Jurnal AgroBiogen 7(2):76-84
Keragaman Genetik 96 Aksesi Plasma Nutfah Padi Berdasarkan 30 Marka SSR Terpaut Gen Pengatur Waktu Pembungaan (HD Genes) Dwinita W. Utami*, Sutoro, Nurul Hidayatun, Andari Risliawati, dan Ida Hanarida Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Jl. Tentara Pelajar 3A, Bogor 16111 Telp. (0251) 8337975; Faks. (0251) 8338820; *E-mail:
[email protected] Diajukan: 15 April 2011; Diterima: 23 September 2011
ABSTRACT Genetic Diversity of 96 Accession of Rice Germplasm Using 30 SSR Markers Linked to Heading Date Genes (HD Genes). Dwinita W. Utami, Sutoro, Nurul Hidayatun, Andari Risliawati, and Ida Hanarida. Rice with early maturity is one of an important genetic resources in rice germplasm collection. Characterization and identification of genetic diversity is an important issue for plant variety protection. Molecular identification by microsatellite markers using Genetic Analyzer enables resolve of this issue. The objective of this research is to identify the genetic diversity of 96 rice accessions based on their specific DNA fingerprint using microsatellite markers. A total of 96 accessions consisting of a diverse variety of maturity classification were genotyped with 30 SSR markers linked to HD genes which spread out in 12 chromosomes of rice geneome. The total 297 alleles were detected indicated the level of marker informativeness. RM5607 generated 7 allele with the size range from 103 to 197 and the highest PIC at 0.90. RM3571 (linked to HD12 gene) has a significant value associated with varieties which have early maturity trait. Clustering analysis showed the cluster based on Sub Species genome background and on early maturity trait. Keywords: DNA fingerprinting, SSR marker, HD genes, early maturity trait.
ABSTRAK Keragaman Genetik 96 Aksesi Plasma Nutfah Padi Berdasarkan 30 Marka SSR Terpaut Gen Pengatur Waktu Pembungaan (HD Genes). Dwinita W. Utami, Sutoro, Nurul Hidayatun, Andari Risliawati, dan Ida Hanarida. Padi dengan karakter umur genjah merupakan salah satu sumber daya genetik penting dari koleksi plasma nutfah padi. Karakterisasi dan identifikasi keragaman genetik merupakan faktor penting dalam perlindungan varietas tanaman. Identifikasi molekuler dengan penanda mikrosatelit dan analisis genetik dapat berperan penting dalam masalah ini. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi keragaman genetik 96 aksesi padi, berdasarkan sidik jari DNA spesifik dengan menggunakan penanda mikrosatelit. Sebanyak 96 aksesi plasma nutfah yang terdiri dari aksesi dengan variasi umur tanaman digunakan dalam analisis genotiping menggunakan 30 marka SSR terpaut dengan gen HD yang Hak Cipta © 2011, BB-Biogen
tersebar di 12 kromosom dalam genom padi. Hasil analisis menunjukkan telah terseleksi sebanyak total alel 297. Marka RM5607 adalah marka dengan nilai PIC tertinggi 0,90, total jumlah 7 alel dengan kisaran ukuran 103-197. Marka RM3571 (terpaut dengan gen HD12) memiliki tingkat signifikansi paling tinggi terhadap varietas berumur sangat genjah. Hasil analisis pengelompokan menunjukkan adanya pengelompokan yang menggambarkan variasi dalam fenotipe kelompok Subspesies: Indica, Japonica, dan Tropical Japonica serta dalam karakter umur tanaman. Kata kunci: Sidik jari DNA, marka SSR, gen HD, karakter genjah.
PENDAHULUAN Identifikasi dan diskriminasi varietas secara akurat diperlukan dalam kegiatan pengelolaan, perlindungan, dan pemanfaatan plasma nutfah. Sebuah varietas harus memenuhi kriteria DUS (distinctness, uniformity, and stability), yaitu benar-benar mengandung kebaruan (novelty) dan unik walaupun hanya berbeda dalam satu karakter dengan semua varietas yang sudah ada, harus menunjukkan keseragaman dan stabilitas karakter yang diklaim (Bredemeijer et al., 2002) serta harus dilengkapi dengan konfirmasi varietas turunan esensial (essentially derived varieties) (Van Eeuwijk dan Baril, 2001). Namun dengan semakin bertambahnya varietas yang didaftarkan ke kantor PVT (perlindungan varietas tanaman) setiap tahun, perbedaan varietas baru dengan yang sudah ada dalam database PVT akan menjadi sulit apabila karakterisasi hanya berdasarkan pada morfologi dan fisiologi. Terlebih lagi, karena varietas-varietas baru umumnya berasal dari persilangan antara anggota kelompok elit dengan tetua yang mirip secara genetik, keragaman genetik antar varietas yang baru dikembangkan menjadi semakin sempit (Rongwen et al., 1995). Penanda molekuler dapat memecahkan masalah ini dengan menyediakan profil unik DNA dari varietasvarietas yang akan dilindungi. Informasi sidik jari DNA bermanfaat untuk pembuatan koleksi inti (core collection), menata ulang koleksi agar tidak terjadi duplikasi, dan memberi arah dalam pengumpulan
2011
D.W. UTAMI ET AL.: Keragaman Genetik 96 Aksesi Plasma Nutfah Padi
plasma nutfah terutama yang masih belum diprioritaskan (Septiningsih et al., 2004), dan membantu pemanfaatan sumber daya genetik secara lebih baik melalui seleksi calon tetua pada tahap dini (Brown-Guedira et al., 2000). Saat ini penanda molekuler yang paling luas digunakan untuk mendeteksi keragaman genetik adalah mikrosatelit (SSR, simple sequence repeat), karena sifatnya yang reproducible, kodominan, dan dapat mendeteksi variasi alel yang tinggi. Penanda ini telah banyak diterapkan pada komoditas tanaman penting seperti padi (Luce et al., 2001), kedelai (Narvel et al., 2000), tomat (Bredemeijer et al., 2002), kentang (Corbett et al., 2001), gandum (Plaschke et al., 1995), dan ubi jalar (Zhang et al., 2000). Beberapa marka SSR (dan juga marka RFLP) telah diketahui terpaut dekat dengan beberapa gen untuk karakter-karakter penting pada tanaman padi sehingga dapat digunakan sebagai penanda dari karakter yang diinginkan. Pada tanaman padi beberapa marka SSR telah diketahui terpaut dengan gen/QTL pengatur umur pembungaan (heading date/HD) (Yamamoto et al., 2000). Seperti telah diketahui bahwa waktu pembungaan tanaman dikontrol oleh faktor genetik endogen dan sinyal fotoperiodik dari lingkungan. Kemajuan terkini dalam penelitian genom telah memberikan strategi baru untuk menganalisis kontrol genetik umur berbunga tanaman padi. Beberapa studi telah menunjukkan bahwa struktur gen yang terlibat dalam respon fotoperiodik berbunga pada tanaman padi menunjukkan kesamaan dengan gen pada Arabidopsis (Yano et al., 2001). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menganalisis keragaman genetik dan pengelompokan dari 96 aksesi plasma nutfah padi berdasarkan profil sidik jari DNA-nya menggunakan 30 marka SSR terpaut dengan beberapa gen umur pembungaan (HD genes). Analisis keragaman genetik dilakukan untuk mendiskriminasi ciri genetik yang dimiliki setiap aksesi plasma nutfah padi. Sedangkan analisis pengelompokan dilakukan untuk merekonstruksi hubungan kekerabatan antar aksesi (Gravendeel, 2000), khususnya dalam hubungannya dengan sifat umur pembungaan.
77
Analisis PCR DNA diisolasi dari daun tanaman berumur 3-5 minggu dengan menggunakan protokol baku dari lab McCouch dalam skala miniprep dengan sedikit modifikasi (Septiningsih et al., 2004). DNA digandakan pada mesin PCR DNA Engine Tetrad® 2 Peltier Thermal Cycler MJ Research menggunakan profil PCR sebagai berikut: predenaturasi dalam suhu 95oC kemudian diikuti 29 siklus yang terdiri atas tahapan: denaturasi pada suhu 95oC diikuti dengan annealing pada suhu 55oC dan pemanjangan pada suhu 72oC masing-masing selama 45 detik. Kemudian diteruskan dengan 7 siklus yang terdiri atas tahapan denaturasi pada suhu 95oC, annealing pada suhu 53oC, pemanjangan pada suhu 72oC masing-masing selama 45 detik dan diakhiri dengan satu siklus final extension pada suhu 72oC selama 10 menit dan inkubasi pada suhu 4oC. Analisis fragmen DNA dengan mesin Genetic Analysis Beckman Coulter CEQ 8000 Sampel dianalisis secara multiplexing, yaitu dengan mencampurkan produk hasil amplifikasi PCR dari 5 primer dengan warna label fluoresen yang berbeda atau ukuran fragmen yang berbeda dalam satu sumur sampel. Untuk merancang set multiplex terlebih dahulu perlu dilakukan optimisasi primer-primer yang digunakan untuk mengetahui kisaran ukuran fragmen DNA yang teramplifikasi dan kekuatan sinyal fluoresen yang melabel primernya. Produk PCR diencerkan dengan ddH2O dan/atau SLS (sample loading solution) sesuai besarnya sinyal fluoresen yang terdeteksi saat optimasi. Produk PCR dari tiap primer dicampurkan dalam satu sumur lalu ditambah dengan SLS dan 0,5 μl CEQ internal size standard (400 bp) dengan volume akhir 40 μl. Minyak mineral (satu tetes) ditambahkan pada tiap sampel. Pada plate lain diisikan bufer CEQ sebanyak tiga perempat volume sumur. Plate sampel dan bufer di-load dan dijalankan bersama-sama secara otomatis pada mesin sesuai petunjuk dari pabrik CEQ. Fragmenfragmen DNA terdeteksi di layar monitor sebagai puncak (peaks) dengan tiga macam warna fluoresen. Analisis Data
BAHAN DAN METODE Material Genetik Material genetik yang digunakan adalah 96 aksesi plasma nutfah padi yang terdiri atas varietas unggul, varietas lokal, varietas introduksi dan galur harapan (Tabel 1). DNA tanaman dianalisis dengan menggunakan 30 primer SSR berlabel fluoresen.
Ukuran fragmen hasil analisis pada CEQ 8000 (allele calling) diolah dengan CEQ Fragment Analysis Software. Selanjutnya dilakukan binning, yaitu pengelompokan fragmen DNA (alel-alel) berdasarkan jumlah pengulangan motif DNA tertentu (misalnya pengulangan utasan dari dua, tiga atau empat pasang basa) yang diapit oleh sepasang marka mikrosatelit. Data hasil dari proses binning dianalisis menggunakan piranti
78
JURNAL AGROBIOGEN
VOL. 7 NO. 2
Tabel 1. Genotipe yang digunakan untuk analisis sidik jari DNA beserta informasinya sesuai dengan database di Bank Gen BB-Biogen. No. Nama 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65.
Kinamaze Wase Oikoku Nipponbare Silugonggo Maninjau KDM IR 7114-6-407-2-1-2-1-1 CT 13234 BP 1979B-23-7-TB-1-1 S4616-PN-7-3 B10970C-MR-4-2-1-1-1-Si-3-2-4-2-1 B11283-6C-PN-5-MR-2-3-Si-1-2-1-1 B11283-6C-PN-5-MR-2-3-Si-1-3-1-1 B11742-RS*-2-3-MR-34-1-1-3 B11742-RS*-2-3-MR-34-1-1-4 B11742-RS*-2-3-MR-34-1-1-5 B11742-RS*-2-3-MR-34-1-2-1 B11742-RS*-2-3-MR-34-1-2-3 B11742-RS*-2-3-MR-34-1-4-3 B11742-RS*-2-3-MR-34-1-4-1 OM 2395 OM 4495 OM 5240 Dodokan Jalawara Huma Gadag Popot BPI 76 Inpari-1 RI_1 IR-1509-8803 Genjah Rawe Celebes Genjah Welut Ketan Lekatar Ketan Huma Bintang Ketan Kawi Pae Biyu Nggolopua Rangkat-B Laka Repong Azelapan Mandel Handayani Menthik Putih Menur Jawa Bali Jawa Wakai Padi Merah Padi Lemunyan Pae Wila I.B Pae Wila I.A Morin Lalanjar Ketan Saru-A Rhoe Fatmawati IR30 Pulut Sappa Ketan Leler Telur Ikan Ase Pulut Jawa Kenanga Lambau Lestari Pandan Wangi
Umur 90 90 90 90 95 100 104 104 104 104 104 104 104 104 104 104 104 104 104 104 105 105 105 105 107 108 109 109 110 110 110 110 110 110 111 112 112 112 114 114 114 114 114 115 115 115 115 115 115 115 115 115 115 115 115 115 118 118 118 119 119 120 130 120 120
Jenis
Asal
Introduksi Introduksi Introduksi VUN VUN Var. lokal Introduksi Introduksi Galur Galur Galur Galur Galur Galur Galur Galur Galur Galur Galur Galur Introduksi Introduksi Introduksi VUN Var. lokal Var. lokal Var. lokal Introduksi VUN Var. lokal Galur Var. lokal VUN Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal VUN Introduksi Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal
Jepang Jepang Jepang Koleksi BB-Padi Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 19672 Thailand IRRI CIAT-CIRAD Koleksi BB Padi Koleksi BB Padi Koleksi BB Padi Koleksi BB Padi Koleksi BB Padi Koleksi BB Padi Koleksi BB Padi Koleksi BB Padi Koleksi BB Padi Koleksi BB Padi Koleksi BB Padi Koleksi BB Padi Taiwan Taiwan Taiwan BB Padi Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 19284, asal Karangagung, Palembang Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20966, asal Sukabumi, Jabar Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20982, asal Kaltim IRRI BB Padi DIY Koleksi BB Padi Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 7782, asal Jatim Koleksi BB Padi Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 12476, asal Jateng Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 21001, asal Kaltim Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20924 Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20855, asal Gorontalo, Sulut Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 8542, asal Samarinda, Kaltim Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20892, asal Kendari, Sulteng Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20760, asal Lamda Leda, NTT Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20750, asal Kota Kumbah, NTT Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20749, asal Kota Kumbah, NTT Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 19297, asal Karangagung, Palembang Pemkab Gunung Kidul, DIY Koleksi BPTP Yogyakarta Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 5873, asal Indramayu Jabar Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 21058, asal Kaltim Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 21011, asal Kaltim Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 21003, asal Kaltim Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20980, asal Kaltim Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20894, asal Kendari, Sulteng Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20893, asal Kendari, Sulteng Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20722, asal Belu, NTT Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20422, asal Kalteng Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 8220, asal Aceh Koleksi BB Padi IRRI Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 8541, asal Samarinda, Kaltim Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 8520 Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20379b, asal Kalteng Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20833, asal Gowa, Sulsel Koleksi BPTP, Yogyakarta Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 19870, asal Sintang Kalbar Bantul, DIY Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 12367, asal Cianjur Jabar
2011
D.W. UTAMI ET AL.: Keragaman Genetik 96 Aksesi Plasma Nutfah Padi
79
Tabel 1. Lanjutan. No. Nama 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96.
Umur
Pare Lea Pulu Mandoti Slegreng Ciganjur Rodjolele Gepyok Jalu Pakok Jalu Least Ketan Hitam Aek Sibundong Sintanur Gilirang Andel Merah Rebo Rodjolele Siam Putih Cempo Merah Cempo Putih Hawara Bunar Saodah Merah Si Pulut Padi Kuda Pare Barri Pare Bau Pare Kombong Pindjan Ketan Gajih Ketan Gembong Dupa Si Bau Gunung Perak Pulut Sawijan
150 150 120 120 120 120 120 156 120 120 120 130 121 123 123 125 125 125 125 130 130 126 150 150 150 157 150 132 139 140 140
Jenis
Asal
Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal VUN VUN VUN Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal Var. lokal
Sulsel Sulsel Gunung Kidul, DIY Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 21177, asal Subang Jabar Koleksi BPTP, Yogyakarta Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 21033, asal Kaltim Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 21032, asal Kaltim Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 21026, asal Kaltim Koleksi BB Padi Koleksi BB Padi Koleksi BB Padi Bantul, DIY Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20774, asal Sikka, NTT Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 5736, asal Pati Jateng Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20984, asal Kaltim Sleman, DIY Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 5806, asal Purwokerto Jateng Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 19285, asal Cianjur Jabar Bantul, DIY Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 8300, asal L. Batu, Sumut Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 8065, asal Tanjung Jabung, Jambi Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20911, asal Tana Toraja Sulsel Sulsel Sulsel Sulsel Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 6744, asal Lampung Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 8216, asal Aceh Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 20985, asal Pasir Kaltim Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 19746, asal Kapuas Hulu Kalbar Sulsel Koleksi Bank Gen BB-Biogen, Reg. 7618, asal Sumbar
Kriteria umur padi: ultra genjah <90 HSS, sangat genjah = 90-104 HSS, genjah = 105-124 HSS, sedang = 125-150 HSS, dalam = >150 HSS. HSS = hari setelah sebar (Balitpa, 2009).
lunak PowerMarker untuk mengetahui besarnya keragaman genetik dan hubungan antar aksesi serta pembuatan dendrogram. HASIL DAN PEMBAHASAN Keragaman Genetik 96 Aksesi Plasma Nutfah Padi Analisis sidik jari DNA plasma nutfah padi dilakukan terhadap 96 aksesi padi yang meliputi aksesi padi beras merah, aromatik, dan umur genjah. Analisis DNA dilakukan dengan mengamplifikasi DNA sampel dengan menggunakan 30 marka SSR yang sebagian besar terpaut dengan gen pengatur umur berbunga (heading date). Penentuan ukuran kuantitatif fragmen DNA hasil amplifikasi dilakukan pada mesin CEQ8000 Genetic Analysis System. Keluaran pada layar monitor yang berupa puncak-puncak (peak) yang merupakan sinyal dari fragmen hasil amplifikasi dari setiap primer (Gambar 1). Hasil kuantifikasi ukuran alel pada Gambar 1 terlihat bahwa aksesi plasma nutfah Aek Sibundong memiliki keragaman alel pada beberapa lokus marka
SSR: RM277, RM283, RM162, dan RM433 yang berturutturut berukuran 137, 137, 210, dan 342 basa nukleotida. Secara keseluruhan, hasil analisis keragaman genetik dari 30 marka SSR yang digunakan terdeteksi total alel sebanyak 297 alel. Dalam setiap lokus terdeteksi mulai 1 alel (RM3859) sampai 21 alel (RM162) dengan ratarata 10 alel per lokus. Nilai PIC (polymorphic information content) berkisar antara 0,33 pada lokus RM283 dan lokus RM6536 sampai dengan 0,9 pada lokus RM5607 (Tabel 2). Kemampuan marka dalam menghasilkan alel polimorfis tercermin dalam nilai PIC. Dari data profil alel diketahui bahwa marka RM5607 memiliki nilai PIC yang tertinggi yang berarti bahwa primer tersebut bisa menghasilkan sejumlah besar karakter pembeda antar aksesi yang diteliti. Marka RM5607 terpaut dengan gen pengatur umur pembungaan HD7 yang terdapat pada kromosom 7. Marka ini dapat menunjukkan polimorfisme ukuran alel antara plasma nutfah padi genjahsangat genjah (Silugonggo, IR7114-6-407-2-1, OM5240, Nipponbare) memiliki ukuran alel 183-193 pb, sedangkan plasma nutfah padi yang berumur sedang (Celebes, Pae Wita) memiliki alel yang berukuran 103-
80
JURNAL AGROBIOGEN
VOL. 7 NO. 2
Aek Sibundong 35.000 137 RM277
30.000 25.000 20.000 15.000
342 RM433
10.000 137 RM283
5.000
210 RM162
0 0
50
100
150
200
250 Size (nt)
300
350
400
450
Gambar 1. Profil fragmen DNA hasil analisis mesin Genetic Analyzer CEQ8000 dari salah satu aksesi plasma nutfah Aek Sibundong. Gambar menunjukkan ukuran alel DNA padi yang dirunning secara multiplex hasil amplifikasi marka berlabel fluorescent warna: RM277, RM433 (biru), berukuran 137 dan 342, RM283 (hijau) berukuran 137, dan RM162 (hitam) berukuran 210. Tabel 2. Profil keragaman alel yang terdeteksi berdasarkan sidik jari DNA menggunakan 30 marka SSR terpaut gen pengatur umur pembungaan (HD genes). No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30.
Marka RM5 RM283 RM3857 RM5404 RM5607 RM514 RM55 RM5393 RM5475 RM5924 RM5442 RM124 RM161 RM162 RM6003 RM3463 RM6536 RM5218 RM7074 RM1306 RM3859 RM433 RM5432 RM6070 RM3571 RM215 RM5392 RM5756 RM6704 RM277 Rata-rata
Krom 1 1 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 5 6 6 6 6 6 7 7 7 8 8 8 8 9 10 10 10 12
Terpaut gen
HD7 HD7 HD7
HD8 HD6 HD6 HD8
HD3 HD3 HD3 HD3 HD4 HD2 HD4 HD5 HD12 HD12 HD14 HD14 HD14
Jumlah alel 10 15 6 11 7 17 10 15 3 18 8 9 9 21 12 13 5 8 3 15 1 5 6 6 18 12 3 15 5 11 10
Alel dominan Ukuran (pb)
Frekuensi (%)
118 150 196 146 188 245 223 164 170 160 168 265 164 208 146 164 170 166 102 178 109 222 120 195 160 146 104 170 166 119/120
0,18 0,26 0,67 0,34 0,29 0,16 0,32 0,43 0,77 0,17 0,56 0,56 0,58 0,28 0,54 0,13 0,64 0,49 0,72 0,26 1 0,40 0,79 0,48 0,13 0,19 0,66 0,17 0,75 0,70
PIC 0,43 0,33 0,56 0,83 0,90 0,43 0,47 0,58 0,53 0,55 0,54 0,37 0,50 0,59 0,46 0,58 0,33 0,58 0,67 0,47 0,51 0,84 0,48 0,56 0,54 0,67 0,68 0,84 0,66 0,37 0,62
2011
D.W. UTAMI ET AL.: Keragaman Genetik 96 Aksesi Plasma Nutfah Padi
81
112 pb. Hasil pada Tabel 2 juga menujukkan adanya ukuran alel dominan yang ditemukan dari setiap lokus marka yang dianalisis. Frekuensi tertinggi alel dominan terdeteksi pada lokus RM3859 karena hanya mendeteksi 1 macam alel berukuran 109. Di samping alel dominan terdapat alel jarang pada setiap lokus, yaitu alel yang terdeteksi dengan frekuensinya kurang dari 5%. Keberadaan alel jarang atau alel spesifik ini dapat menjadi pembeda satu aksesi dengan aksesi yang lain. Tingkat keberadaan alel jarang ini dapat tercermin pada tingkat polimorfime dari masing-masing lokus yang ditandai oleh masing-masing marker.
RM3571 yang terpaut dengan salah satu gen pengatur umur pembungaan, HD2, seperti pada Gambar 2.
Identifikasi Kandidat Marka Pembeda Aksesi dan Umur Berbunga
Polimorfisme juga terlihat pada analisis selanjutnya, yaitu analisis kuantifikasi ukuran alel menggunakan mesin Genetic Analyzer 8000, dan salah satu hasil analisis tersebut seperti terlihat pada Gambar 3. Polimorfisme yang terlihat pada Gambar 3 menunjukkan bahwa plasma nutfah BP1979B-23-7-TB-1-1 yang ber-
Hasil pada Gambar 2 menunjukkan bahwa marka RM3571 yang terpaut dengan salah satu gen pengatur umur pembungaan, HD2, bersifat polimorfis untuk beberapa aksesi. Polimorfisme terlihat pada plasma nutfah Kinamaze (urutan running nomor 15) yang berumur sangat genjah (90 hari) dengan plasma nutfah Lambau (urutan running nomor 16) yang berumur sedang (130 hari). Secara keseluruhan variasi ukuran hasil amplifikasi PCR pada Gambar 2 berkisar pada ukuran sekitar 300 pasang basa.
Dari 30 marka SSR yang digunakan untuk analisis, beberapa marka menunjukkan adanya polimorfisme antara aksesi padi umur genjah dan sedang. Salah satunya adalah hasil amplifikasi menggunakan marka
1 2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16
17 18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 31
Gambar 2. Profil hasil amplifikasi PCR dengan marka RM3571. Urutan sampel: 1 = Aek Sibundong, 2 = Andel Merah, 3 = Celebes, 4 = Cempo Merah, 5 = Cempo Putih, 6 = Dodokan, 7 = Dupa, 8 = Fatmawati, 9 = Gilirang, 10 = Gunung Perak, 11 = Hawara Bunar, 12 = Inpari1, 13 = IR7114-6-407-2-1-2-1-1, 14 = Kenanga, 15 = Kinamaze, 16 = Lambau, 17 = Lestari, 18 = Mandel Handayani, 19 = Menthik Putih, 20 = Menur, 21 = Pandan Wangi, 22 = Pare Barri, 23 = Pare Bau, 24 = Pare Kombong, 25 = Pare Lea, 26 = Pindjan, 27 = Pulut Mandoti, 28 = RI-1, 29 = Rodjolele, 30 = Saodah Merah, 31 = Slegreng. BP 1979B-23-7-TB-1-1 (104 hari)
Pare Kombong (150 hari) 6.000
5.000
RM7074 105
5.500
4.500
5.000
4.000
4.500
3.500
4.000
RM7074 100
3.000 2.500
3.500 3.000 2.500
RM5607 104
2.000
2.000
1.500
1.500
1.000
90,38
500 60
60
70
65
70 75
80,10 81,87 80
80
90,37 88,06 90
97,25
100
130
85 90 95 100 105 110 115 120 Size (nt)
1.000 500
63,10 60
70
76,00 79,45 80 81,62
61,27
0 55
60
65
70
75
96,84 90,03 90,05 90 87,81 94,8797,52
80 85 90 Size (nt)
95 100 105 110 115
Gambar 3. Salah satu hasil analisis kuantifikasi ukuran alel yang bersifat polimorfis antara plasma nutfah BP1979B-23-7-TB-1-1 yang berumur sangat genjah (104 hari) dengan Pare Kombong yang berumur sedang (150 hari).
82
JURNAL AGROBIOGEN
VOL. 7 NO. 2
Tropical Japonica Umur sedang-umur dalam
Pae Wila I.A Ketan Mesir Ketan gajih Huma Gadag Jalawara Ketan Lekatar Rebo Ketan Gembong Jawa Wakai Ketan Kawi Pulut Pontianak Fatmawati Kinamaze IR7114-6-407-2-1-2-1-1 Hawara Bunar Pulut Sappa Morin Lalanjar BPI 76 Popot Si Pulut IR-1509-8803 Jalu Least Jalu Pakok IR30 Padi Kuda Ketan Hitam Maninjau Padi Lemunyan Padi Merah Rangkat-B Gilirang Bintang Ketan Huma Siam Putih Ketan Saru-A Repong Laka Azelapan Telur Asin Jawa Bali Celebes Dupa Pae Wila I.B Pae Biyu Nggolopua Saodah Merah RI_1 Inpari-1 Si Bau Slegreng Kenanga Menthik Putih Lestari Menur Mandel Cempo Merah Andel Merah Aek Sibundong Nipponbare Wase Oikoku CT 13234 Silugonggo Pulut Mandoti Pare Barri Rodjolele Pare Lea Pare Kombong Pare Bau Pandan Wangi B11742-RS*-2-3-MR-34-1-1-5 BP B11283-6C-PN-5-MR-2-3-Si-1-3-1-1 Rodjolele Gepyok Cempo Putih Pindjan Genjah Welut Genjah Rawe S4616-PN-7-3 Ciganjur Ketan Gajih OM 5240 Gunung Perak Dodokan KDM B11742-RS*-2-3-MR-34-1-1-4 B11742-RS*-2-3-MR-34-1-1-3 B11742-RS*-2-3-MR-34-1-2-3 B10970C-MR-4-2-1-1-1-Si-3-2-4-2-1 B11742-RS*-2-3-MR-34-1-4-3 B11742-RS*-2-3-MR-34-1-2-1 OM 4495 Pulut Sawijan B11742-RS*-2-3-MR-34-1-4-1 Sintanur OM 2395 B11283-6C-PN-5-MR-2-3-Si-1-2-1-1 Lambau
Indica/Japonica Umur sangat genjah-genjah
0.1 Expected Substations per Size
Gambar 3. Dendrogram keragaman 96 aksesi plasma nutfah padi menggunakan 30 marka SSR terpaut dengan gen pengatur umur pembungaan (HD genes).
2011
D.W. UTAMI ET AL.: Keragaman Genetik 96 Aksesi Plasma Nutfah Padi
umur sangat genjah (104 hari) terdeteksi memiliki alel yang berukuran 100 basa nukleotida pada lokus RM7074 dan 104 basa nukleotida pada lokus RM5607. Kedua marka SSR terpaut dengan gen pengatur umur pembungaan HD4 dan HD7. Untuk menentukan marka SSR mana yang signifikan dapat mewakili keragaman fenotipe dan genotipe maka dilakukan analisis gabungan (association test) antara data fenotipe, yaitu data umur berbunga dengan data genotipe, yaitu ukuran alel dari 30 marka SSR pada 96 aksesi plasma nutfah padi. Hasil analisis gabungan ini menunjukkan bahwa marka RM3571 merupakan marka yang paling signifikan (P val : 0,0003) berkorelasi terhadap keragaman ukuran alel dan keragaman umur tanaman pada varietas-varietas umur sangat genjah, khususnya pada varietas Silugonggo dan Nipponbare. Marka RM3571 adalah marka SSR yang terpaut dengan gen HD12 yang terdapat pada kromosom 8. Analisis Pengelompokan 96 Aksesi Plasma Nutfah Padi Analisis pengelompokan dilakukan untuk mengidentifikasi hubungan kekerabatan antar aksesi. Hasil analisis pengelompokan keragaman sidik jari DNA yang berupa ukuran alel dari 96 aksesi plasma nutfah padi yang digunakan dalam penelitian ini, secara garis besar diperoleh dua kelompok besar berdasarkan Subspesiesnya dan juga berdasarkan karakter umur pembungaannya (Gambar 4). Kelompok pertama adalah kelompok yang sebagian besar terdiri atas plasma nutfah padi Subspesies Tropical Japonica dan berumur antara umur sedang sampai dengan umur dalam. Sebagian besar plasma nutfah yang termasuk kelompok ini adalah varietas padi lokal. Meskipun demikian terdapat pengecualian pada kelompok pertama ini, yaitu terdapatnya satu cabang kelompok yang berbeda, yaitu cabang yang terdiri dari plasma nutfah Kinamaze (Japonica, umur berbunga 90 hari), Fatmawati (Indica, umur berbunga 115 hari), dan IR7114-6-407-2-1-2-1-1 (Indica, umur berbunga 104). Salah satu kemungkinannya, ketiga varietas tersebut memiliki kedekatan atau kemiripan nenek moyang dengan padi lokal. Namun demikian perlu dilakukan analisis lebih lanjut menggunakan marka-marka lain, terutama marka yang polimorfis untuk genom Indica dan Japonica. Kelompok kedua adalah kelompok yang sebagian besar terdiri atas plasma nutfah padi Subspesies Indica atau Japonica yang berumur antara umur sangat genjah sampai dengan genjah. Sebagian besar
83
plasma nutfah yang termasuk kelompok ini adalah varietas padi introduksi dan galur harapan. KESIMPULAN Hasil analisis keragaman genetik 96 aksesi plasma nutfah padi berdasarkan sidik jari DNA menggunakan 30 marka SSR yang 67% terpaut dengan gen umur berbunga (HD/heading date): terdeteksi total 297 alel, rerata nilai PIC yang diperoleh 0,62 dengan nilai PIC tertinggi terdapat pada lokus yang ditandai marka RM5607. Marka ini dapat menunjukkan polimorfisme ukuran alel antara plasma nutfah padi genjah-sangat genjah dengan padi umur sedang. Hasil analisis gabungan menunjukkan bahwa marka RM3571 merupakan marka yang paling signifikan (P val : 0,0003) berkorelasi terhadap keragaman ukuran alel dan keragaman umur tanaman pada varietas-varietas umur sangat genjah, khususnya pada varietas Silugonggo dan Nipponbare. Marka RM3571 adalah marka SSR yang terpaut dengan gen HD12 yang terdapat pada kromosom 8. Berdasarkan hasil analisis pengelompokan secara garis besar diketahui hubungan kekerabatan antar aksesi, yaitu diperolehnya dua kelompok besar berdasarkan Subspesiesnya dan juga berdasarkan karakter umur pembungaannya DAFTAR PUSTAKA Balai Penelitian Tanaman Padi. 2009. Benchmarking Padi. Unpublished. Bredemeijer, M., J. Cooke, W. Ganal, R. Peeters, P. Isaac, Y. Noordijk, S. Rendell, J. Jackson, S. Roder, K. Wendehake, M. Dijcks, M. Amelaine, V. Wickaert, L. Bertrand, and B. Vosman. 2002. Construction and testing of a microsatellite containing more than 500 tomato varieties. Theor. Appl. Genet. 105:1019-1026. Brown-Guedira, G.L., J.A. Thompson, R.L. Nelson, and M.L. Warburton. 2000. Evaluation of genetic diversity of soybean introduction and North American ancestors using RAPD and SSR markers. Crop Sci. 40:815-823. Corbett, G., D. Lee, P. Donini, and R.J. Cooke. 2001. Identification of potato varieties by DNA profiling. Acta Hort. 546:387-390. Gravendeel, B. 2000. Reorganizing the orchid geneus Coelogyne: A phylogenetic classification based on morphology and molecules. National Herbarium Netherland. Luce, C., J.L. Noyer, D. Tharreau, N. Ahmadi, and H. Feyt. 2001. The use of microsatellite markers to examine the diversity of the genetic resources of rice (Oryza sativa) adapted to european condition. Acta Hort. 546:221-235.
84
JURNAL AGROBIOGEN
VOL. 7 NO. 2
Narvel, J.M., W.R. Fehr, W. Chu, D. Grant, and R.C. Shoemaker. 2000. Simple sequence repeat diversity among soybean plant introductions and elite genotypes. Crop Sci. 40:1452-1458.
Van Eeuwijk, F.A. and C.P. Baril. 2001. Conceptual and statistical issues related to the use of molecular markers for distinctness and essential derivation. Proc. Int. Symp. on Molecular markers. Acta Hort. 546:35-53.
Plaschke, J., M.W. Ganal, and M.S. Röder. 1995. Detection of genetic diversity in closely related bread wheat using microsatellite markers. Theor. Appl. Genet. 91:10011007.
Yamamoto, T., H.X. Lin, T. Sasaki, and M. Yano. 2000. Identification of heading date quantitative trait locus Hd6 and characterization of its epistatic interactions with Hd2 in rice using advanced backcross progeny. Genetics 154:885-891.
Rongwen, J., M.S. Akkaya, A.A. Bhagwat, U. Lavi, and P.B. Cregan. 1995. The use of microsatellite DNA markers for soybean genotype identification. Theor. Appl. Genet. 90:43-48. Septiningsih, E.M., T.J. Santoso, D.W. Utami, and N. Hidayatun. 2004. Analisis sidik jari DNA varietas tanaman pangan. Kumpulan Makalah Seminar Hasil Penelitian BB-Biogen Tahun 2004. hlm. 140-151.
Yano, M., S. Kojima, Y. Takahashi, H. Lin, and T. Sasaki. 2001. Genetic control of flowering time in rice, a shortday plant. Plant Physiol. 127:1425-1429. Zhang, D.P., D. Carbajulca, L. Ojeda, G. Rossel, S. Milla, C. Herrera, and M. Ghislain. 2000. Microsatellite analysis of genetic diversity in sweetpotato varieties from Latin America. CIP Program report 1999-2000. p. 295-301.
