KARAKTERISASI FRAGMEN GEN 18S rrna POKEA (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) DI SUNGAI POHARA KECAMATAN SAMPARA KABUPATEN KONAWE

Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014

25

ISSN : 2355-6404

KARAKTERISASI FRAGMEN GEN 18S rRNA POKEA (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) DI SUNGAI POHARA KECAMATAN SAMPARA KABUPATEN KONAWE (Characterization of 18S rRNA Gene Fragmen from Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) in the Pohara River Sampara District Konawe Regency) Muzuni1,2*, Dwi Arinto Adi1,2, dan Satriani Syarif2 1

2

Jurusan Biologi FMIPA, Universitas Halu Oleo, Kendari Laboratorium Biologi FMIPA, Universitas Halu Oleo, Kendari e-mail :[email protected]

ABSTRACT This study aims to characterize sequences of 18S rRNA gene fragment from Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) and its role in differentiated Pokea with other Bivalvia. The method used is a series of PCR (Polymerase Chain Reaction) reaction used to determine the sequence of 18S rRNA gene fragments Pokea. Analysis of the data using program NCBI (National Center for Biotechnology Information), Clustal X, Phydit (Phylogenetik editor), and TreeViewX for characterization 18S rRNA gene sequence to construct a phylogenetik tree of Pokea. The results showed that character of 18S rRNA gene fragments Pokea, namely: size 827 bp, including the family Corbicullidae because it has the closest kinship with Corbicula fluminea, as well as having restriction enzyme sites XhoI, PstI, BamHI, and DraI. Keywords: Morphology, characterization, 18S rRNA gene, Pokea (Batissa Violacea celebensis Martens, 1897). dikonsumsi

PENDAHULUAN Provinsi

masyarakat

karena

Tenggara

mengandung gizi yang tinggi terutama

memiliki beberapa sungai besar maupun

protein. Selain itu, kerang dapat pula

sungai kecil yang sangat potensial untuk

digunakan sebagai bahan perhiasan yang

kebutuhan air bersih, irigasi, pembangkit

mempunyai

listrik, dan untuk berbagai kebutuhan

Cangkangnya,

lainnya. Sungai Pohara merupakan salah

tertentu, dapat dijadikan pupuk, makanan

satu sungai yang terdapat di Sulawesi

tambahan unggas, dan pembuatan cat, serta

Tenggara. Masyarakat yang bermukim di

kapur (Nadia, 2011).

daerah

Sulawesi

oleh

Sungai

Pohara

nilai

ekonomis

setelah

melalui

penting. proses

menggunakan

Bivalvia yang hidup di Sungai

sungai tersebut sebagai sumber mata

Pohara berasal dari family Corbicullidae

pencaharian dan salah satunya adalah

dengan jenis Batissa violacea celebensis

menangkap

Martens,

kerang

di

sungai

lalu

menjualnya (Nafsal, 2008). Kerang (Bivalvia) adalah salah satu

jenis

makanan

yang

banyak

1897.

Masyarakat

mengenalnya

dengan

Berdasarkan

informasi

sebutan

setempat Pokea.

LIPI-Cibinong

dalam Bahtiar (2005) bahwa pokea ini


Karakterisasi Fragmen Gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) Di Sungai Pohara Kecamatan Sampara Kabupaten Konawe

26

merupakan hewan endemik di Sulawesi

organisme secara morfologi. Penelitian ini

Tenggara sedangkan di sungai lain yang

dapat menjelaskan karakteristik fragmen

ada di Sulawesi Tenggara belum ada

gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea

informasi ditemukannya organisme ini.

celebensis Martens, 1897) yang diperoleh

Penelitian

karakter

dari Sungai Pohara Kecamatan Sampara

morfologi dan fenotip pada Pokea (Batissa

Kabupaten Konawe Provinsi Sulawesi

violacea celebensis Martens, 1897) telah

Tenggara. Karakteristik ini dapat dijadikan

banyak dilakukan (Bahtiar, 2005; Nafsal,

sebagai pembeda dengan organisme yang

2008;

lain.

Renel,

mengenai

2001),

mengidentifikasi

namun

suatu

untuk

organisme

menggunakan teknik molekuler belum banyak

dilakukan.

molekuler

telah

Beberapa

dikembangkan

teknik

METODE PENELITIAN Alat dan Bahan

untuk

Alat

yang

digunakan

dalam

melacak adanya urutan DNA spesifik dari

penelitian ini adalah

organisme tertentu, contohnya penggunaan

sentrifugator, vortex, set elektroforesis,

urutan gen 18S rRNA untuk menentukan

mesin PCR, waterbath, tabung eppendorff,

hubungan kekerabatan suatu organisme

inkubator,

dengan

photoforesis,

yang

lain

melalui

pohon

filogenetik.

micropipet, tip,

timbangan erlemeyer,

analitik, hotplate,

spektrofotometer, spatula, alu dan mortar.

Gen 18S rRNA sering digunakan

Bahan

yang

digunakan

dalam

untuk studi filogenetik karena mempunyai

penelitian adalah pokea (Batissa violacea

daerah yang conserve (tidak berubah dari

celebensis Martens, 1897) yang diambil

satu organisme ke organisme yang lain).

dari Sungai Pohara Kecamatan Sampara

Daerah conserve dan unik dapat digunakan

Kabupaten Konawe Provinsi Sulawesi

untuk pencirian organisme bersangkutan

Tenggara, buffer CTAB, primer, master

sehingga menjadi urutan tanda tangan

mix, agarose, PCI (Phenol-Chlorofom-

(signature sequence). Data basa penyandi

Isoamyl Alcohol), pasir kuarsa, ethidium

gen 18S rRNA memungkinkan untuk

bromide, TAE (Tris-acetic EDTA) 1X,

digunakan dalam mengkontruksi pohon

etanol 70 %, etanol absolut, aquadest,

filogenetik

RNAse, dan loading dye.

yang

menunjukkan

nenek

moyang dan kekerabatan suatu organisme (Suwanto,

2011).

Penelitian

secara

molekuler dapat menjadi pelengkap atau alternatif

untuk

mengidentifikasi


27


Prosedur Kerja

2 x volume etanol absolut lalu diinkubasi

Isolasi DNA

selama 2 jam. Setelah 2 jam suspensi

Ektraksi violacea

DNA

Pokea

celebensis

menggunakan

kemudian disentrifugasi kembali selama 20

Martens,1897)

menit pada 10.000 rpm suhu 40C sehingga

(Cetyl

pellet DNA diperoleh. Selanjutnya pellet

Trimetyl Ammonium Bromide) (Sambrook

DNA dicuci dengan 0,5 ml ethanol 70 %,

et al., 1989). Sebelum dilakukan ekstraksi,

lalu

terlebih dahulu buffer lisis disiapkan

dalam 20 μl H2O. Untuk menghilangkan

dengan kebutuhan sesuai jumlah sampel

RNA, larutan ditambahkan 100 μg/μl

yang

yang

RNAse, lalu diinkubasi pada suhu 370C

diambil dari kaki Pokea terlebih dahulu

selama 12 jam. Larutan DNA selanjutnya

ditimbang

disimpan pada suhu -40C.

akan

metode

(Batissa

CTAB

diekstraksi.

sebanyak

Sampel

0,1-0,2

gr

dan

dikeringkan

kemudian

dilarutkan

dipotong kecil-kecil, lalu digerus dengan bantuan pasir kuarsa. Sampel dimasukkan ke

dalam

eppendorff

1,5

ml

diinkubasi selama 30 menit dengan suhu 65oC dan dibolak-balik setiap 5 menit. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam es selama 5 menit lalu disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan lalu

dimasukkan

ke

dalam

eppendorff baru ukuran 1,5 ml dan ditambahkan 1 x volume PCI (PhenolChlorofom-Isoamyl

Alcohol)

yang

berfungsi memisahkan kontaminan seperti protein dan senyawa - senyawa organik

Selanjutnya suspensi disentrifugasi pada 10.000 rpm, suhu 40C selama 10 Supernatan

elektroforesis

diambil

ditambahkan dengan 0,1 volume sodium

spektofotometer,

alat spektrofotometer. Elektroforesis DNA hasil isolasi berfungsi untuk mengetahui apakah DNA utuh atau terdegradasi. Spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm berfungsi untuk mengetahui apakah DNA murni atau terkontaminasi. Panjang gelombang yang digunakan untuk mengetahui kandungan DNA/RNA menggunakan spektrofotometri UV adalah 260 nm, sedangkan untuk kandungan

protein

menggunakan spektrofotometri UV dengan panjang gelombang 280 nm. Kualitas

dan

dipindahkan dalam eppendorff 1,5 ml lalu

dan

sedangkan kuantitas DNA diukur dengan

mengetahui

dengan DNA.

menit.

Kualitas DNA dapat diukur dengan

dan

ditambahkan 600 μl buffer lisis. Sampel

diambil

Uji Kualitas dan Kuantitas DNA

DNA

ditetapkan

berdasarkan nilai rasio A260/A280 sekitar 1,8 - 2,0. Kuantitas DNA ditetapkan

asetat 3 M pH 5,2 kemudian ditambahkan Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014

28


berdasarkan asumsi bahwa 1 DO = 50

Reaksi Amplifikasi dan Elektroforesis

μg/ml DNA utas ganda dengan rumus:

dilakukan dalam bak berisi es. Sebanyak

[DNA] = A260 x 50 μg/ml x FP

1,5 μl

50 μg/ml FP

DNA contoh (konsentrasi 100

ng/μl), 1 μl primer forward (konsentrasi 10

Keterangan : A260

Persiapan PCR untuk amplifikasi

= Konsentrasi DNA = Absorbansi pada panjang gelombang 260 nm = Konstanta untuk DNA = Faktor pengenceran

μM), 1 μl primer reverse (konsentrasi 10 μM), 1,5 μl dH2O dan 5 μl master mix 2x yang terdiri dari H2O, 10 x Stoffel Buffer, dNTP, MgCl2, dan enzim Taq DNA Polymerase, dimasukkan dalam eppendorff

Desain Primer Primer spesifik yang digunakan

ukuran 0,5 ml. Campuran kemudian

dalam penelitian ini adalah bagian dari

divortex

dan

disentrifugasi,

urutan 18S rRNA beberapa Bivalvia,

dimasukkan ke dalam mesin PCR.

lalu

yakni: Anodonta cygnea (AM774476); Reaksi PCR dilakukan sebanyak 35

Psilunio littoralis (AF120536); Anodonta cardium

siklus yang terdiri dari 2 stage. Stage 1

complanata

dilakukan sebanyak 5 siklus yang terdiri

lamarckii

dari 3 step, yaitu: denaturasi selama 1

(AM774478). Urutan-urutan DNA tersebut

menit pada suhu 940C, annealing selama

diperoleh dari bank data gen (Genebank).

30 menit pada suhu 600C, dan extension

Selanjutnya

tersebut

selama 90 menit pada suhu 720C. Stage 2

menggunakan

dilakukan sebanyak 30 siklus yang terdiri

Program BioEdit versi 7.0.9. Daerah yang

dari 3 step, yaitu: denaturasi selama 1

terkonservasi merupakan daerah spesifik

menit pada suhu 940C, annealing selama

yang dimiliki oleh gen tersebut sehingga

30 menit pada suhu 550C, dan extension

dapat digunakan sebagai primer spesifik.

selama 90 menit pada suhu 720C.

sp.

(AY579090);

(AF120537); (AF117738);

disejajarkan

Lampsilis

Elliptio Neotrigonia

seluruh dengan

urutan

Hasil

Primer yang digunakan dalam penelitian

amplifikasi

selanjutnya

ini adalah primer Anodr-F (5’-GAC ACG

dielektroforesis dengan agarose 1 % (0,3 g

GGG AGG TAG TGA CG-3’) dan primer

agarose, 30 ml TAE 1x dan 7,5 μl etidium

Anodr-R (5’-CCA CCC ACC GAA TCA

bromida) pada voltase konstan 100 volt

AGA AA-3’). Perkiraan jumlah urutan

dan

fragmen gen 18S rRNA yang akan

divisualisasikan di atas UV transiluminator

terbentuk adalah 821 bp (base pair).

kemudian dilakukan pemotretan dengan

80

A

photoforesis. Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014

selama

30

menit

lalu

29


Pengurutan DNA

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pengurutan DNA hasil amplifikasi menggunakan alat DNA sequencer

Isolasi DNA Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897)

ABI Pada

Prism 377. Pengurutan dilakukan dengan

tahap

ini

sampel

yang

metode Sanger, menggunakan terminator

digunakan terdiri dari 4 ulangan. Setelah

dye berupa fluorescent dye rhodamin

diisolasi DNA kemudian dielektroforesis

(PRISM reaction dyedoaxy terminator

untuk mengetahui apakah isolasi berhasil

cycle

Setelah

atau tidak. Keberhasilan proses isolasi

mendapatkan hasil pengurutan, urutan

dilihat berdasarkan ada atau tidaknya pita

sequencing

kemudian

kit).

disejajarkan

dengan

DNA hasil elektroforesis. Elektroforesis juga berfungsi untuk mengetahui apakah

menggunakan program NCBI blast.

DNA hasil isolasi utuh atau terdegradasi. Analisis Data

Hasil elektroforesis memperlihatkan

Identifikasi

urutan

dilakukan

dengan

Analisis

kesejajaran

nukleotida

pita DNA utuh (Gambar 1) hanya pada

analisis.

ulangan 2 dan 4, sedangkan pada ulangan 1

beberapa lokal

(local

dan

3

tidak

terlihat.

DNA

utuh

alignment) hasil pengurutan DNA dengan

terkonsentrasi pada ujung sedikit di bawah

data yang ada di GeneBank dilakukan

sumur. Pemendekan yang ada di sepanjang

dengan program BLAST (Basic Local

sumur bagian tengah menunjukkan DNA

Alignment Search Tools) yang disediakan

yang mengalami degradasi. Degradasi

NCBI (National Center for Biotechnology

DNA dapat terjadi karena adanya DNA

Information)

yang terpotong-potong akibat pemipetan

melalui

http://www. al.,

sampel berulang-ulang atau penempatan

2010 ; Mursyidin et al., 2012). Data urutan

DNA dalam suhu kamar terlalu lama.

gen

dengan

DNA mengalami degradasi juga bisa

program Clustal X (Hidayat et al., 2008).

disebabkan oleh karena DNA mengalami

Konstruksi

pembekuan

ncbi.nlm.nih.gov/blast

18S

rRNA

pohon

(Muzuni

disejajarkan

filogenetik

et

dengan

berulang-kali,

pengenceran

metode neighbour-joining menggunakan

atau kontaminasi nuklease selama proses

program

ekstraksi DNA (Lester, 2011).

Phydit

(phylogenetik

tree)

(Sembiring et al., 2008). Analisis situs retriksi menggunakan program NEBcutter 2.0 (Muzuni et al., 2010).


30


DNA utuh

DNA terdegradasi

RNA terdegradasi

Gambar 1. Hasil elektroforesis DNA. 1, 2, 3 dan 4 menunjukkan 4 ulangan. RNA

terdegradasi

selanjutnya. Pengenceran DNA yaitu hasil

tampak pada bagian bawah sumur di setiap

ekstraksi DNA yang didapatkan dicampur

ulangan. Untuk menghilangkan RNA,

aquabides. Perbandingan antara DNA dan

sebelum pengukuran kualitas dan kuantitas

aquabides disesuaikan dengan besarnya

DNA

ditambahkan

pengenceran. Pengenceran dilakukan agar

RNAse sehingga dapat memberikan hasil

mendapatkan konsentrasi yang seragam

elektroforesis yang bersih dari RNA pada

untuk digunakan dalam analisis PCR.

proses

sampel

yang

telah

nomor

2

elektroforesis

selanjutnya.

Kuantitas DNA didasarkan pada

Penambahan RNAse hanya diberikan pada

nilai konsentrasi DNA, dimana konsentrasi

sampel nomor 2 karena hanya pada sampel

DNA

nomor 2 pita DNA utuh terlihat tebal dan

konsentrasi DNA (μg/ml) = Absorbansi

jelas.

(260)

didapatkan

dengan

rumus

x Faktor konversi DNA (50 μg/ml) x

Faktor pengenceran (pembacaan 1 pada Pengukuran Kualitas Dan Kuantitas DNA

260 nm setara dengan 50 μg/ml DNA untai ganda). Tingkat kemurnian DNA yang

Pengukuran kualitas dan kuantitas DNA

diperlukan

untuk

mengetahui

baik

untuk

digunakan

dalam

proses

amplifikasi dengan PCR, jika nilai rasio

kualitas DNA, sehingga dapat ditentukan

yang

pengenceran yang diperlukan untuk proses

(Suharsono, 2005 ; Sambrook et al., 1989)


didapatkan

adalah

1,8-2,0

31


Tabel 1. Hasil spektrofotometer pada sampel nomor 2 No

Perlakuan Sampel

1

Sampel Pokea

Absorbansi pada panjang gelombang () 260 280 0,274

Konsentrasi (μg /ml)

Kemurnian (260/280)

2740

1,9291

0,142

Hasil spektrofotometer pada Tabel

M

1

2

3

4

1 menunjukkan kualitas DNA adalah 1,9291, hal ini mengindikasikan DNA tergolong murni dan bisa digunakan pada 2000 pb

tahap selanjutnya yaitu amplifikasi DNA.

1000 pb

DNA adalah 2740 μg/ml,

1650 pb 850 pb

Konsentrasi

setelah perhitungan maka DNA diencerkan dengan konsentrasi

akhir 100 µg/ml

volume 20 μl, menggunakan 0,7299 μl dan aquabides

19,270

μl

untuk

proses

amplifikasi PCR. Nilai dari volume akhir pengenceran 20 µg/ml dipilih karena

Gambar 2. Hasil PCR. M = Marker 1 kb leader; 1, 2, 3 dan 4 menunjukkan 4 ulangan

dianggap jumlah yang sesuai agar DNA Pada tahap ini digunakan banyak

stok yang digunakan tidak terlalu banyak dan tidak terlalu sedikit sehingga dapat

ulangan dengan komposisi DNA yang berbeda-beda untuk mencari komposisi

menghemat stok DNA yang ada.

DNA

tepat

agar

proses

PCR

selanjutnya lebih maksimal. DNA dalam

Amplifikasi DNA Hasil PCR kemudian dielektroforesis untuk melihat pita DNA yang terbentuk. Pada tahap ini ada 4 ulangan dari 1 sampel yang sama (nomor 2) dengan komposisi DNA yang berbeda-beda. Ulangan 1 jumlah DNA yang digunakan

yang

sebanyak

proses PCR terdiri dari dua jenis yaitu: (1) DNA target yang akan diamplifikasi kembali, (2) DNA non target (Kennedy, 2011). Hasil visualisasi PCR menunjukkan tidak terbentuk pita DNA pada ulangan 2, sedangkan pada ulangan 1, 3 dan 4

0,5 μl, ulangan 2 jumlah DNA yang

terbentuk pita DNA yang mengindikasikan

sebanyak 1 μl, ulangan 3

komposisi PCR berhasil melipatgandakan

digunakan

jumlah DNA yang digunakan sebanyak 1,5

DNA. Ulangan 1 hanya menghasilkan

μl, dan ulangan 4 jumlah DNA yang

DNA target atau DNA yang diinginkan,

digunakan sebanyak 2 μl (Gambar 2).

sedangkan


pada

ulangan

3

dan

4

32


membentuk pita DNA non target dan DNA

forward dan ujung reverse menggunakan

target. Hal ini menunjukkan jumlah DNA

primer Anodr-F dan Anodr-R.

0,5

μl

komposisi

yang tepat

untuk

mendapatkan hasil PCR yang maksimal.

Primer

yang digunakan dalam penelitian ini sengaja dirancang agar berukuran kecil

DNA target berukuran sekitar 850

yaitu berukuran 20 nukleotida, karena

bp, hal ini sesuai dengan perkiraan jumlah

primer yang memiliki urutan yang pendek

yang akan dihasilkan oleh primer forward

lebih mudah diamplifikasi. Kespesifikan

dan primer reverse. Sedangkan DNA non

primer tidak akan meningkat jika panjang

target berukuran sekitar 12.000 bp yang

primer lebih dari 30 nukleotida. Primer

merupakan DNA genom. Komposisi DNA

yang tidak spesifik dapat menyebabkan

1,5 μl dan 2 μl merupakan komposisi yang

teramplifikasinya daerah lain dalam genom

menghasilkan DNA non target berupa

yang tidak dijadikan target atau sebaliknya

DNA genom, hal ini menunjukkan jumlah

tidak ada daerah pada genom yang

tersebut bukan komposisi yang tepat untuk

teramplifikasi.

mendapatkan hasil PCR yang maksimal

Hasil pengurutan fragmen gen 18S

untuk Pokea (Batissa violacea celebensis

rRNA menggunakan mesin sequencer

Martens, 1897).

berupa dendogram yang memperlihatkan

Banyaknya

DNA

yang

grafik nukleotida. Nukleotida diwakili

digunakan akan menentukan hasil akhir

warna yang berbeda-beda. Nukleotida G

dari proses amplifikasi. Jika DNA target

diwakili oleh warna hitam, nukleotida C

yang digunakan terlalu sedikit maka DNA

diwakili oleh warna biru, nukleotida T

yang

bahkan

diwakili oleh warna merah dan nukleotida

teramplifikasi,

A diwakili oleh warna hijau. Setelah diolah

dihasilkan

kemungkinan

tidak

target

sedikit

sedangkan apabila terlalu banyak DNA

menggunakan

program

Bioedit

dapat

target maka akan diperoleh lebih banyak

diketahui bahwa urutan gen 18S rRNA

DNA yang tidak diinginkan (Yuwono,

yang diurutkan dari arah forward memiliki

2006; Kennedy, 2011).

688 nukleotida sedangkan

dari arah

reverse memiliki 677 nukleotida (data Pengurutan Fragmen DNA

tidak ditunjukkan).

Pengurutan fragmen gen 18S rRNA dilakukan dari dua arah, arah ujung



33

Gambar 3. Urutan gen 18S rRNA parsial Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897). Urutan fragmen gen 18S rRNA dari Pokea

secara

masih harus diolah kembali menggunakan

BLAST

analisis contig menggunakan program

Analisis

Bioedit untuk mengetahui urutan DNA

penyejajaran (alignment) dengan database

yang terbaca dari dua arah (forward dan

urutan gen 18S rRNA yang terdapat pada

reverse). Setelah diolah lebih lanjut,

GeneBank.

diketahui bahwa fragmen gen 18S rRNA

BLAST akan memproses penyejajaran

Pokea berukuran 827 bp (Gambar 3).

urutan gen 18S rRNA yang dimasukkan.

Sebagai pembanding, gen 18S rRNA full

Analisis dengan menggunakan program ini

length

bp

dilakukan untuk mengetahui kesesuaian

(Itskovich et al., 2007 ; Soltis et al., 2001).

antara urutan basa yang didapatkan dengan

Fragmen gen 18S rRNA Pokea

urutan yang terdapat dalam bank data gen.

berukuran

sekitar

1.800

dalam

online pada

menggunakan situs

yang

Secara

genebank dilakukan

otomatis

program NCBI. yakni

program

penelitian ini berada pada bagian tengah

Hasil blast menggunakan NCBI

gen 18S rRNA, yaitu daerah yang diapit

tidak ditemukan adanya urutan gen 18S

oleh primer Anodr-F dan Anodr-R yang

rRNA yang memiliki presentase identitas kemiripan hingga 100% dengan Pokea.

berukuran 827 bp.

Beberapa urutan gen 18S rRNA yang Analisis Filogenetik Berdasarkan Urutan Fragmen Gen 18S rRNA Urutan fragmen gen 18S rRNA Pokea Martens,

terdapat di NCBI mempunyai identitas kemiripan hanya berkisar 93% sampai dengan 99% (data tidak ditunjukkan). Hal

(Batissa

violacea

celebensis

ini menunjukkan bahwa belum tersedianya

1897)

selanjutnya

dianalisis

urutan fragmen gen 18S rRNA Pokea di


34


GeneBank. Persentase identitas kemiripan

neighbour-joining dengan 1000x replikasi.

teratas ditempati oleh Corbicula fluminea.

Berdasarkan Gambar 4, terlihat Pokea

Hal ini menandakan Urutan gen 18S rRNA

berada pada clade X dengan 4 spesies

Pokea apabila dilihat dari hasil blast

lainnya

memiliki hubungan kekerabatan dengan

Corbicula fluminea, Hemidonax pictus,

Corbicula fluminea.

Artica, dan Ruditapes variegatus. Clade ini

Pengolahan

data

otomatis menggunakan berkaitan

dengan

dilakukan

software yang

skala

0,1.

Diantaranya

mempunyai nilai kepercayaan 100 % yang menunjukkan

Clade

X

ini

adalah

pohon

kelompok yang stabil. Menurut Felsenstein

filogenetik. Pada penelitian ini digunakan

(1985) dalam Bahagiawati (2010) clade

3 program yaitu NCBI, Clustal X, Phydit

yang memiliki nilai bootstrap atau nilai

(Phylogenetik editor), dan TreeViewX.

kepercayaan

Metode

dikatakan sebagai clade yang benar-benar

yang

pembuatan

pada

digunakan

untuk

mengkontruksi pohon filogenetik adalah

95%

atau

lebih

dapat

stabil.

Gambar 4. Pohon filogeni yang menunjukkan hubungan kekerabatan antara Pokea (Batissa violacea celebensis martens,1897) dengan spesies Bivalvia atas dasar urutan gen 18S rRNA. Angka pada percabangan mengindikasikan nilai bootstrap (%) berdasarkan alogaritma neighbour-joining dengan 1000x replikasi. Skala mengindikasikan subtitusi 1 per 10 nukleotida pada urutan gen. Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014

35


Pokea terlihat memiliki hubungan kekerabatan

paling

bootstrap ini bisa meningkat apabila

dekat

dengan

Batissa violacea celebensis Martens, 1897

dengan

tingkat

dibandingkan dengan genus yang sama

kepercayaan 71 %. Hal ini menandakan

yaitu genus Batissa dari spesies lain. Pokea

clade Batissa violacea celebensis belum

dan

stabil

mengalami

morfologi

dan

perubahan dalam pengambilan sampel atau

hubungan

kekerabatan

replikasi menggunakan metode neighbour-

keduanya berada dalam famili yang sama

joining. Tingkat kepercayaan atau nilai

yaitu Corbicullidae namun berbeda genus.

Tabel

menggunakan software clustal X dan

Corbicula

fluminea

dan

2.

Spesies Batissa violacea celebencis (Bvc) Corbicula fluminea (Cf)

masih

bisa

Hubungan similaritas dan nukleotida difference dari clade Batissa violacea celebencis Bvc

Cf

A

Rv

6/827

7/827

dari

taksonomi

segi

memiliki

yang

dekat;

Urutan fragmen gen 18S rRNA

Hp

8/827

fluminea

Phydit (Phylogenetik editor).

Pokea setelah diamplifikasi berdasarkan primer

---

Corbicula

24/827

Anodr-F

dan

Anodr-R

serta

dikonstruksi pohon filogenetiknya dapat dijadikan pembeda dengan organisme yang

Artica (A) Ruditapes variegates (Rv) Hemidonax pictus (Hp)

99.27

---

9/827

10/827

28/827

99.15

98.91

---

3/827

23/827

18S

99.03

98.79

99.64

---

24/827

membandingkan Pokea dengan Bivalvia

97.1

96.61

97.22

97.1

---

lain atau Bivalvia lain. Urutan fragmen gen

lain

rRNA

sampai

dapat

digunakan

tingkat

genus,

untuk

untuk

mengetahui hubungan kekerabatan Pokea

antara

dengan organisme lain. Namun dalam

Batissa violacea celebensis dan Corbicula

penelitian ini hanya dibandingkan sampai

fluminea juga didukung dari hasil analisis

ke tingkat famili, hal ini disebabkan belum

similaritas.

tersedianya urutan gen 18S rRNA Pokea

Hubungan

kekerabatan

Diantara

kelima

spesies 3,

genus Batissa di dalam GeneBank. Hasil

menunjukkan urutan nukleotida gen 18S

analisis restriksi urutan fragmen gen 18S

rRNA

celebensis

rRNA Pokea menggunakan NEBcutter

Martens,1897 dan Corbicula fluminea

dapat dilihat pada Gambar 5. Berdasarkan

memiliki

hasil amplifikasi urutan fragmen gen 18S

Bivalvia

tersebut

Batissa

pada

violacea

kemiripan

Tabel

tertinggi

dengan

indeks similaritas sebesar 99.27 % dengan

rRNA

perbedaan 6 nukleotida dari 827 basa yang

berdasarkan primer Anodr-F dan Anodr-R,

diperbandingkan.

urutan gen ini dikenali oleh banyak enzim

Analisis

ini

Pokea

setelah

diamplifikasi

restriksi, diantaranya yang biasa digunakan Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014

36


di laboratorium adalah XhoI, PstI, BamHI,

berhasil diisolasi sehingga dapat digunakan

dan DraI. Enzim-enzim ini merupakan

sebagai pembeda dengan bivalvia lain pada

salah satu karakter yang dimiliki oleh

daerah yang setara.

fragmen gen 18S rRNA pokea yang

Gambar 5. Enzim restriksi umum pada fragmen gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) yaitu: XhoI, PstI, BamHI, dan DraI (kotak) dengan menggunakan program NEBcutter. Gen 18S rRNA berperanan dalam

sedangkan fragmen bivalvia lain yang

membedakan Pokea (Batissa violacea

digunakan sebagai pembanding adalah gen

celebensis Martens, 1897) dengan Bivalvia

18S rRNA bivalvia lain yang diperoleh

lain.

dari

Berdasarkan

hasil

penelitian

GeneBank

yang

sejajar

dengan

menunjukkan bahwa fragmen gen 18S

fragmen gen 18S rRNA pokea. Oleh

rRNA

untuk

karena fragmen gen 18S rRNA pokea

membedakan pokea dengan bivalvia lain

diperoleh dengan menggunakan metode

(Gambar

yang

PCR, maka dapat dijelaskan bahwa metode

digunakan sebagai acuan pembeda adalah

PCR dapat digunakan untuk memperoleh

fragmen gen 18S rRNA pokea yang

fragmen DNA yang dapat membedakan

dibatasi oleh primer Anodr-F dan Anodr-R,

satu organisme dengan organisme lain.

dapat

4

juga

dan

digunakan

5).

Fragmen



SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Simpulan

dalam

penelitian

ini

adalah sebagai berikut : 1. Karakteristik fragmen gen 18S rRNA Pokea adalah: memiliki ukuran 827 bp, termasuk dalam family Corbicullidae karena Pokea dan Corbicula fluminea mempunyai paling

hubungan

dekat

kekerabatan

dengan

tingkat

kepercayaan 71% dan perbedaan 6 nukleotida

dari

827

basa

diperbandingkan,

serta

mempunyai

situs

enzim

restriksi

XhoI,

yang

PstI,

BamHI, dan DraI. 2. Gen

18S

rRNA

berperan

dalam

membedakan spesies Pokea dengan Bivalvia spesies lain. Saran Saran dalam penelitian ini adalah dilakukan

penelitian

lanjutan

dengan

mengkarakterisasi gen 18S rRNA Pokea (Batissa 1897)

violacea hingga

celebensis ke

tingkat

Martens, spesies

menggunakan daerah ITS.

DAFTAR PUSTAKA Bahagiawati, Utami, W., D., dan Buchori, D. 2010. Pengelompokkan dan Struktur Populasi Parasitoid Telur Trichogrammatoidea armigera pada Telur Helicoverpa armigera pada Jagung Berdasarkan Karakter Molekuler, J. Entomologi, 7(1):5465.

37

Bahtiar. 2005. Keberadaan Populasi Pokea (Batissa Violacea Celebensis Martens, 1897) pada Berbagai Daerah yang Berbeda pada Sungai Pohara Kecamatan Sampara Kabupaten Konawe. Tesis Sekolah Pasca Sarjana, IPB, Bogor. Hidayat, T., Kusumawaty, D., Yati, D., D., Muchtar, A., dan Mariana, D. 2008. Analisis Filogenetik Molekuler pada Phyllanthus niruri L. (Euphorbiaceae) menggunakan Urutan Basa DNA Internal Transcribed Spacer (ITS). Jurusan Biologi Fakultas Matemateka dan Ilmu Pengetahuan Alam, Bandung. Itskovich, V., Belikov, S., Efremova, S., Masuda, Y., Perez, T., Alivon, E., Borchiellini, C., and Boury, N. 2007. Phylogenetic Relationship Between Freshwater and marine Haplosclerida (Porifera, Demospongiae) based on the Full Length 18S rRNA and Partial COXI Gene Sequences, Porifera Researches Biodeversity, Rusia. Kennedy, N. 2011. PCR Troubleshooting and Optimization. Caister Academic Press, USA. Lester, J. 2011. Troubleshooting Poor Quality Template, http://www.bio.cam.ac.uk /pflgroup/DNA_Facility/Quality.ht ml, Diakses pada tanggal 01 Juni 2012. Mursyidin, D., H. 2012. Kekerabatan Filogenetik 15 Jenis Durian (Duri spp.) Berdasarkan Analisis Bioinformatik Gen 5.8S rRNA dan ITS Region. BIOSCIENTIAE, 9(1):45-54. Muzuni, Soepandi, D., Suharsono, U. W., Suharsono. 2010. Isolasi dan Pengklonan Fragmen cDNA Gen Penyandi H+-ATPase Membran Plasma dari Melastoma malabathricum L. J. Agron. Indonesia, 38(1): 67-74. Nadia, L. A. R. 2011. Kumpulan Jurnal Internasional : Bivalvia,



Gastropoda, dan Echinodermata. Program Pasca Sarjana, Universitas Gajah Mada, Yogyakarta. Nafsal, A. 2008. Distribusi dan Kepadatan Kerang Pokea (Batissa Violacea Celebensis Martens, 1897) Secara Spasial dan Temporal di Perairan Sungai Pohara Sulawesi Tenggara. Skripsi, Universitas Halu Oleo, Kendari. Renel, K. 2001. Studi Kepadatan dan Distribusi Kerang Pokea (Curbicula spp) pada Desa Andadowi Kecamatan Bondoala. Skripsi, Universitas Halu Oleo, Kendari. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY.

38

Sembiring, L., Susilawati, L., dan Suhartanti, D. 2008. Seleksi, Karakterisasi, dan Identifikasi Bakteri Pendegradasi 2(thiocyanomethylthio) benzothiazole (TCMTB). Biota, 13(3): 126-131. Soltis, E., D., Soltis, S., P., Doyle, J., J. 2001 Molecular Systematics of Plants II; DNA Sequencing. Kluwer Academic Publisher, New York. Suharsono, S. 2005. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen dan Pengurutan DNA. Pusat Antar Universitas Bioteknologi IPB, Bogor. Suwanto, A. 2011. Keanekaragaman Hayati Mikroorganisme. Jurusan Biologi FMIPA IPB, Bogor. Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction, ANDI OFFSET, Yogyakarta.


KARAKTERISASI FRAGMEN GEN 18S rrna POKEA (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) DI SUNGAI POHARA KECAMATAN SAMPARA KABUPATEN KONAWE

Recommend Documents