellentétben kristályvizet nem tartalmazó, és nem teljesen tiszta volt) kristályok keletkeztek (25%), 1H NMR jelei alapján azt állapítottam meg, hogy a két anyag azonos, az összesített termelés 41%.
28
35. ábra 2-amino-3-(benzotiazol-2-il)propánsav (2) előállítása hidrolízissel Kísérletet tettem 27 amin-észter hidrolízisére 5N sósav oldatban refluxáltatva 7 órán keresztül (35. ábra, II.). A pH-t semlegesre állítottam 10%-os nátrium-karbonát oldattal, majd azonos térfogatú etanolt adtam a rendszerhez és azeotróp bepárlást végeztem. A maradékhoz kevés hideg vizet adva feloldottam a nátrium-kloridot, a visszamaradó világosbarna kristályt szűrtem és dietil-éterrel mostam. Ezt követően infralámpa alatt szárítottam, 10%-os termeléssel jutottam 2 aminosavhoz. 6. Redukciós módszerek összehasonlítása Az előzetes kísérleteim 27 előállítására reduktív aminálással nem vezettek eredményre. Így a továbbiakban a redukciós módszerek tanulmányozása során, arra kerestem a választ, hogy milyen körülmények között állítható elő a legnagyobb termeléssel 5 oxim-észterből 27 aminoészter. A hidrogén atmoszférában, 10bar-on, 24 óra alatt, Selcat Q6 10% Pd/C katalizátor jelenlétében elvégzett katalitikus hidrogénezések során azt tapasztaltam, hogy sósavas közegben, 40-80°C hőmérséklet intervallumban az aminná történő redukció kedvezményezett. A legnagyobb termeléseket 40°C-on, diklórmetán oldószerben (16%) és 80°C-on 0,5M sósavas etanol közegben (15%) végrehajtott reakciók során értem el. A módszer hátránya, az alacsony termelés mellett, hogy 80°C alatt stabil enamin intermedier keletkezik; míg 80°C felett dezaminálódás történik. Továbbá a reakció nem költséghatékony, hiszen a katalizátort jelentős mennyiségben alakalmaztam, mivel a szubsztrátum katalizátorméreg típusú vegyület. Cink-hangyasav redukciót kipróbálva figyeltem meg, hogy a hőmérséklet nagy befolyással bír a képződő termékre, mivel az oldószer forrpontján végzett reakciók során nem tapasztaltam az amin funkció kiépülését, addig 0°C-on lejátszódik az oxim-csoport redukciója, 27 vegyületet közepes hozammal állítottam elő
29
7. Az enzimatikus átalakítás A Fermentia Kft.-nél eltöltött kötelező nyári szakmai gyakorlat alatt – többek között – PcPAL fermentációjával foglalkoztam. Gazdaszervezetként génmódosított Echerichia coli Rosetta (DE3) törzset használtam, a biokatalizátor expresszióját 10 literes fermentorban hajtottam
végre,
a
sejtek
feltárását
homogenizátorral
végeztem.
Az
enzimet
a
kutatócsoportunkban affinitás-kromatográfiával tisztították: a rekombináns fehérje egy polihisztidin jelölést tartalmaz, ami alkalmas Ni2+ ionok komplexálására. A PcPAL enzim több heteroaromás L-fenilalanin és (E)-fahéjsav analogont is elfogad szubsztrátjaként (26. ábra). UV-VIS spektrofotometriás méréssel igazoltam, hogy az enzim katalizálja az ammónia eliminációját 2-amino-3-(benzotiazol-2-il)propánsav (2) vegyületből miközben (E)-3-(benzotiazol-2-il)akrilsav (3) keletkezik. Az enzimaktivitás optimuma TRISpufferben [0,1M trisz-hidroximetil(aminometán)] 8,5-9,0 pH-n van. A mérések során 8,8 pHjú oldatokat használtam. Az aminosav és az akrilsav teljes spektrumának felvételéhez 2-t és 3t 0,045mM koncentrációban tartalmazó oldatát használtam. A 36. ábra alapján megállapítottam, hogy 30°C-on 310 nm-en 3 vegyület abszorbanciájának lokális maximuma van, míg 2 vegyületnek nincs elnyelése, így az enzimaktivitás mérést ezen a hullámhosszon végeztem. 2,5
Abszorbancia (-)
2
1,5
1
0,5
0 210
230
250
270
290
310
330
350
370
390
Hullámhossz (nm) (E)-3-(benzotiazol-2-il)akrilsav
3-amino-(benzotiazol-2-il)propánsav
36. ábra A 2 és 3 vegyületek teljes spektruma Az enzimkinetikai méréshez 2 4,5mM koncentrációjú TRIS-oldatához 300 µl 0,12 mg/ml koncentrációjú natív enzimet adtam és vizsgáltam, hogy 30°C-on az idő függvényében 30
hogyan változik az abszorbancia 310 nm-en. A 37. ábra alapján kijelenthető, hogy a 2 vegyület szubsztrátja a PcPAL enzimnek, hiszen az abszorbancia monoton nő az idő függvényében. 1,2
Abszorbancia (-)
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
idő (másodperc)
37. ábra Enzimkinetikai görbe A 2 aminosav sikeres szintézisét megelőzően már vizsgáltam az enzimkatalizált addíciós reakciókat is. A biotranszoformációt natív és ChiralVision Immobead T2-150 hordozóhoz rögzített enzimmel is végrehajtottam. A kísérleteimet ammónia 6M-os vizes oldatában, melynek a pH-ját szárazjég hozzáadásával 10,2-re állítottam, termosztálható rázógépben, 30°C-on végeztem. Vékonyréteg-kromatográfiával követve az átalakulást, ninhidrinnel előhívott lila színű foltból a reakció sikerességére következtettem. Kísérleteket végeztem nem konvencionális közegekben, magas ammóniakoncentrációjú (2-8 M) metanolos és etanolos oldatokban is, melyek szintén pozitív eredménnyel jártak. Az azóta eltelt időben 2 vegyület sikeres szintézisét megvalósítottam, így a jövőben alkalmunk nyílik az előzetes vizsgálataim eredményeit komolyabb analitikai módszerekkel alátámasztani.
31
Összefoglalás 1. Kutatómunkám során 2-metilbenzotiazolból (1) kiindulva optimáltam az etil-[3(benzotiazol-2-il)-2-(hidroxiimino)propionát
(5),
és
reprodukáltam
az
(E)-3-
(benzotiazol-2-il)akrilsav (3) előállítását. Az 1 → 5 átalakítás 4-es számú oxo-észter köztitermékének előállítását az eddigi 58% helyett 81%-os termeléssel valósítottam meg; valamint 4 hidroxil-ammónium-kloriddal történő átalakításakor a korábbi 88%-os hozammal szemben 94%-os hozamot sikerült elérnem. 2. Megkíséreltem a 4-es számú oxo-észter típusú vegyület reduktív aminálással történő átalakítását, de kísérleteim nem voltak eredményesek. 3. Sikeresen
előállítottam
2-amino-3-(benzotiazol-2-il)propánsavat
(2)
etil-[3-
(benzotiazol-2-il)-2-(hidroxiimino)propionátból (5) kiindulva. Különböző redukciós módszereket kipróbálva megállapítottam, hogy a célvegyület egy kétlépéses szintézis során állítható elő a legjobb hozamban. Első lépésként etil-[3-(benzotiazol-2-il)-2(hidroxiimino)propionát (5) cink hangyasav:víz:etanol oldószerelegyben történő redukcióját hajtottam végre 38%-os termeléssel. A redukció főtermékét, a 27-es számú intermediert lúgos hidrolízissel továbbalakítottam, így 2-amino-3-(benzotiazol-2il)propánsavat (2) 41%-ban nyertem ki a reakcióelegyből. 4. A redukciós módszerek összehasonlítása során magyarázatot adtam a katalitikus hidrogénezés során keletkező termékelegy összetételének arányára, melyet a reakció körülményeinek változtatásával próbáltam eltolni a 27-es számú intermedier keletkezésének irányába. 5. UV-VIS spektrofotometriás méréssel igazoltam, hogy a Petroselinum crispum
L-
fenilalanin-ammónia-liáz enzim katalizálja az ammónia eliminációját 2-amino-3(benzotiazol-2-il)propánsav
(2)
vegyületből
(E)-3-(benzotiazol-2-il)akrilsav
(3)
képződését eredményezve.
32
Kísérleti rész Alkalmazott módszerek A reakciók követésére Merck Kieselgel 60 F254 VRK lapokat használtam. Előhíváshoz UV-fényt (Vilber Lourmat VL-6.Lc, 254 nm és 365 nm), valamint foszfor-molibdénsavas oldatot, jódot, vagy ninhidrin-oldatot (3m/m%-os propanolos oldata+egy csepp ecetsav) használtam. Az oszlopkromatográfiás elválasztásokat Kieselgel 60 G, valamint Merck Kieselgel 60 (0,0015 mm- 0,0040 mm) szilikagél segítségével végeztem. Az NMR spektrumok Bruker DRX-500 készüléken kerültek felvételre (500 és 300 MHz). A kémiai eltolódásokat (δ) ppm, a csatolási állandókat (J) Hz mértékegységben tüntettem fel. Az anyagok IR spektruma Bruker ALPHA FT-IR készülék segítségével készült. A fotometriás méréseket Spectronic Genesys 2 típusú UV-spektrofotométer segítségével végeztem el. 1. Reprodukció I.58 Triklóracetaldehid (klorál) Háromnyakú-gömblombikba klorál–hidrátot (50g; 0,303 mol) mértem, 25 ml koncentrált kénsavval forraltam fél órán át (kálcium-kloridos csövet tettem a refluxhűtőre), majd az így kialakult két fázist szobahőmérsékletre hűlést követően elválasztottam. A klorálos fázist kétszer koncentrált kénsavval mostam. A szerves fázist ledesztilláltam. Előpárlatot 35°C-ig szedtem, majd 92-97°C között főpárlatot, így 26 g (0,176 mol; 58%-os termelés) tiszta, átlátszó, színtelen folyadékot nyertem. A terméket törésmutatója n=1,455. A klorált sötétített üvegben, parafilmmel lezárva, alufóliával körbetekerve a mélyhűtőben tároltam. Alkalmazásakor kerültem a fényt, az oldat felmelegedését, mivel ezek mindegyike okozhatja a vegyület polimerizálódását. 3-(Benzotiazol-2-il)-1,1,1-triklórpropán-2-ol (6) 2-metilbenzotiazolt (1; 3,0 ml; 3,52 g; 24 mmol) vízmentes piridinbe (12 ml) tettem, majd hozzáadtam a triklóracetaldehidet (3,0 ml; 4,55 g; 30,89 mmol). 11 órát forraltam a reakcióelegyet, majd bepároltam. A bepárlási maradékot 1N HCl (50 ml) és etil-acetát (15 ml) hozzáadásával kevertettem, a kivált kristályokat szűrtem, vízzel (25 ml) semleges pH-ig mostam. Így nyerstermékként barna színű kristályos anyagot (6,46 g) kaptam, amelyet vákuum
33
oszlopkromatográfiával
tisztítottam (hexán:etil-acetát 10:1).
Így citromsárgás színű
kristályokat (6; 5,0 g; 18,7 mmol 78%-os termelés) kaptam. C10Cl3H8NOS Op.: 126 °C (irodalmi: 125,5-126 °C) 1H
NMR (CDCl3, 500 MHz): δ (ppm): 7,98 (d, 1H, ArH); 7,86 (d, 1H, ArH), 7,47 (t, 1H,
ArH), 7,39 (t, 1H, ArH), 4,95 (d, 1H, OH), 4,77 (d, 1H, CH), 3,88 (m, 1H, CH2), 3,51 (m, 1H, CH2) 3-(Benzotiazol-2-il)prop-2-énsav (3) KOH-ot (2,84 g; 51 mmol) feloldottam EtOH-ban (17 ml) forralva, majd hozzáadtam a 6 kloráladduktot (2,52 g; 12 mmol) és 5 órát forraltam a reakcióelegyet. A kivált kristályokat szűrtem, forró EtOH-lal (3 × 5 ml) mostam, majd EtOH-ban (10 ml) újra felvettem és forraltam 10 percet, utána újra szűrtem. Az egyesített szűrleteket bepároltam, majd a keletkezett kristályokat vízben feloldottam, és 1N HCl oldattal pH 5-ig savanyítottam a vizes oldatot. A kivált kristályokat, szűrtem, vízzel (10 ml) semleges pH-ra mostam, így barna kristályokat (3; 1,13 g; 5,5 mmol; 46%) kaptam. C10H11NO2S Op.: 217-218°C 1H
NMR (DMSO-d6, d-TFA, 500MHz): δ (ppm): 11,98 (s, 1H, COOH), 8,12 (d, 1H, ArH),
8,05 (d, 1H, ArH), 7,75 (d, 1H, CH=CH), 7,55 (t, 1H, ArH), 7,49 (t, 1H, ArH), 6,81 (d, 1H, CH=CH). 2. Reprodukció II. és optimalizálás59 Etil-[3-(benzotiazol-2-il)-2-oxopropionát] (4) Kihevített négynyakú gömblombikba argon atmoszféra alatt nátrium-hidridet (60%-os szuszpenzió formájában; 1,50 g; 37,6 mmol), vízmentes tetrahidrofuránt (30 ml) és 4 kiindulási vegyületet (1; 2,80 g; 2,26 ml; 18,8 mmol) mértem be. Az elegyet 50-60°C között egy órán át kevertettem, majd 30 perc alatt dietil-oxalát (5,49g; 5,1 ml; 37,6 mmol) vízmentes tetrahidrofurános (10 ml) oldatát csepegtettem hozzá. A reakcióelegyet 48 órát forraltam, a keletkező citromsárga szuszpenzió keveredését további tetrahidrofurán (50 ml) hozzáadásával segítettem elő. Ezt követően szobahőmérsékletre hűtöttem, az elegyhez dietil-étert (30 ml) ecetsavat (3 ml), valamint vizet (30 ml) adtam. A keletkezett kétfázisú rendszert intenzíven kevertettem. Kiszűrtem keletkező kristályokat (4; 3,814 g; 15,3 mmol; 81 %). 34
C12H11NO3S Op.: 147°C 1H
NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7,92 (d, J = 7,8 Hz, 1H, ArH); 7,86 (d, J = 7,6 Hz, 1H, ArH);
7,51 (t, J = 7,4 Hz, 1H, ArH); 7,40 (t, J = 7,3 Hz, 1H, ArH); 6,80 (s, 1H, CH=C); 4,40 (q, J = 7,1 Hz, 2H, O-CH2-CH3); 1,42 (t, J = 7,1 Hz, 3H, O-CH2-CH3) ppm. Etil-[3-(benzotiazol-2-il)-2-(hidroxiimino)propionát] (5) Háromnyakú gömblombikban a 4 kiindulási anyagot (4,01 g; 16,1 mmol) EtOH-ban (300ml) melegítve feloldottam. Ecetsavat (115µl), majd hidroxilammónium–hidroklorid (1,23g 17,7 mmol) vízzel készített oldatát (20 ml) adtam az oldathoz. A reakció szobahőmérsékleten öt nap alatt játszódott le. A reakcióelegyet bepároltam, vízben felvettem, a kivált kristályokat szűrtem, infralámpa alatt szárítottam (5; 4,02g;15,2 mmol; 94 %-os hozam). C12H12N2O3S Op.: 142°C 1H
NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8,02 (d, J = 8,1 Hz, 1H, ArH); 7,82 (d, J = 7,9 Hz, 1H, ArH);
7,44 (t, J = 7,3 Hz, 1H, ArH); 7,36 (t, J = 7,0 Hz, 1H, ArH); 4,51 (s, 2H, CH2); 4,32 (q, J = 7,1 Hz, 2H, O-CH2-CH3); 2,18 (s, 1H, OH); 1,32 (t, J = 7,1 Hz, 3H, O-CH2-CH3) ppm. 3. Saját kísérletek Áltános eljárás Etil-[3-(benzotiazol-2-il)-2-(hidroxiimino)propionát] (5) katalitikus hidrogénezésére 250 ml-es autoklávtestbe mértem 5 kiindulási anyagot (0,5g, 1,9mmol), melyet az oldószerben (50 ml) feloldottam, majd hozzáadtam a katalizátort (Selcat Q6 10% Pd/C; 0,25g). A 24 bar-os fejet rászereltem a testre, a csavarokat átellenesen meghúztam. Nitrogén gázzal inertizáltam a készüléket, majd hidrogén gázzal kétszer átöblítettem, végül 10 bar nyomásra feltöltöttem az autoklávot. Felmelegítettem a kívánt hőmérsékletre, és 24 órán keresztül intenzíven kevertettem a reakcióelegyet. Ezt követően hagytam szobahőmérsékletre lehűlni, feljegyeztem a hidrogénfogyást, majd nitrogénnel inertizáltam. Üvegszűrővel, Celit®-en kiszűrtem a katalizátort. A reakcióelegyet bepároltam, a termékeket oszlopkromatográfiával választottam el egymástól (hexán:etil-acetát gradiens elúcióval). Etil-[2-amino-3-(benzotiazol-2-il)akrilát] (25) 250 ml-es autoklávtestbe mértem etil-[3-(benzotiazol-2-il)-2-(hidroxiimino)propionát] (5;
35
0,50g; 1,9mmol), melyet diklórmetánban (50 ml) feloldottam, majd hozzáadtam a katalizátort (Selcat Q6 10% Pd/C; 0,25g). A 24 bar-os fejet rászereltem a testre, a csavarokat átellenesen meghúzva. Nitrogén gázzal inertizáltam, hidrogén gázzal kétszer átöblítettem, majd 10 bar nyomásra feltöltöttem a készüléket. 60°C-on, 24 órán keresztül ment a reakció. Ezt követően hagytam szobahőmérsékletre lehűlni, ~0,4 bar nyomáscsökkenést tapasztaltam, majd nitrogénnel inertizáltam. Üvegszűrővel, Celit®-en kiszűrtem a katalizátort. A reakcióelegyet bepároltam. A termékeket oszlopkromatográfiával választottam el egymástól, hexán:etil-acetát 100:3 eluenset használva jutottam 25 citromsárga, kristályos termékhez (0,28g; 56%-os termelés). C12H12N2O2S Op.: 120°C 1H
NMR (300 MHz, DMSO): δ 8,00 (d, J = 7,8 Hz, 1H, ArH); 7,91 (d, J = 8,0 Hz, 1H, ArH);
7,68 (s, 2H, NH2); 7,46 (t, J = 7.5 Hz, 1H, ArH); 7,33 (t, J = 7.5 Hz, 1H, ArH); 6,24 (s, 1H CH=C); 4,30 (q, J = 7.1 Hz, 2H, OCH2); 1,32 (t, J = 7.1 Hz, 3H, CH3) ppm. 13C
NMR (75 MHz, DMSO): δ 166,0; 163,5; 153,4;, 140,0; 132,7; 126,6; 124,3; 121,2; 91,7;
61,9; 57,2; 39,8; 39,5; 39,2; 14,0 ppm. IR (KBr, cm-1): 3456, 3303, 2989, 1719, 1609, 1418, 1296, 1221, 755. Etil-[3-(benzotiazol-2-il)propanoát] (62) 250 ml-es autoklávtestbe mértem etil-[3-(benzotiazol-2-il)-2-(hidroxiimino)propionát] (5; 0,45g; 1,7 mmol), etanolban (50 ml) feloldottam, majd hozzáadtam a katalizátort (Selcat Q6 10% Pd/C; 0,23g). A 24 bar-os fejet rászereltem a testre, a csavarokat átellenesen meghúzva. Nitrogén gázzal inertizáltam, hidrogén gázzal kétszer átöblítettem, majd 10 bar nyomásra feltöltöttem a készüléket. 120°C-on, 24 órán keresztül ment a reakció. Ezt követően hagytam szobahőmérsékletre lehűlni, ~0,5 bar nyomáscsökkenést tapasztaltam, majd nitrogénnel inertizáltam. Üvegszűrővel, Celit®-en kiszűrtem a katalizátort. A reakcióelegyet bepároltam. A termékeket oszlopkromatográfiával tisztítottam hexán:etil-acetát 10:1 eluenst használva jutottam 62 szürkés, kristályos termékhez (62; 0,18 g; 45%). C12H13NO2S 1H
NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7,97 (d, J = 8,0 Hz, 1H, ArH); 7,85 (d, J = 7,9 Hz, 1H, ArH);
7,46 (t, J = 7,4 Hz, 1H, ArH); 7,36 (t, J = 7,4 Hz, 1H, ArH); 4,18 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH2); 3,45 (t, J = 7,4 Hz, 2H, CH2); 2,95 (t, J = 7,4 Hz, 2H, CH2); 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H, CH3) 36
ppm. 13C
NMR (75 MHz, CDCl3): δ 172,2; 170,0; 153,4; 126,2; 125,1; 122,9; 121,7, 61,0; 33,4;
29,5; 14,4 ppm. IR (KBr, cm-1): 3435, 2935, 1729, 1181, 760. Etil-[3-amino-(benzotiazol-2-il)propanoát] (27) Egynyakú gömblombikba bemértem etil-[3-(benzotiazol-2-il)-2-(hidroxiimino)propionát] (5; 0,54g; 2,0 mmol), etanolt (10 ml), 100%-os hangyasavat (10 ml) és desztillált vizet (6 ml). A rendszert 0°C-on tartottam jeges hűtéssel, fél óra alatt apránként hozzáadagoltam a cinket (0,4935 g; 7,5 mmol), majd további három órán keresztül 0°C-on tartottam a hőmérsékletet. Ezt követően 12 órát kevertettem szobahőmérsékleten. A cinket kiszűrtem, az etanolt ledesztilláltam vákuumban. Majd etilacetátot (10 ml) adtam hozzá, elválasztottam a fázisokat, és a szerves fázist 5%-os sósav oldatottal kiráztam választótölcsérben (3x10 ml). Egyesítettem a vizes fázisokat, a pH-t. 1N NaOH-oldattal 8-ra állítottam, a kiváló fehér csapadékot kiszűrtem, majd a vizes fázis etil-acetáttal extraháltam (3x30 ml). Az egyesített szerves fázisokat nátriumszulfáttal szárítottam, majd bepároltam, így jutottam sárgás-barna olajhoz (27; 0,19 g; 38%). C12H14N2O2S 1H
NMR (500 MHz, DMSO): δ 8,07 (d, J = 8,0 Hz, 1H, ArH); 7,96 (d, J = 8,1 Hz, 1H, ArH);
7,50 (t, J = 7,6 Hz, 1H, ArH); 7,42 (t, J = 7,6 Hz, 1H, ArH); 4,09 (dd, J = 7,0; 5,0 Hz, 1H, CH); 3,95 (t, 1H, OCH2); 3,48 (dd, J = 15,3; 5,4 Hz, 1H, CH2); 3,39 (dd, J = 15,3, 7,4 Hz, 1H, CH2); 1,13 (t, J = 7,1 Hz, 3H, CH3) ppm. 13C
NMR (75 MHz, DMSO): δ 172,6; 168,1; 152,1; 134,7; 126,1; 125; 122,12; 122,1; 60,7;
53,4; 37,2; 13,9 ppm. IR (KBr, cm-1): 3438, 3231, 2986, 1728, 1589, 1131, 758. 3-Amino-(benzotiazol-2-il)propánsav (2) Egynyakú gömblombikba mértem etil-[3-amino-(benzotiazol-2-il)propanoát] (27; 43 mg; 0,17 mmol), THF-et (1,370µl), desztillált vizet (550µl). A kiindulási anyag feloldását követően lítium-hidroxidot (33 mg; 0,79 mmol) adtam a reakcióelegyhez. Szobahőmérsékleten internzíven kevertettem 24 órát. A fázisokat választótölcsérben elválasztottam egymástól. A vizes fázis pH-ját 4-5 közé állítottam 1N sósav-oldat adagolásával, majd etil-acetáttal extraháltam, mely során fehér színű kristály vált ki, amit infralámpa alatt szárítottam (2; 7 mg; 0,028 mmol; 16%). A tetrahidrofurános fázis bepárlásából sárga olajat kaptam, amelyből dietil37
éterrel történő szárazjeges dörzsölés során szobahőmérsékleten kristályok keletkeztek (2; 11mg; 0,044 mmol; 25%). A két vegyület azonos 1H NMR alapján, így összesen 41%-ban sikerült kinyernem a 2 terméket. 1H
NMR (500 MHz, DMSO): δ 8,06 (d, J = 7,7 Hz, 1H, ArH); 7,94 (d, J = 8,1 Hz, 1H, ArH);
7,49 (t, J = 7,1 Hz, 1H, ArH); 7,41 (t, J = 7.3 Hz, 1H, ArH); 3,77 – 3,56 (m, 3H, CH+CH2). 4. Károlyi Johanna diplomamunkája alapján reprodukáltam triklóracetaldehid (klorál) Háromnyakú-gömblombikba klorál–hidrátot (50g; 0,303 mol) mértem, 25 ml koncentrált kénsavval refluxáltattam fél órán át (kálcium-kloridos csövet tettem a refluxhűtőre), majd az így kialakult két fázist szobahőmérsékletre hűlést követően elválasztottam. A klorálos fázist kétszer koncentrált kénsavval mostam. A szerves fázist ledesztilláltam. Előpárlatot 35°C-ig szedtem, majd 92-97°C között főpárlatot (26 g; 0,176 mol; 58%-os termelés) tiszta, átlátszó, színtelen folyadék. A terméket törésmutatója n=1,455. A klorált sötétített üvegben, parafilmmel lezárva, alufóliával körbetekerve a mélyhűtőben tároltam. Alkalmazásakor kerültem a fényt, az oldat felmelegedését vagy a szennyezők bevitelét, mivel ezek mindegyike okozhatja a vegyület polimerizálódását.
38
3-(benzotiazol-2-il)-1,1,1-triklórpropán-2-ol (6) 2-metilbenzotiazolt (1) (3,0 ml; 3,52 g; 24 mmol) vízmentes piridinbe (12 ml) tettem, majd hozzáadtam a triklóracetaldehidet (3,0 ml; 4,55 g; 30,89 mmol). 11 órát forraltam a reakcióelegyet, majd bepároltam. A bepárlási maradékot 1N HCl (50 ml) és etil-acetát (15 ml) hozzáadásával kevertettem, a kivált kristályokat szűrtem, vízzel (25 ml) semleges pH-ig mostam. Így nyerstermékként barna színű kristályos anyagot (6,46 g) kaptam, amelyet vákuum oszlopkromatográfiával
tisztítottam (hexán:etil-acetát 10:1).
Így citromsárgás színű
kristályokat (6; 5,0 g; 18,7 mmol 78%-os termelés) kaptam. C10Cl3H8NOS Op.: 126 °C (irodalmi: 125,5-126 °C) 1H
NMR (CDCl3, 500 MHz): δ (ppm): 7,98 (d, 1H, ArH); 7,86 (d, 1H, ArH), 7,47 (t, 1H,
ArH), 7,39 (t, 1H, ArH), 4,95 (d, 1H, OH), 4,77 (d, 1H, CH), 3,88 (m, 1H, CH2), 3,51 (m, 1H, CH2) 3-(benzotiazol-2-il)prop-2-énsav (3) KOH-ot (2,84 g; 51 mmol) feloldottam EtOH-ban (17 ml) forralva, majd hozzáadtam a 6 kloráladduktot (2,52 g; 12 mmol), és 5 órát forraltam a reakcióelegyet. A kivált kristályokat szűrtem, forró EtOH-lal (3 × 5 ml) mostam, majd EtOH-ban (10 ml) újra felvettem és forraltam 10 percet, utána újra szűrtem. Az egyesített szűrleteket bepároltam, majd a keletkezett kristályokat vízben feloldottam, és 1N HCl oldattal pH 5-ig savanyítottam a vizes oldatot. A kivált kristályokat, szűrtem, vízzel (10 ml) semleges pH-ra mostam, így barna kristályokat (3; 1,13 g; 5,5 mmol; 46%-os hozam) kaptam. A reakciót a kutatócsoport e reakciójának reprodukciójával készítettem. C10H11NO2S Op.: 217-218°C (irodalmi: 223-224°C) 1H
NMR (DMSO-d6, d-TFA, 500MHz): δ (ppm): 11,98 (s, 1H, COOH), 8,12 (d, 1H, ArH),
8,05 (d, 1H, ArH), 7,75 (d, 1H, CH=CH), 7,55 (t, 1H, ArH), 7,49 (t, 1H, ArH), 6,81 (d, 1H, CH=CH). 5. Óvári László diplomamunkája alapján optimáltam Etil-[3-(benzotiazol-2-il)-2-oxopropionát] (4) Kihevített négynyakú gömblombikba argon atmoszféra alatt nátrium-hidridet (60%-os szuszpenzió formájában, 1,50 g, 37,6 mmol), vízmentes tetrahidrofuránt (30 ml) és 4 kiindulási 39
vegyületet (1, 2,80 g, 2,26 ml, 18,8 mmol) mértem be. Az elegyet 50-60°C között egy órán át kevertettem, majd 30 perc alatt dietil-oxalát (5,49g, 5,1 ml, 37,6 mmol) vízmentes tetrahidrofurános (10 ml) oldatát csepegtettem hozzá. A reakcióelegyet 48 órát refluxáltattam, a keletkező citromsárga szuszpenzió keveredését további tetrahidrofurán (50 ml) hozzáadásával segítettem elő. Ezt követően szobahőmérsékletre hűtöttem, az elegyhez dietil-étert (30 ml) ecetsavat (3 ml), valamint vizet (30 ml) adtam. A keletkezett kétfázisú rendszert intenzíven kevertettem. Kiszűrtem keletkező kristályokat (3,814 g, 15,3 mmol, 81,4 %). C12H11NO3S Op.: 147°C (irodalmi 161-162) 1H
NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7,92 (d, J = 7,8 Hz, 1H, ArH); 7,86 (d, J = 7,6 Hz, 1H, ArH);
7,51 (t, J = 7,4 Hz, 1H, ArH); 7,40 (t, J = 7,3 Hz, 1H, ArH); 6,80 (s, 1H, CH=C); 4,40 (q, J = 7,1 Hz, 2H, O-CH2-CH3); 1,42 (t, J = 7,1 Hz, 3H, O-CH2-CH3) ppm. Etil-[3-(benzotiazol-2-il)-2-(hidroxiimino)propionát] (5) Háromnyakú gömblombikban a 4 kiindulási anyagot (4,01 g, 16,1 mmol) 300ml EtOH-ban melegítve feloldottam. Ecetsavat (115µl), majd hidroxilamin–hidroklorid (1,23g 17,7 mmol) vízzel készített oldatát (20 ml) adtam az oldathoz. A reakció szobahőmérsékleten öt nap alatt játszódott le. A reakcióelegyet bepároltam, vízben felvettem, a kivált kristályokat szűrtem, infralámpa alatt szárítottam (4,02g, 15,2 mmol, 94,4%-os hozam). C12H12N2O3S Op.: 142°C (irodalmi 147°C) 1H
NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8,02 (d, J = 8,1 Hz, 1H, ArH); 7,82 (d, J = 7,9 Hz, 1H, ArH);
7,44 (t, J = 7,3 Hz, 1H, ArH); 7,36 (t, J = 7,0 Hz, 1H, ArH); 4,51 (s, 2H, CH2); 4,32 (q, J = 7,1 Hz, 2H, O-CH2-CH3); 2,18 (s, 1H, OH); 1,32 (t, J = 7,1 Hz, 3H, O-CH2-CH3) ppm. 6. Eredményes kísérleteim receptúrái Áltános eljárás Etil-[3-(benzotiazol-2-il)-2-(hidroxiimino)propionát] (5) katalitikus hidrogénezésére 250 ml-es autoklávtestbe mértem 5 kiindulási anyagot (0,5g, 1,9mmol), melyet az oldószerben (50 ml) feloldottam, majd hozzáadtam a katalizátort (Selcat Q6 10% Pd/C; 0,25g). A 24 bar-os fejet rászereltem a testre, a csavarokat átellenesen meghúzva. Nitrogén gázzal inertizáltam, hidrogén gázzal kétszer átöblítettem, majd 10 bar nyomásra feltöltöttem a készüléket. Felmelegítettem a kívánt hőmérsékletre, és 24 órán keresztül intenzíven kevertettem a rendszert. Ezt követően hagytam szobahőmérsékletre lehűlni, feljegyeztem a hidrogénfogyást, 40
majd nitrogénnel inertizáltam. Üvegszűrővel, Celit®-en kiszűrtem a katalizátort. A reakcióelegyet bepároltam, a termékeket oszlopkromatográfiával választottam el egymástól, hexán:etil-acetát eleggyel eluáltam. Etil-[2-amino-3-(benzotiazol-2-il)akrilát] (25) 250 ml-es autoklávtestbe mértem 5 kiindulási anyagot (0,50g, 1,9mmol), melyet diklórmetánban (50 ml) feloldottam, majd hozzáadtam a katalizátort (Selcat Q6 10% Pd/C; 0,25g). A 24 bar-os fejet rászereltem a testre, a csavarokat átellenesen meghúzva. Nitrogén gázzal inertizáltam, hidrogén gázzal kétszer átöblítettem, majd 10 bar nyomásra feltöltöttem a készüléket. 60°C-on, 24 órán keresztül ment a reakció. Ezt követően hagytam szobahőmérsékletre lehűlni, ~0,4 bar nyomáscsökkenést tapasztaltam, majd nitrogénnel inertizáltam. Üvegszűrővel, Celit®-en kiszűrtem a katalizátort. A reakcióelegyet bepároltam. A termékeket oszlopkromatográfiával választottam el egymástól, hexán:etil-acetát 100:3 eluenset használva jutottam 25 citromsárga, kristályos termékhez (0,28g; 56%-os termelés). C12H12N2O2S Op.: 120°C (irodalmi 122-123,5°C) 1H
NMR (300 MHz, DMSO) δ 8.00 (d, J = 7.8 Hz, 1H, ArH), 7.91 (d, J = 8.0 Hz, 1H, ArH),
7.68 (s, 2H, NH2), 7.46 (t, J = 7.5 Hz, 1H, ArH), 7.33 (t, J = 7.5 Hz, 1H, ArH), 6.24 (s, 1H CH=C), 4.30 (q, J = 7.1 Hz, 2H, OCH2), 1.32 (t, J = 7.1 Hz, 3H, CH3). 13C
NMR (75 MHz, DMSO) δ 166.04, 163.46, 153.42, 139.90, 132.74, 126.31, 124.27,
121.17, 91.65, 61.86, 57.21, 39.78, 39.50, 39.22, 13.97. IR (KBr, cm-1):3456, 3303, 2989, 1719, 1609, 1418, 1296, 1221, 755 Etil-[3-(benzotiazol-2-il)propanoát] (62) 250 ml-es autoklávtestbe mértem 5 kiindulási anyagot (0,45g, 1,7 mmol), etanolban (50 ml) feloldottam, majd hozzáadtam a katalizátort (Selcat Q6 10% Pd/C; 0,23g). A 24 bar-os fejet rászereltem a testre, a csavarokat átellenesen meghúzva. Nitrogén gázzal inertizáltam, hidrogén gázzal kétszer átöblítettem, majd 10 bar nyomásra feltöltöttem a készüléket. 120°C-on, 24 órán keresztül ment a reakció. Ezt követően hagytam szobahőmérsékletre lehűlni, ~0,5 bar nyomáscsökkenést tapasztaltam, majd nitrogénnel inertizáltam. Üvegszűrővel, Celit®-en kiszűrtem a katalizátort. A reakcióelegyet bepároltam. A termékeket oszlopkromatográfiával
41
tisztítottam 10:1 eluenst használva jutottam 25 szürkés, kristályos termékhez (62, 0,18 g; 45%os termelés). C12H13NO2S Op.: 1H
NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.97 (d, J = 8.0 Hz, 1H, ArH), 7.85 (d, J = 7.9 Hz, 1H, ArH),
7.46 (t, J = 7.4 Hz, 1H, ArH), 7.36 (t, J = 7.4 Hz, 1H, ArH), 4.18 (q, J = 7.1 Hz, 2H, OCH2), 3.45 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH2), 2.95 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH2), 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 3H, CH3). 13C
NMR (75 MHz, CDCl3) δ 172.21, 169.92, 153.40, 126.19, 125.09, 122.89, 121.73, 61.03,
33.43, 29.47, 14.41. IR (KBr, cm-1):3435, 2935, 1729, 1181, 760 Etil-[3-amino-(benzotiazol-2-il)propanoát] (27) Egynyakú gömblombikba bemértem 5 (0,54g; 2,0 mmol), etanolt (10 ml), 100%-os hangyasavat (10 ml) és desztillált vizet (6 ml). A rendszert 0°C-on tartottam jeges hűtéssel, fél óra alatt apránként hozzáadagoltam a cinket (0,4935 g; 7,5 mmol), majd további három órán keresztül
0°C-on
tartottam
a
hőmérsékletet.
Ezt
követően
12
órát
kevertettem
szobahőmérsékleten. A cinket kiszűrtem, az etanolt ledesztilláltam vákuumban. Majd etilacetátot (10 ml adtam hozzá), elválasztottam a fázisokat, és a szerves fázist 5%-os sósavoldatottal kiráztam választótölcsérben (3x10 ml). Egyesítettem a vizes fázisokat, a pH-t. 1N NaOH-oldattal 8-ra állítotam, a kiváló fehér csapadékot kiszűrtem, majd a vizes fázis etilacetáttal extraháltam (3x30 ml). Az egyesített szerves fázisokat nátrium-szulfáttal szárítottam, majd bepároltam, így jutottam sárgás-barna olajhoz (27; 0,19 g; 38%). C12H14N2O2S 1H
NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.07 (d, J = 8.0 Hz, 1H, ArH), 7.96 (d, J = 8.1 Hz, 1H, ArH),
7.50 (t, J = 7.6 Hz, 1H, ArH), 7.42 (t, J = 7.6 Hz, 1H, ArH), 4.09 (dd, J = 7.0, 5.0 Hz, 1H, CH), 3.95 (t, 1H, OCH2), 3.48 (dd, J = 15.3, 5.4 Hz, 1H, CH2), 3.39 (dd, J = 15.3, 7.4 Hz, 1H, CH2), 1.13 (t, J = 7.1 Hz, 3H, CH3). 13C
NMR (75 MHz, DMSO) δ 172.65, 168.09, 152.08, 134.67, 126.09, 125.04, 122.12,
122.05, 60.70, 53.40, 37.19, 13.89. IR (KBr, cm-1):3438, 3231, 2986, 1728, 1589, 1131, 758
42
3-amino-(benzotiazol-2-il)propánsav (2) Egynyakú gömblombikba mértem 27 (43 mg; 0,17 mmol), THF-et (1,370µl), desztillált vizet (550µl). A kiindulási anyag feloldását követően hozzáadtam lítium-hidroxidot (33 mg;0,79 mmol). Szobahőmérsékleten iternzíven kevertettem 24 órát reakcióelegyet. A fázisokat választótölcsérben elválasztottam egymástól. A vizes fázis pH-ját 4-5 közé állítottam 1N sósavoldat adagolásával, majd etil-acetáttal extraháltam, mely során fehér színű kristály vált ki, amit infralámpa alatt szárítottam (2; 7 mg; 0,028 mmol; 16%). A tetrahidrofurános fázis bepárlásából sárga
olajat
kaptam,
amelyből
dietil-éterrel
történő
szárazjeges
dörzsölés
során
szobahőmérsékleten instabil kristályok keletkeztek (2; 11mg; 0,044 mmol; 25%). Kiindulási anyag hiánya miatt a dolgozat elkészültéig nem volt lehetőségem a vegyület újbóli szintézisére, így csak 1H NMR alapján tudom igazolni a szerkezetet. 1H
NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.06 (d, J = 7.7 Hz, 1H, ArH), 7.94 (d, J = 8.1 Hz, 1H, ArH),
7.49 (t, J = 7.1 Hz, 1H, ArH), 7.41 (t, J = 7.3 Hz, 1H, ArH), 3.77 – 3.56 (m, 3H, CH+CH2).
43
Irodalomjegyzék
1
Kasperkiewicz, P.; Gajda, A.D.; Drag, M.: Biological Chemistry, 2012, 393, 843–851.
2
Pojitkov, A.E.; Efremenko, E.N.; Varfolomeev, S.: Journal of Molecular Catalysis B:
Enzymatic, 2000, 10, 47–55. 3
Lu, Y.: Current Opinion in Chemical Biology, 2005, 9, 118–126.
4
Hitoshi, I.; Masato, K.; Shigero, O.: Biopolymers, 2004, 76, 69-82.
5
Wang, C; Pettman, A.; Bacsa, J.; Xiao, J.: Angewandte Chemie, 2010, 122, 7710 –7714.
6
Baxter, E.W.; Reitz, A.B.: Reductive Aminations of Carbonyl Compounds with
Borohydride and Borane Reducing Agents in Organic Reactions, John Wiley and Sons., New York, 2002. 7
Kinbara, K.; Harada, J.; Saigo, K.; J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 2000, 1339–1347
8
Borch, R.F.; Bernstein, M.D.; Durst, H.D.: Journal of the American Chemical Society, 1971,
93, 2897-2904. 9
Abdel-Magid, A.F.; Mehrman, S.,J.: Organic Process Research & Development, 2006, 10,
971−1031. 10
Dinesh, T.; Poyatos, S.; Robertson, N.; Craig, M.; Jianliang, X.: Chemistry - A European
Journal, 2014, 20, 45-252. 11
Dinesh, T.; Weijun, T.; Chao, W.; Barbara, V.M.; Jianliang, X.: Catalyst Compounds,
Patent, 2013, WO 2013/153407 A1. 12
Thorsten, W.; Kerstin, K.; Wolfgang, F.; David, B.-G.: Process For The Reductive
Amination Of A-keto Carboxylic Acids, Patent, 2013, WO 2012/28721. 13
Koji, H.; Kazuyasu, T.: Method for Producing Methionine, Patent, 2013, US 2013/0158292
A1. 14
Knoop: Oesterlin Hoppe-Seyler's Zeitschrift fuer Physiologische Chemie, 1925 148, 311.
15
Knoop: Oesterlin Hoppe-Seyler's Zeitschrift fuer Physiologische Chemie, 1927 170, 187-
195. 16
Bourguel: Comptes Rendus Hebdomadaires des Seances de l'Academie des Sciences, 1928,
186, 1845. 17
Blasche: Biol. Z., 1933, 257, 14-15.
18
Desnuelle: Fromageot Bulletin de la Societe Chimique de France, 1934, 5, 701.
19
Rozzell, J.D.; Bommarius, A.S.: Enzyme Catalysis on Organic Synthesis, 2002, Wiley-
VCH, Weinheim Drauz, K., Waldmann. 44
20
Xue, F.;Xiao, X.;Wang, H.; Shi,Y.: Tetrahedron, 2012, 68, 6862-6867.
21
Kolar, P.; Petric, A.; Tisler, M; Felluga, F.: Journal of Heterocyclic Chemistry, 1991, 28,
1715-1720. 22
Baudet, P.; Otten, C.: Helvetica Chimica Acta, 1970, 53, 1683-1693.
23
Ried; Schiller: Chemische Berichte, 1953, 86, 730-734.
24
Crowe; Nord: Journal of Organic Chemistry, 1950, 15, 688-693.
25
Mozingo, R.; Stanton, A.H.; Wolf, D.E.; Hoffhine Jr., C.E., Easton, N.R., Folkers, K.:
Journal of American Chemical Society, 1945, 67, 2092-2095. 26
Dittmer, K.: Journal of American Chemical Society, 1949, 71, 1205-1207.
27
Wensbo, D.; Gronowitz, S.: Tetrahedron, 1996, 52, 4975-14988.
28
Abiraj, K; Gowda, D. C.: Journal of Chemical Research, 2003, 332–334.
29
Baruah, P.K.; Dinsmore, J.; King, A.M.; Salomé, C.; De Ryck, M.; Kaminski, R.; Provins,
L.; Kohn, H.: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2012, 20, 3551–3564. 30
Hatanaka,M.; Ishimaru,T.: Bulletin of the Chemical Society of Japan, 1973, 46, 3600-3601.
31
Sycheva, T.P. Kiseleva, I.D.; Shchukina, M.N.: Chemistry of Heterocyclic Compounds,
1966, 2, 529-531. 32
Ermolaeva, V.G.; Shchukina, M.N.: Chemistry of Heterocyclic Compounds, 1967, 3, 59-61.
33
Kukolja, S.; Draheim, S.E.; Pfeil, J.L.; Cooper, R.D.G.; Graves, B.J.; Holmes, R.E.; Neel,
D.A.; Huffman, G.W.; Webber, J.A.: Journal of Medicinal Chemistry, 1985, 28, 1886-1896. 34
Kukolja, S.; Draheim, S.E.; Graves, B.J.; Hunden, B.C.; Pfeil, J.L.; Cooper, R.D.G.; Ott,
J.L.; Counter, F.T.: Journal of Medicinal Chemistry, 1985, 28, 1896-1903. 35
Kitagawa, T.; Khandmaa, D.; Fukumoto A.; Asada, M.: Chemical and Pharmaceutical
Bulletin, 2004, 52, 1137-1139. 36
Liu, S.; Yang, Y.; Zhen, X.; Li, J.; He, H.; Feng, J.; Whiting, A.:Organic and Biomolecular
Chemistry, 2012, 10, 663-670. 37
Periasamy, M.; Thirumalaikumar, M.: Journal of Organometallic Chemistry, 2000, 609,
137–151. 38
Maslov, M.A.; Morozova, N.G.; Solomatina, T.V.; Sergeeva, O.A.; Cheshkovb, D.A.;
Serebrennikovaa, D.A.: Mendeleev Communication, 2011, 21, 137–139. 39
Dubler, C.; Kreuzfeld, H.J., Krause, H.W.; Michalik, M.; Tetrahedron: Asymmerry, 1993,
4, 1833-1842. 40
Gracia, S.; Marion, C.; Rey, J.; Popowycz, F.; Pellet-Rostaing, S.; Lemaire, M.:
Tetrahedron Letters, 2012, 53, 3165–3168. 45
41
Jincong, Z.; Thomas, M.P.; Ding-Quan, Q.; Wenqing, Y.: Substituted Heterocyclic
Compounds, Patent, 2010, US 2010/0240671 A1. 42
Chabert, J.F.; Marquez, B.; Neville, L.; Joucla, L.; Broussous, S.; Bouhours, P.; David, E.;
Pellet-Rostaing, S.; Marquet, B.; Moreaub, N.; Lemairea, M.: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2007, 15, 4482–4497. 43
Tasnádi, G.; Forró, E.; Fülöp, F.: Organic & Biomolecular Chemistry, 2010, 8, 793–799.
44
Thomas, W.; Thomas, L.: European Journal of Organic Chemistry, 2013, 9, 1649-1652.
45
Murai, Y.; Hatanaka, Y.; Kanaoka, Y.; Hashimoto, M.: Heterocycles, 2009, 79, 359-364
46
Kovács, K.; Bánóczi, G.; Varga, A.; Szabó, I.; Holczinger, A.; Hornyánszky, G.; Zagyva,
I.; Paizs, Cs.; Vértessy, B.G.; Poppe, L.: PLoS ONE, 2014, 9, 85943. 47
Alla, M.M.N.; Younis, M.E.: Journal of Experimental botany, 1995, 46, 1731–1736.
48
Hyun M.W.; Yun Y.H.; Kim, J.Y.; Kim, S.H.: Mycobiology, 2011, 39, 257–265.
49
Alunni, S.; Cipiciani, A.; Fioroni, G.; Ottavi, L.: Archives of Biochemistry and Biophysics,
2003, 412, 170–175. 50
Scriver, C.R: Human mutation, 2007, 28, 831-845.
51
Kang, T.S.; Wang, L.; Sarkissian, C.N.; Gámez, A.; Scriver, C.R.; Stevens, R.C.:
Molecular Genetics and Metabolism, 2010, 99, 4–9. 52
D'Cunha, G.B.; Satyanarayan, V.; Nair, Madhusudanan, P.: From Enzyme and Microbial
Technology, 1996, 19, 421-427. 53
Quinn, A.J., Pickup, M.J., D’Cunha, G.B.: Biotechnology Progress, 2011, 27, 1554-1560
54
Ritter, H.; Schulz, G.E.: Plant Cell, 2004, 16, 3426-3436.
55
Gloge, A.; Zoń, J; Kövári A.; Poppe, L.; Rétey, J.: Chemistry - A European Journal, 2000,
6, 3386-3390. 56
Paizs, Cs.; Tosa, M.I.; Bencze, L.Cs.; Brem, J.; Irmie, F.D.; Rétey, J.: Heterocycles, 2011,
82, 1217-1228. 57 58
Paizs, Cs.; Katona, A.; Rétey, J.: Chemistry - A European Journal, 2006, 12, 2739–2744 Károlyi Johanna: Királis nem-természetes aminosavak előállítása racém és enzimkatalitikus
úton; 2014, diplomamunka 59
Óvári László: Kíséreletek racém heteroaromás alfa-aminosavak előállítására, 2014,
diplomamunka
46