PROSIDING SEMINAR NASIONAL REKAYASA KIMIA DAN PROSES 2004 ISSN : 1411 - 4216
Kinetika pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae pada berbagai sumber nitrogen: Studi regulasi pada metabolisme nitrogen Yalun Arifin, Deddy Sugijanto, Vina Agustina, Dewi Anna Sitepu, Erli Sasmito Laboratorium Bioproses, Jurusan Teknik Kimia, Universitas Surabaya Jalan Raya Kalirungkut, Surabaya 60292 Tel: 031 2981158, Fax: 031 2981178 Email:
[email protected]
Abstrak Kinetika pertumbuhan mikroorganisme ditentukan oleh banyak faktor meliputi jenis sumber nutrient, temperature, pH, konsentrasi oksigen, dan lainnya. Dalam penelitian ini, mikroorganisme Saccharomyces cerevisiae ditumbuhkan dalam mineral medium di sistem batch dengan variasi sumber nitrogen (ammonium sulfat, leucine, proline, urea, dan alanine). Yeast S. cerevisiae akan melakukan regulasi mengadaptasi sumber nitrogen yang tersedia. Sumber nitrogen sendiri bisa dibedakan menjadi baik (good), sedang (medium-rich), dan buruk (poor) nitrogen sources. Penentuan baik buruknya sumber nitrogen bisa dilakukan dengan mengukur specific growth rate maksimum (µmax) dan/atau analisis ekspresi genetik secara menyeluruh walaupun metode genetik sering dianggap lebih valid. Diperoleh hasil µmax di ammonium sebesar 0,37 jam-1 oleh strain CEN.PK 113-7D dan 0,44 jam-1 oleh strain lokal. Dengan leucine sebagai sumber nitrogen, kedua strain tumbuh hampir sama cepat, sekitar 0,25 jam-1. Dalam kultur proline, CEN.PK 113-7D tumbuh dengan µmax 0,20 jam-1, sementara strain lokal dua kali lebih cepat. Kedua strain tumbuh hampir sama cepat di urea dan juga di alanine. Hasil ini menunjukkan ammonium sulfat adalah good nitrogen sources sedangkan leucine dan alanine medium rich nitrogen sources. Proline adalah sumber nitrogen yang baik hanya pada strain lokal. Urea tergolong baik namun perlu dibandingkan dengan data analisis genetika.
Abstract The growth kinetics of microorganisms depends on several factors such as nutrient, temperature, pH, oxygen level, and many others. The yeasts Saccharomyces cerevisiae grow in mineral medium in batch system under different nitrogen sources (ammonium sulfate, leucine, proline, urea and alanine). The S. cerevisiae regulate its metabolism in order to adapt to available nitrogen source. The nitrogen sources can be categorized into good, medium-rich, and poor nitrogen sources that depend on the value of the maximum specific growth rate and oligonucleotide micro array analyzes. The later method is often considered more valid. The maximum specific growth rate for S. cerevisiae under ammonia as nitrogen source for CEN.PK 113-7D strain and local strain are 0.37 h-1 and 0.44 h-1, respectively. The leucine-grown cells give almost the same µmax value for each strain, i.e. 0.25 h-1. The strain CEN.PK 113-7D grow with µmax 0.20 h-1 in proline, whereas local strain grow twice faster. Both strains grow almost at the same rate in urea or alanine. Ammonium sulfate is considered as a good nitrogen source, while leucine and alanine are medium-rich nitrogen sources. Proline is only good for local strain. Urea is good nitrogen sources but further comparison with genetic analyzes is needed.
Keywords: Saccharomyces cerevisiae, yeast, metabolisme nitrogen, asam amino, specific growth rate
Pendahuluan Nitrogen adalah salah unsur terpenting selain carbon, hidrogen dan oksigen dalam metabolisme oleh mikroorganisme dan kebanyakan makhluk tingkat tinggi lainnya. Yeast Saccharomyces cerevisiae mampu memperoleh nitrogen dari sumber- sumber nitrogen baik senyawa anorganik (ammonium sulfate, urea) dan organik (asam amino). Metabolisme nitrogen sangat menentukan jenis, kualitas dan kuantitas produk metabolisme (metabolite). Hal ini berarti jenis sumber nitrogen akan menentukan ketiga parameter di atas. Penelitian-penelitian di laboratorium amat diperlukan untuk mempelajari metabolisme nitrogen, misalkan efek jenis sumber nitrogen terhadap pertumbuhan sel yeast dan produk metabolisme yang akan dihasilkan.
JURUSAN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG
B-8-1
Metabolisme nitrogen oleh S. cerevisiae merupakan topik yang cukup hangat dalam riset bioteknologi era kini ditunjukkan dengan ratusan jurnal internasional berkaitan erat dengan topik ini. Salah satu jurnal yang bagus adalah review paper oleh Boris Magasanik dan Chris Kaiser [5] tentang metabolisme nitrogen oleh S. cerevisiae yang difokuskan pada regulasi ekspresi gen-gen. Sebagai pengantar, perlu dipahami konsep central nitrogen metabolism [4,5] seperti ditunjukkan di gambar di bawah. Semua jenis sumber nitrogen akan disintesis menjadi glutamine dan glutamate karena 85 % kandungan nitrogen dalam sel didapat dari glutamate dan sisanya oleh glutamine.
Gambar 1. Skema central nitrogen metabolism Magasanik menyatakan bahwa sumber-sumber nitrogen bisa dikategorikan sebagai good/rich dan poor nitrogen sources. Riset yang telah kami lakukan pada jenis strain yang berbeda menunjukkan adanya medium rich nitrogen sources [6]. Suatu sumber nitrogen bisa dikatakan poor jika sumber nitrogen ini bisa mengaktifkan mekanisme tambahan yang harus dilakukan oleh sel untuk melakukan katabolisa sumber nitrogen tersebut. Dengan kata lain sel harus melakukan usaha ekstra dalam memanfaatkan sumber nitrogen yang termasuk poor. Magasanik mendefinisikan regulasi nitrogen oleh sel sebagai berikut: the mechanism designed to prevent or reduce the unnecessary divergence of the cells’ synthetic capacity to the formation of enzymes and permeases for the utilization of compounds that are non-preferred source of glutamate and glutamine when a preferred nitrogen sources is available. Maka jika glutamate dan glutamine dipakai sebagai sumber nitrogen maka sel tidak akan mengaktifkan sistem ekstra yang akan menguras energi. Oleh sebab itu salah satu parameter yang paling sederhana untuk menentukan baik buruknya suatu sumber nitrogen adalah harga specific growth rate (µmax). Cara kedua yang lebih valid adalah dengan mengukur ekspresi gen-gen dengan teknik oligonucleutide microarray yang telah kami lakukan dengan yeast strain CEN-PK.113-7D di Belanda. Namun metode ini amat sulit dan butuh peralatan yang canggih dan mahal sekali. Sumber nitrogen umumnya dikatakan baik jika menghasilkan nilai µmax yang relatif tinggi. Sebagai contoh yeast tumbuh di sistem batch dengan ammonia dan asparagine sebagai sumber nitrogen memiliki µmax sebesar 0,37 jam-1 dan 0,45 jam-1 [6]. Pada methionine dan proline sebagai sumber nitrogen memiliki µmax sebesar masing-masing 0,20 jam-1. Hal ini menunjukkan ammonia dan asparagine adalah sumber nitrogen yang baik/good dan methionine dan proline sebagai sumber nitrogen yang buruk/poor. Dalam sistem kontinu di chemostat, parameter yang dipakai adalah Ysx, yaitu gram sel yang dihasilkan per gram substrat yang dikonsumsi. Salah satu jurnal yang berkaitan erat adalah jurnal oleh Boer et.al. Sebagai standar sumber nitrogen yang baik adalah ammonia dengan Ysx sebesar 0,49 ± 0.01 g sel/g glukosa [7].
Metode Penelitian Medium dan jenis strain Pertumbuhan yeast S. cerevisiae dilakukan dalam kultur batch 100 ml dalam erlenmeyer secara aerob. Kultur dikocok dengan shaker dengan laju 200 rpm pada temperature 30oC. Medium yang digunakan adalah mineral medium berdasarkan Verduyn et.al (10). Komposisi mineral medium terdiri atas K2SO4 6,58 g/l, KH2PO4 3 g/l, dan MgSO4.7H2O 0,5 g/l di mana sumber nitrogen divariasi 5 jenis yang digunakan salah satu ( JURUSAN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG
B-8-2
(NH4)2SO4 5 g/l, leucine 10 g/l, proline 8,78 g/l, alanine 6,75 g/l, urea 2,27 g/l1 ). Trace elements adalah EDTA 15 mg/l, ZnSO4.7H2O 4,5 mg/l, CoCl2.6H2O 0,3 mg/l, MnCl2.4H2O 1 mg/l, CuSO4.5H2O 0,3 mg/l, CaCl2.2H2O 4,5 mg/l, FeSO4.7H2O 3 mg/l, Na2MoO4.2H2O 0,4 mg/l, H3BO3 1 mg/l, dan KI 0,1 mg/l. Komposisi glukosa dalam medium ini adalah 2 % w/v. Konsentrasi vitamin di larutan medium adalah Biotin 0,05 mg/l, Calcium pantothenate 1 mg/l, Nicotinic acid 1 mg/l, Inositol 25 mg/l, Thiamine HCl 1 mg/l, Pyridoxine HCl 1 mg/l, dan Para-amino benzoic acid 0,2 mg/l. Yeast S. cerevisiae yang digunakan adalah strain lokal yang belum didefinisikan dan strain CEN.PK 113-7D yang kami peroleh dari Kluyver Laboratory for Biotechnology, Delft University of Technology, Belanda.
Eksperimen Mineral medium disiapkan steril lengkap dengan vitamin, trace elements, dan glukosa. Sumber nitrogen divariasi dari kelima jenis di atas. Yeast yang disimpan dalam Eppendorf tube dengan kondisi –80oC diinokulasikan ke mineral medium. Kultur ini kemudian ditumbuhkan ± 24 jam untuk adaptasi. Kemudian kultur ditransfer ke medium lain yang identik dengan medium sebelumnya di mana yeast sudah berada pada fase pertumbuhan log. Setelah 1 jam, sampling dilakukan setiap jam selama 7-8 jam untuk memperoleh data pertumbuhan. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan UV-Vis spectrophotometer Agilent pada panjang gelombang 660 nm untuk memperoleh optical density (OD) setiap jam. Nilai OD awal dibuat mendekati 0,1 dengan mengatur jumlah volume inokulum yang ditransfer. Berdasarkan data OD vs waktu dibuat plot eksponensial berdasarkan persamaan: OD = ODo exp µ maxt (1) di mana persamaan (1) merepresentasikan pertumbuhan sel di fase log dalam kultur batch: C X = C Xo exp µ maxt (2) max Dengan ini nilai maximum specific growth rate (µ ) bisa diperoleh. Eksperimen yang sama dilakukan dengan menggunakan jenis-jenis sumber nitrogen yang lain dan diduplikasi. Keseluruhan kerja lalu diulang lagi dengan jenis strain yang berbeda.
(
)
(
)
Hasil dan pembahasan Pertumbuhan kedua jenis strain S. cerevisiae dalam sumber nitrogen yang berbeda-beda ditunjukkan di Gambar 2 dan 3 di bawah ini.
3
OD660
2,5
ammonium sulfate
2
leucine
1,5
proline
1
alanine urea
0,5 0 0
2
4
6
8
t [jam] Gambar 2. Pertumbuhan S. cerevisiae lokal di mineral medium dengan berbagai sumber nitrogen Tabel 1 menunjukkan nilai µmax kedua strain S. cerevisiae pada sumber nitrogen yang berbeda-beda. Dapat dilihat jika kedua strain tumbuh dengan laju yang baik pada ammonium sulfate sebagai sumber nitrogen. Hal ini wajar mengingat ammonium sulfate termasuk sumber nitrogen yang baik. Nilai µmax kedua strain pada medium leucine relatif agak rendah sehingga leucine dinyatakan sebagai sumber nitrogen yang medium rich. Hal ini diperkuat oleh hasil analisis genetika yang menunjukkan beberap gen terekspresi lebih pada kultur leucine dibanding kultur ammonium [6]. Katabolisme leucine mengikuti Ehrlich route (Gambar 4), di mana produk akhirnya adalah isoamyl alcohol [11], senyawa yang sering digunakan sebagai solvent, bahan 1
SETIAP MEDIUM MENGGUNAKAN SATU SUMBER N YANG BERBEDA. SETIAP SUMBER N SETARA DENGAN 75.71 MMOL NITROGEN PER LITER JURUSAN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG
B-8-3
intermediate di industri kimia, dan bahan flavor. Isoamyl alcohol bisa menginhibisi pertumbuhan mikroorganisme seperti halnya inhibisi oleh asam benzoat terhadap pertumbuhan sel [6,10]. Secara termodinamika, reaksi awal pada katabolisme leucine (transaminasi) bersifat sangat endothermal relatif terhadap reaksi transaminasi pada beberapa asam amino jenis lain [12].
ammonium sulfate
1,2
OD660
1
leucine
0,8 0,6
proline
0,4 alanine
0,2 0 0
1
2
3
4
5
6
7
urea
t [jam] Gambar 3. Pertumbuhan S. cerevisiae CEN.PK 113-7D di mineral medium dengan berbagai sumber nitrogen Strain CEN.PK 113-7D tumbuh lambat di medium proline, namun strain lokal tumbuh sangat cepat. Pada strain CEN.PK 113-7D, excess glukosa diduga kuat menginhibisi katabolisme proline. Glukosa berlebih bisa menginhibisi kerja enzim-enzim pendegradasi proline (proline oxidase dan L-∆1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase) menjadi glutamate yang akhirnya menjadi pool dari nitrogen dalam sel (Gambar 5). Hal tersebut mungkin tidak terjadi pada strain lokal. Tabel 1. Nilai maximum specific growth rate (µmax) dari kedua jenis strain S. cerevisiae pada berbagai sumber nitrogen. µmax [jam-1]2 N-source
Strain lokal
CEN.PK 113-7D
(NH4)2SO4
0,44 ± 0,02
0,37 ± 0,01
Leucine
0,24 ± 0,01
0,26 ± 0,00
Proline
0,48 ± 0,00
0,20 ± 0,01
Alanine
0,33 ± 0,00
0,28 ± 0,01
Urea
0,49 ± 0,00
0,41 ± 0,05
Gambar 4 Ehrlich route. Untuk leucine: R1 = R2 = CH3, R3 = H. Step 1 adalah transaminasi dikatalisis oleh amino transferase, step 2 adalah dekarboksilasi dikatalisis oleh decarboxylase, and step 3 adalah aldehyde reduction dikatalisis oleh alcohol dehydrogenase. 2
HASIL MERUPAKAN RATA-RATA DUA EKSPERIMEN YANG INDEPENDEN. DIBERIKAN.
JURUSAN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG
STANDARD DEVIATION JUGA B-8-4
Alanine bisa dikategorikan sumber nitrogen yang kelas medium-rich karena nilai µmax nya antara sumber nitrogen yang baik dan buruk. Penelitian lebih lanjut pada katabolisme alanine bisa dilakukan untuk menjelaskan fenomenan tersebut. Urea sering disebut sumber nitrogen yang buruk namun berdasarkan nilai µmax nya, sumber nitrogen ini cenderung masuk kategori yang baik. Hal ini perlu dipertegas dengan analisis ekspresi genetika dengan oligonucleotide microarray apakah urea termasuk sumber nitrogen yang baik atau buruk, mengingat metode kedua ini adalah yang paling akurat.
Gambar 5 Metabolic pathway degradasi proline
Kesimpulan Berdasarkan pengukuran nilai maximum specific growth rate (µmax), bagi yeast ammonium dan urea termasuk sumber nitrogen yang baik. Hanya saja untuk urea, perlu dipertegas dengan analisis ekspresi gen. Proline termasuk sumber nitrogen yang kurang baik (buruk), kecuali pada pertumbuhan yeast strain lokal. Leucine dan alanine dikategorikan sumber nitrogen medium rich.
Ucapan terima kasih Terima kasih kepada Prof. Dr. Jack T.Pronk dan drs. Viktor M. Boer dari Kluyverlab TU Delft atas sumbangan berupa yeast strain dan beberapa masukan yang terkait.
Daftar pustaka 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
8.
Michael J. Waites, Neil L. Morgan, John S. Rockey, Gary Higton (2001), “Industrial Microbiology: An Introduction”, Blackwell Science Ltd., Oxford, UK. Introduction to yeast Saccharomyces cerevisiae http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biology/01_Introduction.htm Saccharomyces Genome Databases http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/ J.N.Strathen, E.W.Jones, J.R.Broach, (1982), “The molecular biology of the yeast saccharomyces: metabolism and gene expression”, p.39-99, Cold Spring Harbor Laboratory, NY Boris Magasanik, Chris A.Kaiser (2002). “Nitrogen Regulation in Saccharomyces cerevisiae”, Gene 290, 1-18. Yalun Arifin (2003), Nitrogen metabolism in chemostat grown Saccharomyces cerevisiae, MSc thesis, Kluyver Laboratory for Biotechnology, Delft University of Technology Viktor M. Boer, Johannes H. de Winde, Jack T. Pronk, and Matthew D. W. Piper (2003), “The Genome-wide Transcriptional Responses of Saccharomyces cerevisiae Grown on Glucose in Aerobic Chemostat Cultures Limited for Carbon, Nitrogen, Phosphorus, or Sulfur”, J. Biol. Chem., Vol. 278, Issue 5, 3265-3274, January 31, 2003 van Dijken et.al (2000), Enz. Microb. Technology 26: p.706-714
JURUSAN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG
B-8-5
9.
Verduyn et.al (1990), PhD thesis, Kluyver Laboratory for Biotechnology, Delft University of Technology 10. C. Verduyn, E. Postma, W.A. Scheffers, J.P. van Dijken (1992), “Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts: A continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation”, Yeast vol.8: 501-517. 11. J.R.Dickinson, M.M.Lanterman, D.J.Danner, B.M. Pearson, P. Sanz, S.J. Harrison, M.J.E. Hewlins, (1997), “A 13C Nuclear resonance investigation of the metabolism of leucine to isoamyl alcohol in Saccharomyces cerevisiae”, J Biol.Chem, Vol.272, No.43, pp.26871-26878. 12. Yadu B. Tewari, Robert N. Goldberg, J. David Rozzell (2000), “Thermodynamics of reactions catalysed by branched-chain-amino-acid transaminase”, The Journal of Chemical Thermodynamics, Volume 32, Issue 10, October 2000, Pages 1381-1398
JURUSAN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG
B-8-6
