Kawalatur Expresi Gen Gene Expression and Regulation A. Sintesis Protein a) Kod Genetik *
Maklumat dalam gen dibawa dalam bentuk kod= kod genetik.
*
jujukan asid nukleik pada mRNA dibaca mengikut kodon= 1 kodon terdiri daripada 3 bes.
*
1 asid amino mungkin dikodkan oleh lebih daripada satu kodon.
*
Korana, Nirenberg dan Leder memainkan peranan penting dalam penyelidikan kod genetik
1
Kod Genetik
2
*
Contoh:
DNA: TAC AAA AAG GTT TCG CAC ACT
mRNA:AUG UUU UUC CAA AGC GUG UGA
AA:
Met Phe Phe Gln Ser Val ***
Kodon Mula: ATG (>90%), GTG (>10%) Kodon “Stop”: UGA, UAA, UAG
3
b) Peranan mRNA
*
messenger RNA dihasilkan oleh polimerase RNA menggunakan DNA (kromosom) sebagai templat. Proses digelar TRANSKRIPSI
*
mRNA membawa maklumat tentang protein yang perlu dihasilkan didalam jujukan asid nukleiknya.
*
jujukan mRNA di TERJEMAHKAN oleh ribosom untuk menghasilkan jujukan asid amino (protein)
4
Transkripsi RNA polimerase
Tapak TGTTGACA--11-15bp--TATAAT--5-8bp-- Transkripsi Mula -35 -10
*
Jujukan -35 dan -10 (Pribnow box, TATAA box) yang ditunjukkan ialah jujukan konsensus Gen
rrnA2 rrnE1 rrnD1 bioB trp lac *
* * 5
-10
TATTAT TATAAT TATAAT TAGGTT TTAACT TATGTT
Enzim RNA polimerase bersentuhan dengan templat DNA di bahagian -35 dan -10 Nukleotida pertama yang ditranskripsikan lazimnya purina: A atau G mRNA:
SD Kodon (RBS) Mula
Kodon Stop
Bahagian yang diterjemahkan 3-10 nukleotida diantara RBS dan Kodon Mula
SD (jujukan Shine -Dalgarno) = RBS (Ribosome binding site) *
Jujukan RBS adalah komplementari pada suatu jujukan dalam 16S rRNA yang terdapat dalam subunit 30S ribosom.
mRNA
5'-UAAGGAGGNNNNNNNNNAUG
3'
|||||||| 16SrRNA OH-AUUCCUCC-(~1400 NNN)-5'
6
Kodon Mula *
Amino asid pertama dalam rantai peptida ialah "Methionine"
*
Oleh itu "Kodon Mula" lazimnya: ATG (>90%)
*
Dalam beberapa gen kodon mula didapati mempunyai jujukan GTG (>10%)
*
GTG dijumpai sebagai kodon mula dalam organisma yang mempunyai kandungan GC yang tinggi dalam kromosom e.g. M. tuberculosis (65% kromosomnya terdiri daripada G dan C)
*
Sekiranya GTG kodon mula dalam sesuatu gen, GTG mula ini masih kod untuk methionine BUKAN valine
7
c) “mRNA splicing” * Gen eukariot terdiri daripada intron dan exon
Intron
Exon
DNA mRNA mRNA matang * “Splicing” berlaku dalam nukleus * mRNA matang lah yang akan diterjemahkan
Homework: Apakah mekanisma yang digunakan dalam mRNA splicing?
8
c) Peranan Ribosom *
Ribosom dijumpai dalam sitoplasma sel
*
Lebihkurang 10,000 ribosom dalam satu sel: kilang protein
Ribosom prokariot: * Satu subunit 30S & satu subunit 50S subunit (= 70S) * Subunit 30S terdiri drpd. 16S RNA + 21 proteins * Subunit 50S terdiri drpd. 23S & 5S RNA + 34 proteins * Boleh mengesan RBS pada mRNA * mempunyai 2 (transfer RNA)
9
tapak
mengikat
tRNA
d) Peranan tRNA
*
struktur: 3 "hairpin loops"
*
~ 60 jenis dalam bakteria (>100 dalam eukariot)
*
panjang: 73-93 nukleotida
10
*
mengandungi bes yang dimodifikasi (selepas dihasilkan): e.g. pseudouridine, inosine
*
tapak antikodon: mengesan dan mengikat kodon di mRNA
*
Asid amino dilekatkan kepada "asid amino arm" melalui aktiviti enzim aminoacyl tRNA synthetase
Homework: Berapakah jumlah asid amino? Berapakah jumlah aminoacyl tRNA synthesase? Berapakah jumlah tRNA dalam prokariot dan eukariot? Berapakah jumlah kodon dalam kod genetik?
11
Beberapa fakta penting tentang tRNA untuk methionine: * Ada sekurang-kurangnya 2 tRNA untuk methionine: tRNAiMet yang membawa methionine untuk kodon mula (AUG) tRNAMet yang membawa methionine untuk kodon AUG lain dalam rantaian. * methionine tRNA synthetase akan melekatkan methionine kepada kedua-dua jenis tRNA:
Met- tRNAiMet Met
Met- tRNA
* Dalam bakteria kumpulan amino dalam methionine dalam Met- tRNAiMet dimodifikasikan: "formylated"
12
(a) Langkah-langkah Permulaan (Initiation) dalam Sintesis Protein
* Proses sintesis bermula dengan subunit 30S (melalui 16S rRNA) mengesan dan mengikat mRNA pada jujukan RBS. Proses dibantu IF (initiation factors)Kompleks Permulaan 30S * 50S ribosome mengikat mRNA dan subunit 30S; IF terbebas dan GTP dihidrolisiskan untuk tenaga * tRNA membawa N-formylmethionine ke posisi pertama (tapak P) menghasilkan: Kompleks Permulaan 70S
13
(b) Pemanjangan (Elongation)
*
2 tapak bersebelahan dalam ribosom: P&A
*
Tapak A terima tRNA-AA baru; dalam contoh ini tRNA yang membawa phenylalanine (Phe-tRNAPhe)
*
Asid amino methionine akan diikat dengan asid amino phenylalanine menghasilkan permulaan rantai peptida
14
*
Ribosome akan bergerak ke arah kodon seterusnya menyebabkan Phe-tRNAPhe dan rantai peptida baru dipindahkan dari tapak A ke tapak P (pergerakan ini digelar translokasi)
*
Tapak A akan menjadi kosong
*
tRNAMet yang tidak lagi mempunyai amino asid methionine akan terkeluar dari kompleks ini
*
Perlu tenaga (GTP) and faktor-faktor pemanjangan (elongation factors)
*
Leu-tRNALeu yang membawa leucine pula bersedia untuk memasuki kompleks ini.
15
*
Leu-tRNALeu akan mengambil tempat di tapak A
*
Rantai Met--Phe akan bersambung dengan asid amino Leu menghasilkan rantai peptida Met--Phe--Leu
*
Proses ini berterusan dan rantaian akan berpanjangan: GTP dan Faktor Pemanjangan G (G elongation factor) diperlukan dalam sistem prokariot.
*
Pemanjangan akan berhenti apabila proses pemberhentian berlaku
16
(c) Pemberhentian (Termination)
*
Berlaku apabila ribosom mengesan kodon berhenti "stop codon": UAG, UAA, or UGA
* Faktor-faktor pemberhentian (termination factors': TF) menyebabkan komplex ribosom-mRNA terurai.
17
B. Kawalan Ekspresi Gen
(a) Kawalan diperingkat transkripsi:
*
Banyak gen terdapat dalam bentuk operon: beberapa gen dikawal oleh satu promoter
*
Oleh itu bila promoter “off” semua gen dalam operon tidak diekspresikan.
Homework: Review lac and trp operons! *
Kawalan transkripsi melalui mobilisasi gen Promoter
18
Gene A
Gene B
Gene B
Gene A
*
Kawalan promoter
transkripsi
melalui
“flip-flop”
Promoter
*
Promoter kuat dan promoter lemah (strong and weak promoters)
*
Pemberhentian Transkripsi (Transcription termination) Dalam prokariot kromosom kecil-gen berdekatan diantara satu dengan yang lain Kawalan pemberhentian transkripsi penting untuk menghalang masaalah penghasilan mRNA yang tidak betul.
19
Dua mekanisma utama: a) Rho-dependent (perlu protein Rho termination factor) *
50% tapak pemberhentian menggunakan protein Rho - tiada persamaan jujukan dapat dilihat
*
Protein Rho berasosiasi dengan rantaian mRNA dan interaksi ini mengaktifkan aktiviti ATPase
*
Rho bertranslokasi di atas mRNA ke arah 3' *
20
Mungkin "menolak" RNA polymerase daripada templat DNA
b) Rho independent (tidak perlu protein khas)
mRNA forms Stem - Loop RNA polymeras
21
22
(a) Kawalan diperingkat terjemahan: *
jumlah gen rRNA: lagi banyak gen rRNA lagi banyak ribosom dihasilkan dan lebih cepat ekspresi
*
mRNA prokariot bersifat polisistron: satu mRNA mengkodkan lebih dari satu gen dan diekspresikan serentak.
*
Gen-gen dalam berlainan
kerangka
terjemahan
AUG GCG ACG UUU UUA UGC GCC UGC
23
Jenis-jenis ekspresi 1. Constitutive * *
Sentiasa diekspresikan contoh: gen ribosomal, gen-gen replikasi dan transkripsi, metabolisme
2. Inducible *
Ekspresi perlu diransangkan
*
Contoh: lac operon. Bila lactose ditambah dalam medium E. coli, enzim ßgalactosidase dan lac permease dihasilkan dalam beberapa minit.
*
repressor lac menghalang transkripsi. Lactose mengikat protein repressor. Kedua-dua enzim diekspresikan sekali.
*
Lazim melibatkan kemasukan bahan dari luar kedalam sel.
24
3. Repressible *
Gen dieskpresikan secara normal (contoh gen penghasilan asid amino tertentu)
*
Jika asid amino tersebut terdapat dalam medium dan masuk kedalam sel atau penghasilan asid amino melebihi keperluan: asid amino berlebihan mengikat repressor protein dan kompleks asid amino-repressor menghalang transkripsi
4.
Cryptic
* *
Gen yang tidak ditranskripsi ?
25
