KEYWORDS Food supplements, Lacobacillus, DNA isolation, magnetic microspheres, immunomagnetic separation, polymerase chain reaction

2

ABSTRAKT Probiotické druhy bakterií mléčného kvašení rodu Lactobacillus hrají důležitou roli v trávicím traktu člověka. Používají se v potravinářském průmyslu a jsou rovněž součástí stravy. K identifikaci baktérií mléčného kvašení rodu Lactobacillus lze použít polymerázovou řetězovou reakci (PCR). V experimentální části práce byla izolována DNA z hrubých lyzátů buněk 4 synbiotických doplňků stravy pomocí magnetických částic P(HEMA-co-GMA). Izolovaná DNA byla amplifikována v PCR pomocí rodově a druhově specifických primerů. V další části práce byly testovány magnetické nosiče s imobilizovanou protilátkou proti bakteriím rodu Lactobacillus. Uvedené částice byly použity k izolaci cílových buněk z výrobků následně identifikovaných pomocí rodově specifické PCR.

ABSTRACT Probiotic lactic acid bacteria of genus Lactobacillus play an important role in the digestive tract of human. They are used in food processing and they are the part of food supplements. Lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus can be identificated by polymerase chain reaction (PCR). Bacterial DNA was isolated from cell lysates of 4 synbiotic food suplements by magnetic particles P(HEMA-co-GMA). Isolated DNA was amplified by genus-specific and speciesspecific primers. Magnetic particles with immobilized antibodies against Lactobacillus bacteria were used in the next part of thesis. These particles were used for isolation target cells from products with their identification by genus specific PCR.

KLÍČOVÁ SLOVA Doplněk stravy, Lactobacillus, izolace DNA, magnetické částice, imunomagnetická separace, polymerázová řetězová reakce

KEYWORDS Food supplements, Lacobacillus, DNA isolation, magnetic microspheres, immunomagnetic separation, polymerase chain reaction

3

NOVOTNÁ, E. Selektivní izolace bakterií rodu Lactobacillus z potravin. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2012. 83 s. Vedoucí diplomové práce doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc.

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně a že všechny použité literární zdroje jsem správně a úplně citovala. Diplomová práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana FCH VUT.

………………………… Podpis studenta

PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala paní doc. RNDr. Aleně Španové, CSc a panu doc. Ing. Bohuslavu Rittichovi, CSc. za čas, cenné rady a odborné vedení, které mi věnovali při vypracování této diplomové práce ale také Ing. Monice Zovčákové za poskytnutí cenných informací a praktických rad.

4

1

ÚVOD..............................................................................................................8

2

TEORETICKÁ ČÁST ...................................................................................9 2.1 PROBIOTIKA ................................................................................................................................................. 9 2.1.1 Probiotika a jejich zdraví prospěšné vlastnosti ................................................................................. 9 2.1.2

Probiotické mikroorganismy ........................................................................................................... 10

2.2 2.3

PREBIOTIKA ............................................................................................................................................... 12 SYNBIOTIKA............................................................................................................................................... 12

2.4

POTRAVINY OBSAHUJÍCÍ PROBIOTIKA ........................................................................................................ 12

2.5 CHARAKTERISTIKA BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ ................................................................................... 13 2.5.1 Dělení bakterií mléčného kvašení.................................................................................................... 14 2.5.2

Rozdělení rodu Lactobacillus podle metabolismu ........................................................................... 14

2.6 IDENTIFIKACE LAKTOBACILŮ V POTRAVINÁCH .......................................................................................... 16 2.6.1 Polymerázová řetězová reakce (PCR) ............................................................................................. 16 2.6.2

Detekce produktů PCR pomocí agarózové gelové elektroforézy .................................................... 19

2.7 MAGNETICKÉ NOSIČE ................................................................................................................................ 19 2.7.1 Vlastnosti magnetických nosičů....................................................................................................... 20 2.7.2

Magnetické mikročástice ................................................................................................................. 20

2.8 IMUNOMAGNETICKÁ SEPARACE ................................................................................................................. 20 2.8.1 Princip imunomagnetické separace................................................................................................. 21

3

CÍL PRÁCE..................................................................................................22

4

MATERIÁL..................................................................................................23 4.1

POUŽITÉ POTRAVINOVÉ DOPLŇKY ............................................................................................................. 23

4.2 4.3

BAKTERIÁLNÍ KULTURY............................................................................................................................. 25 CHEMIKÁLIE A ROZTOKY ........................................................................................................................... 25

4.3.1

Kultivační média.............................................................................................................................. 25

4.3.2 4.3.3

Roztoky pro přípravu hrubých lyzátů buněk ................................................................................... 26 Magnetické částice pro izolaci DNA ............................................................................................... 26

4.3.4

Roztoky pro izolaci DNA pomocí magnetických částic.................................................................... 26

4.3.5 4.3.6

Roztoky pro agarózovou gelovou elektroforézu............................................................................... 27 Komponenty pro PCR...................................................................................................................... 27

4.4

5

POMŮCKY A PŘÍSTROJE .............................................................................................................................. 27

METODY......................................................................................................29 5.1

IZOLACE DNA Z POTRAVINOVÝCH DOPLŇKŮ ............................................................................................ 29

5.1.1

Lyze buněk z tablet a kapslí potravinových doplňků........................................................................ 29

5.1.2 5.1.3

Příprava směsi pro izolaci DNA pomocí magnetických nosičů....................................................... 29 Izolace buněk Lactobacillus pomocí imunomagnetické separace ................................................... 30

5.1.4

Kultivace bakteriálních buněk ......................................................................................................... 30

5.1.5 5.1.6

Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty DNA ............................................................. 30 Složení směsí pro PCR při stanovení citlivosti PCR........................................................................ 30

5.1.7

PCR pro doménu Bacteria s DNA izolovanou z potravinových doplňků......................................... 31

5

5.1.8 5.1.9

6

Rodově specifická PCR s bakteriální DNA izolovanou z potravinových doplňků ........................... 32 Druhově specifická PCR s bakteriální DNA izolovanou z potravinových doplňků ......................... 34

VÝSLEDKY..................................................................................................36 6.1 6.2

PŘÍPRAVA HRUBÝCH LYZÁTŮ BUNĚK A IZOLACE DNA POMOCÍ MAGNETICKÝCH NOSIČŮ.......................... 36 SPEKTROFOTOMETRICKÉ STANOVENÍ KONCENTRACE DNA IZOLOVANÉ Z VÝROBKŮ ............................... 36

6.2.1

Pangamin Bifi plus (3 šarže) ........................................................................................................... 36

6.2.2 6.2.3

Biopron............................................................................................................................................ 37 Linex Forte ...................................................................................................................................... 38

6.2.4

MultiLac .......................................................................................................................................... 38

6.3 STANOVENÍ CITLIVOSTI AMPLIFIKACE V PCR S PURIFIKOVANOU DNA..................................................... 38 6.3.1 Citlivost amplifikace pro rod Lactobacillus .................................................................................... 39 6.3.2

Citlivost amplifikace pro druh Lactobacillus acidophilus............................................................... 40

6.3.3 Shrnutí citlivostí amplifikace v rodově a druhově specifických PCR ............................................ 41 6.4 OVĚŘENÍ AMPLIFIKOVATELNOSTI DNA IZOLOVANÉ Z VÝROBKŮ POMOCÍ MAGNETICKÝCH NOSIČŮ V PCR PRO DOMÉNU BACTERIA.............................................................................................................................. 41

6.4.1 6.4.2

DNA z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus v PCR pro doménu Bacteria ........................... 41 DNA z potravinového doplňku Biopron v PCR pro doménu Bacteria............................................. 45

6.4.3

DNA z potravinového doplňku Linex Forte v PCR pro doménu Bacteria ....................................... 46

6.4.4 DNA z potravinového doplňku MultiLac v PCR pro doménu Bacteria ........................................... 47 6.5 PCR SPECIFICKÁ PRO ROD LACTOBACILLUS S BAKTERIÁLNÍ DNA IZOLOVANOU Z VÝROBKŮ POMOCÍ MAGNETICKÉHO NOSIČE............................................................................................................................. 48

6.5.1 6.5.2

DNA z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus v rodově specifické PCR Lactobacillus........... 48 DNA z potravinového doplňku Biopron v rodově specifické PCR Lactobacillus ............................ 51

6.5.3

DNA z potravinového doplňku Linex Forte v rodově specifické PCR Lactobacillus....................... 52

6.5.4 DNA z potravinového doplňku MultiLac v rodově specifické PCR Lactobacillus........................... 53 6.6 PCR SPECIFICKÁ PRO DRUH LACTOBACILLUS ACIDOPHILLUS S BAKTERIÁLNÍ DNA IZOLOVANOU Z VÝROBKŮ POMOCÍ MAGNETICKÉHO NOSIČE ............................................................................................................... 54

6.6.1

DNA z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus v druhově specifické PCR Lactobacillus acidophilus....................................................................................................................................... 54

6.6.2

DNA z potravinového doplňku Biopron v druhově specifické PCR Lactobacillus acidophilus....... 57

6.6.3 6.6.4

DNA z potravinového doplňku Linex Forte v druhově specifické PCR Lactobacillus acidophilus . 58 DNA z potravinového doplňku MultiLac v druhově specifické PCR Lactobacillus acidophilus ..... 59

6.7

SHRNUTÍ ANALÝZY PŘÍTOMNOSTI PROBIOTICKÝCH BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ V POTRAVINOVÝCH DOPLŇCÍCH ................................................................................................................................................ 61

6.8

SROVNÁNÍ DEKLAROVANÉ A DETEKOVANÉ PŘÍTOMNOSTI PROBIOTICKÝCH BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ 61

6.9 PŘÍPRAVA VZORKŮ PRO IMUNOMAGNETICKOU IZOLACI BUNĚK ................................................................. 61 6.9.1 Stanovení počtu bakterií v tobolce................................................................................................... 61 6.9.2

Identifikace buněk pomocí PCR z bakteriálních kolonií.................................................................. 62

6.10 IMUNOMAGNETICKÁ SEPARACE BUNĚK................................................................................................. 70 6.10.1 Identifikace buněk separovaných imunomagnetickými nosiči kultivační metodou (IMS - KM).. 71 6.10.2

Identifikace buněk separovaných imunomagnetickými nosiči pomocí PCR (IMS - PCR) .......... 73

6

6.11

7

SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ IMS - KULTIVACE A IMS - PCR ........................................................................... 75

DISKUZE......................................................................................................76 7.1

IZOLACE CELKOVÉ DNA A SPEKTROFOTOMETRICKÉ STANOVENÍ KONCENTRACE A ČISTOTY DNA ........... 76

7.2 7.3

PCR PRO DOMÉNU BACTERIA ..................................................................................................................... 77 RODOVĚ SPECIFICKÁ PCR PRO LACTOBACILLUS ......................................................................................... 77

7.4

DRUHOVĚ SPECIFICKÁ PCR PRO LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ................................................................. 77

7.5

SELEKTIVNÍ IZOLACE BUNĚK LAKTOBACILŮ POMOCÍ MAGNETICKÉHO NOSIČE S IMOBILIZOVANOU PROTILÁTKOU ............................................................................................................................................ 77

7.6

SROVNÁNÍ PŘÍTOMNOSTI BAKTERIÍ RODU LACTOBACILLUS S ÚDAJI NA ŠTÍTKU DEKLAROVANÝMI VÝROBCEM ................................................................................................................................................ 77

8

ZÁVĚR..........................................................................................................78

9

SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ .............................................................78

10

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ......................................................83

7

1

ÚVOD

V posledních desetiletích je velká pozornost věnována pozitivním účinkům mikroorganismů na zdraví člověka. Mikroorganismy, mezi které se řadí i bakterie mléčného kvašení (BMK), které jsou označovány jako probiotika, hrají v přírodě a v životě člověka velmi významnou roli. [1]. Probiotika se definují jako živé nepatogenní mikroorganizmy, které po osídlení trávícího traktu působí prospěšně na zdraví hostitele [2]. Probiotické bakterie poskytují širokou škálu zdravotních výhod [3], kterými jsou: prevence rakoviny tlustého střeva inhibice patogenních bakterií stimulace imunitního systému prevence laktózové intolerance V současnosti jsou mezi probiotika řazeny především bakterie mléčného kvašení (BMK) rodu Lactobacilllus a zástupci rodu Bifidobacterium. Využívání probiotických druhů laktobacilů v potravinových výrobcích vyžaduje jejich charakteristiku a jednoznačnou identifikaci. K tomu se využívají především moderní molekulárně genetické metody [4]. Při analýze mikroorganismů obsažených v potravinách a v potravinových doplňcích stravy se využívají metody založené na amplifikaci DNA, např. polymerázová řetězová reakce (PCR) a postupy na ní založené.

8

2 2.1

TEORETICKÁ ČÁST Probiotika

Označení „probiotický“ pochází z řečtiny, volně přeloženo znamená „pro život“ a je protikladem označení antibiotický. Obecně se jedná o bakterie, včetně pravých jogurtových bakterií, které jsou odolné vůči nepříznivému prostředí v žaludku člověka, tj. vůči nízkému pH, proteolytickým enzymům a zejména proti lysozymu, který způsobuje lyzi bakterií. Probiotické bakterie jsou v zažívacím traktu odolné i vůči žlučovým kyselinám a nízkému povrchovému napětí [5]. Současně potlačují nežádoucí mikroflóru, včetně mikrobů choroboplodných. Probiotické kmeny jsou vybírány podle jejich prospěšných vlastností a úmyslně přidávány do velkého množství potravin a krmiv [6]. Z existujících důkazů je způsob účinku probiotických kmenů pravděpodobně multifaktoriální. Probiotická terapie je zkoumána s cílem vyléčit či zabránit řadě gastrointestinálních chorob a poruch [7].

2.1.1 Probiotika a jejich zdraví prospěšné vlastnosti Tyto kmeny musí splňovat několik kritérií, mezi něž patří: zdravotní nezávadnost nesmí být patogenní přežívají v kyselém prostředí a v přítomnosti žluči (nesmí být během průchodu zažívacím traktem zničeny nebo poškozeny) přichycují se na epiteliální buňky ve střevech a jsou schopny se dělit je prokázán jejich pozitivní vliv na zdravotní stav hostitele musí být natolik odolné, aby se „nepoškodily“ v průběhu technologického zpracování výrobku a nesmí ovlivňovat organoleptické vlastnosti výrobku během výrobního procesu zůstávají životaschopné stejně jako po celou dobu trvanlivosti výrobku (potraviny) [12]. Je rovněž nutné, aby kmeny měly dobré technologické vlastnosti, aby mohly být použity pro výrobu a pro začlenění do potravinářských výrobků bez ztráty životaschopnosti a funkčnosti. Nesmí vytvářet nepříjemné příchutě nebo textury [9]. Řada probiotických kmenů byla vyhodnocena s různým stupněm úspěšnosti z hlediska protiprůjmových vlastností. Probiotické kmeny inhibují patogenní bakterie in vitro a in vivo pomocí několika různých mechanismů. Patří mezi ně syntéza inhibičních látek (např. bakteriocinů), snížení pH produkcí kyseliny mléčné či mastných kyselin s krátkým řetězcem (které jsou samy o sobě přímo inhibiční pro určité patogeny), soutěž o živiny a adhezi v určitých místech střevní stěny a jiné [11]. Účinek probiotik také závisí na věku a fyziologickém stavu příjemce [17].

9

2.1.2 Probiotické mikroorganismy Jako probiotika jsou používány různé mikroorganismy, nejčastěji se jedná o bakterie mléčného kvašení (BMK). V posledních letech byly popsány další probiotické nebo potenciálně probiotické mikroorganismy, mezi nimi jsou kvasinky i bakterie rodu Bacillus a Escherchia [10]. K nejznámějším zástupcům probiotik patří zejména bakteriální druhy Lactobacilllus casei, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum a řada dalších. Působení těchto bakterií má obvykle shodné účinky v prevenci určitých onemocnění. V léčbě se ale mohou využívat pouze určité kmeny [11]. V klinických studiích prokázané účinky probiotických bakterií jsou shrnuty v Tab.1.

10

Probiotické bakterie a kmeny kvasinek a jejich prokázané účinky [14, 15] Kmen Lactobacillus acidophilus LC1

Prokázané účinky v klinických studiích posiluje imunitu, adherentní ke střevním buňkám, navozuje rovnováhu střevní mikroflóry Lactobacillus acidophilus NFCO1748 snižuje fekální mutagenitu, prevencí průjmů spojených s radioterapií, léčba zácpy Lactobacillus GG (Lactobacillus casei, prevence postantibiotického průjmu, léčba sub. rhamnosus) a prevence rotavirových průjmů, léčba relapsujícího průjmu způsobeného Clostridium difficile, prevence akutních průjmů, zmírnění Crohnovy choroby, působí antikarcinogenně Lactobacillus casei Shirota prevence střevních poruch, prevence rotavirových průjmů, vyrovnávání intestinálních bakterií, snižování poměru počtu nežádoucích fekálních mikroorganismů, inhibice rakoviny povrchu močového měchýře, posílení imunity Lactobacillus gasseri ADH redukce fekálních mikroorganismů, přežívá ve sřevech Bifidobacterium bifidum léčení rotavirových průjmů, vyrovnávání poměru střevní mikroflóry Streptococcus thermophilus transformace laktosy na kyselinu mléčnou (prevence laktózové intolerance), možné pozitivní účinky u pacientů podstupujících chemoterapii, zabraňuje přeměně dusičnanů na karcinogenní látky Lactobacillus bulgaricus snižuje pH ve střevě, čímž brání hnilobným procesům, udržuje rovnováhu střevní mikroflóry, zabraňuje adhezi patogenních mikroorganismů Lactobacillus reuteri osídlování střev, dosud provedeny hlavně studie na zvířatech, možná nově prodávané probiotikum Saccharomyces boulardii prevence cestovatelských průjmů, prevence a léčba průjmu způsobeného C. difficile Probiotická směs (Lactobacillus prevence cestovatelských průjmů acidophilus, Bifidobacterium bifidum, Streptococcus thermophilus a Lactobacillus bulgaricus)

- 11 -

2.2

Prebiotika

Prebiotika jsou definována jako nestravitelná součást potravy, která slouží jako substrát pro růst a stimulaci funkce probiotických mikroorganismů prospěšných pro lidské zdraví. Prebiotika procházejí gastrointestinálním traktem až do tlustého střeva, aniž by byla natrávena enzymy trávicího traktu. K jejich štěpení dochází až střevními bakteriemi, které prebiotika hydrolyzují na monomery, nezbytné pro výživu kolonocytů a mikrobiální flóry. Mezi prebiotika se řadí oligosacharidy (hlavně fruktooligosacharidy, galaktooligosacharidy a laktulóza), inulin, laktinol a některé polysacharidy. Zatím jsou nejlépe prozkoumané prebiotické fruktooligosacharidy (FOS) [12]. Většina v současnosti využívaných prebiotik se vyskytuje jako přirozená složka v zelenině např. v cibuli, česneku, artičocích, pórku nebo čekance, v menší míře i v obilovinách, ve fazolích a hrachu. Mnoho z nich je již dnes komerčně dostupných a využívají se jako přísady do funkčních potravin. Tyto látky nemají žádné genotoxické, toxické nebo kancerogenní vlastnosti. Jsou mírně laxativní, při užívání velkých dávek ale způsobují nadýmání [12]. Podávání prebiotik způsobuje celkové zlepšení střevních funkcí, vede k úpravě zácpových a průjmových stavů a k potlačení růstu patogenů. Slibné jsou také výsledky studií, které byly zaměřeny na sledování zvýšení absorpce minerálů, především vápníku a hořčíku, které je umožněno snížením pH ve střevech (zvýšenou produkcí kyselin). Zlepšení absorpce minerálů snižuje riziko vzniku osteoporózy a „posiluje“ kosti [12].

2.3

Synbiotika

Tento termín se používá pro současnou přítomnost prebiotik a probiotik. Jelikož termín sám evokuje pojem synergizmu, je důsledně rezervován pro takové situace, kdy přítomné prebiotikum skutečně selektivně favorizuje přítomné probiotikum. V přísném slova smyslu produkt, který obsahuje oligofruktosu a bifidobakterie, vyhovuje této definici synbiotika, protože oligofruktosa je metabolizována a podporuje růst bifidobakterií. Naproti tomu produkt obsahující oligofruktosu a např. Lactobacillus casei není synbiotický, neboť Lactobacillus casei sám oligofruktosu nemetabolizuje ač je probiotikem [13].

2.4

Potraviny obsahující probiotika

K nejběžnějším zdrojům probiotik patří zejména kysané (fermentované) mléčné výrobky. Probiotické mléčné výrobky zaznamenaly v posledních letech v mlékárenství značný rozmach. Mezi potraviny s nezanedbatelným obsahem probiotických kultur také řadíme vysokodohřívané tvrdé sýry, mléčným kysáním konzervovanou zeleninu (kysané zelí, rychlokvašené okurky) a šťávu z kysaného zelí. Opomíjeným, ale dnes také důležitým zdrojem probiotik jsou ušlechtilé suché salámy. Naopak méně výhodné z hlediska obsahu probiotických kultur jsou termizované dezerty a tavené sýry. Při výběru potravin s probiotickými kulturami je třeba se o potravině informovat. Je totiž nutné, aby potravina obsahovala dostatečné množství živých buněk probiotických kultur. Některé potraviny obsahují minimální, zákonem stanovený počet probiotik, jiné obsahují několikanásobně více těchto mikroorganismů. Takové potraviny mívají obvykle kratší dobu trvanlivosti, a proto je musíme uchovávat v chladu [12].

- 12 -

V probiotických výrobcích, např. v jogurtech nebo v acidofilním mléce, mají být k datu trvanlivosti anebo při dřívější spotřebě probiotika přítomné v koncentraci více jak 106 KTJ/ml nebo 106 KTJ/g výrobku. (KTJ, kolonie tvořící jednotky). Jen v této vyšší koncentraci mají ve střevě požadovaný zdraví prospěšný účinek, předpokládá-li se konzumace 100 – 150 g výrobku [9].

2.5

Charakteristika bakterií mléčného kvašení

Potravinářský mikrobiolog rozumí pod tímto pojmem zpravidla skupinu kokovitých i tyčinkovitých bakterií zahrnující některé druhy rodů: Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus a Bifidobacterium [5]. V klasické monografii Dána Orla-Jensena (1919) [5] pojednávající o BMK se uvádí: „Pravé bakterie mléčného kvašení tvoří velkou přirozenou skupinu nesporulujících grampozitivních koků a tyčinek, které fermentují sacharidy za fakultativně anaerobních podmínek a tvoří přitom hlavně kyselinu mléčnou“ [5]. Fylogenetický strom BMK a příbuzných bakterií je uveden na obr. 1.

Obr.1:

Fylogenetický strom BMK a příbuzných grampozitivních baktérií s nízkým a vysokým obsahem

G+C v DNA [16].

BMK se nevyskytují pouze v mléce a fermentovaných mléčných produktech, nacházejí se i na intaktních a rozkládajících se rostlinách a ve střevech lidí a zvířat [11]. Pravděpodobně nejvíce studovaná probiotika patří do rodu Lactobacillus [7].

- 13 -

2.5.1 Dělení bakterií mléčného kvašení Společným znakem bakterií mléčného kvašení je produkce kyseliny mléčné z fermentovatelných sacharidů. Podle vedlejších fermentačních produktů je dělíme na: homofermentativní, které tvoří jako téměř jediný produkt kyselinu mléčnou (90 %) heterofermentativní přeměňující fermentovaný sacharid na kyselinu mléčnou (>50 %), kyselinu octovou, CO2 a za určitých okolností i ethanol [5].

2.5.2 Rozdělení rodu Lactobacillus podle metabolismu Rod Lactobacillus je rozdělen z hlediska typu fermentace do tří skupin. Skupina I - obligátně homofermentativní laktobacily Zkvašují hexózy téměř výlučně na kyselinu mléčnou (>90 %). Tyto baktérie rostou spíše při vyšších teplotách kolem 45°C. Do této skupiny patří všechny termobakterie a další nově popsané druhy. Patří sem např. L. delbrueckii ssp. delbrueckii, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii ssp. lactis, L. acidophilus, L. salivarius a další [5]. Skupina II - fakultativně heterofermentativní laktobacily Hexózy jsou fermentovány hlavně na kyselinu mléčnou (>90 %). Při nedostatku glukózy produkují některé druhy kyselinu octovou, ethanol a kyselinu mravenčí. Pentózy zkvašují pomocí indukovatelné fosfoketolázy. Teplota růstu se pohybuje okolo 15°C. Patří sem například L. plantarum, L. pseudoplantarum, L. casei ssp. casei, L. rhamnosus, L. curvatus a další. Skupina III - obligátně heterofermentativní laktobacily Hexózy jsou fermentovány na kyselinu mléčnou, kyselinu octovou (případně ethanol) a CO2. Pentózy zkvašují na kyselinu mléčnou a kyselinu octovou. Teplota optimálního růstu se pohybuje většinou okolo 45°C. Tato skupina obsahuje v Orla-Jensenovém pojetí heterofermentativní laktobacily tvořící plyn s původním pojmenování betabakterie a jiné nově popsané druhy. Patří sem L. bifermentas, L. brevis, L. buchneri, L. confusus, L. divergens, L. fermentum a další [5]. Morfologie buněk některých druhů Lactobacillus jsou uvedeny na obr. 2, obr. 3 a na obr. 4

- 14 -

Obr.2:

Latobacillus bulgaricus [18].

Obr.3:

Lactobacillus casei [18].

- 15 -

Obr.4:

2.6

Lactobacillus brevis [18].

Identifikace laktobacilů v potravinách

Identifikace laktobacilů ve vzorcích potravin byla prováděna donedávna hlavně pomocí biochemických a fenotypických metod. Tyto metody jsou složité, zdlouhavé a ne vždy dávají správné výsledky. Molekulární techniky představují velmi účinné nástroje pro typizaci, identifikaci a charakterizaci všech bakterií potravinového řetězce [19]. Velmi často se využívá metoda polymerázové řetězové reakce (PCR). Metoda PCR pro identifikaci bakterií rodu Lactobacillus byla popsána v roce 2002 [20]. 2.6.1 Polymerázová řetězová reakce (PCR) PCR je enzymová metoda in vitro sloužící k syntéze definovaného úseku DNA, pro nějž jsou k dispozici oligonukleotidové primery komplementární k 3´- a 5´-koncovým sekvencím jednotlivých řetězců úseku DNA, jenž má být amplifikována [26]. Metoda PCR byla zavedena v roce 1983 Kary Mullisem. Za tento objev mu byla udělena v roce 1993 Nobelova cena. Metodou PCR lze syntetizovat z jedné molekuly DNA přibližně 100 miliard kopií a to za několik hodin [27]. Polymerázová řetězová reakce je nejběžněji užívaná metoda amplifikace nukleové kyseliny. PCR je základní metoda, která se používá jak pro výzkumné účely ve vědeckých laboratořích, tak pro diagnostiku mikroorganismů včetně probiotických bakterií v provozních laboratořích [28]. 2.6.1.1 Princip PCR Vysoká teplota nejprve denaturuje DNA na jednořetězcová vlákna. K vybraným úsekům komplementárních vláken DNA se připojují primery (krátké chemicky syntetizované oligonukleotidy). Tento DNA/primer heteroduplex je primárním místem nasednutí DNA polymerázy, která syntetizuje syntézu nového komplementárního vlákna resp. nového řetězce DNA. Jako primery slouží syntetické sekvence jednovláknové DNA (20 – 30 nukleotidů). Jak je uvedeno výše, využívají se dva druhy primerů, jeden který je komplementární k jednomu

- 16 -

vláknu DNA na začátku aplifikovaného fragmentu a druhý, který je komplementární k druhému vláknu DNA na konci amplifikovaného fragmentu [29]. 2.6.1.2 Komponenty PCR a reakční podmínky Reakční směs (obvykle v objemu 25 – 100 µl) se skládá z následujících složek: Matrice DNA (DNA templát) – makromolekula DNA, podle které se komplementárně syntetizují nové řetězce DNA. Obsahuje cílová místa pro primery. Typická množství bakteriální DNA, přidávané do reakce, jsou 10 až 1 ng. Oligonukleotidové primery – bývají chemicky syntetizované a jsou sekvenčně specifické. Typické primery mají 18 – 30 nukleotidů a obsahují 40 – 60% GC bází. Teplota tání primerů bývá v rozmezí 55 – 65 °C. Primery by neměly být mezi sebou komplementární, zejména ne na 3´-konci, kde párování dvou nebo tří bází vede ke vzniku dimerů primerů, zejména při nadbytku primerů. Potřebná koncentrace každého primeru pro jednu reakci bývá 0,1 – 0,5 mM. DNA-polymerasa – syntetizuje novou DNA ve směru 5´ → 3´ podle sekvence nukleotidů v komplementárním řetězci DNA od 3´ konce primeru. Ke katalýze se používají termostabilní polymerasy, např. Taq DNA-polymerasa izolovaná z mikroorganismu. 2´-deoxynukleosid-5´-trifosfáty (dNTP) – (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) jsou stavební kameny pro syntézu nové DNA. Optimální koncetrace je 200 mM, toleranční rozpětí je 20 – 400 mM. Vysoké koncentrace dNTP (od 4 mM a výše) působí inhibičně, protože vyvazují hořečnaté ionty (Mg2+), nezbytné pro činnost enzymu. Mg2+ionty – jsou nezbytné pro aktivitu DNA-polymerasy. Koncentrace Mg2+ musí být optimalizována pro každou kombinaci primerů a DNA templátu. Obvykle se používá koncentrace 1,5 mM Mg2+. Toleranční rozpětí je 0,5 – 8 mM. Vyšší koncentrace iontů snižuje specifitu PCR. U primerů bohatých na G a C báze je ale použití vyšší koncentrace Mg2+ vhodnější. Pufr pro PCR – vytváří optimální prostředí pro DNA-polymerasu. Standardní reakční pufr obsahuje 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 – 8,8), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2; případně může ještě obsahovat acetamid, albumin, želatinu nebo Tween 20. Voda pro PCR – používá se na doplnění směsi pro PCR na požadovaný objem. Nejvhodnější je voda o odporu 18 mΩ. [30]. 2.6.1.3 Termocyklér Termocyklér je programovatelný termostat, který umožňuje rychlý přechod mezi různými teplotami. Hlavní požadavky jsou kladeny na přesnost teploty a rychlost přechodu mezi jednotlivými teplotami. V současné době existuje celá řada výrobců těchto přístrojů s různými typy vyhřívání a chlazení [26]. Ukázka termocykleru je na obr. 5.

- 17 -

Obr.5:

Termocyklér [35]

2.6.1.4 Amplifikace DNA a vznik produktů PCR V PCR se amplifikuje DNA ve více cyklech za vzniku specifického produktu PCR (amplikonu). Jeden cyklus PCR se skládá ze 3 kroků: Denaturace templátu: tohoto efektu je dosaženo zvýšením teploty na 95°C. DNA je denaturována zpravidla po dobu 1 – 5 minut. Je důležité, aby došlo ke kompletnímu oddělení obou vláken. Jinak by totiž mohlo dojít k velmi rychlé renaturaci celé molekuly, což by zabránilo interakci vláken DNA s primery [26]. Hybridizace primerů: tímto druhým krokem je renaturace, při níž je reakční směs ochlazena na zvolenou teplotu, která se pohybuje obvykle kolem 55°C [26]. Teplota vhodná pro hybridizaci závisí na délce oligonukleotidů a na zastoupení A-T a G-C párů (tři vodíkové můstky mezi G-C, zvyšující stabilitu dvouřetězce a tím i denaturační teplotu) [26, 27]. Pokud je teplota příliš vysoká, primery hybridizují málo účinně a množství amplifikované DNA je malé. Naopak při příliš nízké teplotě dochází k nespecifické hybridizaci primerů a k amplifikaci nežádoucích fragmentů DNA [27]. Syntéza nového komplementárního řetězce: dochází k elongaci DNA vlákna, během kterého DNA polymeráza přisyntetizovává k 3´OH konci primeru nukleotidy, které se vážou na nový řetězec podle komplementární sekvence templátu. Teplota je při tomto kroku v případě použití Taq polymerázy zvýšena na 72°C, což je teplotní optimum tohoto enzymu [27]. Princip polymerázové řetězové reakce je uvedena na obr. 6.

- 18 -

Obr.6:

Amplifikace DNA, upraveno dle [34]

2.6.1.5 Vysoká citlivost PCR Je nezbytně nutné provádět míchání PCR směsi ve speciálních PCR boxech předem vyzářených UV zářením a při práci používat sterilní rukavice z důvodu vyloučení kontaminace z laboratorního prostředí (DNA bakterií, virů až po cizorodou DNA) [33]. Pro odhalení případné kontaminace je nezbytné provádět negativní a pozitivní kontrolu při každé PCR [32]. 2.6.2 Detekce produktů PCR pomocí agarózové gelové elektroforézy K identifikaci amplikonů DNA získaných pomocí PCR se používá elektroforéza v agarózovém gelu. Fragmenty jsou děleny v elektrickém poli v závislosti na jejich velikosti. Touto metodou může být detekováno velmi malé množství DNA (u bakterií 50 – 100 ng) [31]. Gel je obarven ethidium bromidem, což je interkalační činidlo, které se váže mezi vlákna DNA a po ozáření ultrafialovým světlem (260 – 360 nm) fluoreskuje. Velikost produktu PCR se porovná se standardem DNA (DNA žebříček), který obsahuje fragmenty DNA o známé velikosti [32].

2.7

Magnetické nosiče

Klasická izolace DNA jakou je fenolová extrakce vyžaduje aplikaci toxických látek (fenol, chloroform). Navíc je poměrně složitá a časově náročná. Z toho důvodu byly vyvinuty nové

- 19 -

alternativní metody izolace DNA využívající reverzní imobilizaci DNA na pevnou fázi. Izolace DNA pomocí magnetických nosičů je snadnější, rychlejší a efektivnější a umožňuje separovat DNA v kvalitě vhodné pro PCR přímo z hrubých lyzátu buněk komplexních vzorků (např. buněk mléčných výrobků nebo lyofilizátů) [32,37]. Magnetické nosiče jsou tvořeny kombinací organické polymerní matrice a anorganického jádra, které zajišťuje magnetické vlastnosti nosičů. Polymerní vrstva chrání vnitřní magnetické jádro před přímým kontaktem s analytem a před nespecifickými interakcemi. Umožňuje rovněž úpravu povrchu nosičů funkcionalizací umožňující následnou imobilizaci cílové molekuly. Povrchová úprava magnetických jader je nutná nejen z důvodu stabilizace nosičů, ale především zajišťuje biokompatibilitu nosičů. Magnetické jádro, které je základem nejnovějších typů magnetických nosičů, je tvořeno magnetickými materiály o průměru menším než 30 nm. [36]. 2.7.1 Vlastnosti magnetických nosičů V závislosti na praktickém použití je na nano- a mikročástice kladena řada požadavků. Mezi základní vlastnosti patří (super)paramagnetismus, morfologické vlastnosti, velikost, tvar, polydispersita, obsah funkčních skupin, dostatečný obsah magnetického materiálu. Nosiče musí být mimo jiné stabilní v roztocích (neagregovat), zachovat si biokompatibilitu, nepodléhat chemickým přeměnám a současně mít vysoký obsah magnetického plniva, aby separace v magnetickém poli byla dostatečně rychlá. Důležitý je nejen pravidelný sférický tvar nosičů, ale také jejich velikost a monodispersita (jednotná velikost). Monodisperzní nosiče vykazují jednotné fyzikální a chemické vlastnosti. Na rozdíl od velkých nosičů, mají nosiče s malým průměrem velký specifický povrch, který slouží k připojení funkčních skupin, případně k imobilizaci biomolekul, jako jsou například enzymy či další biologicky aktivní látky. Vyšší specifický povrch zároveň poskytuje větší výsledný prostor pro možné interakce s cílovými molekulami (účinnost separace je přímo úměrná velikosti povrchu) [36]. 2.7.2 Magnetické mikročástice Magnetické nanočástice a mikročástice nalezly významné uplatnění v celé řadě oborů, např. v molekulární biologii, buněčné biologii, mikrobiologii, biotechnologii a různých medicínských aplikacích. Významnou vlastností magnetických materiálů je možnost jejich selektivní separace s využitím vnějšího magnetického pole, a to i ze složitých systémů. [39, 40]. V této práci byly využity magnetické mikročástice P(HEMA-co-GMA). Tyto částice mají na svém povrchu karboxylové skupiny, které reverzibilně adsorbují DNA [38]. K adsorbci DNA na povrch částic dochází za podmínek kondenzace DNA (kulovitěspirálovitý tvar). To umožňuje navázat DNA na záporně nabité karboxylové skupiny na povrchu nosiče (DNA nese záporný náboj). Pro navození kondenzace DNA je nutná přítomnost polyethylen glykolu (PEG 6000) a chloridu sodného [30]

2.8

Imunomagnetická separace

Imunomagnetická separace, využívá magnetické mikročástice s navázanou specifickou protilátkou a umožňuje rychlé navázání a následné oddělení cílových buněk. Je významnou technikou pro urychlení mikrobiologických rozborů v potravinářském průmyslu. Díky této

- 20 -

metodě je možno efektivně analyzovat velké množství vzorků a stanovovat výskyt významných patogenních mikroorganismů, např. salmonel, listerií nebo verotoxigenních kmenů Escherichia coli ve vzorcích, které jsou komplexní a které obsahují velké množství dalších buněk. Tímto způsobem byli izolováni i výše zmínění patogeni, kteří byli subletálně poškozeni v důsledku technologického zpracování potraviny. [42]. 2.8.1 Princip imunomagnetické separace Standardní mikrobiologický postup pro detekci patogenních bakterií v potravinách obvykle vyžaduje čtyři kroky a nejméně čtyři různá kultivační média; celkový čas nezbytný pro detekci cílových bakterií je několik dnů. Jednou z možností, jak zkrátit celkovou dobu stanovení, je náhrada kroku selektivního pomnožení (obvyklá doba trvání je 24 hodin) postupem nevyžadujícím kultivaci. Optimální možností je využití specifické imunologické separace (IMS) cílových mikrobiálních buněk přímo z analyzovaného vzorku, nebo z neselektivního pomnožovacího média po vhodně dlouhé kultivaci. Vlastní separační krok, tj. specifické navázání cílových buněk na imunomagnetické částice, trvá obvykle méně než jednu hodinu (nejčastěji používané doby inkubace jsou v rozmezí 10 až 60 hodin). Pro úspěšné provedení IMS je nezbytné použít vhodných imunomagnetických částic, tj., magnetických částic (nejčastěji o rozměrech v jednotkách mikrometrů), na jejichž povrchu jsou imobilizovány protilátky proti příslušných epitopům cílových buněk. Zásadní výhodou imunomagnetické separace je skutečnost, že s její pomocí je možno separovat cílové mikroorganismy prakticky z jakékoli matrice (např. potraviny, voda, výkaly, biologické materiály, půda, kaly apod.) a získané buňky následně analyzovat celou škálou mikrobiologických, molekulárně biologických, mikroskopických a dalších technik. Imunomagnetická separace je široce využívána zejména v potravinářské, klinické, veterinární a environmentální mikrobiologii. Ve srovnání se standardními kultivačními metodami IMS umožňuje získat (díky eliminaci kroku selektivního pomnožení) výsledky v kratším čase a navíc obvykle poskytuje vyšší počet pozitivních nálezů. Pomocí IMS je rovněž možno separovat a následně stanovit i subletálně poškozené cílové mikrobiální buňky. IMS neovlivňuje životaschopnost zachycených buněk, a proto magneticky separované buňky mohou být kultivovány na selektivních agarech nebo v tekutých živných médiích a testovány standardním způsobem [41, 42]. Cílové buňky zachycené na imunomagnetických částicích mohou být rovněž detekovány pomocí impedančních technik, imunochemicky (ELISA metody) apod. Významná je možnost propojení IMS s polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Proces kombinující tyto dvě metody je někdy označován jako MIPA (magnetic immuno PCR assay). Vzhledem ke krátké době spotřeby u potravin určených pro přímou spotřebu je vhodné pro mikrobiologické rozbory použít rychlé metody. Kombinace IMS a PCR přináší několik zásadních výhod, a sice možnost zkoncentrování cílových buněk s využitím magnetických částic, přičemž jsou zároveň odstraněny inhibitory PCR, a rychlá a specifická detekce cílového patogenu pomocí PCR. Zároveň je možné část imunomagnetických částic s navázanými buňkami vyočkovat na vhodný agar, což umožní detailní charakterizaci nalezeného patogenního mikroorganismu [41, 42].

- 21 -

3

CÍL PRÁCE

Cílem diplomové práce byla izolace DNA v kvalitě vhodné pro PCR z komplexních matric probiotických doplňků stravy. Dalším cílem byla rodová a druhová identifikace bakterií, jejich přítomnost byla ve výrobku deklarována výrobcem. K tomu provést Izolace DNA z hrubého lyzátu buněk magnetickým nosičem P(HEMA-co-GMA) pokrytým COOH skupinami Spektrofotometrické stanovení koncentrace izolované DNA Izolace buněk pomocí magnetického nosiče s imobilizovanou protilátkou proti bakteriím rodu Lactobacillus. Provedení PCR pro rod Lactobacillus Provedení PCR pro druh Lactobacillus acidophilus

- 22 -

4 4.1

MATERIÁL Použité potravinové doplňky

V diplomové práci byly použity 4 druhy probiotických potravinových doplňků. Výrobky byly vybrány náhodně a zakoupeny v běžné komerční síti. Jejich deklarované složení je uvedeno v tab.2 Tab.2: Použité potravinové doplňky s deklarovaným složením Název

Šarže

Forma

Probiotika

Tablety

Lactobacily a Bifidobakterie

Linex Forte

30.9.2012 9.7.2012 10.1.2014 BK2735

Kapsle

Lyofilizované kultury 1×109 kolonií kmenů Lactobacillus bakterií / 1 acidophilus (LA-5), tobolka Bifidobacterium animalis

Biopron

27978

Kapsle

MultiLac

8138107

Kapsle

Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei Lyofilizované kultury kmenů Lcb. casei, Lcb.acidophilus

Pangamin Bifi plus

Deklarované množství buňek Výrobce neuvádí

9×109 kolonií bakterií / 2 tobolky 4,5×109 kolonií bakterií / 1 tobolka

Fotografie potravinových doplňků jsou uvedeny na obr.7, obr.8, obr.9 a obr.10.

Obr.7:

Fotografie výrobku Pangamin Bifi plus [21]

- 23 -

Obr.8:

Fotografie výrobku Linex Forte [22]

Obr.9:

Fotografie výrobku Biopron [23]

Obr.10:

Fotografie výrobku MultiLac [24]

- 24 -

4.2

Bakteriální kultury

DNA pro pozitivní kontroly v PCR a pro ověření citlivosti PCR byla izolována ze sbírkových kmenů. Lactobacillus acidophilus CCM 4833 Lactobacillus casei CCM 7088

4.3

Chemikálie a roztoky

Všechny chemikálie byly v čistotě p. a. Roztoky byly připravovány ze sterilních roztoků. Ředění bylo prováděno sterilní destilovanou H2O. Pro přípravu potřebných roztoků byly použity následující chemikálie: Agaróza pro elektroforézu DNA (Top-Bio, Praha, ČR) DNA standard (100 bp) (Malamité, Moravské Prusy, ČR) Destilovaná voda (FCH VUT Brno, ČR) Ethanol (Penta, Chrudim, ČR) Ethidium bromid (5mg/ml) (EtBr) (Sigma, St. Louis, USA) Ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA) (Penta, Chrudim, ČR) Chlorid sodný (Lachema, Brno, ČR) Chlorid draselný (Lachema, Brno, ČR) Chloroform (Penta, Chrudim, ČR) Izoamylalkohol (Lachema, Brno, ČR) Kyselina boritá (HBO2) (Penta, Chrudim, ČR) Lysozym (Serva, Heidelberg, SRN) Nanášecí pufr (2,5% Ficoll 400) (Top-Bio, Praha, ČR) Octan sodný (Lachema, Brno, ČR) PCR komponenty (Top-Bio, Praha, ČR) PEG 6000 (Sigma, St. Louis, USA) Proteinasa K (100µg/ml) (Serva, Heidelberg, SRN) SDS (Sigma, St. Louis, USA) Tris-hydroxymethyl-aminomethan (Tris-base) (Serva, Heidelberg, SRN) Tris-hydroxymethyl-aminomethan (Tris-HCl) (Serva, Heidelberg, SRN) 4.3.1 Kultivační média M.R.S. médium MRS médium připravit podle návodu od výrobce. V 1 000 ml destilované vody rozpustit 52 g MRS média, pH média upravit na hodnotu 6,2. Sterilizovat v autoklávou při 121 °C po dobu 15 minut. M.R.S. agar MRS médium připravit podle návodu od výrobce. Přidat agarózu (15 g/l). Médium sterilizovat autoklávováním při 121 °C po dobu 15 minut, poté rozplnit do Petriho misek

- 25 -

a uchovávat v ledničce. 4.3.2 Roztoky pro přípravu hrubých lyzátů buněk Příprava 0,5 M EDTA (pH 8,0): 186,1 g EDTA rozpuštěno v 800 ml destilované vody pomocí 1M NaOH bylo upraveno pH na 8,0 roztok byl doplněn do objemu 1 l destilovanou H2O, rozdělen do alikvotů a sterilizován autoklávováním (121°C, 20 min) Příprava zásobního roztoku 1 M Tris HCl (pH 7,8): 12,1 g Tris base 70 ml destilované H2O pomocí 1M HCl bylo upraveno pH na 7,8 roztok byl doplněn do objemu 100 ml destilovanou vodou a sterilizován autoklávováním (121°C, 20 min) Příprava lyzačního roztoku A: 10 mM Tris HCl (pH 7,8) 5 mM EDTA (pH 8,0) roztok byl připraven sterilně ze zásobních roztoků 1 M Tris HCl a 0,5 M EDTA Příprava lyzačního roztoku B: lyzační roztok A lysozym 3 mg/ml lysozym byl přidán do lyzačního roztoku těsně před použitím Příprava SDS (20 %) 20 g SDS rozpuštěno v 80 ml sterilní destilované vody roztok zahřát na teplotu 68 °C pomocí koncentrované HCl bylo upraveno pH na 7,0 roztok byl doplněn destilovanou vodou do 100 ml bez sterilizace Příprava proteinasy K (100 µg/ml) rozpuštěno 100 µg proteinasy K v 1 ml destilované vody rozplněno do alikvotů uchovávat při -20 °C 4.3.3 Magnetické částice pro izolaci DNA Poly-(2-hydroxyethyl methakrylát-co-glycidyl methakrylát (P(HEMA-co-GMA)) (1:1) pokrytý karboxylovými skupinami. Průměru částic je 2,2 µm s obsahem COOH skupin 2,67 % a obsahem železa 6,5% 4.3.4 Roztoky pro izolaci DNA pomocí magnetických částic Příprava 5 M NaCl rozpuštěno 58,4 g NaCl ve 150 ml destilované vody

- 26 -

doplněno destilovanou vodou do 200 ml sterilizování v autoklávu (121 °C/15 minut) Příprava 40 % PEG 6000 rozpuštěno 40 g PEG 6000 v 60 ml destilované vody doplněno destilovanou vodou do 100 ml uchovávano při 4 °C Příprava 70 % ethanolu smícháno 70 ml 96 % ethanolu s 26 ml destilované vody Příprava TE pufru 10 mM Tris HCl (pH 7,8) 1 mM EDTA (pH 8,0) roztok byl připraven sterilně ze zásobních roztoků 1 M Tris HCl (pH 7,8) a 0,5 M EDTA (pH 8,0) 4.3.5 Roztoky pro agarózovou gelovou elektroforézu Příprava 5 x TBE pufru rozpuštěno 54 g Tris-base a 27,5 g kyseliny borité v 600 ml destilované vody přidáno 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) pH upraveno na 8,0 pomocí 1 M NaOH doplněno destilovanou vodou do 1000 ml před použitím se roztok naředil10 x destilovanou vodou Příprava Agarózového gelu (1,8 %) rozvařena 1,8 g agarózy ve 100 ml 0,5 x koncentrovaného TBE pufru Příprava Ethidium bromidu (0,5 µg/ml) 100 µl roztoku EtBr (2,5 mg/ml) rozředěno v 500 ml sterilní destilované vody 4.3.6 Komponenty pro PCR PCR voda (Top-Bio, Praha, ČR) Reakční pufr kompletní (10x koncentrovaný); složení: 750 mM Tris HCl (pH 8,8) 200 mM (NH4)2SO4, 0,1 % Tween 20, 15 mM MgCl2 (Top-Bio, Praha, ČR) dNTP směs 10 mM (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), pH 7,5 (Top-Bio, Praha, ČR) Primery (Generi-Biotech, Hradec Králové, ČR) Taq DNA polymeráza 1.1 (1 U/µl) (Top-Bio, Praha, ČR)

4.4

Pomůcky a přístroje Laboratorní váhy (Kern and Sohn, Německo) Centrifuga Mini Spin 14 500 min-1 (Eppendorf, Hamburg, Německo) Exikátor (KIF LAB Freiburg, Německo) Mikropipety Discovery HTL o objemu 10, 20, 200 a 1000 µl (Varšava, Polsko) Mikrovlnná trouba SMW 5020 (SENCOR, ČR)

- 27 -

Termostat Mini Incubator (Labnet, USA) Termostat FTC 901 (VELP SCIENTIFICA, Milano, Itálie) Transiluminátor TVR 3121 (Spectroline, USA) Zařízení pro elektroforézu Mini Gel (Hoefer, USA) Zdroj elektrického napětí pro elektroforézu Lighting Volt Power Supply, model OSP300 (Owl Scientific, USA) Očkovací box (Fatran, ČR) Termocycler PTC-200 (BIO-RAD Lab., USA) Minicycler PTC-150 (MJ Research, Inc., Watertown, USA) NanoPhotometr (Implen, Německo) Digitální fotoaparát (Kodak, Dánsko) Bežné laboratorní sklo, umělohmotný laboratorní materiál a pomůcky

- 28 -

5

METODY

Popsané postupy byly prováděny podle práce [30] a osobního sdělení doc. RNDr. A. Španové, CSc. a Ing. Zovčákové.

5.1

Izolace DNA z potravinových doplňků

5.1.1 Lyze buněk z tablet a kapslí potravinových doplňků Tablety byly sterilně odebrány a resuspendovány v 1 ml lyzačního roztoku A bez lysozymu. Suspenze byla důkladně promíchána. K 0,5 g prášku z kapslí bylo přidáno 2,25 ml lyzačního roztoku B s lysozymem a vzorky byly důkladně rozsuspendovány a inkubovány při laboratorní teplotě po dobu 1 hod. Následně bylo přidáno 57 µl 20% SDS a 4,5 µl proteinázy K (100µg/ml). Vše bylo důkladně promícháno a ponecháno inkubovat přes noc při 55 °C. Z takto připravených hrubých lyzátů buněk byla prováděna izolace DNA magnetickými nosičemi. Vzorky byly uchovávány při -20 °C, aby se předešlo možné degradaci DNA. 5.1.2 Příprava směsi pro izolaci DNA pomocí magnetických nosičů Separační směsi byly připravované v Eppendorfových zkumavkách. Pořadí a objem jednotlivých komponent je uveden v tabulce 3. Tab. 3: Příprava separační směsi pro izolaci DNA pomocí magnetických nosičů (P(HEMA-co-GMA)) Pořadí 1. 2. 3. 4.

Komponenty NaCl (5M) DNA matrice PEG (40%) Magnetické částice (2 mg/ml)

Výsledný objem

Objem (µl) 400 350 200 50 1000

Komponenty byly smíchány v daném pořadí a ponechány inkubovat 15 min. při laboratorní teplotě. Částice s navázanou DNA byly separovány pomocí magnetu 15 min při laboratorní teplotě. Supernatant byl opatrně odpipetován a částice byly 2x promyty 1000µl 70% ethanolu. Částice byly separovány magnetem 2 min při laboratorní teplotě. Ethanol byl opatrně odebrán a částice byly sušeny v termostatu (55 °C) do úplného odpaření ethanolu. DNA adsorbovaná na magnetických částicích byla rozsuspendována ve 100 µl TE pufru a ponechána eluovat přes noc při laboratorní teplotě. Druhý den byly částice odseparovány a eluovaná DNA byla přenesena do čisté eppendorfovy zkumavky. Takto připravená DNA se použila pro PCR

- 29 -

5.1.3 Izolace buněk Lactobacillus pomocí imunomagnetické separace Izolace buněk rodu Lactobacillus pomocí imunomagnetické separace se prováděla z hrubých lyzátů buněk z potravinových doplňků Biopron a Linex Forte. přeneslo se 100 µl magnetických částic ke 100 µl hrubého lyzátu do 1,5 ml Eppendorffovy zkumavky nechalo se 1 hodinu inkubovat při laboratorní teplotě roztok umístěn v magnetickém separátoru nejméně 30 s opatrně byl odebrán supernatant (zkumavka byla stále umístěna v separátoru) k magnetickým kuličkám bylo přidáno 50 µl PBS pufru promytí se 4-krát opakovalo nakonec se ke kuličkám přidalo 50 µl PBS pufru a vyselo na Petriho misku misky se daly do termostatu při 37 °C (aerobní i anaerobní kultivace) z narostlé kultury se část sterilně odebrala do Eppendorfových zkumavk s 20 µl TE pufru zkumavky byly povařeny v cykleru na 99 °C/ 30 minut po vyndání ze cykleru byly vloženy do ledové vodní lázně a následně se s nimi pracovalo jako DNA matrice 5.1.4 Kultivace bakteriálních buněk Hrubé lyzáty byly zředěny na 1·10-4, 1·10-5 a 1·10-6. 10 µl naředěného vzorku bylo rozetřeno na agorovou plotnu. Zbývající část byla přenesena do 10 ml tekutého média MRS (inokulace 3 %). Kultivace probíhala aerobně i anaerobně v termostatu při 37 °C 24 hodin. Po kultivaci byl vizuálně zkontrolován vzhled kolonií na Petriho miskách, které byly dále uchovávány v lednici. 5.1.5 Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty DNA měření bylo prováděno na spektrofotometru NanoPhotometr Implen (lid 10) pro nastavení spektrofotometru byl nejprve proměřen TE pufr (objem 3 µl) poté byly proměřeny vzorky DNA (objem 3 µl) na přístroji byla přímo odečtena hodnota A260/A280 (posouzení čistoty DNA) a koncentrace DNA (v ng/ µl) 5.1.6 Složení směsí pro PCR při stanovení citlivosti PCR PCR směsi pro stanovení citlivosti PCR byly připraveny podle tabulky 4. Jako DNA matrice byla použita DNA ředěná na různé koncentrace (od 10 ng/µl po 1040 fg/µl). Citlivost PCR byla sledována u rodově specifických PCR Lactobacillus pro druh Lactobacillus acidophilus.

- 30 -

Tab. 4: Složení směsi pro PCR při stanovení citlivosti PCR Pořadí 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Komponenty voda pro PCR 10× reakční pufr kompletní směs dNTP (10 mM) primer LbLMA 1 (10 pmol/ µl), primer F eub (10 pmol/ µl) primer R 16-1 (10 pmol/ µl), primer R eub (10 pmol/ µl) DNA polymerasa Top Bio 1.1 (1 U/ µl) DNA matrice (20 ng/ µl)

Množství (µl) 18 2,5 0,5 0,5 0,5 1 2

5.1.7 PCR pro doménu Bacteria s DNA izolovanou z potravinových doplňků Pro doménu Bacteria byla prováděna amplifikace fragmentu DNA o délce asi 466 bp pomocí primerů F eub a R eub [25]. Byla použita DNA o koncentraci 10 ng/µl. 5.1.7.1 Příprava PCR směsi všechny komponenty PCR směsi byly před použitím krátce centrifugovány komponenty byly míchány v pořadí, které je uvedeno v tab. 5 (doména Bacteria) při každém přidání další složky byla směs dobře promíchána bylo připraveno 25 µl PCR směsi do 200 µl Eppendorfových zkumavek pro negativní kontrolu (kontrola kontaminace složek PCR) byla namísto DNA matrice přidána PCR voda o objemu 2 µl pro pozitivní kontrolu (kontrola specifity PCR) byla jako DNA matrice použita bakteriální DNA druhu Lactobacillus casei o koncentraci 10 ng/µl Tab. 5: Komponenty a jejich množství v PCR směsi (25 µl) pro doménu Bacteria Pořadí 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Komponenty voda pro PCR 10× reakční pufr kompletní směs dNTP (10 mM) primer F eub (10 pmol/ µl) primer R eub (10 pmol/ µl) DNA polymerasa Top Bio 1.1 (1 U/ µl) DNA matrice (20 ng/ µl)

Množství (µl) 18 2,5 0,5 0,5 0,5 1 2

5.1.7.2 Průběh amplifikace vzorky se všemi komponenty byly opatrně promíchány a krátce centrifugovány vzorky byly vloženy do termocykléru, který pracoval podle předem nastaveného programu DOMBAC (tab. 6)

- 31 -

Tab. 6: Program PCR se specifickými primery pro doménu Bakteria Krok 1. Horký start 2. Denaturace DNA 3. Hybridizace primerů 4. Syntéza DNA 5.Prodloužení syntézy DNA (v posledním cyklu)

Teplota (°C) 95 95 55 72 72

Čas (s) 300 30 30 60 600

po prvním kroku byla DNA zahřívána při 95°C po dobu 5 min. (horký start) po prvním cyklu byly kroky 2 – 4 zopakovány v dalších 29 cyklech, v posledním cyklu byla syntéza prodloužena na 10 minut 5.1.7.3 Detekce PCR produktů agarózovou gelovou elektroforézou byl připraven 1,8 % agarozový gel (1,8 g agarózy, 100 ml 0,5× TBE pufru) k množství 25 µl PCR produktu bylo přidáno 5 µl stop pufru do jednotlivých komůrek gelu byly naneseny PCR produkty a do zvláštní komůrky velikostní standard vanička s gelem byla vložena do elektroforetické vany, převrstvena asi 250 ml 0,5× TBE pufru a elektroforéza byla spuštěna (pod napětím 70 V) přibližně po 2 hodinách byla elektroforéza zastavena, gel byl vyjmut a obarven v lázni připravené z 500 ml destilované vody a ethidium bromidu (výsledná koncentrace 1 µg/ml) obarvený gel byl prohlížen na transiluminátoru v UV světle výsledky byly zdokumentovány digitálním fotoaparátem

5.1.8

Rodově specifická PCR s bakteriální DNA izolovanou z potravinových doplňků Při rodově specifické PCR byla prováděna amplifikace fragmentu DNA o délce asi 250 bp pomocí primerů LbLMA1 a R16-1 [20]. Tento fragment je specifický pro bakterie rodu Lactobacillus. 5.1.8.1 Příprava PCR směsi všechny komponenty PCR směsi byly před použitím krátce centrifugovány komponenty byly míchány v pořadí, které je uvedeno v tab. 7 (rodově specifická PCR) při každém přidání další složky byla směs dobře promíchána bylo připraveno 25 µl PCR směsi do 200 µl Eppendorfových zkumavek pro negativní kontrolu (kontrola kontaminace složek PCR) byla namísto DNA matrice přidána PCR voda o objemu 2 µl pro pozitivní kontrolu (kontrola specifity PCR) byla jako DNA matrice použita bakteriální DNA druhu Lactobacillus casei o koncentraci 10 ng/µl

- 32 -

Tab. 7: Komponenty a jejich množství v PCR směsi (25 µl) pro rodově specifickou PCR Lactobacillus Pořadí 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Komponenty voda pro PCR 10× reakční pufr kompletní směs dNTP (10 mM) primer LbLMA 1 (10 pmol/ µl) primer R 16-1 (10 pmol/ µl) DNA polymerasa Top Bio 1.1 (1 U/ µl) DNA matrice (20 ng/ µl)

Množství (µl) 18 2,5 0,5 0,5 0,5 1 2

5.1.8.2 Průběh amplifikace vzorky se všemi komponenty byly opatrně promíchány a krátce centrifugovány vzorky byly vloženy do termocykléru, který pracoval podle předem nastaveného programu LBC ROD (tab. 8) Tab. 8: Program PCR s rodově specifickými primery Lactobacillus Krok 1. Horký start 2. Denaturace DNA 3. Hybridizace primerů 4. Syntéza DNA 5.Prodloužení syntézy DNA (v posledním cyklu)

Teplota (°C) 95 95 55 72 72

Čas (s) 300 30 30 60 600

po prvním kroku byla DNA zahřívána při 95°C po dobu 5 min. (horký start) po prvním cyklu byly kroky 2 – 4 zopakovány v dalších 29 cyklech, v posledním cyklu byla syntéza prodloužena na 10 minut 5.1.8.3

Detekce rodově specifických PCR produktů agarózovou gelovou elektroforézou byl připraven 1,8 % agarozový gel (1,8 g agarózy, 100 ml 0,5× TBE pufru) k množství 25 µl PCR produktu bylo přidáno 5 µl stop pufru do jednotlivých komůrek gelu byly naneseny PCR produkty a do zvláštní komůrky velikostní standard vanička s gelem byla vložena do elektroforetické vany, převrstvena asi 250 ml 0,5× TBE pufru a elektroforéza byla spuštěna (pod napětím 70 V) přibližně po 2 hodinách byla elektroforéza zastavena, gel byl vyjmut a obarven v lázni připravené z 500 ml destilované vody a ethidium bromidu (výsledná koncentrace 1 µg/ml) obarvený gel byl prohlížen na transiluminátoru v UV světle výsledky byly zdokumentovány digitálním fotoaparátem

- 33 -

5.1.9

Druhově specifická PCR s bakteriální DNA izolovanou z potravinových doplňků Při druhově specifické PCR byla prováděna amplifikace fragmentu DNA o délce asi 800 bp pomocí primerů Aci16SI a 16SII [20]. Tento fragment je specifický pro bakterie druhu Lactobacillus acidophilus 5.1.9.1 Příprava PCR směsi všechny komponenty PCR směsi byly před použitím krátce centrifugovány komponenty byly míchány v pořadí, které je uvedeno v tab. 9 (druhově specifická PCR) při každém přidání další složky byla směs dobře promíchána bylo připraveno 25 µl PCR směsi do 200 µl Eppendorfových zkumavek pro negativní kontrolu (kontrola kontaminace složek PCR) byla namísto DNA matrice přidána PCR voda o objemu 2 µl pro pozitivní kontrolu (kontrola specifity PCR) byla jako DNA matrice použita bakteriální DNA druhu Lactobacillus acidophilus o koncentraci 10 ng/µl Tab. 9: Komponenty a jejich množství v PCR směsi (25 µl) pro druhově specifickou PCR Lactobacillus acidophilus Pořadí 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Komponenty voda pro PCR 10× reakční pufr kompletní směs dNTP (10 mM) primer Aci16SI (10 pmol/ µl) primer 16SII (10 pmol/ µl) DNA polymerasa Top Bio 1.1 (1 U/ µl) DNA matrice (20 ng/ µl)

Množství (µl) 18 2,5 0,5 0,5 0,5 1 2

5.1.9.2 Průběh amplifikace vzorky se všemi komponenty byly opatrně promíchány a krátce centrifugovány vzorky byly vloženy do termocykléru, který pracoval podle předem nastaveného programu LBCRHAM (tab. 10) Tab. 10: Program PCR s druhově specifickými primery Lactobacillus acidophilus Krok Teplota (°C) Čas (s) 1. Horký start 95 300 2. Denaturace DNA 95 30 3. Hybridizace primerů 55 30 4. Syntéza DNA 72 60 5.Prodloužení syntézy DNA 72 300 (v posledním cyklu)

- 34 -

po prvním kroku byla DNA zahřívána při 95°C po dobu 5 min. (horký start) po prvním cyklu byly kroky 2 – 4 zopakovány v dalších 29 cyklech, v posledním cyklu byla syntéza prodloužena na 5 minut 5.1.9.3

Detekce druhově specifických PCR produktů agarózovou gelovou elektroforézou byl připraven 1,8 % agarozový gel (1,8 g agarózy, 100 ml 0,5× TBE pufru) k množství 25 µl PCR produktu bylo přidáno 5 µl stop pufru do jednotlivých komůrek gelu byly naneseny PCR produkty a do zvláštní komůrky velikostní standard vanička s gelem byla vložena do elektroforetické vany, převrstvena asi 250 ml 0,5× TBE pufru a elektroforéza byla spuštěna (pod napětím 70 V) přibližně po 2 hodinách byla elektroforéza zastavena, gel byl vyjmut a obarven v lázni připravené z 500 ml destilované vody a ethidium bromidu (výsledná koncentrace 1 µg/ml) obarvený gel byl prohlížen na transiluminátoru v UV světle výsledky byly zdokumentovány digitálním fotoaparátem

5.1.9.4 Velikostní standard 100 bp žebříček Jako velikostní standard byl pro stanovení velikosti PCR produktu pomocí agarózové gelové elektroforézy použit žebříček 100 bp žebříček. Obsahuje následující fragmenty DNA. Na obr. 11 je zobrazen DNA standard (100 bp žebříček).

Obr.11:

DNA standard (100 bp žebříček)

- 35 -

6 6.1

Výsledky Příprava hrubých lyzátů buněk a izolace DNA pomocí magnetických nosičů

Hrubé lyzáty buněk byly připraveny z výrobků dle metod (viz 5.1.1). Z každého výrobku byly připraveny čtyři hrubé lyzáty buněk pro porovnání množství DNA připadající na jednu tabletu. Hrubé lyzáty byly připraveny z 0,5 g komplexní matrice, což odpovídá asi 1 tabletě Pangamin Bifi Plus, 2 kapslím Linex Forte, 2 kapslím Biopron a 1 kapsli MultiLac. Z připravených hrubých lyzátů byla izolována DNA pomocí magnetického nosiče (viz 5.1.2). DNA byla eluována do 100 µl TE pufru.

6.2

Spektrofotometrické stanovení koncentrace DNA izolované z výrobků

Přítomnost DNA byla ověřena spektrofotometricky. Pro stanovení koncentrace a čistoty izolované DNA byl použit přístroj NanoPhotometerTM Implen. Výsledky měření jsou shrnuty v tab. 11 – 16. 6.2.1 Pangamin Bifi plus (3 šarže) Nejprve bylo provedeno spektrofotometrické stanovení koncentrace DNA izolované ze třech různých šarží výrobků Pangamin Bifi Plus. Koncentrace jsou uvedeny v (tab. 11, tab.12, tab.13) První šarže Tab. 11 Koncentrace a množství DNA izolované z potravinového doplňku Pangamin Bifi Plus a hodnoty absorbance při různých vlnových délkách (šarže 1)

Pangamin Bifi plus

Výrobek Šarže 1 Vzorek.č 1 2 3 4

c (ng/µl) 55,0 48,0 62,5 71,5

A230 (nm) 0,420 0,305 0,442 0,493

A260 (nm) 0,161 0,134 0,203 0,220

A280 (nm) 0,135 0,107 0,181 0,191

A320 (nm) 0,051 0,038 0,078 0,077

A260/280 (nm) 1,310 1,391 1,214 1,254

A260/320 (nm) 0,296 0,360 0,343 0,344

Množství DNA (ng) 5500 4800 6250 7150

- 36 -

Druhá šarže Tab. 12 Koncentrace a množství DNA izolované z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus a hodnoty absorbance při různých vlnových délkách (šarže 2)

Pangamin Bifi plus


c (ng/µl) 61,5 73,5 54,5 37,0

A230 (nm) 0,626 0,502 0,493 0,423

A260 (nm) 0,148 0,198 0,151 0,093

A280 (nm) 0,142 0,160 0,136 0,095

A320 (nm) 0,025 0,051 0,042 0,019

A260/280 (nm) 1,051 1,349 1,160 0,974

A260/320 (nm) 0,205 0,326 0,242 0,183

Množství DNA (ng) 6150 7350 5450 3700

Třetí šarže Tab. 13 Koncentrace a množství DNA izolované z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus a hodnoty absorbance při různých vlnových délkách (šarže 3)

Pangamin Bifi plus


c (ng/µl) 30,5 24,5 27,5 27,5

A230 (nm) 0,063 0,042 0,061 0,062

A260 (nm) 0,068 0,050 0,061 0,062

A280 (nm) 0,040 0,026 0,038 0,036

A320 (nm) 0,007 0,001 0,006 0,007

A260/280 (nm) 1,848 1,960 1,719 1,897

A260/320 (nm) 1,089 1,195 1,000 1,000

Množství DNA (ng) 3050 2450 2750 2750

Ze čtyř vzorků potravinového doplňku Pangamin Bifi Plus (šarže 1) byla izolována DNA v koncentraci 48,0 - 71,5 ng/µl a v množství 4,8 - 7,15 µg. Ze čtyř vzorků potravinového doplňku Pangamin Bifi Plus (šarže 2) byla izolována DNA v koncentraci 37,0 - 73,5 ng/µl a v množství 3,7 - 7,35 µg. Ze čtyř vzorků potravinového doplňku Pangamin Bifi Plus (šarže 3) byla izolována DNA v koncentraci 24,5 - 30,5 ng/µl a v množství 2,45 – 3,05 µg. 6.2.2 Biopron Koncentrace a množství DNA izolovaná z potravinového výrobku Biopron je uvedeno v tab. 14. Tab. 14 Koncentrace a množství DNA izolované z potravinového doplňku Biopron a hodnoty absorbance při různých vlnových délkách

Biopron

Výrobek Vzorek.č 1 2 3 4

c (ng/µl) 13,0 28,0 24,0 31,5

A230 (nm) 0,033 0,068 0,077 0,108

A260 (nm) 0,029 0,071 0,060 0,078

A280 (nm) 0,018 0,053 0,043 0,057

A320 (nm) 0,003 0,015 0,012 0,015

A260/280 (nm) 1,733 1,474 1,450 1,500

A260/320 (nm) 0,867 1,057 0,738 0,670

Množství DNA (ng) 1300 2800 2400 3150

- 37 -

Ze čtyř vzorků potravinového doplňku Biopron byla izolována DNA v koncentraci 13,0 - 31,5 ng/µl a v množství 1,3 – 3,15 µg. 6.2.3 Linex Forte Koncentrace a množství DNA izolovaná z potravinového výrobku Linex Forte je uvedeno v tab. 15. Tab. 15 Koncentrace a množství DNA izolované z potravinového doplňku Linex Forte a hodnoty absorbance při různých vlnových délkách

Linex Forte


c (ng/µl) 14,0 15,5 11,5 10,0

A230 (nm) 0,032 0,018 0,027 0,030

A260 (nm) 0,031 0,037 0,026 0,024

A280 (nm) 0,020 0,027 0,017 0,017

A320 (nm) 0,003 0,006 0,003 0,005

A260/280 (nm) 1,647 1,476 1,643 1,583

A260/320 (nm) 0,966 2,583 0,958 0,760

Množství DNA (ng) 1400 1550 1150 1000

Ze čtyř vzorků potravinového doplňku Linex Forte byla izolována DNA v koncentraci 10,0 - 15,5 ng/µl a v množství 1,0 – 1,55 µg. 6.2.4 MultiLac Koncentrace a množství DNA izolovaná z potravinového výrobku MultiLac je uvedeno v tab. 16. Tab. 16 Koncentrace a množství DNA izolované z potravinového doplňku MultiLac a hodnoty absorbance při různých vlnových délkách

MultiLac


c (ng/µl) 27,5 39,0 32,0 78,5

A230 (nm) 0,069 0,111 0,081 0,309

A260 (nm) 0,071 0,104 0,084 0,242

A280 (nm) 0,049 0,073 0,062 0,189

A320 (nm) 0,016 0,026 0,020 0,085

A260/280 (nm) 1,667 1,660 1,524 1,510

A260/320 (nm) 1,038 0,918 1,049 0,701

Množství DNA (ng) 2750 3900 3200 7850

Ze čtyř vzorků potravinového doplňku MultiLac byla izolována DNA v koncentraci 27,5 – 78,5 ng/µl a v množství 2,75 - 7,85 µg.

6.3

Stanovení citlivosti amplifikace v PCR s purifikovanou DNA

Byla provedena PCR s různým množstvím DNA purifikovaných z čistých bakteriálních kultur pro zjištění nejnižšího množství DNA, která se amplifikuje v PCR za vzniku produktu PCR detekovatelného pomocí agarózové gelové elektroforézy. DNA matrice byla naředěna pomocí TE pufru na koncentraci 10 ng/µl, 1 ng/µl, 100 pg/µl, 10 pg/µl, 1 pg/µl a 100 fg/µl a byla amplifikována v rodově a druhově specifických PCR.

- 38 -

6.3.1 Citlivost amplifikace pro rod Lactobacillus Směs pro PCR byla připravena dle 5.1.6 s DNA matricí Lactobacillus casei CCM 7088 a amplifikována s rodově specifickými primery LblMA-1 a R16-1 (viz 5.5.8.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 250 bp (obr.12) Obr.12:

Agarózová gelová elektroforéza specifických produktů PCR (250 bp) pro rod

Lactobacillus. Amplifikováno bylo 2 µl DNA Lactobacillus casei CCM 7088

bp

1

2

3 4 5

6

7

8

9

500 PCR produkt 100 Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Koncentrace DNA DNA standard (3 µl) 10 ng/ µl 1 ng/ µl 100 pg/ µl 10 pg/ µl 1 pg/ µl 100 pg/ µl PK NK

Množství DNA / PCR směs -

20 ng 2 ng 200 pg 20 pg 2 pg 200 fg 20 ng -

Detekce produktu PCR 100 bp žebříček +++ ++ + -

+++ -

Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě ++ detekován PCR produkt o střední intenzitě + detekován PCR produkt o střední intenzitě

PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná Nejnižší množství DNA amplifikovatelné v PCR za vzniku rodově specifických produktů PCR dobře detekovatelných na gelu je 200 pg.

- 39 -

6.3.2 Citlivost amplifikace pro druh Lactobacillus acidophilus Směs pro PCR byla připravena dle 5.6.1 s DNA matricí Lactobacillus acidophilus CCM 4833 a amplifikována s druhově specifickými primery Aci16SI a 16SII (viz 5.5.9.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 800 bp (obr. 13) Obr.13:

Agarózová gelová elektroforéza specifických produktů PCR (800 bp) pro druh Lactobacillus

acidophilus. Amplifikováno bylo 2 µl DNA Lactobacillus acidophilus CCM 4833

bp

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1000 PCR produkt

100 Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Koncentrace DNA DNA standard (3 µl) 10 ng/ µl 1 ng/ µl 100 pg/ µl 10 pg/ µl 1 pg/ µl 100 pg/ µl PK NK

Množství DNA / PCR směs -

20 ng 2 ng 200 pg 20 pg 2 pg 200 fg 20 ng -

Detekce produktu PCR 100 bp žebříček +++ ++ -

+++ -

Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě ++ detekován PCR produkt o střední intenzitě + detekován PCR produkt o slabé intenzitě

PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. acidophilus (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná Nejnižší množství DNA amplifikovatelné v PCR za vzniku druhově specifických produktů PCR dobře detekovatelných na gelu je 2 ng.

- 40 -

6.3.3 Shrnutí citlivostí amplifikace v rodově a druhově specifických PCR V tabulce 17 jsou uvedena nejnižší množství DNA amplifikovatelná v rodově a druhově specifických PCR za vzniku produktů PCR dobře detekovatelných na gelu. Tab. 17: Shrnutí detekce citlivostí v rodově a druhově specifických PCR

PCR specifická pro

rod Lactobacillus druh Lactobacillus acidophilus

Mn.DNA/ PCR směs 2 ng 200 pg 6 1·10 buněk 1·105 buněk

+ +

+

+ nejnižší množství DNA amplifikovatelné ve směsi pro PCR za vzniku amplikonu detekovatelného na gelu V rodově specifické PCR lze amplifikací detekovat minimálně 200 pg DNA pro rod Lactobacillus. V druhově specifické PCR je nejnižší amplifikovatelné množství DNA 2 ng DNA pro druh Lactobacillus acidophilus.

6.4

Ověření amplifikovatelnosti DNA izolované z výrobků pomocí magnetických nosičů v PCR pro doménu Bacteria

Ověření amplifikovatelnosti DNA v PCR pro doménu Bacteria byla provedena pomocí primerů F_eub a R_eub podle postupu uvedeného v kapitole 5. Metody. Do PCR bylo použito množství DNA (2 µl ) z potravinových doplňků, naředěné na koncentraci 10 ng/µl. Srovnáním polohy amplikonů s fragmenty dané velikosti ve standardu byla stanovena velikost produktu PCR.

6.4.1

DNA z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus v PCR pro doménu Bacteria DNA izolovaná pomocí magnetických nosičů ze 4 hrubých lyzátů první, druhé a třetí šarže potravinového doplňku Pangamin Bifi Plus byla amplifikována za použití specifických primerů F_eub a R_eub podle programu DOMBAC (viz 5.1.7.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 466 bp (obr.14 - 16).

- 41 -

První šarže Obr.14:

Agarózová gelová elektroforéza specifických produktů PCR (466 bp) pro doménu Bacteria.

DNA izolovaná z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus první šarže o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro doménu Bacteria. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

1

2

3

4

5

6

bp

7

1000

PCR produkt

100

Běh č.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

DNA Pangamin Bifi plus (první šarže) (c = ng/ µl) NK PK 10 10 10 10 DNA standard (3 µl)

Množství DNA / směs PCR (ng)

20 20 20 20 20

Detekce produktu PCR +++ +++ +++ +++ +++ 100 bp žebříček

Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro doménu Bacteria byly detekovány po amplifikaci DNA všech vzorků.

- 42 -

Druhá šarže Obr.15:


DNA izolovaná z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus druhé šarže o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro doménu Bacteria. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

bp

1

2

3

4

5

6

7

1000 PCR produkt

100

Běh č.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

DNA Pangamin Bifi plus (druhá šarže) (c = ng/ µl) DNA standard (3 µl) 10 10 10 10 PK NK


20 20 20 20 20

Detekce produktu PCR 100 bp žebříček +++ +++ +++ +++ +++ -

Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná

PCR produkty specifické pro doménu Bacteria byly detekovány po amplifikaci DNA všech vzorků.

- 43 -

Třetí šarže Obr.16:


DNA izolovaná z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus třetí šarže o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro doménu Bacteria. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

bp

1

2

3

4

5

6

7

1000 PCR produkt

100

Běh č.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

DNA Pangamin Bifi plus (třetí šarže) (c = ng/ µl) DNA standard (3 µl) 10 10 10 10 PK NK


20 20 20 20 20




- 44 -

6.4.2

DNA z potravinového doplňku Biopron v PCR pro doménu Bacteria

DNA izolovaná pomocí magnetických nosičů ze 4 hrubých lyzátů potravinového doplňku Biopron byla amplifikována za použití rodově specifických primerů F_eub a R_eub podle programu DOMBAC (viz 5.1.7.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 466 bp (obr. 17). Obr.17:


DNA izolovaná z potravinového doplňku Biopron o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro doménu Bacteria. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

1

2

3

4

5

6

bp

7

1000 PCR produkt

100 Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

DNA Biopronu (c = ng/ µl) NK PK 10 10 10 10 DNA standard (3 µl)

Množství DNA / směs PCR (ng) 20 20 20 20 20

Detekce produktu PCR +++ +++ +++ +++ +++ 100 bp žebříček



- 45 -

6.4.3

DNA z potravinového doplňku Linex Forte v PCR pro doménu Bacteria

DNA izolovaná pomocí magnetických nosičů ze 4 hrubých lyzátů potravinového doplňku Linex Forte byla amplifikována za použití rodově specifických primerů F_eub a R_eub podle programu DOMBAC (viz 5.1.7.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 466 bp (obr. 18). Obr.18:


DNA izolovaná z potravinového doplňku Linex Forte o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro doménu Bacteria. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

bp

1

2

3

4

5

6

7

1000

PCR produkt

100

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

DNA Linexu Forte (c = ng/ µl) DNA standard (3 µl) PK 10 10 10 10 NK




- 46 -

6.4.4

DNA z potravinového doplňku MultiLac v PCR pro doménu Bacteria

DNA izolovaná pomocí magnetických nosičů ze 4 hrubých lyzátů potravinového doplňku MultiLac byla amplifikována za použití rodově specifických primerů F_eub a R_eub podle programu DOMBAC (viz 5.1.7.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 466 bp (obr.19). Obr.19:


DNA izolovaná z potravinového doplňku MultiLac o koncentraci 10 ng/l byla amplifikována pomocí primerů specifických pro doménu Bacteria. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

bp 1

2

3

4

5

6

7

1000 PCR produkt

100

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

DNA Linexu Forte (c = ng/ µl) DNA standard (3 µl) PK 10 10 10 10 NK




- 47 -

6.5

PCR specifická pro rod Lactobacillus s bakteriální DNA izolovanou z výrobků pomocí magnetického nosiče

Specifická PCR pro detekci bakterií rodu Lactobacillus byla provedena pomocí primerů LbLMA1 a R16 – 1 dle postupu uvedeného v kapitole 5. Metody. Do PCR bylo použito množství DNA (2 µl ) z potravinových doplňků, naředěné na koncentraci 10 ng/µl. Srovnáním polohy amplikonů s fragmenty dané velikosti ve standardu byla stanovena velikost PCR produktu. 6.5.1

DNA z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus v rodově specifické PCR Lactobacillus DNA izolovaná pomocí magnetických nosičů ze 4 hrubých lyzátů první, druhé a třetí šarže potravinového doplňku Pangamin Bifi Plus byla amplifikována za použití rodově specifických primerů LblMA-1 a R16-1 podle programu LBCROD (viz 5.1.8.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 250 bp (obr.20 - 22). První šarže Výsledek agarózové gelové elektroforézy potravinového doplňku Pangamin Bifi plus (první šarže) je na obr. 21 Obr.20:

Agarózová gelová elektroforéza specifických produktů PCR (250 bp) pro rod Lactobacillus.

DNA izolovaná z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus první šarže o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro rod Lactobacillus. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

1

2

3

4

5

6

7

bp

500 PCR produkt 100 Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

DNA Pangamin Bifi plus Množství DNA / směs (c = ng/ µl) PCR (ng) NK PK 20 10 20 10 20 10 20 10 20 DNA standard (3 µl)

Detekce produktu PCR +++ +++ +++ ++ ++ 100 bp žebříček -

- 48 -

Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován ++ detekován PCR produkt o silné intenzitě +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro rod Lactobacillus byly detekovány po amplifikaci DNA všech vzorků. Druhá šarže Výsledek agarózové gelové elektroforézy potravinového doplňku Pangamin Bifi plus (druhá šarže) je na obr. 21 Obr.21:


DNA izolovaná z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus druhé šarže o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro rod Lactobacillus. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

bp

1

2

3

4

5

6

7

500 PCR produkt 100

- 49 -

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

DNA Pangamin Bifi plus Množství DNA / směs (c = ng/ µl) PCR (ng) DNA standard (3 µl) PK 20 10 20 10 20 10 20 10 20 NK

Detekce produktu PCR 100 bp žebříček ++ ++ ++ ++ +++ -

Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován ++ detekován PCR produkt o silné intenzitě +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro rod Lactobacillus byly detekovány po amplifikaci DNA všech vzorků. Třetí šarže Výsledek agarózové gelové elektroforézy potravinového doplňku Pangamin Bifi plus (třetí šarže) je na obr. 22 Obr.22:


DNA izolovaná z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus třetí šarže o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro rod Lactobacillus. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

bp

1

2

3

4

5

6

7

500 PCR produkt 100

- 50 -

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.



Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován ++ detekován PCR produkt o silné intenzitě +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro rod Lactobacillus byly detekovány po amplifikaci DNA všech vzorků. DNA z potravinového doplňku Biopron v rodově specifické PCR Lactobacillus DNA izolovaná pomocí magnetických nosičů ze 4 hrubých lyzátů potravinového doplňku Biopron byla amplifikována za použití rodově specifických primerů LblMA-1 a R16-1 podle programu LBCROD (viz 5.1.8.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 250 bp (obr. 23). 6.5.2

Obr.23:


DNA izolovaná z potravinového doplňku Biopron o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro rod Lactobacillus. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

1

2

3

4

5

6

7

bp

1000

PCR produkt 100

- 51 -

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

DNA Biopronu Množství DNA / směs (c = ng/ µl) PCR (ng) NK PK 20 10 20 10 20 10 20 10 20 DNA standard (3 µl)

Detekce produktu PCR ++ ++ ++ ++ +++ 100 bp žebříček

Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován ++ detekován PCR produkt o silné intenzitě +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro rod Lactobacillus byly detekovány po amplifikaci DNA všech vzorků.

6.5.3

DNA z potravinového doplňku Linex Forte v rodově specifické PCR Lactobacillus

DNA izolovaná pomocí magnetických nosičů ze 4 hrubých lyzátů potravinového doplňku Linex Forte byla amplifikována za použití rodově specifických primerů LblMA-1 a R16-1 podle programu LBCROD (viz 5.1.8.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 250 bp (obr.24). Obr.24:


DNA izolovaná z potravinového doplňku Linex Forte o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro rod Lactobacillus. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

bp

1

2

3

4

5

6

7

1000

PCR produkt

100

- 52 -

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

DNA Linex Forte Množství DNA / směs (c = ng/ µl) PCR (ng) DNA standard (3 µl) PK 20 10 20 10 20 10 20 10 20 NK


Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro rod Lactobacillus byly detekovány po amplifikaci DNA všech vzorků. DNA z potravinového doplňku MultiLac v rodově specifické PCR Lactobacillus DNA izolovaná pomocí magnetických nosičů ze 4 hrubých lyzátů potravinového doplňku MultiLac byla amplifikována za použití rodově specifických primerů LblMA-1 a R16-1 podle programu LBCROD (viz 5.1.8.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 250 bp (obr. 25). 6.5.4

Obr.25:


DNA izolovaná z potravinového doplňku MultiLac o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro rod Lactobacillus. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

bp

1

2

3

4

5

6

7

1000

PCR produkt

100

- 53 -

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

DNA MultiLac Množství DNA / směs (c = ng/ µl) PCR (ng) DNA standard (3 µl) PK 20 10 20 10 20 10 20 10 20 NK


Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován ++ detekován PCR produkt o silné intenzitě +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro rod Lactobacillus byly detekovány po amplifikaci DNA všech vzorků.

6.6

PCR specifická pro druh Lactobacillus acidophillus s bakteriální DNA izolovanou z výrobků pomocí magnetického nosiče

Specifická PCR pro detekci bakterií druhu Lactobacillus acidophilus byla provedena pomocí primerů Aci16SI a Aci16SII – dle postupu uvedeného v kapitole 5. Metody. Do PCR bylo použito množství DNA (2 µl ) z potravinových výrobků, naředěné na koncentraci 10 ng/µl. Srovnáním polohy amplikonů s fragmenty dané velikosti ve standardu byla stanovena velikost PCR produktu.

6.6.1

DNA z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus v druhově specifické PCR Lactobacillus acidophilus

DNA izolovaná pomocí magnetických nosičů ze 4 hrubých lyzátů první, druhé a třetí šarže potravinového doplňku Pangamin Bifi Plus byla amplifikována za použití druhově specifických primerů Aci16SI a Aci16SII podle programu LBCRHAM (viz 5.1.9.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 800 bp (obr.26 - 28).

- 54 -

První šarže Obr.26:


acidophilus. DNA izolovaná z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus první šarže o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro druh Lactobacillus acidophilus. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

bp

1

2

3

4

5

6

7

1000 PCR produkt

100

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.



Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. acidophilus(c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro druh Lactobacillus acidophilus byly detekovány po amplifikaci DNA všech vzorků.

- 55 -

Druhá šarže Obr.27:


acidophilus. DNA izolovaná z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus druhé šarže o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro druh Lactobacillus acidophilus. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

bp

1

2

3

4

5

6

7

1000 PCR produkt

100

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.



Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován ++ detekován PCR produkt o silné intenzitě +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro druh Lactobacillus acidophilus byly detekovány po amplifikaci DNA všech vzorků.

- 56 -

Třetí šarže Obr.28:


acidophilus. DNA izolovaná z potravinového doplňku Pangamin Bifi plus třetí šarže o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro druh Lactobacillus acidophilus. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

bp

1

2

3

4

5

6

7

1000 PCR produkt

100

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.



Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro druh Lactobacillus acidophilus byly detekovány po amplifikaci DNA všech vzorků.

6.6.2

DNA z potravinového doplňku Biopron v druhově specifické PCR Lactobacillus acidophilus DNA izolovaná pomocí magnetických nosičů ze 4 hrubých lyzátů potravinového doplňku Biopron byla amplifikována za použití druhově specifických primerů Aci16SI a Aci16SII

- 57 -

podle programu LBCRHAM (viz 5.1.9.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 800 bp (obr. 29). Obr.29:


acidophilus. DNA izolovaná z potravinového doplňku Biopron o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro druh Lactobacillus acidophilus. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

bp

1

2

3

4

5

6

7

1000 PCR produkt

100

Běh č.

Množství DNA / směs DNA Biopron (c = ng/ µl) PCR (ng) DNA standard (3 µl) 1. PK 20 2. 10 20 3. 10 20 4. 10 20 5. 10 20 6. NK 7. Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě


PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro druh Lactobacillus acidophilus byly detekovány po amplifikaci DNA všech vzorků. DNA z potravinového doplňku Linex Forte v druhově specifické PCR Lactobacillus acidophilus DNA izolovaná pomocí magnetických nosičů ze 4 hrubých lyzátů potravinového doplňku Linex Forte byla amplifikována za použití druhově specifických primerů Aci16SI a 6.6.3

- 58 -

Aci16SII podle programu LBCRHAM (viz 5.1.9.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 800 bp (obr. 30). Obr.30:


acidophilus. DNA izolovaná z potravinového doplňku Linex Forte o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro druh Lactobacillus acidophilus. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

bp

1

2

3

4

5

6

7

1000 PCR produkt

100 Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

DNA Linex Forte Množství DNA / směs (c = ng/ µl) PCR (ng) DNA standard (3 µl) PK 20 10 20 10 20 10 20 10 20 NK


Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. acidophilus (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro druh Lactobacillus acidophilus byly detekovány po amplifikaci DNA všech vzorků. 6.6.4

DNA z potravinového doplňku MultiLac v druhově specifické PCR Lactobacillus acidophilus

- 59 -

DNA izolovaná pomocí magnetických nosičů ze 4 hrubých lyzátů potravinového doplňku MultiLac byla amplifikována za použití druhově specifických primerů Aci16SI a Aci16SII podle programu LBCRHAM (viz 5.1.9.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 800 bp (obr. 31). Obr.31:


acidophilus. DNA izolovaná z potravinového doplňku MultiLac o koncentraci 10 ng/µl byla amplifikována pomocí primerů specifických pro druh Lactobacillus acidophilus. Na gel bylo nanášeno 25 µl PCR produktů.

bp

1

2

3

4

5

6

7

1000 PCR produkt

100

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

DNA MultiLac Množství DNA / směs (c = ng/ µl) PCR (ng) DNA standard (3 µl) PK 20 10 20 10 20 10 20 10 20 NK


Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován ++ detekován PCR produkt o silné intenzitě +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. acidophilus(c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro druh Lactobacillus acidophilus byly detekovány po amplifikaci DNA všech vzorků.

- 60 -

6.7

Shrnutí analýzy přítomnosti probiotických bakterií mléčného kvašení v potravinových doplňcích

Byly analyzovány různé potravinové doplňky (Pangamin Bifi Plus, Linex Forte, Biopron a MultiLac) na přítomnost probiotických bakterií mléčného kvašení v souladu s deklarovaným složením uváděným výrobcem na obale produktu.

6.8

Srovnání deklarované a detekované přítomnosti probiotických bakterií mléčného kvašení

Ve všech šaržích obou výrobků byly deklarované rody i druhy potvrzeny. Přítomnost deklarovaných probiotických bakterií mléčného kvašení rodu Lactobacillus byla prokázána u všech potravinových doplňků. Jejich množství se liší ve výrobcích, kde byla spektrofotometricky změřena odlišná koncentrace DNA a v rodově a druhově specifických PCR amplifikována a detekována různá množství DNA, což je patrné z intenzity jednotlivých bendů. Detekce rodově i druhově specifických PCR produktů Lactobacillus je uvedeno v tab.18 Výrobky Pangamin Bifi plus Linex Forte Biopron MultiLac

rod Lactobacillus + + + +

druh Lactobacillus acidophilus + + + +

+ deklarovaná a prokázaná přítomnost bakterií V souladu s deklarovaným složením byly analyzovány výrobky Pangamin Bifi plus, Linex Forte, Biopron a MultiLac, kde u všech výrobků byl potvrzen deklarovaný rod i druh.

6.9

Příprava vzorků pro imunomagnetickou izolaci buněk

Byly připraveny roztoky tobolek výrobků Biopron a Linex Forte. Roztoky byly vysety na MRS médium a narostlé kolonie byly identifikovány pomocí specifických PCR. 6.9.1 Stanovení počtu bakterií v tobolce Z tobolek výrobku Biopron a Linex Forte rozpuštěných v PBS pufru byly připraveny ředění 10-4, 10-5 a 10-6. Z ředění bylo odebráno 10 µl, které byly vysety na MRS médium a byly kultivovány aerobně i anaerobně. Narostlé kolonie byly spočítány a dále bylo vypočítáno množství mikroorganismů v jedné tobolce. Bylo stanoveno, že ve výrobku Biopron je 1,73 108 mikroorganismů a ve výrobku Linex forte je 2,67 108 mikroorganismů. Ředění a počet narostlých bakteriálních kolonií ve výrobku Biopron a Linex Forte je uvedeno v tab. 19. Kolonie bakterií narostlé z jednotlivých výrobků jsou uvedeny v tab. 20.

- 61 -

Tab. 19 Počty kolonií odpovídající ředění ve vzorku Biopron po aerobní a anaerobní kultivaci Výrobek

Biopron

Linex Biopron Linex Forte Forte Aerobní Anaerobní Počet narostlých kolonií

Biopron

64 3 2

Počet buněk na ml (cfu/ml) 1,15 108 1,78 108 Počet buněk v tobolce 1,73 108 2,67 108

Kultivace Ředění 10-4 10-5 10-6

18 0 0

51 15 5

160 29 8

Linex Forte

Tab. 20 Bakteriální kolonie narostlé z výrobků Kultivace Aerobní Anaerobní

Biopron Velké bílé kolonie, Malé bílé kolonie Velké bíle kolonie

Linex Forte Malé šedé kolonie Velké bílé kolonie

Jak po aerobní tak po anaerobní kultivaci narostly kolonie různé morfologie 6.9.2 Identifikace buněk pomocí PCR z bakteriálních kolonií Z každé kultivace byly odebrány zástupci jednoho druhu kolonií a byly připraveny na identifikaci pomocí PCR. Nejprve byla provedena PCR specifická pro doménu Bacteria a poté PCR specifická pro rod Lactobacillus. 6.9.2.1 Ověření amplifikovatelnosti DNA izolované z jednotlivých typů kolonií Ověření amplifikovatelnosti DNA z jednotlivých kolonií v PCR pro doménu Bacteria byla provedena pomocí primerů F_eub a R_eub podle postupu uvedeného v kapitole 5. Metody. Do PCR bylo použito množství DNA (2 µl ) z hrubého lyzátu buněk v koloniích potravinového doplňku Biopron a Linex Forte. Srovnáním polohy amplikonů s fragmenty dané velikosti ve standardu byla stanovena velikost PCR produktu. Kolonie z aerobní kultivace – výrobek Biopron a Linex Forte Výsledky aerobní kultivace pomocí agarózové gelové elektroforézy jsou uvedeny na obr. 32. a obr.33.

- 62 -

Obr.32:


bp

1

2

3

4

5

6

7

1000

PCR produkt

100

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

DNA Biopron (c = ng/ µl) DNA standard (3 µl) Velké bílé kolonie Malé bílé kolonie Malé bílé kolonie Malé bílé kolonie PK NK


Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován ++ detekován PCR produkt o silné intenzitě +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro doménu Bacteria byly detekovány po amplifikaci DNA z velké bílé a malých bílých kolonií.

- 63 -

Obr.33:


bp

1

2

3

4

5

6

1000

PCR produkt

100

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6.

DNA Linex Forte (c = ng/ µl) DNA standard (3 µl) Malé šedé kolonie Malé šedé kolonie Malé šedé kolonie PK NK

Detekce produktu PCR 100 bp žebříček ++ ++ ++ +++ -

Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován ++ detekován PCR produkt o silné intenzitě +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro doménu Bacteria byly detekovány po amplifikaci DNA z malých šedých kolonií Kolonie z anaerobní kultivace – výrobek Biopron a Linex Forte Výsledky anaerobní kultivace pomocí agarózové gelové elektroforézy jsou uvedeny na obr. 34 a obr.35.

- 64 -

Obr.34:

Agarózova gelová elektroforéza specifických produktů PCR (466 bp) pro doménu Bacteria.

bp

1

2

3

4

5

6

1000

PCR produkt

100 Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6.

DNA Biopron (c = ng/ µl) DNA standard (3 µl) Velké bílé kolonie Velké bílé kolonie Velké bílé kolonie PK NK


Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován ++ detekován PCR produkt o silné intenzitě +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro doménu Bacteria byly detekovány po amplifikaci DNA z velkých bílých kolonií

- 65 -

Obr.35:

Agarózova gelová elektroforéza specifických produktů PCR (466 bp) pro doménu Bacteria.

1

bp

2

3

4

5

6

1000

PCR produkt

100

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6.



Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován ++ detekován PCR produkt o silné intenzitě +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro doménu Bacteria byly detekovány po amplifikaci DNA z malých šedých kolonií 6.9.2.2 PCR specifická pro rod Lactobacillus s bakteriální DNA Specifická PCR pro detekci bakterií rodu Lactobacillus byla provedena pomocí primerů LbLMA1 a R16 – 1 dle postupu uvedeného v kapitole 5. Metody. Do PCR bylo použito množství DNA (2 µl ) z potravinových doplňků (Biopron a Linex Forte). Srovnáním polohy amplikonů s fragmenty dané velikosti ve standardu byla stanovena velikost PCR produktu. Kolonie z aerobní kultivace – výrobek Biopron a Linex Forte

- 66 -

Výsledky aerobní kultivace pomocí agarózové gelové elektroforézy jsou uvedeny na obr. 36 a obr.37. Obr.36:

Agarózova gelová elektroforéza specifických produktů PCR (250 bp) pro rod Lactobacillus.

bp

1

2

3

4

5

6

7

1000

PCR produkty

100 Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

DNA Biopron (c = ng/ µl) DNA standard (3 µl) Velké bílé kolonie Malé bílé kolonie Malé bílé kolonie Malé bílé kolonie PK NK

Detekce produktu PCR 100 bp žebříček +++ +++ ++ ++ +++ -

Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován ++ detekován PCR produkt o silné intenzitě +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro rod Lactobacillus byly detekovány po amplifikaci DNA z velké bílé a malých bílých kolonií.

- 67 -

Obr.37:


bp

1

2

3

4

5

6

7

1000

PCR produkt

100

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6.


Detekce produktu PCR 100 bp žebříček +++ ++ +++ +++ -

Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován ++ detekován PCR produkt o silné intenzitě +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro rod Lactobacillus byly detekovány po amplifikaci DNA z malých šedých kolonií. Kolonie z anaerobní kultivace – výrobky Biopron a Linex Forte Výsledky anaerobní kultivace pomocí agarózové gelové elektroforézy jsou uvedeny na obr. 38 a obr.39.

- 68 -

Obr.38:


bp

1

2

3

4

5

6

7

1000

PCR produkt

100 Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6.

DNA Biopron (c = ng/ µl) DNA standard (3 µl) Velké bílé kolonie Velké bílé kolonie Velké bílé kolonie PK NK


Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován ++ detekován PCR produkt o silné intenzitě +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro rod Lactobacillus byly detekovány po amplifikaci DNA z velkých bílých kolonií.

- 69 -

Obr.39:


bp

1

2

3

4

5

6

7

1000

PCR produkt 100

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5. 6.

DNA Linex Forte (c = ng/ µl) DNA standard (3 µl) Velké bílé kolonie Velké bílé kolonie Velké bílé kolonie PK NK

Detekce produktu PCR 100 bp žebříček +++ +++ +++ +++ -

Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován ++ detekován PCR produkt o silné intenzitě +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro rod Lactobacillus byly detekovány po amplifikaci DNA z velkých bílých kolonií.

6.10 Imunomagnetická separace buněk Ze dvou potravinových doplňků (Biopron a Linex Forte) byly vyizolovány buňky podle postupu (5.1.3) pomocí imunomagnetického nosiče „magnetická perlová celulóza“.

- 70 -

6.10.1 Identifikace buněk separovaných imunomagnetickými nosiči kultivační metodou (IMS - KM) Buňky se separovaly z výrobků pomocí imunomagnetické separace. Ty se vysely na misku, kde narostly kolonie. Kultivace probíhala aerobně v termostatu při 37°C po dobu 48 hodin. Z narostlých kolonií byl odebrán jeden druh a byl připraven na identifikaci pomocí PCR. Nejprve byla provedena PCR specifická pro doménu Bacteria a poté PCR specifická pro rod Lactobacillus. 6.10.1.1 PCR pro doménu Bacteria Buňky izolované pomocí imunomagnetického nosiče z potravinových doplňků byly amplifikovány za použití specifických primerů F_eub a R_eub podle programu DOMBAC (viz 5.1.7.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 466 bp (obr.40). Obr.40:


bp

1

2

3

4

5

1000

PCR produkt

100

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5.

Buňky DNA standard (3 µl) Velká bílá kolonie (Linex Forte) Velká bílá kolonie (Biopron) PK NK

Detekce produktu PCR 100 bp žebříček +++ +++ +++ -

Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl)

- 71 -

NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro doménu Bacteria byly detekovány po amplifikaci DNA z velkých bílých kolonií. 6.10.1.2 Rodově specifická PCR pro Lactobacillus Buňky izolované pomocí magnetického nosiče z potravinových doplňků byly amplifikovány za použití rodově specifických primerů LblMA-1 a R16-1 podle programu LBCROD (viz 5.1.8.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 250 bp (obr.41). Obr.41:


bp

1

2

3

4

5

500 PCR produkt 100

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5.


Detekce produktu PCR 100 bp žebříček +++ +++ +++ -

Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro rod Lactobacillus byly detekovány po amplifikaci DNA z velkých bílých kolonií.

- 72 -

6.10.2 Identifikace buněk separovaných imunomagnetickými nosiči pomocí PCR (IMS - PCR) Buňky se separovaly z výrobků pomocí imunomagnetické separace, ale bez kultivace. Buňky společně s magnetickým nosičem byly připraveny na identifikaci pomocí PCR. Nejprve byla provedena PCR specifická pro doménu Bacteria a poté PCR specifická pro rod Lactobacillus. 6.10.2.1 PCR pro doménu Bacteria Buňky izolované pomocí imunomagnetického nosiče z potravinových doplňků byly amplifikovány za použití specifických primerů F_eub a R_eub podle programu DOMBAC (viz 5.1.7.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 466 bp (obr.42). Obr.42:


bp

1

2

3

4

5

1000

PCR produkt

100

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5.


Detekce produktu PCR 100 bp žebříček ++ ++ +++ -

Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě

- 73 -

PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro doménu Bacteria byly detekovány po amplifikaci DNA z velkých bílých kolonií. 6.10.2.2 Rodově specifická PCR pro Lactobacillus Buňky izolované pomocí magnetického nosiče z potravinových doplňků byly amplifikovány za použití rodově specifických primerů LblMA-1 a R16-1 podle programu LBCROD (viz 5.1.8.2). Amplifikoval se produkt PCR o velikosti 250 bp (obr.43). Obr.43:

Agarózová gelová elektroforéza specifických produktů PCR (250bp) pro rod Lactobacillus

bp

1

2

3

4

5

1000

PCR produkt 100

Běh č. 1. 2. 3. 4. 5.


Detekce produktu PCR 100 bp žebříček ++ ++ +++ -

Detekce PCR produktu: - PCR produkt nebyl detekován +++ detekován PCR produkt o silné intenzitě ++ detekován PCR produkt o střední intenzitě

- 74 -

PK – pozitivní kontrola s DNA Lbc. casei (c = 10 ng/ µl) NK – negativní kontrola, DNA nepřítomná PCR produkty specifické pro doménu Bacteria byly detekovány po amplifikaci DNA z velkých bílých kolonií.

6.11 Shrnutí výsledků IMS - kultivace a IMS - PCR Detekce rodově specifických PCR produktů Lactobacillus (tab. 21) Tab. 21 Shrnutí detekce PCR produktů při rodově specifické PCR pro Lactobacillus

rod Lactobacillus

Linex Forte +

Biopron +

+ deklarovaná a prokázaná přítomnost bakterií V souladu s deklarovaným složením byly analyzovány výrobky Linex Forte a Biopron, kde u obou výrobků byl potvrzen deklarovaný rod.

- 75 -

7

DISKUZE

Molekulárně diagnostické postupy, které jsou založeny na amplifikaci DNA in vitro, jako je polymerázová řetězová reakce, jsou v poslední době velice využívané metody pro identifikaci mikroorganismů v potravinách a jiných komplexních vzorcích. PCR se využívá k identifikaci jak prospěšných bakterií (bakterií mléčného kvašení) tak i k identifikaci patogenních mikroorganismů [39]. Tradiční diagnostické mikrobiologické testy jsou testy mikroskopické, kultivační či imunologické. Role tradičních testů je stále důležitá. Navíc PCR má některá omezení. Vyžaduje aspoň částečnou znalost sekvence DNA, kterou chceme amplifikovat. Tyto sekvence jsou dnes veřejně přístupné v databázích, ale nejsou k dispozici pro všechny druhy mikroorganismů. Neočekávané mutace v sekvencích DNA mohou negativně ovlivňovat PCR. Rovněž falešně pozitivní PCR reakce, které vznikají v důsledku kontaminace mohou působit problémy v diagnostické laboratoři využívající PCR. Proto je třeba dodržovat přísná pravidla pro práci s DNA v laboratořích určených pro provádění PCR. Pečlivost je nezbytná nejen při provádění PCR zkoušky, ale i při interpretaci jejich výsledků [28]. V experimentální části diplomové práce byla z hrubých lyzátů buněk potravinových výrobků (Pangamin Bifi plus, Linex forte, Biopron a MultiLac) izolována DNA pomocí magnetických částic P(HEMA-co-GMA). V další části práce byly testovány magnetické nosiče s imobilizovanou protilátkou proti bakteriím rodu Lactobacillus. K identifikaci DNA z tablet byly použité primery pro specifickou DNA domény, rodu a druhu. Specificita amplikonu byla ověřena pomocí agarozové gelové elektroforézy (produkt PCR 250 bp pro rod Lactobacillus a produkt PCR 800 bp pro druh Lactobacillus acidophilus). Ve všech potravinových doplňcích stravy byla prokázána přítomnost bakterií rodu Lactobacillus.

7.1

Izolace celkové DNA a spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty DNA

DNA byla izolována z hrubých lyzátů buněk 4 synbiotických doplňků stravy (Pangamin Bifi plus, Linex Forte, Biopron, MultiLac) pomocí magnetických částic P(HEMA-co-GMA). Koncentrace a čistota izolované DNA byla stanovena pomocí UV spektrofotometrie. Byla měřena absorbance DNA při vlnových délkách 230 – 320 nm. Zkoumané vzorky DNA byly proměřeny na přístroji NanoPhotometerTM Implen, který umožňuje stanovit koncentraci v ng/µl. Z poměru hodnot A260nm/A280nm byla stanovena čistota DNA. Poměr absorbancí čisté DNA se pohybuje v rozmezí 1,8 – 2,0. Obsahuje-li vzorek proteiny je A260nm < 1,8, v případě obsahu RNA je poměr A260nm /A280nm ≥ 2,0 [43]. Z výsledků měření DNA izolované z potravinového dopňku Pangamin Bifi plus (první a druhé šarže) vyplývá, že vzorky obsahovaly určité množství proteinů. Tyto proteiny by mohly interferovat v PCR. Do PCR se DNA obvykle ředí a tím se ředí i inhibitory PCR [20]. V práci byla DNA zředěna na 10 ng/ µl.

- 76 -

7.2

PCR pro doménu Bacteria

Izolovaná DNA ze všech tablet je amplifikovatelná. Po amplifikaci DNA byly detekované produkty PCR (466 bp), které jsou specifické pro doménu Bacteria. DNA byla izolována pomocí magnetických částic P(HEMA-co-GMA) z hrubých lyzátů buněk, což potvrdilo jejich zařadění do domény Bacteria. Izolace DNA v kvalitě vhodné pro PCR s využitím magnetického nosiče je známa z literatury [37, 38] .

7.3

Rodově specifická PCR pro Lactobacillus

Byla potvrzena přítomnost bakterií rodu Lactobacillus ve všech testovaných preparátech, což souhlasí s údaji deklarovanými na obalu. Dle autorů [20] se v PCR amplifikuje PCR produkt délky asi 250 bp. Ve výrobcích byly po amplifikaci DNA detekovány produkty PCR, které se svou velikostí částečně lišily, a proto lze předpokládat, že výrobky obsahovaly různé druhy laktobacilů.

7.4

Druhově specifická PCR pro Lactobacillus acidophilus

Byla potvrzena přítomnost bakterií druhu Lactobacillus acidophilus ve všech testovaných preparátech, což souhlasí s údaji deklarovanými na obalu. Pangamin Bifi Plus má deklarované jen laktobacily a bifidobakterie. Přítomnost bakterií druhu Lactobacillus acidophilus byla v této tabletě prokázána.

7.5

Selektivní izolace buněk laktobacilů pomocí magnetického nosiče s imobilizovanou protilátkou

V další části byla testována izolace DNA ze 2 synbiotických doplňků stravy (Biopron a Linex Forte) pomocí magnetických nosičů s imobilizovanou protilátkou proti bakteriím rodu Lactobacillus. Takto selektivně izolované buňky lze použít na jejich testování př. v klasických kultivačních metodách nebo v PCR, včetně kvantitativní PCR. Ověření selektivní izolace DNA Lactobacillus v eluátech bylo provedeno pomocí PCR s rodově specifickými primery (LbLMA 1 – rev a R 16 – 1) [20]. Na gelu byly detegovány specifické produkty PCR (250 bp) různé intenzity u všech vzorků, čímž byla potvrzena přítomnost této DNA ve všech izolátech.

7.6

Srovnání přítomnosti bakterií rodu Lactobacillus s údaji na štítku deklarovanými výrobcem

Srovnání identifikace bakterií rodu Lactobacillus pomocí PCR s údaji deklarovanými na výrobcích se shodují. Bylo prokázáno, že výrobek Pangamin Bifi plus obsahuje druh Lactobacillus acidophilus, kterou měl uvedenou jako probiotickou kulturu.bez druhové identifikace.Množství DNA odpovídá řádově 109 buněk/ 0,5 g výrobu.

- 77 -

8

ZÁVĚR

Teoretická část diplomové práce pojednává o probiotických bakteriích v potravinových doplňcích stravy, bakteriích rodu Lactobacillus v probiotických výrobcích a o jejich identifikaci pomocí PCR. Ze čtyř vzorků potravinového doplňku Pangamin Bifi Plus (šarže 1) byla izolována DNA v množství 4,8 - 7,15 µg. Ze šarže 2 byla izolována DNA v množství 3,7 - 7,35 µg a ze šarže 3 byla izolována DNA v množství 2,45 – 3,05 µg. Ze čtyř vzorků potravinového doplňku Biopron byla izolována DNA v množství 1,3 – 3,15 µg; z doplňku Linex Forte v množství 1,0 – 1,55 µg a z doplňku MultiLac byla izolována DNA v množství 2,75 - 7,85 µg. V PCR pro rod Lactobacillus byl detegován specifický produkt PCR 250 bp u všech 4 testovaných potravinových doplňků stravy (Pangamin Bifi plus, Linex Forte, Biopron, MultiLac). V PCR pro druh Lactobacillus acidophilus byl detekován specifický produkt PCR 800 bp u všech 4 testovaných potravinových doplňků stravy.

- 78 -

9

SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ

[1]

TVRDÍKOVÁ, J. Izolace DNA z probiotických druhů bakterií mléčného kvašení v potravinových doplňcích. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2009.109 s. Vedoucí diplomové práce doc. RNDr. Alena Španová, CSc.

[2]

TUOHY, Kieran, et al. Using probiotics and prebiotics to improve gut health . Drug Discovery Today. 2003, 8, s. 692-700.

[3]

RUIZ-MOYANO S., MARTIN A., BENITO M. J., NEVADO F. P., DE GUIDA CÓRDOBA M.,Screening of lactic acid bacteria and bifidobacteria for potencial probiotic use in Iberian dry fermented sausages. Els. Ltd. 10. March 2008. stránky 715721.

[4]

FUJIMOTO, Junji, et al. Identification and quantification of Lactobacillus casei strain Shirota in human feces with strain-specific primers derived from randomly amplified polymorphic DNA . International Journal of Food Microbiology. 2008, 126, s. 210-215

[5]

GÖRNER, Fridrich, et al. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. Bratislava: Malé centrum, 2004. 1. vydání. 528 s. ISBN 80-967064-9-7.

[6]

TURKOVÁ, K. Využití metod amplifikace DNA při identifikaci baktérií rodu Lactobacillus. Brno, 2009. 106 s. Diplomová práce. Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta.

[7]

TUOHY, Kieran, et al. Using probiotics and prebiotics to improve gut health . Drug Discovery Today. 2003, 8, s. 692-700.

[8]

Department of Microbiology [online]. [cit. 2012-03-17]. MU Přírodovědecká fakulta. Dostupné z WWW: .

[9]

MATTILA-SANDHOLM, T., et al. Technological challenges for future probiotic foods. International Dairy Journal. 2002, 12, s. 173-182.

[10] OUWEHAND, A. C., SALMINEM, S., ISOLAURI, E. : Probiotics: an overview of beneficial effect. 2002. Antonie van Leewenhoek 82: 279 – 289. [11] LUKÁŠ, Karel, et al. Pharmanews [online]. 2006 [cit. 2012-03-11]. Probiotika. Dostupné z WWW: . [12] ŠMAHELOVÁ, H. Probiotika. Brno: Ústav preventivního lékařství LF Masarykovy univerzity, 2008. 82 s. Vedoucí bakalářské práce RNDr. Danuše Lefnerová, Ph.D.

- 79 -

[13] PETR, P., KÁLOVÁ, H. Nutraceutika : vybrané kapitoly z nutraceutické teorie a praxe. [s.l.] Vysoká škola evropských a regionálních studií, 2006. 47 s. ISBN 80-86708-17-9 [14] LEE, Yan-Kun; SALMINEM, Seppo. The coming of age of probiotics. Trends in Food and Technology. July 1995, 6, s. 241-245. [15] HOLZAPFEL, Wilhelm H., et al. Overview of gut flora and probiotics. International Journal of Food Microbiology. 1998, 41, s. 85-101. [16] HOLZAPFEL, Wilhelm, et al. Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food nutrition. American Society for Clinical Nutrition. 2001, 73, s. 365-73. [17] RADA, V. Využití probiotik, prebiotik a synbiotik. Interní Med., 2010, roč. 12, č. 2, s. 92–97. [18] Biology – www.biology.usu.edu [online]. 2010 [cit. 2012-04-29]. The microscopy facility. Dostupné z WWW: . [19] JUREČKOVÁ, N. Identifikace bakterií mléčného kvašení v kysaných mléčných výrobcích s využitím amplifikačních metod. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2008. 39 s. Vedoucí bakalářské práce doc. RNDr. Alena Španová, CSc. [20] DUBERNET, S., DESMASURES, N., GUÉGUEN, M. A PCR-based method for identification of lactobacilli at the genus level . FEMS Microbiology Letters. 2002, 214, s. 271-275. ISSN 0378-1097 [21] Pangamin Bifi plus – [online]. [cit. 2012-04-25]. Dostupné z WWW: < http://www.prozdravi.cz/> [22] Linex Forte – [online]. [cit. 2012-04-25]. Dostupné z WWW: < http://www.mojelekarna.cz/> [23] Biopron – [online]. [cit. 2012-04-25]. Dostupné z WWW: [24] MultiLac – [online]. [cit. 2012-04-25]. Dostupné z WWW: < http://health-products-market.com/> [25] HAARMAN M., KNOL, J. Quantitative real-time PCR analysis of fecal Lactobacillus species in infants receiving a prebioic infant formula. App. Environ. Microbio. 16January. 2006. stránky 2359-2365. [26] RUML, T. Genové inženýrství. Praha: VŠCHT, 2002. 1. vydání. 270 s. ISBN 80-7080499-8.

- 80 -

[27] JUREČKOVÁ, N. Identifikace bakterií mléčného kvašení v kysaných mléčných výrobcích s využitím amplifikačních metod. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2008. 39 s. Vedoucí bakalářské práce doc. RNDr. Alena Španová, CSc. [28] MACKAY, M., et al. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin Microbiol Infect. 2004, 10, s. 190-212 [29] RIEGELOVÁ, K. Molekulární identifikace vybraných druhů bakterií mléčného kvašení a bifidobakterií v doplňcích stravy. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2011. 73 s. Vedoucí diplomové práce doc. RNDr. Alena Španová, CSc.. [30] ŠPANOVÁ, A.; RITTICH, B. Analýza vybraných druhů bakterií mléčného kvašení pomocí metod molekulární biologie. Brno : Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická. 2010. 86 s. ISBN 978-80-214-4004-3. [31] KRÁLOVÁ, B.; FUKAL, L.; RAUCH, P.; RUML, T. Bioanalytické metody, 3. vyd. Praha: VŠCHT, 2007, 254 s. ISBN 978-807080-449-3. [32] BALOGOVÁ, P. Identifikace baktérií mléčného kvašení v probiotických preparátech (tabletách) s využitím amplifikačních metod. Brno, 2007. 35 s. Bakalářská práce. Vysoké učení technické v Brně, Chemická fakulta. [33] PCR Polymerase Chain Reaction [online]. [cit. 2012-04-27]. PCR Station. Dostupné z WWW: . [34] Učebnice biochemie [online]. [cit. 2012-04-27]. Amplifikační metody. Dostupné z WWW: . [35] Termocykler [online]. [cit. 2012-04-27]. Dostupné z WWW: . [36] TRACHTOVÁ, Š.: Studium reversibilní adsorpce nukleových kyselin na pevných nosičích. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2011. 138 s. Vedoucí dizertacní práce: Doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc [37] RITTICH, B.; ŠPANOVÁ, A.; HORÁK, D. Carboxyl–functionalized magnetic carrier for isolation and identification of DNA in dairy products. Journal of Magnetism and Magnentic Materials. 2007, 311, s. 247-254. [38] RITTICH, B.; ŠPANOVÁ, A.; HORÁK, D.;BENEŠ, M.J.; KLESNILOVÁ, M.; PETROVÁ, K.; RYBNÍKÁŘ, A. Isolation of microbial DNA by newly designed magnetic particles. Colloids and Surfaces. B: Interfaces. 2006, 52, s.143-148. [39] ŠAFAŘÍK, I., ŠAFAŘÍKOVÁ, M. Magnetic nano- and biotechnology. Chem papers 2009; 63:497-505

microparticles

in

- 81 -

[40] ŠAFAŘÍK, I., ŠAFAŘÍKOVÁ, M. Magnetic nanoparticles and biosciences. Mon Chem 2002; 133: 737-759 [41] ŠAFAŘÍK, I., ŠAFAŘÍKOVÁ, M. Immunomagnetic techniques for detection of microorganisms in poultry products. Veterinářství 2011; 61: 199-202 [42] ŠAFAŘÍK, I., ŠAFAŘÍKOVÁ, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J Chromatogr B 1999; 722: 33-53 [43] SAMBROOK, J., RUSSEL, D.W. Molecular cloning: A laboratory manual (II). 3. vydání. New York : Cold Spring Labor. Harb. Press. 2001.

- 82 -

10 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK BMK bp KTJ CIZ dATP dCTP dGTP DNA dNTP dTTP EDTA FOS PCR SDS TBE TE UV CCM Lb. FCH

bakterie mléčného kvašení pár bází (base pair) kolonie tvořící jednotka chloroform-izoamylalkohol 2’-deoxyadenosin 5’-trifosfát 2’-deoxycytidin 5’-trifosfát 2’-deoxyguanosin 5’-trifosfát deoxyribonukleová kyselina deoxyribonukleosidtrifosfát 2’-deoxythymidin 5’-trifosfát kyselina ethylendiamintetraoctová fruktooligosacharidy polymerázová řetězová reakce dodecylsulfát sodný Tris-borát-EDTA Tris-EDTA ultrafialové světlo Česká sbírka mikroorganismů (Czech Collection Microorganismes) Lactobacillus fakulta chemická

- 83 -

KEYWORDS Food supplements, Lacobacillus, DNA isolation, magnetic microspheres, immunomagnetic separation, polymerase chain reaction

Recommend Documents