KATIONCSATORNÁK MODULÁCIÓJÁNAK ELEKTROFIZIOLÓGIAI ÉS FARMAKOLÓGIAI VIZSGÁLATA PRIMER SZENZOROS NEURONOKBAN ÉS AGYI KAPILLÁRIS ENDOTÉLSEJTEKBEN

KATIONCSATORNÁK MODULÁCIÓJÁNAK ELEKTROFIZIOLÓGIAI ÉS FARMAKOLÓGIAI VIZSGÁLATA PRIMER SZENZOROS NEURONOKBAN ÉS AGYI KAPILLÁRIS ENDOTÉLSEJTEKBEN

DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS

DR. BALLA ZSOLT

PROGRAMVEZETŐ: PROF. DR. SZOLCSÁNYI JÁNOS TÉMAVEZETŐ: PROF. DR. CZÉH GÁBOR *PD.

DR. INGOLF E. BLASIG

PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM, ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR FARMAKOLÓGIAI ÉS FARMAKOTERÁPIAI INTÉZET, MTA NEUROFARMAKOLÓGIAI KUTATÓCSOPORT *FORSCHUNGSINSTITUT

FÜR MOLEKULARE PHARMAKOLOGIE,

BERLIN, GERMANY

PÉCS, 2003

TARTALOMJEGYZÉK A FESZÜLTSÉGFÜGGŐ Na+ ÉS K+ CSATORNÁK..................................................................................................4 A FESZÜLTSÉGFÜGGŐ Na+ CSATORNÁK ....................................................................................................................5 A FESZÜLTSÉGFÜGGŐ K+ CSATORNÁK ......................................................................................................................9 KAPSZAICIN FESZÜLTSÉGFÜGGŐ Na+ CSATORNÁKRA GYAKOROLT HATÁSA PRIMER SZENZOROS NEURONOKBAN ......................................................................................................................................................18 BEVEZETÉS .........................................................................................................................................................18 PROBLÉMAFELVETÉS.......................................................................................................................................21 CÉLKITŰZÉSEK ..................................................................................................................................................24 KÍSÉRLETI MÓDSZEREK ..................................................................................................................................25 1. Preparátumok ...............................................................................................................................................25 2. Elektrofiziológia ..........................................................................................................................................26 3. Adatfeldolgozás ...........................................................................................................................................28 EREDMÉNYEK ....................................................................................................................................................28 1. NGF-kezelt trigeminus ganglionsejt tenyészet ............................................................................................28 2. Akutan izolált trigeminus ganglionsejtek.....................................................................................................35 3. Trigeminus ganglion szeletpreparátum ........................................................................................................35 ÚJ EREDMÉNYEK, MEGBESZÉLÉS .................................................................................................................39 A VR1 RECEPTOR KAPSZAICIN ÁLTALI AKTIVÁCIÓJÁNAK VIZSGÁLATA FLUORESZCENS Ca2+ MÉRÉSI MÓDSZERREL...........................................................................................................................................45 BEVEZETÉS .........................................................................................................................................................45 CÉLKITŰZÉSEK ..................................................................................................................................................46 KÍSÉRLETI MÓDSZEREK ..................................................................................................................................47 1. Sejtkultúra....................................................................................................................................................47 2. Fluoreszcens Ca2+-mérés..............................................................................................................................47 3. RT-PCR .......................................................................................................................................................48 4. A VR1 cDNS klónozása ..............................................................................................................................48 5. Humán sejtvonal transzfekciója ...................................................................................................................50 EREDMÉNYEK ....................................................................................................................................................51 1. Kapszaicin hatása trigeminus ganglionsejtek intracelluláris Ca2+ koncentrációjára ....................................51 2. Kapszaicin hatása patkány VR1 receptorral transzfektált HT1080 sejtvonalban.........................................52 ÚJ EREDMÉNYEK, MEGBESZÉLÉS .................................................................................................................54 A Ca2+/KALMODULIN-DEPENDENS PROTEIN KINÁZ II IZOENZIMEK MODULÁLÓ HATÁSA KAPILLÁRIS ENDOTÉLSEJTEK FESZÜLTSÉGFÜGGŐ K+ CSATORNÁIRA HIPOXIÁBAN .........................56 BEVEZETÉS .........................................................................................................................................................56 PROBLÉMAFELVETÉS.......................................................................................................................................59 CÉLKITŰZÉSEK ..................................................................................................................................................60 KÍSÉRLETI MÓDSZEREK ..................................................................................................................................61 1. Sejtkultúra....................................................................................................................................................61 2. Hipoxia protokoll .........................................................................................................................................61 3. RT-PCR .......................................................................................................................................................62 4. Immunoblot..................................................................................................................................................62 5. Immunhisztokémia.......................................................................................................................................63 6. Laser scanning mikroszkópia.......................................................................................................................63 7. Elektrofiziológia ..........................................................................................................................................63 8. Adatfeldolgozás ...........................................................................................................................................64 EREDMÉNYEK ....................................................................................................................................................65 1. Az agyi kapilláris endotélsejtek hipoxiás duzzadása ...................................................................................65 2. A feszültségfüggő K+ áram komponensei, azok szeparálása .......................................................................68 3. A feszültségfüggő K+ áram jellemzése, hipoxiás modulációjának leírása ...................................................70 4. A hipoxiás moduláció mechanizmusának vizsgálata ...................................................................................72 5. A CaMKII izoenzimek transzkripciós mintázatának jellemzése patkány agyi kapilláris endotélsejtekben.73 6. A CaMKII izoenzim proteinek expressziós mintázatának jellemzése .........................................................75 7. A CaMKII izoenzimek ionomycinnel és hipoxiával kiváltott aktiválódásának kimutatása, jellemzése ......76 8. A tranziens outward K+ áramot vezető csatornaprotein immunhisztológiai detektálása ..............................77 ÚJ EREDMÉNYEK, MEGBESZÉLÉS .................................................................................................................78

2

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS.....................................................................................................................................85 HIVATKOZOTT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE.....................................................................................................86 SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE ........................................................................................................................98

3

A feszültségfüggő Na+ és K+ csatornák Az élő sejtek általános jellemzője a membránpotenciál, mely a töltött részecskék számára közvetlenül átjárhatatlan sejtmembrán két oldalán a nem neutrális részecskék által hordozott elektromos töltés egyenlőtlen eloszlásából ered. Az intracelluláris térben több negatív töltés halmozódik fel, ennek megfelelően a nyugalmi membránpotenciál a sejttípustól függően különböző mértékben negatív (-20 - -90 mV). A membránpotenciál kialakításában és szabályozásában számos tényező játszik szerepet (az ioncsatornák adott ionra vonatkozó vezetőképessége, az extra- és intracelluláris ionkoncentrációk, Na-KATP-áz, transzporterek, stb.). A membránpotenciál fenntartása és aktív szabályozása energiaigényes folyamat, azonban számos fontos sejtfunkcióhoz nélkülözhetetlen (ingerületterjedés és annak szinaptikus átvitele, kontrakció, szekréció, stb.). Az ionok transzmembrán mozgása speciális membránfehérjéken, az ioncsatornákon át zajlik, melyek 2 alaptípusa: kapuzott és nem-kapuzott csatornák. A nem-kapuzott csatornák vezetőképessége nem regulált, konstans. Ilyenek bizonyos Na+, K+ és Cl- csatornák. Ezeken az ún. szivárgási (leakage) csatornákon át nyugalmi állapotban passzív áramok folynak, a csatornák fenti ionokra

vonatkoztatott

vezetőképessége

a

nyugalmi

membránpotenciál

kialakításában döntő szerepet játszik. A kapuzott csatornák bizonyos ionokra vonatkoztatott vezetőképessége változó, különféle mechanizmusok által szabályozott, ennek módja alapján az alábbi

csoportokra

(intracelluláris)

oszthatók:

szignál-aktivált,

feszültség-aktivált,

mechanikai

ligand-aktivált,

erő-aktivált,

valamint

a

disszertációban részletesen jellemzett, kapszaicin, protonok és fájdalmas hőingerek által aktivált vanilloid receptor (VR1). A feszültség-aktivált csatornák Na+, K+, Ca2+ és Cl- ionokra permeábilis családjai ismertek. Ezen csatornák a membránpotenciál

dinamikus

szabályozásában

(pl.

akciós

potenciál,

szinaptikus transzmisszió, stb.), ill. egyes Ca2+-szignalizációs mechanizmusok elindításában (neuronok,

bírnak

izomsejtek)

jelentős

szereppel.

membránjában

Elsősorban

találhatók.

Az

excitábilis akciós

sejtek

potenciál

iniciációja, terjedése a szinaptikus transzmisszióval egységbe szerveződve a biológiai információtovábbítás leggyorsabb útvonalát képezi. Mindez nem zárja

4

ki

azonban

azt,

hogy

ezen

csatornák

a

klasszikus

értelemben

nem

excitábilisnek tekintett sejtek (pl. endotélsejtek) felszínén is megtalálhatók legyenek és szabályozó funkcióval bírjanak. Munkám során a feszültségfüggő Na+ és K+ csatornáknak a célsejtekben betöltött funkcióját, azok patológiás körülmények közötti változását, ennek lehetséges következményeit és farmakológiai modulálhatóságát vizsgáltam. Ennek megfelelően e két csatornatípusról adok a teljesség igénye nélkül részletesebb áttekintést, nem feledve azonban azt, hogy működésük a sejtek elektrofiziológiai

tulajdonságainak

módosításán

keresztül

jórészt

a

feszültségfüggő Ca2+ csatornák funkciója által a sejtek Ca2+-homeosztázisát befolyásolva

számos

szignalizációs

utat

aktivál,

melyek

közvetlenül

szabályozzák a sejtfunkciót, akár magukon a csatornákon kifejtett moduláló hatással is.

A FESZÜLTSÉGFÜGGŐ Na+ CSATORNÁK A feszültségfüggő Na+ csatornák az akciós potenciál indulásában és a neuronális ingerület terjedésében játszanak fontos szerepet. A klasszikus Na+ áram igen gyorsan aktiválódik, majd inaktiválódik. Single channel vizsgálatok szerint a csatorna átlagos nyitvatartási ideje 0.7 ms, az elemi vezetőképessége (konduktancia) 5-20 pS. A membrán depolarizálódásakor a küszöbpotenciált elérve elegendő arányú zárt állapotú (tehát aktiválható) Na+ csatorna esetén a csatornák tömeges megnyílása a membrán további gyors depolarizációját okozza. Az akciós potenciál létrehozásában és lecsengésében, a refrakter periódus kialakításában a K+ konduktanciák későbbi aktiválódása mellett a Na+ csatorna 3 különböző funkcionális állapotának ciklikus váltakozása játszik szerepet. Ezek jellemzésére Hodgkin és Huxley már az 50-es években alkalmazta az m és h partikulumok fogalmát, ahol az m partikulum az aktivációban, a h az inaktivációban játszik szerepet, mindkettő feszültségfüggő, egymástól pedig függetlenek, ami eltérő aktivációs (m∝) és inaktivációs (h∝) függvényt eredményez (Hodgkin és Huxley, 1952). A Na+ áramok vizsgálata alapján matematikai modelljüket 3 db m és 1 db h részecske létezésének feltételezésével építették fel. A maximális amplitúdó, valamint az aktivációs és

5

inaktivációs időállandó ismeretében az egyenletek jól használhatók a csatornák funkcionális állapotai közti átmenetek leírására. A Hodgkin-Huxley modell erejét a mért és a modell által számolt akciós potenciálok paramétereinek nagyfokú egyezősége mutatja. Mechanisztikusan szemlélve a csatorna zárt állapotában ”csukott” helyzetű m retesz depolarizációkor megnyílik, átlagos hajtóerő mellett ms-ként kb. 7000 Na+ ion beáramlását biztosítva. Néhány ms-on belül a h retesz a nyitott állapotú m reteszhez kapcsolódva a csatorna záródását okozza, létrehozva az inaktiválódott állapotot. Ezen állapotban a csatorna újra nem aktiválható, a repolarizáció során azonban a h retesz az m-ről leválik, s az m retesz újra zárt állapotába kerül, miáltal a csatorna depolarizációval újra aktiválhatóvá válik. A zárt→aktivált→inaktivált→zárt állapotciklus egyirányú. Mint minden modell, így a Hodgkin-Huxley is egyszerűsít, tehát természetszerűleg

korlátokkal

rendelkezik.

Újabb

vizsgálatok

szerint

az

aktiváció és inaktiváció folyamata nem teljesen függetlenek egymástól, az aktiváció feszültségfüggése az inaktiváció feszültségfüggését befolyásolni képes. A csatorna nyugalmi és nyitott állapota között átmeneti, köztes, ún. primed állapot is létezik, másrészt pedig az aktív, de még fel nem nyílt csatorna akár közvetlenül felnyílás nélkül is inaktív állapotba kerülhet (Catterall, 2000). A Na+ csatornaprotein α alegysége (subunitja) 4 közel homológ doménből (I-IV) áll, melyek egyenként 6 transzmembrán szegmenst (S1-6) tartalmaznak, a domének egymás felé forduló felszíneivel csatornát képezve (1. A). A pórust az S5-S6 közötti hairpin hurkok (H5) bélelik. A 4 domén rokon pozícióban levő aminosavai egy külső és belső gyűrűbe rendeződnek, a szelektivitási szűrőt a csatorna külső vestibulumához közeli Asp, Gly, Lys, Ala csoportok alkotják, ill. a belső gyűrű szekvenciája is meghatározó e tekintetben. Az amfipatikus S4 szegmens

a

pozitív

feszültségszenzorként

töltésű

szolgál

(m

ismétlődő retesz).

Az

Arg, S5-S6

Lys

szekvenciákkal

közti

hurok

TTX-

kötőhelyként, míg a III és IV domének közti intracelluláris hurok az inaktivációs kapuként (h retesz) funkcionál (1. B, C, D), ahol több foszforilációs hely is található. Az I és II domén közti hurok Ser tagjának protein kináz A (PKA) általi foszforilációja az áram maximális amplitúdóját csökkenti, a protein kináz C (PKC) általi foszforiláció pedig a maximális (peak) amplitúdó csökkentése

(I-II

domén

közti

hurok

foszforiláció)

mellett

a

csatorna

6

inaktivációját is lassítja (h retesz foszforiláció). A csatorna tirozin kináz általi foszforilációja pedig az inaktivációs függvényt tolja el negatív irányba. Bizonyos szövetekben az α-alegységek mellé β1, β2, ill. β3 alegység is kapcsolódhat, a β1 az α-subunitok stabilizálásában játszhat szerepet. A β-alegységek a csatorna szelektivitását, konduktanciáját nem befolyásolják, a stabilizáció mellett a kémiai szenzitivitást modulálják, emellett szerkezetükből adódóan a csatorna cytoskeletonhoz való rögzítésében is szereppel bírhatnak.

1. ábra A feszültségfüggő Na+ csatorna szerkezete A. A csatorna 4 (I-IV) doménje, egyenként 6 transzmembrán szegmenssel (S1S6). B. A III és IV domén közötti inaktivációs kapu. C. Az inaktivációs kapu helyzete a csatorna aktivált állapotában. D. Az inaktivációs kapu helyzete a csatorna inaktivált állapotában.

7

A

feszültségvezérelt

csatornablokkolók

iránti

Na+

csatornák

érzékenységük

klasszikus

alapján

történik,

felosztása ami

a

szerint

tetrodotoxin (TTX) szenzitív (TTXs) és rezisztens (TTXr) altípusok léteznek. Farmakológiai profiljuk kialakításában 6 különböző méregcsoportot kötő hely (site1-6) vesz részt, ezek sorrendben: site1 – TTX, STX (saxitoxin), μ-conotoxin; site2 – veratridin, grayanotoxin, aconitin, batrachotoxin; site3 - α-scorpion toxin, anemone toxin; site4 - β-scorpion toxin; site5 – brevetoxin, ciguatoxin, site6 – δ-conotoxinok. blokkolja a

A toxinok kötődése változatos hatást eredményez,

konduktanciát, megváltoztatja a szelektivitást, lassítja vagy

megakadályozza

az

inaktivációt,

az

aktivációs

függvényt

módosítja.

A

kötőhelyek közötti interakciók tovább komplikálják a toxinok hatásait (Cestele és Catterall, 2000). Említést érdemel a primer szenzoros neuronokban, pl. hátsó gyöki ganglionsejtekben (DRG) leírt TTXr Na+ áramok populációja. Az elsősorban kis DRG-sejtekben látható tipikus TTXr áram aktivációs küszöbe

kb. 10 mV-al

pozitívabb, elemi konduktanciája kisebb, az aktivációs kinetikát jellemző Boltzmann (k) konstans azonban nem tér el a TTXs áramétól. A legnagyobb különbséget a TTXr áram lassú inaktivációja jelenti, amely már inkább a tranziens Ca2+ áramra jellemző idődimenzióban mozog. Létezik viszont olyan TTXr áram altípus is, amelyet inaktivációjának extrém lassúsága miatt (kb. 16 s időállandó) perzisztens Na+ áram névvel illetnek. Mindezeken kívül DRGsejtekben található több olyan áramtípus is, melyek a központi idegrendszer sejtjeiben nem fordulnak elő. Ilyen pl. a TTX-szenzitív PN1-hNE típus, mely hirtelen

depolarizációkor

gyors,

nagy

amplitúdójú

áramot

vezet,

lassú

depolarizáció hatására viszont lassan inaktiválódó áram jellemzi. A TTXr áramok közül pedig az SNS-PN3 (SNS: sensory neuron specific), NaN (más névvel SNS2), ill. az NaG ismertek. Pontos funkciójuk még tisztázásra szorul, a TTXs típusok valószínűleg az akciós potenciál keletkezéséért felelősek, míg a TTXr áramok az ingerületvezetést modulálják, pl. a tüzelési minta (firing pattern) beállításával (Elliott, 1997, Renganathan és mtsai, 2003). A TTXr áramok szelektív gátlása révén a nociceptív afferensek blokkolására és antinociceptív hatású farmakonok kifejlesztésére is folynak kísérletek (Trezise és mtsai, 1998, Brau és mtsai, 2001).

8

A FESZÜLTSÉGFÜGGŐ K+ CSATORNÁK A

sejtek

nyugalmi

K+

konduktanciája

az

állandóan

nyitott

K+

csatornáknak köszönhetően magas, s ez jelentős mértékben meghatározza a nyugalmi membránpotenciál értékét. A feszültségfüggő K+ csatornáknak a membránpotenciál

szabályozásában

betöltött

szerepe

jelentős.

A

megemelkedett K+ konduktancia membránpotenciált stabilizáló erőként lép fel. Lévén a K+ ekvilibriumpotenciálja a szokványos extra- és intracelluláris K+ koncentráció mellett –90 mV körüli, a depolarizációra nyíló K+ csatornák aktiválódása által létrehozott K+ konduktancianövekedés a repolarizáció irányában hat. Bizonyos csatornatípusok

az akciós potenciál repolarizációs,

valamint utóhiperpolarizációs fázisának kialakításában vesznek részt. A K+ áramok összetett szerepet töltenek be a sejtek elektrofiziológiai folyamataiban, a funkciók többé-kevésbé a különböző K+ áram és csatornatípusok szerint differenciálódnak (Pongs, 1990, Christie, 1995). Míg a Na+ és Ca2+ csatornák esetében a 4 domén egyetlen fehérjeláncra van

˝felfűzve˝, addig a K+

csatornák

esetében

a

domének

elkülönült

molekulákat alkotnak (2. A). Így a csatornák α4β4 heteromultimerek, a 6 transzmembrán szegmenssel rendelkező α alegységek alkotják az ioncsatornát (2. B), a β, citoplazmatikus subunitok modulátor szereppel bírnak (Yellen, 2002). Hasonlóan a Na+ csatornához, a pozitív töltésű S4 szegmens szolgál feszültségszenzorként (n reteszek) (2. C, D). A Hodgkin-Huxley modell szerint a K+ csatorna nyitását negyedfokú egyenlet írja le, jelezve, hogy ehhez 4 retesz elmozdulására van szükség (Hodgkin és Huxley, 1952). A modell ez esetben is jól korrelál a később felfedett molekuláris szerkezettel. Az S4 régió a Na+, K+, Ca2+ csatornák esetében nagyfokú homológiát mutat. Az S5-S6 közötti hurkok (szinonimák: H5, P régió, turret) egymás felé fordulva alkotják az ioncsatornát (2. B). A H5 régióban elhelyezkedő selectivity filter szakasz minden K+ csatorna esetében ugyanaz, ennek megőrzése a K+ szelektivitás szempontjából jelentős, ugyanis itt egy vagy két aminosav megváltozása elegendő a K+-Na+ szelektivitás elvesztéséhez, ill. ahhoz, hogy a csatorna Ca2+-permeábilis, vagy nem-szelektív kation csatorna legyen. Az S4-S5 közti Leu-ban gazdag belső hurok a PKC által foszforilálódhat, a Leu más aminosavra való cseréje pedig a csatorna feszültségfüggését módosítja. Az S1-S2 között glikozilált extracelluláris hurok

9

található. A K+ csatornák inaktivációja a Na+ csatornákétól eltérő módon zajlik. Bizonyos

típusú

minimálisan

csatornák

a

depolarizációs

inaktiválódnak,

s

ennek

állapot

megfelelően

alatt

nem,

vagy

szintén

nem,

vagy

kismértékben inaktiválódó áramokat, pl. az ún. késői típusú (delayed rectifier) áramot hozzák létre. Más csatornák esetében a csatornafehérje intracelluláris N-terminálisa az ún. ˝ball-and-chain˝ mechanizmussal a Na+ csatornához hasonló, azonban lassabb inaktivációra képes, ez esetben pl. a tranziens, ún. A áramot alakítva ki. Az inaktivációs mechanizmus ezen modelljét eredetileg a Na+ csatornák inaktivációjának leírására alkalmazták, azonban a K+ csatornák inaktivációjának modellezésére sokkal alkalmasabbnak bizonyult (Armstrong és Bezanilla, 1973, 1977) (2. E). E csatornák esetében az N-terminális megfelelő helyen levő Cys aminosavának oxidációja, ill. a 14., 17. Arg, valamint a 18., 19. Lys neutrális aminosavra való cseréje az inaktivációt lassítja, gátolja. A

szakasz

első

22

aminosavának

részleges,

ill.

teljes

eltávolítása

az

inaktiválódás lassulását, ill. eltűnését okozza (Hoshi és mtsai, 1990). Az ily módon az inaktivációs képességét elvesztett csatornákhoz az első 22 aminosav által alkotott ˝golyót˝ visszajuttatva a csatornák visszanyerték inaktiválódó jellegüket (Zagotta és mtsai, 1990). Az inaktiváció során a ˝golyó˝ pozitív töltésű aminosavai lépnek kapcsolatba a csatorna szájadékában elhelyezkedő negatív töltésű

aromás

szerkezetű

aminosavakkal.

Az

N-terminális

régió

foszforilálásával az inaktiváció paraméterei modulálhatók. A csatornamolekula N-terminálisa által megvalósuló inaktivációt N-típusú inaktiváció névvel illetik. Más mechanizmussal zajlik az ún. C-típusú inaktiváció, mely az N-típusúhoz képest lassabb, minek során a csatornapórus permeabilitása csökken, s e jelenség a csatornamolekula C-terminálisához (S6, P régió) köthető (LopezBarneo és mtsai, 1993). Bizonyos esetekben pedig a β alegységek is rendelkezhetnek inaktiváló funkcióval.

10

2. ábra A feszültségfüggő K+ csatornák szerkezete A. A 4 α domén elhelyezkedése. B. Az α domén struktúrája, S1-S6: transzmembrán szegmensek, P: a csatornát bélelő turret régió. C. A feszültségszenzor zárt állapota. D. A feszültségszenzor nyitott állapota. E. A gyors inaktivációra képes csatorna állapotai. Az inaktiválódás a ˝ball-andchain˝ mechanizmussal történik. Az α és β alegységeket kódoló gének rendívül variábilisak, az alegységek számtalan alosztályát alakítva ki (α: Kv1.1-1.7 Shaker, Kv2.1-2.2 Shab, Kv3.13.4 Shaw, Kv4.1-4.3 Shal, Kv5-8, Kv9.1-9.3, KvLQT, EAG, β: Kvβ1.1-1.3, Kvβ23), melyek még további alosztályokra tagolódnak. Mindemellett az α és β subunitok nagy varianciával rekombinálódhatnak. Az α alegységek rendszerint homotetramert

alkotnak,

azonban

egy

alosztályon

belül

a

subunitok

heterotetramereket is képezhetnek. A különböző alosztályok subunitjai nem rekombinálódhatnak, ennek meghatározásában az N-terminális és az S1 közötti T1 domén bír központi szereppel (Li és mtsai, 1992). Bizonyos csatornák esetében pedig az alegységek 2, ill. egyetlen transzmembrán doménből épülnek fel. Ezen okok miatt a feszültségfüggő K+ csatornák egy rendkívül variábilis elektrofiziológiai

paraméterekkel

rendelkező

családot

alkotnak.

A

11

feszültségfüggő K+ csatornák egyszerűbb szerkezete és az itt megismert szerkezeti moduloknak a Na+, valamint Ca+ csatornák esetében látható bonyolultabb szerveződése arra utalnak, hogy a feszültségfüggő Na+ és Ca+ csatornák filogenetikai ősét a K+ csatorna jelenti. A fent ismertetett nevezéktan a gyümölcslégy (Drosophila melanogaster) depolarizációra aktiválódó K+ csatornáit kódoló gének molekuláris biológiai vizsgálatából ered. A mutáns X kromoszómával rendelkező Drosophila egyedek esetében éterrel történt anesztéziában jellegzetes lábrázás lépett fel, emiatt kapták a Shaker nevet. A Shaker locus mutációja a K+ áramok elektrofiziológiai jellemzőinek megváltozásához vezetett, utalva arra, hogy ezen szakasz a K+ csatornafehérjéket kódolja (Salkoff, 1983). A gén számos exont tartalmaz, melyek különböző kombinációjú expressziója okozza az általa kódolt csatornák sokféleségét. A Shakerrel rokonságot mutató gének pedig a Shab, Shaw, Shal nevet kapták. Emlősökben az ezen családokkal nagyfokú homológiát (90-98%) mutató génszakaszok szintén megtalálhatók (Butler és mtsai, 1989). A későbbiekben a befelé egyenirányító (inward rectifier) csatornákat kódoló, mintegy 6 családot alkotó gének is felfedezésre kerültek (Doupnik és mtsai, 1995). A

makroszkópos

áramok

osztályozása

és

a

csatornafehérjék

Kv

klasszifikációjának megfeleltetése összetett dolog. Az egyes áramformák kialakításában többféle csatornamolekula aktiválódása is részt vehet, egy bizonyos típusú áram pedig különböző sejtekben különféle csatornafehérjék működése által jön létre, sőt neuronokban ismeretes a szomatikus, dendritikus lokalizáció szerinti differenciáltság is. Mindezeken túl az irodalmi adatok az egyes

csatornamolekulák

variabilitással

jellemzik.

A

elektrofiziológiai fentiek

alapján

a

paramétereit

nagyfokú

makroszkóposan

leírt

K+

áramoknak sokfajta típusa ismert, melyek számos paraméterükben, pl. aktivációs, inaktivációs kinetika, küszöb, rektifikáció, amplitúdó, szelektivitás, farmakológiai profil, moduláció, stb. különböznek. Ilyen makroszkópos áram pl. a gyors, tranziens ún. A áram, a késői típusú (delayed rectifier), valamint az előzőnél is lassabban inaktiválódó delay áram, a különféle Ca2+-függő K+ áramok,

a

hiperpolarizáció

által

aktivált

inward

rectifier

(IR)

és

h

(szívizomsejtben f, neuronban Q névvel is illetett) áramok. Említést érdemel azon tény, hogy a határozott feszültségfüggéssel rendelkező konduktanciájú K+

12

csatornák

mellett

vannak

olyanok

is,

melyek

konduktanciáját

a

membránpotenciál kevésbé, vagy alig befolyásolja, annál inkább viszont bizonyos modulátor anyagok, pl. transzmitterek (szerotonin, GABA, stb.) vagy intracelluláris szignál molekulák (ATP, G-proteinek). Természetesen a szoros feszültségfüggéssel rendelkező konduktanciájú csatornák is modulálhatók pl. az intracelluláris Ca2+ koncentráció által. A lényeges momentum e tekintetben az, hogy míg bizonyos csatornák esetében a konduktancia feszültségfüggése a hangsúlyos tényező, amit a modulálhatóság finomít, más csatornák esetében a vezetőképesség tekintetében a modulátor anyagok bírnak központi szereppel, míg a feszültségfüggés háttérbe szorul. Az utóbbiakra az ATP-szenzitív és a többféle

G-protein

által

mediált

befelé

egyenirányító

(GIRK)

áramok

szolgáltatnak példát. A befelé egyenirányító, az ATP-szenzitív (KATP), valamint a GIRK csatornák mindössze 2 transzmembrán doménnel (jellemzően S5, S6) rendelkeznek (3. ábra). A közvetlenebb megfelelés miatt az utóbbi esetekben az ionáram elnevezése szolgáltatja a csatorna nevét is.

3. ábra A Kv, inward rectifier és Ca-függő K+ csatornák szerkezeti sémája Az ábramagyarázatot ld. a szövegben. A különféle K+ áramok funkciója azok alapvető tulajdonságainak tudatában írható le, ennek megfelelően a tranziens és delayed rectifier áramról adok a teljesség igénye nélkül rövid jellemzést, míg a további feszültségfüggő K+ áramtípusok munkám fókuszától távolabb esve inkább említés szintjén kerülnek szóba.

13

A kifelé irányuló gyors, azaz tranziens outward (A, Ito) áram a parancs (kommand) feszültség függvényében 1-2 ms időállandóval aktiválódik és kb. 10-25 ms időállandóval inaktiválódik. Jellegzetessége, hogy az áramot kialakító csatornák nagy része a nyugalmi membránpotenciál értékén inaktivált állapotban van, ezért csak a csatornák de-inaktivációját okozó előzetes hiperpolarizáció utáni depolarizáció váltja ki az áramot. Tipikus gátlószere a néhány mM koncentrációban adott 4-aminopyridin (4-AP), mely azonban más típusú K+ áramok amplitúdójának csökkentésére is képes. Neuronokban az akciós potenciált követő utóhiperpolarizáció képes de-inaktiválni a csatornákat, így az áram a következő akciós potenciál előtti prepotenciál ideje alatt aktiválódva a K+ konduktancia emelésével fékezi a depolarizáció ütemét. Depolarizált állapotban viszont e csatornák inaktiválódnak. Az áram képes csökkenteni az akciós potenciál sorozat frekvenciáját, tehát a neuronok tüzelésének ritmusát, ill. azok ingerlékenységét szabályozza (Gustaffson és mtsai, 1982). Hasonlóan ehhez a szívizomsejtekben az áram az akciós potenciál korai repolarizációs fázisát kialakítva az akciós potenciál hosszát képes szabályozni (Benndorf és Nilius, 1988). A legelsőként leírt K+ áramtípust, a késői típusú, ún. delayed rectifier (IK(DR)) áramot már Hodgkin és Huxley is jellemezte tintahal óriásaxonon végzett klasszikus

kísérleteikben

(Hodgkin

és

Huxley,

1952).

A

nyugalmi

membránpotenciál értékéről induló depolarizáció aktiválni képes az áramot, mely a lassabb aktivációt (5-50 ms time to peak idő) követően a fenntartott néhány 100 ms depolarizáció ideje alatt nem inaktiválódik (fenntartott, sustained

áram).

Több

másodperces

depolarizált

állapotban

azonban

amplitúdója különböző mértékben csökken. Az áram az akciós potenciál leszálló szárának kialakításában vesz részt, a csatornák lassú inaktivációja miatt pedig a lomhábban csökkenő K+ konduktancia a membránpotenciált a K+ ekvilibriumpotenciálja

felé

tolva

az

utóhiperpolarizáció

fázisának

létrehozásában is döntő fontosságú. Tetraetilammónuim-klorid (TEA) több, egyéb K+ áram mellett a delayed rectifier áramot is jelentősen blokkolja. Mivel 4-AP képes a 100 ms depolarizáció idején fennálló sustained komponens kismértékű gátlására, ill. az A áram korai komponense is blokkolható bizonyos mértékig TEA alkalmazásával, e 2 gátlószer önmagában nem alkalmas a fenti 2 áramtípus tökéletes szeparálására.

14

A Ca2+-függő K+ csatornák küszöbfeszültsége az intracelluláris Ca2+ koncentráció emelkedésével csökken, más esetekben pedig ezzel párhuzamosan az áram intenzitása nő. Azon esetekben, melyek során a depolarizáció intracelluláris Ca2+ szint emelkedéssel jár, tipikusan repetitív tüzelés esetén, ahol a Ca2+-belépés még tovább depolarizálja a membránt, a Ca2+-függő K+ csatornák aktiválódása erősíti a nyugalmi potenciál helyreállítására törekvő repolarizációs, hiperpolarizációs mechanizmust. Ezen áramcsalád részt vesz az utóhiperpolarizáció kialakításában (AHP-áramok) is, mely a neuronoknál megfigyelt adaptációs jelenség (firing rate accomodation) során a tüzelési frekvencia csökkenését okozza. A

Ba-szenzitív

inward

rectifier

csatornatípusok

konduktanciáját

hiperpolarizáció emeli, ill. gyorsan aktiválja, majd a csatornák lassan inaktiválódnak.

A

nyugalmi

membránpotenciál

fenntartásán

kívül

szívizomzatban az akciós potenciál elnyújtásában játszanak szerepet. A hiperpolarizációval aktivált Cs-szenzitív h (f, Q) áram kevert jellegű, a K+ mellett a csatornák Na+-ra is permeábilisek, emiatt az áram fordulási (reverz) potenciálja jóval pozitívabb, mint az előző áramtípusé. A lassan aktiválódó áram a membránpotenciált a pozitív tartományok felé tolja. Az áram szerepet játszhat a spontán akciós potenciálok kialakításában.

A feszültségfüggő ioncsatornák vizsgálatára a patch-clamp metodika voltage-clamp variánsa (egyetlen membránfoltban való feszültségbeállítás) jól bevált módszer. Ennek okán munkám során e módszerrel tanulmányoztam primer szenzoros neuronokban a kapszaicin feszültségfüggő Na+ csatornákon kifejtett hatását, ennek a deszenzitizáció jelenségében játszott szerepét. Ez a későbbiekben alkalmazásával,

kiegészült mellyel

a a

fluoreszcens patkány

VR1

Ca2+

mérés

receptor

módszerének

sejtvonalba

történt

transzfekcióját is jellemeztük. Agyi kapilláris endotélsejtek esetében pedig a feszültségfüggő

K+

csatornák

inaktivációjának

hipoxiás

modulációját

vizsgáltam. Ezen esetben a Ca2+/kalmodulin-dependens protein kináz II

(CaMKII) izoenzimek ebben játszott szerepének felderítésére a patch-clamp metodikát az RT-PCR és Western-blot módszerekkel kombináltam. A disszertációban összefoglalt munkám a PTE-ÁOK Farmakológiai és

15

Farmakoterápiai Intézetében kezdődött, ahol mint Ph.D. ösztöndíjas hallgató vettem részt a celluláris elektrofiziológiai laboratóriumban az alábbi új módszerek elindításában: -

patch-clamp technika

-

fluoreszcens Ca2+-mérés

-

a szövetszelet technika adaptációja trigeminus ganglionra

-

a

primer

neuronok

tenyésztésének

elindítása

és

elektrofiziológiai

alkalmazása -

az elektrofiziológiai és fluoreszcens mérésekkel kapcsolatban felmerülő számítógépes problémák megoldása hardver- és szoftverszinten. A

számos

új

módszer

beállítása,

optimalizálása

során

nyert

tapasztalataimra alapozva pályázat által vendégkutatói állást kaptam a berlini Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie Intézetben, ahol teljesen önállóan egy patch-clamp laboratórium felszerelése és munkájának biztosítása volt feladatom. Itt a módszert kapilláris endotélsejteken alkalmaztam, mely a sejtek tulajdonságaiból eredően technikailag még nagyobb kihívást jelentett. Az intézet profiljából adódóan módom nyílt egyes alapvető molekuláris biológiai technikák elsajátítására is, melyet az elektrofiziológia módszerével kombinálva alkalmaztam, ill. betekintést nyerni a gyógyászati, farmakológiai kérdések molekuláris szintű megközelítésének módszereibe is. Mindezeket azért tartom fontosnak megemlíteni, mivel az értekezés lényeges eleme a modern sejtélettani, sejtszintű biokémiai módszerek sokoldalú beállítása. A dolgozat 2 témakört érint, melyek az alapproblémát tekintve nem állnak

közvetlen

kapcsolatban

egymással.

Mindkét

munkámban

a

problémamegoldáshoz alkalmazott többirányú módszertani beállítás központi szerepét a patch-clamp technika aktuális körülményekre való adaptációja töltötte be. Általános tapasztalatom szerint egy Ph.D. disszertáció felépítését tekintve kívánatos a munka homogén jellegének hangsúlyozása, ill. az adatok ezen szempont szerinti prezentációja. Dolgozatomban én a hazai és külföldön végzett munkámat mindezek ellenére külön tárgyalva ismertetem. Véleményem szerint bármely olyan próbálkozás, mely a két tudományos probléma tárgyalását a dolgozatban találhatónál nagyobb mértékben próbálja egyesíteni, ˝összegyúrni˝, a disszertáció mondanivalójának megértését nem segíti, sőt valószínűleg bonyolultabbá, nehezen áttekinthetővé teszi. A 2 munka közös

16

nevezőpontja a feszültségfüggő Na+, valamint K+ csatornafunkció farmakológiai befolyásolhatóságának, ill. kóros állapotban zajló modulációjának vizsgálata, e jelenségek

potenciális

farmakoterápiás

haszonnal

kecsegtető

vizsgálata.

Ioncsatornákról lévén szó mindkét esetben elsődlegesen a patch-clamp módszer alkalmazása bizonyult célravezetőnek, mely hazai munkámat tekintve a fluoreszcens Ca2+ mérés és néhány molekuláris biológiai módszer, külföldi munkámat tekintve pedig több egyéb (molekuláris biológia, immunhisztokémia, laser scanning mikroszkópia) módszer alkalmazásával is kiegészült.

17

Kapszaicin feszültségfüggő Na+ csatornákra gyakorolt hatása primer szenzoros neuronokban

BEVEZETÉS A kapszaicin (8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide), mely a paprika csípős anyaga, a vanilloid receptor (VR1) szelektív aktivátora. A kapszaicin hatások vizsgálatának elindítása magyar kutatók nevéhez (Hőgyes, 1878, Jancsó Miklós, 1955) kapcsolódik. A későbbiekben a szerkezet-hatás vizsgálatok alapján egy kapszaicinre specifikus receptor létezésének felvetése szintén magyar ötlet (Szolcsányi és Jancsó-Gábor, 1975, 1976). A kapszaicin VR1 receptorra vonatkoztatott szelektivitása már a kutatások kezdeti szakaszában nagy hangsúlyt kapott, a kapszaicin nagyobb dózisai által kiváltott, egyéb kémiai fájdalomkeltőkkel szembeni deszenzibilizáció kialakulása is egy korán leírt alapjelenség (Jancsó Miklós, 1955). A kapszaicinre specifikus receptorra vonatkozó hipotézis helyességét a receptor újabban történt klónozása igazolta (Caterina és mtsai, 1997) (4. ábra). A molekula 838 aminosavból épül fel, relatív molekulatömege 95.000. A receptor-csatorna komplex feltételezett alapszerkezete 6 transzmembrán β-szalag doménből épül fel, a pórust az V. és VI. domén közti hidrofób hurok alkotja. Mind a prolinban gazdag N-, mind a Cterminális régió intracelluláris elhelyezkedésű, az N-terminálishoz közeli 3 ankyrin régióval. A VR1 molekula működését a protein kinázok modulálják, a PKC aktiváció a csatorna nyitására (Premkumar és Ahern, 2000), míg a PKA aktivációja a csatornafunkció potencírozására, a deszenzitizáció csökkentésére képes (Bhave és mtsai, 2002). A szerkezet emlékeztet az ún. store-operated Ca2+ csatornákéra. Ezek tipikus képviselője a Drosophila retinájában található TRP (tranziens receptor potenciál) protein, ezért a VR1 receptort és a többi, magas hőmérséklettel aktiválható hasonló szerkezetű ioncsatornát az új nevezéktan alapján a TRP kationcsatornák szupercsaládjának TRPV1-6 alcsoportjába sorolták (Montell és mtsai, 2002). A TRPV1/VR1 receptor agonistája

több

vanilloid

szerkezetű

anyag

(kapszaicin,

resiniferatoxin),

természetes aktivátorának a savas pH (protonok) valamint a fájdalmas, 43 °Cot meghaladó hőinger tekinthető, vagyis a receptor a fájdalmas fizikai és kémiai

18

ingerek integrátoraként funkcionál (Tominaga és mtsai, 1998). A jelenleg ismert többi TRPV ioncsatorna nem aktiválható kapszaicinnel. A TRPV1/VR1 endogén ligandjának meghatározása jelenleg is aktuális kérdés.

4. ábra A TRPV1/VR1 molekula szerkezete A molekula alapszerkezete 6 transzmembrán (β-szalag) doménből épül fel (I-VI), az 5. és 6. domén közti hidrofób hurok alkotja a feltételezett pórus régiót. Az Nterminális régió prolinban gazdag, a zöld szín a 3 ankyrin régiót jelzi. A TRPV1/VR1 receptor plazmamembrán protein egy nem-szelektív kationcsatorna, mely a Ca2+ ionokra erősen permeábilis (Bevan és Szolcsányi, 1990). E receptor-csatorna komplex megtalálható a primer szenzoros neuronok jelentős részében, melyek szómája a trigeminális, valamint a hátsó gyöki ganglionokban található. A kapszaicin szenzitív primer afferens neuronok (Szolcsányi, 1982) csoportját az exteroceptív területek C-polimodális és Aδpolimodális nociceptorai, valamint az interoceptív területeken a nyálkahártyák és

a

viszcerális

szervek

perivaszkuláris

kemonociceptorai

alkotják.

A

polimodalitás kifejezés a fájdalmas hőingerek, a fájdalomkeltő kémiai és mechanikai ingerek általi aktiválhatóságra utal. A szenzoros terminálisok mellett a trigeminus és hátsógyöki ganglion neuronpopuláció kis méretű, B típusú sejtjeinek szómamembránja kapszaicin direkt adagolására szintén érzékenységet mutat (Bevan, 1996). Átmeneti izgató hatást követően a kapszaicin a polimodális nociceptorokat deszenzitizálja természetes ingerekkel szemben is. A kapszaicin szelektív hatásáról több összefoglaló tanulmány jelent

19

meg. A bőridegekről elvezetett egyrost vizsgálatok alapján bizonyított, hogy a bőr

vékony

rostos

afferentációjának

mintegy

felét

kitevő

polimodális

nociceptorok mellett kapszaicin képes a forró receptorok, valamint a fizikai ingerrel nem aktiválható kemonociceptorok aktiválására is (Schmelz és mtsai, 1996, Yeomans és Proudfit, 1996, Ringkamp és mtsai, 2001), ugyanakkor az anyag

hatástalannak

bizonyult

a

bőr

valamennyi

Aβ,

Aδ

és

C

mechanoreceptorán (Holzer, 1991, Szolcsányi és mtsai, 1988, Szolcsányi, 1993, 1996, Belmonte és Cervero, 1996, Szállási és Blumberg, 1999). A

polimodális

nociceptorok

tekintetében

további

említésre

méltó

eredmények születtek. A klasszikus axonreflex teória szerint az antidrómos vazodilatációért felelős mediátorok bizonyos primer afferensek specializálódott effektor végzõdéseibõl szabadulnak fel. Későbbi tanulmányok igazolták, hogy a szenzoros axonterminálisok kettõs, azaz afferens és efferens funkcióval rendelkeznek,

vagyis

inger

hatására

képesek

a

vezikulák

formájában

raktározott neuropeptideket közvetlenül, axonális vezetés nélkül felszabadítani (Szolcsányi, 1984, 1996, Maggi és Meli, 1988). Tehát a nociceptív afferensek klasszikus afferens funkciójukon túl lokális effektor (Szolcsányi és Barthó, 1978, Lembeck és Holzer, 1979, Szolcsányi, 1984), valamint szisztémás regulációs (Szolcsányi, 1996) szereppel is bírnak. A neuropeptidek az ideg által innervált

bőr

és

nyálkahártyaterületeken

lokális

válaszként

neurogén

gyulladást (Jancsó és mtsai, 1967, Szolcsányi, 1988) váltanak ki. A kapszaicin szelektív hatásának felfedezése a szenzoros neuronok farmakológiai vizsgálatának nagy lendületet adott. Számos új VR1 agonista vált ismertté,

mint

pl.

a

természetes

eredetű

piperin,

zingeron,

eugenol,

terpenoidok, guajacol, resiniferatoxin (RTX), ill. a szintetikus olvanil, nuvanil, forbol vanilloidok (Szállási és Blumberg, 1999). Ezen anyagok receptor aktiváló, deszenzitizáló hatásukban különböznek egymástól. Az erős csípőanyagok a csatornát gyorsan aktiválva és nagy ionáramot létrehozva akciós potenciált váltanak ki, míg az enyhébben csípő anyagok a csatornát lassabban nyitják, kisebb ionáramot generálnak, így akciós potenciált kisebb valószínűséggel váltanak ki. A feketebors csípőanyaga, a piperin is képes neuropeptidek felszabadítására, valamint a kapszaicinnel keresztdeszenzitizációt is mutat, utalva a közös hatáshelyre (Szolcsányi, 1983, Patacchini és mtsai, 1990, Liu és Simon, 1996). Gyakran használt potens analóg az RTX, melynek érdekessége,

20

hogy a VR1 receptor-csatorna komplexet lassabban nyitja, mint a kapszaicin (Liu és mtsai, 1998), a pulmonális kemoreceptorokat előzetes aktiváció nélkül is deszenzitizálja, mégis receptor affinitási és deszenzitizációs vizsgálatokban a kapszaicinnél több ezerszer hatásosabbnak bizonyult (Szállási és Blumberg, 1990, 1999, Blumberg és mtsai, 1993). A VR1 agonisták vizsgálatával párhuzamosan a VR1 receptorral rokonságot mutató molekulák kutatása is folyik (TRPV2-6) (Szállási és Di Marzo, 2000). A vanilloid receptor farmakológiai tanulmányozásának fontos aspektusa a nociceptorok deszenzitizációja. Ebből a szempontból a deszenzitizációt előzetes izgatás nélkül létrehozó anyagok vizsgálata különös jelentőséggel bír. A szenzoros neuronok farmakológiáját tekintve jelentős ismeretanyag gyűlt össze, magát a VR1 receptort pedig 1997-ben klónozással azonosították. Mindezek ellenére jelenleg sem rendelkezünk a szenzoros neuronokon szelektíven ható gyógyszerekkel. Mivel ezek szisztematikus fejlesztésében a deszenzitizáció mechanizmusa áll középpontban, kísérleteink során a kapszaicinnek a nociceptorok deszenzitizációjában játszott szerepét az elektrofiziológia és a fluoreszcens Ca2+ mérés módszerének alkalmazásával vizsgáltuk.

PROBLÉMAFELVETÉS A

kapszaicin

regisztráció

során

szenzitív kapszaicin

neuronok hatására

intracelluláris

elektrofiziológiai

koncentrációfüggő

depolarizációt

mutatnak, melyhez gyakran akciós potenciál, valamint membrán konduktancia növekedés is társul (Baccaglini és Hogan, 1983, Heyman és Rang, 1985). Voltage-clamp vizsgálatok során a kation csatorna kapszaicin hatására történő nyitása különböző időkinetikájú befelé folyó áramokat generált a Ca2+ beáramlással párhuzamosan (Bevan és Szolcsányi, 1990, Oh és mtsai, 1996, Wood

és

Docherty,

plazmamembránban

1997).

A

elhelyezkedő

konduktancia ioncsatorna

növekedése

jelzi

megnyílását.

a

Egyes

puhatestűekben a depolarizáció az input rezisztencia emelkedésével párosul (Erdelyi

és

Such,

1986).

Kapszaicin

folyamatos

rámosása

ellenére

a

depolarizáció lassan megszűnik, ami hiperpolarizációba is átmehet. Ezzel párhuzamosan az input rezisztencia is a kontroll érték felé csökkenhet,

21

azonban stabilizálódhat a kezdeti értékhez képest magasabb, változatlan vagy kisebb értéken is, függetlenül attól, hogy a membrán a kontrollhoz képest akár hiperpolarizált állapotban is lehet. A kapszaicin rámosás alatti depolarizáció csökkenés oka egyrészt a receptor deszenzitizációja, másrészt a késői hiperpolarizációs válasz lehet, az utóbbi alapját pedig a Ca2+-függő K+ csatornák megnyílása képezheti (Marsh és mtsai, 1987). A kapszaicin-indukált áram fordulási potenciálja 0 mV körüli, ami egy nem-szelektív kationcsatorna aktiválódását sugallja (Oh és mtsai, 1996). Ion szubsztitúciós és radioaktív 45Ca2+-mal

végzett kísérletek a megnyíló konduktancia divalens kationokra,

azon belül is túlnyomórészt Ca2+-ra való permeabilitását mutatták (Wood és mtsai, 1988). Több tanulmány által leírt jelenség, hogy átmeneti izgató hatást követően kapszaicin a polimodális nociceptorokat deszenzitizálja természetes ingerekkel, így mechanikai, hő és kémiai (bradykinin) ingerekkel szemben is (Szolcsányi, 1987, 1993, Szolcsányi és mtsai, 1988). A deszenzitizáció jelensége jól megfigyelhető kapszaicin ismételt adagolását követően (Szállási és Blumberg, 1999). Nagyobb dózisban alkalmazva az anyag neurotoxikus hatást fejt ki. A deszenzitizációt tekintve el kell különíteni a farmakológiai és a funkcionális deszenzitizáció fogalmát. A farmakológiai deszenzitizáció során kapszaicin hosszabb idejű vagy ismételt adásakor a válasz folyamatos csökkenése tapasztalható, funkcionális stimulusokkal farmakológiai

azonban

a

többi

deszenzitizáció kiváltható

inger

során

válaszokat

deszenzitizációt

a

változatlanul

kapszaicin is

csökkenti

kapszaicin

hatásos

marad.

alkalmazása vagy

a

más

megszünteti.

koncentrációja

és

A A

adagolási

gyakorisága befolyásolja, míg a funkcionális deszenzitizációt az extracelluláris Ca2+ jelenléte, koncentrációja (Santicioli és mtsai, 1987). Voltage-clamp kísérletekben a pozitív membránpotenciál értéken tartott sejtek nagymértékben csökkent deszenzitizációt mutattak (Piper és mtsai, 1999), hasonlóan a Ca2+kelátor

BAPTA-val

dializált

sejtekhez.

Mindezek

azt

mutatják,

hogy

a

deszenzitizációban a Ca2+-beáramlás hatására kialakuló intracelluláris Ca2+ koncentráció emelkedés központi szereppel bír. Egyes tanulmányok szerint a megemelkedett intracelluláris Ca2+ koncentráció hatására aktiválódó, Ca2+ és kalmodulin dependens enzim, a protein foszfatáz 2B (kalcineurin) játszik főszerepet (Docherty és mtsai, 1996). Ezt támasztják alá azon megfigyelések,

22

melyek szerint a kalcineurin inhibitor cyclosporin A és cyclophilin megszünteti a deszenzitizációt (Liu és mtsai, 1991). Ezen adatok szerint a kalcineurin aktivációja lehet felelős mind a farmakológiai deszenzitizációért, mind a hosszabb távú funkcionális deszenzitizációért, mely során egyes ioncsatornák, ill. bizonyos enzimek Ca2+-dependens defoszforilációja történik. Ezt látszanak alátámasztani azon tények, melyek szerint a funkcionális deszenzitizáció függ az extracelluláris Ca2+ koncentrációtól (Santicioli és mtsai, 1987), ill. hogy a jelenség

kialakulása

ruténium

vörössel,

a

VR1

receptor

blokkolójával

megakadályozható (Maggi és mtsai, 1998). Más tanulmányok szerint az akut deszenzitizáció jelenségében a tartós depolarizációt követő receptor-csatorna komplex defoszforiláció játszik szerepet (Piper és mtsai, 1999). A kapszaicin által kiváltott Ca2+ csatorna blokkolásban tehát az aktivált receptor-csatorna komplexen át történő Ca2+-influx szerepe vetődött fel (Bleakman és mtsai, 1990, Bevan, 1996). Ennek megfelelően hátsó gyöki ganglionsejtekben

az

extracelluláris

Ca2+-nak

Ba2+-ra

történő

cseréje

megakadályozta a feszültségfüggő Ca2+ áramok kapszaicin adagolást követő gátlását. Azon sejtekben, ahol a kapszaicin nem növelte a membrán konduktanciát,

nem

volt

megfigyelhető

a

feszültségfüggő

csatornák

funkciójának változása sem (Docherty és mtsai, 1991, Bevan és Docherty, 1993). Eszerint a feszültségfüggő befelé folyó (inward) áramok modulálásában a vanilloid receptor aktiválódásának szerepe jelentős (Koplas és mtsai, 1997), mivel a kationcsatornán át belépő Na+ és Ca2+ az iongrádienst módosítva befolyásolja

az

adott

ionokra

ható

hajtóerőket.

Kapszaicin

nagyobb

koncentrációban (10-100 μM) a feszültségfüggő Ca2+ és K+ áramokat blokkolni képes. Ezen koncentrációtartományban a feszültségfüggő csatornablokkoló hatás azonban nem-neuronális sejteken is jelentkezik, az inward áram, az akciós potenciál vagy a jellemző viselkedési válaszok megjelenése nélkül is (Szolcsányi, 1990, 1993, Holzer, 1991). A témát érintő számos publikáció ellenére a kapszaicin hatására létrejövő deszenzitizáció pontos mechanizmusa még nem ismert. A deszenzitizáció egyik lehetséges magyarázata a VR1 receptor funkció kiesése, részleteit tekintve azonban a hosszantartó szenzoros deszenzitizáció pontos mechanizmusa még tisztázásra szorul. A szenzoros neuronok ionáramainak, azok kapszaicin általi direkt

vagy

indirekt

modulálódásának

jellemzése

az

egyik

lehetséges

23

megközelítési mód. A nociceptív neuronokban kapszaicin akciós potenciálokat generál, szereppel

melyek

létrejöttében

bírnak.

A

a

vanilloid

feszültségfüggő receptor

ioncsatornák

aktiválódásának

központi

feszültségfüggő

csatornákra gyakorolt hatása, ill. ennek szerepe a deszenzitizáció jelenségében javarészt még tisztázatlan. E

tekintetben

számos,

a

feszültségfüggő

Ca2+

áramokat

vizsgáló

publikáció született, a Na+ áramokra gyakorolt hatás azonban még kevéssé vizsgált. Továbbá látható, hogy a bőségesen rendelkezésre álló irodalmi adatok a kapszaicin-indukált áramok, ill. a kapszaicin adagolással kapcsolatos egyéb elektrofiziológiai jelenségek paramétereit meglehetősen nagy variabilitással írják le. Hiányzik viszont a szisztematikus összehasonlítás arról, hogy ezek mennyiben tudhatók be a kísérleti elrendezés körülményeinek, a kapszaicin adagolási módjának ill. annak, hogyan módosítják a kapszaicin hatását a sejttenyésztés körülményei, pl. hogy vizsgálhatók-e az ionáramok szenzoros ganglionból készített szelet preparátumon.

CÉLKITŰZÉSEK Kísérleteink során a fentebb leírtaknak megfelelően az alábbi kérdések vizsgálatát választottuk feladatul: I.

Kapszaicinnek a sejtek elektrofiziológiai paramétereire, valamint a feszültségfüggő inward áramokra gyakorolt hatásainak leírása.

II.

A

nM-os

nagyságrendben

alkalmazott

kapszaicin

hatásosságának

vizsgálata. III.

Kapszaicin hatása a TTX-szenzitív és rezisztens Na+ áramokra.

IV.

Ismételten alkalmazott kapszaicin ionáramokra gyakorolt hatásának leírása.

V.

A kapszaicin által indukált inward clamp-áram és a feszültségfüggő inward áramok közötti kapcsolat vizsgálata.

VI.

A kapszaicin szenzitív sejtek arányának összehasonlító vizsgálata szelet preparátumban,

akutan

izolált

és

tenyésztett

trigeminus

ganglionsejtekben. VII.

A kapszaicin által indukált membránáramok összehasonlító vizsgálata

24

szelet

preparátumban,

akutan

izolált

és

tenyésztett

trigeminus

ganglionsejtekben. VIII. Az idegnövekedési faktor (NGF) szerepének tisztázása a fentiekben. IX.

A

különböző

módszerrel

adagolt

kapszaicin

által

indukált

membránáramok összehasonlító vizsgálata.

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK 1. Preparátumok a. Sejtkultúra A

primer

sejttenyészetek

készítéséhez

1-7

napos

Wistar

patkányok

trigeminális ganglionját használtuk. Éteres altatásban végzett dekapitációt követően a ganglionokat steril foszfát pufferben (PBS) preparáltuk ki, kb. 1 mm3-es részekre daraboltuk, melyek ezután 2% kollagenázt (XI. típus) tartalmazó 37 ˚C-os PBS oldatban 5% CO2-tartalom mellett 40 percig emésztődtek. Ezt 8 perces dezoxyribonukleáz I. (0.5 mg/ml) tartalmú PBS-sel történő inkubálás követte, majd triturációt végeztünk. A sejteket 24 lyukú tenyésztőedényben elhelyezett poly-D-lysin borítású üveglemezekre ülepítettük és ebben tenyésztettük. A tenyésztőmédium összetétele a következő volt: 180 ml Dulbecco´s-Modified Eagle Medium (D-MEM), 20 ml ló szérum, 20 ml borjúszérum,

2

ml

inzulin-transzferrin-szelenium-S,

3.2

ml

putrescin-

dihidroklorid (100 μg/ml), 20 μl trijódtironin (0.2 mg/ml), 1.24 ml progeszteron (0.5 mg/ml), 100 μl penicillin, 100 μl streptomycin. Az inkubáció 37 ˚C-on, 5% CO2, 100% páratartalom mellett történt. Egyes sejttenyészetekben a médium 200 ng/ml NGF-el egészült ki. b. Akutan izolált sejtek Az eltávolított trigeminus ganglionok 50 percre 34 ˚C-os Ca2+ és Mg2+ mentes, kollagenáz (Ia típus, 0.03 mg/ml) és pronáz E (0.12 mg/ml) tartalmú mesterséges cerebrospinális folyadékban (ACSF) emésztődtek, a folyamat 1 perces tripszin inhibitoros mosással lett leállítva. A sejteket HEPES pufferelt ACSF oldatban triturációval disszociáltuk, majd üveglemezre ülepítettük, melyek 4 órán belül a regisztráló kamrába kerültek.

25

c. Szeletpreparátumok 3-12 napos, éterrel altatott, majd jéghideg vízbe helyezett Wistar patkányok agyának gyors eltávolítását követően preparáltuk ki a trigeminus ganglionokat jéghideg, oxigenált, magas Mg2+ és alacsony Ca2+ tartalmú ACSF oldat folyamatos rámosása mellett. A kötőszövet eltávolítása után vibratommal 400 μm vastag szeletek készültek, melyek ezt követően ACSF oldatban lassan, fokozatosan melegedtek fel. Az idősebb (7-12 napos) állatokból származó szeleteket a tiszta, szabad sejtfelszínhez való hozzáférés érdekében 5-10 percig IV. típusú kollagenázzal (2 %) emésztettük.

2. Elektrofiziológia A

trigeminus

szobahőmérsékleten

ganglionsejtek (23

°C)

whole-cell

történt,

voltage-clamp

folyamatos

átáramlású

vizsgálata regisztráló

kamrában az alábbiak szerint: 1) a szelet preparátumokat a 230 μl térfogatú kamra aljára rögzítve oxigenált ACSF oldattal mostuk folyamatosan; 2) az akutan izolált és tenyésztett sejtek 1.2 ml térfogatú kamrába kerültek HEPES pufferelt extracelluláris oldat átáramlása mellett. A kapszaicin az alábbi 3 módon került alkalmazásra: 1) Mind az extracelluláris, mind a kapszaicin tesztoldat perisztaltikus pumpa segítségével áramlott 2 külön polietilén csőben, azok alternáló használatával.

A

kis

kamrát

használva

a

teljes

kamravolumen

kicserélődési ideje 5 sec alatt maradt. Szenzitív sejtek esetén a kapszaicin bemosás időtartama maximum 1 perc volt, míg a sejtek gyors válaszának hiányában a bemosást 5 percig tartottuk fenn. 2) A kapszaicin rámosás idejére a perisztaltikus pumpát leállítottuk, s mikropipetta segítségével a kamrában elérni kívánt végkoncentrációnak megfelelő mennyiségű kapszaicint injektáltunk be. 3) A kapszaicin tesztoldat perisztaltikus pumpa által hajtva direkt, gyors rámosással jutott el a sejtekhez, ahol a polietilén cső szájadéka a kiválasztott sejttől 150-200 μm távolságra helyezkedett el. A DIC optikájú mikroszkópos képek rögzítése digitális videokamerával (SensiCam PCO CCD) történt, a sejtekre vonatkozó vizuális szelekciós

26

kritériumok az alábbiak voltak: éles sejtkontúr, homogén textúra citoplazma szegregáció és a sejtduzzadás jelei nélkül. Filamentes pipettákat használtunk (KTW 150F-3), melyek a húzást és hőpolírozást követően 2-5 MOhm tip rezisztenciával rendelkeztek. A pipetták célba juttatása Burleigh PCS540 manipulátorral történt. Az ionáramok mérése Axopatch 200B erősítőt és CV 203BU hűtött headstage-et használtunk. A kommand pulzusok vezérlése és az adatok elsődleges rögzítése a Clampex 7.0 szoftverrel történt, a digitális kamera képét pedig az ezzel szimultán futó Axon Imaging Workbench 2.1 program jelenítette meg. Sok esetben a nyers adatok rögzítése a merevlemezzel párhuzamosan folyamatos 44 kHz-es digitalizálással DRA400 recorderrel CD-lemezre is történt. A regisztrátumok 20 kHz-es mintavételezéssel 10 kHz-es felülvágó Bessel-szűréssel kerültek rögzítésre. A sejtkapacitás és soros ellenállás kompenzálásra került. A sejtek elektrofiziológiai szelekciós kritériumai a következők voltak: min. 1 GOhm seal-rezisztencia; 20 MOhm alatti soros rezisztencia; -50 mV alatti membránpotenciál; -60, -70 mV holding potenciál mellett mért stabil, gyenge szivárgási (leak) áram (<150 pA); a megfelelő step-, ill. ramp-protokollra létrejövő robosztus befelé folyó áram. A feszültségfüggő csatornák vizsgálatára step- és ramp-kommandok variánsait használtuk. A step-kommand variánsok az alábbi paraméterekkel bírtak: -60 mV holding potenciálról egy 20-500 ms, -100 mV priming stepet követően -60 - -10 mV tartományban 2-5 mV-os növekményekkel 100-200 ms step-sorozat történt 3 s interstimulus intervallummal. Túl nagy amplitúdójú válaszok esetén a priming step paramétereit módosítottuk, ill. szükség esetén el is hagytuk. Egyes esetekben az áramok amplitúdóját kolin-kloriddal való szubsztitúcióval csökkentettük. A leak áram a p4 protokoll alkalmazásával már a regisztrációval egyidejűleg, vagy az egyes sweepek után alkalmazott 10 mV step-kommandra

adott

válaszok

átlagolásával

kiszámított

értékkel,

a

regisztráció után került levonásra. A ramp-protokollok során a holding potenciálról –100 mV 20 ms priming step után indult a 50-500 ms tartamú depolarizáló ramp, melynek végpontja a -30 - +100 mV tartományban mozgott. Így a feszültségváltozás rátája 0.03 és 3 mV/ms között alakult. Repetitív alkalmazás esetén 5-8 sec intervallumokat

27

tartva elkerülhető volt a kiváltott áramok depressziója. Az áram-feszültség (I-V) függvények mind a step, mind a ramp regisztrátumok esetében is kiszámításra kerültek. A step- és ramp-protokollok közötti időben a holdingon mért alapvonali (clamp) áramot a DRA-400 recorderrel folyamatosan rögzítettük.

3. Adatfeldolgozás A regisztrátumok kiértékelése a Clampfit 7.0 szoftverrel történt, a DRA-400 recorderrel felvett folyamatos alapvonali (baseline) áramot szükség esetén alacsonyabb

frekvencián

újradigitalizáltuk.

A

sejtek

méretének

meghatározásához képfeldolgozó szoftverben azok legkisebb és legnagyobb átmérőjét számoltuk ki.

EREDMÉNYEK 1. NGF-kezelt trigeminus ganglionsejt tenyészet A 200 ng/ml NGF jelenlétében tenyésztett sejtek 78%-a volt kapszaicin szenzitív. A Módszerek 2. alatt említett vizuális kritériumokat teljesítő sejtek közül a regisztrátum felvételére a kis méretű populáció tagjaiból választottunk (nagy sejtátmérő átlaga: 25.1 μm, kis sejtátmérő átlaga: 21.7 μm, átlagos sejtátmérő: 23.41±5.2 μm, n=83). A szenzitivitás

kritériumai az alábbiak

voltak: 100 pA-t meghaladó amplitúdójú befelé folyó áram kapszaicin 150 nM, 330 nM vagy 1 μM koncentrációinak hatására és/vagy kapszaicin hatására fellépő membránkonduktancia növekedés. A

kontroll

csoport

sejtjei

esetében

(n=7)

a

kapszaicin-szenzitivitás

bizonyítását a kapszaicin nélküli szolvens rámosása követte, mely nem váltotta ki a kapszaicinre adott jellemző válaszokat. a. Step-pulzusok által kiváltott TTXs és TTXr inward áramok Ezen kísérletsorozatunkban a depolarizációkor fellépő kifelé folyó (outward) K+ áramok eliminálásához CsCl tartalmú patch-pipettával dializáltuk a sejteket. A step-pulzus sorozatok változatos időkarakterisztikájú befelé folyó áramokat

28

váltottak ki (5. ábra). Legtöbb esetben az inward áramot a kezdeti, gyorsan kifejlődő csúcsáramot követő kisebb amplitúdójú, lassan gyengülő komponens jellemezte (5. A). Más esetekben a lassú, nagy amplitúdójú komponens dominált (5. B). Az esetek egy részében a kezdeti peak áram az 5. A ábrán bemutatottnál valamivel lassabban fejlődött ki (5. C, D). A step-kommandokkal kiváltott befelé folyó áram TTX alkalmazásával egy TTX-szenzitív (TTXs) és egy TTX-rezisztens (TTXr) Na+ komponensre volt bontható. A gyors, nagy amplitúdójú TTXs komponenst 1 μM TTX erőteljesen, gyakran teljes mértékben blokkolta. A fennmaradó lassabb, kisebb amplitúdójú TTXr komponens a vizsgált sejtek 80%-ban kimutatható (5. E). A kevert és a TTXs komponens küszöbe a -50 - -45 mV tartományban mozgott, -24±2.02 mV (n=5) számított fél-maximális aktivációs küszöbbel (5. F). A TTXr áram küszöbe és csúcsintenzitása is kb. 10 mV-al volt pozitívabb, kalkulált fél-maximális aktivációs küszöbe pedig -16±1.28 mV (n=5) volt.

5. ábra Trigeminus ganglionsejtek depolarizáló pulzus által kiváltott kevert áramai A regisztrátumok CsCl-dal töltött elektróddal készültek -60 mV holding potenciál mellett. A. A leggyakoribb áramtípus esetében a gyors csúcskomponenst egy lassabb követi. A regisztrátumok p4 leak kivonással készültek, a -60 – -10 mV tartományban 5 mV-os növekményű depolarizáló step sorozattal. A felső vonal a step-kommand sorozat egy tagját ábrázolja. B. Nagy amplitúdójú lassú komponenssel bíró áramok. A regisztrátumok leak

29

levonás nélkül, a -45 – 0 mV tartományban 5 mV-os növekményű depolarizáló step sorozattal készültek. C. Szintén gyakori, lassabb kezdeti peak-kel rendelkező áramtípus. D. A C. panelen mutatott, a -40 – -24 mV tartományban 2 mV növekményű step sorozattal regisztrált áramok off-line leak levonással. E. 1 μM TTX jelenlétében, a -35 – -2 mV tartományban 2 mV növekményű kommandokkal felvett áramok off-line leak levonással. F. Az aktivációs görbéken a csúcsáramra normalizált amplitúdók feszültségfüggése az E. panelen bemutatott regisztrátumok (•), ill. ugyanazon sejtben a -60 – -10 mV tartományban 5 mV növekményű step sorozattal felvett regisztrátumok adataiból ({) került kiszámításra. b. Kapszaicin hatása step-pulzusokkal kiváltott inward áramokra A kapszaicin depolarizáló step-pulzus által kiváltott befelé folyó áramokra gyakorolt hatását 6 sec-ként ismétlődő step-sorozattal monitoroztuk, melyek 3 depolarizáló sweep-je közül egy küszöb alatti, 2 küszöb feletti volt. A csökkenés mértéke a kapszaicin hatás csúcsán mért és a rámosás előtti utolsó kontroll amplitúdó arányaként került kiszámításra. 330 nM, ill. 1 μM kapszaicin rámosása a sejtek legtöbbjében 20-80%-kal csökkentette a feszültségfüggő inward áram amplitúdóját, a depresszió átlagos értéke 32.78±26.42% (n=27) volt (6. A, B). A feszültségfüggő befelé folyó áram részleges depressziója a kapszaicin rámosástól számított 20-30 sec-on belül bekövetkezett, az áram visszatérése lassú és még 5 perces kimosási periódus után sem volt teljes (6. C, D). A sejtek egy csoportjában a depolarizáló step által kiváltott áram amplitúdójának lassú, fokozatos csökkenését tapasztaltuk a 10-15 perces kontroll periódusban (run-down) (6. D). Ezen sejteknél a step-kommand által kiváltott áram amplitúdójának hirtelen, a kapszaicin rámosást rövid időn belül követő csökkenése jelezte a kapszaicin hatását (n=22).

30

6. ábra A feszültségfüggő inward áram kapszaicin általi depressziója A.-C. Egyetlen, 1 μM kapszaicinnel tesztelt sejtnek a –60 mV holding potenciálról –10 mV-ra léptetett depolarizáló step által kiváltott áramai. A számok a trace-sorozat megfelelő tagját jelzik, melyek időbeli azonosítását a C panel számozása segíti. A, kontroll. 1 perces időtartamban felvett kontroll regisztrátumok. A, CAPS. Az alapvonal kapszaicin jelenlétében észlelt eltolódása az inward irányú clamp-áram növekedését mutatja, párhuzamosan a step-kommand által kiváltott befelé folyó áram csökkenésével. B. A regisztrátumok kezdeti szakaszának kinagyított ábrázolása jól mutatja az átmeneti, bevezető facilitációt (trace 19), melyet depresszió követ (trace 20-23). C. A csúcsintenzitásra normalizált áramamplitúdó kapszaicin hatására bekövetkező csökkenése. D. A normalizált amplitúdók 10 sejtből nyert átlagának kapszaicin általi depressziója. A sejtek 6 sec-ként felvett amplitúdó adatai az időtengelyen a nyíl által jelzett kapszaicin hatás kezdetéhez lettek igazítva. A negatív időadatok a kapszaicin adás előtti periódust mutatják. A kapszaicin adás előtt a run-down jelenség figyelhető meg. A sejtek egy másik csoportjában (n=6) a feszültségfüggő inward áram depressziója tisztán, a run-down jelenség nélkül volt megfigyelhető (7., 8. B).

31

7. ábra Run-down nélküli sejt feszültségfüggő inward áramának kapszaicin általi depressziója Az inzert a –60 mV holdingról 0 mV-ra történő step hatására kialakuló befelé folyó áram kezdei szakaszát ábrázolja, az amplitúdó meghatározásának módját a nyíl mutatja. Leak áram kivonás nem történt. A normalizált amplitúdó 20 sec 330 nM kapszaicin adására jelentősen csökkent.

c. Kapszaicin hatása ramp-pulzusokkal kiváltott inward áramokra A depolarizáló ramp-kommandok 6-8 sec intervallummal alkalmazva demonstrálták

kapszaicinnek

(330

nM)

a

slope-konduktanciára

és

a

feszültségfüggő befelé folyó áramra kifejtett hatását, annak időbeli alakulását és a clamp-áramhoz való viszonyát (8. A). Bizonyos esetekben step-ramp pulzuspárokat alkalmaztunk (8. A1). Az I-V karakterisztika –95 és –65 mV közötti szakasza a sejtek túlnyomó többségében lineáris volt. Kapszaicin (330 nM) a kontroll 18.01±8.79 pA/mVról 28.376±14.24 pA/mV-re (n=34) növelte e szakasz meredekségét, ez 170.5±68%-os emelkedés. A jelenség kvantifikálásához a kapszaicin hatás alatt mért

legmeredekebb

és

a

rámosás

előtti

utolsó

kontroll

regisztrátum

meredekségének arányát számítottuk ki. A ramp-válasz meredekségének emelkedése, mely a slope-konduktancia növekedését mutatja, gyors és átmeneti volt, melyet lassú visszatérés követett, s a kimosás utáni 3. percben gyakran már a kontroll értékre tért vissza. Ezt tükrözi a ramp-válaszokból származtatott I-V függvény –95 és –65 mV közötti szakasza meredekségének gyors, a maximumra történő emelkedése, majd a lassabb, fokozatos, a kontroll értékre való csökkenése (8. D). Sok esetben az I-V függvény e szakasza meredekségének emelkedése és a

32

feszültségfüggő befelé folyó áram blokkja időben egybeesett (8. C, D). A feszültségfüggő áram 25%-ra való csökkenésének időpontjában a meredekség a kontroll 13.5±9.9 mV/pA-ről 18.8±11.8 mV/pA-re, azaz 160%-kal emelkedett (n=14). A feszültségfüggő áram amplitúdójának depresszióból való visszatérése a kimosási fázisban azonban hosszabb időt vett igénybe, mint a meredekség, azaz a slope-konduktancia rendeződése. A

clamp-áram

negatív

irányú

növekedése,

a

slope-konduktancia

emelkedése és a feszültségfüggő áram depressziója időben párhuzamosan zajlottak (8. A, C, D). Gyakran azonban a clamp-áram inward irányú növekedésének

csúcsa

megelőzte

a

step-pulzus

által

kiváltott

áram

depressziójának maximumát (8. B).

8. ábra Kapszaicin módosítja a sejtek I-V karakterisztikáját A regisztrátumok egyetlen, -60 mV holding potenciálon tartott sejtből származnak. A. A clamp-áram folyamatos regisztrátumán a vertikális vonalpárok az A1 panelen mutatott step-ramp-kommand párokra adott válaszokat jelzik. Az 1-7 számozás a további paneleken feltüntetett trace-ek azonosítását segíti. A1. Step-ramp-kommand pár, egy rövid, 0 mV-ra depolarizáló step-et 600 ms-al később ramp követ. B. A normalizált clampáram növekedés (•) és a step-kommand kiváltotta befelé folyó áram normalizált amplitúdója csökkenésének ({) idöbeli viszonya. A clamp-áram értéke a stepkommand előtti 20 ms periódusban került meghatározásra. A clamp-áramra

33

vonatkozó vertikális skála értékei 10-szer nagyobbak, mint a step-kiváltott inward áramé. A clamp-áram emelkedésének csúcsa megelőzi a step-pulzus által kiváltott áram depressziójának maximumát. C. A -10 mV-ra léptetett stepkommandra adott válaszok regisztrátuma, a 2., 3. trace a kapszaicin adás előtt, a 4., 5. kapszaicin hatás alatt került rögzítésre. D. A ramp-kommandra adott válaszokból származtatott I-V függvények. Kapszaicin hatására a gyors, tranziens befelé folyó áram blokkja mellett a meredekség gyors emelkedését (vö. 3, 4 görbe) annak fokozatos csökkenése követi (4-7 görbe).

d. Kapszaicin hatása az inward áram komponenseire Míg egyes sejtekben tisztán TTXs befelé folyó áramok voltak regisztrálhatók, sok sejtben kevert áramot mértünk TTXr komponenssel. Kapszaicin a TTXs áramot egy átmeneti facilitáció után blokkolta (n=6), a TTXr komponensnél viszont tiszta depressziót láttunk (n=16). e. Kapszaicinnel kiváltott inward áramok A

szenzitív

sejtekben,

melyek

konduktanciája

az

anyag

hatására

megemelkedett, kapszaicin több, mint 50 pA-rel emelte inward irányba a clamp-áram amplitúdóját –60 mV-os holding potenciál mellett. Az adagolási protokoll nagymértékben befolyásolta az inward áramok amplitúdó- és időparamétereit. A kapszaicinnek a regisztráló kamrába a Módszerek részben leírt 1) és 2) módon való bejuttatása kis amplitúdójú (100-400 pA) áramokat váltott ki kb. 15 sec latenciával, 10-20 sec-os

elnyújtott csúccsal és lassú,

fokozatos csökkenéssel. A direkt rámosás során kapszaicin többnyire nagy, tipikusan 1-3 nA amplitúdójú, kis latenciájú, meredeken növekvő befelé folyó áramokat indukált kb. 6-8 sec time-to-peak idővel, gyorsabb, esetenként azonban elnyújtott alapvonalra való visszatéréssel (20-50 sec). Gyors, nagy amplitúdójú vagy komplex áramokat azonban direkt adagolás esetében is csak NGF-el történő tenyésztést követően figyeltünk meg. f. Kapszaicin ismételt alkalmazása Kapszaicin (330 nM) többszöri alkalmazása során az egyes expozíciók között 10 perces periódust tartva 2-4 alkalommal végeztünk rámosást (n=15). Az

ismétlések

során

a

kapszaicin

által

indukált

inward

clamp-áram

amplitúdója egyre csökkent, a 3., 4. rámosás esetén az 1. rámosáskor mért befelé folyó áram amplitúdójának 25-0%-át mértük. Mindezen idő alatt a

34

feszültségfüggő áramok blokkjának jelensége változatlanul fennállt.

2. Akutan izolált trigeminus ganglionsejtek Mind az akutan izolált (2-8 órás), mind az NGF nélkül tenyésztett sejtek kisebb hányada, 14%-a (n=28) reagált kapszaicinre (150 nM - 3.3 μM). Az inward

áram

amplitúdója

a

100-200

pA

tartományban

mozgott

a

feszültségfüggő befelé folyó áramok depressziójával, ill. teljes, permanens blokkjával társulva.

3. Trigeminus ganglion szeletpreparátum A

ganglionszeletekben

a

szabad

felszíntől

50

μm

távolságon

belül

elhelyezkedő sejtekről történt elvezetés. A seal létrehozása előtt a szatellita sejteket pozitív nyomás alkalmazásával távolítottuk el a ganglionsejtek felszínéről. A ganglionszeletekben a kapszaicin szenzitív sejtek aránya 40% volt (n=67). Az NGF-kezelt tenyésztett sejtekkel összevetve szeletpreparátumban kisebb amplitúdójú, a 100-400 pA tartományban mozgó és lassabb kapszaicin által indukált inward áramokat mértünk kb. 30-40 sec time-to-peak idővel és 150-200 sec alapvonalra való visszatérési idővel. a. Kapszaicin hatása step-pulzusokkal kiváltott válaszokra A ganglionsejtek 3 sec intervallumokkal kaptak depolarizáló steppulzust. A kapszaicin által indukált inward clamp-áram kifejlődésekor a küszöbalatti pulzusokra adott válaszok amplitúdója a kontroll értékről 674±420%-ra

emelkedett

(n=10).

Amikor

a

depolarizáló

step-pulzus

feszültségfüggő befelé folyó áramot váltott ki, kapszaicin ennek depresszióját okozta hasonlóan a sejttenyészetben tapasztaltakhoz. b. Kapszaicin hatása ramp-pulzusokkal kiváltott válaszokra 5 sec-ként ismétlődő, 0.8 mV/ms rátájú ramp-pulzusokkal vizsgálva (9. A, B) a válaszokból származtatott I-V függvények -100 - -50 mV közötti tartományának meredeksége 150 nM kapszaicin hatására átlagosan 218±86%-

35

ra emelkedett (n=18) a clamp-áram inward irányú növekedésével egyidejűleg (9. D). A nem szenzitív sejtek esetében a meredekség szignifikánsan nem változott (109±7.5%, n=11). A meredekség változása mellett a rektifikáció átmeneti változását is tapasztaltuk, a fordulási (zéró-áram) potenciál pedig átmenetileg pozitív irányba tolódott. A kapszaicin hatását az I-V függvény -50 mV-nál pozitívabb szakaszain több tényező is befolyásolta. A legegyszerűbb változás a CsCl-os töltőoldattal dializált sejteknél volt megfigyelhető abban az esetben, amikor a ramp nem aktiválta a feszültségfüggő áramot. Ez esetben kapszaicin hatására a meredekség megnőtt, főleg a negatív feszültségtartományban. A visszatérés kb. 10 percet vett igénybe. A KCl-os pipettával dializált sejtek esetében az I-V görbék kapszaicin hatására összetettebb módon változtak meg. A kapszaicin hatásának csúcsán a görbék negatív feszültségtartományának meredeksége nőtt, míg a pozitív tartományé kevéssé, vagy nem változott (9. C). Az egész I-V tartomány 3 részre volt bontható, melyeknél az alábbi slope-konduktanciák voltak mérhetők: a -100 mV - -70 mV tartományban 3 nS, a -30 mV - 0 mV-ban 29.5 nS, míg a 0 mV - +40 mV szakaszon 35.5 nS. Mindezek az értékek kapszaicin maximális hatása alatt az előbbi sorrendben a következőképp alakultak: 10.6 nS, 31 nS, 34.5 nS. A slope konduktancia változásával párhuzamosan a rampok előtt alkalmazott

step-pulzusok

válaszaiból

számolt

konduktancia

kapszaicin

hatására 500%-os növekedést mutatott (9. E).

36

9. ábra Kapszaicinre adott válaszok trigeminus ganglionszelet sejtjeiben A. A B panelen feltüntetett 0.8 mV/ms rátájú ramp-kommandra adott válasz. C. –100 - +80 mV tartományban futó ramp-kommandra adott válaszból származtatott 2 I-V görbe kontroll állapotban és 150 nM kapszaicin hatásának csúcsán felvéve. A szaggatott vonal a CAPS görbe középső tartományára illeszkedik. D. A kapszaicin hatására létrejövő clamp-áram változását jelző görbén a vertikális vonalak a ramp-kommandokra adott válaszokat jelzik. A számozás a C-E panelek regisztrátumainak értelmezését segíti. E. A rampok előtti –65 mV-ról –100 mV-ra lépő hiperpolarizáló step-pulzusokra adott válaszokból kalkulált konduktancia kapszaicin hatására történő változása. E1. A step-kommandra adott válaszok kezdeti szakasza. A nyilak a konduktancia számolásához felvett adatpontokat jelölik, a regisztrátumok vertikális eltolódása a kapszaicin-indukált inward clamp-áramot jelzi. A magasabb feszültségváltozási rátájú (1.8 mV/ms) rampok (10. B) aktiválták a gyors feszültségfüggő inward áramot, ezek kapszaicin hatására bekövetkező

depressziója

most

is

megfigyelhető

volt

(10.

A,

C,

D),

párhuzamosan az inward clamp-áram kifejlődésével (10. E). A feszültségfüggő befelé folyó áram blokkja a kimosási periódus első néhány percében is tartott.

37

10. ábra Ramp-pulzura adott válaszok patkány trigeminus ganglionszelet sejtjeiben A. 1.8 mV/ms rátájú ramp-kommandra adott válaszok kapszaicin adás előtt (1), 150 nM kapszaicin hatása alatt (7), valamint röviddel az adagolás befejezését követően (12). Az E panel vertikális vonalai segítik a trace-ek időviszonyainak értelmezését. B. A ramp-stimulus adatai. Az időtengely az A panel görbéinek időtengelyével azonos. C. A szaggatott vonallal jelzett trace az utolsó kontroll, kapszaicin adás előtti ramp-válasz, a folyamatos vonallal jelzett pedig 10 perccel az adagolás befejezése után, a részleges visszatérés fázisában készült. D. a. 4 ramp-válasz átlagából szerkesztett görbe a kapszaicin bemosás közvetlen kezdetén (ld. E panel Da). b. 4 ramp-válasz átlagolt görbéje kapszaicin kimosás után (ld. E panel Db). E. A clamp-áram kapszaicin hatására történő változása. A vertikális vonalak a ramp-válaszokat jelölik. Összevetve az NGF jelenlétében tenyésztett sejtekből nyert eredményekkel megállapítható, hogy bár a kapszaicin által indukált befelé folyó áram megjelenése és a feszültségfüggő inward áram blokkja szelet preparátumban is megfigyelhető volt, azonban ez esetben a feszültségfüggő áramon kifejtett gátló hatás dominált a clamp-áram negatív irányú növekedésével szemben. Szelet preparátumban a kapszaicinre érzékeny sejtek aránya kisebb volt, mint NGF-el tenyésztett sejtek esetében, de nagyobb, mint az akutan izolált és az NGF nélkül tenyésztett sejtek esetében.

38

ÚJ EREDMÉNYEK, MEGBESZÉLÉS I.

Kapszaicin jelentősen csökkentette, ill. blokkolta a feszültségfüggő

inward áramokat mindhárom preparátum típusban. A befelé folyó kevert áram töltéshordozói ganglionsejtekben is a Na+ és a Ca2+ ionok (Wood és mtsai, 1988, Bevan és Szolcsányi, 1990). Mivel a sikeres mérések többségében a Na+ komponens csökkentésére kolin ionokat, sőt gyakran TTX oldatot használtunk, a Ca2+ áramok kapszaicin érzékenységét biztosra vehetjük. A ganglionsejtekben ismert feszültségfüggő Ca2+ áramok fajtáinak egyedi kapszaicin érzékenységét (Petersen

és

LaMotte,

1991)

későbbi

elemzés

tisztázhatja.

Ugyancsak

tisztázatlan a Ca2+ áramoktól csak igen körülményesen elválasztható TTXr (Blair és Bean, 2002) Na+ áram kapszaicin érzékenysége. A kinetikája alapján feltételesen azonosított TTXs Na+ áram biztosan gyengül kapszaicin kezelés kapcsán. Kísérleteinkben 330 nM kapszaicin mintegy 20-80%-kal csökkentette a feszültségfüggő kevert befelé folyó áram amplitúdóját. Sok esetben ezzel párhuzamosan a membránkonduktancia értéke mintegy 150-600%-kal nőtt. Megfigyeléseink egy, a kísérleteink befejezését követően megjelent közlemény (Liu és mtsai, 2001) fő eredményeihez hasonlóak. II.

Kísérleteinkben kapszaicin már 150 nM higításban is hatékonynak

bizonyult, a membránkonduktancia nőtt, az inward (clamp-)áram észlelhető volt és a feszültségfüggő befelé folyó áramok csökkentek. Az irodalom elsősorban a kapszaicin μM-os dimenziókban használt koncentrációinak hatásaival

foglalkozik

(Szállási

és

Blumberg,

1999),

kevés

ismerettel

rendelkezünk a nM-os higításban kifejtett hatásokról. Ez a kérdés különösen fontos,

hiszen

a

több

μM-os

higításban

észlelt

neurotoxikus

hatás

közreműködésével jelen vizsgálatainkban nem kell számolnunk. A kapszaicin feszültségfüggő csatorna blokkoló hatása független a magasabb

dózisainak

toxikus

hatásától

(Bevan

és

Docherty,

1993).

Feltételezve, hogy a kapszaicin azonos hatással bír a szómán és a terminálison, a regenerációs zóna feszültségfüggő csatornáinak blokkolása a polimodális nociceptor

funkcionális

deszenzitizációjának

alapjául

szolgálhat.

A

feszültségfüggő csatornák működése pedig egyrészt a kationcsatornán át belépő Na+ és Ca2+ iongrádienst módosító hatása révén befolyásolható,

39

másrészt pedig a Ca2+-beáramlás és a membrán depolarizációja second messenger (cAMP) úton modulálhatja mind a feszültségfüggő csatornákat, mind magát a VR1 receptort (Bevan és Szolcsányi, 1990, Docherty és mtsai, 1991, Cholewinski és mtsai, 1993). A kapszaicin-indukált deszenzitizáció tehát egyrészt a VR1 receptor deszenzitizációja, másrészt a feszültségfüggő csatornák gátlása útján valósulhat meg. III.

Kapszaicin a TTXr áram tiszta depressziója mellett a TTXs áramnál

átmeneti facilitáció után blokkolta az áramot. A TTXr és TTXs áramok eltérő kapszaicin szenzitivitása arra utal, hogy a feszültségfüggő Na+ áram blokkolása nem csupán a kationcsatornán át történő Na+-beáramlás következménye volt. IV.

Kapszaicin ismételt alkalmazása során a feszültségfüggő inward áramok

permanens blokkolása mellett a kapszaicinnel kiváltott inward clamp-áram amplitúdójának csökkenését regisztráltuk. Az inward clamp-áram nagysága, ill. jelenléte tehát ez esetben is független volt a feszültségfüggő áramok blokkjától. V.

A III. és IV. pontok alatt tett megállapítások arra utalnak, hogy a

feszültségfüggő

áram

blokkja

nem

egyszerűen

az

inward

clamp-áram

kifejlődésének tudható be. Méréseink szerint a feszültségfüggő befelé folyó áram gátlása, sőt esetenként blokkolása akkor is jelentkezett, amikor a kapszaicin-indukált inward clamp-áram amplitúdója méréshatár alatt maradt, viszont a membrán konduktancia növekedett. Bár véleményünk szerint a membrán vezetőképesség növekedése érzékenyebb mutató, mint a befelé folyó clamp-áram, a patch-technika egyik gyakori hibaforrása (az ún. seal-vagy tapadó ellenállás változása a teszt folyadék lokális áramoltatása kapcsán) miatt csak

e

tünetből

kockázatos

volna

farmakológiai

hatásra

vonatkozó

következtetést levonni. Kétségtelen azonban, hogy egyes esetekben mérhető kapszaicin-indukált clamp-áram hiányában is blokkoló hatás jelentkezett a feszültségfüggő csatornákon. Az áramok méréshatárhoz viszonyított mértéke viszont közismerten függ a tapadó ellenállás mértékétől, ezért hiányából bármely szer hatástalanságára következtetni kétséges. Mindhárom mutató észlelésekor

a

kapszaicin-indukált

inward

clamp-áram,

a

membrán

konduktancia növekedése, valamint a feszültségfüggő áram blokkolása időben

40

párhuzamosan futott. A feszültségfüggő áram amplitúdójának regenerációja azonban lassabb, gyakran csak részleges volt még akkor is, amikor a másik két mutató (a membrán konduktancia, valamint a clamp-áram) már visszatért a szer bemosása előtti időszakot jellemző mértékeihez. Mindemellett gyakran az inward clamp-áram maximuma időben megelőzte a feszültségfüggő áram maximális depresszióját. A viszonyokat érzékeltető tapasztalatunk szerint a befelé folyó clamp-áram mértéke gyenge korrelációt mutat a két másik mutató mértékével. Ez leginkább ganglionszeletben tűnt fel, ahol a kapszaicin markáns feszültségfüggő áramot blokkoló hatása mellett alig vagy nem észlelhető befelé folyó áramot mértünk. Összességében elmondható, hogy a feszültségfüggő csatornák blokkolása mindazon sejtekben létrejött, ahol a kapszaicin befelé folyó áramot indukált vagy a membrán konduktanciát növelte, kapszaicin inszenzitív sejteknél a blokkolás viszont elmaradt. E probléma részletes taglalását indokolja, hogy egyes szerzők (Docherty és mtsai, 1991) általában a befelé folyó clamp-áram növekedés kritériumát használják a neuronok kapszaicin érzékenység szerinti osztályozásakor. Szerintünk létezhetnek olyan kapszaicin-érzékeny primer afferensek is, melyek sejttestében nincs észlelhető fokú clamp-áram növekedés. VI.

A

trigeminus

befolyásolta

a

ganglionsejtek

kapszaicin

szenzitív

preparálási sejtek

és

tenyésztési

arányát.

NGF-et

módszere tartalmazó

médiumban tenyésztett sejtek esetében a szenzitív sejtek aránya 78% volt, míg az akutan izolált, valamint az NGF-nélkül tenyésztett sejteknél ez az arány 14%, a ganglionszeletben pedig 40% volt. A kapszaicin szenzitív, azaz a polimodális kemonociceptor sejtek hányada a primer afferensek között ismételten visszatérő kérdés az irodalomban és a valós hányad becslése helyett szerzők a saját mintáikra jellemző értékeket közlik, melyek szélső értékei 20 illetve 90% (Holzer, 1991, Szolcsányi, 1993, Szállási és Blumberg, 1999). Könnyen belátható, hogy e neuronok pontos arányának meghatározása elsősorban módszertani okok miatt bizonytalan eredményhez vezet. Közismert, hogy a C-rosttal rendelkező polimodális nociceptorok sejtteste kicsiny, a szelekció felső határát 20-23 μm átlagos átmérőnél szokás meghúzni. A

kis

neuronok

bármely

elektrofiziológiai

technika

használatakor

sérülékenynek bizonyulnak, emiatt a sikerrel vizsgálható hányad bizonytalanul

41

tükrözi a mintát valóban jellemző viszonyokat. Kísérleteink során a sejtek patch-elektróddal való vizsgálata (illetve annak technikai követelményei ld. Módszerek fejezet), a preparálási folyamat óta eltelt idő, az alkalmazott emésztőenzmimek (kollagenáz Ia, pronáz E), valamint a tápoldatból hiányzó valamely faktor ronthatja a sejtek funkcionális állapotát. A membránfehérjék és azon belül a VR1 receptor-csatorna komplex finom ultrastruktúrája sérülhet, a molekulák internalizálódhatnak, foszforilációjuk mértéke csökkenhet, a neuron belső homeosztázisa módosul. Emiatt a kapszaicin válasz hiányzik, illetve a méréshatár alatt marad olyan sejtekben is, melyek valójában expresszálnak VR1 receptorokat. VII.

A szenzitív sejtek aránya mellett a kapszaicin-indukált inward áram

kvantitatív jellemzőit szintén befolyásolta a preparálási, tenyésztési módszer. Tenyésztett sejtekben nagy amplitúdójú (1-3 nA), gyorsan kifejlődő (6-8 sec time-to-peak idő) inward áramokat mértünk, melyek 20-50 sec alatt tértek vissza az alapvonalra. Az akutan izolált sejteknél elsősorban az alacsonyabb áramamplitúdó (100-200 pA), ganglionszeletben pedig a kis amplitúdó (100400 pA) mellett a lassabb áramkinetika (30-40 sec time-to-peak idő, 150-200 sec visszatérési idő) volt tipikus. VIII. A kapszaicin szenzitív sejtek arányának és a kapszaicin-indukált inward áram jellemzőinek különbségéért a preparálást jellemző körülmények mellett az NGF hiánya, ill. jelenléte is felelős. A sejttenyésztéshez használt médiumunk 200 ng/ml koncentrációban tartalmazott NGF-et. Az NGF a VR1 receptor expressziójához szükséges, így a sejt kapszaicin érzékenységét befolyásolni képes. Irodalmi adatok szerint már 20 ng/ml NGF, mely koncentráció a tenyésztő médiumunkban alkalmazottnak tizede, 10 perces időtartam után gátolja a kapszaicin-indukált befelé folyó áram tachyphylaxisát (Shu és Mendell, 1998). Nociceptív neuronokban NGF adagolás perceken belül képes az akciós potenciál időtartamának elnyújtására (Shen és Crain, 1994). Magának a nociceptor fenotípusának kifejlődéséhez is NGF szükségeltetik (Mendell, 1996). A ganglionszeletben a kapszaicin szenzitív sejtek aránya az akutan izolált és NGF nélkül tenyésztett sejtekben találtnak felette volt, hiszen a szelet preparátum őrzi meg leginkább a sejtek természetes mikrokörnyezetét, s ez

42

esetben az exogén NGF hatása kiküszöbölhető. Nyilvánvaló, hogy a különféle preparátumokban

a

különböző

mértékű

NGF

hatás

eltérő

VR1

receptorsűrűséget eredményez, ami meghatározza a kapszaicin rámosásra kialakuló inward áram amplitúdóját és kinetikáját. IX.

A kapszaicin adagolási módszere is kritikusnak bizonyult a sejtek

kapszaicin érzékenysége, elsősorban a befelé folyó clamp-áram amplitúdó- és időparaméterei szempontjából. A kapszaicinnek a regisztráló kamrába a Módszerek Elektrofiziológia részben leírt 1) és 2) módon való lassabb, fokozatos rámosása kis amplitúdójú (100-400 pA) áramokat váltott ki kb. 15 sec latenciával, 10-20 sec-os elnyújtott csúccsal és lassú, fokozatos csökkenéssel. A Módszerek Elektrofiziológia 3) alatt részletezett direkt rámosás során kapszaicin a fentiekben említett nagy amplitúdójú, kis latenciájú, meredeken növekvő befelé folyó áramokat indukált, gyorsabb, esetenként elnyújtott visszatéréssel. Kapszaicin ugyanis csak akkor hatásos, ha a sejtfelszíni VR1 receptorokat közvetlenül, a kellő koncentrációban és gyorsan éri el. Hosszabb idő alatt kisebb koncentrációban az anyag a receptorokat feltehetően még az észlelhető reakció kifejlődése előtt deszenzitizálja. Azonban gyors, nagy amplitúdójú, komplex áramokat direkt adagolás esetében is csak NGF-el történő tenyésztést követően regisztráltunk. Legrosszabb

körülményekkel

a

ganglionszelet

preparátumban

kell

számolni, itt juthat a leglassabban a kapszaicin a ganglionsejtek felszínéhez. Ennek oka egyrészt az, hogy a regisztrátumok gyakorta a szelet felszínétől mélyebben fekvő sejtekről készültek, a ganglion kötőszövet által sejtfészkekre osztott

szerkezete

pedig

akadályozza

a

kapszaicin

sejtfelszínre

történő

diffúzióját. A másik ok pedig az, hogy az érződúcban minden egyes neuront egy különleges gliasejt, a szatellita sejt burkol be. A regisztrátumok felvétele előtt minden egyes ganglionsejt esetében a szatellita sejteket pozitív nyomás segítségével távolítottuk el a ganglionsejtek felületéről, azonban nem zárhatjuk ki, hogy egyes esetekben a neuronok szómamembránjának bizonyos része mégis

a

szatellita

sejtek

által

fedve

maradt,

csökkentve

a

szabadon

hozzáférhető VR1 receptorok számát. A ganglionszelet alkalmazása a fentiek tekintetében számos technikai problémát vetett fel, ezek tükrében érthető, hogy

43

trigeminus ganglionszeletben végzett voltage-clamp vizsgálatokról az irodalom csak elvétve számol be (Spigelman és Puil, 1989, 1990), kapszaicin hatásának vizsgálatára ganglionszeletben pedig hivatkozás nem található. Kísérleteinkben elsőként hasonlítottuk össze a kapszaicin által kiváltott válaszokat a szenzoros ganglionsejtek három különböző preparátumán. Mindezek fényében a kapszaicin-indukált áramok irodalomban található nagyfokú

diverzitásának

alapja

inkább

a

sejt-

és

preparátumtípusok,

tenyésztési módszerek, tesztanyag adagolási módok változatossága, nem pedig a receptorok többféle fajtájának jelentkezése. Ezt a következtetést a VR1 receptor klónozásával kapcsolatos megfigyelések is alátámasztják, hiszen egyféle molekula beépítésével is sikerült változatos kinetikával jellemzett áramokat észlelni (Tominaga és mtsai, 1998), másfelől a VR1 knockout egerek érzéketlenek a kapszaicin összes eddig vizsgált hatásával szemben (Caterina és mtsai, 2000). Összegezve a fenti meggondolásokat következtetésként megállapítható, hogy a

feszültségfüggő

következménye,

csatornák

mechanizmusát

gátlása tekintve

a

vanilloid azonban

receptor ez

nem

aktiváció csupán

a

kationcsatornán át történő Na+ és Ca2+ beáramláson alapul. A problémakör még számos tisztázatlan részlete ellenére feltehető, hogy a feszültségfüggő csatornák gátlása fontos szerepet játszik a szenzoros neuronok funkcionális deszenzitizációjában, így a kapszaicin analgetikus hatásában. A kvantitatív különbségek ellenére e hatás szeletpreparátumban, sejttenyészetben és akutan izolált szenzoros neuronokon egyaránt kimutatható.

44

A VR1 receptor kapszaicin általi aktivációjának vizsgálata fluoreszcens Ca2+ mérési módszerrel

BEVEZETÉS A trigeminus ganglionsejtek elektrofiziológiai vizsgálata mellett a PTE ÁOK Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézetben folytatott Ph.D. munkám keretében vettem részt a fluoreszcens Ca2+ mérés módszerének trigeminus ganglionsejt tenyészetre való adaptálásában. Kapszaicin a VR1 receptort aktiválva a nem-szelektív kationcsatornán át Ca2+ és Na+ beáramlást okoz (Bevan és Szolcsányi, 1990). Ezen folyamat többféle, részben még tisztázatlan mechanizmussal befolyásolja, gátolja a szenzoros neuronok feszültségfüggő áramait. A feszültségfüggő csatornák gátlása pedig a funkcionális deszenzitizációban játszik szerepet. Ennek mechanizmusát főleg a Ca2+ áramok tekintetében tárták fel, a Ca2+ csatorna blokkolásban az aktivált receptor-csatorna komplexen át történő Ca2+-influx szerepe

igazolódott

egybevágólag

(Bleakman

kimutatták,

hogy

és a

mtsai,

1990,

funkcionális

Bevan,

1996).

deszenzitizáció

Ezzel

függ

az

extracelluláris Ca2+ koncentrációtól (Santicioli és mtsai, 1987), valamint hogy a jelenségben a VR1 receptor aktiválódása közvetlen szerepet játszik, ugyanis a deszenzitizáció kialakulása ruténium vörössel megakadályozható volt (Maggi és mtsai, 1998). Elektrofiziológiai vizsgálataink során a kapszaicin okozta VR1 receptor aktiválódás feszültségfüggő Na+ áramokra gyakorolt hatására, ennek a deszenzitizációban betöltött lehetséges szerepére fókuszáltunk. A receptor aktiváció során kialakuló Ca2+ beáramlás nyilvánvalóan szerepet játszott az inward clamp-áram, valamint a depolarizáció által aktivált feszültségfüggő befelé folyó áram kialakításában. Munkánk során azonban közvetlenül nem vizsgáltuk a fenti áramok Ca2+ komponensét. A fluoreszcens Ca2+ mérés módszerével viszont közvetlen információt nyertünk a VR1 receptor aktiváció intracelluláris szabad Ca2+ koncentrációra gyakorolt

hatásáról,

annak

jellemzőiről.

A

metodika

hatékonyan

alkalmazhatónak bizonyult egy endokannabinoid, az anandamid trigeminus

45

ganglion neuronokon kifejtett hatásának vizsgálatára, mely szerint anandamid a kapszaicinhez hasonlóan emeli az intracelluláris Ca2+ szintet, valamint az anyag nanomoláris koncentrációi gátolni képesek a kapszaicin hatására létrejövő Ca2+ akkumulációt (Szőke és mtsai, 2000). A módszer segítségével sikerült

demonstrálni

a

protonofór

FCCP

(carbonylcyanid

p-

trifluoromethoxyphenylhydrazon) gátló hatását a kapszaicin és RTX indukálta intracelluláris Ca2+ koncentráció emelkedésre (Szőke és mtsai, MITT 2002. évi konferenciája).

CÉLKITŰZÉSEK A

VR1

receptor

tanulmányozása

hagyományosan

csak

in

vivo

modellekben, valamint szenzoros neuron sejtkultúrákban volt lehetséges. A kapszaicin receptor klónozása (Caterina és mtsai, 1997) megnyitotta az utat a molekuláris biológiai módszerek számára a VR1 receptor, ill. a kapszaicin receptoriális hatásainak molekuláris szintű vizsgálatához. A receptor klónozása lehetővé tette annak sejtvonalakba történő transzfekcióját, mely számos új lehetőséget kínál. Natív sejtekben a VR1 receptor számos splicing variánsa, valamint

egyéb,

a

vanilloid

receptorhoz

hasonló

szerkezetű

proteinek

találhatók, míg a transzfektált sejtek egyetlen meghatározott VR1 molekulát expresszálnak, ami lehetővé teszi az egyes receptor típusok pontosabb leírását (McIntyre és mtsai, 2001, Oláh és mtsai, 2001). Mindezeken túl mutáns formák használatával lehetőség nyílik a funkcionális domének, ill. a különféle aktivátorok és inhibitorok kötőhelyének tanulmányozására (Welch és mtsai, 2000). A VR1 receptort stabilan expresszáló sejtvonal használata pedig a sejttenyészetnél jobban reprodukálható eredményekre vezet. A fent említett lehetőségek kihasználása céljából dr. Sándor Zoltán vezetésével egy nagyobb távlatú munka kezdeti lépéseként humán HT1080 sejtvonalba

transzfektáltunk

patkány

VR1

receptort.

Kísérleteinkben

a

fluoreszcens Ca2+ mérés módszerét alkalmazva a funkcionális szempontból is sikerrel járó VR1 receptor molekula transzfekciót detektáltuk és jellemeztük.

46

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK 1. Sejtkultúra A primer sejttenyészetek preparálása az előző fejezetben leírtak szerint történt. A tenyésztőmédium összetétele a következő volt: 180 ml Dulbecco´sModified Eagle Medium (D-MEM), 5% ló szérum, 5% újszülött kecske szérum, 5% borjúszérum, 100 μl penicillin, 100 μl streptomycin. A médium 200 ng/ml NGF-el egészült ki. Az inkubáció 37 ˚C-on, 5% CO2, 100% páratartalom mellett történt.

2. Fluoreszcens Ca2+-mérés

A 3-8 napos tenyészetek 1 μM fura-2-acetoxy-metilészter (fura-2-AM)

fluoreszcens Ca2+ indikátor festéket tartalmazó oldatban inkubálódtak 37 °Con 15 percig. Az oldat összetétele az alábbi volt (mM): NaCl, 122; KCl, 3.3; CaCl2, 1.3; MgSO4, 0.4; KH2PO4, 1.2; HEPES, 25; glükóz, 10, fura-2-AM, 0.001; pH 7.3. Az inkubálás során a festék észter formájában képes átjutni a sejtmembránon.

A

sejt

észterázai

az

acetoxy-metil

csoportot

a

festékmolekuláról lehasítják, ezáltal az membrán-impermeábilissá válva a sejtekben akkumulálódik.

Az inkubálást 20 perces mosás követte az alábbi

összetételű oldatban (mM): NaCl, 160; KCl, 2.5; CaCl2, 1; MgCl2, 2; HEPES, 10; glükóz, 10; pH 7.3. A fluoreszcens mérések szobahőmérsékleten (23 °C) történtek Olympus BX50WI fluoreszcens mikroszkóppal, 20x nagyítású vízimmerziós objektívvel. A folyamatos átáramlású kamrába helyezett tenyészetek normál és fluoreszcens képének regisztrálása SensiCam PCO CCD kamerával történt, melynek adatait az Axon Imaging Workbench 2.2 szoftver segítségével dolgoztuk fel. A festék gerjesztéséhez használt monokromatikus fényt monokromátor (Polychrome II, Till Photonics) állítottuk elő. A mérések során az alternálva alkalmazott 340 nm és 380 nm hullámhosszú gerjesztő fényre adott 510 nm hullámhosszú emittált fény intenzitásainak arányát határoztuk meg (rációmetrikus érték, R=F340/F380) az idő függvényében. Az R érték az intracelluláris szabad Ca2+ koncentrációval egyenes arányban változott. 3-15 sejtről történt szimultán, egy látótérben regisztráció, a 640x480 pixel felbontású 12 bit intenzitású szürkeskálás képeken egyetlen sejt kb. 800-1500 pixel területet foglalt el. A sejtek területére

47

illesztett

zónák

ill.

ROI-k

(Region

Of

Interest)

által

befoglalt

pixelek

intenzitásának átlaga jellemezte egyetlen sejt fluoreszcens intenzitásának időbeli alakulását. A pixelek intenzitásértékeihez a szoftver segítségével pszeudoszínskálát rendeltünk. A sejtmentes területek intenzitásadatainak felhasználásával minden egyes méréskor háttérlevonást alkalmaztunk. Perfúziós

rendszerünk

használatával

a

folyamatosan

adott

tápoldat

áramlását megszakítva pár sec időtartamban közvetlenül a sejtek felületére mostuk a tesztanyagokat, mely kapszaicin (330 nM), valamint KCl (50 mM) volt. A KCl-os tesztoldat Na+ koncentrációját az ozmolaritás normál értékének megőrzése céljából lecsökkentettük.

3. RT-PCR A teljes RNS tartalom újszülött Wistar patkányok trigeminus ganglionjából való izolálását követően a reverz transzkripció és a cDNS amplifikációja a Titan One Tube RT-PCR (Roche) rendszerrel egy lépésben történt. Az egyszálú cDNS szintéziséhez AMV reverz transzkriptázt, az amplifikációhoz Taq és Tgo polimerázokat használtunk. A Tgo polimeráz proofreading funkciója a PCR hibaarányát mintegy ezredrészére csökkenti. A 2.6 kb hosszú mRNS a 6 kb-nál kisebb szekvenciák feldolgozására tervezett rendszerben izolálható. A sense primer oligonukleotid szekvenciája 5' gggccacagaggatctggaaa 3', az antisense primeré 5' ccctaagcagaccacccaaaga 3' volt, melyek a VR1 mRNS 58-78 és 26262647 helyeihez kötődnek (Caterina és mtsai, 1997). A 30 perces 50 °C-on zajló reverz transzkripciót 15 amplifikációs ciklus (denaturáció: 10 sec 94 °C, hibridizáció: 30 sec 56 °C, elongáció: 2 perc 68 °C) követte, melyet 20 ciklus folytatott 3 percre növelt elongációs idővel. A reakciót 68 °C-on 7 perces végső elongáció zárta. Az RT-PCR reakció produktuma agaróz gélen futtatva a VR1 cDNS méretének megfelelő 2.6 kb-nál mutatott jelet.

4. A VR1 cDNS klónozása A Klenow polimeráz alkalmazásával kapott blunt end PCR fragmentek Sma I emésztett pGEM-3zf vektorba lettek beépítve blunt end ligációval. E. coliba való transzfekciót követően a VR1 inzertet tartalmazó plazmiddal rendelkező klónok szelekciója X-gal-t tartalmazó agar lemezen történt. Néhány VR1 cDNS klónt izoláltunk és szekvenáltunk, melyek a Tgo polimeráz proofreading

48

funkciója ellenére mutációkat tartalmaztak. Ezért a helyes szekvenciát egyes klónok ép fragmentjeiből állítottuk össze, így a teljes 2.6 kb mutációt nem tartalmazó szekvenciához jutottunk. Első kísérleteinkben olyan mutánsokat használtunk, melyekben a receptor konzervált régiói nem érintettek, ezek a protein variábilis első felében az alábbi mutációkat tartalmazták: P25S, L70P, D88G, I277T, L353P. Ezek a mutánsok ép transzmembrán és pórus régióval rendelkeznek, 3 mutációs hely pedig a humán, patkány és egér molekula konzervált régióin is kívül esik. Emiatt a mutáns receptor bizonyos mértékig a vad típus funkcióját mutatja. Újabb kísérleteinkben sikerült mutációt nem tartalmazó VR1 klónt előállítani, a továbbiakban ezen klónnal szándékozunk dolgozni. A VR1 cDNS-t a pGEM-3zf vektorból az emlős pEGFP-N1 (Clontech) vektorba vittük át, mely egy zölden fluoreszkáló fehérjét (green flourescent protein, GFP) tartalmaz, ami a VR1 receptor C-terminálisával fuzionálva jelöli azt. Két különböző vektort használtunk (11. ábra), a pVR1 csak a VR1 cDNS-t és az immediate early CMV promotert, valamint az SV40 terminátort tartalmazta. A pVR1eGFP vektor a 11 aminosav hosszúságú linker szakasszal összekapcsolt VR1-eGFP fúziós proteint expresszálta. Az utóbbi vektor használatával a sejtek VR1 expressziója könnyen detektálható és flowcitometriával kvantifikálható. A stabilan beépült plazmiddal rendelkező sejtek szűrésére mindkét vektor neomycin szelekciós markert is tartalmazott, ezáltal a VR1 receptort folyamatosan expresszáló sejtvonalat tudunk előállítani.

11. ábra A HT1080 sejtvonal transzfekciójához használt expressziós vektorok A pVR1 vektor a VR1 cDNS-t, valamint a CMV promotert és az SV40 terminátort tartalmazta. A pVR1eGFP vektor a 11 aminosav hosszúságú linker

49

szakasszal összekapcsolt VR1-eGFP fúziós proteint expresszálta. Mindkét vektor neomycin szelekciós markerrel is rendelkezik. CMV IE: CMV immediate early promoter, TSV40: SV40 terminátor.

5. Humán sejtvonal transzfekciója Az

expressziós

sejtvonalba

vektorokat

transzfektáltuk.

humán

Ezt

a

fibroszarkóma standard

eredetű

kalcium-foszfát,

HT1080 ill.

a

polyethylenimine-t használó ExGen500 (Fermentas) transzfekciós reagenssel végeztük, kb. 20%-os hatékonysággal. A pVR1 vektor transzfekciójának sikerességét a kontroll eGFP expressziós vektorral való kotranszfekció útján határoztuk meg. A pVR1eGFP vektor transzfekciója a VR1-eGFP fúziós protein fluoreszcens detektálásával közvetlenül is kimutatható volt. A patkány VR1 receptor humán sejtvonalba való transzfekciójának főbb lépéseit a 12. ábra foglalja össze.

12. ábra Patkány VR1 receptor molekula humán HT1080 sejtvonalba történő transzfekciója Részletes ismertetést ld. a szövegben.

50

EREDMÉNYEK 1. Kapszaicin

hatása

trigeminus

ganglionsejtek

intracelluláris

Ca2+

koncentrációjára A szabad intracelluláris Ca2+ koncentrációt a rációmetrikus érték (R), azaz a 340 nm és 380 nm hullámhosszú gerjesztő fényre adott 510 nm hullámhosszú emittált fény intenzitásainak aránya (F340/F380) jelezte, azzal pozitív korrelációt mutatva. 330 nM kapszaicin hatására a sejtek 45%-a (n=75) reagált Ca2+ koncentráció emelkedéssel (13. ábra). A pozitív válaszú csoportba sorolás kritériuma R>0.1 volt. Az 5 sec kapszaicin rámosás hatására az R érték maximuma 30 sec-on belül kifejlődött, a visszatérés azonban rövidebbhosszabb időt (20-260 sec) vett igénybe (14. A). Az R értékek maximumainak átlaga 0.68±0.2 (n=34) volt. A kapszaicin inszenzitív sejtek 90%-ában (n=20) 50 mM extracelluláris KCl-dal keltett depolarizáció az R érték növekedését okozta (14. B), igazolva ezzel, hogy a kapszaicin válasz hiánya nem a sejtek károsodására, hanem a VR1 receptorok hiányára vezethető vissza.

A

B

C

13. ábra Trigeminus ganglionsejtek pszeudoszínskálán kifejezett fluoreszcens intenzitása A sejtek képfeldolgozó szoftverrel nyert fluoreszcens (fura-2) intenzitása kapszaicin (330 nM) rámosása előtt (A.) és alatt (B.). A képeken az eredeti fekete (0 intenzitású) háttér fehér színnel jelölt. C. A 12 biten kifejezett,

51

212=4096 diszkrét pszeudoszínskálán.

A

értéket

felvevő

intenzitás

megfeleltetése

a

B

14. ábra A rációmetrikus érték változása kapszaicin és KCl hatására A. A rációmetrikus (R) érték változása kapszaicin (330 nM) hatására. B. A rációmetrikus érték változása extracelluláris KCl-dal (50 mM) létrehozott depolarizáció hatására.

2. Kapszaicin hatása patkány VR1 receptorral transzfektált HT1080 sejtvonalban A VR1 receptor sejtfelszíni expresszióját mindkét vektor esetében a 488 nm excitációs és 507 nm emissziós maximummal rendelkező GFP segítségével detektáltuk floureszcens mikroszkópiával. A pVR1 vektor transzfekcióját a kontroll eGFP expressziós vektorral (pEGFP-N1) való kotranszfekció útján határoztuk meg (15. A), míg a pVR1eGFP vektor esetében a VR1-eGFP fúziós protein közvetlenül detektálható volt (15. B). A normál klónokkal összevetve a mutációt tartalmazó klónok esetében kisebb fluoreszcens jelet detektáltunk, ami a plazmamembrán mellett a citoplazmában is megfigyelhető volt.

52

15. ábra A transzfekció kimutatása GFP protein segítségével Fluoreszcens mikroszkópos felvételek. A. A pVR1 vektor transzfekciójának igazolása pEGFP-N1-el történt kotranszfekcióval. B. A pVR1eGFP vektor transzfekcióját a VR1-eGFP fúziós protein jelezte.

A VR1 receptorral transzfektált HT1080 sejtvonal 5 sec 330 nM kapszaicin rámosásakor az R érték emelkedését mutatta, jelezve a VR1 molekula aktiválódását. Az R érték változásának mértéke és időbeli lefutása a ganglionsejtekben

tapasztaltakhoz

hasonló

volt.

A

mutáns

VR1

klónt

tartalmazó HT1080 sejtek esetében a fura-2 jel emelkedése a tenyésztett trigeminus ganglionsejtek reakciójánál lassabb és kisebb mértékű volt. A transzfektált sejteket Ca2+-mentes extracelluláris oldatban vizsgálva kapszaicin rámosásakor a floureszcens intenzitás az alapvonalon maradt, hasonlóan a nem transzfektált HT1080 sejtekhez (16. ábra).

53

16. ábra Patkány VR1 receptorral transzfektált HT1080 sejtek és trigeminus ganglionsejtek intracelluláris Ca2+ koncentrációjának változása kapszaicin hatására Az ábra normál és mutáns pVR1 vektorral transzfektált HT1080 sejtek, egy nem transzfektált HT1080 sejt, valamint 2 kapszaicin szenzitív és egy nem szenzitív trigeminus ganglionsejt rációmetrikus (R) értékének időbeli változását mutatja kapszaicin (330 nM, 5 sec) rámosásakor. Egy további pVR1 vektorral transzfektált HT1080 sejt esetében Ca2+-mentes extracelluláris oldatot használtunk. Az áttekinthetőség kedvéért a görbék vertikális irányban szeparálva lettek, így vertikális helyzetük nem tükrözi abszolút Ca2+ koncentrációjuk viszonyait.

ÚJ EREDMÉNYEK, MEGBESZÉLÉS I.

Fluoreszcens Ca2+ méréseink során a trigeminus ganglionsejtek mintegy

fele (45%) mutatott 5 sec 330 nM kapszaicin hatására intracelluláris Ca2+ koncentráció emelkedést. A rációmetrikus (R) érték time-to-peak idejénél (1030 sec) az alapvonalra való visszatérés ideje (20-260 sec) lényegesen nagyobb variabilitást mutatott. Ennek oka lehet a kapszaicin direkt rámosási és kimosási kinetikájának egyes sejtek közti differenciája, valamint a sejtek Ca2+-

54

ot

˝eltakarító˝

plazmamembrán

mechanizmusainak, Ca2+ ATP-áz,

pl.

a

Na+/Ca2+

endoplazmatikus

cseretranszport,

retikulum

Ca2+ ATP-áz,

mitokondriális szekvesztráció, stb. hatékonysága. Ezen rendszerek működését pedig

nagymértékben

befolyásolhatja

a

sejt

aktuális

állapota,

ami

a

fiziológiástól az elhalt állapotig széles skálán változhat. II.

A pVR1, valamint a pVR1eGFP vektorokkal transzfektált sejtekben a VR1

receptorok sejtfelszíni jelenlétét a GFP fehérje fluoreszcens intenzitásának jelenléte mutatta. A transzfekció kb. 20%-os eredményességet ért el, a fluoreszcens intenzitás a pVR1eGFP vektorokkal transzfektált sejtekben valamivel kisebb volt. A mutáns VR1 receptorokkal rendelkező sejtekben a kisebb, s jelentős mértékben a citoplazmában is észlelt intenzitás arra utal, hogy a mutáció a VR1 molekula olyan térszerkezeti változását okozhatta, ami a plazmamembránba való beépülését megváltoztatta, megnehezítette. III.

A VR1 molekula működőképességét a kapszaicin (330 nM) rámosásra

kifejlődő intracelluláris Ca2+ koncentráció emelkedés mutatta. A normál VR1 klónt

tartalmazó

HT1080

sejteknél

a

fura-2

szignálnak

a

tenyésztett

ganglionsejtekhez hasonló alakulása a teljesen funkcióképes VR1 molekula jelenlétét mutatja. A mutáns VR1 molekulával rendelkező sejtekben a fluoreszcens jel emelkedése a tenyésztett trigeminus ganglionsejtekhez képest lassabb és kisebb mértékű volt. Ennek oka lehet egyrészt az, hogy a sejtek felszínén a VR1 receptorok kisebb számban expresszálódnak, másrészt a mutáció a VR1 molekula ultrastruktúráját befolyásolva annak működését közvetlenül is módosíthatja. Eredményeinket összefoglalva elmondható, hogy transzfekció útján sikerült létrehoznunk egy VR1 receptort expresszáló sejtvonalat, amely további kísérleteink alapjául szolgálhat.

55

A Ca2+/kalmodulin-dependens protein kináz II izoenzimek moduláló hatása kapilláris endotélsejtek feszültségfüggő K+ csatornáira hipoxiában

BEVEZETÉS Az

endotélsejtek

jellegzetes

multifunkcionális

sejtek,

működésük

komplexitásába egyre szélesebb körű betekintést nyerünk. Mivel a vérárammal óriási felszínen érintkeznek, normál és patofiziológiás körülmények közötti működésük megértése nagy jelentőségű. Az endotélsejtek kulcsszerepet játszanak többek között a koagulációs, antikoagulációs folyamatokban, mint antigén

prezentáló

sejtek

az

immunválaszok

mediálásában,

az

angiogenezisben, stb. Mindemellett az érátmérőnek az aktuális hemodinamikai igényekhez

történő

kapcsolataik

beállításában

módosulása

révén

is

részt

valósul

vesznek.

A

meg

plazmaextravazáció,

a

sejt-sejt

közötti

ödémaképződés, ill. a vér-agy gát permeabilitás szabályozásának egy lépése. Természetesen

sokféle

differenciált,

így

funkciójuk

anatómiai

különbséget

kell

meghatározottságuk

tennünk

a

szerint

makro-

és

mikrovaszkuláris/kapilláris endotélium működése között, s ezen funkcionális differenciáltság egyik meghatározója az ioncsatorna mintázatuk eltérése. A

vazoaktív

anyagok

(NO,

EDHF,

endotelin,

substance

P,

prosztaglandinok, ATP, stb.) számos funkciójukat modulálják, s ezen anyagok többségét maguk is szekretálják (Inagami és mtsai, 1995). Ezen anyagok jelentős hányadának szekréciója Ca2+-függő, tehát az intracelluláris szabad Ca2+ koncentráció és a Ca2+-triggerelt jelátviteli mechanizmusok ebben a folyamatban szabályozó szerepet játszanak (Usachev és mtsai, 1995). A szabad Ca2+ koncentrációt pedig nagymértékben befolyásolja a Ca2+-beáramlás, mely a feszültségfüggő, a vazoaktív agonisták, valamint a mechanikai, hemodinamikai (axiális és tangenciális) erők által aktivált ioncsatornákon át történik (Nilius, 1991). Mindezek mellett az endotélsejtek membránpotenciálja, mely nagyrészt K+, Cl-, ill. nem-szelektív kationcsatornák által meghatározott, szintén fontos szereppel bír a Ca2+-influx szabályozásában a Ca2+-ra irányuló hajtóerő beállítása révén (Luckhoff és Busse, 1990).

56

Látható

tehát,

hogy

az

ioncsatornák,

azok

funkciójának

szignál

transzdukciós mechanizmusok általi modulációja az endotélsejtek működését alapvetően befolyásolni képes. Napjainkra mind nagyobb számú ioncsatornát írnak le endotélsejteken, melyen meghatározóak a membránpotenciál, a sejtvolumen, érpermeabilitás, mechanoszenzor funkciók, valamint a Ca2+szignalizációs utak szabályozásában (Nilius és mtsai, 1997). Pontos szerepük definiálása azonban számos esetben még várat magára. Általánosan elfogadott nézet szerint az endotélsejtek nem excitábilisek, ennek ellenére feszültségfüggő Na+ (Walsh és mtsai, 1998), K+ (Takeda és mtsai, 1987) valamint Ca2+ (Bkaily és mtsai, 1993) csatornák is találhatók rajtuk, melyek egyik feltételezett szerepe a membránpotenciál

regulálásával

az

intracelluláris

Ca2+

koncentráció

beállításán keresztül a vazoaktív anyagok szekréciójának szabályozása. A makrovaszkuláris endotélium ioncsatornái részletesebben meghatározottak, ellentétben a kapilláris endotéliummal, ahol jelen ideig feszültségfüggő Ca2+ (Bossu és mtsai, 1992), Na+ (Walsh és mtsai, 1998), ATP-szenzitív és feszülésaktivált nem-szelektív kation (Popp és Gogelein, 1992, Popp és mtsai, 1992) csatornákat írtak le. A K+ csatornák közül Ca2+-függő (Jow és mtsai, 1999), valamint feszültségfüggő csatornák találhatók (Dittrich és Daut, 1999). A feszültségfüggő K+ csatornák népes családja (Shaker, Shab, Shaw, Shal, stb.) egyes tagjainak funkcióját különböző protein kinázok, többek között a Ca2+/kalmodulin-dependens protein kináz II (CaMKII) modulálja. A Shakertípusú Kv1.4 K+ csatorna intracelluláris N-terminális inaktivációs doménjének CaMKII általi foszforilációja modulálni képes a tranziens outward, A típusú K+ áram inaktivációs kinetikáját transzfektált HEK sejteken (Roeper és mtsai, 1997). Hasonló moduláció ismert excitábilis sejteken, nevezetesen pitvari szívizomsejteken (Tessier és mtsai, 1999) és colon simaizomsejteken (Koh és mtsai, 1999) is. A multifunkcionális Ser/Thr protein kináz családba tartozó CaMKII a Ca2+-szignált

továbbítva

szabályozásában

(Nghiem

sejtdifferenciálódásban

részt és

(Wang

vesz mtsai, és

a

génexpresszió

1994,

Simonson,

Masse 1996),

és

és a

a

Kelly,

sejtciklus 1997),

a

memóriafunkció

regulálásában (Mayford és mtsai, 1995). A CaMKII proteinek az agy bizonyos régióiban a teljes fehérjetartalom 2%-át is kiteszik. Jelentős szerepet játszanak a szívizomzat kontraktilitásának szabályozásában is (Braun és Schulman,

57

1995, Hoch és mtsai, 1999). A CaMKII holoenzim egy 8-12 azonos vagy eltérő alegységből álló oligomer (Kanaseki és mtsai, 1991). A 4 gén (α, β, γ, δ) által kódolt primer transzkriptek alternatív splicing-ja következtében az alegységek több alosztálya létezik (Tobimatsu és Fujisawa, 1989, Braun és Schulman, 1995). Az enzim sejtspecifikus, ill. szubcelluláris lokalizációját a holoenzim összetétele határozza meg. Míg az α és β izoformok neuronálisan fordulnak elő, a γ és δ formák a neuronok mellett változatos szöveti expressziót mutatnak (Tobimatsu és Fujisawa, 1989). A makrovaszkuláris endotélium esetén a CaMKII trombin-indukált barrier diszfunkcióban (Borbiev és mtsai, 2001) és az NO szintáz szabályozásában (Cai és mtsai, 2001) betöltött szerepe igazolódott. A

CaMKII

aktiválódása

többlépcsős

folyamat

(17.

ábra).

Inaktív

állapotában az inhibitoros (I) és katalitikus domén (C) között szoros kapcsolat áll fenn. A Ca2+/kalmodulin komplex kötődésekor aktiválja az enzimet, s ekkor a katalitikus domén foszforilálja az inhibitoros domént (autofoszforiláció), ezáltal válik a CaMKII teljesen aktívvá. Ebben az állapotban az enzim kalmodulin iránti affinitása megnövekszik, s katalitikus aktivitását még a Ca2+/kalmodulin komplex disszociációját követően is megtartja (részlegesen aktív CaMKII). Inaktivációja protein foszfatáz általi defoszforilációval valósul meg. A folyamat lényegét a CaMKII aktivitásának Ca2+ hiányában való fennmaradása képezi, mely által egy rövid idejű intracelluláris szabad Ca2+ szint emelkedés által indított szignál idejét az enzim hosszabb időre fenntartja, lehetővé téve, hogy ezen idő alatt a Ca2+ szint rendeződjön, ami a sejt integritásának megőrzése szempontjából bír jelentőséggel.

58

17. ábra A CaMKII aktiválódásának és inaktiválódásának lépései Az ábramagyarázatot ld. a szövegben.

PROBLÉMAFELVETÉS Az endotélsejtek morfológiai tulajdonságai fontos szerepet játszanak a sejt-sejt

kapcsolatok

integritásának

megőrzésében,

ami

a

vaszkuláris

permeabilitást nagymértékben befolyásolni képes. A patológiás morfológiai megjelenés

(duzzadás,

dezorganizáció)

kapilláris

perfúziós

zavarokhoz,

megnövekedett plazmaextravazációhoz vezet (Ward és Firth, 1989, Mazzoni és mtsai, 1995). A normál morfológiai jellegzetességek megőrzésében a sejtek ozmotikus homeosztázisának fenntartása fontos tényező, melyhez az ionos homeosztázis szükségeltetik.

(Na+, A

K+,

Cl-)

pontos

volumenregulációban

szabályozása szerepet

és

játszó

fenntartása ionok

mellett

is a

mikrovaszkuláris endotélsejtek hidraulikus permeabilitását a Ca2+-beáramlás is befolyásolja (He és Curry, 1991). Tartós vagy hosszabb hipoxiás állapot számos patofiziológiai jelenség velejárója, gyakori klinikai probléma. A citoplazmatikus Ca2+ koncentráció hipoxiás, poszthipoxiás emelkedése is régóta ismert folyamat. A poszthipoxiás Ca2+ koncentráció emelkedése és a sejtduzzadás jelensége endotélsejtek

59

esetében is leírásra került (Mertsch és mtsai, 1998). Humán endotél sejtkultúrában az intracelluláris szabad Ca2+ koncentráció hipoxiás emelkedése főként az extracelluláris Ca2+ beáramlásának köszönhető (Arnould és mtsai, 1992). Az intracelluláris Ca2+-akkumuláció pedig morfológiai eltérésekkel jár. Humán köldökvéna sejtek esetében konfokális laser scanning mikroszkópia a hipoxiás stressz után keletkező kitüremkedések (bleb) területén lokális Ca2+ koncentráció emelkedést mutatott ki (Ikeda és mtsai, 1998). Vér-agy gát modellben hipoxiás állapot a megnövekedett paraendoteliális permeabilitás által jelzett barrier funkció sérüléshez vezetett (Giese és mtsai, 1995). Mindezek mellett a megemelkedett szabad intracelluláris Ca2+ koncentráció számos szignál transzdukciós utat aktivál (PKC, CaMKII, stb.). A fentiek alapján feltételeztük, hogy a CaMKII, annak egyes izoenzimei a hipoxiás sejtkárosodás folyamatában aktiválódnak kapilláris endotélsejtek esetében is. Az aktivált CaMKII pedig befolyásolni képes a feszültségfüggő K+ csatorna

működését,

mely

a

membránpotenciál

és

az

ozmoreguláció

szabályozásának szempontjából bír jelentőséggel. Ezen paraméterek pedig a fentiek

szerint

fontos

szerepet

játszanak

az

endotélium

normál

morfológiájának, és ezzel egyben normál funkciójának megtartásában is.

CÉLKITŰZÉSEK A CaMKII különféle izoenzimeinek jelenléte, azok hipoxiás aktivációja kapilláris endotélsejtekben még nem került leírásra. Hasonlóan ismeretlen volt kapilláris

endotélsejtekben

a

feszültségfüggő

K+

csatorna

működésének

hipoxiás modulációja, ill. az, hogy ennek hátterében mely mechanizmusok állhatnak. Ezeknek és a fentebb vázolt munkahipotézisünknek megfelelően kísérleteink során az alábbi kérdések megválaszolását tűztük ki célul: I.

A feszültségfüggő outward áram komponenseinek leírása patkány agyi kapilláris endotélsejtekben.

II.

A feszültségfüggő outward áram szelektivitásának meghatározása.

III.

A feszültségfüggő outward K+ áram jellemzése, hipoxiás modulációjának leírása.

IV.

A hipoxiás moduláció mechanizmusának vizsgálata.

60

V.

A CaMKII izoenzimek transzkripciós mintázatának jellemzése patkány agyi kapilláris endotélsejtekben.

VI.

A CaMKII izoenzim proteinek expressziós mintázatának jellemzése.

VII.

A

CaMKII

izoenzimek

ionomycinnel,

valamint

hipoxiával

kiváltott

aktiválódásának kimutatása, jellemzése. VIII. A modulált áramot vezetni képes feszültségfüggő K+ csatornatípusok kimutatása sejtvonalunkban

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK 1. Sejtkultúra Munkánk során immortalizált patkány agyi kapilláris endotél sejtkultúrát használtunk. Az immortalizáció pCMVLT2, pCMVLTdl8, pCMVLTdl23 és pK1 vektorokkal történt az alábbi immortalizáló, immortalizáló/transzformáló gének felhasználásával: polyoma large T antigén, polyoma modifikált large T antigén, polyoma middle T antigén, SV40 large T antigén, SV40 small t antigén. A kontroll

(mock)

transzfekcióval

együtt

a

transzfekció

6

sejtvonalat

eredményezett: rat brain capillary endothelial cell line 1-6 (rBCEC1-6). A sejtvonalak közül a primer kapilláris endotél fenotípusát legjobban megőrző sejtvonal lett kiszelektálva és került további felhasználásra. A szelekció számos morfológiai, proliferációs, biokémiai (ACE, FVIII, γ-GT, AP, iNOS, eNOS, SOD, kataláz, GSH, GSSG, 6-keto-PGF1α, TXB2) és funkcionális (paraendoteliális permeabilitás

-

fluoreszcein)

kritérium

szerint

zajlott,

a

4.

sejtvonal

kiválasztását eredményezve (rBCEC4) (Blasig és mtsai, 2001). A tenyésztő médium összetétele az alábbi volt: 90 ml D-MEM, 10 ml borjúszérum, 4.5 g/l glükóz, 1.2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2.5 µg/ml amphotericin, 100 µg/ml Na-heparin, 110 µg/ml Na-pyruvát, 10 µg/ml ECGF (endothelial cell growth factor). Csak a 20.30. szubkultúrák kerültek kísérletekre.

2. Hipoxia protokoll A sejtkultúrák 5 óra inkubációs időre anaerob kamrába kerültek, melynek

61

gázösszetétele a következő volt: 90% N2, 5% CO2, 5% H2 (100% páratartalom, 37 ºC).

3. RT-PCR A CaMKII izoenzimek transzkripciójának vizsgálatához RT-PCR módszert használtunk 35 ciklussal, az izoenzimekhez egyedileg optimalizált további paraméterekkel. Az RNS extrakció az rBCEC4 sejtekből az Invisorb rendszer alkalmazásával, míg patkány agyszövetből a guanidin-tiocianát módszerrel történt (Kingston és mtsai, 1994). Az izolációt a DNS szennyeződés emésztése, majd reextrakció követte. Az α, β, γ izoenzimek esetében az osztályra jellemző variábilis régióknak megfelelő flanking primer párokat használtunk, ami az összes expresszált variáns amplifikációját lehetővé tette. A δ osztály vizsgálata az egyedi δ alosztályokra specifikus primer kombinációkkal történt. A PCR termékek vizsgálatához ethidium-bromidos agaróz (2%), ill. poliakrilamid gélt (4%) használtunk. A szekvenálás a gélből való extrakciót követően az InViTek standard módszerével történt.

4. Immunoblot A CaMKII izoenzim fehérjék expressziójának vizsgálatára a Western-blot módszert alkalmaztuk. HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) oldattal történő mosást követően 37 ºC-on 15 perces stabilizációs periódust hagytunk ugyanezen oldatban. Az izoenzimek aktiválásához 250 nM ionomycint, gátlásához pedig 20 μM KN-93-al 30 perces előinkubációt alkalmaztunk a HBSS oldatban. A további feldolgozáshoz a tenyésztőedények jégre helyezését követően 5% triklórecetsavval (TCA) fixálás történt. Ezt 2.5% TCA-val végzett kétszeri mosás után centrifugálás követte (12000x, 4 °C, 10 perc). A szedimentum elektroforézis oldatba került (pH 6.8), szükség esetén a neutralizációhoz 1 M Tris-t használtunk, majd 5 perces inkubálás következett 95 °C-on. Az elektroforézis és a blotting 10% poliakrilamid gélen futott sávonként 20 μg proteinnel. Az aktivált izoenzimek detektálásához a CaMKII autofoszforilált

formája

elleni

antitesteket

alkalmaztunk

1

μg/ml

koncentrációban. Az antitest a CaMKII autofoszforilációs helyén található Thr287 körüli régiónak megfelelő MHRQEpTVDC foszfopeptid ellen nyúlban

62

termelődött. A CaMKII δ izomerjének detektálásához használt alosztály specifikus antitest a C-terminálistól számított 2. variábilis domént ismerte fel. A γ osztály azonosításához a Santa Cruz Biotechnology által forgalmazott antitestet alkalmaztuk. termelt

Másodlagos antitestként nyúlban, ill. kecskében

peroxidáz-konjugált

antitestet

használtunk.

Az

eredmények

vizualizációja kemolumineszcens kit és autoradiográfia alkalmazásával történt. A sejtlizátumban történő proteinmeghatározást módosított Lowry módszerrel végeztük.

5. Immunhisztokémia A sejttenyészetet PBS-el történő mosást követően 1% paraformaldehiddel fixáltuk 15 percig. Háromszori PBS-ben való mosás után 0.2% Triton X-100-al permeabilizáltunk, majd 60 perces blokkolást követően (1% PBS-ben oldott borjúszérum) anti-Kv1.4 antitesttel inkubáltuk. Ezt három alkalommal 0.2% borjúszérummal végzett mosás követte, ami után 60 percig Cy3-konjugált szekunder antitesttel inkubáltunk. Négyszeri mosás után a sejteket lefedtük. A mintákat Zeiss fluoreszcens mikroszkóppal, a Zeiss Axiovision képfeldolgozó szoftver segítségével elemeztük ki.

6. Laser scanning mikroszkópia A kontroll és az 5 órás hipoxia protokollon átesett sejteket Zeiss LSM 410 laser scanning mikroszkóppal vizsgáltuk. A sejtek keresése a készülék transzmissziós módjában, a laser fény használata nélkül DIC optikával történt. A sejtmorfológia részletes elemzése a reflexiós módban zajlott, ahol az eltérő optikai denzitású közegek határfelületéről (pl. sejtmembrán, organellumok) visszaverődő lasernyaláb elemzése történt. Ebben a módban lehetőség nyílt az x-y síkban való sorozatok rögzítése mellett a vertikális irányú x-z-metszetek felvételére is. Fényforrásként HeNe lasert (543 nm) alkalmaztunk.

7. Elektrofiziológia A feszültségfüggő K+ csatornákon folyó áram vizsgálatára a patch-clamp technika

whole-cell

voltage-clamp

módszerét

alkalmaztuk.

A

kísérletek

szobahőmérsékleten (23 °C) folytak. A mérések 150 μl térfogatú regisztráló kamrában

zajlottak,

8-10

ml/óra

extracelluláris

folyadékáramlással.

A

63

mikroszkópos képanalízishez digitális videokamerát használtunk. A sejtek vizuális szelekciójának kritériumai a következők voltak: szeparált sejtek éles kontúrral, homogén, szegregációmentes citoplazmával a sejtduzzadás jelei nélkül. Filament nélküli pipettákat használtunk (PGL150T-7.5), a húzást és hőpolírozást követő 2-4 MOhm rezisztenciával. Az elektromos zaj csökkentése céljából a pipetták HIPEC® monokomponens elasztomer borítást kaptak. A standard extracelluláris oldat összetétele a következő volt (mM): 135 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glükóz, 10 HEPES, 1 NaH2PO4 (pH 7.4, NaOH). A magas TEA és 4-AP koncentrációjú oldatokban az ozmolaritás konstans értéken

tartásának

megfelelően

a

Na+

koncentrációt

csökkentettük.

A

pipettában használt intracelluláris oldat összetétele az alábbi volt (mM): 45 KCl, 100 K-aszpartát, 3 MgCl2, 2 Na2ATP, 10 HEPES, 10 EGTA (pH 7.2, KOH). A K+ áramok méréséhez Axopatch 200A erősítőt használtunk. A kommand protokollok generálása és az adatrögzítés Clampex 8.1 szoftver segítségével történt. A regisztrátumokat 10 kHz-en digitalizáltuk 5kHz-es felülvágó Besselszűréssel. A sejtkapacitás és a soros ellenállás az erősítő megfelelő kompenzáló áramköreinek segítségével került kiszámításra és 0-85%-os kompenzációra. Csak a 10 MOhm alatti soros ellenállással rendelkező sejtekből történt elvezetés. A K+ áramok kiváltására step-kommandokat használtunk a következő paraméterekkel: 2 sec –90 mV prepulzus, 1 sec step-pulzusok –80 mV - +80 mV tartományban 10 mV lépésközzel, 10 sec interstimulus intervallum. Ez a protokoll a tranziens outward és delayed rectifier áram együttes kiváltására alkalmas. A sustained áramkomponens amplitúdója (Isus) az 1 sec step-pulzus végén mért kifelé folyó áram amplitúdójaként lett definiálva. A tranziens outward áram maximuma (Ito) a teljes kifelé folyó áram maximuma (Ipeak) és a sustained áram különbségeként került kiszámításra. Az áramok amplitúdója a sejtkapacitásra lett normalizálva.

8. Adatfeldolgozás A nyers adatok kiértékelése a Clampfit 8.1 szoftver, további feldolgozása a Microcal™ Origin® program segítségével történt. A sejtkultúrák digitális képfeldolgozásához a Scion Image szoftvert használtuk. A tranziens áram gyors

64

inaktivációs fázis időállandójának (τfast) kiszámítása az outward áram leszálló fázisára történő biexponenciális illesztéssel történt. Az inaktiváció mértéke a tranziens áram és a teljes kifelé folyó áram amplitúdójának arányaként (Ito/Ipeak) lett meghatározva.

Whole-cell voltage-clamp KN-93 + Hipoxia

Hipoxia

RT-PCR, immunoblot KN-93 + Hipoxia

Ca2+ /calmodulin-dependens protein kináz II CaMKII

Hipoxia

Ionomycin

Feszültségfüggő outward K+ áram

CaMKII izoenzimek

• komponensek szeparálása • K + szelektivitás • normalizált amplitúdók • inaktivációs időállandó (τfast) • inaktiváció mértéke (Ito/Ipeak)

• transzkripciós mintázat • protein expresszió • aktiváció - autofoszforiláció

18. ábra A kísérleti protokollok összefoglaló sémája Részletes ismertetést ld. a szövegben. KN-93: szelektív CaMKII blokkoló, ionomycin: Ca2+-ionofor.

EREDMÉNYEK 1. Az agyi kapilláris endotélsejtek hipoxiás duzzadása Kísérleteink első lépéseként igazolni kívántuk, hogy a hipoxia protokollon átesett sejtjeink esetében patofiziológiailag releváns változás történt. A sejtduzzadás

mértékének

egyik

lehetséges

meghatározásaként

a

sejtek

felületének változását mértük digitális képfeldolgozással 2-dimenzióban (19. ábra). A hipoxia protokoll szignifikánsan növelte a sejtek felületét (kezdő érték: 481±23 μm2, n=29; poszthipoxiás érték: 617±36 μm2, n=21, P<0.05), míg az ugyanolyan időtartamban (5 óra) vizsgált normoxiás kontroll sejtek esetében szignifikáns változást nem tapasztaltunk (normoxiás kontroll érték: 510±37 μm2, n=20, P>0.05).

65

19. ábra Az agyi kapilláris endotélsejtek poszthipoxiás duzzadása A képek fáziskontraszt mikroszkóppal készültek (40x). A. A sejtek hipoxiás protokollt megelőző mikroszkópos képe. B. Az 5 órás hipoxia protokollon átesett sejteken jól észrevehetők a sejtduzzadás jelei (nyilak). C. A poszthipoxiás sejtek átlagos felülete (III) szignifikánsan nőtt a kiindulási értékhez (I) képest, míg az 5 órás, normoxiás inkubáción átesett sejtek felülete (II) a kiindulási értékhez képest szignifikáns eltérést nem mutatott. Átlag±SEM. *P<0.05 A fenti módszerrel meghatározott felületnövekedés mellett a laser scanning mikroszkópia módszerét alkalmazva a hipoxiás endotélsejtek morfológiai változásának finomabb, részletesebb elemzésére is módunk nyílt. Eszerint a 2 dimenzióban leképezett terület megnövekedésén túl a sejtek alakja, térfogata komplexebb módon is megváltozott, sokszor azon esetben is, mikor a sejtek felülete 2 dimenzióban vizsgálva nem mutatott lényeges növekedést. A laser scanning mikroszkóp transzmissziós üzemmódját használva első lépésként a megfelelő sejtek, sejtcsoportok képére lineáris, lehetőleg a sejteket minél nagyobb szakaszon metsző vonalakat illesztettünk, s második lépésként e vonalak mentén reflexiós módban leképeztük a sejtek x-z-vetületét (20. ábra).

66

A 20. A ábra 3 sejt (a, b, c) x-z-vetületét a hipoxia protokoll előtt, a 20. B pedig utána ábrázolja. Látható, hogy míg az a sejt esetében feltűnő morfológiai változás nem történt, addig a b sejtnél a magasság- és formaváltozás szembeötlő, a c esetében pedig a sejt tapadási felületének, alapjának elkeskenyedése a magasság enyhébb fokú növekedésével párosul.

A

B

20. ábra Az agyi kapilláris endotélsejtek poszthipoxiás morfológiai változásai laser scanning mikroszkóp x-z-vetületében A. A sejtek (a, b, c) hipoxiás protokoll előtti képe. B. Hipoxiát követően a b sejt magassága jelentősen megnőtt, formája megváltozott, a c sejt alapja csökkent, magassága kisebb mértékben nőtt, míg az a sejt esetében csak minimális változás történt. A

sejtek

morfológiai

változásának

jellemzésére

más

módszert

is

alkalmaztunk. Reflexiós módban a 20. ábrán fehér alapként jelzett tárgylemez felületéről felfelé indulva 0.5 μm-es lépésközönként az x-y síkban metszeteket készítettünk, s minden egyes metszeten a sejtek kerületét és területét lemérve Microsoft Excel programban írt macro script segítségével lehetőség nyílt a térbeli felület és térfogat közelítő kiszámolására. A 21. ábra szemléletes képet nyújt a sejtalak hipoxia hatására bekövetkező változatos módosulásáról. A 21. A diagram a hipoxia protokoll előtti, a 21. B pedig az azt követő állapotokat tükrözi. Az s tengely az alapról felfelé indulva a szelet számát, tehát a tárgylemeztől számított magasságát, a c az egyes sejteket, az a pedig a sejtek aktuális szeletben mért területét ábrázolja. Jól látható, hogy a hipoxia után a C1 sejtnél a tapadási alap csökkenése, a magasság növekedése volt tapasztalható szinte változatlan térfogat mellett, míg a C6 sejt esetében mind az alap, mind a magasság megnövekedése a térfogat emelkedését vonta maga után.

67

A

B a (μm2)

a (μm2)

200

200

150

150

100

100

50 1

50 1

7

s

0 13 19 C1

C2

C3

C4

C5

c

C6

C7

7

s

0 13 19 C3 C1

C4

C2

c

C5

C6

C7

21. ábra Az agyi kapilláris endotélsejtek poszthipoxiás morfológiai változásai laser scanning mikroszkóp x-y vetületében A diagram felvételének magyarázatát ld. a szövegben. A. Hipoxia előtti állapot. B. Hipoxiát követően a kapilláris endotélsejtek finomabb morfológiai eltéréseit mutató adatok többféle módon változtak meg, pl. a C1 sejt tapadási alapja csökkent, magassága nőtt, a C6 sejt esetében pedig mind a tapadási alap, mind a magasság értéke megemelkedett.

2. A feszültségfüggő K+ áram komponensei, azok szeparálása A step-kommandok által kiváltott teljes outward áram 2 komponensre tagolható: a gyorsan aktiválódó és lassabb kinetikával inaktiválódó (tranziens) komponensre, valamint a step-kommand időtartama alatt inaktivációt nem mutató (sustained) komponensre. A tranziens komponens megfeleltethető a klasszikus A-típusú K+ áramnak, míg a sustained komponens kialakításában döntő szerepe van a delayed rectifier K+ áramnak. Az áramkomponensek szelektivitásának vizsgálatára 2 tipikus K+ csatorna blokkolót, 4-AP-t és TEA-t használtunk, melyek áramtípusra szelektív, dózisfüggő, megfelelő koncentrációban szignifikáns blokkoló hatást mutattak. 4-AP blokkolta az Ito (22. A), míg a TEA az Isus áramot (22. B). A dózis-hatás függvény pontjaira illesztett Hill-görbe kissé eltérő karakterisztikájú blokkoló hatást mutatott a 2 blokkolót összevetve (22. C, D). A 4-AP Ito-ra gyakorolt maximális blokkoló hatását 5 mM koncentrációnál érte el, ahol +70 mV-on az áram amplitúdóját a kontroll 9%-ra csökkentette. A dózis-hatás görbe további

68

paraméterei: IC50 = 1.1±0.04 mM, a Hill-koefficiens, azaz nH = 2.9±0.05. A TEA Isus-on kifejtett maximális blokkoló hatását 10 mM koncentrációnál érte el +70 mV-on 21%-ra csökkentve a kontroll amplitúdót, további paraméterek: IC50 = 2.8±0.5 mM, nH = 1.4±0.3. TEA nagyobb koncentrációban (10 mM) az Ito áram amplitúdóját is csökkentette kisebb mértékben, 86%-ra (n=4). A Ca2+-függő K+ csatornát blokkoló charybdotoxin (1 μM) nem befolyásolta szignifikánsan az Ito és Isus áramokat.

B

Ito Kontroll 4-AP 0.1 mM 4-AP 0.5 mM 4-AP 1 mM 4-AP 5 mM 4-AP 10 mM

10

5

0 -80 -60 -40 -20

0

20 40

1,0

D

Ito

5

0

0,6 0,4 0,2

0

20 40

60 80

Feszültség (mV) 1,0

Isus

0,8

IKont/ITEA

IKont/I4-AP

Kontroll TEA 0.2 mM TEA 1 mM TEA 5 mM TEA 10 mM TEA 20 mM

-80 -60 -40 -20

0,8

0,0

10

60 80

Feszültség (mV)

C

Isus Normalizált amplitúdó (pA/pF)

Normalizált amplitúdó (pA/pF)

A

0,6 0,4 0,2

0,1

1

4-AP (mM)

10

0,0

1

TEA (mM)

10

22. ábra K+ csatorna blokkolók hatása az outward K+ áram komponensein A K+ áramok a 23. ábra Stimulus panelje szerinti protokollal kerültek kiváltásra. A sustained áramkomponens amplitúdója (Isus) az 1 sec step-pulzus végén mért kifelé folyó áram amplitúdójaként lett definiálva. A tranziens outward áram maximuma (Ito) a teljes outward áram maximuma (Ipeak) és a sustained áram különbségeként került kiszámításra. Az áramok amplitúdója a sejtkapacitásra lett normalizálva. Az áram-feszültség (I-V) függvények az egyre nagyobb dózisú 4-AP Ito-ra (A), valamint TEA Isus-ra (B) kifejtett blokkoló hatását demonstrálják. A Hill-görbéken a +70 mV-on regisztrált áramamplitúdók (I4-AP, ITEA) kontrollra (IKont) normalizált értékei a 4-AP (C), valamint a TEA (D) koncentrációnak függvényében kerültek ábrázolásra.

69

3. A feszültségfüggő K+ áram jellemzése, hipoxiás modulációjának leírása A K+ áram komponenseinek jellemzésére a következő paramétereket használtuk: tranziens outward komponens maximális amplitúdó (Ito), sustained outward komponens amplitúdó (Isus), az Ito gyors inaktivációs fázisának időállandója (τfast), az inaktiváció mértéke (Ito/Ipeak), (ld. Módszerek 5, 6). A sejtkapacitásra normalizált áramok amplitúdóinak (pA/pF) meghatároztuk az IV karakterisztikáját. A feszültségfüggő kifelé folyó K+ áramokat a Módszerek 6. alatt leírtak szerint váltottuk ki (23. Stimulus). Regisztráltuk a normoxiás állapotban (23. A), valamint az 5 órás hipoxia protokoll után kiváltható áramsorozatokat (23. B). A következő pontban tárgyalt, a hipoxiás moduláció mechanizmusának feltárására irányuló vizsgálataink keretében a sejtek egy csoportjában megelőzően

a

regisztrátumok

KN-93-mal,

a

felvétele

CaMKII

esetében

szelektív

a

hipoxiás

blokkolójával

protokollt végeztünk

előinkubációt (23. C). A KN-93 előinkubáció részletesebb ismertetését a következő alfejezet tartalmazza. Hipoxia szignifikánsan növelte az Ito-t a +50 mV - +80 mV (+70 mV-on kontroll állapot: 11.5±2.3 pA/pF, n=22, hipoxia után: 15.9±1 pA/pF, n=16, p<0.05) (23. D), ill. az Isus-t a -10 mV - +80 mV (+70 mV-on kontroll állapot: 11.4±2.4 pA/pF, n=23, hipoxia után: 24.1±4.9 pA/pF, n=18, p<0.01) (23. E) tartományban.

70

23. ábra A hipoxia protokoll hatása rBCEC4 sejtek outward K+ áramkomponenseinek amplitúdójára KN-93 előkezeléssel és anélkül Az outward K+ áramok a Stimulus protokoll szerint kerültek kiváltásra kontroll körülmények között (A), az 5 órás hipoxia protokoll után (B), valamint a hipoxiás protokollt megelőző KN-93 előinkubáció esetén (C). D. A tranziens komponens (Ito) I-V függvénye kontroll körülmények között ({) (n=22), hipoxiát követően ( ) (n=16), valamint KN-93 előinkubációval végrehajtott hipoxia protokoll után (n=16) (). E. A sustained komponens (Isus) I-V függvénye kontroll körülmények között ({) (n=23), hipoxiát követően ( ) (n=18), valamint KN-93 előinkubációval végrehajtott hipoxia protokoll után (n=17) (). Az áramok amplitúdója a sejtkapacitásra lett normalizálva. Átlag±SEM. *P<0.05, **P<0.01 Az

inaktiváció

kinetikáját

leíró

alábbi

2

szignifikánsan emelkedett a +40 mV - +80 mV

paraméter

közül

a

τfast

tartományban (+70 mV-on

kontroll állapot: 76.7±2.5 ms, n=21, hipoxia után: 89.7±3.2 ms, n=16, p<0.01) (24. A, B). Az időállandó emelkedése az outward áram inaktivációjának lassulását jelzi. Az Ito/Ipeak arány szignifikáns csökkenését találtuk poszthipoxiás állapotban (+70 mV-on kontroll állapot: 0.5±0.04, n=22, hipoxia után: 0.4±0.02, n=16, p<0.01), ami a tranziens komponensnek a teljes áramhoz való csökkent mértékű hozzájárulását jelzi (24. C).

71

24. ábra A hipoxia protokoll hatása rBCEC4 sejtek outward K+ áramkomponenseinek inaktivációs paramétereire KN-93 előkezeléssel és anélkül A. Az outward K+ áramok a Stimulus protokoll szerint +70 mV-ra léptetett kommand feszültséggel kerültek kiváltásra kontroll körülmények között, a hipoxia protokoll után, valamint a hipoxiás protokollt megelőző KN-93 előinkubáció esetén. B. A tranziens komponens leszálló szakaszára biexponenciális illesztéssel nyert inaktivációs időállandó (τfast) értékei a kommand feszültség függvényében kerültek feltüntetésre kontroll körülmények között ({) (n=21), 5 óra hipoxiát követően( ) (n=16), valamint KN-93 előinkubációval kombinált hipoxia protokoll után () (n=15). C. A tranziens áram és a teljes kifelé folyó áram amplitúdójának arányaként (Ito/Ipeak) definiált paraméter, az inaktiváció mértéke került feltüntetésre kontroll (n=22), hipoxiát követő (n=16), valamint KN-93 előinkubációval társult hipoxia utáni állapotban (n=15). Átlag±SEM. *P<0.05, **P<0.01

4. A hipoxiás moduláció mechanizmusának vizsgálata A CaMKII izoenzimeknek a K+ áram hipoxiás változásában betöltött szerepének feltételezett

alátámasztására hipoxiás

a

sejtek

aktiválódását

a

egy

csoportjában

CaMKII

egy

az

izoenzimek

szelektív,

potens

blokkolójával, a KN-93-al kívántuk megakadályozni. Ebben a csoportban a

72

hipoxiás protokoll előtt 20 μM KN-93-al 30 perces inkubációt végeztünk. Mivel egyes

irodalmi

adatok

szerint

bizonyos

sejtekben

a

KN-93

képes

a

feszültségfüggő K+ csatornák közvetlen blokkolására is (Ledoux és mtsai, 1998), ezért negatív kontrollként hasonló paraméterekkel végeztünk inkubációt a KN92-vel is, ami a KN-93 CaMKII blokkoló hatással nem rendelkező szerkezeti analógja. A KN-93 előkezelés mind a 4, a K+ áramot jellemző paraméter esetén képes volt azok hipoxiás módosulását megakadályozni, azaz a paraméterek a kontroll tartományban maradtak. Így az értékek az alábbiak szerint alakultak +70 mVon: Ito 10.7±1.7 pA/pF, n=16, Isus 10.3±2.4 pA/pF, n=17 (23. C, D, E), τfast 71.6±2.6 ms, n=15 (24. A, B), Ito/Ipeak 0.51±0.04, n=15 (24. C). KN-92 alkalmazása nem befolyásolta a paraméterek hipoxiás változását, tehát ezen értékek a hipoxiás tartományban maradtak, azaz +70 mV-on a következőképp alakultak: Ito 15.6±1.5 pA/pF, n=11, Isus 23.7±8.8 pA/pF, n=11, τfast 93.4±4.9 ms, n=11, Ito/Ipeak 0.4±0.06, n=11.

5. A CaMKII izoenzimek transzkripciós mintázatának jellemzése patkány agyi kapilláris endotélsejtekben A CaMKII izoenzimek mRNS expressziójának meghatározásához osztály-, ill. izoform specifikus primer párokat használtunk az RT-PCR során. A CaMKII α, β, γ izoenzimek osztályspecifikus primerei az osztályra jellemző variábilis flanking régióknak feleltek meg, így az összes expresszált izoform kimutatható volt.

A

δ

izoenzimek

kimutatása

egyedi

alosztályspecifikus

primer

kombinációkkal történt (25. ábra). Az rBCEC4 sejtekből nyert RNS (25. 1 panelek) mellett pozitív kontrollként patkány agyból származó RNS-t használtunk (25. 3 panelek), mivel az α és β izoenzimek főként neuronban expresszálódnak (α: 505 bp, β: 439 bp). Negatív kontrollként az RT-PCR reverz transzkriptáz enzim nélkül kapott eredménye szolgált (25. 2 panelek). Ellentétben a patkány agyszövettel, sejtvonalunkban nem találtunk

α és β izoenzimnek megfelelő mRNS-t. A γ osztály specifikus

kombinációval a kapilláris sejtekben 2 jelet találtunk, melyek méretük és a szekvenálás alapján a γB és γC izoformoknak felelnek meg (γB: 701 bp, γC: 632

73

bp). A CaMKIIδ esetében a nem-neuronális alosztályoknak (δ2, δ3, δ4, δ9) megfelelő primereket használtunk, pozitív kontrollként pedig a megfelelő izoformokat tartalmazó plazmidokat alkalmaztunk. Ez esetben specifikus szignált a CaMKIIδ2-nek megfelelő primer esetében kaptunk (δ2: 531 bp). A β izoform 1. panelben található szignál a szekvenálás alapján műterméknek bizonyult

(nemspecifikus).

A

δ2-9 izoform

1.,

2.

paneljének

gyengébb

intenzitású szignáljai nem egyeznek méretben a pozitív kontrollokkal, így PCR artefaktoknak tekinthetők.

25. ábra A CaMKII izoenzimek mRNS expressziója rBCEC4 sejtekben A CaMKII α (balra fent), β (középen fent), γ (jobbra fent) és az egyedi δ (alul) alosztályspecifikus primerekkel végzett RT-PCR eredmények 35 ciklust követően. A teljes RNS izolátum rBCEC4 sejtekből (1) és patkány agyszövetből (3) származik. Negatív kontrollként az rBCEC4 sejtekkel reverz transzkriptáz nélkül végrehajtott RT-PCR szolgál (2). A δ alosztályok esetében a megfelelő izoformot tartalmazó plazmidokkal végzett kontroll PCR eredményei is láthatók (pozitív kontroll). A β izoform 1. panelben található szignál a szekvenálás alapján műterméknek bizonyult (nemspecifikus). A nyilak a detektált szignál méretét (bp) jelzik.

74

6. A CaMKII izoenzim proteinek expressziós mintázatának jellemzése A CaMKII enzimfehérjék expressziójának kimutatására az mRNS adatok alapján választott CaMKIIγ- és CaMKIIδ-specifikus antitestekkel dolgoztunk (26. A). A δ izoform elleni antitest a C-terminális régiót felismerve több alosztály azonosítására alkalmas. A γ-specifikus antitest az összes ismert izoform alosztályban közös konzervált szekvenciát ismeri fel. A δ antitest egyetlen, 54 kDa-os jelet adott, mely a transzkripciós adatok és a molekulatömeg alapján a δ2 izoenzimnek felel meg (26. A 1). A γ-specifikus antitest 3 jelet azonosított 42, 54 és 60 kDa molekulatömeggel (26. A 2). Az mRNS adatok és a tömeg alapján a kifejezett 60 kDa-os jel a γB, míg a kisebb intenzitású 54 kDa-os a γC izoformot mutatja. A 42 kDa nagyságú jel kívül esik az ismert CaMKII proteinek mérettartományán.

26. ábra A CaMKII izoenzim fehérjék expressziója és aktivációja rBCEC4 sejtekben A. Az 1. sáv a CaMKIIδ-specifikus antitesttel, a 2. a CaMKIIγ-specifikus antitesttel kapott szignált jelzi. B. A CaMKII γ és δ izoenzimek ionomycin hatására bekövetkező autofoszforilációja 30 perces 20 μM KN-93 előkezeléssel, valamint annak hiányában. c: kontroll, iono: ionomycin (250 nM), P-CaMKIIγ: a CaMKIIγ autofoszforilált formája elleni antitest, P-CaMKIIδ: a CaMKIIδ autofoszforilált formája elleni antitest, MM: molekulatömeg

75

7. A

CaMKII

izoenzimek

ionomycinnel

és

hipoxiával

kiváltott

aktiválódásának kimutatása, jellemzése Az ionomycin mint közismert Ca2+-ionofor az intracelluláris szabad Ca2+ koncentráció emelésével képes aktiválni a CaMKII izoenzimeket. 250 nM ionomycin alkalmazását követően a CaMKII aktivált (autofoszforilált) formája elleni antitestek egy 54 és 60 kDa jelet azonosítottak a CaMKIIδ2 és a CaMKIIγB izoenzimeknek megfelelően (26. B). Az autofoszforilált δ2 izoform aktivitása kontroll állapotban minimális volt, ionomycin stimulációra azonban gyorsan és robosztusan emelkedett. Mindez azonban rövid idejű volt, az aktivált forma 10 perc elteltével már nem volt detektálható. Ezzel ellentétben a γB izomer autofoszforilált formájának magasabb alapaktivitása ionomycin stimulációra lassabb

időkinetikával

emelkedett,

viszont

az

autofoszforilációs

állapot

stabilabbnak bizonyult, mert az autofoszforilált CaMKIIγB 10 perc elteltével is detektálható volt. A 42 kDa pozícióban nem találtunk autofoszforilációs jelet. 30 perces KN-93 előkezelés szignifikánsan csökkentette mindkét izoenzim autofoszforilációját. 5 óra anoxiás protokoll az előzőekhez hasonló módon aktiválta mindkét izoenzimet, melyet szintén az autofoszforilált formák detektálásával vizsgáltunk (27. A). Azaz a δ2 izoform aktivitása a kontroll állapotú minimumról hipoxia hatására gyorsan és nagymértékben emelkedett (kontroll: 10±2.6 O.D., n=3, hipoxia: 85.6±7.4 O.D., n=5, P<0.01), míg a γB esetében magasabb kontroll aktivitásról kisebb rátájú, de szintén szignifikáns növekedést tapasztaltunk (kontroll: 74.3±5.7 O.D., n=3, hipoxia: 121.8±10.7 O.D., n=5, P<0.05). KN-93 előkezelés

ez

esetben

is

teljesen

blokkolta

a

hipoxia

által

kiváltott

autofoszforilációt mindkét izoenzim esetében (CaMKIIδ2: 11.6±1.6 O.D., n=5, CaMKIIγB: 75.6±9.9 O.D., n=5) (27. B).

76

A MM (kDa) P-CaMKIIγ P-CaMKIIδ

50 1

2

3

B * OD (arbitrary units)

125 100

**

75 50 25 0

2 3 1 P-CaMKIIδ

2 1 3 P-CaMKIIγ

27. ábra 5 órás hipoxia CaMKII izoenzimek autofoszforilációjára gyakorolt hatása KN-93 előkezeléssel és anélkül rBCEC4 sejtekben A. Kontroll (1), hipoxia protokollon átesett (2) és KN-93 előkezelést követő hipoxia protokollon átesett (3) sejtek autofoszforilált CaMKII izoenzimeinek detektálása a megfelelő autofoszforilációs helyre specifikus antitestekkel. B. Az egyes kísérleti csoportokból a megfelelő autofoszforilált izoenzimek elleni antitestekkel kapott immunoblottok optikai denzitásának kvantifikálása. PCaMKIIγ: a CaMKIIγ autofoszforilált formája elleni antitest, P-CaMKIIδ: a CaMKIIδ autofoszforilált formája elleni antitest, MM: molekulatömeg, Átlag±SEM. *P<0.05, **P<0.01

8. A

tranziens

outward

K+

áramot

vezető

csatornaprotein

immunhisztológiai detektálása Irodalmi adatok szerint a Shaker-típusú Kv1.4 csatorna részt vesz a tranziens outward, A-típusú K+ áram kialakításában. Az anti-Kv1.4 antitesttel végzett immunhisztológiai vizsgálattal, Cy3-konjugált szekunder antitesttel

77

történt vizualizációval igazoltuk sejtvonalunkban a Kv1.4 proteinek jelenlétét (28. ábra).

28. ábra A Kv1.4 proteinek jelenléte rBCEC4 sejtekben Immunfluoreszcens mikroszkópos felvétel nyúlban termelt anti-Kv1.4 antitesttel inkubált rBCEC4 sejtekről. A vizualizáció kecskében termelt Cy3konjugált szekunder antitesttel történt.

ÚJ EREDMÉNYEK, MEGBESZÉLÉS I.a.

Mind az A típusú, mind a delayed rectifier outward áram, melyek

irodalmi adatok szerint megtalálhatók primer kapilláris endotélsejteken (Jow és mtsai, 1999, Dittrich és Daut, 1999), a kísérleteinkben regisztrált Ito és Isus áramoknak

feleltethetők

nagymértékben

megőrizte

meg. a

Ezek

primer

szerint

endotélsejtek

rBCEC4

sejtvonalunk

tulajdonságait,

ezáltal

igazolva eredményeink validitását az elektrofiziológiai adatokra vonatkoztatva is. Az A áram - Ito, valamint delayed rectifier - Isus megfeleltetés alapjául egyrészt az általunk használt kommand pulzus szolgál, mely a hiperpolarizáló priming miatt képes mindkét áram kiváltására. A komponensek szeparálása nem a klasszikus módon történt, mely szerint a hiperpolarizáló priminggel kombinált

depolarizációval

kiváltott

áramokból

a

priming

nélküli

depolarizációval regisztrált áram kivonása történik, hanem a Módszerek alatt

78

leírtak szerint. Mivel az A áram az 1 sec depolarizáló pulzus végére teljesen inaktiválódik, aktivációja pedig lényegesen gyorsabb a delayed rectifier komponenshez képest (azaz a delayed rectifier komponens amplitúdója az A áram csúcsán csak csekély mértékben járul hozzá a teljes kifelé folyó áramhoz), ezért a módszerünk szerinti szeparáció elegendően pontos. Az endotélsejtek feszültségfüggő kifelé folyó K+ áramait vizsgáló közlemények túlnyomó része az általunk is használt módszerrel dolgozik. A megfeleltetés alapjául másrészt pedig a klasszikus K+ csatorna blokkolókkal végzett vizsgálataink szolgálnak. Sejttenyészetek esetében gyakran felmerülő probléma az, hogy a sejtek mennyiben őrzik meg a megváltozott celluláris és kémiai mikrokörnyezetben primer tulajdonságaikat. Még nagyobb súllyal esik latba e kérdés immortalizált sejtvonal esetén, ahol a szubkultúrák szekvenciális felhasználása történik. Ezért kísérleteinkben az immortalizált sejtek alapos morfológiai, proliferációs, biokémiai és funkcionális szelekcióját követően csak a 20.-30. szubkultúrák sejtjeit használtuk. Azonban még ezen szubkultúrák esetében is bármiféle, a fent felsorolt, valamint az elektrofiziológiai tulajdonságokat érintő változás esetén a sejtkultúra továbbvitelét befejeztük és folyékony N2-ben konzervált korai sejtekkel új szubkultúrát indítottunk. I.b.

A hipoxia protokoll után kimutatott szignifikáns mértékű sejtduzzadás

igazolta, hogy ezen esetben méréseink releváns patofiziológiai eltéréseket mutató állapotban történtek. Míg egyszerű fáziskontraszt mikroszkópos vizsgálatok hipoxia után a kapilláris

endotélsejtek

2

dimenzióba

vetített

területének

növekedését

mutatták, a laser scanning mikroszkópia a sejtek alakjának változatos módosulását demonstrálta. Vizsgálatainkat az elektrofiziológiai kritériumok teljesítése céljából solitaer, egymással nem érintkező

sejteken végeztük, s

ehhez igazodva ilyen sejteken történtek a morfológiai vizsgálatok is. Könnyen belátható, hogy az általunk kimutatott morfológiai eltérések a kapillárisokban egymással szoros kontaktusban levő endotélsejtek esetében a struktúra dezorganizációjához vezetnek, ami a barrier funkciót nagymértékben károsítja. Klinikai vizsgálatok szövettanilag igazolták iszkémiát követően az endotélsejtek duzzadását, dezintegrációját. Ennek meghatározó jelentősége van az ún. noreflow

jelenség

létrehozásában,

amikor

a

sikeres

makrovaszkuláris

79

rekanalizáció ellenére a kapilláris reperfúzió nem, vagy elégtelen szinten valósul meg. Ez jól ismert probléma a szívinfarktus, stroke ellátásában, valamint a koronária és transzplantációs sebészetben (Welt és mtsai, 2000, Vizzotto és mtsai, 2001). A probléma megoldására többféle módszer is kipróbálásra került, pl. lipoxigenáz inhibitorok (Welt és mtsai, 2000), hiperozmotikus oldatok alkalmazása (Kempski és Behmanesh, 1997), megnyugtató eredmények e tekintetben azonban még nem születtek. II.a.

A 4-AP és TEA klasszikus feszültségfüggő K+ csatorna blokkolókkal

kapott eredmények szerint a vizsgált áramok hordozója döntő mértékben K+ volt. Elsőként írtuk le ezen blokkolók dózis-hatás görbéjének paramétereit agyi kapilláris endotél esetében. A 4-AP és TEA a fenti áramok mellett több más K+ áramot is gátol, különböző mértékben. Ismeretes, hogy bár az A áram ˝tipikus˝ blokkolója a 4AP, és a delayed rectifier-é a TEA, azonban 4-AP is képes a sustained komponens kismértékű gátlására, ill. az A áram korai komponense is blokkolható bizonyos mértékig TEA alkalmazásával. Ez utóbbi jelenséget kísérleteink is igazolták. E 2 gátlószer tehát önmagában nem alkalmas a fenti 2 áramtípus tökéletes szeparálására, azonban a számtalan irodalmi adat szerint is kellően pontos ahhoz, hogy a 2 áramot egymástól elkülönítsük és az áramot döntően meghatározó töltéshordozót azonosítsuk. II.b.

A charybdotoxin hatástalansága igazolta, hogy a Ca2+-függő K+ áramok

nem játszanak közvetlen szerepet a vizsgált áramok modulációjában. A Ca2+-függő K+ csatornák jelenléte endotélsejteken több esetben is leírásra került, elsősorban azonban makrovaszkuláris endotéliumban (Colden és mtsai, 1987, Demirel és mtsai, 1994). Természetesen e csatornák jelenléte rBCEC4 sejtvonalunk esetén sem zárható ki. Ezek funkcióját pedig a hipoxia hatására

megemelkedő

befolyásolhatja.

A

hipoxiás

intracelluláris protokollt

szabad

követően

Ca2+

azonban

koncentráció egyrészt

nem

tapasztaltuk a feszültségfüggő outward komponensek küszöbének csökkenését, valamint 1 μM charybdotoxin, a Ca2+-függő K+ csatornablokkoló alkalmazása sem befolyásolta sem a kontroll, sem a poszthipoxiás áramparamétereket. Ezen adatok arra utalnak, hogy az általunk leírt jelenség kialakításában a Ca2+-függő

80

K+ csatornák aktiválódása nem játszik szerepet. III.a. Munkánk során elsőként írtuk le agyi kapilláris endotélsejteken a feszültségfüggő outward K+ áram komponensek I-V karakterisztikáját. Az Ito (A) és Isus (IDR) áramok egyes paraméterei variabilitást mutatnak az irodalmi adatokat egymással és saját méréseinkkel összevetve is. Ennek magyarázatául a bevezetésben már említett azon tény szolgálhat, miszerint egyes makroszkópos áramformák kialakításában többféle csatornamolekula aktiválódása is részt vehet. A tranziens, A áram kialakításában pl. a Kv1.4, Kv3.4 csatornák is szerepet játszanak, ezek expressziós aránya, mintázata határozza meg a makroszkópos áram paramétereit. Emellett az egyes csatornák áramvezetési paraméterei számos szignál által (pl. citokinek) modulálhatók, kísérleteinkben mi a hipoxia hatására történő foszforiláció által megvalósuló regulációt igazoltuk. A variabilitáshoz hozzájárul a sejtek változatos kémiai mikrokörnyezete is, humán kapilláris endotélsejtek esetében a kondícionált tenyésztőmédium az A típusú és Ca2+-függő K+ áram megjelenését indukálta (Jow és mtsai, 1999). III.b. Az

amplitúdó,

valamint

a

kinetikai

paraméterek

alkalmazásával

részletesen jellemeztük az áramkomponensek hipoxiás modulációját. Eszerint hipoxia megnöveli a tranziens, még inkább a sustained komponens

amplitúdóját

ezáltal

csökkentve

az

inaktiváció

mértékét.

Mindezeken felül a tranziens komponens inaktivációs időállandóját emeli, ami az inaktiváció sebességének csökkenését mutatja. Ezen jelenségek egyes részletei leírásra kerültek excitábilis sejteken (pitvari izomsejteken és colon simaizomsejteken)

(Tessier

és

mtsai,

1999,

Koh

és

mtsai,

1999),

endotélsejteken azonban ezidáig még nem. IV.a. KN-93, a CaMKII izoenzimek szelektív gátlószere megakadályozta az áramkomponensek paramétereinek hipoxiás módosulását. Ezen jelenség alátámasztja azon munkahipotézisünket, mely szerint a hipoxiára bekövetkező intracelluláris szabad Ca2+ koncentráció emelkedése aktiválja a CaMKII izoenzimeket endotélsejtekben, melyek a feszültségfüggő K+ csatornák foszforilálásával azok áramvezetési paramétereit módosítják. Ezen

81

paraméterek CaMKII általi, normoxiás körülmények alatti szabályozásának egyes elemei ismertek voltak transzfektált HEK (Roeper és mtsai, 1997), valamint egyes excitábilis sejteken (Tessier és mtsai, 1999, Koh és mtsai, 1999), azonban sem hipoxiás körülmények között, sem endotélsejteken még nem kerültek leírásra. A CaMKII izoenzimek hipoxia általi aktiválódása az Ito (A) áram inaktivációjának

lassulásához

vezet.

Az

A

áram

a

membrán

előzetes

hiperpolarizációját követő depolarizációja során a csatornák de-inaktivációja miatt aktiválódik. Emiatt a depolarizáció ideje alatt a K+ konduktanciát növelve a további depolarizációt fékező, a repolarizáció irányába ható effektusa van. Az áram inaktivációjának lassulása a K+ kiáramlást emelve ezt a repolarizációs erőt növeli. Bizonyos vazoaktív anyagok, pl. bradikinin, hisztamin hiperpolarizálják mindazon endotélsejteket, melyek nyugalmi membránpotenciálja nem áll szorosan az inward rectifier K+ áram kontrollja alatt. Ilyenek tipikusan a kapilláris endotélsejtek, az inward rectifier K+ áramok ui. a makrovaszkuláris endotéliumra jellemzőek. A kezdeti hiperpolarizációt, mely oka a Ca2+-függő K+ csatornák

aktiválódása,

gyakran

depolarizáció

követi

a

nem-szelektív

kationcsatornák aktiválódása miatt (Luckhoff és Busse, 1990, Daut és mtsai, 1994). A hiperpolarizáció a Ca2+-ra ható hajtóerő révén emeli, a depolarizáció pedig csökkenti a Ca2+-beáramlást (Mehrke és Daut, 1990, Marchenko és Sage, 1993). A depolarizáció a nem-szelektív kationcsatornák mellett az R-típusú Ca2+ csatornákat

feszültségfüggő

aktiválva

azonban

a

Ca2+-beáramlást

növelheti is. A különböző ioncsatornák aktivitásának, a membránpotenciál változásának és a Ca2+-influxnak a kölcsönhatása az intracelluláris Ca2+ koncentráció

és

a

membránpotenciál

oszcillációját

eredményezi.

A

membránpotenciál oszcillációja képes az A áram kiváltására, az A áram inaktivációjának

csökkenése

pedig

az

oszcilláció

egyik

elemét

képező

depolarizáció ellen ható mechanizmust erősíti. IV.b. Egyes sejttípusokban a KN-93 közvetlen K+ csatornablokkoló hatással bír (Ledoux és mtsai, 1998). A KN-93 negatív kontrollként alkalmazott szerkezeti analógjának, a KN-92-nek az áramparaméterekre vonatkozó hatástalansága bizonyította, hogy sejtjeinkben a KN-93 közvetlen csatornablokkoló hatással

82

nem rendelkezett. Tehát a KN-93 áramkomponensekre gyakorolt hatása a CaMKII izoenzimekre gyakorolt közvetlen blokkoló effektusának tudható be. V.

Kapilláris

endotélsejtekben

a

CaMKII

izoenzimek

transzkripciós

mintázata ismeretlen volt. Az RT-PCR technika alkalmazásával az izoenzimek közül a γB, γC, valamint a δ2 alosztályok mRNS-einek transzkripcióját detektáltuk. Várakozásunknak

megfelelően

a

CaMKII

tipikusan

neuronokban

expresszálódó α és β izoformjait nem detektáltuk. A CaMKIIδ nem-neuronális tagjai (δ2, δ3, δ4, δ9) közül csak a δ2 transzkripcióját találtuk, mely sokféle szövetben expresszálódik, a szívizomzatban pedig konstitutíven is jelen van. A β alosztály esetén szekvenálással, a δ alosztályok esetén pedig pozitív kontrollok segítségével sikerült elkülönítenünk a PCR műtermékeket. VI.

A Western-blot módszer segítségével az RT-PCR által mRNS szinten

detektált izoenzimek proteinjeinek expressziós mintázatát mutattuk ki. A CaMKIIγ- és CaMKIIδ-specifikus antitestekkel az 54 kDa δ2, valamint a 60 kDa γB izoenzim intenzív expresszióját mutattuk ki. A γC izoform várható méretének megfelelő 54 kDa pozícióban detektált gyengébb szignál jelezheti magát a γC izoformot, azonban a nagymértékben expresszálódó δ2 izoenzimmel való keresztreakció lehetősége sem zárható ki teljes bizonyossággal. A 42 kDa szignál nem reprezentál egyetlen ismert CaMKIIγ izoformot sem. VII.

Az autofoszforilált (aktivált) izoenzimek elleni antitestek alkalmazásával

kimutattuk az izoformok aktiválódását mind Ca2+-ionofor alkalmazása, mind hipoxia

hatására.

Elsőként

jellemeztük

az

izoenzimek

aktiválódásának

időkinetikáját endotélsejtekben. Az

izoenzimek

aktiválódásának

jellemzői

hasonlóak

voltak

mind

ionomycin alkalmazásakor, mind hipoxia után, azaz a δ2 izoenzim a γB–vel összehasonlítva kontroll állapotban kisebb aktivitással rendelkezett, ami stimulációra gyorsabban és nagyobb mértékben emelkedett, viszont rövidebb idejű volt. Az eltérő aktivációs kinetika alapjául szolgálhat az izoenzimek másmás

intracelluláris

lokalizációja

miatt

a

Ca2+

és/vagy

kalmodulin

83

hozzáférhetőségében rejlő különbség, a különböző foszfatáz aktivitás, de lehet ez a CaMKII izoenzimekre egyedileg jellemző tulajdonság is. A γB izoenzim aktivációja magasabb kalmodulin koncentrációt igényel, viszont a többi CaMKIIγ formánál erősebben köti azt (Kwiatkowski és McGill, 2000). A γB izoform emellett a γC-nél magasabb katalitikus aktivitással rendelkezik (Singer és mtsai, 1997). Észleléseink az irodalmi adatokkal összhangban

a

γ

alosztályokat

tekintve

a

γB

izoenzim

aktivitásának

dominanciájára utalnak. A 42 kDa pozícióban az autofoszforilációs jel hiánya arra utal, hogy a CaMKIIγ-specifikus antitesttel kapott 42 kDa jel nem reprezentál egyetlen ismert, funkcióképes γ izomert sem. Patkány myoblast sejtvonalon kapott adatok szerint a δ2 izoenzim a plazmamembránnál is lokalizálódhat (Hoch és mtsai, 1998). Ez a tény, valamint a δ2 izomer robosztusabb aktivációjára vonatkozó adataink azt mutatják, hogy a K+ csatornák modulációját tekintve a γ izoformokkal szemben a δ2 szerepe lehet meghatározó. VIII. Immunhisztológiai vizsgálattal a Kv1.4 csatorna jelenlétét bizonyítottuk rBCEC4 sejteken A Kv1.4 típusú csatornák jellemzője az N-terminális domén által megvalósuló gyors inaktiváció (Hoshi és mtsai, 1991). HEK sejtekben a transzfektált Kv1.4 csatorna N-terminálisának CaMKII általi foszforilációja lassítja az A áram inaktivációját (Roeper és mtsai, 1997). A kimutatott Shakertípusú csatorna mellett azonban más típusok, így pl. a Kv3.4 is alkalmas a tranziens A áram kialakítására, így ezen leletünk csak közvetett jellegű, s valószínűsíti a Kv1.4 csatornákon megvalósuló regulációt.

84

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezúton mondok köszönetet mindazoknak, akik a disszertáció alapjául szolgáló munkámban segítségemre voltak. Hazai munkámat tekintve tisztelet és köszönet illeti Szolcsányi János professzor urat és Czéh Gábor professzor urat, akik a tudományos iskola programvezetőjeként és témavezetőjeként biztosították

számomra

a

kedvező

észrevételeikkel, kritikáikkal neurofarmakológia

és

feltételeket,

valamint

tanácsaikkal,

segítették kísérleteimet, és akik bevezettek a

celluláris

elektrofiziológia

korántsem

egyszerű

tudományába. Köszönettel tartozom továbbá munkatársaimnak: Dr. Szőke Évának,

Varga

Angelikának

és

Dr.

Sándor

Zoltánnak,

akik

egy-egy

kísérletsorozatban voltak segítségemre. A kísérletekhez nyújtott megbízható és nélkülözhetetlen segítségért köszönetem fejezem ki Búzási Ádámné Anna és Disztl

Cecília

asszisztensnőknek.

Mindezeken

túl

köszönet

illeti

a

Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet minden dolgozóját, hogy munkámat nyugodt, oldott légkörben végezhettem. Külföldi munkámat illetően köszönettel tartozom Dr. Ingolf E. Blasig docens úrnak és Peter Karczewski professzor úrnak, akik kísérleteimhez a kedvező hátteret biztosították és tanácsaikkal, ötleteikkel segítették azt. Köszönettel gondolok munkatársaimra: Dr. Brigitte Hoch-ra és Dr. Kenan Maric-ra az egyes kísérletsorozatokban nyújtott értékes segítségükért. Odaadó, precíz munkájáért ugyancsak köszönet illeti Barbara Eilemann asszisztensnőt. Szeretném külön köszönetem kifejezni a Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie,

Berlin

segítőkészségükkel,

valamennyi

szimpátiájukkal

munkatársának, könnyítették

meg

akik

őszinte

számomra

a

beilleszkedést és biztosították a produktív, baráti légkört. Nagy szeretettel és hálával gondolok feleségemre, szüleimre és öcsémre, akik az önmagam megtalálásáért folytatott próbálkozásaim, küzdelmem során mindvégig megértettek, támogattak és kitartottak mellettem.

85

HIVATKOZOTT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Armstrong, C. M. and Bezanilla, F. (1973) Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels. Nature 242, 459-461 Armstrong, C. M. and Bezanilla, F. (1977) Inactivation of the sodium channel. II. Gating current experiments J. Gen. Physiol. 70, 567-590 Arnould, T., Michiels, C., Alexandre, I. and Remacle, J. (1992) Effect of hypoxia upon intracellular calcium concentration of human endothelial cells. J. Cell Physiol. 152, 215-221 Baccaglini, P. I. and Hogan, P. G. (1983) Some rat sensory neurones in culture express characteristics of differentiated pain sensory cells. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80, 594-598 Bhave, G., Zhu, W., Wang, H., Brasier, D. J., Oxford, G. S. and Gereau, R. W. (2002) cAMPdependent protein kinase regulates desensitization of the capsaicin receptor (VR1) by direct phosphorylation. Neuron 35(4), 721-731 Belmonte, C. and Cervero, F. (eds) (1996) Neurobiology of nociceptors. Oxford Univ. Press Benndorf, K. and Nilius, B. (1988) Properties of an early outward current in single cells of the mouse ventricle. Gen. Physiol. Biophys. 7, 449-466 Bevan, S. (1996) Intracellular messengers and signal transduction in nociceptors. In Neurbiology of Nociceptors (eds: Belmonte, C. and Cervero, F.) pp. 298-324, Oxford Univ. Press, Oxford Bevan, S. and Docherty, R. J. (1993) Cellular mechanisms of the action of capsaicin. In Capsaicin in the Study of Pain. (ed. Wood, J. N.) pp. 27-44, Academic Press, London Bevan, S. and Szolcsányi, J. (1990) ) Sensory neuron specific actions of capsaicin: mechanisms and applications. Trends Pharmac. Sci. 11, 330-333 Bkaily, G., d'Orleans-Juste, P., Naik, R., Perodin, J., Stankova, J., Abdulnour, E. and RolaPleszczynski, M. (1993) PAF activation of a voltage-gated R-type Ca2+ channel in human and canine aortic endothelial cells. Br. J. Pharmacol. 110, 519-520 Blair, N. T. and Bean, B. P. (2002) Roles of tetrodotoxin (TTX)-sensitive Na+ current, TTXresistant Na+ current, and Ca2+ current in the action potentials of nociceptive sensory neurons. J. Neurosci. 22(23),10277-10290

86

Blasig, I. E., Giese, H., Schroeter, M. L., Sporbert, A., Utepbergenov, D. I., Buchwalow, I. B., Neubert, K., Schonfelder, G., Freyer, D., Schimke, I., Siems, W. E., Paul, M., Haseloff, R. F. and Blasig, R. (2001) NO and oxyradical metabolism in new cell lines of rat brain capillary endothelial cells forming the blood-brain barrier. Microvasc. Res. 62(2), 114-127 Bleakman, D., Brorson, J. R. and Miller R. J. (1990) The effects of capsaicin on voltage-gated calcium currents and calcium signals in cultured dorsal root ganglion cells. Br. J. Pharmacol. 101, 423-431 Blumberg, P. M., Szállási, Á. and Ács, G. (1993) Resiniferatoxin – an ultrapotent capsaicin analogue. In Capsaicin in the Study of Pain (ed. Wood., J. N.) pp. 45-62, Academic Press, London Borbiev, T., Verin, A. D., Shi, S., Liu, F. and Garcia, J. G. N. (2001) Regulation of endothelial cell barrier function by calcium/calmodulin-dependent protein kinase II Am. J. Physiol. 280, L983-990 Bossu, J. L., Elhamdani, A. and Feltz, A. (1992) Voltage-dependent calcium entry in confluent bovine capillary endothelial cells. FEBS Lett. 299, 239-242 Brau, M. E., Dreimann, M., Olschewski, A., Vogel, W. and Hempelmann, G. (2001) Effect of drugs used for neuropathic pain management on tetrodotoxin-resistant Na+ currents in rat sensory neurons. Anesthesiology 94(1), 137-144 Braun, A. P. and Schulman, H. (1995) The multifunctional calcium/calmodulin-dependent protein kinase: from form to function. Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 Butler, A., Wei, A., Baker, K. and Salkoff, L. (1989) A family of putative potassium channel genes in Drosophila. Science 243, 943-947 Cai, H., Davis, M. E., Drummond, G. R. and Harrison, D. G. (2001) Induction of endothelial NO synthase by hydrogen peroxide via a Ca(2+)/calmodulin-dependent protein kinase II/janus kinase 2-dependent pathway. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21, 1571-1576 Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine J. D. and Julius D. (1997) The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 389, 816-824 Caterina, M. J., Leffler, A., Malmberg, A. B., Martin, W. J., Trafton, J., Petersen-Zeitz, K. R., Koltzenburg, M., Basbaum, A. I. and Julius, D. (2000) Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science 288(5464), 306-313

87

Catterall, W. (2000) From ionic currents to molecular mechanisms: the structure and function of voltage-gated sodium channels. Neuron 26, 13-25 Cestele, S. and Catterall, W. A. (2000) Molecular mechanisms of neurotoxin action on voltagegated sodium channels. Biochimie 82(9-10), 883-892 Christie, M. J. (1995) Molecular and functional diversity of K+ channels. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22(12), 944-951 Cholewinski, A., Burgess, G. M. and Bevan S. (1993) The role of calcium in capsaicin-induced desensitization in rat cultured dorsal root ganglion neurones. Neuroscience 55, 1015-1023. Colden, S. M., Schilling, W. P., Ritchie, A. K., Eskin, S. G., Navarro, L. T. and Kunze, D. E. (1987) Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 61, 632-640 Daut, J., Standen, N. B. and Nelson, M. T. (1994) The role of the membrane potential of endothelial and smooth muscle cells in the regulation of coronary blood flow. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 5, 154-181 Demirel, E., Rusko, J., Laskey, R. E., Adams, D. J. and van Breemen, A. C. (1994) TEA inhibits ACh-induced EDRF release: endothelial Ca2+-dependent K+ channels contribute to vascular tone. Am. J. Physiol. 267, H1135-41 Dittrich, M. and Daut, J. (1999) Voltage-dependent K+ current in capillary endothelial cells isolated from guinea pig heart. J. Physiol. 277, H119-127 Docherty, R. J., Robertson, B. and Bevan, S. (1991) Capsaicin causes prolonged inhibition of voltage-activated calcium currents in adult rat dorsal root ganglion neurones in culture. Neuroscience 40, 513-521 Docherty, R. J., Yeats, J. C., Bevan, S. and Boddeke, H. W. (1996) Inhibition of calcineurin inhibits the desensitization of capsaicin-evoked currents in cultured dorsal root ganglion neurones from adult rats. Pflügers Arch. 431(6), 828-837 Doupnik, C. A., Davidson, N. and Lester, H. A. (1995) The inward rectifier potassium channel family. Curr. Opin. Neurobiol. 5, 268-277 Elliott, J. R. (1997) Slow Na+ channel inactivation and bursting discharge in a simple model axon: implications for neuropathic pain. Brain Res. 754(1-2), 221-226

88

Erdelyi, L. and Such, G. (1986) Effects of capsaicin on molluscan neurons: a voltage clamp study. Comp. Biochem. Physiol. 85(2), 319-327 Giese, H., Mertsch, K. and Blasig, I. E. (1995) Effect of MK-801 and U83836E on a porcine brain capillary endothelial cell barrier during hypoxia. Neurosci. Lett. 191, 169-172 Gustafsson, B., Galvan, M., Grafe, P. and Wigström, H. (1982) A transient outward current in a mammalian central neurone blocked by 4-aminopyridine. Nature 299, 252-254 He, P. and Curry, F. E. (1991) Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability. Am. J.Physiol. 261, H1246–1254 Heyman, I. and Rang, H. P. (1985) Depolarizing responses to capsaicin in a subpopulation of rat dorsal root ganglion cells. Neuroscience Letters 56, 69-75 Hoch, B., Haase, H., Schulze, W., Hagemann, D., Morano, I., Krause, E. G. and Karczewski, P. (1998) Differentiation-dependent expression of cardiac delta-CaMKII isoforms. J. Cell. Biochem. 68, 259-268 Hoch, B., Meyer, R., Hetzer, R., Krause, E-G. and Karczewski, P. (1999) Identification and expression of delta-isoforms of the multifunctional Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase in failing and nonfailing human myocardium. Circ. Res. 84, 713-721 Hodgkin, A. L. and Huxley, A. F. (1952a) Currents carried by sodium and potassium ions through the membrane of the giant axon of Loligo. J. Physiol. 116, 449-472 Hodgkin, A. L. and Huxley, A. F. (1952b) The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. J. Physiol. 116, 473-496 Hodgkin, A. L. and Huxley, A. F. (1952c) The dual effect of membrane potential on sodium conductance in the giant axon of Loligo. J. Physiol. 116, 497-506 Hodgkin, A. L. and Huxley, A. F. (1952d) A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J. Physiol. 117, 500-544 Holzer, P. (1991) Capsaicin: Cellular targets, mechanisms of action, and selectivity for thin sensory neurons. Pharmacol. Rev 43, 143-201 Hoshi, T., Zagotta, W. N. and Aldrich, R. W. (1990) Biophysical and molecular mechanisms of Shaker potassium channel inactivation. Science 250, 533-538

89

Hoshi, T., Zagotta, W. N. and Aldrich, R. W. (1991) Two types of inactivation in Shaker K+ channels: effects of alterations in the carboxy-terminal region. Neuron 7, 547-556 Hőgyes, A. (1878) Beitrage zur physiologischen Wirkung der Bestandteile des Capsicum annum. Arch. Exp. Path. Pharmac. 9, 117-130 Ikeda, M., Ariyoshi, H., Sakon, M., Kambayashi, J., Yoshikawa, N., Shinoki, N., Kawasaki, T. and Monden, M. (1998) A role for local calcium gradients upon hypoxic injury in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Cell Calcium 24, 49-57 Inagami T., Naruse M. and Hoover R. (1995) Endothelium as an endocrine organ. Annu. Rev. Physiol. 57, 171–189 Jancsó, N. (1955) Speicherung. Stoffanreicherung in Retikuloendothel und in der Niere. Budapest: Akadémiai Kiadó Jancsó, N., Jancsó-Gábor, A. and Szolcsányi, J. (1967). Direct evidence for neurogenic inflammation and its prevention by denervation and by pretreatment with capsaicin. Br. J. Pharmacol. 31, 138-151 Jow, F., Sullivan, K., Sokol, P. and Numann, R. (1999) Induction of Ca2+-activated K+ current and transient outward currents in human capillary endothelial cells. J. Membr. Biol. 167, 5364 Kanaseki, T., Ikeuchi, Y., Sugiura, H. and Yamauchi, T. (1991) Structural features of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II revealed by electron microscopy. J. Cell. Biol. 115, 1049-1060 Kempski, O. and Behmanesh, S. (1997) Endothelial cell swelling and brain perfusion. J. Trauma 42, 38-40 Kéri, G., Tóth, I. Molecular Pathomechanisms and New Trends in Drug Research. Taylor & Francis, London, 2002 Kingston, R. E., Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1994) in Ausubee, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G. and Struhl, K. (eds.) Curr. Protocols in Mol. Biol. Suppl. 23., pp. 4.2.1 - 4.2.8, John Wiley & Sons, NY Koh, S. D., Perrino, B. A., Hatton, W. J., Kenyon, J. L. and Sanders, K. M. (1999) Novel regulation of the A-type K+ current in murine proximal colon by calcium-calmodulin-dependent

90

protein kinase II. J. Physiol. (Lond). 517, 75-84 Koplas, P. A., Rosenberg, R. L. and Oxford, G. S. (1997) The role of calcium in the desensitization of capsaicin responses in rat dorsal root ganglion neurones. J. Neuroscience 17, 3525-3537 Kwiatkowski, A. P. and Mc Gill, J. M. (2000) Alternative splice variant of gamma-calmodulindependent protein kinase II alters activation by calmodulin. Arch. Biochem. Biophys. 378, 377383 Ledoux, J., Chartier, D. and Leblanc, N. (1998) Inhibitors of calmodulin-dependent protein kinase are nonspecific blockers of voltage-dependent K+ channels in vascular myocytes. J. Pharm. Exp. Ther. 290, 1165-1174 Lembeck, F. and Holzer, P. (1979) Substance P as neurogenic mediator of antidromic vasodilation and neurogenic plasma extravasation. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 310, 175-183 Li, M., Jan, Y. N. and Jan, L. Y. (1992) Specification of subunit assembly by the hydrophilic amino-terminal domain of the Shaker potassium channel. Science 257, 1225-1230 Liu, J., Farmer, J. D., Lane, W. S., Friedman, J., Weissman, I. and Screiber, S. L. (1991) Calcineurin is a common target of cyclophilin-cyclosporin A and FKBP-FK506 complexes. Cell 66, 807-815 Liu, L. and Simon, S. A.

(1996) Similarities and differences in the currents activated by

capsaicin, piperine, and zingerone in rat trigeminal ganglion cells. J. Neurophysiol. 76, 18581869 Liu, L., Szállási, A and Simon, S. A. (1998) A non-pungent resiniferatoxin analogue, phorbol 12-phenylacetate 13 acetate 20-homovanillate, reveals vanilloid receptor subtypes on rat trigeminal ganglion neurons. Neuroscience 84, 569-581 Liu, L., Oortgiesen, M., Li, L. and Simon. S. A. (2001) Capsaicin inhibits activation of voltagegated sodium currents in capsaicin-sensitive trigeminal ganglion neurons. J. Neurophysiol. 85(2), 745-758 Lopez-Barneo, J., Hoshi, T., Heinemann, S. H. and Aldrich, R. W. (1993) Effects of external cations and mutations in the pore region on C-type inactivation of Shaker potassium channels. Receptors and Channels 1, 61-71

91

Luckhoff, A. and Busse, R. (1990) Activators of potassium channels enhance calcium influx into endothelial cells as a consequence of potassium currents. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 342, 94–99 Maggi, C. A. and Meli, A. (1988a) The sensory-efferent function of capsaicin-sensitive sensory neurons Gen. Pharmacol. 19, 1-43 Maggi, C. A., Patacchini, R., Santicioli, P., Giuliani, S., Geppetti, P. and Meli, A. (1988b) Protective action of ruthenium red toward capsaicin desensitization of sensory fibers. Neurosci. Lett. 88, 201-205 Marchenko, S. M. and Sage, S. O. (1993) Electrical properties of resting and acetylcholinestimulated endothelium in intact rat aorta. J. Physiol. 462, 735-751 Marsh, S. J., Stansfeld, C. E., Brown, D. A., Davey, R. and McCarthey, D. (1987) The mechanism of action of capsaicin on sensory C-type neurons and their axons in vitro. Neuroscience 23, 275-289 Masse, T. and Kelly, P. T. (1997) Overexpression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II in PC12 cells alters cell growth, morphology, and nerve growth factor-induced differentiation. J. Neurosci. 17, 924-931 Mayford, M., Wang, J., Kandel, E. R. and O´Dell, T. J. (1995) CaMKII regulates the frequencyresponse function of hippocampal synapses for the production of both LTD and LTP. Cell 81, 891-904 Mazzoni, M. C., Borgstrom, P., Warnke, K. C., Skalak, T. C., Intaglietta, M. and Arfors, K. E. (1995) Mechanisms and implications of capillary endothelial swelling and luminal narrowing in low-flow ischemias. Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 265-270 McIntyre, P., McLatchie, L. M., Chambers, A., Phillips, E., Clarke, M., Savidge, J., Toms, C., Peacock, M., Shah, K., Winter, J., Weerasakera, N., Webb, M., Rang, H. P., Bevan, S. and James, I. F. (2001) Pharmacological differences between the human and rat vanilloid receptor 1 (VR1). Br. J. Pharmacol. 132(5), 1084-1094 Mehrke, G. and Daut, J. (1990) The electrical response of cultured guinea-pig coronary endothelial cells to endothelium-dependent vasodilators. J. Physiol. 430, 251-272 Mendell, L. M. (1996) Development of the nocicpetor phenotype: role of nerve growth factor. In Neurbiology of Nociceptors (eds: Belmonte, C. and Cervero, F.) pp. 455-472, Oxford Univ. Press, Oxford

92

Mertsch, K., Grune, T., Kunstmann, S., Wiesner, B., Ladhoff, A. M., Siems, W. G., Haseloff, R. F. and Blasig, I. E. (1998) Protective effects of the thiophosphate amifostine (WR 2721) and a lazaroid (U83836E) on lipid peroxidation in endothelial cells during hypoxia/reoxygenation. Biochem. Pharmacol. 56, 945-954 Montell, C. (2002) A unified nomenclature for the superfamily of TRP cation channels. Mol. Cell 9(2), 229-231 Nghiem, P., Ollick, T., Gardner, P. and Schulman, H. (1994) Interleukin-2 transcriptional block by multifunctional Ca2+/calmodulin kinase. Nature 371, 347-350 Nilius, B. (1991)Regulation of transmembrane calcium fluxes in endothelium. News Physiol. Sci. 6, 100-114 Nilius, B., Viana, F. and Droogmans, G. (1997) Ion channels in vascular endothelium. Annu. Rev. Physiol. 59, 145-170 Oh, U., Hwang, S. W. and Kim, D. (1996) Capsaicin activates a nonselective cation channel in cultured neonatal rat dorsal root ganglion neurons. J. Neurosci. 16, 1659-1667 Oláh, Z., Szabó, T., Karai, L., Hough, C., Fields, R. D., Caudle, R. M., Blumberg, P. M. and Iadarola, M. J. (2001) Ligand-induced dynamic membrane changes and cell deletion conferred by vanilloid receptor 1. J. Biol. Chem. 276(14), 11021-11030 Patacchini, R., Maggi, A. and Meli, A. (1990) Capsaicin-like activity of some natural pungent substances on peripheral endings of visceral primary afferents. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 342, 72-77 Petersen, M., LaMotte, R. H. Relationships between capsaicin sensitivity of mammalian sensory neurons, cell size and type of voltage gated Ca-currents. Brain Res. 561(1), 20-26 Piper, A. S., Yeats, J. C., Bevan, S. and Docherty, R. J. (1999) A study of the voltage dependence of capsaicin-activated membrane currents in rat sensory neurones before and after acute desensitization. J. Physiol. (London) 518, 721-733 Pongs, O. (1990) Structural basis of potassium channel diversity in the nervous system. J. Basic Clin. Physiol. Pharmacol. 1(1-4), 31-39 Popp, R. and Gogelein, H. (1992) A calcium and ATP sensitive nonselective cation channel in the antiluminal membrane of rat cerebral capillary endothelial cells. Biochim. Biophys. Acta

93

1108, 59-66 Popp, R., Hoyer, J., Meyer, J., Galla, H. J. and Gogelein, H. (1992) Stretch-activated nonselective cation channels in the antiluminal membrane of porcine cerebral capillaries. J. Physiol. 454435-454449 Premkumar, L. S. and Ahern, G. P. (2000) Induction of vanilloid receptor channel activity by protein kinase C. Nature 408(6815), 985-990 Renganathan, M., Gelderblom, M., Black, J. A. and Waxman, S. G. (2003) Expression of Na(v)1.8 sodium channels perturbs the firing patterns of cerebellar purkinje cells. Brain Res. 959(2), 235-242 Ringkamp, M., Peng, Y. B., Wu, G., Hartke, T. V., Campbell, J. N. and Meyer, R. A. (2001) Capsaicin responses in heat-sensitive and heat-insensitive A-fiber nociceptors. J Neurosci. 21(12), 4460-4468 Roeper, R., Lorra, C. and Pongs, O. (1997) Frequency-dependent inactivation of mammalian Atype K+ channel KV1.4 regulated by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase. J. Neurosci. 17, 3379-3391 Salkoff, L. (1983) Genetic and voltage-clamp analysis of a Drosophila potassium channel. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 48, 221-231 Santicioli, P.,

Patacchini, R., Maggi, C. A. and Meli, A. (1987) Exposure to calcium-free

medium protects sensory fibers by capsaicin desensitization. Neurosci. Lett. 80, 167-172 Schmelz, M., Schmidt, R., Ringkamp, M., Forster, C., Handwerker, H. O. and Torebjork, H. E. (1996) Limitation of sensitization to injured parts of receptive fields in human skin Cnociceptors. Exp. Brain Res. 109(1),141-147 Shen, K. F. and Crain, S. M. (1994) Nerve growth factor rapidly prolongs the action potential of mature sensory ganglion neurones in culture, and this effect requires activation of Gs-coupled excitatory kappa-opioid receptors on these cells. J. Neurosci. 14, 5570-5579 Shu, X-Q. and

Mendell, L. M. (1998) Neurotrophin effects on capsaicin-induced inward

currents of sensory neurones in the rat. Abstr. Soc. Neurosci, No. 319.10. Singer, H. A., Benscoter, H. A. and Schworer, C. M. (1997) Novel Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II gamma-subunit variants expressed in vascular smooth muscle, brain, and cardiomyocytes. J. Biol. Chem. 272, 9393-9400

94

Spigelman, I. and Puil, E. (1989) K+-channel blockade in trigeminal root ganglion neurons: effects on membrane outward currents. J. Neurophysiol. 62(3), 802-809 Spigelman, I. and Puil, E. (1990) Ionic mechanism of substance P actions on neurons in trigeminal root ganglia. J. Neurophysiol. 64(1), 273-281 Szállási, Á. and Blumberg, P. M. (1990) Resiniferatoxin and its analogs provide novel insights into the pharmacology of the vanilloid (capsaicin) receptor. Life. Sci. 47, 1399-1408 Szállási, Á. and Blumberg, P. M. (1999) Vanilloid (Capsaicin) receptors and mechanisms. Pharmacological Rev. 51(2), 159-211 Szállási, Á. and Di Marzo, V. (2000) New perspectives on enigmatic vanilloid receptors. Trends Neurosci. 23, 491-497 Szolcsányi, J. (1982) Capsaicin type pungent agents producing pyrexia. in Handbook of experimental pharmacology, Pyretics and Antipyretics, (Ed. Milton, A. S.), Vol. 60., pp. 437-478, Springer-Verlag, Berlin Szolcsányi, J. (1983) Tetrodotoxin-resistant non-cholinergic neurogenic contraction evoked by capsaicinoids and piperine on the guinea-pig trachea. Neurosci. Lett. 42, 83-88 Szolcsányi, J. (1984) Capsaicin and neurogenic inflammation: History and early findings. in Antidromic Vasodilatation and Neurogenic Inflammation (eds. Chahl, L. A., Szolcsányi, J. and Lembeck, F.) pp. 27-53, Akadámiai Kiadó, Budapest Szolcsányi, J. (1987) Selective responsiveness of polymodal nociceptors of the rabbit ear to capsaicin, bradykinin and ultra-violet irradiation. J. Physiol. 338, 9-23 Szolcsányi, J. (1988) Antidromic vasodilatation and neurogenic inflammation. Agents Actions 23, 4-11 Szolcsányi, J., Anton, F., Reeh, P. W. and Handwerker, H.O. (1988) Selective excitation by capsaicin of mechano-heat sensitive nociceptors in rat skin. Brain Res. 446(2), 262-268 Szolcsányi, J. (1990) Capsaicin, irradiation and desensitization: neurophysiological basis and future perspectives. in Chemical Senses, Vol. 2: Irradiation. (eds Green, B. G., Mason, J. R. and Kare, M. R.) pp. 141-169, Marcel Dekker, Inc. New York Szolcsányi, J. (1993) Actions of capsaicin on sensory receptors. in Capsaicin in the Study of

95

Pain (ed. Wood, J., N.) pp. 1-26, Academic Press, London Szolcsányi, J. (1996) Capsaicin-sensitive sensory nerve terminals with local and systemic efferent functions: Facts and scopes of an unorthodox neuroregulatory mechanism. in Progress in Brain Research: The Polymodal Receptor – A Gateway to Pathologivcal Pain (eds. Kumazawa, T., Kruger, M. and Mizumura, K.) 113, pp. 343-359, Elsevier, Amsterdam Szolcsányi, J. and Barthó, L. (1978) New type of nerve-mediated cholinergic contractions of the guinea-pig small intestine and its selective blockade by capsaicin. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 305, 83-90 Szolcsányi, J. and Jancsó-Gábor, A. (1975) Sensory effects of capsaicin congeners I. Relationship between chemical structure and pain producing potency of pungent agents. Arzneimittelforschung (Drug Res.) 25, 1877-1881 Szolcsányi, J.and Jancsó-Gábor, A. (1976) Sensory effects of capsaicin congeners. Part II: Importance of chemical structure and pungency in desensitizing activity of capsaicin-type compounds. Arzneimittelforschung (Drug Res.) 26, 33-37 Szőke, É., Balla, Zs., Csernoch, L., Czéh, G. and Szolcsányi, J. (2000) Interacting effects of capsaicin and anandamide on intracellular calcium in sensory neurones. Neuroreport 11:9 1949-1952 Takeda, K., Schini, V. and Stoeckel, H. (1987) Voltage-activated potassium, but not calcium currents in cultured bovine aortic endothelial cells. Pflügers Arch. 410, 385-393 Tessier, S., Karczewski, P., Krause, E-G., Pansard, Y., Acar, C., Lang-Lazdunski, M., Mercadier, J-J. and Hatem, S. N. (1999) Regulation of the transient outward K+ current by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases II in human atrial myocytes. Circ. Res. 85, 810819 Tobimatsu, T. and Fujisawa, H. (1989) Tissue-specific expression of four types of rat calmodulin-dependent protein kinase II mRNAs. J. Biol. Chem. 264, 17907-17912 Tominaga, M.,

Caterina, M. J., Malmberg, A. B., Rosen, T. A., Gilbert, H., Skinner, K.,

Baumann, B. E., Basbaum, A., I. and Julius, D. (1998) The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli. Neuron 21, 531-543 Trezise, D. J., John, V. H. and Xie, X. M. (1998) Voltage- and use-dependent inhibition of Na+ channels in rat sensory neurones by 4030W92, a new antihyperalgesic agent Br. J. Pharmacol., 124, 953-963

96

Usachev Y. M., Marchenko S. M. and Sage S. O. (1995) Cytosolic calcium concentration in resting and stimulated endothelium of excised intact rat aorta. J. Physiol. 489, 309–317 Vizzotto, I., Vertemati, M., Degna, C.T. and Aseni, P. (2001) Liver transplantation in man: morphometric analysis of the parenchymal alterations following cold ischaemia and warm ischaemia/reperfusion. J. Anat. 198, 603-10 Walsh, K. B., Wolf, M. B. and Fan, J. (1998) Voltage-gated sodium channels in cardiac microvascular endothelial cells. Am. J. Physiol. 274, H506-512 Wang,

Y.

and

Simonson,

M.

S.

(1996)

Voltage-insensitive

Ca2+

channels

and

Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases propagate signals from endothelin-1 receptors to the c-fos promoter. Mol. Cell. Biol. 16, 5915-5923 Ward, B. J. and Firth, J. A. (1989) Effect of hypoxia on endothelial morphology and interendothelial junctions in the isolated perfused rat heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 12, 13371347 Welch, J. M., Simon, S. A. and Reinhart, P. H. (2000) The activation mechanism of rat vanilloid receptor 1 by capsaicin involves the pore domain and differs from the activation by either acid or heat. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97(25), 13889-13894 Welt, K., Fitzl, G. and Mark, B. (2000) Lipoxygenase inhibitor FLM 5011, an effective protectant of

myocardial

microvessels

against

ischemia-reperfusion

injury?

An

ultrastructural-

morphometric study. Exp. Toxicol. Pathol. 52, 27-36 Wood, J. N., Winter, J., James, I. F., Rang, H. P., Yeats, J. and Bevan, S. (1988) Capsaicininduced ion fluxes in dorsal root ganglion cells in culture. J. Neurosci. 8, 3208-3220 Wood, J. N. and Docherty, R. (1997) Chemical activators of sensory neurons. Annu. Rev. Physiol. 59, 457-482 Yellen, G. (2002) The voltage-gated potassium channels and their relatives. 419(6902), 35-42 Yeomans, D.C. and Proudfit, H.K. (1996) Nociceptive responses to high and low rates of noxious cutaneous heating are mediated by different nociceptors in the rat: electrophysiological evidence. Pain 68(1), 141-150 Zagotta, W. N., Hoshi, T. and Aldrich, R. W. (1990) Restoration of inactivation in mutants of Shaker potassium channels by a peptide derived from ShB. Science 250, 568-571

97

SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE

Az értekezéshez kapcsolódó közlemények Balla, Z., Hoch, B., Karczewski, P., Blasig, I.E. (2002): Calcium/calmodulindependent Protein Kinase IIdelta2 and gamma Isoforms Regulate Potassium Currents of Rat Brain Capillary Endothelial Cells under Hypoxic Conditions. Journal of Biological Chemistry 277(24):21306-14. IF: 7.258 Balla, Z., Szőke, É., Czéh, G., Szolcsányi, J. (2001) Effect of capsaicin on voltage-gated currents of trigeminal neurones in cell culture and slice preparations. Acta Physiologica Hungarica 88(3-4):173-196. IF: 0.246 Szőke, É., Balla, Z., Csernoch, L., Czéh, G., Szolcsányi, J. (2000): Interacting effects of capsaicin and anandamide on intracellular calcium in sensory neurones. Neuroreport 11(9):1949-52. IF: 2.374

Egyéb közlemények Pongo, É., Balla, Z., Mubagwa, K., Flameng, W., Édes, I., Szilvássy, Z., Ferdinandy P. (2001): Deterioration of the protein kinase C-K(ATP) channel pathway in regulation of coronary flow in hypercholesterolaemic rabbits. European Journal of Pharmacology 418(3):217-23. IF: 2.164

98

Németh, J., Vecsernyés, M., Oroszi, G., Balla, Z., Helyes, Zs., Farkas, B., Szilvássy,

Z.

(2000):

Preparation

of

mono-125I-labelled

gastrin-17

for

radioimmunoassay measurements. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 43(9):855-863. IF: 0.839 Balla, Z., Németh, J., Kovács, P., Rablóczky, Gy., Literáti-Nagy, P., Szolcsányi, J., Ferdinándi, P., Szilvássy, Z. Development of insulin resistance by nitrate tolerance in conscious rabbits. European Journal of Pharmacology – közlésre benyújtva

Folyóiratban megjelent referált (megbírált) idézhető abstractok Sándor Z., Balla Zs., Szolcsányi J. Expression of rat vanilloid-1 (VR1) receptor in cell culture Clinical Neuroscience, közlésre elfogadva IF: 1.353 Angelika Varga, Éva Szőke, Zs. Balla, G. Czéh, J. Szolcsányi Parallel measurement of rhodamine 123 and fura-2 in capsaicin-stimulated sensory neurons Clinical Neuroscience, közlésre elfogadva IF: 1.353 Balla, Z., Hoch, B., Karczewski, P., Blasig, I. E. (2002) Ca2+/calmodulindependent protein kinase II isoforms regulate K+ currents of rat brain capillary endothelial cells under hypoxic conditions. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacogy 365(1):65 IF: 2.472

99

Czéh, G., Balla, Z., Szőke, É., Szolcsányi, J. (2000) Membrane current and intracellular calcium changes induced by capsaicin and anandamide in the rat’s isolated trigeminal neurones. J. Physiol. London, 526. IF: 4.476 Balla, Z., Szőke, É., Czéh , G., Szolcsányi, J. (2000) Effects of capsaicin on voltage-gated currents of trigeminal neurones in cell culture and slice preparations Eur. J. Neurosci. 12:309 IF: 3.919 Szőke, É., Czéh, G., Balla, Z., Szolcsányi, J. (2000) Capsaicin and anandamide induced current and calcium changes in sensory neurones. Eur. J. Neurosci. 12:308 IF: 3.919 Balla, Z., Szőke, É., Szolcsányi, J, Czéh, G. (1999) Capsaicin in low concentration modulates voltage-gated ionic currents in vanilloid sensitive trigeminal nerve-cells in slice preparation. Fundam. Clin. Pharmacol., 13. IF: 1.036

Folyóiratban megjelent egyéb idézhető abstractok Balla, Z., Szőke, É., Szolcsányi, J., Czéh, G. (1999) Changes of free calcium ion concentration in sensory neurons. Neurobiology 7(3):280 Szőke, É., Balla, Z., Szolcsányi, J., Czéh, G. (1999) Capsaicin-sensitive voltagegated ionic currents in sensory neurons. Neurobiology 7(3):392-393 Becze Z., Balla Z., Szolcsányi J., Czéh G. (1998) Intracellular recordings from

100

control and capsaicin treated trigeminal ganglia of rat pups. Neurobiology 6(2):8-9 Horváth, Z., Balla, Z., Hati, K., Vajda, Z., Seress, L. (1996) Kindling of the perforant pathway results in epileptic behavior but no sprouting of the mossy fibers in rat hippocampus. Neurobiology 4:323 Hati, K., Balla, Z., Vajda, Z., Horváth, Z. (1994) Kindling-induced structural changes in rat nervous system. Neurobiology 2:59

Angol nyelvű előadások, poszterek Zs. Balla, É. Szőke, J. Szolcsányi, G. Czéh: Capsaicin in low concentration modulates voltage-gated ionic currents in vanilloid sensitive trigeminal nervecells in slice preparation Second European congress of Pharmacology, 1999, Budapest, poszter Zs. Balla, É. Szőke, J. Szolcsányi, G. Czéh: Depression of voltage-gated sodium and potassium currents by capsaicin The Primary Nociceptive Neuron, Official Meeting of the 9th World Congress on Pain, 1999, Prague, Czeh Republic, poszter G. Czéh, Zs. Balla. É. Szőke, J. Szolcsányi: Membrane current and intracellular calcium changes induced by capsaicin and anandamide in the rat’s isolated trigeminal neurones The Joint Meeting of the Physiological Society with the Hungarian Physiological Society, 2000, Budapest, előadás Zs. Balla, É. Szőke, G. Czéh, J. Szolcsányi: Effects of capsaicin on voltagegated currents of trigeminal neurones in cell culture and slice preparations Forum of European Neuroscience, Millennium Meeting, 2000, Brighton, UK, poszter

101

É. Szőke, G. Czéh, Zs. Balla, J. Szolcsányi: Capsaicin and anandamide induced current and calcium changes in sensory neurones Forum of European Neuroscience, Millennium Meeting, 2000, Brighton, UK, poszter Balla, Z., Hoch, B., Karczewski, P., Blasig, I. E.: The role of Ca2+/calmodulindependent protein kinase II isoforms in the regulation of K+ currents of rat brain capillary endothelial cells under hypoxic conditions VIIth International Dahlem Symposium on Cellular Signal Recognition and Transduction, 2001, Berlin-Dahlem, Germany, poszter Balla, Z., Hoch, B., Karczewski, P., Blasig, I. E.: Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IIγ and δ isoforms regulate K+ currents of rat brain capillary endothelial cells under hypoxic conditions 43. Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie, 2002, Mainz, Germany, előadás Z. Balla, M. Sladek, T. Bauer, I. E. Blasig: AMPA/Kainate receptor activation in rat cortical astrocytes under normal and hypoxic conditions Berlin Neuroscience Forum, 2002, Liebenwalde, Germany, poszter Balla, Z., Hoch, B., Karczewski, P. and Blasig, I. E.: Ca2+/calmodulindependent protein kinase II δ2 and γ isoforms regulate K+ currents of rat brain capillary endothelial cells under hypoxic conditions Fifth Symposium on Signal transduction in the blood-brain barriers, 2002, Potsdam, Germany, előadás

Magyat nyelvű előadások, poszterek Hati, K., Balla, Z., Vajda, Z. és Horváth, Z.: Kindling-indukálta strukturális változások patkány központi idegrendszerében MITT 1994. évi konferenciája, Pécs (1994), poszter

102

Horváth, Z., Balla, Z. Hati, K., Vajda, Z., Seress, L.: Perforáns pálya kindling okozta epilepsziás magatartás moharost sarjadzás nélkül patkányokban MITT 1996. évi konferenciája, Balatonfüred (1996), elôadás Becze Zs., Balla Zs., Szolcsányi J., Czéh G.: Intracellular recordings from control and capsaicin treated trigeminal ganglia of rat pups MITT 1998. évi konferenciája, Debrecen (1998), poszter Balla Zs., Szőke É., Czéh G., Szolcsányi J.: Capsaicin-indukált kation áramok trigeminus ganglion B-típusú sejtjeiben II. Országos Ph.D. Konferencia, Debrecen (1998.), I. díjas előadás Szőke É., Balla Zs., Czéh G., Szolcsányi J.: Capsaicin-indukált kation áramok trigeminus ganglion B-típusú sejtjeiben II. Országos Ph.D. Konferencia, Debrecen (1998.), poszter Zs. Balla, É. Szőke, J. Szolcsányi and G. Czéh: Changes of free calcium ion concentration in sensory neurons MITT 1999. évi konferenciája, Harkány (1999.), előadás É. Szőke, Zs. Balla, J. Szolcsányi and G. Czéh: Capsaicin-sensitive voltagegated ionic currents in sensory neurons MITT 1999. évi konferenciája, Harkány (1999.), előadás Szőke É., Balla Zs., Czéh G., Szolcsányi J. Capsaicin által kiváltott calciumszint változás sejtszintű vizsgálata fluoreszcens módszerrel IBRO-MITT Milleniumi Konferencia 2000, Budapest, poszter Sándor Z., Balla Zs., Szolcsányi J. Expression of rat vanilloid-1 (VR1) receptor in cell culture MITT IX. konferenciája, Balatonfüred, 2003, poszter Angelika Varga, Éva Szőke, Zs. Balla, G. Czéh, J. Szolcsányi Parallel measurement of rhodamine 123 and fura-2 in capsaicin-stimulated sensory

103

neurons MITT IX. konferenciája, Balatonfüred, 2003, poszter

104