KETAHANAN MUTAN Cronobacter sakazakii DAN MIKROORGANISME LAIN TERHADAP AMPISILIN UNTUK PENGEMBANGAN MEDIA SPESIFIK
RUTH THERESIA
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Ketahanan Mutan Cronobacter sakazakii dan Mikroorganisme Lain terhadap Ampisilin untuk Pengembangan Media Spesifik adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, September 2015 Ruth Theresia NIM F24110056
ABSTRAK RUTH THERESIA. Ketahanan Mutan Cronobacter sakazakii dan Mikroorganisme Lain terhadap Ampisilin untuk Pengembangan Media Sepsifik. Dibimbing oleh SITI NURJANAH. C. sakazakii ditemukan sebagai kontaminan pada pangan kering. Metode analisis mikrobiologi pangan konvensional masih sulit digunakan untuk membedakan bakteri target dengan bakteri lainnya serta mikroorganisme lain. Penggunaan isolat mutan yang dilabel dengan plasmid Green Flourescent Protein (pGFP) dapat mempermudah analisis, tetapi masih diperlukan pengembangan media spesifik untuk metode deteksi dan pengujian. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ketahanan hidup C. sakazakii mutan dan wild-type pada media yang mengandung ampisilin, menentukan konsentrasi ampisilin optimum dan mengetahui profil ketahanan mikroorganisme lain (bakteri asam laktat, khamir dan kapang) dalam media ampisilin. Metode perhitungan yang digunakan adalah Standar Plate Count. Isolat C. sakazakii FWHc3 wild-type dan YRt2a wild-type tidak dapat tumbuh pada media TSA yang mengandung ampisilin sedangkan isolat C. sakazakii mutan dapat bertahan pada media ampisilin. Konsentrasi optimum untuk isolat FWHc3 mutan dan YRt2a mutan adalah konsentrasi 30 µg/ml berdasarkan perhitungan skor tertimbang, dimana FWHc3 mutan dan YRt2a mutan memiliki nilai recovery number yang optimum masing-masing sebesar 87.50 % dan 107.04 % serta adanya reduksi jumlah khamir sebesar 2 log dan bakteri asam laktat sebesar 3.2log. Isolat C. sakazakii, kapang, khamir dan bakteri asam laktat yang ditumbuhkan secara bersamaan pada konsentrasi optimum menunjukan pertumbuhan mutan tidak terganggu atau tidak berbeda dengan kontrol, tetapi kapang, khamir dan bakteri asam laktat menurun. Kata kunci : C. sakazakii, Green Flourescent Protein, Bakteri asam laktat, Ampisilin, Khamir
ABSTRACT RUTH THERESIA. Resistance of Mutants C. sakazakii and other microorganisms against Ampicilin for Development of a Spesific Enumeration Medium. Supervised by SITI NURJANAH. C. sakazakii was found as a contaminant in dried food. However, microbiological analysis by conventional methods is difficult to distinguish the target bacterian from other microorganisms. Use of mutant, example Cronobacter sakazakii labeled with pGFP, could improve the detection rate, but it required development a specific medium. This study aimed to determine: the survival of C. sakazakii mutant and wild-type in media containing ampicillin, optimum concentration of ampicillin and the resistance of other microorganisms against ampicillin. The method of enumeration used was Standard Plate Count, Reduction Amount and Number of Recovery Mutant. The results showed that isolates of C. sakazakii FWHc3 and YRt2a wild-type did not grow on TSA medium containing ampicillin whereas mutant isolates of C. sakazakii survived on ampicillin media. Optimum concentration of mutant isolates FWHc3 and YRt2a mutant at a concentration of 30 µg/ml against molds based on weighted scoring, yeasts and latic acid bacterian because both of them had recovery number mutant optimum (87.50 % for FWHc3 and 107.04 % for YRt2a), reduction amount of yeast (2 log) and lactic acid bacterian (3.2 log). Observation of isolates mixture at the optimum concentration, growth of mutant was not hampered but molds, yeasts and lactic acid bacteria decreased. Keywords : C. sakazakii, Green Flourescent Protein, Lactic acid bacterian, Ampicilin, Mold
KETAHANAN MUTAN Cronobacter sakazakii DAN MIKROORGANISME LAIN TERHADAP AMPISILIN UNTUK PENGEMBANGAN MEDIA SPESIFIK
RUTH THERESIA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
Judul
: Ketahanan Mutan Cronobacter sakazakii dan Mikroorganisme Lain
Nama
: Ruth Theresia
NIM
: F24110056
terhadap Ampisilin untuk Pengembangan Media Spesifik
Disetujui oleh :
~
Dr. Siti Nurjanah STP, MSi. Dosen Pembimbing
Diketahu i oleh:
Tanggal Lulus:
f2
1 SEP 20115
PRAKATA Segala puji dan syukur dipanjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa, atas kasih dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan judul “Ketahanan Mutan Cronobacter sakazakii dan Mikroorganisme Lain terhadap Ampisilin untuk Pengembangan Media Spesifik”dapat diselesaikan. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Bapak (Parlaungan Sihombing) dan Mama (Alm Dra. Dianna Siburian) selaku orang tua yang telah mendoakan serta memberi semangat, nasehat dan dukungannya. Tidak lupa terima kasih untuk kakak dan adik tercinta Novriana Elizabeth ST dan Samuel Leonardo untuk dukungannya. 2. Dr. Siti Nurjanah STP, M.Si sebagai dosen pembimbing skripsi yang telah banyak memberikan arahan dan bimbingan kepada penulis hingga terselesaikannya skripsi ini. 3. Prof. Dr. Ir. Ratih Dewanti, MSc dan Dr. Ir. Budi Nurtama selaku dosen penguji. 4. Brian Hoffni ST yang selalu memberi dukungan bantuan dan saran dalam penulisan skripsi ini serta Aldila Setiawati dan Nuriska Rahma Dewanti. 5. Teman-teman mikrob atas kebersamaannya di laboratorium dan masukannya, serta teman-teman ITP 48 yang telah mendukung dan membantu dalam penulisan skripsi ini. 6. Para teknisi laboratorium Mbak Ari, Kak Tami dan Teh Asih yang membantu penulis selama di laboratorium. Penulis berharap penelitian ini dapat memberikan manfaat bagi semua pihak.
Bogor, September 2015
Ruth Theresia
vi
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI
vi
DAFTAR TABEL
vii
DAFTARGAMBAR
vii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
2
METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Bahan dan Alat
2
Prosedur Penelitian
3
Pemupukan pada Media Ampisilin
5
Perhitungan Penurunan Jumlah Mikroba terhadap Konsentrasi Ampisilin
5
Penentuan Konsentrasi Ampisilin Optimum
6
Pengujian profil pertumbuhan C. sakazakii mutan dan mikroorganisme lainnya pada konsentrasi optimum secara bersamaan
6
Analisis Statistik
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
7
Ketahanan Hidup C. sakazakii Wild-type dan Mutan pada Media Ampisilin
7
Konsentrasi Ampisilin Optimum
8
Profil Pertumbuhan C. sakazakii Mutan, BAL, Khamir dan Kapang pada Konsentrasi Ampisilin Optimum yang Ditumbuhkan secara Bersamaan 10 PENUTUP
11
Simpulan
11
Saran
12
DAFTAR PUSTAKA
13
Riwayat Hidup
15
15
DAFTAR TABEL 1 Jenis-jenis Isolat yang Digunakan dalam Penelitian 2 Skor tertimbang dari Recovery number mutan serta nilai reduksi 3 Jumlah koloni C. sakazakii mutan, kapang serta BAL dan khamir
3 10 11
DAFTAR GAMBAR 1 Diagram alir penelitian 2 Jumlah koloni C. sakazakii FWHc3 dan YRt2a dalam media ampisilin 3 Jumlah koloni C. sakazakii Mutan, BAL, Khamir dan Kapang yang Ditumbuhkan pada Media Ampisilin 4 Pengamatan mikroorganisme campuran
4 7 10 12
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Cronobacter sakazakii (sebelumnya dikenal sebagai Enterobacter sakazakii) adalah bakteri gram negatif, berbentuk batang, fakultatif anaerob dan motil (Healy et al. 2010). C. sakazakii merupakan salah satu dari tujuh spesies dalam genus Cronobacter spp. Perbedaan antara spesies ini adalah berdasarkan reaksi biokimia, serologi dan molekuler teknik (Iversen et al 2008). C. sakazakii termasuk salah satu bakteri patogen atau bakteri yang dapat menyebabkan penyakit. Bakteri ini banyak terdapat di lingkungan sekitar kita bahkan bisa juga ditemukan di dalam pencernaan manusia yang sehat (Tisnadjaja 2011). Infeksi pada manusia yang disebabkan oleh C. sakazakii dapat terjadi pada semua kalangan usia. Bayi paling berisiko untuk terinfeksi bakteri ini, terutama pada bayi yang mengalami berat badan kurang, bayi lahir prematur, bayi yang mempunyai penurunan sistem imun, bayi dari ibu yang menderita HIV (FAO/WHO 2008). Adanya kasus meningitis yang disebabkan oleh infeksi C. sakazakii dan telah diisolasi dari jaringan otak dan cairan cerebrospinal bayi yang terserang meningitis di Osterhills Hospital, Inggris (Urmenyi AMC dan Franklin AW 1961). Gitapratiwi (2011) telah mengisolasi C. sakazakii dari maizena (2 sampel dari 8 sampel). Kontaminasi C. sakazakii pada pati-patian juga ditemukan oleh Hamdani (2012), yaitu 1 sampel pati singkong (tapioka) dari 3 sampel patipatian serta Senzani (2011) juga telah mengisolasi C. sakazakii dari sayuran, yaitu kubis. Metode analisis mikrobiologi pangan konvensional tidak dapat membedakan bakteri target dengan mikroorganisme lainnya. Hal ini disebabkan karena pada bahan pangan mengandung mikroorganisme dengan jumlah dan jenis yang beragam. Selain itu metode konvensional memerlukan waktu yang lama dan biaya yang besar. Teknik pelabelan menggunakan plasmid Green Flourescent Protein (pGFP) menjadi salah satu alternatif penelusuran perilaku bakteri ini tanpa melakukan dekontaminasi atau sterilisasi untuk menekan pertumbuhan ataupun membunuh mikroba lainnya (Nurjanah 2014). Teknik pelabelan dilakukan dengan cara menyisipkan plasmid GFP pada isolat C. sakazakii. Selain itu pGFP juga tidak bersifat toksik sehingga uji biologis dapat dilakukan secara in vivo dan pengambilan gambar bisa menggunakan sel hidup (in vivo imaging) (Widyajayantie 2011). pGFPuv merupakan salah satu varian plasmid Green Flourescent Protein (pGFP) yang memikilik intensitas berflouresen 45 kali lipat di bawah sinar UV sehingga dapat dibedakan dengan mikroorganisme lainnya dan dapat tumbuh pada media yang mengandung ampisilin. Pada media yang mengandung ampisilin isolat mutan lebih stabil berflouresen. Menurut Zahner dan Maas (1972), ampisilin dapat bersifat bakterisidal terhadap bakteri gram negatif dan gram positif. Selain C. sakazakii mutan dapat bertahan terhadap ampisilin tetapi ada beberapa mikroorganisme lainya dapat tumbuh terutama kelompok khamir dan kapang. Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Sarah (2013) telah melakukan penumbuhan mutan dalam media ampsilin dan membandingkannya dengan mikroorganisme lainnya namun perhitungan yang dilakukan secara kualitatif. Pertumbuhan mikroorganisme lain ini dapat mengganggu dalam perhitungan jika
2
jumlahnya lebih besar dari mutan. Oleh karena itu, penting dicari konsentrasi ampisilin optimum yang ditambahkan dalam media perhitungan. Konsentrasi optimum ini dipilih berdasarkan nilai recovery number mutan dan penurunan bakteri asam laktat (BAL) sampai dengan tiga log sehingga tidak mengganggu pengamatan mutan. Recovery number adalah persentase jumlah koloni mutan yang hidup dalam media ampisilin dibandingkan dengan media tanpa ampisilin. C. sakazakii yang digunakan pada penelitian ini adalah isolat wild-type YRt2a (Meutia 2008) dan FWHc3 (Hamdani 2012) serta isolat mutan dari kedua nya (Nurjanah 2014). Penelitian ini bertujuan mengetahui ketahanan C. sakazakii baik wild-type ataupun mutan terhadap media ampisilin dan juga akan dibandingkan dengan mikroorganisme lain seperti kapang (A. flavus, A. niger, F. oxysporum), khamir (K. ohmeri, C. krusei, dan C. zeylanoides) dan kultur BAL (Pediococcus sp., L. plantarum, dan L. Lactis) yang telah diisolasi oleh Rahmawati et al (2012) dalam media ampisilin ditumbuhkan secara bersamaan untuk menentukan konsentrasi ampisilin optimum. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan: 1. Mengetahui ketahanan hidup C. sakazakii wild-type dan mutan pada media yang mengandung ampisilin. 2. Menentukan konsentrasi ampisilin optimum dalam media untuk mendukung pertumbuhan C. sakazakii mutan. 3. Melihat profil pertumbuhan C. sakazakii mutan dan mikroorganisme lain (Kapang, khamir dan BAL) pada konsentrasi ampisilin optimum yang ditumbuhkan bersamaan. Manfaat Penelitian Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah diperolehnya informasi tentang ketahanan C. sakazakii wild-type dan mutan serta mikroorganisme lain (Kapang, khamir dan BAL) terhadap antibiotik ampisilin. Konsentrasi ampisilin optimum direkomendasikan untuk digunakan dalam media.
METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan selama bulan Februari - Agustus 2015. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi SEAFAST Center IPB. Bahan dan Alat Bahan baku yang digunakan pada penelitian ini adalah ampisilin, air destilata, alkohol 70%, spirtus, kapas, kertas tisu, plastik, aluminium foil, media pertumbuhan TSA (Tryptone Soy Agar), DFIA (Druggan Forsythe Iversen Agar), BHI (Brain Heart Infusion), BPW (Buffered Peptone Water), PDA (Potato Dextrose Agar), MRSB (De Man Rogosa Sharp Broth), dan NB (Nutrient Broth).
3
Kultur bakteri yang digunakan adalah koleksi SEAFAST Center dapat dilihat pada Tabel 1. Peralatan yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari neraca, inkubator suhu 37°C, inkubator suhu 55°C, autoklaf, oven, lampu UV (366 nm), pipet mikro, tip pipet, tabung reaksi berulir, cawan petri, erlenmeyer, gelas piala, gelas ukur, sudip, sendok, rak tabung reaksi, hocky stick, pipet Mohr, pipet tetes, bulb, bunsen, kaca preparat, dan gelas objek. Tabel 1 Jenis-jenis Isolat yang Digunakan dalam Penelitian Kelompok Spesies/ kode Referensi mikroorganisme C. sakazakii C. sakazakii FWHc3 mutan Nurjanah 2014 C. sakazakii YRt2a mutan
BAL
Khamir
Kapang
C. sakazakii FWHc3 wild-type
Hamdani 2012
C. sakazakii YRt2a wild-type
Meutia 2008
Pediococcus sp. Lactobacillus plantarum Lactobacillus lactis Kodameae ohmeri Candida krusei Candida zeylanoides Aspergillus flavus Aspergillus niger Fusarium oxysporum
Rahmawati 2012
Prosedur Penelitian Penelitian ini terdiri dari dua tahap yaitu (1) penentuan konsentrasi ampisilin optimum untuk media perhitungan C. sakazakii mutan, (2) profil pertumbuhan mutan C. sakazakii dan mikroorganisme lainnya (BAL, khamir dan kapang). Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 1.
4
Tahap 1 Penentuan Konsentrasi Ampisilin Optimum
Kultur Ampisilin Persiapan Kultur
Pemupukan secara terpisah
Pembuatan media ampisilin dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100 μg/ml
Perhitungan Jumlah Koloni (Standart Plate Count)
Perhitungan : 1. Recovery number mutan
2. Jumlah reduksi BAL, khamir dan kapang
Konsentrasi optimum
Pemupukan secara bersamaan
Tahap 2 Profil Pertumbuhan Profil pertumbuhan C. sakazakii mutan, BAL, khamir dan kapang
Gambar 1 Diagram alir penelitian
5
Pemupukan pada Media Ampisilin Persiapan Inokulum. Isolat FWHc3 dan YRt2a wild-type dan mutan diinokulasikan masing-masing ke media BHI, lalu diinkubasi selama 1 hari pada suhu 37°C. Kultur kapang (A. flavus, A. niger, F. oxysporum), khamir (K. ohmeri, C. krusei, dan C. zeylanoides) dibuat dengan menginokulasikan 1 ose untuk masing-masing isolat ke PDB, lalu diinkubasi pada suhu 30°C selama 1 hari. Kultur BAL (Pediococcus sp., L. plantarum, dan L. lactis) dibuat dengan menginokulasikan 1 ose untuk masing-masing isolat ke MRSB, lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 hari. Kultur campuran dibuat dengan menginokulasikan masing-masing isolat BAL, khamir dan kapang, YRt2a mutan, dan FWHc3 mutan ke NB. Pembuatan Stok Ampisilin. Satu tablet ampisilin yang mengandung 500 mg ampisilin dihaluskan menggunakan mortar, lalu dimasukkan ke dalam 100 ml air steril sehingga diperoleh konsentrasi 5000 μg/ml. Kemudian larutan stok ampisilin tersebut disterilisasi menggunakan microfilter dengan bantuan syringe steril. Pembuatan Media Pemupukan. Media tumbuh yang digunakan adalah TSA yang ditambah ampisilin dengan konsentrasi 0 μg/ml (kontrol), 10μg/ml, 20 μg/ml, 30 μg/ml, 30 μg/ml, 50 μg/ml, 75 μg/ml dan 100 μg/ml. Jumlah media TSA yang dibuat disesuaikan dengan konsentrasi ampisilin berdasarkan rumus pengenceran, lalu disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Sebelum media TSA digunakan, ampisilin dari stok ditambahkan sesuai konsentrasi masing-masing. Pemupukan. Inokulum diencerkan menggunakan BPW, lalu sebanyak 0.1 ml dipupukkan ke cawan petri steril dan sekitar 15 ml media TSA dengan konsentrasi ampisilin tertentu dituang. Kemudian cawan diinkubasi pada suhu 37°C selama 2 hari dengan posisi terbalik. Perhitungan Penurunan Jumlah Mikroba terhadap Konsentrasi Ampisilin Setelah masa inkubasi, cawan diamati dan untuk isolat mutan dapat diamati menggunakan UV dengan panjang gelombang 366 nm. Koloni yang teramati dihitung dengan rumus Standar Plate Count sebagai berikut: N= Kemudian setelah mendapatkan jumlah mikroba yang sudah dalam bentuk log maka dilakukan perhitungan penurunan jumlah log dengan rumus sebagai berikut: S = log N0 log Nt Setelah itu dilakukan perhitungan recovery number dengan rumus : Recovery number =
6
Keterangan N C n1 n2 d S N0 Nt
:
: Total mikroba per ml atau gram sampel : Jumlah mikroba dari semua cawan yang masuk dalam batas perhitungan : Jumlah cawan pada pengenceran pertama : Jumlah cawan pada pengenceran kedua : Tingkat pengenceran pertama saat mulai perhitungan : Reduksi log mikroba : Jumlah mikroba tanpa ampisilin : Jumlah mikroba pada media ampisilin
Penentuan Konsentrasi Ampisilin Optimum Konsentrasi ampisilin optimum ditentukan melalui perhitungan skor tertimbang. Parameter yang digunakan untuk menghitung skor tertimbang meliputi recovery number mutan dan jumlah reduksi dari BAL dan khamir. Perhitungan dilakukan denan persamaan berikut : Ȓ=
.................................... (1)
Xs = Rmin + ((X –Xmin) x Ȓ)................ (2) Xt = 0.3 Xs(RN) + 0.2 Xs(r) ................ .. (3) Keterangan: Ȓ : Selang Rmax : Nilai maksimum pada selang Rmin : Nilai minimum pada selang Xmax : Nilai respon tertinggi Xmin : Nilai respon terendah X : Nilai respon pada konsentrasi ampisilin Xs : Skor dalam selang Xt : Skor tertimbang RN : Recovery Number r : Jumlah reduksi Pengujian profil pertumbuhan C. sakazakii mutan dan mikroorganisme lainnya pada konsentrasi optimum secara bersamaan Inokulum akan dicampur di dalam media NB setelah itu akan diencerkan menggunakan BPW, lalu sebanyak 0.1 ml dipupukkan ke cawan petri steril dan sekitar 15 ml media TSA dengan konsentrasi ampisilin optimum dan konsentrasi 0 µg/ml dijadikan sebagai kontrol. Kemudian cawan diinkubasi pada suhu 30°C selama 2 hari dengan posisi terbalik. BAL dan khamir dihitung secara total karena sulit dibedakan saat pengamatan. Analisis Statistik Data yang telah diperoleh diolah dengan menggunakan program komputer Microsoft Excel, kemudian dilanjutkan uji ANOVA dengan uji lanjut Dunnett untuk data jumlah koloni yang ditumbuhkan secara terpisah dan uji Independent-
7
Sampel T Test untuk data jumlah koloni yang ditumbuhkan secara bersamaan. Uji ini menggunakan program komputer SPSS 22.
HASIL DAN PEMBAHASAN Ketahanan Hidup C. sakazakii Wild-type dan Mutan pada Media Ampisilin Penelitian ini menggunakan isolat C. sakazakii wild-type YRt2a (Meutia 2008) yang berasal dari susu formula dan FWHc3 (Hamdani 2012) yang berasal dari pati singkong serta mutan dari kedua isolat tersebut (Nurjanah 2014). Isolat YRt2a merupakan isolat nontoksik, sedangkan FWHc3 merupakan isolat toksik (Nurjanah 2014). Penggunaan isolat mutan C. sakazakii bertujuan sebagai penanda atau mempermudah dalam membedakan C. sakazakii dengan isolat lainnya saat ditumbuhkan di dalam media. Hal ini disebabkan karena isolat mutan C. sakazakii memiliki kemampuan berflouresens dibawah lampu UV dan tahan terhadap ampisilin. Mutan merupakan organisme atau sel yang telah mengalami perubahan fenotip akibat dari proses mutasi sehingga berbeda dari wild-type atau bentuk yang ditemukan di alam. Konsentrasi ampisilin yang digunakan adalah 0, 10, 20, 30, 40, 50, 75, dan 100 μg/ml dalam media TSA (Tryptone Soy Agar). Koloni bakteri dihitung dengan rumus Standard Plate Count (BAM 2001) dan dikonversi dalam satuan log. Pemupukan isolat C. sakazakii wild-type dan mutan ke dalam media TSA yang sudah diberi ampisilin dalam berbagai konsentrasi bertujuan dapat mengetahui ketahanannya. FWHc3 wild-type dan YRt2a wild-type tidak dapat tumbuh pada media TSA yang mengandung ampisilin seperti yang ditunjukan pada Gambar 2. Hasil penelitian menunjukan pada konsentrasi ampisilin terendah yaitu 10 µg/ml tidak ada sama sekali pertumbuhan. Mekanisme ampisilin yang bekerja menghambat enzim transpeptidase yang berfungsi dalam pembentukan struktur ikatan silang pada dinding sel bakteri. Pertumbuhan sel dengan keberadaan ampisilin akan mengakibatkan pembentukan dinding sel yang lemah sehingga sel bakteri akan pecah karena tekanan osmotik internal yang tinggi (Haddix et al. 2000).
FWHc3 wild-type FWHc3 mutan
YRt2a wild-type
YRt2a mutan
Gambar 2 Jumlah koloni C. sakazakii FWHc3 dan YRt2a dalam media ampisilin
8
Hal sebaliknya isolat C. sakazakii mutan dapat bertahan pada media TSA yang diberi ampisilin. Jumlah FWHc3 mutan pada konsentrasi ampisilin 10 µg/ml adalah 7.3 log CFU/ml dan pada konsentrasi 100 µg/ml adalah 3.6 log CFU/ml. Hal yang serupa pada jumlah FWHc3 mutan di konsentrasi ampisilin 10 µg/ml adalah 7.1 log CFU/ml dan pada konsentrasi 100 µg/ml adalah 6.2 log CFU/ml. Hal ini juga dapat disimpulkan bahwa YRt2a mutan lebih resisten terhadap ampisilin dibandingkan dengan FWHc3 mutan. Hasil penelitian menunjukan semakin tinggi konsentrasi ampisilin jumlah FWHc3 mutan dan YRt2a mutan semakin menurun namun masih dapat tumbuh pada konsentrasi ampisilin 100 µg/ml. Hal ini disebabkan pGFPuv yang disisipkan mengandung gen Ampr yang menyandikan enzim β-lactamase. Enzim ini dapat menghidrolisis ampisilin sehingga tidak mengganggu pembentukan ikatan silang pada dinding sel bakteri (Haddix et al. 2000). Konsentrasi Ampisilin Optimum Jenis kultur lain yang digunakan adalah kultur BAL, khamir dan kapang. Kultur tersebut diperoleh dari fermentasi spontan perendaman jagung (Rahmawati 2012). Ketiga kultur ini akan dibandingkan dengan isolat C. sakazakii untuk mengetahui tingkat ketahanannya terhadap ampisilin dalam konsentrasi optimum. Dalam tahap ini akan dihitung jumlah koloni dari isolat mutan, BAL, khamir dan kapang yang ditumbuhkan secara terpisah. Hasil penelitian menunjukan bahwa kultur FWHc3 mutan, YRt2a mutan, BAL, khamir dan kapang masih dapat tumbuh pada media ampisilin konsentrasi 100 µg/ml. Berdasarkan uji Dunnett FWHc3 mutan berbeda nyata penurunannya pada konsentrasi 10 sampai 100 µg/ml dengan kontrol sedangkan untuk YRt2a berbeda nyata penurunannya pada konsentrasi 30 sampai 100 µg/ml dengan kontrol. Berdasarkan uji Dunnett untuk isolat khamir dan BAL memperlihatkan bahwa pemberian ampisilin pada media TSA mempengaruhi penurunan jumlah secara signifikan (p<0.05) terhadap kontrol pada konsentrasi ampisilin 10 µg/ml sampai 100 µg/ml µg/ml. Berdasarkan uji Dunnett penurunan jumlah koloni kapang berbeda nyata (p<0.05) terhadap kontrol pada konsentrasi 50 µg/ml. Kapang setelah ditumbuhkan pada konsentrasi 100 µg/ml jumlah koloninya 7.1 Log CFU/ml. Jumlah khamir pada konsentrasi 100 µg/ml sebesar 5.1 Log CFU/ml. BAL masih dapat tumbuh konsentrasi 100 µg/ml sebesar 1.4 Log CFU/ml. Dilihat dari jumlah penurunan hasil uji Dunnett menunjukan kapang lebih dapat bertahan pada media ampisilin dibandingkan dengan BAL dan khamir . Bedasarkan studi microbial analysis (Pranay 2014) menyatakan bahwa kapang (Aspergillus flavus dan Fusarium oxysporum) mampu mengalami zone inhibition tinggi terhadap ampisilin. Pearlman (1979) menyatakan ampisilin tidak efektif terhadap kapang dan khamir, sedangkan bakteri yang masuk kedalam gram positif seperti BAL ada yang sensitif dan ada yang tahan terhadap ampisilin. BAL yang digunakan untuk dianalisis merupakan kultur Pediococcus spp., L. plantarum, dan L. lactis yang telah disegarkan kemudian dilakukan pencampuran kultur. Hartanti (2007) menyatakan bahwa Pediococcus spp. tergolong pada kelompok lebih tahan terhadap ampisilin dibandingkan dengan Lactobacillus rhamnosus yang lebih sensitif terhadap ampisilin. Hummel (2007) juga
9
menyatakan bahwa ketahanan ampisilin tidak terjadi pada Lactobacillus, S. thermophilus, dan Leuconostoc. Hal ini dapat disimpulkan bahwa kemungkinan pada konsentrasi 100 µg/ml BAL yang masih dapat bertahan merupakan kultur Pediococcus spp. BAL yang tahan terhadap ampisilin dapat disebabkan oleh degradasi enzimatis senyawa antibiotik sehingga tidak dapat kontak dengan senyawa target, perubahan protein bakteri yang menjadi target antibiotik tersebut, atau perubahan permeabilitas membran terhadap antibiotik tersebut (Dever dan Dermody 1991). Pada tahap penentuan konsentrasi ampisilin optimum, kapang tidak dijadikan parameter dalam pemilihan konsentrasi ampislin karena pertumbuhannya stabil dalam media ampisilin hingga konsentrasi 100 µg/ml. BAL dan khamir yang tahan terhadap ampisilin ini dapat menggangu hasil perhitungan dari isolat mutan, maka dari itu metode pemupukan dikombinasi dengan media berampisilin dan diamati menggunakan UV. Pemilihan nilai recovery number yang optimum dilakukan agar presentase mutan yang tumbuh saat di media ampisilin tidak terlalu menurun dari sebenarnya (kontrol). Contoh perhitungan skor tertimbang dapat dilihat pada. Adanya penurunan jumlah dari BAL dan khamir dapat memudahkan untuk pembedaan dan perhitungan isolat mutan. Pemilihan konsentrasi optimum dilakukan dengan perhitungan skor tertimbang. Data recovery number FWHc3 mutan dan YRt2a mutan serta jumlah reduksi BAL dan khamir yang telah diperoleh dimodifikasi sehingga berada pada sekala 10 sampai 100. Nilai ini kemudian digunakan untuk menghitung skor tertimbang. Bobot untuk recovery number FWHc3 mutan dan YRt2a mutan masing-masing sebesar 30% sedangkan bobot untuk nilai reduksi BAL dan khamir masing-masing sebesar 20%. Pembobotan dilakukan berdasarkan prioritas tujuan pengujian yaitu kemudahan dalam membedakan isolat mutan dengan mikroorganisme lain, sehingga bobot recovery number lebih besar dibandingkan jumlah reduksi. Metode ini dilakukan agar lebih mudah diaplikasikan pada C. sakazaki mutan lainnya Konsentrasi optimum yang dipilih adalah konsentrasi 30 µg/ml untuk FWHc3 mutan dan YRt2a mutan. Data penelitian menunjukan bahwa skor tertimbang pada konsentrasi 30 µg/ml memiliki nilai yang lebih tinggi dibandingkan konsentrasi lainnya dapat dilihat pada Tabel 2. Nilai recovery number FWHc3 mutan yang dipilih dalam parameter konsentrasi optimum adalah 87.50% dan YRt2a mutan memiliki nilai recovery number paling besar 107.04 %. Pada konsentrasi 30 µg/ml jumlah reduksi BAL mencapai 3.2 log. Selain BAL, jumlah khamir juga menurun sebesar 2 log sedangkan kapang tidak mengalami penurunan dapat dilihat pada Gambar 3. Penurunan jumlah BAL dan khamir dapat mempermudah pengamatan dan perhitungan karena isolat mutan tidak akan tertutupi saat ditumbuhkan. Ketahanan C. sakazakii YRt2a mutan lebih tahan dibandingkan dengan FWHc3 mutan. Hal ini menunjukan bahwa satu spesies mikroorganisme dengan strain yang berbeda memiliki sifat ketahanan yang berbeda terhadap antibiotik. Berdasarkan penelitian Vali et al (2006) menunjukan hasil yang sama yaitu Escheriachia coli O26 diuji menggunakan beberapa antibiotik memiliki ketahanan (2.7%) sedangkan Escheriachia coli O103 memiliki ketahanan lebih tinggi (49.3%).
10
Gambar 3 Jumlah koloni C. sakazakii Mutan, BAL, Khamir dan Kapang yang Ditumbuhkan pada Media Ampisilin Tabel 2 Skor tertimbang dari Recovery number mutan serta nilai reduksi BAL dan khamir Konsentrasi Ampislin (µg/ml)
Recovery number FWHc3
Skor tertimbang
Recovery number YRt2a
Skor tertimbang
Reduksi BAL
Skor tertimbang
Reduksi Khamir
Skor tertimbang
10 20 30 40 50 75 100
90.30 88.90 87.50 86.10 73.60 72.20 50.00
30 29.06 28.12 27.19 18.81 17.87 3
100 100 107.04 95.80 88.70 87.30 87.30
20 20 30.00 14.63 4.91 3 3
1.10 1.20 3.20 4.10 5.20 5.60 5.90
3 3.56 14.81 19.88 26.06 28.31 30
1 1.90 2.00 2.10 2.10 2.10 2.10
3 25.09 27.55 30 30 30 30
Jumlah skor tertimbang 66.00 87.72 100.48 98.13 80.85 79.19 66.00
Media yang digunakan adalah media tryptone soy agar (TSA) karena pada media TSA ini dapat tumbuh mikoorganisme fastidious dan nonfastidious (Downes dan Ito 2001). Media nutrient agar (NA) juga dapat ditumbuhi beragam jenis mikroba, jamur dan bateri. Namun tidak semua bakteri dapat tumbuh pada media NA karena beberapa bakteri memerlukan nutrisi yang lebih banyak seperti kaldu sapi dan beberapa ekstrak dari ragi. Media NA juga tidak selektif untuk pertumbuhan bakteri patogen (Chapin et al 2003). Selain NA ada pula media yang dapat ditumbuhi beragam mikroorganisme yaitu plate count agar (PCA), PCA berfungsi untuk penentuan jumlah mikroorganisme dengan metode Total Plate Count. PCA dapat mengisolasi mikroorganisme dalam susu dan produk susu lainnya (Downes dan Ito 2001). Profil Pertumbuhan C. sakazakii Mutan, BAL, Khamir dan Kapang pada Konsentrasi Ampisilin Optimum yang Ditumbuhkan secara Bersamaan Dalam tahap ini BAL dan khamir saat ditumbuhkan bersamaan tidak dapat dibedakan oleh karena itu dilakukan perhitungan dan dilaporkan sebagai total BAL dan khamir. Pengamatan di bawah lampu UV menjadi metode perhitungan yang spesifik karena yang terhitung hanya isolat mutan. Hasil pengamatan pada konsentrasi ampisilin 30 µg/ml untuk FWHc3 mutan didapat jumlah dari isolat
11
FWHc3 mutan menurun 0.1 log dari kontrol dan uji t-test menunjukan jumlah FWHc3 mutan tidak berbeda nyata (p>0.05) terhadap kontrol. Kapang menurun 0.4 log dari kontrol dan berdasatkan uji t-test berbedanyata (p<0.05) terhadap kontrol. BAL dan khamir mengalami penurunan sebanyak 1.1 log dari kontrol dan bberdasarkan uji t-test berbeda nyata (p<0.05) terhadap kontrol. Isolat mutan dapat dengan mudah di hitung menggunakan UV tanpa ada gangguan dari mikroorganisme lainnya yang ikut tumbuh dalam media. Hal ini juga dialami serupa oleh isolat YRt2a mutan, kapang serta BAL dan khamir pada konsentrasi 30 µg/ml. Kontrol yang digunakan adalah setiap mikroorganisme ditumbuhkan secara bersamaan pada media TSA tanpa diberi ampisilin. Penurunan jumlah dapat disebabkan selain adanya ampisilin di dalam media terjadinya persaingan hidup di dalam media untuk mendapatkan sumber makanan. Dapat dilihat dari Tabel 3 menunjukan jumlah dari koloni masing-masing isolat. Tabel 3 Jumlah koloni C. sakazakii mutan, kapang serta BAL dan khamir
FWHc3 mutan
Jumlah koloni (Log CFU/ml) pada 0 µg/ml 6.2 ± 0.06a
Jumlah koloni (Log CFU/ml) pada 30 µg/ml 6.1 ± 0.06a
Jumlah Reduksi (Log) 0.1
Kapang
6.0 ± 0.02a
5.6 ± 0.10b
0.4
BAL dan khamir
6.9 ± 0.02a
5.6 ± 0.10b
1.3
YRt2a mutan
6.2 ± 0.04a
6.1 ± 0.010a
0.1
Kapang
6.0 ± 0.01a
5.6 ± 0.03b
0.4
BAL dan khamir
6.7 ± 0.02a
5.6 ± 0.11b
1.1
Isolat
Koloni C. sakazakii mutan, kapang serta BAL dan khamir yang ditumbuhkan bersamaan kedalam media TSA berampisilin tidak menggunakan UV seperti yang ditunjukan pada Gambar 4a. Hasil pengamatan pada isolat campuran tanpa bantuan sinar UV tidak bisa membedakan antara mutan, BAL dan khamir. Namun pengamatan dengan menggunakan UV pada kisaran 366 nm dapat membedakan FWHc3 mutan (Gambar 4b dan Gambar 4c) dan YRt2a mutan (Gambar 4d dan Gambar 4e) dibandingkan dengan mirkoorganime lainnya.
PENUTUP Simpulan C. sakazakii FWHc3 dan YRt2a wild-type tidak dapat tumbuh pada media yang mengandung ampisilin sedangkan isolat mutan memiliki ketahanan hidup tehadap media yang diberi ampisilin sampai 100 µg/ml. Konsentrasi ampisilin optimum berdasarkan nilai recovery number serta jumlah reduksi BAL, khamir dan kapang adalah 30 µg/ml untuk isolat FWHc3 mutan dan isolat YRt2a mutan. Profil pertumbuhan C. sakazakii mutan, kapang, BAL dan khamir pada konsentrasi ampisilin optimum menunjukan FWHc3 mutan dan isolat YRt2a mutan tidak terganggu pertumbuhannya tetapi pada kapang serta BAL dan khamir menurunan jumlahnya.
12
Saran Penelitian selanjutnya diharapkan melakukan aplikasi metode perhitungan C. sakazakii mutan secara kuantitatif dengan menggunakan media ampisilin konsentrasi optimum serta menganalisis efektivitas pengujian dalam analisis C. sakazakii mutan produk pangan.
(a)
(a)
(c)
(d) (e) Gambar 4 Pengamatan mikroorganisme campuran (a) tidak menggunakan lampu UV (b) Menggunakan UV konsentrasi 0 µg/ml (mutan FWHc3) (c) Menggunakan UV konsentrasi 30 µg/ml (mutan FWHc3) (d) Menggunakan UV konsentrasi 0 µg/ml (mutan YRt2a) (e) Menggunakan UV konsentrasi 30 µg/ml (mutan YRt2a)
13
DAFTAR PUSTAKA [BAM] Bacteriological Analytical Method. 2001. http://www.cfsan.fda.gov/ [10 November 2014]. [FAO-WHO] Food and Agriculture Organization - World Health Organization. 2008. Enterobacter sakazakii and other microorganisms in powdered infant formula. Microbiological Risk Assessment. series 15. Geneva: WHO. Chapin, K.C., and T.-L. Lauderdale. 2003. Reagents, stains, and media: bacteriology. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. Dever LA, Dermody TS. 1991. Mechanisms of bacterial resistance to antibiotics. Archives of Internal Medicine 151(5): 886-895. Downes, F.P., and K. Ito (ed.). 2001. Compendium of methods for the microbiological examination of foods, 4th ed. American Public Health Association, Washington, D.C. Gitapratiwi D, Dewanti-Hariyadi R, Hidayat SH. 2012. Genetic relatedness of Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) isolated from dried food products in Indonesia. International Food Research Journal. 19(4): 1745- 1749. Haddix PL, Paulsen ET, Werner TF. 2000. Measurement of mutation to antibiotic resistance: ampicillin resistance in Serratia marcescens. Bioscene 26 (1): 17-21. Healy B, Cooney S, O’Brien S, Iversen C, Whyte P, Nally J, Callanan JJ, Fanning S. 2010. Cronobacter (Enterobacter sakazakii): an opportunistic foodborne pathogen. Foodborne Pathogens and Disease.7: 339-350. Haddix PL, Paulsen ET, Werner TF. 2000. Measurement of mutation to antibiotic resistance: ampicillin resistance in Serratia marcescens. Bioscene 26 (1): 17-21. Hamdani FW. 2012. Evaluasi Keragaman Genetika Isolat Lokal Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) yang diperoleh dari Produk Pangan Kering. Tesis. Bogor: Fakultas Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Hartanti AW. 2007, Seleksi bakteri asan laktat yang berpotensi sebagai probiotik dari isolat air susu ibu [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Hummel AS, Hertel C, Holzapfel WH, Franz CMAP. 2007. Antibiotik resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria. Applied and Environmental Microbiology 73(3): 730-739 Iversen C, Mullane N, McCardell B, Tall BD, Lehner A, Fanning S, Stephan R and Joosten H. 2008. Cronobacter gen. nov., a new genus to accommodate the biogroups of Enterobacter sakazakii, and proposal of Cronobacter sakazakii gen. nov., comb. nov., Cronobacter malonaticus sp. nov., Cronobacter turicensis sp. nov., Cronobacter muytjensii sp. nov., Cronobacter dublinensis sp. nov., Cronobacter genomospecies 1, and of three subspecies, Cronobacter dublinensis subsp. dublinensis subsp. nov., Cronobacter dublinensis subsp. lausannensis subsp. nov. and Cronobacter dublinensis subsp. lactaridi subsp. nov. Int J Syst Evol Micr. 58: 1442-1447.
14
Meutia YR, Dewanti-Hariyadi R, Estuningsih S. 2008. Characterization of 16S rRNA gene of Enterobacter sakazakii isolated from powdered infant formula. Dalam : Abstrak Seminar Nasional PATPI. 14-16 Oktober, Palembang, Indonesia. Perhimpunan Ahli Teknologi Pangan Indonesia, Jakarta, Indonesia Nurjanah S. 2014. Stability and Growth Characteristics of GFPuv- Labeled Cronobacter sakazakii Isolated from Foods. Food J Sci Biotechnol. 23 (5) : 1491-1496. DOI 10.1007/s10068-014-0204-3. Pearlman D. 1979. Use of antibiotics in cell culture media. Dalam: Jacoby WB, Pastan JH (eds.). Methods in Enzymology. New York: Academic press. Pranay, Guru. 2014. Microbial Analysis on Some Coordination Compound of Metals with Ampicillin. J of chemistry and Materials Research. 1 (2) : 4044. Rahmawati, Dewanti-Hariyadi R, Hariyadi P, Fardiaz D, Richana N. 2013. Isolation and identification of microorganisms during spontaneous fermentation of maize. J Teknol Indust Pangan. 24 : 33-39. DOI:10.6066/jtip.2013.24.1.33. Sarah TS. 2013. Kajian pembuatan maizena dari jagung kuning dan sintas mutan Cronobacter spp. selama pembuatan maizena [skripsi]. Bogor :Institut Pertanian Bogor. Senzani WH. 2011. Isolation and identification of Enterobacter sakazakii from fresh vegetables and fruits samples from Bogor, Indonesia [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Tisnadjaja, Djadjat. 2011. Enterobacter sakazakii dan Meningitis. Pusat Penelitian Bioteknologi-Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia : Cibinong. Urmenyi, A.M.C. & White-Franklin, A. 1961. Neonatal death from pigmented coliform infection. The Lancet, 11 Feb. 1961: 313-315. Vali, Leila et al. 2006. Antibiotic resistance and molecular epidemiology of Escherichia coli O26, O103 and O145 shed by two cohorts of Scottish beef cattle. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 59 (3): 403-410. Widyajayantie, Dwi. 2011. Kontruksi Plasmid Overrekspresi Gen sgfpS65T Berbasis Vektor Binary pCAMBIA1305.1 untuk Studi Aktivitas Promoter. [Skripsi]. Depok (ID): UI. Zahner, H., and W. Maas. 1972. Biology of Antibiotics. Springer-Verlag, NY.
15
Riwayat Hidup Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 11 Maret 1993 pasangan Parlaungan Sihombing dan (alm) drs. Dianna Durbin Pinta Uli. Penulis adalah putri kedua dari tiga bersaudara. Jenjang pendidikan formal telah dilalui oleh penulis adalah SD Mardi Waluya Bogor dan lulus pada tahun 2005. Penulis melanjutkan ke sekolah menengah pertama di SMP Mardi Waluya Bogor dan lulus pada tahun 2008 dan masuk ke SMA Negeri Bogor. Tahun 2011 penulis lulus dari SMAN 1 Bogor dan pada tahun yang sama penulis diterima melalui jalur SNMPTN Undangan di Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Institut Pertanian Bogor. Penulis telah mengikuti beberapa kegiatan kepanitiaan antara lain HACCP – PLASMA 2013, BAUR-ACCES 2013, Kebaktian Awal Tahun Ajaran (KATA PMK 2013) sebagai ketua divisi konsumsi dan usaha (DANUS) dan Paskah PMK FATETA 2015 sebagai anggota Humas. Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar sarjana Teknologi Pertanian pada Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor, penulis melakukan penyusunan skripsi dengan judul “Ketahanan Mutan Cronobacter sakazakii dan Mikroorganisme Lain terhadap Ampisilin untuk Pengembangan Media Spesifik” dibawah bimbingan Dr. Siti Nurjanah STP, M.Si.
25
e
