" K e t a h u i l a h bahwa s y u r g a i t u a d a l a h m e l a l u i Besedihan yang p a n j a n g dan sesungguhnya neralra i t u r n e l a l u i lremudahan-kemudahan dengan rnengikuti n a f s u " (Iladi t s )
-
"Sesungguhnya s e s u d a h k e s u l i t a n it.u a d a lremudahan,
Maka apa-
b i l a kamu s e l e s a i d a r i s a t u u r u s a n , k e r j a k a n l a h dengan sungguh-sungguh u r u s a n yang l a i n , dan hanya kepada Tuhanm~iLtih hendalrnya kamu b e r h a r a p " (Q.S.
Alara flasyrah: 6
-
8).
Kupersembakkan llntuli i b u , bapak, Indnh, T r i dan Ucilr. * e r c j ? l t a .
f --
-4 $ -
F(TW/~7Q9
cy*;?
n
" '
QQ
#
k.$$%? I:
+,
PENGARUN GAWAM PADA STABllbTAS ENZIM AWlllOGLUKOSlDASE DARl Aspergillus niger L 51/NRRL A-11,2
Oleh AGUS HERU PRATOMO
F 20.0617
1 9 8 8
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN ICISTITUT PERTANIAN BOQOD B O G O R
hui
Agus IIeru Pratomo.
F20 .O617.
17engarul1 Garam Pada S t a b i l i t a s
Enzirn Amiloglukosidase D a r i A:
A-lit
Dibaviah bimbingan M e Aman ;li.ralrartalrusurtiah, A n s c r i Rah-
man clan Budi bbrt,ama.
RINGKASAN
P e n e l i t i a n i n i b e r t u j u a n u n t u k rnempela j a r i pengaruh j en i s dan k o n s e n t r a s i b e r b a g a i macam garam, pH dan suhu t e r h a dap s t a b i l i t a s enzim a m i l o g l u l r o s i d a s e d a r i lrapang & n ~ ~ g i l I u s L?l/NRRL
A-11,264.
P e r l a k u a n yang d i t e r a p k a n dalam p e n e l i t i a n i n i a d a l a h penarnbahan CaC12 0 g / l ,
0.5 g / l ,
"10 g / l dan
1.5 g / l ; penam-
b a h a i ~K2S04 0 11, 0.2 M, O.l+ Pf, 0 . 6 M; penambahan K C 1 0 M, 0.2 M, 0.4 M dan 0,6 M.
P e r l a k u a n pengaruh pH t e r h a d a p s t a -
b i l i t a s l i ~ e l i p u t ipH 3,0,
!t,O,
ii ,5, 5,0,
6,O dan 7.0,
sedang-
kan p e r l a k u a n pengaruh suhu terliadap s t a b i l i t a s m e l i p u t i suhu 60, 6 5 , 70,dan 75'~.
Pengamatan d i l a k u k a n t e r h a d a p a k t i f i t a s
r e s i du, a ! r t i f i t z s awal dan khndungan p r o t e i n enzim, Penambahan C a r l 2 menlberilran d < t i f i t a s r e s i d ~( s t a b i l i t a s ) t e r t j n g ~ i ,d i i k u t i IC SO dan Kt71 dzn h a s i l t e r t i n g g i d i p e r o 2 it . l e h pads penambahan CaC12 dengan l r o ~ l s e n t ~ a 1s ,i 0 g / l . S t a b i l i t a s t e r t i n g g i , enzim amilogluicosidase d i h a s i l l c a n padn pH 1t.5, !aenurun!:an
pH yang l e b i h r e n d a h a t a u l e b i h t i n g g i d a r i
s t a b i l i t a s enzim.
4.5
,edan,~iran pada perlalruan suhu ' 7
e n z i : ' ~~ a ; i l o g l ~ ! l i~doa s e r e 1 a t i f innsih s t
ampai suhu 6
'Panpa penamhhan s t a b i l i s e r CaCl g l u l ~ o s i d a s es e b e s a r 0.6958
persen.
2 n i l a i ICm enzirn amiloIJenambahan s t a b i l i s e r
-
CaCI, 1.0 g / l meningkatl~ann i l a i Iim rnenjadi 0,8331 p e r s e n a t a u denzan p e r s e n t a s e peningiratan s e b e s a r 15.47 p e r s e n " N i l a i IConstanta U e a k t i f a s i (k) i:icninglrat dengan n a i k n y a suhu. S e d a n ~ l r a ne n e r g i I l e a k t i f a s i ( E d ) enzim a m i l o g l u l r o s i d a s e sebesar
35 522 k a l o r i / m o l .
PENGARUH GARAN PADA S T A B L L I T A S
ENZIM AMLLOGLUKOSIDASE D b R I
L .51/I?RRL
A-11,264
Oleh AGUS HERET PRATOMO
INSTITUT PRRTANIAN BOGCR FAICULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN PZNGARUH GARAM PADA STABILITAS EMZIM AMILOGLUKOSIDASE D A R I m r g i l l u s
SKRIPSI S e b a g a i s a l a h s a t u s y a r a t u n t u k memperoleh g e l a r SARJANA TESCNOLOGI PERTANIAlJ pada J u r u s a n TEKNOLOGI PANGAN DAN G I Z I Fakul t a s Telrnologi P e r t a n ' I n s t i t u t P e r t a n i a n Bog Oleh AGUS HERU PRATOMO F20.0617 D i l a h i r k a n pada t a n g g a l 20 Aguskuc d i Semarang Tanggal l u l u s : 18 Maret 1988 D i ~ teu j u i , Bogor, 9 A p r i l
1961;
KATA PENGANTAR
P u j i s y u k u r k e h a d l i r a t N l a h SWT, a t a s b e r k a t r a h n a t dan bimbingannya s k r i p s i i n i d a p a t t e r s e l e s a i k a n . Pada kesempatan i n i p e n u l i s i n g i n mengucapkan t e r i m a k a s i h kepada :
1. Bapak Dr.1r.M.
Aman Wiralrartakusumah MSc, Bapak I r , Anajori
Rahman MS dan Bapak Ir. Budi Nurtama s e l a k u Dosen pembimb i n g yang t e l a h memberikan bimbingan, s a r a n dan dorongan m o r i l yang s a n g a t bermafaat.
2. I b u , bapak dan adik-adilc t e r c i n t a yang s e n a n t i a s a memberikan dorongan semangat, p e r h a t i a n dan doa.
3. Rekan I i e r r y dan Harry a t a s k e r j a saraa yang bailr s e l a m a penelitian
4. Teman-teman dan semua p i h a k yang t e l a h memberikan b a n t u a n hingga s k r i p s i i n i t e r s e l e s a i k a n . Akhirnya k r i t i k dan s a r a n s a n g a t p e n u l i s harapkan demi perbaikan t u l i s a n i n i .
Bogor, Maret 1 9 8 8
IV
.
Halaman
........................... ..............................
HASIL DAN PEMBAHASAN
43
A
43
. PRODUICSI ENZIM
.
..... .................... .........................
1 Pertumbuhan K u l t u r m e r ~ i l l u n~i a, e r
. 3. 2
B
A n a l i s a P r o t e i n Enzim
45
P u r i f i k a s i Enzim
Lt7
. STABILISASI ENZIM AMILOGLUI(OS1DASE ..........
. 2. 3. 4. 5.
.
49
...... Pengaruh pH .............................. Pengaruh Suhu ............................ Ke t e r g a n t u n g a n K o n s t a n t a D e ~ k t iaf s i Enzim Terhadap Suhu ............*...............
63
Penentuan N i l a i K o n s t a n t a M i c h a e l i s (IOn)
68
1 Pengaruh Garam Cam2. K2S04 dan K C1
V
43
..
........................... A . KESIMPULAN .................................. B . SARAN ....................................... DAFTAR PUSTAKA ................................. LAMPIRAN ....................................... IIliSIMPULAN DAN SARAN
49 56
60
72 72 73
74 79
Halaman 9
..................
Tabel
1.
Komposisi kimia m o l a s e s
Tabel
2.
Pengaruh s t a b i l i s e r t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim a a i l o g l u k o s i d a s e d a r i A s w e r ~ i l l u s n i s e r 1851/NRRL A-11,264
..................
53
DAFTAR GAMBAR
Gambar
1.
Gambar
2.
Pola. a l i r a n s u s p e n s i pada f e r m e n t o r "unbaf f l e d - t a n k " dan "baf f l e d - t a n k "
Gambar
3.
Pengaruh s u b s t r a t p a t i t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e d a r i C l o s t r i d i u m thermoh~drosulfuricum
Gambar
4,
Pengaruh .CaC12 t e r h a d a p s t a b i l i t a s d\-amilase dari Bacillus s u b t i l i s
Gambar
6.
Pengaruh pH t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim amilog l u k o s i d a s e d a r i A. n i c e r
Gambar
7.
Gambar
8.
............... Skema t a t a - l e t a k f e r m e n t o r dan p e r l e n g k a p a n p e n u n j a n g s e r t a k l e p p e n g a t u r ............
Gambar
9.
......
.....................
.................... .................
Pengaruh suhu t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim amil o g l u l ~ o s i d a s ed a r i A. n i g e r
SIcema p r o d u k s i s u s p e n s i k u l t u r A. L51/NRRL A-11, 264 pada mesin f ermentor model MSJ-U2-30L
......................... ................... ......................... ......................... A. ..................................
Gambar 10.
Pengaruh , s t a b i l i s e r . t e r h a d a p s t a b i l i t a i i enzim a ~ n i l o g l u k o s i d a s e
Gambar 11.
Pengaruh pH t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim amiloglukosidase
Gambar 1 2 ,
Pengaruh suhu t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim amiloglukosidase
Gambar
13.
Gambar 14. Gambm 1.5.
P r o s e d u r p e n g u j i a n a l r t i f i t a s aviaL enzim amiloglukos i d a s e d a r i n i fqer L ~ ~ / N R R L R-11,264
.......................... P r o s e d u r a n a l i s a p r o t e i n enzim dengan metode " l o v r y U ............................ P r o s e d u r a n a l i s a g u l a p e r e d u l r s i rnetode " s h a f f e r somogytl
Halaman Gambar 16.
Hubungan a n t a r a lradar p r o t e i n @g/rnl) dengan a b s o r b a n s i pada h = 500 nm
lt 6
Gambar 17.
Pengaruh CaCl t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d $ s e d a r i A. n i c e r L51/NRRL A-11,264
................................
50
Pengaruh I< SO dan K C 1 t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim a m i l 6 g l h k o s i d a s e d a r i A. niffer L51/NRRL A-11,264
51
Pengaruh p H t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e d a r i A. nirrer L5l/NRRL A-11,264 dengan adanya 1.0 g / l C a C 1 2
57
Pengaruh suhu t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e d a r i A, n i e r L51/NRRL A-11,264 dengan adanya 1.0 g 1 C a C 1 2
61
SIubungan a n t a r a l o g % a k t i f i t a s r e s i d u dengan waktu p r e i n k u b a s i d a r i enzim a ~ n i l o guko l s i d a s e L5l/NRRL A-11,264 dengan adanya s t a b i l i s e r C a C 1 2
64
Hubungan a n t a r a K o n s t a n t a D e a l c t i f a s i enzim a m i l o g l u k o s i d a s e dengan adanya;.sfabil i s e r CaC12 ( k ) dengan suhu p r e i n k u b a s i
65
Kurva hubungan a n t a r a l o g k dengan l / T d a r i enzim a m i l o g l u k o s i d a s e d a r i L51/NRRL A-11,264
66
Gambar 18.
Gambar 1 9 .
Gambar 20.
.......
.......................
....
-7-
Gambar 21.
......
..................
Gambar 22.
Gambar 23.
Gambar 24.
... A. ......................... A, ...........
Kurva Lineweaver dan B u r k untulr enzim amiloglulcosidase d a r i -ex L51/NRRJ2 A-11,264 dengan dan t a n p a CaC12
69
DAFTNi LAMPIRAN
Lmpiran
Lampiran
1.
2.
Prosedur produksi suspensi k u l t u r n i c e r L?l/NRRL A-11,264 pada mesin f e r m e n t o r model MSJ-U2-30L
.....
79
...........
80
A.
P r o s e d u r e k s t r a k s i enzim m i l o g l u k o s i d a s e dalam bentulc k e r i n g
........... ........ 4. ................................
Lampiran
3.
Produlcsi enzim a m i l o g l u k o s i d a s e d a r i A, n i c e r L31/NRRL A-11,264
Lampiran
4.
Pengaruh j e n i s d a n l c o n s e n t r a s i s t a b i l i s e r t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e d a r i 8. n i g e r L>l/Ni?RL A-11,264
83
Pencaruh pH t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim n i ~ e L51/NRRL r amiloglukosidase d a r i A-11,264
85
Pengaruh suhu t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e d a r i A, n i ~ e rL51/NRRL A-11,264
86
Lampiran
5.
................................
Lampiran
7.
Pengaruh k o n s e n t r a s i s u b s t r a t ( p a t i ) t e r h a d a p a k t i f i t a s avial enzim amilogluk o s i d a s e d a r i A, n i g e r L51/NRPJt . A-11,264
..*............................. 90
Lampiran
Lampiran
8.
9.
Lampiran 10.
Pengaruh suhu t e r h a d a p n i l a i K o n s t a n t a D e a k t i f a f i i enzim a m i l o g l u k o s i d a s e clGari -A. n i n e r L51/NiIRL A-11,264
.............. ....... ..........................
9
Pembuatan p e r e a k s i s h a f f e r solnogy P e r e a l r s i Loviry
9
I . PENDAHULUAN
D i dalam k u r u n waktu dua puluh tahunan s e j a l r t a h u n enan
puluhan penggunaan enzim s e c a r a k o m e r s i a l t e l a h maju p e s a t . Produlrsi b e r b a g a i senyawa b a r u s e p e r t i a n t i b i o t i k a , a s m asam o r g a n i k dan v i t a m i n b i a s a n y a d i l a k u k a n dengan c a r a f e r m e n t a s i yang pada h a k i k a t n y a memanfzatkan k e r j a s u a t u enzim, Penggunaan enzim t e l a h meluas bahlran sampai k e i n d u s t r i det e r g e n dimana enzim yang terkandung dalam d e t e r g e n d a p a t mel a r u t k a n p r o t e i n - p r o t e i n yang merupakan k o t o r a n pada b e r b a g a i benda.
S a l a h s a t u perkembangan penggunaan enzim yang cukup
n y a t a a d a l a h dalam i n d u s t r i pangan. i n d u s t r i pangan,
Pemanfaatan enzim dalam
t e r d a p a t m i s a l n y a pada p r o s e s pengempukan
daging, p r o d u k s i d e k s t r o s a a t a u g l u k o s a d a r i p a t i , p r o s e s p e n j e r n i h a n anggur a t a u brem dan juga p r o d u k s i s u s u dengan kadar l a k t o s a rendah b a g i p e n d e r i t a l o c t o s e i n t o l e r a n c e . P r o d u k s i enzim t e r u t a m a d a r i kapang dan b a k t s r i semakin berkembang k a r e n a rnurah dan p r o s e s pembuatannya c e p a t .
Bagi
n e g a r a k i t a t i d a k t e r t u t u p lremungkinan u n t u k mengembangkan erizim mengingat banyaknya sumber uaya raikroba s e p e r t i kapang yang d a p a t menghasilkan enzim pemecah p a t i . S a l a h s a t u enzim pemecah p a t i yang s e c a r a k o r c ~ s s i a lbanyak d i p r o d u k s i d a r i kapang a d a l a h enZiul a m i l o g l u k o s i d a s e . S e c a r a k o ~ n e r s i a lenzim i n i d a p a t d i p r o d u l r s i d a r k kapang A_soerg i l l u s niger.
Kegunaan enzlm a m i l o g l u k o s i d a s e b e s a r s e k a l i ,
terutama dalam i n d u s t r i pemidatan g u l a .
Kemudahan dalam.
p r o d u k s i n y a didukung o l e h t e r s e d i a n y a m o l a s e s dan l i m b a h l a i n n y a s e c a r a melimpah s e b a g a i media pcrtumbuhan mi!-roba, Usaha-usaha o p t i m i s a s i p r o s e s o p e r a s i dalam memproduksi en-
zim a m i l o g l u k o s i d a s e dan dalam mempertabaLLan a k t i f i t a s n y a sebelum s a a t penggunaan pada b e r b a g a i k o n d i s i p e r l u d i p a l a p jari dan dikembangkan. K e s t a b i l a n a k t i f i t a s enzim selama ponyimpanan dan p-3a b e r b a g a i k o n d i s i pengolahan merupakan s u a t u masalah yang penting.
Enzim d a p a t d i s t a b i l k a n dengan beberapo t e k n i k s e p e r t i
i m m o b i l i s a s i , penambahan a d i t i f , m o d i f i k a s i k i m i a dan l a i n sebagainya.
Dengan i m m o b i l i s a s i , ellzio t e t a p s t a b i l a k t i f i -
t a s n y a s e t e l a h digunakan b e r u l a n g k a l i ,
Agar e n z i ~ at e t a p s t a -
b i l selama penyimpanan maupun pada k.ondisi p e n g u j i a n , penambahan beberapa j e n i s a d i t i f ( s u k r o s a , g l i s e r o l , s o r b i t o l maupun garam) diharaplran d a p a t mempertahalzkan a k t i f i t a s n y a .
Pe-
n e l i t i a n i n i b e r t u j u a n u n t u k m e m p e l a j a r i pengaruh penggunaan CaC12 t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzi.m yang d i l a k u k a n pada b e r b a g a i
11, TIIfJJAUAI'i PUSTkKA
A, P R O D U K S I EWZIM DARI bUKEOBA
1, Enzim Mikroba Enzim a d a l a h p r o t e i n yang dJ.hasil.!rc.a ~3 e h s e l h i dup dan b e r f u n g s i s e b a g a i b i o k a t d i s kimi-a yang s p e s i s i f i k (Baing, 19821, dan enzim-enzim
Wikroba m e n s i n t e s a banyak enzim
t e r s e b u t b e r f u n g s i d a l a z pertumbuhan,
metabolisme dan a u t o l i s x (Aunstrup, 1 9 7 7 ) , Menurut T r i b e dan Gray (1977) t a r d a p a t dua golongan enzim mikroba b e r d a s a r k a n l o k a s i d j l a n mikroba dan kegunaannya, y a i t u golongan e k s t r a s e l u l e r dan i n traseluler.
&zim e k c t r a s e l u l e r a d a l a h enzim yang d i -
h a s i l k a n d i d a l t t l n s e l , t e t a p i d i k e l u a r k a n k e media f e r rnentasi untuls m e n g h i d r o l i s a dan mendegradasi senyavta komplelrs menjadi senyawa seddarhana yang nudah l a r u t dan d i s e r a p o l e h mikroba. kan d i d d z m s e l zim
i n i mel&u:,:an
Enzim i n t r a s e l u l e r d i h a s i l
y s i t u pada membran s i t a p l a s o l a .
En-
metabolisme d i d a l a sex.
I4enurut Gasida (196%) b e r d a s a r k a n p r o s e s pembeli Irannga, enzim d i b a g i dua, y a i t u enzim i n d u s i b e l , clan enzim k o n s t i t i l t i f .
Enzim i n d u s i b s l t e r b e n t u k s e b a g a i
r e s p o n t e r h a d a p senyawa t e r t e n t u dalam medium, s e a Iran enzirn l r o o s t i t u t i i d i p r o d u k s i miirroorganisne t a n d i p e n g a r u h i o l e h media,
A s ~ o r g i l l u s&= --
a d a l a h l ~ a p a n gyalig terii?asuIr d.a-
lam genus e s ~ e r ~ i l l u sf a, m i l i Elui~i.l.iacsae,n~-:.!o Monol i a l e s , s u b d i v i s i Deuteromycotina (Poiigi L m p s r f e c t i ) dan d i v i s i Eumycota.
S t r a i n yang t e r s e l e l r s i s e c a r a
k o m e r s i d l digunzllran u n t u k produlrsi asam s i t r a t , a s a a g l u k o n a t dan b e r b a g a i j e n i s enziui ( F r a z i e r dan West-hoff, 197a). mempunyai h i f a gang b e r s e p t a t d a n d i l e n g k a p i dengan s p o r a a s e k s u a l
.
Iiif a yang be:-hubungan
l a n g s u n g dengan media b e r f u n g s i s e b a g a i p e n y e r a p u n s u r h a r a dan yang menghadap permulraan b e r f u n g s i s e b a g a i a l a t r e p r o d u k s i (Wolf, 1 9 4 9 ) .
Molekul-nolekul s e d e r -
hana s e p e r t i g u l a dan kornponen 1-ain yang t e r l a r u t d i s e k e l i l i n g h i f a d a p a t l a n g s u n g d i s e r a p , eedangkan molek u l l a i n yang l e b i h kompleks d i p e c a h t e - l e b i h d a h u l u , UntulrituA.
'
menghasilkan beberapa enzim e k s t r a -
s e l u l e r s e p e r t i amilase, amiloglukosidase, s 8 l u l a s e , p e k t i n a s e , k a t a l a s e dan l a i n - l a i n ( B l a i n , 1 9 7 5 ) . Pada p r o s e s f e r m e n t a s i , inokulum yang b e r u p a spor a b i a s a n y a merupakan s t a r t e r t e r b a i k u n t u k memulai fermentasi.
Akan t e t a p i untuk s!rala yang l e b i h b e s a r
s e p e r t i s k a l a I 1 p i l o t p l a n t r 1 dan i n d u s t r i l e b i h b a i k menggunakan inokulum h a s i l p r o p a g a s i k u l t u r n u r n i (Cock e r dan G r e e n s h i e l d s , 197.5).
Garobar 1.
Bagian-bagian A s p e r f f i l l u s ( F r a z i e r dan Westhoff, 1 9 7 8 )
3 Enzim Amiloglukosidase Menurut Lee dan Whelan (1971) enzim yang d a p a t m e n g h i d r o l i s a ikatan'i(1,Lt glukoarorlase (E.C. 3-2.1.3
dan!/,l,6
d i g o l o n g k a n daZam
sinonim d a r i g l u k o m i l a s e ,
a m i l o g l u k o s i d a s e dan 8 - a m i l a s e ) Enzim a m i l o g l u k o s i d a s e digunakan dalam i n d u s t r i untuk m e n g h i d r o l i s a p a t i s e c a r a lenglrap m e n j a d i g l u kosa. r/
Dalarn k e r j a n y a enzim i n i mengurai i k a t a n q , 1-4,
1-3 s e r t a memindakkan u n i t gluirosa m ~ l l a id a r i u j u n g
non p e r e d u k s i pada a m i l o s a dan amilopelrtin,
Kemampuan
m e n g h i d r o l i s a enzim i n i b e r v a r i a s i t e r g a n t u h g j e n i s mikrobanya ( B u l l , 1 9 7 9 ) . Amiloglukosidase d a p a t d i p r o d u k s i dari b e r b a g a i g a i u r kaparlg, t e t a p i yang d i g u n a k a : ~ u n t u k p r o d u k s i
-
k o ~ n e r s i a ld a r i genus Asperp;il.lns, i?hizopus dan Endo-
-m y c e s
(Aunstrup, 1 9 7 9 ) .
Sedangkan menurut Arima (1964)
a m i l o g l u k o s i d a s e juga d a p a t d i p r o d u k s i d a r i b a k t e r i Clostridium. T e r d a p a t dua k l a s i f i l r a s i a n i l o g l u k o s i d a s e , y a i t u kelompok pertama m e n g h i d r o l i s a p a t i menghasilkan h i d r o l i s a p a t i t o t a l d a n q - l i m i t d e k s t r i n dan yang kedua n e n g h a s i l k a n 8 0 p e r s e n h i d r o l i s a p a t i dan 40 persen konversi
P
- l i m i t t i e k s t r i n men j a d i g l u k o s a ( n e -
ming yang d i k u t i p o l e h Wardoyo, 1 9 8 5 ) . B e r a t rnolekul enzim a m i l o ~ l u l r o s i d a s eb e r k i s a r a n t a r a 60 000
-
100 000 dan rnerupakm g l i k o p r o t e i n
yang mengandung 5
-
20 p e r s e n k a r b o h l d r a t , b i a s a n y a
t e r d i r i d a r i g l u k o s a , mannosa, glukosarnin dan g d a k t o s a (Fogarty, 1983). Menurut Norman (1979) enzim a m i l o g l u k o s i d a s e dap a t a e n g h i d r o l i s a 30 p e r s e n (w/v) s u b s t r a t dengan der a . j a t k o n v e r s i hanya 85 p e r s e n , s e d m g k a n dengan nenggunaka1 k o n s e n t r a s i s u b s t r a t 10 p e r s e n
(w/v) d e r a j a t
k 0 n v a r ~ id a p a t d i t i n g k a t k a n a e n j a d i 9 5 p e r s e n . Menurut Commision on Enzg--e o f The 1 n t e r n a t i . o n a l Union o f Biochemistry, a k t i f i t a s enzim d i n y a t a k a n da-
1x0I n t e r n a t i o n a l Unit.
S a t u I n t e r o a t i o n a l U n i t enzim
a d a l a h enzim yang rnunghasilkan pembentukan s a t u mol ~ r ~ d up ekr menit dibalmb lcondi n i t e r t e n t u . (Reed, 1 9 7 5 ) .
A k t i f i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e d i n y a t a l r a n da-
l a m satuan u n i t per m i l i l i t e r f i l t r a t . ,
S a t u u n i t ak-
t i f i t a s s e t a r a dengan s a t u mikro mol g l u k o s a ( s e b a g a i g u l a p e r e d u l r s i ) yang d i h a s i l l r a n d a r i perla!rum terhadap l a r u t a n p a t i .
enzim
A n a l i s a a ! i t . i f i t a s enzim auiilo-
g l u k o s i d a s e dilakulran dengan rnenganalisa g u l a p e ~ e d u l r -
s i yang d i h a s i l k a n d a r i p e r l a k u a n enzim t e r h a d a p pa-
t i dengan metode Somogy (Somogy, 1945). A k t i f i t a s enzim d a p a t p u l a d i n y a t a k a n d d a m &tif i t a s s p e s i f i k , y a i t u U n i t p e r m i l i g r a m p r o t e i n (iieed, 1975).
Pengukuran k a d a r p r o t e i n d i l a k ~ r k a ndengan me-
t o d e Lowry ( L o r r y , 1 9 5 1 ) yang pada p r i n s i p n y a nenguk u r warna b i r u lembayung y a n g t e r b e n t u k a k i b a t r e a k s i p r o t e i n dengan i o n
CU"
dalam s u a s a n a basa.
Psrigukuran
d i l a k u k a n pada s p e k t r o f o t o m e t e r dengan p a n j a n g gelombang 500
-
750 nm.
4. F r o d u k s i Enzim A m i l o g l u k o s i d a s e A s p e r g i l l u s n i e e r s e b a i k n y a d i f e r n e n t a s i k a z r pada l r u l t u r terendam yang d i l e n g k a p i dengan s i s t i m a g i t a s i dan a e r a s i (Tomodo yang d i k u t i p o l e h C a s i d a ,
1968),
Menurut B l e v i n e dan D a v i s ( 1 9 7 9 ) keuntungan c l a r i k u l t u r t e r e n d m , y a i t u media c a i r r e l a t Z f l c b i h murah, penanganannya l e b i h mudah, r e s i k o k o n t a r n i n a s i r33.pat dikurangi. dan l e b i h mudah d i k o n t s o l
.
Sumber lrarbon yang b a i k untuls n e n g h a s i l k a n amiloglukosidase d a r i A s a e r ~ i l l u s ton e t d , 1 9 7 2 ) .
a d a l a h pa.ti ( B a r -
Penambahan i n d u s e r m a l t o s a menun-
juldcan a k t i f i t a s yang p a l i n g t i n g g i d a r i m i l o g l u k o s i dase.
K o n s e n t r a s i m a l t o s a gang b i a s a d i t a n b a h k a n
a d a l a h 2.8 x
lo-' M
sampai
1.4 x
hf
juiiilah
ddail
enzim yang t e r b e n t u k meningkat dt-ngzn m e i ~ i n g k a t n y a konsentrasi,
Untuk memperoleh enzim dengan a k t i f i t a s
yang t i n g g i , i n d u s e r b i a s a n y a ditambahkan s e t e l a h dua h a r i i n k u b a s i (Barton e t a l , 1972).
Menurut Soekopi-
t o j o (1986) penambahan i n d u s e r maltose. dua &,ram p e r l i t e r media dengan waktu i n k u b a s i 96 jam rcenghasiliran a k t i f i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e p a l i n g t i n g g i d a l a n p r o d u k s i menggunakan " s h a k e r t 1 dengan k e c e p a t s a a g i t a -
s i 200 rpm. Wardoyo (1985) menyatakan bahwa a s ~ e r ~ i l l uniprer s
L 5l/NRRL A-11,264
cukup p o t e n s i a l . u n t u k rnenghasilkan
a m i l o g l u k o s i d a s e dengan s u b s t r a t molases.
Aktif'itas
a m i l o g l u k o s i d a s e yang maksimum d i p e r o l e h dengan ferm e n t a s i pada suhu i n k u b a s i 3 3 ' ~ selama 49 jam dengan k e c e p a t a n " s h a k e r w a t e r b a t h " 5.0 rpm. Menurut Bakar (1986) " s c a l e upt1 p r o d u k s i amilo- . g l u k o s i d a s e pada f e r m e n t o r model MSJ-U2 &&a
30 li-
r;er ( p i l o t plan%)menggunakan s m b e r karbon d a r i molas e s dan k o n s e n t r a s i s t a r t e r 4. J~LI264 sebanyak
4
L 5l/NRRI, A - 1 1 ,
p e r s e n (w/v) s e r t a pada k o n d i s i
Tabel 1.
Komposisi k i m i a m o l a s e s a
Komponen
Kisaran (
Rata-rata
(,%I
Air Sukrosa ~ r u k t o i a( L e v u l o s a ) D e k s t r o s a (Glukosa) Pereduksi l a i n Karbohidrat l a i n Abu : IC20 C a0
MgO Na20
'2'5
SiO dan o k s i d a _2. yang..h%dakl a r u t N i t r o g e n majemuk : 2-6 Protein kasar Asam amino Asam non n i t r o g e n 2-8 L i l i n , s t e r o l dan f o s 0.1-1 lipid Pigmen dan v i t a m i n
-
-
aWolfrom dan B i n k l e y ( 1 9 5 3 ) yang d i k u t i p o l e h ~ a t u r a e l (1982) '
o p t i m a l , y a i t u suhu 3 5 O C , pH
4-5 dan k e c e p a t a n a e r a s i
1 VVM selama 49 jam, menghasilkan a k t i f i t a s enzim tert i n g g i pada t a n g k i f e r m e n t o r b e r a g i t a s i 300 -$?a, Suhu optimum p e r tumbuhan A S ~ e ~ g i l & qg - j - 6 e k i tar
3 7 O ~ , sedangkan suhu maksimumnya mencapai 6 5 ' ~ dengan k i s a r a n pH yang cukup l u a s , y a i t u 2,8 dan Hubert, 1 9 7 8 ) .
- 8-8
(LaksJ-n
Davies (1963) menyatakan b ~ h w apem-
bentukan enzim e k s o s e l u l e r l e b i h bailr pada suhu yang l e b i h r e n d a h d a r i suhu optimum pertumbuhan dan pada pH yang mendekati n i l & pH a k t i f i t a s maksimum enzim. L a j u pertumbuhan mikroorganisme d i p e n g a r u h i o l e h k o n s e n t r a s i komponen penyusun media f e r m e n t a s i ,
Baik
media alami, semi s i n t e t i k maupun s i n t e t i l r h a r u s d a p a t m e n s u p l a i kebutuhan u n s u r e l e r n e n t e r s e l d a r i milrroba yang digunakan.
Unsur utama yang d i p e r l u k a n a d a l a h
k a r b o n , n i t r o g e n , s u l f u r dan f o s f o r .
Disamping i t u
A s p e r n i l l u ~niRer memerlukan juga unsur-unsur k e l u n i t seperti
CU",
a ' ' ,
Mg",
~ a ' " , 'K
dan l a i n - l a i n (Stain-
b u r y dan Whitaker, 1 9 8 4 ) . Menurut Brannon yang d i k u t i p o l e h Cockerdan Greens h i e l d s (1977) f e r m e n t a s i menggunalcan
= = akan b e r h a s i l b a i k
17li
&-
j i k a f r u k t o s a dan g l u k o s a d i -
gunakan bersama-sama s e b a g a i s u n b e r karbon, Umumnya dalam p r o s e s f e r m e n t a s i a e r o b i k digunakan f e r m e n t o r yang d i a d u k s e c a r a rnekanik ( S t i r r e d t a n k f e r m e n t o r ) dan d i l e n g k a p i dengan s i s t e m a e r a s i dan "baf f l e " ( S i t t i g , 1 9 8 2 ; Weigrich dan S h u r t e r , 1 3 5 3 ) .
UNBAFFLES
pandangan Earnping
pandangan a t a s
samplng Gambar 2.
atas
P o l a a l i r a n s u s p e n s f k u l t u r pada f e r m e n t o r " u n b a f f l e d - t a n k dan l l b a f f l e d - t a n k l l (Oldshua, 1 9 8 3 ) .
Pengadukan b e r f u n g s l meningkatkan l u a s permukaan c a i r a n untulr m e n t r a s f e r o k s i g e n Ire d a l m c a i r a n k u l t u r , menghalangi l e p a s n y a o k s i g e n yang t e l a h t e r t a n g k a p , memp e r k e c i l ukuran gelembung u d a r a dan mencegah pengelompokan gelembung u d a r a * Udara s t e r i l dipompakan k e daa zlm tarlgki ferrnentor nlelalui "spargerrl.
Kecepatan a l i r a n u d a r a dinyatalran
dalam VVM (volume v e l o c i t y p e r volume media p e r m e n i t ) ,
Kecepatan a l i r a n u d a r a yang r e l a t i f rendah menyebabkan t e r p e n u h i n y a jumlah o k s i g e n yang d i b u t u h k a n o l e h
ticli.!-
mikroorganisme, s e b a l i k n y a k e c e p a t a n a e r a s i yang t e r l a l u t i n g g i menyebabkan busa meluap yang menghalangi t r a n s f e r o k s i g e n ke c a i r a n .
Untufr sfrala " p i l o t p l a n t T T
umumnya d i o p e r a s i k a n k e c e p a t a l a e r a s i 0.5
- 1,5 VVM.
P e n g o n t r o l a n d i l a k u k a n pada k r a n pemasukan u d a r a dan p e n g a t u r a n tekanan u d a r a dalam t a n g k i f e r m e n t o r .
5. Pemurnian Enzim Pemurnian enzim a m i l o g l u k o s i d a s e d a p a t d i l a k u k a n dengan menggunakan ammonium s u l f a t dan e t h a n o l ( P h i l l i p s dan Galdwell, 1 9 5 1 ) , pemurnian dengan k h r o m a t o g r a f i DEAE-celullose (Fleming clan S t o n e , 1 9 5 1 ) dan pemurnian dengan u l t r a s e n t r i f u g a s i ( I l a t t o r i dan Takeuchi, 1 9 6 1 ) . Tahap p e r tama pemurnian enzim e k s o s e l u l e r a d a l a h memisahkan f i l t r a t enzim d a r i biomassa s e l dan p a d a t a n l a i n n y a dengan c a r a s e n t r i f u g a s i a t a u panyaringan ( f i l t r a s i ) , kemudian pengendapan dengan garam a t a u p e l a r u t o r g a n i k , d i a l i s a , e l e k t r o f o r e s i s dan pengeringan.
Pe-
murnian l e b i h l a n j u t a d a l a h msmisahkan f r a k s i - f r a k e l
en-
zim dengan k h r o m a t o g r a f i , a d s o r h s i m e l a l u i p e r t u k a r a n i o n s e r t a e l e k t r o f o r e s i s yang l e b i h sempurna dan t a h a pan a k h i r a d a l a h k r i s t a l i s a s i enzim ( h i b a , 1973; Arima, 1964; Schrimmer dan P a r d e e , 1 9 4 7 ; S t a n b u r y dan Whitaker, 1984).
Untulr mengurangi volume f i l t r a t enzim, d i l a k u k a n pemekatan dengan c a r a e v a p o r a s i a t a u u l t r a f i l t r a s i . E v a p o r a s i d a p a t d i l a k u k a n s e c a r a t r a d i s i o n a l a t a u menggunakan e v a p o r a s i wakum dimana suhu d a p a t d i k o n t r o l ant a r a 30
-
4 0 ' ~ a g a r enzim t i d a k rusal;.
Pemekatan de-
ngan k o n t r o l suhu yang k e t a t s e k a l i p u n akan menyebabkan t e r j a d i n y a penurunan a i r t i f i t a s s e c a r a p r o p o s i o n a l , umumnya k u r a n g l e b i h 10 p e r s e n (Aunstfup, 1 9 7 9 ) . Metode ! ! f r e e z e c o n c e n t r a t i o n " merupakan s u a t u ca-
r a u n t u k memekatkan l a r u t a n dengan membekukan l a r u t a n s e d i k i t demi s e d i k i t a t a u dengan c a r a menempatkan l a r u t a n d i barvah u n i t p e n d i n g i n r e f r i g e r a t o r dan l a p i s a n e s yang t e r b e n t u k dibuang.
Metode i n i s e l a i n memekat,
kan k o n s e n t r a s i enzim j u g a memekat1ra.n garam s e h i n g g a d a p a t menyebabkan t e r j a d i n g a d e n a t u r a s i p r o t e i n (Schwimmer, 1981). S e t e l a h l a r u t a n cukup p e k a t kemudian p r o t e i n d i p i sahkan.
Menurut S t a n b u r y dan Whitaker (19841, a d a dua
metode unbu1c mendapatkan f r a k s i p r o t e i n , y a i t u " s a l t i n g o u t " p r o t e i n menggunakan garam i n o r g a n i k s e p e r t f ammonium dan sodium s u l f a t s e r t a yang kedua y a i t u dengan meriambahkan p e l a r u t o r g a n i k pada r ' i l t r a t dibaviah suhu k u r a n g d a r i -5 0 C. Umumnya garam yang digunakan a d a l a h ammonium s a fat.
Menurut Dixon dan Webb (1979) yang d i k u t i p ole11
Wiseman ( 1 9 8 5 ) , keuntungan penggunaan garam mmonium s u l f a t y a i t u b i a y a n y a r e l a t i f murah, k e l a r u t a n n y a
t i n g g i , pH l a r u t a n t i d a k t e r l a l u e k s t r i m yang t i d a k memberi pengarvh b e r a l .- t e r h a d a p enzim dan tidal% t o k sik,
Namun penggunaan ammonium s u l f a t j u c a mempunyai
k e r u g i a n , y a i t u k o n s e n t r a s i garam yang t e r t i n g g a l dalam produk t i n g g i dan k u r a n g e f i s i e n dalam menghilangkan f l i m p u r i t i e s l l (Aunstrup, 1 9 7 9 ) . Pengendapan dengan p e l a r u t o r g a n i k s e p e r t i metano1 dan a s e t o n yang d i i k u t i pemurnian dengan d e s t i l a -
si menghasilkan produk dengan a k t i f i t a s t i n g g i , t e t a p i k o n d i s i suhu h a r u s d i k o n t r o l pada ~ u h ur e n d a h (dibawah
-5'~) dan ha1 i n i k u r a n g ekonomis (Aunstrup, 1979). Menurut A r i m a (196Lt) u n t u k mendapatkan rendemen yang l e b i h t i n g g i s e l a m a pengendapan p r o t e i n enzim, s e b a i k n y a digunakan garam l s o n s e n t r a s i 70 p e r s e n jenuh, B i a s a n y a garam ditambahkan dalam bentuk p a d a t a n , h a 1 i n i u n t u k menghindariran p e n m b a h a n volume yang b e s a r . Makin lama pengendapan, rendemen yang d i d a p a t k a n akan makin t i n g g i .
Waktu pengendapan miaimal 15 m e n i t (No-
z a i k i dan H a y a i s h i yang d i k u t i p o l e h L i l y , 1 9 7 9 ) . Untuk memisahkan c a i r a n endapan p r o t e i n , d a p a t d i lalrukan dengan s e n t r i f u g a s i a t a u penyaringan.
Penyari-
ngan a d a l a h c a r a yaug umum digunakan untuk b e r b a g a i skal a , t e t a p i kekurangannya d i b a n d i n g dengan s e n t r i f u g a s i y a i t u waktu yang clihutuhkzn l e b i h lama, s u l i t d i k o n t r o l dan endapan p r o t e i n h a r u s d i p i s a h k a n d a r i media penyar i n g ( S t a n b u r r y dan irihitalter, l 9 6 4 ) ,
Schimmer dan Pardee (1974) menyarankan s e n t r i f u g a -
s i dengan k e c e p a t a n 1 0 000 rpm pada suhu 4 ' ~ selama
1 5 lnenit u n t u k memisahkan endapan d a r i c a i r a n n y a . Untuk memisahkan p r o t e i n enzim d a r i " i m p u r i t i e s u d i l a k u k a n dengan d i a l i s a .
Prinsip kerja dialisa yaitu
mempertahankan molekul yang m e m i l i k i b e r a t molekul t i n g gi, diatas
5 000, s e p e r t i molekul p r o t e i n dan melewat-
kan molekul k e c i l , m i s a l n y a garam m e l d l u i membran semi permeabel (Wiseman, 1 9 8 4 ) . D i a l i s a d a p a t d i l a k u k a n dengan menggunakan se3.of a n yang d i i s i dengan f i l t r a t enzim kemudian direndam dalam p e l a r u t b e b a s i o n a t a u l a r u t a n b u f f e r .
Selama
d i a Z i s a p e l a r u t d i s i r k u l a s i k a n menggunakan s t i r e r dan s e t i a p jangka waktu t e r t e n t u p e l a r u t d i g a n t i u n t u k memp e r c e p a t d i a l i s a (Mc P h i e yang d d k u t i p o l e h Schimmer, 1981)
.
Penggunaan s e l o f a n mempunyai keuntungan, y a i t u pelaksanaannya yang r e l a t i f mudah dan raurah, akan t e t a p i membutuhkan waktu Lama dan t i d a k p r a k t i s d i t e r a p k a n pada s k a l a b e s a r d i a t a s s e p u l u h l i t e r (Schimmer dan Pardee,
1974; Biseman, 1 9 8 4 ) .
B. STABILISASI ENZIM
1. I k a t a n Yang Berperan Terhadap S t a b i l i t a s Enzim Menurut Monsan (198Lt) a k t i f i t a s enzim s e c a r a l a n g sung berhubungan dengan p e r l i n d u n g a n s t r u k t u r t i g a d i mensi d a r i rnolekul p r o t e i n enzirn.
Selanjutnya Kliba-
nov (1983) menyatakan bahwa pada k o n d i s i normal, s t r u k t u r a k t i f enzim d i j a g a o l e h keseimbangan k e k u a t a n nonk o v a l e n yang b e r l a i n a n , y a i t u i k a t a n h i d r o g e n , h i d r o f o b i k , i o n i k dan Van d e e r Waals,
Dengan nailrnya suhu,
semua k e k u a t a n d i a t a s menurun dan molekal p r o t e i n enzim akan t e r b u k a ( u n f o l d i n g ) .
Karena p u s a t a k t i f en-
zim s e l a l u t e r d i r i a t a s b e b e r a p a r e s i d u asam amino yang t e r d a p a t dalam s t r u k t u r t i g a d i m e n s i p r o t e i n enzim, s e h i n g g a pambukaan r a n t a i molekul p r o t e i n menyebabkan k e r u s a k a n p u s a t yang a k t i f dan enzim menjadi i n a k t i f .
Hal i n i didukung o l e h p e n e l i t i a n S e g e l (1975) yang men y a t a k a n s t r u k t u r t e r s i e r enzim d i k o n t r o l o l e h s e j u m l a h l k a t a n non-kovalen yang leinah.
Molekul enzim m e m i l i k i
s t r u k t u r yang l e m b u t dan audah r u s a k .
J i k a molekul en-
zim menyerap e n e r g i yang t e r l a l u b e s a r , s t r u k t u r t e r s i e r akan t e r g a n g g u dan enzim akan t e r d o n a t u r a s i , y a i t u k e h i langan a k t i f i t a s katalitiknya. Enzim d a p a t d i s t a b i l k a n dengan b e b e r a p a t e k n i k , s e p e r t i i m m o b i l i s a s i , penggunaan a d i t i f , m o d i f i k a s i k i m i a dan p e n g i k a t a n dengan p o l i s a k a r i d a (Henley dan Sadana, 1 9 8 4 ) .
S e l a n j u t n y a Kenley dan Sadana (1985)
menyatakan bahwa s t a b i l i t a s enzim berubah s e c a r a i n t r i n s i k dengan perubahan asare amino.
Iial B a l i membawa
perubahan pada i n t e r a k s i e l e k t r o s t a t i k , i k a t a n h i d r o gen, i k a t a n d i s u l f i d a , i n t e r d r s i h i d r o f o b i k dan kekonpakan enzim.
S t a b i l i t a s enzim d a p a t berubah o l e h pe-
nambahan s t a b i l i s e r s e p e r t i k a t i o n , n c r o s s - l i n k s n , p e p t i d a dan l a i n - l a i n . Menurut wagen (1984) p e r g a n t i a n s a t u asam amino dalam s t r u k t u r p r o t e i n enzim d a p a t memberikan k o n t r i b u s i yang b e r a r t i t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim.
Klibanov
(1983) menyatakan bahwa jembatan garam memainkan p e r a nan dalam p e r l i n d u n g a n l ~ o n f o r m a s ip r o t e i n enzim, Jernb a t a n garam d i b e n t u k a n t a r a muatan n e g a t i f a s p a r t a t dan g l u t a m a t dengan muatan p o s i t i p h i s t i d i n , l i o i n dan arginin.
pKs h i s t i d i n dan l i s i n l e b i h r e n d a h d a r i p ~ d a
arginin,
Karenanya pada pH n e t r a l dam b a s a , i o n - i o n
gugus h i s t i d i n dan l i s i n akan b e r d i a o s i a s i (menimbulkan k e r u s a k a n jembatan garam) pada suhu yang 1eFi.h r e n dah d e i p a d a a r g i n i n .
Hal i n i b e r a k i b a t jeinbatan garam
yang d i b e n t u k o l e h a r g i n i n l e b i h k u a t d a r i p a d a yang d i bentuk o l e h h i s t i d i n dan l i s i n .
Dapat d i s i m p u l k a n ,
p e n g g a n t i a n h i s t i d i n dan l i s i n akan meningkatkan kekuat a n jembatan garam. Menurut Wiseman (1984) t i a p - t i a p molekul a t a u s u b u n i t p r o t e i n g l o b u l a r yang memperlihatkan a k t i f i t a s e n z i m a t i k dalam l a r u t a n , b e r b e n t u k gulungan u n t u k
.
rnemberilsan permukaan p o l a r pada viaktu k o n t a k dengan l i n g k u n g a n l u a r yang l e b i h l l a q u e u s t l , Bagian d d a m mol e k u l protein r e l a t i f b e r s i f a t hidrofobik.
Pengenda-
l i a n a k t i f i t a s enzimatik sebagian besar ditentukan o l e h b e s a r n y a i k a t a n h i d r o f o b i k m e l d u i sisi r a n t a i a s m ainino non-polar s e p e r t i p h e n i l a l a n i n , l e u s i n , i s o l e u s i n dan v a l i n .
l k a t a n yang l a i n , y a i t u jembatan garam an-
t a r a gugus yang bermuatan s e p e r t i gugus amino (-NH
3
)
dan gugus k a r b o k s i l (-COO-).
2. Penggunaan A d i t i f S e b a g a i S t a b i l i s e r Enzim Monsan (1984) mengatalran bahwa s u k r o s a , l a k t o s a , s o r b i t o l , garam dan b e r b a g a i p o l i m e r t e l a h digunakan s e c a r a l u a s d d a m s t a b i l i s a s i l a r u t a n enzim.
Wiseman
(1977) bahan a d i t i f yang b e r i n t e r a k s i l e b i h k u a t d e n g a s enzim d a r i p a d a dengan a i r akan cenderung memberj-kan den a t u r a s i yang s t a b i l pada enzim t e r s e b u t dengau membentuk iliatan intermolekuler a n t a r aditif-enzim.
Hd ini
alran menyebabkan t e r j a d i n y a k e r u s a k a n i k a t a n i n t r a m o l e k u l a r awal d a r i moleicul enzim,
D i l a i n pihak, a d i t i f
yang b e r i n t e r a k s i l e b i h k u a t dengan molekul a i r d a r i p a d a dengan enzim akan menaikkan t i n g k a t o r g a n i s a s i molekul a i r dengan pembentukan l ~ c l u s t e r udan akau membatasi t e r bukanya r a n t a i p r o t e i n dan akan mc?ingkatkan s t a b i l i t a s enzim.
a. Pengaruh S u b s t r a t Substr
i t
dan i n h i b i t o r yang mengilrat s i r i k a t a -
l i t i k s e r i n g menyebablian p e n i n g k a t a n s t a b i l i t a s enzim,
Sdanya i n h i b i t o r akan memperlihatkan k e t a h a -
nan enzim yang l e b i h b e s a r t e r h a d a p d e n a t u r a s i pan a s (Wiseman, 1 9 6 4 ) .
P e n g i k a t a n enzim dengan subs-
t r a t mungkin d i i k u t i o l e h perubahan konf orroasi pada
s i s i a k t i r ' enzim dan meningkatkan s t a b i l i t a s enzirn (Henley dan Sadana, 1 9 8 5 ) . Pada suhu 60°c,
adanya s u b s t r a t ( s u k r o s a ) d i -
bawah k o n s e n t r a s i
1.5 M t i d a l , membawla perubahan t e r -
hadap " h a l f - l i f e "
invertase
.
" H a l f - l i f el1 n a i k dgngall
c e p a t s e c a r a l i n i e r dengan n a i k n y a k o n ~ e n t r a s isubs-
trat,
" H a l f - l i f e t 1 a d a l a h waktu yang d i p e r l u k a n b a g i
enzim u n t u k k e h i l a n g a n 50 p e r s e n a k t i f i t a s awalnya (Monsan, 1 9 8 4 ) . S t a b i l i t a s panas d a r i amiloglukosidase n a j k dengan adanya s u b s t r a t .
Penambahan l i m a p e r s e n p a t i
niembuat enzim a m i l o g l u k o s i d a s e d a r i C l o s t r i d i u m menjadi s t a b 1 1 pada suhu
7 5 ' ~ dan 50 p e r s e n a k t i f i t a s n y a m a s i b t c r l i h a t s e t e l a h p e r l a k u a n 8 5 ' ~ selama s a t u jam (Hyun dan Zei-
5 %, 8 5 ' ~ 2 $, 8 5 ' ~
Aktifitas residu
(7;)
Gambar 3.
b.
Pengaruh s u b s t r a t p a t i t e s h a d a p stab i l i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e d a r i Clostridiurn ~ m o h y d r o s ufurlcurn l (Hyun dan Zeikus, 1 9 8 5 ) ,
Pengaruh Garam Dan I o n Logam Garam ammonium s u l f a t urnumnya m e m l l i k i pengaruh s t a b i l i s a s i yang t i n g g i , b a i k pada k o n s e n t r a s i r e n dah maupun t i n g g i (Monsan, 1 9 8 4 ) .
Menurut Wiseman
(1977) ammonium s u l f a t ( j e n u h ) s e r i n g digunakan unt u k s t a b i l i s a s i enaim sewaktu p r e p a r a s i ,
Gliserol
dan ammonium s u l f a t d a p a t memberikan k e s t a b i l a n pada
4- i s o p r o p i l
malate isomerase d a r i r a g i .
Pangguna-
an 20 p e r s e n a t a u 30 p e r s e n g l i s e r o l dengan 1 M a m a nium s u l f a t d a p a t memberikan k e s t a b i l a n pada p r o p i l malate isomerase d a r i r a g i c
-
iso-
Disamping i t u
-
20
30 p e r s e n ammonium s u l f a t juga memberikan ke-
s t a b i l a n pada i s o s i t r a t d e h i d r o g e n a s e . Kalsium k l o r i d a memberikan pengaruh s t a b i l i s a s i pada k o n s e n t r a s i rendah, namun menyebabkan d e n a t u r a -
s i pada k o n s e n t r a s i t i n g g i (Monsan, 1 9 8 4 ) .
Banyak
enzim d i s t a b i l k a n o l e h i o n ~ a + + ,termasuk s t a b i l i s a -
si terhadap panas d a r i thermolisin,
T h e r m o l i s i n me-
rupakan p r o t e a s e d a r i b a l r t e r i t e r i u o f i l i k yang s t r u k t u r n y a d i b e n t u k bersama o l e h i k a t a n e l e k t r o s t a t i k yang k u a t a n t a r a ~ a + +( d u a p e r molekul) dan gugus k a r b o k s i l a t a t a u gugus k a r b o n i l dalam b a g i a n molekul yang b e r s i f a t h i d r o f o b i k .
4
cai4 d a p a t melindungi
- a m i l a s e t e r h a d a p d e n a t u r a s i panas.
Ca
++
menem-
p a t k a n d i r i pada i k a t a n d i s u l f i d a dalam p o r m a n n y a s e b a g a i s t a b i l i s e r enzim.
Disawping i t u ca4+ j u g a
d a p a t memberikan k e s t a b i l a n pada p r o t e a s e d a r i p s i k o t r o p i k Pseudomonas sp. Menurut Wiseman (1984) t e l a h banyak dilaporican bahwa i o n - i o n logam d a p a t n e m p e r t i n g g i s t a b i l i t a s enzim t e r h a d a p panas.
Panggunaan
caif
dan M a
++ ju.
g a garam d a r i asam i n o r g a n i k d a p a t memberikan p e r l i n dungan b a g i L - a r g i n a s e
sevraktu p u r i f i k a s i dan p s n y i n -
panan. Menurut K l i b a n o v (1983) $on--ion Ca,; Mg dan Zn meningkatkan s t a b i l i t a s enzim t e r h a d a p panas.
Pe-
n g a r u h i o n - i o n i n i s a n g a t s p e s i f i k , s e b a g a i contoh Ca
++
meningkatkan s t a b i l i t a s t e r h a d a p p a n a s d a r i
.
100
h
Alrtifitas residu
(%I
Oe5
0 Gambar
4,
1.O
1.5
Pengaruh CaCl t e r h a d a p s t a b i l i t a s daGi B a c i l l u s s u b t i l i s
d\ - a m i l a s e
(NOVO, 1 9 8 5 ) .
d,- a m i l a s e
d a r i Bacillus c d d o l i t i c ~ *
Menurut H o c h s t e i n dan Schraam (1971) gar-
in-
o r g a n i k memberikan s t a b i l i t a s enzim dengan menetral i s a s i k e l e b i h a n muatan e l e k t r o s t a t i k dalam molekul enzim, s e b a b b i l a t i d a k d i n e t r a l k a n d a p a t t e r j a d i k e r u s a k a n s t r u k t u r q u a r t e n e r molekul p r o t e i n enzirn. P e l a r u t a n enzim murni pada b e r b a g a i gararn i n o r g a n i k akan memberikan kenaikkan a l r t i f i t a s pada k o n s e n t r a -
si yang l e b i h t i n g g i .
P e r l i n d u n g a n sempurna b a g i
a k t i f i t a s enzim a d e n o s i n monophosphate r i i p e r o l e h pada B o n s e n t r a s i K2S04 a t a u K C 1 l 6 b i h d a r i 200 mM, demikian j u g a dengan KZHPO
4'
Sementara i t u g a r m
MgC12 a t a u MgS04 akan memberikan p e r l i n d u n g a n rang b a i k j u s t r u pada k o n s e n t r a s i r e n d a h .
c,
Pengaruh P o l i h i d r i k kllrohol P e l a r u t organilr s e r i n g rnemberikan s t a b i . l i t a s enzim pada k o n s e n t r a s i rendah, namun rnengakibatkan d e m t u r a s i pada k o n s e n t r a s i t i n g g i
.
Te t a p i p o l i h i -
d r i k a l k o h o l b i a s a n y a memililsi pengaruh s t a b i l i s a s i yang t i n g g i t e r h a d a p enzirn, bahkan pada k o n s e n t r a s i yang s a n g a t t i n g g i (Monsan, 1 9 8 4 ) . Seiaua p o l i h i d r i k allrohol yang digunakan o l e h Combes dan Monsan. (1983) y a i t u e t t h y l e n e g l y c o l , g l y c e r o l , e r y t h r i t o l , x y l i t o 1 dan s o r b i t o l melindun g i l n v e r t a s e terhadap d e n a t u r a s i panas,
Pengaruh
Pengaruia p e r l i n d u n g a n p o l i h i d r i k a l k o h o l n a i k dengan n a i k n y a k o n s e n t r a s i dan panjangnya r a n t a i karbon, juga berhubungan dengan jurnlah gugus h i d r o k s i l p e r rnolekul p o l i h i d r i k a l k o h o l ,
S t a b i l i t a s meningkat
dengan n a i k n y a jumlah gugus h i d r o k s i l yang dikandung dalarn inolelrulnya.
3. Pengaruh Suhu Dan pH Terhadap S t a b i l i t a s Enzim Menuru t S e g e l (1975) jilra suhu d i n a i k k a n , molek u l enzirn akan menyerap e n e r g i t e r l a l u b e s a r , h i n g g a s t r u l r t u r t e r s i e r akan terganggu dan enzim akan t e r denaturasi, y a i t u kehilangan a l r t i f i t a s k a t a l i t i k n y a . J a d i kenailckan suhu meriaiMran k e c e p a t a n r e a k s i yang inenghasilkan kenaildian turnbukan enzim dan s u b s t r a t , diimbangi o l a h k e c e p a t a n d e n a t u r a s i .
Stabilitas
enzim t e r h a d a p suhu t e r g a n t u n g d a r i b e r b a g a i f a k t o r , y a i t u pH, k e k u a t a n i o n medium dan ada tidalrnya l i g a n , Pada umumnya enzi-m akan s t a b i l t e r h a d a p p a n a s dalam bentuk enzim b e b a s k a s a r yang mengandung molekul-molek u l p r o t e i n l a i n dalanl k o n s e n t r a s i t i n g g i . S t a b i l i t a s enzim t e r h a d a p pH t e r - ~ n t u n gd a r i banyak f a k t o r , a n t a r a l a i n suhu, k e k u a t a n i o n , bahan k i mia dalam bufferc, k o n s e n t r a s i bahan pengavret, konsen-
trasi i o n logam, k o n s e n t r a s i s u b s t r a t a t a u k o f a k t o r enzim dan k o n s e n t r a s i enzim ( S e g e l , 1 9 7 5 ) .
Menurut
Rodwell (1983) menyebutkan bahwa pH b e r p e n g a r u h t e r h a d a p keadaan muatan l i s t r i k enzim maupun s u b s t r a t .
Un-
t u k enzim, perubahan muatan d a p a t mempengmuhi a k t i f i -
t a s , b a i k dengan perubahan s t r u k t u r maupun d e n g a r perubahan muatan pada r e s i d u asam amino y m g b e r f u n g s i mengikat atau katalis.
H a l i n i d a p a t d i j e l a s k a n dengan
mekanisme r e a k s i s e b a g a i b e r i i r u t : misalLnya b i l a s u a t u enzim bermuatan n e g a t i f ( Enz-). b e r e a k s i dengan s u a t u 4-
s u b s t r a t yang bermuatan p o s i t i p (Sli ), maka akan t n r j a -
+ SH*
------j. EnzSH,
Kemudian pada n i -
dah, Eaz- akan d i p r o t o n i s a s i dan k e h i l a ngan muatan n e g a t i p n y a , Enz- + ti'
--------j, Enz-B,
H a l yang sama, pada n i . l a i pH yang t i n g g i , SH' i o n i s a s i dan k e h i l a n g a n muatan p o s i t i p n y a , SB*
S * .'H
akan t e r -
-----3
Karena b e n t u k yang akan b e r e a k s i hanydlah SZ'
i m akan menur
i
S t a b i l i t a s r e l a t i f (%)
Gambar 6.
Pengaruh pi1 teriladap s t a b i l i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e d a r i A s p e r n i l l u s &(NOVO, 1985).
. 100 - 4 k t i f i tas
residuDO ( % ) 60
40 20
0
Gmbar '7.
60
Pengaruh suhu t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e d a r i A s a e r a i l l u s ni.aer (IiOVO, 1985).
k o n s e n t r a s i e f e k t i f d a r i Enz- dan SH',
j a d i menurunkan
konseutrasi efektif. 0
Penyimpanan enzim amiloglulrosidase pada suhu 2 5 C d s p a t nempertahankan a k t i f i t a s enzim eelama t i g a b u l a n , Unti;k penyimpanan yang l e b i h lama, a k t i f i t a s menukun
r:stn h i n g g a dud p e r s e n t i a p bulan. pan pada suhu
~ O C ,
Lana s a t u tahun.
J i k a enzirn d i s i m -
a k t i f i t a s enzim d a p a t b e r t a h a n se-
Enzim s e b a i k n y a d i s h p a n d d a m r u a -
ngan yang k e r i n g dengan kelembaban r e l a t i f yang t i d a k lebih dari
50
- 60 p e r s e n (NOVO, 1 9 8 5 ) .
Menurut Byun dan Zeikus (1985) enzim a m i l o g l u k o s i d a s a d a r i C l o s t r i d i u m thermokydrosuJ.furicum s t a b i l dalam k i s a r a n pH a t a s GO'C,
5
-
6, namun t i d a k s t a b i l pada suhu d i -
Sementara NOVO (1985) menyebutkan bahwa en-
zim a m i l o g l u k o s i d a s e d a r i A ~ D ~ I ' F ~ ~ n~ ui s s s t a b i l pada k i s a r a n pH
4.5
-
0
5*5 dan masih s t a b i l sampai suhu 60 C,
111, UMIAN DAN METODE PWGEGITIAN
A. BAHBN DAB AI,AT I., Bahan Bahan yang digunakan dalam p e n e l i t i a n i n i m e l i p u t i kul tur A s o e r u , ~ ~
LSl/NRRL A-11,264
yang d i p e r o -
l e h d a r i Laboratorium Teknologi F e r m e n t a s i , I n s t i t u t Telrnologi Bandung, Bandung,
Biakan murni t e r s e b u t d i -
p e l i h a r a dan d i p e r b a a y a k pada medium a g a r m i r i n g PDA ( P o t a t o D s x t r o s e Agar); media pertumbuhan yang t e r d i r i d s r i : molases 3
5,
yU2O 0.02 %, ZnSO
4
(NH ) SO 0,5 Ss KH2?O4 0 * 2 % $ MgSO 4 2 4 0 , 0 2 %, b a c t o pepton 0 - 1 %, a q u a d e s
96,16 %. Bahan-bnhan k i m i a yang digun&:an a s e t a t pH 3, 4, 4.5*
meliputi: b u f f e r
5¶ 6, 7; p e r e a k s i llsomogyll; l a r u
t a n H SO 2 N ; l a r u t a n t i o s u l f a t 2 4. o k s a l a t ; p a t i t e r l a r u t ; ma1 t o s a ; ammonium s u l f a t ; H C 1 l H ; NaOH 2 N; p e r e a k s i " l o ~ r y ~ ~ ; rum dlbumin dan CaC12. 2. .Qat P e r a l a t a n yang digunakan d puti: fermentor berkapasitas 30 madel MSJ-fl2-30L,
Tokyo, J e p a n g ) ; i n c u b a t o r shak
vrater b a t h (Tokyo Rikakika-i GO, Ltd.,
Termoace IT-76V,
Osaka, J e p a n g ) ; f r e e z e c o n c e n t r a t i o n ; s p e c t r o p h o t o m e t e r (Shimadzu S e i s a k u s h o Co.,
model UV-120-02,
Kyoto, J e -
pang) ; f r e e z e d r y e r (Labconco, model DC-55 .4/B,
Tolcyo,
J e p a n g ) ; pH m e t e r ( H o r i b a , model M, 8L, Tokyo, J e p a n g ) ; b u r e t ; k a n t u n g d i a l i s a dan a l a t - a k a t g e l a s .
P e n e l i t i a n i n i t e r b a g i a t a s beberapa t a h a p ,
,
1. P r o d u k s i Enzim K e r i n g K a s a r Memproduksi enzim amiloglulrosidase d a r i kapang A s ~ e r ~ i l l uU$
x L51/NRXL A-11,264 b e r d a s a r k a n ha-
s i l p e n e l i t i a n s k a l a " p i l o t p l a n t u (Bakar, 1 9 8 6 ) dan h a s i l p e n e l i t i a n s k a l a l a b o r a t o r i u n ( S o e k o p i t o -
2. Pengaruh J e n i s Dan K o n s s n t r a s i Garam Mempelajari pengaruh j e n i s dan k o n s e n t r a s i b e r b a g a i macam garam i n o r g a n i k t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e yang d i h a s i l k a n .
3. Pengaruh pH
Dan Suhu
Mempelajari pengaruh pH dan suhu t e r h a d a p s t a b i -
l i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e yang cll.hasilkan s e t e l a h ditambahkan garam yang memberikan s t a b i l i t a s t e r t i n g -
A = J e n i s garam
B = K o n s e n t r a s i CaC12
= t a n p a penambahan
B1 = 0 g/l
A2 = CaC12
B2 = 0 2 g/l
-43 = K 2SO4
Bj = 1 - 0 g / l
A
= KC?-
11-
C = K o n s e n t r a s i K SO
2
4
D = Konsentrasi KC1 D1=OM D2 = 0 * 2 M
D3 = O e 4 ?4
T = Suhu
D, PRODUKSL EIqZIM AMILOGLUKOSIDASE Tahapan p r o d u k s i enzim a r a i l o g l u k o s i d a s e a d d a h seba.g a i berikut:
1, P r o p a g a s i Aral S p o r a biahran murni A s p e r g i l l u s n i g e r L5L/NHRL A - l l , 261+ yang berumur empat h a r i d i e n c e r k a n dalam 10 n! l a r u t a n pengencer ( b u f f e r f o s f a t ) .
Kemudian s p o r a yang
a d a dalam a g a r m i r i n g t e r s e b u t d i h i t u n g jumlahnga dengan menggunakan rnetode haemocytometer dan a g a r ca1.van. L a r u t a n s p o r a sebanyak 4 p e r s e n (v/v) d i i n o k u l a s i k a n k e dalam medium yang t e l a h s t e r i l ,
Selanjutnya k u l t u r
t e r s e b u t d i i n k u b a s i k a n pada ll'shaker w a t e r bathr1 pada suhu 3 5 O ~ , lrecepatan a g i t a s i
5,O rpm selama 96 jam.
I n d u s e r rnaltosa ditambahkan s e t e l a h inlcubasi b e r l a n g sung 48 jam, kemudian i n k u b a s i di1anjutlra.n sarnpai 96
jam, g/l
.
Lnduser m a l t o s a yang ditamballkan sebanyak 2,O
2. P e r s i a p a n Media liledia pertumbuhan t e r d i r i d a r i : molases
: 1 800 gram
( 1\JH4p2SO4
:
300 gram
KH2P04
60 gi-~m
MgS04 7H20
12 gram
ZnSO
: 1 2 gram
4
bacto pepton
: 60 gram
d i l a r u t l r a n dalam 60 l i t e r a i r d e s t i l a t a keniudian
pH d i a t u r t e p a t 4.5*
3. P e r s i a p a n F;rmentor Sebelum d i o p e r a s i l r a n , dilaliuknn p e r s i a p a n f erment o r yang m e l i p u t i p e n g a t u r a n dan k a l i b r a s i a l a t pengont r o l suhu, pH, IN,k e c e p a t a n a g i t a s i dan p e r s i a p a n f a -
s i l i t a s penun jang.
Fermentor model MSJ-U2-30L
dalarn.
o p e r a s i n y a membutuhkan uap, a i r d i n g i n dan u d a r a yang masing-masing d i s u p a i o l e h b o i l e r , c h i l l e r dan kompresor.
K a p a s i t a s pengadaan uap a i r d i b o i l e r a d a l a h
420 kg/jam,
sedangkan u d a r a yang d i l l a s i l k a n liompresor
sebanyak 1 8 3 l i t e r / m e n i t ( l i h a t gambar 8 )
--
--I--
9-
-C7
CRILLED rllATER TAtlK 7 \u/
PA
-
Klep p e n g a t u r
-
'--
- - - - - - - --
Gamhar
8.
-ChiLQ.
I
-
- -(l_o-i*-
-kJ',?iiXtT:~(.A n (2 ....
p;:iil
-
Slcerna t:atr?-l.ctnlc f e r t n e n t o r d a n jic!rLeligI.;s-pan per!,unjung t i e r t a Iclop peng;ilui.
--
Li.
1'engoperasia.n Fermentor
l.le d i a
14'errnen t o r
Boiler
S t e r i l is a s i Chiller
Starter+I n o k u l a s i s t a r t e r
4 "r
(v,/vJ)
Inkubasb : suhu 35 C
I n d u c e r ma. t o m 0 / tarnbahkan s e t e ~ a hf erment a s i 48 jm
PH 4.5
vraktu 96 j*\rn k e c e p a t a n a e r a s i 1 VVW k e c e p a t a n a g i . t a c i 300 rpm
Pemanenan
Suspensi ltul t u r (broth) (;ambar 9 .
Skerna p r o d ~ i i s is u s p e n s i lrultur. -2. p?S 1,51/I"JI~RJ~ A - 1 1 ,264 p a d a mesin fe r r n e t ~ ~ o r rnodel ;iSJ-l,,2- 5OL.
( 2 ) ;uspenr;i
lrul t u r ( b r o t t i ) llasi.1 f e r n i e n t a s i kapnng,
d i s a r i n g me!iggui?al:an k a i n s a r i i l g dan kapas.
bi0-
massa d i p i s a h k a n s e h i n g g a d i p c r o l e h f i l t r a ' t enzim.
(2) P i l t r a t dipekatlcan dengan f r e e z e c o n c e n t r a t i o n denga!~ c a r a menem~yztkan menempatlcan l a r u t a n d i b a viah k o i l p e n d i n g i n dan l t ~ p i s a ne s yang t e r b e n t u k dibuang.
(3) Enzim p e k a t kemudian d i b e r s i h k a n d a r i k o t o r a n k o t o r a n dan m i s e l i a yang masih t e r s i s a .
pembersi-
han d i l a k u k a n aengan menambahkan ammonium s u l f a t s e c a r n p e r l a h a n sambil d i a d u k , (1,)
.
v
" F r a l r s i o n a s i " ( s a l t i n g o u t ) enzirn p e k a t b e r s i h dengall c a r a meneruskan penamballan ammonium s u l f r t t s e d i k i t demi sedilrj. t sambi.1 diadulr sampai t e r l i h a t s u s p e n s i v-ng terbentulr dalani c a i r m pelrat. r o s e s i n i , pII d i t e p a t k a ! ~6.0.
rne!nperce
(5
Untuk
Pengsn~iapan (delrantasi ) s u s p e n s i pada suhu lama 2 1 1 jam.
0
11 i:
ce-
E ' i i t r a t bagian a t a s dipisahkan d a r i
s u s p e n s i yang mengenaap. !;)
I l i ~ t i ~ i~~iernisahkan r e n d a ~ ~ sdencan n bagi.an f i l t r a t d i -
lakui;,in s e n t r i f u g a s i .
lielnudian endapan ditambah
a i r u e s t i l a t a dan dillorno&enkan, t o r u s d i l d c u k a n diali:;n, 1DOC:.
i~entrifu~sd s i l d r u l r a n pada suhu s e l r i i a r
( L j i ~ i a l i x j ; : dilalrulrttil cienL-.li ::ji:n%gunaican irbntuni: di.al i s a :;::.i:a a i r bebar: i o r i i : c r . s ~ ~ h uL[
0
(:
se?.ama i l l > jaiti.
Selnrn;~: tif~il.i.sa a i r c.i-i:>i!ulr ri~en::~una!ra~s t i r r e r d i : n c1ii:snt.i. e t
i 1 . jan,
(.. ) .i;ebelii,.;. d i l r e r i n c k a n ,
.
semal:!.~;,
f?nzi!!! d i b e i r u k a n
tii
freezer
i ' e n g e r j n C i i n dil.aliulran d e n g a n itten~~i.~na!:t~~i
freeze: r i r y e r .
(ikizim y:~ng t l i p e r o l c l ~merupak;~ri <:[I-
z,-ial i:i..ri~ig l c a s a r
.
E
.
STABILZSASI F3$ZIM AMILOGLUKOSIDASE Untuk menguji s t a b i l i t a s enzim m i l o g l u k o s i d a s e maka enzim yang masih dalam bentuk l r e r i n g k a s a r , d i l a r u t k a n dalam b u f f e r a s e t a t s e h i n g g a d i p e r o l e h enzim c a i r ,
Enzim
calr t e r s e b u t ditambahkan b e b e r a p a j e n i s s t a b i l i s e r , kemud i a n d i l a k u l a n p e r l a k u a n t e r h a d a p suhu dan,plI.
Selanjut-
nya enzim d i u j i s t a b i l i t a s n y a s e s u a i dengan p r o s a d u r yang dicantumkan pada gambar 1 0 , 11 dan 1 2 * Pati terlarut dalam b u f f e r a s e t a t pH 4,5 ( 2 $ W/Y)
Enzim k e r i n g k a s a r sebanyalr 70 mg + stabiliser
cc>
J.
(a)
d i l a r u t k a n dalam b u f f e r a p t a t pH 4,5 sampai volume 1 0 0 nil
I
I I
F i l t r a t enzim + stabiliser
L
a m b i l 5(b) r n l ~ a E u t a n( b ) a t a u ( c ) danodiinkubai pada suhu 70 C selama
>
1 0 ml 5 ml (
6 *
.a dicampur dengm tau ( c ) 1
J/
Campuran d i i ~ l r u b a s i pada t:uhu 60 C selama
i n a k t i f p i e n z i u ~pada suhu 80 C selarna 1 0 ixsni! a n a l i s a gula p e r e d ~ ? l * ~ i nietode "shaf f e r somczrw Ganbar 10.
Pengaruh s t a b i l i s e r t e r i l & ~ ?n ~ ikal! : ~il.2. ~ iui enzim amiloglukosidanti,
1 - a ~ it c r l a r u L c ; r ~ i a mb u f f e r a s c t a t pli 4.5 ( 2 :; l.!,'~)
(a)
Enzim 1:criiiL k a s a r sebanyali 70 1112 7 stabiliser
~ z i i t r a tenziii~ i stabiliser
0
L>
D i l a r u t k a n cldarn b u f f e r a s e t a t pi: 4.5 sampai. volllme 100 m i
u U
(b)
a m b i l 5 ~1 ( b ) a t a u ( c ) dan di.igkubn@kan,pada su$u 60 , L5 '70 dan 75 C selama 0, 15, 30, 45 d n n 60 m s n i t .
,
?(I
<
10 m l ( a ) dicampur dengan 5 . m 1 ( b ) n t a u ( c )
II
C a m p u r a ~d i i n k u b a s i p a d a suhu 60 C sclama 30 m e n i t
.I
I n g k t i f a s i enzim pada suhu 8 0 C s e l a n a 1.0 m e n i t
Analisa guln pereduksi metode " s h a f Yer sornogy" Gambar 12.
Pengaruh suhu t e r h a d a p s t a b i l i l a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e .
;
ti
i
tj. t e r l a r u i ; t
buffer
isnzj.fi! ;:eririg !<,2s;tT' scb:i!iyc:ild; 'i0 r!!!; d o ilgali a ttiu iatii 21 s i,i;bi1.i sc?r
7.i. L t r a t enz'irn cxrcnn a t;:?~! sLabil.i.ser
:! I
-. u
d r n b u f f e r scl;;it l;.ji firtm!.al. v o l ~ u n e1.00 rr1.L ( i ~ j
10 1~1.( :/ j di.c:~tfipL!r 5 ~11( b ) :,tail
(;arnl,!.~r:~ncii.i$jkuk);:fij. pad;: s u h u 60 C selarna 30 m e n i t
A n a l i s a la j i e r e d ~ ~ l r s i metode ":;haf f c r cor110gy" Garnbar
13.
p r o s e d u r p e n ~ l l j i a na i r t i f i ' c a s ae'al enzim a r n i l o g l u k o s i d a s e d a r i ~ I s P e r g i l l u s n i c e r Jdsl/liRr
1. A n a l i s a Gula P e r e d u k s i N r t i f i t a s enzim d i u j i b e r d a s a r k a n kemampuannya untulr ulenghasilkan g u l a peredulrsi d a r i p a t i s e p e r t i t e r c a n t m pada gambar 1 4 . B a s i l p e r l a k n a n enzim t e r h a d a p s u b s t r a t sebanyak 15 m l l a r u t a n
1
Diambil 5 m l dan d i e n c e r k a n dengan aquades samnai 1 0 m l larutan
,
Diambil 1-m l ~ i t a m b a h k a n5 n l p e r e a k s i somogy, d i e n c e r k a n dengan aquades sampai volume 1 0 ml I
Tabung ditempatlran dalam a i r mendidih selama 1 5 m e n i t I
Tabung dl.dlnginkan pada air a i e n g a l i r selama Lt ntenit
I \L
D i tambahkan m e l a l u i t e p i t a b u n g sebanyak 2 ml l a r u t a n iodium o i r s a l a t dan 3 ml I12S0,+ 2N I
\I/
Tabung digoyang p e l a n - p e l a n sampai tembaga o k s i d a l a r u t , l a l u d i b i a r k a n dalam a i r d i n g i n selama 2 5 m e n i t I
\b
d i t i t r a s i dengan l a r u t a n t i o s u l f a t 0.005 N menggunakan k a n j i s e b a g a i indikator Garnbar lL+. P r o s e d u r a n a l i s a g u l a p e r e d u k s i metode " s h a f f e r s o t ~ i o g y (Somogy, ~~ 1945)
. Penghi tungon
i i k t i f i tcis drrzim
P e r h i t u n g a n a k t i f i t a s enzim ami.loglu1rosidase d i dc~cariszn a t a s periii.tuli(:ali
1;u:L"c peredulrsi seba.gai g l u -
!rosn yang t i i h a s i l k a n d a r i per!.akuan
t i terlarut.. i
enzim terhatiap pa-
S a t u u n i t ; i l r t i f i . t a s d i d e f i n i s i l i a n seba-
j u m l o l ~ e n z i ~ nyans di.yel-lulian untulr membebaslran s a -
tnerii.t pirda k o n d i s i realcsi t u mi!rro r:iol glulrosa, t%;~!) t e r t e n t u a t a u jumlah mol glulcosa yanc d i h a s i l k a n seua; ii;ni a l r i b a t perlalcuan e11zj.m t e r h a d a p s u b s t r a t .
2ktifi-
t a s s p e s i r i i r d l d e f i n i s i k a i - i s e b a g a i u n i t a k t i f i t a s per. m i l l i ~ r a mp r o t e i n yang di.tentuktu1 dengan rnetode Lowry delican b o v i n e e e m albuirrin s e b a g a i staridas. Cara p e r h i t u n g a n u n i t a k t i f i t a s eilzim amiloglubos i d a s e s e o a g a i b e r i i r u t : selisi1.l h a s i l ti t r a s i blarilio dengan h n s i l t i t r a s i sampel (:I 1r11 t h i o s u l f a t 0.005 IJ) dirnasul~kanire persamaan somogy :
mg d e k s t r o s a = (0.1099 x -4) + 0.048 t i a s i l p e r i i i tuncan d i d a p a tkan jumlah d e l r s t r o s a (i3, mg j
,
cehingga 1 i n i t a k t i f i t a s tiapat d i h i t u n g s e b a g a i b e r i -
Uni t a k t i f i t a s enzirn (13) x (1000) x F a k t o r p e r milliliter f i l t r a t = aenaenceran enzim 180 x 5 x 30 menit
-
A k t i f i t a s s p e s i f i l i = l i n i t a k t i f i t a s (iJ/rnl f i l t r a t ) Kadar p r o t e i n (mg pfot./rfll)
?..arutan :;tan:lar. b o v i n e serun! a l bumin b e r b a g a i ::orisentrar-;i.
:.;n:npcl. cn:~ioii r e r i n g k z s a r sehanyak 5.0 in$, cl-iltir~ttkan daLtirn 1.0 ~1 l a r l t t a a (0.5 rng/ml)
(a)
i;i arnl~.i.l1 1111 (::) a t a u (b) .d i teinii~ail!.;c.~n:j r n l p e r e a k s i
i1~11
C
!(ib-i.ni-i.:an 1.0 m e n i t
l;itanibahkan
0.5 m l p e r e z l i s i E arlran 30 :nenit
i
t lc-cmpj.~,nn1 0
G;imbar 1::.
s o r b a n s i pada i..;mnjang gelo!ilbang 500 ntn
P r o s e d u r a n a l i s a p r o t e i n enzirn dengan metode g l l o ~ ~ r (Lowry, ylt 1951).
IV.
A.
I-IASZL DAN PEI4BAIiASAIi
PRGDUKSI ENZIM
l o Pertumbuhan K a t u r A ~ a e f f f i l l u Sn i ~ e r Sebelum t a h a p p r o p a g a s i a v i d dalam l a b u e r l e n m e y e r d i m u l a i , dilalcukan penghitungan jumlbh s p o r a b i a k a n rnurni A s a e r r i l l u ~
L>l/NRRI, A-11,264 yang a d a da-
lam a g a r m i r i n g s e t e l a h u s i a empat h a r i ,
Penghitungan
j u ~ n l a hs p o r a d i l a k u k a n dengan metode haernocytometer dan a g a r cawan.
H a s i l penghitungan memperlihatlcan bahwa
jumlah s p o r a yang ada dalam a g a r m i r i n g r a t a - r a t a
5.87 x 1 09 spora/ml, s e m e n t a r a jumlah s p o r a yang h i d u p r a t a - r a t a 2.56 x 1 07 spora/ml. Tahap p r o p a g a s i awal dalarn l a b u e r l e u m e y e r d i l a k u lran dengan penambahan i n d u s e r sebanyalc 2.0 gram p e r lit e r media aengan viaktu f e r u l e n t a s i 96 jam.
I n d u s e r mal-
t o s a ditagbahlcan s e t e l a h f e r r n e n t a s i ber-langsung 48 j a m * Jumlah s p o r a yang d i h a s i l l c a n t a h a p p r o p a g a s i awal r a t a r a t a 1.77 x 1 . 0 ~spora/ml, ~ h i d u p r a t a - r a t a 2.1 x 3.0'
sedangkan jumlali s p o r a yang spora/ml,
S e l a n j u t n y a m i s e l i a h a s i l p r o p a g a s i awal digunakan s e b a g a i inokulum untuk memproduksi enzim dalam f e r mentor s k a l a " p i l o t p l a n t " .
F e r m e n t a s i kapang pada pe-
n e l i t i a n i n i menggunalran tnolases s e b a g a i sumber karbon dan k o n s e n t r a s i inolrulum yang d i p a k a i empat p e r s e n (v/w).
Kondisi p r o s e s d i k o n t r o l pada suhu 3 5 O ~ , pii
4.5, kece-
p a t a n a e r a s i 1 VVM dan k e c e p a t a n a g i t a s i 300 rpm,
In-
d u s e r m a l t o s a ditambahkan s e t e l a h f e r m e n t a s i b e r l a n g ~ sung 48 jam.
1.laltosl ditambahkan sebanyak 2.0 gram
p e r l i t e r media. I n d u s e r m a l t o s a ditambahkan s e t e l a h
48
jam fermen-
t a s i dengan maksud untuk memperokeh k o n d i s i yang p a l i n g o p t i m a l dalam s i n t e s a enzim. (1972) s e t e l a h
Menurut B a r t o n e t a l '
48 jam f e r m e n t a s i pH media t u r u n mende-
k a t i 2,O dan pada pH i n i l a h penambahan i n d u s e r m a l t o s a menghasilkan a k t i f i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e yang pal i n g tinggi.
Hal i n i didukung o l e h p e n e l i t i a n Reese
(1972) yang menyatakan bahvra u n t u k menghasilkan enzim dengan a k t i f i t a s o p t i m a l , penambahan i n d u s e r yang t e p a t a d a l a h pada saat k o n s e n t r a s i s u b s t r a t yang t e r s i s a da-
l a m media t i n g g a l s e d i k i t .
48
telah
jam f e r m e n t a s i .
a a l i n i d a p a t t e r c a p a i selslenurut S o e k o p i t o jo (1986)
penambahan i n d u s e r m a l t o s a 2.0 gram p e r l i t e r media pada s a a t f e r ~ n e n t a s ib e r l a n g s u n g 48 jam yang kemudian d i l a n j n t l r a n sampai 96 jam irienghasilkan a l r t i f i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e p a l i n g t i n g g i dalam produlrsi menggunakan I1shakerl' dengan k e c e p a t a n a g i t u s i 200 rpm. A n a l i s a a k t i f i t a s f i l t r a t e n z i n pada p a t i t e r l a r u t 2.0 p e r s e n d i l a k u k a n pada suhu 60°c, meni t.
pH
4.5 selama 30
A k t i f i t a s f i l t r a t enzim yang d i h a s i l k a n s e t e l a h
f e r ~ n e n t a s i96 jam pada p e n e l i t i a n i n i a d a l a h s e b e s a r
1.82 unit/!nl.
Menurut Balcar ( I 986) l l s c a l e upr1 p r o d u k s i
enzim a m i l o g l u k o s i d a s e pada f e r t n e n t o r rlengan mengguna!can s u ~ n b e rlrarbon d a r i molases dan k o n s e n t r a s i 151,JFIyRT.,
A.
niger
A--1.L,26Lt sebanyalc L+ p e r s e n s e r t a pada k o n d i s i
opt,imal., y a i t u suhu 3 5 ' ~ p~H
4,5
s e r t a lcecepatan a e r a -
s i 1 VQ-1 eienghasilkan a l c t i f i t a f i enzim t e r t i . . n g g i pada
tangiri f e r m e n t o r b e r a g i t a s i 300 rpm,
& t i f i t a s enzim
yang di.laporlian Bairar (1986) s e b e s a r 2,341 unit/rnl t r a t enzim.
fil-
Perbedaan h a s i l i n i d i d u g a d i s e b a b k a n ke-
i:epatan agita83, p a d s s a l a h s a t u f e r m e n t o r s u l i t d i a t u r , Kecepatan a g i t a s i t i b a - t i b a d a p a t mencapai 800 dangkan k o n d i s i yang d i p a k a i a d a l a h 300 rpm.
se-
rpin;
Jelas
f l u k t u a s i kecepatan a g i t a s i s e p e r t i i n i berakibat t e r haiiap a l c t i f i t a s enzim yang d i h a s i l k a n o l e h milrroba yang bersangkutan. F a k t o r - f a k t o r yang rnempengaruhi pertumbuhan A.
m
a-
dan a k t i f i t a s enzim yang d i h a s i l k a n a n t a r a l a i n :
rheologi suspensi kultur, a l i r a n turbulensi akibat agit a s i pada t i n g k a t t e r t e n t u , l r e t e r s e d i a a n z a t - z a t makanan dalarn rnedia dan m e t a b o l i t yang d i h a s i l k a n selama f e r r n e n t a s i ( S t a n b u r r y dan Vlhitalrer, 1 9 8 4 ) . 2 , A n a l i s a P r o t e i n Enzim Penentuan k a d a r p r o t e i n enzim d i d a s a r k a n atas k u r va s t a n d a r hubungan jumlah p r o t e i n b o v i n e serum albumin dengan a b s o r b a n s i pada panjang gelombang 500 nm.
Kur-
va s t a n d a r Bang digunakan dalam p e n e l i t i a n i n i d i d a s a r itan pada k u r v a s t a n d a r p e n e l i t i a n Uakar (1986).
Kadar P r o t e i n ( ~ . g / r f l l ) Gan~bar1 6 .
Hubungan a n t a r a k a d a r p r o t e i n ( , W g / ~ l j dengan a b s o r b a n s i pada 2 = 500 nm
Garnbar 1 6 memperlihatlran hubungan a n t a r a j m l a h pr0t;ei.n dengan a b s o r b a n s i pada p a n j a n g gelombang 300 nm
yang bersif a t l i n i e r .
Kadar p r o t e i n f i l t r a t enzim awal
sebellim pelnelratan s e b e s a r 6 630 w g / n i l ,
sedangkan k a d a r
p r o t e i n f i l t r a t enzim s e t e l a n pemekatan s e b e s a r
B l20pJg/!nl.
Kadar p r o t e i n yang t e r d a p a t dalarn enzinl
Iceri rig lcasar dengan k o n s e n t r a s i 700 ,%g/inl enzim a d a l a h s\?besar
515 ,%g/ml.
I n i b e r ~ r t ienzim icering k a s a r me-
n:l;anr?nng p r o Lein s e b e s a r
73.57 p e r s e n .
Iiasil i n i l e b i h
k e c i l d a r i . i i a s i l p e n e l i t i t i n dalrar (1906), y a i t u s e b e s a r fi1t
.53 p e r s e n .
3. P u r i f i l r a s i Enzim Untuk mengurangi volume enzim, d i l a k u k a n dengan pelriekatan menggunakan t t f r e e z e c o n c e n t r a t i o n T t , s e h i n g g a :::emudahkan penambahan ammoniutn s u l f a t .
I'emelratan 1.9
k a l i d a r i f i l t r a t avial se'lama 1.0 h a r i n~enaikkan a k t i f i t a s menjadi 2.60 iinit/ml t a s ~2:ial.
f i l t r a t a t a u l.Lt3 k a l i a l r t i f i -
Apabila p r o s e s pernelratan p r o p o s i o n a l dengan
peningkatan a k t i f i t a s , malra s e t e l a h pemekatan t e l a h t e r j a d i penyusutan a k t i f i t a s s e b e s a r
%4,4 p e r s e n .
Hal i n i
d i s e b a b k a n k a r e n a s e b a g i a n enzim membeku bersama-sama e s dan menempel pada k o i l p e n d i n g i n , s e h i n g g a banyak enzirn yang terbuang.
Pemelratan dengan metode I t f r e e z e
c o n c e n t r a t i o n T 1merupdran s u a t u c a r a u n t u k menghilangkan l r e l e b i h a n a i r dengan mendinginkan l a r u t a n s e d i k i t demi s e d i l c i t dibawah t i t i k beku a i r a t a u dengan c a r a menemp a t k a n l a r u t a n dibawah u n i t p e n d i n g i n r e f r i g e r a t o r dan l a p i s a n e s yang t e r b e a t u l r dibuang (Schwimmer, 1 9 8 1 ) . Metode i n i s e l a i n memekatlian k o n s e n t r a s i enzim juga taemekatkan garam s e h i n g g a d a p a t meriyebabkan t e r j a d i n y a d e n a t u r a s i p r o t e i n . d a n penurunon a k t i f i t a s enzim' Pemehstan'dengan menggunakan metode " f r e e z e concent r a t i o n " i n i t e r n y a t a k u r a n g e f i s i e n k a r e n a memerlukan waktu yang l e b i h lama jilra dibandingkan dengan menggunakan e v a p o r a t o r .
Dengan " f r e e z e c o n c e n t r a t i o n " memer-
l u k a n waktu 1 0 h a r i untulr meinekatkan enzim 1.9 k a l i , sedanglran pemelratan dengan ' % v a p ~ r a s 1i ~0 ~k a l i men~erlukan
waktu llanya ') jam.
Penyusutan a k t i . f i t a s yang t e r j a d i
pada pemelratan dengan e v a p o r a t o r juga l e b i h k e c i l .
Ua-
1,:ar (1986) melaporkan bahwa s e t e l a h pemelratan 1 0 i i a l i selama 9 jarn t e r j a d i penyusutan a k t i f i t a s hays 3.15 persen. Tahap b e r i k u t n y a a d a l a h f r a k s i o n a s i p r o t e i n enzim, pengendapan, s e n t r i f u g a s i dan d i a l i - s a .
Tahap a k h i r
a d s l a h p e n g e r i n g a n beku enzim dengan " f r e e z e d r y e r " . Hasil u j i a i r t i f i t a s
.
enzim l r e r i n g l r a s a r s e b e s a r i. ' ) i : j i
;rni.i:Jml f i l t r a t enziai a t a u s e b e s a r 2.9616 unit/mg protein.
J i l r a dibandingkan dengan f i l t r a t awal t e r j a d i
penurunan a k t i f i t a s s e b e s a r 16.19 p e r s e n yang b e r l a n g sung selama p e r s i a p a n dan pemurnian enzim,
Hasil i n i
tali jauh b e r b e d a dengan h a s i l yang d i p e r o l e h o l e h Baliar (1986) yai.tu s e b e s a r 1.338 unit/ml
f i l t r a t elazim,
Kendemen enzim k e r i n g k a s a r yang d i h a s i l k a n sete.l a h n i e l d u i t a h a p pemekatan f i l t r a t , f r a l i s i o n a s i , pengendapan, s e n t r i f u g a s i , d i a l i s a dan p e n g e r i n g a n belcu a d a l a h s e b e s a r 0.0187 p e r s e n (w/w s u s p e n s i lrul t u r ) a t a u 0.0336 p e r s e n (w/v f i l t r a t enzim).
Hasil i n i l e -
b i h k e c i l d a r i p a d a rendemen yang d i ~ ~ e r o l eBalrar h (1986) y a i t u s e b e s a r 6.058
persen ( i ; / w s u s s p n s i k u l t u r ) a t a u
0.0696 p e r s e n (w/v f i l t r a t enzim). Besarnya rendemen d i p e n g a r u h i o l e h waktu pengendapan s e t e l a h i r a k s i o n a s i ( s a l t i n g - o u t ) menggunalran ammci!ium s u l f a t .
Nozaiki dan iiayaislli yang d i k u t i p o l e h
L i l y (1979) tmenyatakan bah!va waktu mininium pengendapan se1an:a 1 5 m e n i t , dim:ina rnakin lama walrtu pengendapan iualiin t i n g g i rendemen yang d i d a p a t k a n . B
. STABILITAS ENZIM AMILOGLUKOSIDASi3 1. Pengaruh Gararn CaC12, K2SOli dan K G 1 B a s i l p e n e l i t i a n njenunjukkan bahwa CaC12 memberilran l r c s t a b i l a n t e r h a d a p enzim a m i l o g l u l r o s i d a s e , sedangkan K2S0,+ dan K C 1 tidalr rriemberilran pengaruh yang n y a t a t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim s m i l o g l u l r o s i d a s e .
Pengujian
t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim dengan adanya garam-garam 0 d i a t a s dilokulran pada suhu 70 C selama 60 inenit dan pIi 4.5.
U k t i f i t a s r e s i l l u enzim amiJ.oglukosidase d i t e n -
tukan dengan menggunakan p a t i t e r l a r u t dua p e r s e n s e bagai s u b s t r a t .
Campuran d i i n k u b a s i pada suhu 60°G
selnma 30 m e n i t dengan pH 4.5. Gambar 1 7 dan 18 memperlihatkan pengaruh CaC12,
I( SO
dan K C 1 t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim a a i i l o g l u k o s i -
dase.
CaC1,L memberikan k e s t a b i l a n t e r t i n g g i d i i k u t i
2
4
K2S04 dan I i C 1 .
hienurut IIochstein dan Schrnmm (1971)
garam i n o r g a n i k memberikan s t a b i l i t a s enzim dengan men e t r a l i s a s i k e l e b i h a n ti~uatane l e k t r o s t a t i k dalain molek u l enzim, s e b a b b i l a t i d a k d i l i n d u n g i d a p a t t e r j a d i kerusakan s t r u k t u r q u a r t e n e r molekul p r o t e i n enzim.
Gambar 13.7,
-
Pengaruh C a C l... t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim amilog161cosidase d a r i gillus I251/:~IHKL A - l l ,264.
a-
iionseti trasi s t a b i l i s e r ( b i )
Gambar.lae P e n g a r u h i<-Sul uan K.IC1 t e r h a d a p s t a b i / l i t a s enzirn ;iih.loglt~lrosjtiase d a r i &' p e r ~ i l l u sn i i : e r i,51/111
Pad:, izo!isentrasi 0.ti ~ / 1 ,c:ar:l, nai1rl;an n i - t i f i t a s r e s i d u ? p e r s e n .
rnernberilran ice-
-.
iienaililcan a i r t i f i -
t n z resicill t e r t i n g c i d i . p e r o l e l ~densan penambahan G a C l 2 :;+:besar 1.0 g / l ,
dimana a ! < t i f i t a s r e s i d u nieningkat
r a n g lebi.11 1 2 p e r s e n .
,Si:.cianglran 1:onsentr'asi.
liii-
CaCl;, c-
1 . 5 g / l i:culya niernberiir;in 1cenaiI.iian a l c t i f i t a s r e s i d u sc?besar ti pel-sen.
I ; i n bas !consen t r a s i CuC1;!
l n j u kenaiklran a l i t i f i t a : ;
r e s i d u sietiui.tul d e n ~ a brnenirig-
.
i(-.atnya l r o t i i ~ e n t r a s ii:ac:l. '-. ., i ~ i r t i . f i t a i ;resi.du i.ni !::,i:l?
'.
Mei~urnnnyal a ju irenail.;lian lrarena pacia l r o n s e n t r a s i
diti\ii;zt
d i a t a s 1.0 g / l ,
1 . 0 g/1,
i;~l::i.i:i
?~r~!iloglu!
.,
11,;:llami t i e r l a t t ~ r a s i . i2:enurut i-iourisan (l98Ll-j CaCltl me!iii i e ~ i l r a n:to:i~aruh s t a b i l i s s s i . pcttia i i o i i s e i i t r a s i rendail, nalnun menyebabl~antletisturc.tsi pada l r o n s e n t r a s i t i n g g i . niernberi.Iinn k e s t a i:l.VO ( l g e ; : ) Iaenyatakan b;iiiwa GaCl., L b i l a n <-a!:! iilase t e r t i n g g i patin konseiltrafii 0.5 g/l, na!:!un di;i t;:s konsen t r a s i t e r s e b u t perigaruh s t a b i l i . s t i -
si c e n d e r ~ i n gk o n s t a n . LVise:ilan
(1984) menyebutlinn
bai~wa Ca
'nc.rilran I i c c t a b i l a n t e r i ~ a t l z pthermolisfin. siru1:turn
i:i
++
c:apat mein-
'Thermolisin
dibentuli !~cr:;:i!na o l e h i k a t a n e l e k t r o s ta-
ti!
i-i
(d11:i ! ) e r r1ol.clrii1) dan g t ~ g ~ ~ s
k:.~r.boksil.:lt a t a u gugus irnrbonil.1 dnlam bagi.an moleicul
y a n g berr-;ii'ztt hidrofon:ii~.
Ca
++
l a s e ter!i:?(i:ip d e n a t n r a s i p;in2E;.
d a p a t melindungio( -ainiA :(
+1
!nenempatlran d i r i
l,:tla i!cnt;.~ii d i s u l f i d a ii:il~i;! ;:er.cinann;ra s e b a g a i
' e l 2.
i e n g a r u h s t a b i l . ? . s e r ' terlinclal) s t a b i l i ti*:; eiizirn a r n i l o g l u ! i o s i d u s e d a r i ! I s u e r ~ i l I . u s :ii.ger L51/Ni?1
enis stabiliser
CJ
IConseri t r a s i stabiliser
f l l ~ t i f i t c i sav!al ( u n i t/ml)
1.5550
0
~ L a b i l i s e renzirn.
! G c t i i i t & s resiciu (uni t/mL ) 0 >.712j< 0
blenurut Wiseirian (19tjli) rnenyehili.lran
.-.i.i\ia ' i o n - i o n logarn d i ' l a i r j r k a n clapat meml:ertinggi
tA
b i l i t a s e!!::irn
terhndal: y:!nas.
Tabei 2 ~ne~nper.liii-?t!:jilbiih'!!a
Cat:12
t i i l a k mernberi-
k;:n pen&z!i.i~hb e r a r t i . l.ir*i!.ttla-[).a i r t i f i . - h a s cica1 er!::iiii 1::;1;ulros-i . , ; ? s e . 13aliiran ci;i~i
sta-
1.0 .{:;/l,' aktifita:;
~.:oi:i
ntris-
~,encit!ibahsn CaC:L-, 0.5 &/I <-
;:-!!;!I enzim a m i l o g l r i l r o s i d a s e l e -
bi.11 i r e c i l . u i l a dibandi-nglian tienijan a i r t i f i . t a s a~val t a n -
pa penarn!i:;iian
1.5 g/l 7
3
.
1 .T.,?l
CaC12.
Xlrrin t e t a p i pada penarnbahun CaC12
LC:? j a d i k e n a i k l i a n z i k t i f i t a s a w a l enzirn, air tii'i-
ocizim a m i . l o g l u k o n i d a s e meningirat fiienjusii Uf:-i \;,'m1
.
Menurut '*Viseman ( 1 9 0 ~ t )s t a b i l i t a s k o n f o r m a s i enzim d i p e r b a i k i o l e h i o n Ca,
Psda k o n s e n t r a s i CaC12 0 . 5
dan 1 . 0 g/l, CaC12 b i s a b e r s i i a t i n h i b i t o r rneskipun kecil.
Akan t e t a p i s i f a t i n h i b i t o r i n i j u g a d i i k u t i o l c h
s i f a t s t a b i l i s a s i t e r h a d a p enzim t e r s e b u t .
Hal i n i d i -
ciulrung o l e h Vdiseman (1984) yailg iaeriyatakan bahwa i n h i b i t o r yang ~ n e n g i k a t s i s i k a t a l i t i k s e r i n g memberikan s t a b i l i t a s enzim.
I n h i b i t o r enzim akan rnernper1ih:ikkan
tahanan yang l e b i h b e s a r t e r h a d a p d e n a t u r a s i panas. K2S04 r e l a t i f t i d a k mernpunyai pengaruh yang b e r a r -
t i t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e .
Bahkan
padn penambahan 0.2 M K2S04, a l r t i f i t a s r e s i d u j u s t r u tnenurun s e l r i t a r dua p e r s e n d j b;indingkan t a n p a penambahan K2SO4.
Fada k o n s e n t r a s i K2SOLt 0.4 M, s t a b i l i t a s
( a k t i f i t a s r e s i d u ) s e d i k i t meningkat, y a i t u s e k i t a r
1.5 p e r s e n .
Sedanglran penam'oahan 0 - 6 I4 K2SO1+ meningkat-
kan s t a b i l i t a s a m i l o g l u k o s i d a s e s e b e s a r t i g a p e r s e n ( l i h a t gambar l t i ) ,
Terhadap a l r t i f i t a s a v ~ a l , K SO
2
Lt
justru
inemberilran pengaruh nega t i f , y a i t u semalcin t i n g g i $ons e n t r a s i K SO yang ditambahkan, a k t i f i t a s awal enzim 2 Lt semalrin menurun. H a l i n i d a p a t d i l i h a t pada t a b e l 2. Demilrian juga dengan K C l , r e l a t i f t i d a l r niemberikan pengaruh u e r z r t i t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim amiloglulrosiaase.
Pada penambahan K C 1 0.2 1.1,
s t a b i l i t a s (aktif.itas
r e s i d u ) hanya meningkat 0.3 p e r s e n , bahlran d i a t a s lr'ons e n t r ; s i t e r s e b u t , K C 1 mcnurunkan a l c t i f i t a s r e s i d u ( l i -
t
b
1 ) .
Gari t a b e l d t e r l i h n t bahwa penamballan
55 I:C1
t i d a k iiiemberikan pengaruh b e r a r t i t e r h a d a p a k t i f i t a s
avial enzim srfliloglukosidase.
Bahkan a k t i T i t a s avial u a p a t
dilcatakan t e t a p dengan adanya K C 1 . Menurut Klibanov (1983) pengzruh CaC12 t e r h a d a p
O( -2milase s a n g a t s p e s i f i k , CaC12 memberi k e s t a b i l a n t e r hadap d e n a t u r a s i p a n a s ,
Sementara i t u Monsan (1584) me-
nyatalcan bahwa peranan s t a b i l i t a s l r a t i o n d i v a l e n caii a d a l a h k h a s , dimana ~ a + + t e r l i b a t dalam pembentukan jemb a t a n garam dengall gugus beraiuatan n e g a t i f dalam molekul enzim.
iial i n i diciuga juga b e r l a k u t e r h a d a p s t a b i l i t a s
enzim a m i l o g l u k o s i d a s e
.
Klibanov (1983) meny ebu tka11 bahwa pembukaan molelcul enzim o l e h 1,anas ( d e n e t u r a s i ) d a p a t d i t u r u n k a n dengan intramolekul cross-links.
Jembatan ( c r o s s - l i n k s ) i n i
d a p a t berupa i k a t a n s e p e r t i i k a t a n d i s u l f i d a a t a u nonk o v a l e n s e p e r t i jembatan garam, llcross-lin!csrl dengan i o n logam b i v d e n dan s e b a g a i n y a .
S e l a n j u t n y a Wiseman ( 1 9 8 4 )
llcross-lin!<s:f akan meningkatkan kekakuan ( r i g i d i t y ) konforrrinsi enzim.
Menurut Henley dan Sadana (1984) lcekakuan
Bonformasi enzim d a p a t meningkatkan s t a b i l i t a s enzim. S e l a n j u t n y a k o n s e n t r a s i CaC12 1.0 g / l yang memberi!can k e s t a b i l a n t e r t i n g g i d i t u n a k a n untuis p e n ~ u j i a npengar u h pi-1 dan sutlu t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzim amilogluirosidase.
2. Pengaruh pH
H a s i l p e n e l i t i a n meinperlihatlcan bahwa pH s a n g a t rnenentukan s t a b i l i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e .
4.5
Pada pI-I
enzim a r ; ~ i l o g l u k o s i d a s emenunjuldcan s t a b i l i t a s t e r -
tinggi.
Penentuan pengaruh pH t e r h a d a p s t a b i l i t a s en-
zim amiloglulcosidase di.lalcukan deiigan p e r l a k u a n ( p a i n i r u b a s i ) l r i r u t a n enzim pada b e r b a g a i pii
6 clan 7 ) , suhu 60°c selama GO tnenit.
( 3 , 4, 4,5, 5,
S e t e l a h prainku-
b a s i s e l e s a i kemudian pH d i a t u r menjadi 4.5
dan a k t i f i -
t a s r e s i d u d i t e n t u k a n dengan menggunalran p a t i t e r l a r u t dun p e r s e n s e b a g a i s u b s t r a t .
P e n g u j i a n a l c t i f i t a s enziln
d i l a k u k a n pada suhu i n k u b a s i 6 0 ' ~ selama 3 0 m e n i t , Gambar
1 9 memperlihatkan pengaruh pH t e r h a d a p sta-
b i l i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e . pH
T e r l i h a t bahwa pada
4.5 a m i l o g l u k o s i d a s e mernberilran a k t i f i t a s r e s i d u
( s t a b i l i t a s ) t e r t i n g g i , y a i t u s e b e s a r 81.34
persen,
H a s i l i n i talc j a u h berbeda dengan p e n e l i t i a n yang d i l a kuiran o l e h iic)VO (1985) yang rnenyebutkan bahwa enzim ami1ogl:litkosidase d a r i A s u e r ~ illu g r a n pH
4.5
-
5.5.
s t a b i l pada k i s a -
Sedangkan menurut Byun dan B e i k u s
(1985) enzim a m i l o g l u l t o s i d a s e d a r i C l o s t r i d i u m thermgh s d r o s u l f u r i c u m s t a b i l pada k i s a r a n pH
4.5
-
6,
Pada pX 4 enzim a m i l o g l u k o s i d a s e masih memberikan n k t i f i t a s r e s i d u 61.74 p e r s e n dibandingkan dengan 56.18 p e r s e n pada pH 5.
Sahkan pada pH 7 enzim a m i l o g l u k o s i -
d a s i hanya r!lemililri a k t i f i t a s r e s i d u 9.36 p e r s e n .
A k t i f i t a s r e s i d u (76)
Gambar 1 9 ,
Pengaruh pIi t e r h a d a p s t a b i l i t a s enzirn arniloglukosidase d a r i A 6 ~ e r ~ i l l u g& s p~ A-11,264 dengan adanya s t a b i l i s e r CaC12 1.0 dl.
hienurut Klibanov (1983) pada l r o n d i s i normal s t r u l r t u r a k t i f enzim d i j a g a o l e h keseirnbangan lrelruatan non-koval e n , y a i t u i k a t a n h i d r o g e n , h i d r o f o b i k , jembatan garam dan Van d e e r Vlaals.
S e l a n j u t n y a Monsan (1984) menyata-
kan bahwa nioriifikasi pH akan tnenyebablran perubahan i o n i s a s i gugus asam dan basa yang mengairibatlran lrerusakan jembatan garam.
Rusalrnya jembatan garam menyebabkan
menurunnya a l r t i f i t a s dan s t a b i l . i t a s enzim yang b e r s a n g kutan. Dalam p e n e l i t i a n i n i juga d i p e r l i h a t l r a n bahwa pII yang memberikan s t a b i l i t a s t e r t i n g g i t a k jauh b e r b e d a dengan pH yang memberikan a k t i f i t a s t e r t i n g g i , y a i t u PI-i
4.5.
H a l i n i d i p e r k u a t o l e h p e n e l i t i a n Iiyun dan
Zeilrus (1985) bahwa pH o p t i m a l b e k e r j a n y a enzim amslog l u k o s i d a s e d a r i Clostrj.dium thermohydrosulfuricum b e r l r i s a r ;antara pH 4
-
G dan i n i t a k jauh b e r b e d a de-
ngan k i s a r a n pH s t a b i l i t a s , y a i t u pH 4.5
- 6.
Demiki-
a n juga NOVO (1985) menyebutkan bahwa pH o p t i m a l u n t u k a k t i f i t a s enzim a m i l o g l u k o s i d a s e d a r i kapang A s o e r ~ i l l u s
nSFef tasnya
adalah lt
4.5
-
- 5,
s e m e n t a r a i t u k i s a r a n pH s t a b i l i -
5.5.
Pada pH yang t e r l a l u asam, y a i t u pH
3, a k t i f i t a s
r e s i d u enzim a m i l o g l u k o s i d a s e menurun dengan tajarn hingga t i n g g a l
'!+,20 p e r s e n , tiemilrian juga pada pH yang
t e r l a l u basa (pH 7 ) enzim a m i l o g l u k o s i d a s e r e l a t i f s u d ~ ht i d a k s t a b i l l a g i , a k t i f i t a s r e s i d u n y a t i n g g a l 9.36
persen,
Hal i n i d a p a t d i m e n g e r t i k a r e n a pada pH yang
t e r l a l u elifitrim ( t e r l a l u asam a t a u b a s a j enzim alcan mengslami denaturasi.
Menurut Hodwell (1983) bahwa pada
pX yang t e r l a l u e k s t r i t n , enzim akan mengalami d e n a t u r a -
si s e h i n g g n k e h i l a n g a n a l r t i f i t a s k a t a l i t i l m y a .
Selan-
j u t n y a Rodl:iell (1983) menyatdcan bahwa bentulr g r a f i k a l r t i f i t a s pI: d i t e n t u l r a n o l e h f a l r t o r - f a k t o r d e n a t u r a s i enzim pada n i l a i pH yang s a n g a t t i n g g i a t a u r e n d a h , pengnruh t e r h a d a p keadaan muatan l i s t r i k s u b s t r a t a t a u enzim dan perubahan konformasi enzim b i l a pi1 diubahubah. Menurut F o g a r t y (1983) t i t i l r i s o c l e k t r i k enzim a m i l o g l u k o s i d a s e a d a l a h 3 - 4 ( j e n i s I ) dan 4.0
11).
Pada pII
4,5
(jenis
d i p e r k i r a l r a n enzirn a ~ n i l o g l u k o r i d a s e
bermuatan n c g a t i f . Rodwell (1983) menyatakan bahsa pH b e r p e n g a r u h t e r h a d a p keadaan muatan l i s t r i k enzim rnaupun s u b s t r a t . Perubahan muatan d a p a t mempengaruhi a k t i f i t a s dan s t a b i l i t a s , b a i k dengan perubahan s t r u k t u r maupun dengan perubahan ~ o u a t a npada r e s i d u asaln amiilo yang b e r f u n g s i mengikat s u b s t r a t . .
Hal ini d a p a t d i j e l a s k a n dengan
mekanisme r e a k s i s e b a g a i b e r i k u t : Zn z-
+
SH+
---------9
EnzSH
Pada n i l a i pH yang r e n d a h Enz- &an d i p r o t o n l s a s i dan k e h i l a n g a n muatan n e g a t i f n y a .
Pada n i l a i pH yang t i n g g i , SH'
:
akan t e r i o n i s a s i
dan lcehilangan muatan p o s i t i f n y a .
-------- p
SH+
S + H +
Itarena bentuk yong ' . e r e a k s i hanyalah SH
+
dan Enz-
mdca n i l a i pH yang e1cstrj.m alran :iienurunl;an l r o n s e n t r a s i e f e l r t i f Enz
-
dan SH',
s e h i n g g a wenurunkan k e c e p a t a n
.
realrsi.
3. Pengaruh Suhu H a s i l u j i a l s t i f i t a s menun jukkan bahwa suhu s a n g n t b e r s e n g a r u h t e r h a d a p s t a b i l i t a s ( a k t i f i t a s r e s i d u ) enzim a m i l o g l u k o s i d a s e .
idenuru t Wirahadi~usumah (1981)
pada suhu ynng t e r l a l u r e n d a h s t a b i l i t a s enzim t i n g g i namun a k t i f i t a s n y a r e n d a h , sedangkan pada suhu yang t e r l a l u t i n g g i a l r t i f i t a s n y a t i n g g i naniun s t a b i l i t a s n y a r e n dah. Gambar 20 memperlihatkan pengavuh suhu t e r h a d a p a k t i f i t a s r e s i d u ( s t a b i l i t a s ) enziln amilogluIrosidase.
0
T e r l i h a t bahwa pada suhu 60 C, r e l a t i f masih s t a b i l .
enzim a m i l o g l u l r o s i d a s e
Bahkan pada 15 menit p e r t a n a
p e r l a k u a n , enzim a m i l o g l u l r o s i d a s e t i d a k mengalami penurunon a k t i f i t a s .
Baru s e t e l a h 30 menit perlalruan enzim
amiloglukosidase turun a k t i f i t a s n y a kurang l e b i h l i m a persen.
Dan s e t e l a h
45 dan 60 rnenit p e r l a k u a n , enzim
a m i l o g l u k o s i d a s e mengalami penurunan a k t i f i t a s r e s i d u berturut-turut beda den
1 4 dan 17 p e r s e n .
1b.l
i n i t a k jauh ber-
pengamatan IIyun dan Zeikus ( 1 9 8 5 ) yang
ilJ-tifj. tas r e s i a u (%)
l;/;.l-,tu p r e i n k u b a s i ( m e n i t ) Gambar 20.
P e n g a r u h s u h u t e r i l a d a p s t a b i l i tas enzirn a m i l o g l u l c o s i t i a s c d a r i A ~ j o e r i r i lul s n i r e r 1,51/iVRRL ii-11, 2611 dengan a d a n y a 1.0 g / l CaC12.
menyebutlsan bahwa enzim a m i l o g l u k o s i d a s e d a r i C l o s t r i diurn t h e r m o h y d r ~ u l f u r i c u ~~nn a s i hs t a b i l 60'~.
sampai suhu
Dernilrian j u g a inenurut i\lOVO (1985) enzim m i l o -
gluicosidase d a r i A s ~ e r ~ i l l u g
masih s t a b i l sampai
suhu 6 0 ' ~ . Pada suhu 6.5'~ t e r j a d i penurunan a l s t i f i t a s r e s i d u s e b e s a r 21 p e r s e n s e t e l a h 15 m e n i t p e r l a k u a n .
Setelah
30 m e n i t p e r l a k u a n , a k t i f i t a s r e s i d u menurun k u r a n g l e b i h 34 p e r s e n , 40 dan
Penurunan a k t i f i t a s r e s i d u s e b e s a r
45 p e r s e n t e r j a d i s e t e l a h p e r l a k u a n enzim selania
45 dan 60 menit.
Penurunan a k t i f i t a s r e s i d u i n i d i s e -
babkan lrarena ilcatan-ilcatan non-kovalen,
s e p e r t i ilratan
h i d r o g e n , i n t e r a l r s i h i d r o f o b i ! ~ , jembatan garam dan Van d e e r Waals yang b e r t a n g g u n g jawab t e r h a d a p p e n g e n d a l i a n a l c t i f i t a s e n z i m a t i k m u l a i inengalami k e r u s a k a n a k i b a t t i n g g i n y a suhu. f i t i f i t a s r e s i d u enzilii aniiloglu1rosid~:se turuti s e c a r a d r a s t i s yxda suhu 7 5 ' ~ ( l i 1 l a t g a ~ n b a 20 r )
.
Bahlian
s e t e l a h 60 iaenit perlalcuan, a l c t i f i t a s r e s i d u enziin t i n g g a kurang l e b i h enam p e r s e n .
Kecilnya a l r t i f i t a s
r e s i d u ( s t c ! . b i l i t a s ) i n i disebsblian k a r e n a pada suhu t e r s e b u t e n z i ~ na m i l o g l u k o s i d a s e mengalslni d e n a t u r a s i seliingga k e h i l a n g a n a l r t i f i t a s l r a t a l i t i l s n y a .
Menurut
bIounsan (1@81t) a l r t i f i t a s enzim s e c a r a l a n g s u n g berliubungan dengnn p e r l i n d u n g a n s t r i i l r t u r t i g a dirnensi d a r i molekul p r o t e i n enzim.
SeLan j u t n y a l ~ l i b a n o v(1983)
me~~yebutlrnn bahwa densan n c ~ i k n y as u h u ; i k a t a r i h i d r o g e n ,
liidrofobilr, i o n i k dan Van d e e r Waals menurun dan molek u l p r o t e i n enzim akan t e r b u k a ( u n f o l d i n g ) , Karena, pus a t a k t i f enzim s e l a l u t e r d i r i a t a s b e b e r a p a r e s i d u . asam amino dalam s t r u l r t u r t i g a dirnensi p r o t e i n enzim, rnaka pembukaan molekul p r o t e i n menyebabkan k e r u s a k a n p u s a t a k t i f dan enzirn m e n j a d i i n a l r t i f ,
l i d i n i diperkuat oleh
p e n e l i t i a n S e g e l (1975) yang menyebutlran bahwa molekul enzim memililri s t r u k t u r yang l e m b u t dan mudah r u s a k , J i k a molekul enzim menyerap e n e r g i t e r l a l u b e s a r a k i b a t n a i k n y a suhu, s t r u k t u r t e r s i e r &can t e r g a n g g u dan enzim alsan t e r d e n a t u r a s i , y a i t u l r e h i l a n g a n a k t i f i t a s k a t a l i t i k nya.
4. i i e t e r g a n t u n g a n K o n s t a n t a D e a k t i f a s i iy;nzirn Terhadap Suhu Gambar 21 dan 22 memperlihatkan pengaruh suhu t e r hadap n i l a i K o n s t a n t a D e a k t i f a s i (k) enzim a r n i l o g l u k o s i d a s e dengan adanya penambahan s t a b i l i s e r CaC12.
Penen-
t u a n n i l a i lr i n i didasarlran a t a s asumsi bahwa r e a k s i yang b e r l a n g s u n g merupakan r e a k s i ordo pertama.
Nilai
lr d i p e r o l e h d a r i s l o p e hubungan l o g ( a k t i f i t a s r e s i d u ) dengan waktu p r e i n k u b a s i (gambar 21)
.
Besarnya n i l a i k enzim masingsmasing g a i t u l ~ - ~ / m e n iulltuk t suhu 60°c, hu
3.37 x
9.74 x 1 0 - ~ / m e n i t untulr su-
6 5 O ~ , 13.04 x 1 0 - ~ / m e n i t untuls suhu 7 0 ' ~ dan 39.90 x
1 0 - ~ / l r i e n i t pada suhu
7 5 ' ~ ~Dengan meningkatnya i n a k t i -
f a s i rnaka k e c e p a t a n d e n a t u r a s i enzim aka11 selnakin c e p a t , s e h i n g g a K o n s t a n t a D e a k t i f a s i juga meningkat.
Log ( % a l c t i f i t a s r e s i d u ) 2.0,
, -3 ,
$OOC Y = -1.11.7 z 1 0-3 -k
2.01
Y = -1.&.211x 1.0 + 1-98 70'~ Y = -5.67 x 10-3 n,. 4- 1.88 C
1.(..
slope =
Garc~bar21
.
-
C
Y = -17.38
s
[Iubungan an t a r a l o g &ti f i t a s r e s i d u dengan walrtu p r e i r ~ k u b a s i d a r i enzim ami1oglulrosi.dase d a r i 2. n i ~ e rI,~l/i'li?iiL A-11,264 dengan adanya s t a b i l i ~ e rCaC12,
lo-'
-,
X
0
Suhu p r e i n k u b a s i ( C) Garnbar 22
.
IIubungan a n i n r a k o n s t a n t a i n d c t i f a s i ' enzim amilogluiros i d a s e dencan adanya s t a b i l i s e r CaC1, ... ( k ) derlgan s u h u : preinkubasi
.
slope =
Gambar 2j
.
-
Ej
Kurva h u b u n ~ a na n t a r a l o g k dengan 1 / T d a r i enzirn arniloglukosidase d a r i .A.. n i a e r I,51,~i'lhlr'IJA-11,264.
67 D a r i gambar 22 t e r l i h a t bahvra n i l a i k meningkat denean n a i k n y a suhu i n a k t i f a s i , 70°c,
b a l k a n d i a t a s suhu
n i l a i k meningkat s e c a r a tajam.
Hal i n i d a p a t
d i m e n g e r t i k a r e n a n a i k n y a suhu, maka k e c e p a t a n i n a k t i f a s i enzirn juga meningkat.
T i n g g i n y a n i l a i k pada suhu
7 5 ' ~ d i s e b a b k a n k a r e n a pada suhu t e r s e b u t enzim amilog l u k o s i d a s e sudah m u l a i t e r d e n a t u r a s i s e h i n g g a i n a k t i f a s l enzirn b e r l a n g s u n g dengan c e p a t . Dengan memasukkan n i l a i li ice dalam persarnaan Arrh e n i u s ( l o g k = -Ed/2.303
R x l / T + l o g A) d a p a t d i c a -
'ri b e s a r n y a e n e r g i D e a k t i f a s i (Ed) e n z i n ~amilog!.ulcosid a s e dengan adanya s t a b i l i s e r CaC12 (Ed).
N i l a i Ed
menunjukkan lretergantungan l i e c e p a t a n i n a k t i f a s i t e r l ~ a d a p suhu.
Sernalrin b e s a r n i l a i Ed lnaka r e a k s i d e a k t i f a -
s i semakin s e n s i t i f t e r h a d a p perubahan suhu,
Perubahan
suhu yang k e c i l s a j a d a p a t rnengakibatlran perubahan yang b e s a r pada n i l a i k.
Garnbar 2 3 rnemperlihatkan k u r v a un-
t u k m e n c a r i n i l a i Ed.
I j i p e r o l e h n i l a i Ed a m i l o g l u k o s i -
d a s e dengan adanya penamballan s t a b i l i s e r CaC12 s e b e s a r
35 522 k a l o r i / m o l . Menurut S e g e l (1975) uniumnya n i l a i e n e r g i a l c t i f a s i enzirn b e r a d a pada k i s a r a n
5 000
- 15 000
kalori/rnol,
s e m e n t a r a e n e r g i D e a k t i f a s i enzim jauh l e b i h b e s a r ( 5 0 000
-
1 5 0 000 k a l o r i / m o l ) .
Pada suhu r e n d a h , kece-
p a t a n d e n a t u r a s i s a n g a t l a m b a t dibandingkan dengan kecepatan k a t a l i t i k .
Kecepatan d e n a t u r a s i m e n i n g k a t l e -
bill c e p a t d a r i p a d a k e c e p a t a n l r a t a l i s i s j i k a suhu dinailrkan.
5. Penentuan i q i l a i K o n s t a n t a M i c h a e l i s (Km) Iu'ilai k o n s t a n t a M i c h a e l i s
& i p e r o l e h dengan menggu-
nakan k e b a l i l i a n d a r i persalnaan Michaelis-Menten,
V
Vmaks
Vmaks
yaitu:
S
dan memplotkan 1 / V s e b a g a i o r d i n a t , s e m e n t a r a 1/ S
se-
b a g a i a b s i s s e h i n g g a d i p e r o l e h g a r i s l u r u s yang alran memotong o r d i n a t pada l/Vnlaks dan a b s i s pada - I / K m k e m i r i n g a n g a r i s Km/Vmaks.
de-
Dengan clelnikian n i l a i Km
dan Vmaks d a p a t d i k e t a h u i . D a r i gambar 211 t e r l i h a t bahwa n i l a i Km untulc enzim a m i l n g l u k o s i d a s e t a n p a penambahan CaC12 s e b e s a r 0.6958 Dengan adanya CaC12, n i L a i Km meningkat m e n j a d i
persen.
0.0231 p e r s e n .
B e r a r t i penambahan CaC12 meningkatkan
n i l a i Km s e b e s a r
15.47 p e r s e n .
Sementara i t u penamba-
han CaC1,L juga menyebabkan perubahan n i l a i Vmaks. pa C s C 1 2 ,
Tan-
n i l a i Vmaks enziln s e b e s a r 6,8493 u n i t /mg pro-
t e i n , sedangiran n i l a i Vrnalrs taripa penambahan CaC12 s e b e s a r 5.7045 unit/mg p r o t e i n ,
J a d i penambahan CaC12 menu-
r u n l ~ a nn i l a i k e c a p a t a n maksimum enzim s e b e s a r 16.71 p e w sen. Penambahan CaC12 ke dalam medium enzim menyebabkan Ilenurunan n i l a i - - h & s - a t a u penurunan a k t i f i t a s s p e s i f i k aural.
I n i nienyebabkan s u b s t r a t yang d a p a t d i i k a t men j a -
d i l e b i h k e c i l dan b e r a k i b a t k e c e p a t a n r e a k s i menjadi l e b i h k e c i l juga,
Hingga d a p a t diSinpullran bahvra
penambahan CaC12 menurunlian a k t i f i t a s awal namun penurunan a k t i f i t a s awal i n i d i i l i u t i o l e h p e n i n g k a t a n s t a b i l i t a s enzirn.
Menurut Henley dan Sadana (1984) bahwa
n o d i f i k a s i k i m i a dengan (h-oss-links membuat s t r u k t u r enzim menjadi l e b i h kaku ( r i g i d ) .
l-lal i n i niembawa pa-
d a penurunan a k t i f i t a s maksimurn dan a k t i f i t a s awal enzirn, namun i!ienaikkan s t a b i l i t a s .
b l o d i f i k a s i gugus pro-
t e i n , b a i k i t u d e k a t ataupun jauh dengan sisi a k t i f enzim mungkin membawa penurunan a k t i f i t a s awal enzim dan kenaikkan s t a b i l i t a s ,
S e l a n ju t n y a Henley dan Sadana
(1584) menyatakan bahwa penurunan a k t i f i t a s awal d i p e r l i h a t k a n o l e h kenaikkan n i l a i I i m , Penambahan CaC12 meningkatkan n i l a i Km.
hi b e r a r -
t i bahwa dengan adanya CaC12, enzim mernbutuhkan jumlah s u b s t r a t yang l e b i h b e s a r u n t u k mencapai s e t e n g a h kecep a t a n maksirnal d i b a n d i n g j i k a t a n p a penambahan CaC12. Harga Km enzim s a n g a t b e r v a r i a s i , t e r g a n t u n g pada j e n i s s u b s t r a t dan juga l i n g k u n g a n s e p e r t i suhu dan lrekuatan ion.
Harga Km mempunyai dua p e n g e r t i a n .
Perta-
m a , merupalran k o n s e n t r a s i s u b s t r a t yang s e p a r u h l o k a s i alrtifnya t e l a h t e r i s i , y a i t u b i l a kecepatan realcsi t e l a h mencapai s e t e n g a h k e c e p a t a n tnalrsimal.
Kedua, Km meru-
pakan hubungan a n t a r a l a j u k e c e p a t a n r e a l s s i a n t a r a t a hap-tahap enzim y a i t u :
aimana:
E t
S t
'5 k2
>ES
"3
)
E
+
p
V. iCESIiv1PULAii DAN SARAiJ
A. KESI MPULAN
P r o d u k s i enzim a m i l o g l u k o s i d a s e pada s l r a l a t a p l l o t p l a n t " rnenggunakan molases s e b a g a i surnber lrarbon dan k u l t u r
-A.
nicer L51/NRRL
A-11,264
pada k o n d i s i o p t i m a l , y a i t u suhu
3 5 O ~ , pH 4.5, lcecepatan a e r a s i 1 VVM, k e c e p a t a n a g i t a s i j O O rpm selama 96 jam, dengan penamballan i n d u s e r m a l t o s a 2.0 g r a m / l i t e r pada waktu f e r m e n t a s i t e l a h b e r l d n g s u n g 48 jam, menghasilkan a l i t i f i t a s enzim 1 . 8 2 u n i t / m l . Pemekatan 1.9 k a l i f i l t r a t a u ~ a ldengan metode f r e e z e c o n c e n t r a t i o n meningkatkan a k t i f i t a s 1.lt3 i r a l i a k t i f i t a s awal a t a u menyebabkan t e r j a d i n y a penyusutan a k t i f i t a s
se-
b e s a r 24.40 p e r s e n . E k s t r a k s i enzim menghasillian rendemen 0.0187 p e r s e n
(ui/w s u s p e n s i k u l t u r ) a t a u 0.0336 p e r s e n (us/v f i l t r a t enzim) dengan k a d a r p r o t e i n enzirn 1.5252 unit/ml
73.57 p e r s e n dan a k t i f i t a s
a t a u 2.9616 unit/mg p r o t e i n .
Penambahan garam CaC12 dengan k o n s e n t r a s i 1 . 0 g / l meinberikan s t a b i l i t a s t e r t i n g g i t e r h a d a p enzim amilogluko s i d a s e d a r i A s o e r a i l l u ~niffer L51/NRRL A-11,261+. pH 4.5,
Pada
penambahan s t a b i l i s e r CaC12 menghasilkan s t a b i l
t a s tertinggi,
Sementara i t u sampai suhu 60°c,
penamb
CaC12 menjadikan enzim a m i l o g l u l r o s i d a s e r e l a t i f masih s
-
'i1znpa pcilz~mbahan s t a b i l i s e r CaCl, n i l a i icm enzim i\!!li1.oglulcosidasi: r;ebesar 0.6956 p e r s e n , :;er
(:nCl2
Penamballan s t a b i 3 . i -
1.O g / l n~eninglcat1c;in n i . l a i K m men j n d i i; .
'
.?
per-
s e n a t a u dengan p e r s e n t a s e peni.n$katan s e b e s a r 15.47 p e r s e n , N i l a i K o n s t a n t a D e a k t i f a s i (1:) suhu.
meningl'lrat dengan n a i k n y a
Sedanglian e n e r g i Dealiti f a s i (Ed) enzim suniloglulto-
sidase sebesar
35 522 lcjlori/mol..
B. SARAI! Untuk riienghasilkan enzim a ~ n i l o g l u k o s i d a s edengan t i n g !cat s t a b i l i t a s yang t i n g g i , d i p e r l u i i a n p e n e l i t i a n 1.e'nj.h l a j u t t e n t a n g penggunaan bahan-bahan a d i t i f yang l a i n , s e p e r
ti iienggunasn polimer.
J u g s p e r l u p e n e l i t i a ~ l e b i h mend
lam penggunaan kombinasi bahanrbahan lsinlia u n t u k menghasi lcan enzim a m i l o g l u k o s i d a s e yang l e b i h s t a b i l t e r h a d a p b e r bagai kondi si
.
D i p e r l u k a n juga p e n g u j i a n s t a b i l i t a s enzim amilog yang l e b i h lama ( b u l a n a t a u
DAFTAR PUSTAKA
Aiba, S., A. E. Iiumprey, 14. F. M i l l i s . Engineering. Academic P r e s s , I n c
.,
19?3. Biochemical T!ew York.
Arima, I i , 1964. M i c r o b i a l Enzyme P r o d u c t i o n . D i dalam M, P. S t a r r (Ed.), Global I m p s c t o f Applied Microbiology. John Willey & Sons, N c w York. Aunstrup, K. 13'79. P r o d u c t i o n i s o l a t i o n and Economics o f Di d a L. B, Wingard, E. K . E x t r a c e l l u l e r Enzymes. I l a t z i r dan L. G o l s t e i n ( e d s . ) , Ap l i e d B i o c h e m i s t r y and B i o e n g i n e e r i n Vol. 2 Enzyme ethnology. Academic P r e s s , Inc., New ork.
!i
8
B l a i n , J , A. 1975. I n d u s t r i a l Enzyme Pr:>riuckion. D i dalarn J. E. S m i t h dan D. R. Berry. 1975. The F i l a m e n t o u s Edward Arnold, Fungi. Vol 1: I n d u s t r i a l Mycology. London. B l e v i n s , W e T. dan li. D. Davis, 1979. 14ethods f o r Laborator y Fermentation. D i dal-am Pepper, N, J. dan D, Perlman ( eds.) I ~ l i c r o b i d l Technology, Microbial Progress Vol, I. Academic P r e s s , IIevr Yorlr.
.
J. T. P. 1982. Enzyme P r o d u c t i o n , Di G. Iieed fed.) , P r e s s c o t t & Dunnls I n d u s t r i a l Microbiology 4. A V i P u b l i s h i n g Co., Wetport C o n n e c t i c u t ,
Boing
Barton, L, L., C, E, Georgi dan D. R. L i n e Baclc. 1972. E f f e c t of Maltose dn Glucoamylase FoYmation by A s p e r ~ i l l u sn i ~ e r , j. d a c t e r i o l . l l l ( 3 ) : 771-
1979. S t a r c h Degrading b z y m e s o f M i c r o b i a l Origin. Di P r o g r e s s i n I n d u s t r i a l . Microbiology. R s e v i e r S c i e n t i f i c P u b l , Co,, New York,
B u l l , 14. J.
Casida, L. E. 1968. Sons, ]Jew York.
I n d u s t r a i a l Microbiology.
John ki'illey &
Combes, D dan P. Monsan. 1983. E f f e c t of P o l y h i d r i c NcohoU on I n v e r t a s e S t a b i l i z a t i o n , D i dalam A. I. Laskin,, 6. T. Tsao dan L. B. ifcingard, J R , ( e d s , ) 1984. Enzyme E n c i n e e r i n g 7 Vol. 434. Ann. ii, Y. Acad. S c i , New York.
.
Cocker, R. dan R. N. G r e e n s h i e l d s . 1977. Fermenter C u l t i v a t i o n of A s p e r p i l l u s . D i dalam J. E. Smith dan J. A. Paterman (eds.). 1370. G e n e t i c and P h y s i o l o g y of A s a e r ~ i l l u s , Academic P r e s s , ifevi York,
Davies, 1;. 1963. Plicrobe E x t r a c e l l u l e r Enzyn~es, ' I h e i r :?ole l j i dalan~ and Some I ' a c t o r s A f f e c t i n g 'i'iieir l;'ormation, K!ainbow, C, dnn A. II. lioose ( e d s . ) , U i o c l ~ e ~ a i s t royf I l l d u s t r i a l Plicroorganistn. I i r i i v e r s i t y of London P r e s s L t d , London. I'leating, I . D. dan B. A, S t o n e , 1963. F r a c t i o n a t i o n o f 2 i s p e r ~ i l l u ns i g e r An~yloglucosidase. Uiochem, 3. 97 : 3
5.
F o g a r t y , i'l. M. ( e d . ) . 1983. M i c r o b i a l Enzyme and Uiotechnology. Applied S c i e n c e P u b l i s h e r , London. Food M i c r o b i o l o g y F r a z i e r , it'. C. dail D. C. Wethoff, lci81. 3'zita i+lcGraw-!Till Publ. Co. L t d , ilew i i c l l ~ i . Ferdin;lnd, W. 1978, Sons, New York.
The 12nzyme I4olccule,
John C J i l l e y &
iienley, P clan A, Sadana, 1985. E f f e c t o f Chemical H o d i f i c a t i o n on Enzyinatic A c t i v i t i e s and S t a b i l i t i e s , Uiochetll. and Bioengin. 28 ( 2 ) ; 256 268.
-
B o c h s t e i n , L. I dim V, L, Schramm. 1971. S t a b i l i z a t i o n of .LZ1losteric !!denosine i4onophosphat.e i f u c l e o s i d e by I n o r g a n i c SZLts S u b s t r a t and E s s e n s i a l A c t i v a t o r , Biochem. l 0 ( l a j : 3411 3416.
-
i i a t t o r i , Y dan I , Talreuchi. 1961., S t u d i e s on Atnylolylj-tic Enzymes Produced by Endouyces s p , P a r t 11. P u r i f i c a t i o n Agr, B i o l . and [ i e n e r a l P r o p e r t i e s o f Amyloglucosidase. Chern. 2 5 ( 1 2 ) : 095. Inoue, ti., T . Pasuda dan H. liagamoto, 1986. E f f e c t o f Organic S o l v e ~ l t son '?he A c t i v i t y o f Glucoamylase. Ui.otec11. and i i o e i ~ g i n . 2 S ( 1 2 ) : 1172 1177,.
-
Iilibanov, . M. 1383. S t a b i l i z a t i o n of Enzymes A g a i n s t Thermal I n a c t i v a t i o n . I ) i cialam Advances i n Applied P l i c r o b i l o g y Vol. 29. Academic P r e s s , I n c . , :Jew York. Lily, 1 . 1 1979. Enzyme I s o l a t i o n . D i dalam D. I. C, .larigs C. L. Cooney, A r L. Demain, D u n h i l l , A, E. Mumprey I, (eds.). F e r t ~ i e n t a t i o n a d Enzyme iecllnology, p. 250 dj5, John ! l i l l e y .% Sons, Sydney.
-
Lowry, 0 . II., N. J Rosenbrough dan R. J. H a n d a l l , 1951, Prot e i n iieasuretnent w i t h The F o l i n Phenol Lieagent. J . 13iol. (:hem, 1 9 3 : 2"5. Johnson, i i dan R. I,. C o r t e s . 1 , Continuous I'ropagstion oil Yeast Cu1t::res. Food iecilnology i n A u s t r a l i a 3 3 ( 8 ) :
374 - 377.
-
Monsan, P. 1984. S t a b i l i z a t i o n of Enzyme A c t i v i t y . D i dalam Enzyme and Food B i r c h , G. G . dan K. J. P a r k e r ( e d s , ) . P r o c e s s i n g , Applied S c i e n c e P u b l i s h e r Ltd., London. PJcrman, 8. E. 1981. New Developments i n S t a r c h Syrup Technology. Di B i r c h , G. G, dan K. J. P a r k e r ( e d s . ) . Enzyme and Food P r o c e s s i n g . Applied S c i e n c e P u b l i s h e r Ltd., London. NOVO Enzymes* 1980, AMG. Leaflet. NOVO I n d u s t r y A/S. Enzymes D i v i s i o n . EOVO A l l e , DK-2880 Bagsvaerd, penmark, Monsan, P dan I. V a l l a t . 1985. I n f l u e n c e o f Glucose iln The I i i n e t i c s o f 1 - l a l t o d e x t r i n H y d r o l y s i s Using F r e e and Immob i l i z e d Glucoamylase, B i o t e c h . and Dioengin. 2 7 ( 0 ) : 1274 1275.
-
P h i l l i p s , L, L. dan M, L. Caldwell. 1951. A S t u d y o f The P u r i f i c a t i o n and P r o p e r t i e s of a Glucose Forming Amylase from lihizouus delemar, Gluc Amylase, J. Amer, Chem, S O C *
73: 3563. R o d v ~ e l l , W. W. 1983. S i f a t ICinetika Enzim. D i Biolrimia (Terjemahan). EGC P e n e r b i t Buku Icedokteran, J a k a r t a .
1975. Reed, G. ITew York.
Enzymes i n Food P r o c e s s i n g s
Academic p r e s s ,
Sadana, A. dan J. P Henley, 1984. A Mathematical A n a l y s i s o f Enzyme S t a b i l i z a t i o n by a Series-Type "echanism: I n f l u e n c e o f Chemical M o d i f i e r s , Biotech. and Bioengin. 2 6 ( 8 ) : 959 - 969. S e g e l , I. H. 1975. Enzyme I i i n e t i c s : Behavior and A n a l y s i s of & p i d E q u i l i b r i u m and S t e a d S t a t e Enzyme System. John LViilley 2~ Sons, I n c . , lievr Kork. Smith, E. E. dan K, Ono. 1986, P u r i f i c a t i o n of Glucoamylase by Acarbase (BAY g-5421) A f f i n i t y Chromatography. Biot e c h . and Applied Biochem. 8. Academic P r e s s , I n c . Schiinmer , 1 9 0 1 Source Book o f Food Enzymology, Publ. Go. Inc. Wesport, C o n n e c t i c u t .
The A V I
Schviinmer dan A. B. Pardee, 19716. p r i n c i p l e s and P r o c e d u r e i n The I s o l a t i o n o f Enzymes, Idv. Enzymology 1 4 : 375.
:;oe!iopi t o jo, S . 1986. Pengi-~ruhI n d u c e r dan Kceptxtan Agi t a si 'L'erhadsp l'roduksi Ami.l.c;fi'lu?rosidase - d a r i Asperi:.illus k'cillcul t a c Teknologi i s ni.: e r LSl jj!itliL A - 1 1 , 261;. P e r t a n i a n , TPB, Bogor.
.
:;ittig, 1 . tors.
196:i. The P r e s e n t ::.tat;e of b'erinentation i:eacJ. Cilem. Tech. I3:iotechnol. 32: 47.
Sotnogy, 1-1. 1 . A Nevi Keageut f o l . The D e t e r n ~ i r l a t i o no f Sugars. J. B i o l . Chem. 1 6 0 : 69. S t a n b u r r y , P.F. dan A. Whitalcer. 1981;. P r i n c i p l e s of Ferm e n t a t i o n 'l'echnology. Pergamon P r e s s , New Yark. iKlir;ihadilrusumah, M. Asm Nukleat. bvinarno, F.G.
1
1981. Biolcimia: P r o t e i n , Gnzima dan ITB, Bandung. Enzirn I'angan.
PT Gramedia, J a l r a r t a .
iiiardoyo, 11. 1985. P r o d u k s i rliliiloglukosidase d a r i A m e r a l l u s n i g e r J.,5l/NRIU, A - l l , , : I C l t . S1cri.psi.. k'alcultas Telrn o l o g i P e r i ; a n i a n p IPU9 Lioi;:oi-.
-
ihsetnan, . A. 1 . S t a b i l i z a kion o f Enzymes. Iji. d d a m Top i c s i n Enzyme Technology. J o h n Willey & Bons, 1!e1~iiorl.:.
St
i ' i ' e i ~ r i c i l ,O.G. i!an I?..&. S h u r t e r . I A ':!ypical !ierobic Permelitation. 115.5 1160.
-
:;dolf, I .Y. dan Y.F. Wolf. I M i l l e y & :>ens, New Yorl:.
.
I
Ijevelopaient of l h g . i:nem. 45 ( 5 ) :
Ind.
P
i 1
I .
John
L a m p i r o n 1 , F r o s e d u r produlcsi s u s p c - n s i l t u l t u r A. p&??~ ?. 5 l / N R l b A-11.,2611- pudu m e s i n r ' e r r n c n t o ~model. ~ PiSJ--1J2-
3(11,
SUSPENSI KULTUR
+ ) Kecepatan a e r a s i 1 VVM
k e c e p a t a n agitasi 300 rpm
l ' a r n p i r a l i 7L.
13x.osedur e l c s t r i i k s i erlzim o u l i l o [ g l u l - o s i d a s i . Jcasar d u l a m betitul; Icering
t
PENGUWPAN sut,,, 4 O b w a k t u 24 j a -
i
PENCU & M U endapan
.
,
a 5.
i>roiiaksi enzirn a l ; ~ i L o ~ l u l i o s i c l a sdea r i A s p e r ~ i 111;sn i p e r L~l./ili'?l~:i:A - 1 1 , 2611.
ciurnl;tl~s p o r a : i s ~ e r n i l l u sn i i e r a t a r m i r i n g u s i a L; i!ari
1. 2.
6.3 x l o 9 9 5.7 x 1 0
1;. 5.6 x
1 09
:;r;ora/ml spora/ml spora/ml
rata-rata
: 5.87
:
x 109 spora/ml
Jumlah s p o r a y a n e h i d u p :
,Jumlab s p o r a yang a d a dalaln l a b u erlenrneyer s e t e l a h f e r m e n t a s i 4 hnri :
1. 3.0 x 1 010 spora/rnl 2 . 1.1 x 10' spocajml j. 1 . 2 x 10''' spora/ml
rata-rata
:
1.77 x 10" spora/ml
Juml:~h s p o r a yang h i d u p :
I. :?.
C.
1.5
x 10'
2.7 x lo9
s>ora/ml raza-rata
: 2.1
spora/rnl
'L'ahap l ~ e r m e n t n s ip a d a E'er~nel~ tor 1npu.t : media a v ~ d inokulum
:
34 4000
g
: 1 380 g
Output : berat broth i:erat bio::nksa b a s a h jumlah f i l t r a t
. :
;is 370
g
: 3 609 g : 20 l i t e r
x 1 09 spora/ml
-
-
-
-
n ! r t i f i t a s ; sebelurn pemekatan : 1 . 8 2 unit/rnl ~ ~ l ~ t i f i st eat se l a h panie!ratan : 2.60 ullit/ml ;'enyusutan a k t i f i t a s !radar p r o t e i n s e b e l u ~ npeme!<:itan lradar p r o t e i n s e t e l a h pelilc!:s t a n
: %LC.!+ :
,.
6,630 nlg/lnl
: 8,128 mg/ml
E. 'Cahap F r e e z e Ilrying
-
-
b c i , a t enzirn l r e r i n g k a s a r a k t i f i t a s enzim kadar p r o t e i n
:
6.7246
g
: 1.5252 u n i t / m l :
0.515 rng/./ml
Lampiran it.
Hasil pengukuran a k t i f i t a s r e s i d u enzirn amiloglulcosidase pada berbagai jenig clan k o n s e n t r a s i garain pada s u h u prainirubasi 70 C, pH t+,5 selama
60 inenit.
0.2
K2S0~t ( I!'
0-4
1 0.6
.
2)
-
1.4674
2)
-
0.2756
X= 1.51'75
X= 0.2753
1) 1.4222
1.4259
1) 0.2995 2 ) 0.3146
X= 1.4241
X= 0.3073
1) 1.4222 2 ) 1.3538
1) 0.3207 2 ) 0.3305
X= 1.3880
X= 0 -3256
2)
-
-
-
18.1tl
21,58
23*46
s tabiliser
1,zmpiran
.'?.
Iiasil. pengulruran a k t i f i.t a s resi.'du e n z i a amilo.z~bahanC8C17 1.0 g / l g l u k o s i d a s e dengan p pada b e r b a g a i pH dengan suhu 60 C dan waktu prsi-nlrubasi 60 meill t ,
1~ampi.ran 6.
I i a s i l pengulcuran a l i t i f i t a s r e s i d u enzim cuniloglulcosidase dengan penatnbahan CaC1, 1.0 g / l pada b e r b a g a i suhu iian v~alrtu p r a i n k u b a s i pada pll 1.5.
87 B. Suhu 6 5 ' ~
Walrtu ( ~ n e nti)
30
Alrtifitas rebidu
2) 0.9545
-
Aktifitas residu
66.23 .
X= 0.9505
45
1) 0.8568 2) 0.8568
-
59.68
X= 0.8568 1) 0.7036 60
2) 0.810Lt
-
X= 0.7g70
55.52
C,
Suhu 70'~
!Yaktu (menit )
Larapiran 7.
H a s i l pengukuran pengaruh l r o n s e n t r a s i s u b s t r a t ( p a t i ) t e r h a d a p a l r t i f i t a s aural enzirn arnilogluk o s i d a s e dengan adanya CaC12 1,O g/1.
Larnl'iran g.
H a s i l penguk~iran pen,raruh suhu t e r h a d a p n i l a i K o n s t a n t a D e a k t i f a s i enzirn a m i l o g l u k o s i d a s e dencan adanya CaC1, 1-0 g / l ,
-
<
Strilu p r a i ~ l l r u b a s i ( OC)
Iconstanta D e a k t i f a s i ( k ) ( meni t-I
60
3.37
lo-3
65
9.711
lo-5
70
13.04 x
75
39.9~3 x 10-3
a
i
9.
r
I,embuatan Pere;itksi :;kin i'f e r Soiiiogy
Larutzn
25
gram ila..,CC~ L ;s dari
25
gram l i o c i i e l l a
:Lti Li-! 6 ' 4 E20) dal.arn 500 m l a i r d e s t i l a t a .
1
L J i tambail-
!ran s a m b i l tl-i.aduk 75 ml l a v u t a n temhaga s u l f a t ( 1 0 0 gram Cu30
it
. 5 H2
0 d a l a m a i r y a n g d i t e p a t k a n m e n j a d i s a t u li-
t e r ) d a n 20 zram N a - b i k a r b o n a t .
lean
,;
grain icalium y o d i d a .
S e t e l a h l n r u t , di-tambah-
L a r i i t a n d i p i n d a h k a n k e dalam
l i t e r ice:;i~.~rl'innd i t a r n b a h k a n 2 5 0 m l ! I Z ( L ~ 2 (2.1 ?I (3.5Lr/ <:ram K I O - , y a n g d i b u a t ~ i i e n j a d is a t u l i t e r l a b u u k u r :::j.tu
J,
cialan a q u a d e s ) .
Volume d i t e p a t k a n s a m p a i t a n d a t e r a ire-
mudian d i s ; + r i n g d a n d i s i m p a n se!salartl s e b e l u m d i g u n a l r a n . 1 , a r u t a n i d o d i . o k s a l a t d i b u c ~ tdengar1 m e l a r u t l i a n 2.5
KI d a n 2.5 gram K2C204 d a l a m a y u a d e s icemudian d i e n -
grzm
c e r k a n m e n j a d i 100 m l . Larutrrn t i o s u l f a t 0.00:
11. s t a n d a r d i l j u a t s e t i a p
a k a n digunnlran d a r i l a r u t a n t i o s u l f a t 0.1 N. 0
:-
1;
Larutan
d i b u a t d e n g a n m e n g e n c e r k a n l a r u t a n Ei7S(IL,p e l t a t . L
p
i
r
a 10.
I'ereaksi A
1
c r e a l c s i Loivry
: % p e r s e n Tic] j Cii-
IiaOIi lAere,&si B
:
.
a n h i d r a t dalarn 0.1.
i.1
'!
0.5 p e r s e n ;:iiSOL,. 5 2CJ d a l a m l a r u t a n 1 p e r s e n K?,!:i-tartarat.
IJerenlrsi C
: I'erealcsi y;irii;; t e r d i . 1 - i a t a s caicpuran
50 m l l l e r e a k s i A dan 1 m l p e r e a k s i 5 (allrali copper). P e r e a l r s i I!:
: P e r e a l c s i Po1.i.n c h i o c a l t e a u 2-ang d i i ~ u a t
Campur;in y n n z t e r d i r i a t a s 1 0 gram lia2:iCi4. 2'11 0, 2 j grain iia2Mo0
2 r a l a i r d e s t i l a t a , 85
in1
It'
2H20, 700
asam f o s f a t 05 ,6
d a n 100 m l t1Cl p e k a t , d i r e f l u l r s s e l a m a 10' jam.
L i S 0 4 , 50
Sel-anjutnya ditmbahlran 1111
t e t e s brote.
150 gram
a i r d e s t i l a t a dan beberapa Kemudian campuran t e r s e b u t
d i d i h k a n s e l a m a 15 rilenit ( t a i l p a lronciensor a g a r brom y a n g b e r l . e b i h z u d a p a t menguap, dan s e t e l a h dint:in l a r n t a n i n i d i e n c e r k a n sampai 1 1i t e r l.:eaiudian tentukan normalitasnya.
d i s a r i n g cian d i -
