Kata kunci : Flavonoid, Tanin, Enterococcus faecalis, ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L.)

║Journal Caninus Denstistry Volume 2, Nomor 2 (Mei 2017): 92 - 96

Pengaruh Ekstrak Biji Kakao (Theobroma cacao L.) Terhadap Pertumbuhan Enterococcus faecalis Pada Berbagai Konsentrasi Nurul Hafidhah, Rachmi Fanani Hakim, Fakhrurrazi Program Studi Pendidikan Dokter Gigi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Syiah Kuala E-mail author: [email protected] ABSTRAK Enterococcus faecalis adalah bakteri anaerob fakultatif gram positif, non-motil, serta dapat tumbuh dengan cepat pada suhu 37-42ºC dan membentuk koloni non-hemolitik. E. Faecalis merupakan salah satu dari banyak mikroorganisme yang ditemukan di saluran akar gigi dengan perawatan endodontik yang gagal dan juga terlibat dalam infeksi saluran akar yang persisten.Penelitian in vitromenemukan bahwa E. faecalis dapat menginvasi tubulus dentin di mana tidak semua bakteri dapat melakukannya serta resisten terhadap kalsium hidroksida dengan pH di bawah 11,1. Kakao (Theobroma cacao L.) memiliki kandungan flavonoid berupa katekin, antosianin, dan quercetin, serta kandungan tanin berupa prosianidin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L.) terhadap pertumbuhan Enterococcus faecalis pada berbagai konsentrasi. Metode yang digunakan adalah uji antimikroba dengan pengenceran seri. Pada kelompok perlakuan, konsentrasi ekstrak biji kakao yang digunakan adalah 6,25%, 12,5%, 25%, 50%, dan 100%, sedangkan pada kelompok kontrol digunakan chlorhexidine 2% sebagai kontrol positif dan akuades sebagai kontrol negatif. Uji analisis Kruskal-Wallis menunjukkan nilai p= 0,003 yang berarti ekstrak biji kakao berpengaruh secara signifikan terhadap pertumbuhan Enterococcus faecalis. Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan, ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L.) dapat menghambat pertumbuhan Enterococcus faecalis mulai dari konsentrasi 6,25% hingga 100%.

Kata kunci : Flavonoid, Tanin, Enterococcus faecalis, ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L.) ABSTRACT Enterococcus faecalis is anaerob facultative positive, non-motile bacteria, and can grow fast at 3742ºC and form non-hemolytic colony. E. faecalis is one of microorganisms that found in root canal with failed endodontic treatment and involved in persistent root canal infection. In vitro studied discovered that E. faecalis may invade the dentine tubules which there is no much bacteria can do and they have resistance against calcium hydroxide with pH below 11,1. Cacao (Theobroma cacao L.) contains flavonoid such as catechin, anthocyanin, and quercetine, and tannin as procyanidin. The study aims to know the effect of cacao seed extract in different concentration on growth of Enterococcus faecalis. The method used in this study was antimicrobial test with serial dilution. In experimental group, the concentrations of cacao seed extract that be used were 100%, 50%, 25%, 12,5%, and 6,25%, while in control group used chlorhexidine 2% as positive control and aquades as negative control. Kruskal-Wallis test showed p value was 0,003 and indicated that cacao seed extract has significant effect on growth of Enterococcus faecalis. This study showed cacao seed (Theobroma cacao L.) extract can affect the growth of Enterococcus faecalis in 6,25% until 100%.

Keywords : Flavonoid, tannin, Enterococcus faecalis, extract of cacao seed (Theobroma cacao L.) PENDAHULUAN Enterococcus adalah bakteri fakultatif gram positif, non-motil, serta dapat tumbuh dengan cepat pada suhu 37-42ºC dan membentuk koloni non-hemolitik.1,2 Enterococcus faecalis (E. faecalis) adalah salah satu dari banyak mikroorganisme yang ditemukan di saluran akar gigi dengan perawatan endodontik yang gagal dan juga terlibat dalam infeksi saluran akar yang

persisten.3 Sel E. faecalis dapat mempertahankan kelangsungan hidupnya dalam periode yang lama dan resisten terhadap radiasi UV, panas, sodium hipoklorit, hidrogen peroksida, etanol, dan asam. Penelitian in vitro menemukan bahwa E. faecalis dapat menginvasi tubulus dentin di mana tidak semua bakteri dapat melakukannya.4 Bahan alam telah lama digunakan di bidang kesehatan untuk keperluan preventif, kuratif, dan

J o u r n a l C a n i n u s D e n t i s t r y V o l . 2 , N o . 2 : 9 2 - 9 6 | 92

rehabilitatif, termasuk di bidang kedokteran gigi yang kini telah memanfaatkan bahan alam sebagai material klinis.5 Salah satunya adalah tanaman kakao (Theobroma cacao L.). Kakao kaya akan polifenol, kira-kira 12-18% dari berat kering keseluruhan biji. Kelompok polifenol utama dalam kakao adalah katekin dan epikatekin, antosianin, dan prosianidin.6,7 Kakao telah dilaporkan memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi dibandingkan teh dan anggur merah.7 Polifenol merupakan metabolit yang berlimpah dalam tumbuhan, khususnya buahbuahan, biji, dan daun dan memiliki aktivitas pencegahan melawan penyakit infeksi dan degeneratif termasuk penyakit mulut.8 Berdasarkan penelitian telah ditemukan produk kakao mengandung penghambat enzim dextransukrosa yang berperan dalam pembentukan plak polisakarida ekstraselular dari sukrosa. Penelitian selanjutnya menemukan bahwa polifenol kakao dapat menghambat S. sanguinis serta mengurangi pembentukan biofilm dan produk asam dari S. mutans dan S. sanguinis.6 Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L.) terhadap pertumbuhan Enterococcus faecalis pada berbagai konsentrasi. BAHAN DAN METODE Pembuatan ekstrak biji kakao dilakukan di Laboratorium Kimia Fakultas Keguruan dan Ilmu Pengetahuan Unsyiah. Sebanyak 5 kg buah kakao yang sudah masak (ditandai dengan mulai menguningnya buah pada saat dipetik) dibiarkan dahulu selama kurang lebih lima hari untuk memudahkan lepasnya biji dari kulit buahnya.9,10 Satu kg biji buah kakao dibersihkan dari pulpa biji, lalu dikeringkan dengan cara dianginanginkan (tidak dipanaskan dengan sinar matahari langsung, hal ini bertujuan agar zat-zat kimia biji kakao tidak rusak karena terpapar sinar matahari) selama ± 24 jam. Tahap selanjutnya, biji kakao tersebut ditumbuk kasar dan dianginanginkan lagi sampai kering selama ± 48 jam, kemudian dihaluskan dengan blender hingga menjadi serbuk sebanyak 0,2 kg.5 Serbuk biji kakao tersebut direndam dalam etanol 96% selama 24 jam.5 Proses ekstraksi biji kakao ini menggunakan pelarut etanol karena polifenol dari biji kakao bersifat polar dan relatif stabil pada kondisi larutan asam sehingga polifenol dalam biji kakao lebih mudah larut

dalam pelarut polar seperti metanol dan etanol. Larutan diaduk secara konstan dengan mesin maserasi kinetik selama 1 jam terlindung dari cahaya, kemudian disaring menggunakan kertas saring hingga diperoleh cairan berwarna coklat kemerahan yang bebas dari partikel kasar. Filtrat kemudian dipekatkan dengan mesin rotary evaporator selama 2 jam untuk memisahkan solven dengan ekstrak biji kakao hingga diperoleh ekstrak yang pekat sebanyak 50 mL.5 Kemudian ekstrak diencerkan dengan cara pengenceran seri menggungakan aquades untuk mendapatkan ekstrak biji kakao pada konsentrasi 6,25%, 12,5%, 25%, 50%, dan 100%.5,11 Kultur E. faecalis dilakukan dengan menggunakan teknik goresan (streaking) lalu ditanam pada media CHROMagar VRE, diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37ºC.12,13 Kekeruhan suspensi disetarakan dengan Mc Farland 0,5 (1,5 x108 CFU/mL).13 Suspensi sebanyak 0,1 mL kemudian ditanamkan di media MHA dengan metode spread plate menggunakan batang L dan diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37ºC.14 Pengujian pengaruh ekstrak biji kakao dan kelompok kontrol dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Hewan Unsyiah dengan cara yaitu disediakan dahulu sejumlah 7 tabung. Tabung 1 diisi dengan 3,5 mL ekstrak biji kakao konsentrasi 6,25%, tabung 2 diisi dengan 3,5 mL ekstrak biji kakao konsentrasi 12,5%, tabung 3 diisi dengan 3,5 mL ekstrak biji kakao konsentrasi 25%, tabung 4 diisi dengan 3,5 mL ekstrak biji kakao konsentrasi 50%, dan tabung 5 diisi dengan 3,5 mL ekstrak biji kakao konsentrasi 100%. Tabung 6 sebagai kontrol positif diisi dengan chlorhexidine 2% sedangkan tabung 7 sebagai kontrol negatif diisi dengan akuades steril. Kemudian setiap tabung diisi dengan 1 mL suspensi E. faecalis dan 0,5 mL Nutrient Broth. Setiap tabung dihomogenkan menggunakan vortex.5,14 Selanjutnya dari masingmasing tabung diambil 1 mL suspensi E. faecalis lalu diteteskan pada cawan petri berisi media MHA, kemudian disebar dengan metode spread plate. Media diinkubasi dalam keadaan anaerob selama 24 jam pada suhu 37ºC. Pengamatan pengaruh bahan uji terhadap E. faecalis dilakukan dengan penghitungan koloni menggunakan colony counter.13,15

Journal Caninus Dent istry Vol. 2,No.2:92-96|93

HASIL PENELITIAN Uji pengaruh ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L.) terhadap pertumbuhan koloni E. faecalis dilakukan tiga kali pengulangan. Jumlah rata-rata pertumbuhan koloni bakteri E. faecalis dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Jumlah Koloni E. faecalis Setelah Diuji oleh Kelompok Percobaan Jumlah Koloni (CFU/mL) Konsentrasi Bahan Uji 6,25% 12,5% 25% 50% 100% Akuades Chlorhexidin (CHX) 2%

P1

P2

P3

156x104 94x104 60x104 50x104 0 258x104

169x104 123x104 57x104 44x104 4x104 242x104

160x104 131x104 56x104 32x104 3x104 239x104

Rata-rata Jumlah Koloni (CFU/mL) 161,7x104 116x104 57,6x104 42x104 2,3x104 246,3x104

0

0

0

0

Hasil uji Kruskal-Wallis menunjukkan p=0,003 yang artinya p<0,05, maka dapat disimpulkan terdapat perbedaan yang bermakna dari kelompok uji terhadap pertumbuhan Entercoccus faecalis. Hasil uji lanjut Post Hoc menggunakan uji Mann-Whitney menunjukkan nilai p<0,05, sehingga dapat disimpulkan terdapat perbedaan yang bermakna antara tiap kelompok percobaan. Hasil uji Mann-Whitney dapat dilihat pada tabel 2. Tabel 2. Hasil uji Mann-Whitney Kelom pokUji 6,25%

6,25 % -

12,5%

0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,03 7*

25% 50% 100 % Akua des CHX 2%

12,5 % 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,03 7*

25 % 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,03 7*

50% 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,03 7*

100 % 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,12 1

Aku ades 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,05 * 0,03 7*

CHX 2% 0,037* 0,037* 0,037* 0,037* 0,121 0,037* -

PEMBAHASAN Hasil uji ekstrak biji kakao terhadap pertumbuhan E. faecalis berdasarkan Tabel 1 menunjukkan ekstrak biji kakao dapat menghambat pertumbuhan E. faecalis pada berbagai konsentrasi. Hal ini dibuktikan dengan menurunnya jumlah koloni E. faecalis yang tumbuh pada tiap konsentrasi perlakuan jika dibandingkan dengan kontrol negatif.

Kemampuan biji kakao dalam menghambat pertumbuhan E. faecalis dipengaruhi oleh kandungan polifenolnya yang dilaporkan memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi dibandingkan teh dan anggur merah.6,7 Berdasarkan penelitian Devi Ayu Purnamasari dkk (2010), ekstrak biji kakao mulai konsentrasi 12,5% dapat menghambat pertumbuhan S. mutans. Hal itu disebabkan karena adanya kandungan polifenol yang mampu merusak dinding sel bakteri yang mengandung peptidoglikan.5 Sifat antibakteri biji kakao berasal dari zat aktif utamanya, yaitu katekin, prosianidin, dan antosianin. Katekin bersifat bakterisidal dengan cara mendenaturasi protein bakteri, prosianidin dapat menginaktivasi atau mendestruksi materi genetik pada bakteri, sedangkan antosianin berfungsi sebagai antibakteri. Hasil penelitian menunjukkan semakin tinggi konsentrasi ekstrak biji kakao, maka semakin tinggi pula kandungan zat aktif di dalamnya sehingga daya antimikrobanya juga semakin tinggi.11 Pada kontrol negatif jumlah koloni yang tumbuh adalah 246,3x104 CFU/mL. Akuades sebagai kontrol negatif tidak memiliki zat antibakteri sama sekali sehingga tidak mempunyai daya hambat, oleh karena itu E. faecalis dapat tumbuh bebas dengan jumlah koloni yang tumbuh lebih banyak dibandingkan jumlah koloni pada kelompok perlakuan. Pada kontrol positif, jumlah koloni yang tumbuh adalah 0 CFU/mL. Chlorhexidine sebagai kontrol positif diketahui memiliki aktivitas antibakteri spektrum luas terhadap pertumbuhan bakteri Gram positif dan Gram negatif, termasuk E. faecalis. Chlorhexidine pada konsentrasi rendah bersifat bakteriostatik dan pada konsentrasi tinggi bersifat bakteriosidal.16 Secara statistik, pertumbuhan koloni pada semua kelompok perlakuan menunjukkan perbedaan yang signifikan jika dibandingkan dengan kontrol negatif. Perbedaan jumlah koloni yang bermakna antar kelompok perlakuan dan kelompok kontrol negatif terlihat pada konsentrasi 6,25% hingga 100%. Jika dibandingkan dengan pertumbuhan koloni pada kontrol kelompok uji mulai konsentrasi 6,25% hingga 50% menunjukkan perbedaan pengaruh yang signifikan, sementara konsentrasi 100% tidak berbeda secara signifikan dengan kontrol positif. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak biji kakao pada konsentrasi 100% danchlorhexidine

Journal Caninus Dent istry Vol. 2,No.2:92-96|94

2% memiliki daya antibakteri yang tidak memiliki perbedaan yang signifikan. Hasil penelitian menunjukkan kelompok uji mulai konsentrasi 6,25% hingga 100% dan chlorhexidine 2% sebagai kontrol positif dapat menghambat pertumbuhan E. faecalis, tetapi chlorhexidine 2% memiliki efektivitas yang lebih baik. Hal ini ditunjukkan dengan tidak adanya pertumbuhan koloni E. faecalis pada media yang diuji dengan chlorhexidine 2%, sementara pada media yang diuji ekstrak biji kakao masih terdapat pertumbuhan koloni E. faecalis. Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian Wulan Oktaviana mengenai efektivitas antibakteri ekstrak buah mahkota dewa terhadap E. faecalis yang menunjukkan chlorhexidine 2% memiliki daya antibakteri yang lebih tinggi dalam menghambat pertumbuhan E. faecalis. Daya antibakteri chlorhexidine didapatkan dengan merusak sel membran bakteri yang menyebabkan terjadinya perubahan pada permeabilitas membran sitoplasma, mengubah keseimbangan osmotik seluler, mengganggu metabolisme, pertumbuhan dan pembelahan sel bakteri sehingga dinding sel E. faecalis dapat rusak, lisis, dan akhirnya mati.17 KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian, dapat disimpulkan bahwa ekstrak biji kakao pada konsentrasi 6,25% hingga 100% dan chlorhexidine 2% dapat menghambat pertumbuhan E. faecalis. SARAN Perlu dilakukan uji fitokimia untuk mempelajari karakteristik senyawa dalam biji kakao yang aktif sebagai antibakteri serta uji praklinis dan uji klinis lain yang dapat mendukung keefektifan ekstrak biji kakao sebagai medikamen alternatif saluran akar. DAFTAR PUSTAKA 1. Wardhana, Diana Vitria, Mandojo Rukmo, Ananta Tantri Budi. Daya Antibakteri Kombinasi Metronidazol, Siprofloksasin, dan Minosiklin terhadap Enterococcus faecalis. Jurnal Ilmu Konservasi Gigi. 2008; 1(1): 23. 2. Gajan, Eorafil Balaei, Adileh Shirmohammadi, Mohammad Aghazadeh, Mohammad Alizedh, Alireza Sighari Deljavan, Farzin Ahmadpour. Antibiotic Resistance in Enterococcus faecalis Isolated

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

from Hospitalized Patients. Journal of Dental Research, Dental Clinics, Dental Prospects. 2013; 7(2): 104. Ustun, Yakup, Burak Sagsen, Suleyman Durmaz, Duygu Percin. In Vitro Antimicrobial Efficiency of Different Root Canal Sealers Against Enterococcus faecalis. European Journal of General Dentistry. 2013; 2(2): 135. Kayaoglu, Guven, Dag Orstavik. Virulence Factor of Enterococcus faecalis: Relationship to Endodontic Disease. Critical Review in Oral Biology and Medicine. 2004; 15(5): 308-313. Purnamasari, Dewi Ayu, Ellie Mudadziroh, R.M Yogiartono. Konsentrasi Ekstrak Biji Kakao sebagai Material Alam dalam Menghambat Pertumbuhan Streptococcus mutans. Jurnal PDGI. 2010; 59(1): 14. Ferrazzano, Gianmaria F, Ivana Amato, Aniello Ingenito, Antonino De Natale, Antonino Pollio. Anti-Cariogenic Effects of Polyphenols from Plant Stimulant Beverages (Cocoa, Coffee, Tea). Fitoterapia. 2009: 259. Hiie, C.L., C.L. Law, S. Suzannah, Misnawi, M. Cloke. Polyphenol in Cocoa (Theobroma cacao L.). Asian Journal of Food and AgroIndustry. 2009; 2(4):702. Lolayekar, Nikita, Chaitanya Shanbhag. Polyphenols and Oral Health. RSBO. 2012; 9(1): 74. Prasetyo, Dani S, Dhenok Anggi W, Anisa Nurkesuma, Isnadia Naba’atin, Milati Arifah. Pemanfaatan Limbah Kulit Buah Kakao (Theobroma cacao L.) sebagai Periodontal Dressing terhadap Penyembuhan Luka Gingiva Kelinci. 2011: 5,6. Sartini, M. Natsir Djide, Gemini Alam. Ekstraksi Komponen Bioaktif dari Limbah Kulit Buah Kakao dan Pengaruhnya terhadap Aktivitas Antioksidan dan Antimikroba. Universitas Hasanuddin. 2007: 3. Wulandari, Pipiet, Enny Suswati, Misnawi, Alfa Rianul. Efek Antibakteri Ekstrak Etanol Biji Kakao (Theobroma cacao) terhadap Pertumbuhan Shigella dysentriae secara In Vitro. Jurnal Medika Planta. 2012; 1(5): 69,73. Darjono, Uswatun Nisaa’ Arum. Analisis Minyak Atsiri Serai (Cymbopogon citratus) sebagai Alternatif Bahan Irigasi Saluran Akar Gigi dengn Menghambat Pertumbuhan Enterococcus faecalis. Majalah Sultan

Journal Caninus Dent istry Vol. 2,No.2:92-96|95

Agung. p: 4. Available in http://www.unissula.ac.id (Accessed on March 2014). 13. Najib, Muhammad A., Hendri J. Purnama, Fatkhur Rizqi. Aktivitas Antibakteri Tepung Cacing Tanah (Lumbricus rubellus) terhadap Enterococcus faecalis secara In Vitro. Berkala Ilmiah Mahasiswa Kesehatan Indonesia (BIMKES). Available in http://www.bimkes.org/aktivitas-antibakteritepung-cacing-tanah-lumbricus-rubellusterhadap-enterococcus-faecalis-secara-invitro/ (Accessed on July 2014). 14. Petunjuk Pratikum Mikrobiologi Dasar. Purwokerto: Laboratorium Mikrobiologi

Universitas Jendral Soedirman. 2008: 9, 2027, 32-35, 42, 45, 55-56. 15. Paembong, Adyati. Mempelajari Perubahan Kandungan Polifenol Biji Kakao (Theobroma cacao L) dari Hasil Fermentasi yang Diberi Perlakuan Larutan Kapur. Makassar. 2012: 18. Skripsi. 16. Athanassiadis B, Abbott PV, Walsh LJ. The Use of Calcium Hydroxide, Antibiotics, and Biocides as Antimicrobial Medicaments in Endodontics. Aust Dent J. 2007; 52: 64-82. 17. Harman, Ditha Tri Armianty. Efektivitas Antibakteri Ekstrak Daun Sirih (Piper Bette Linn) terhadap Bakteri Enterococcus faecalis. Makassar. 2013: 36, 46. Skripsi.

Journal Caninus Dent istry Vol. 2,No.2:92-96|96