AMPLIFIKASI GEN 18S rRNA PADA DNA METAGENOMIK MADU DARI DESA SERAYA TENGAH, KARANGASEM DENGAN TEKNIK PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
SKRIPSI
Oleh: SATRIYA PUTRA PRAKOSO NIM. 1208105013
JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA BUKIT JIMBARAN 2016
ABSTRAK Telah dilakukan desain primer secara in silico menggunakan program Clone Manager Suite 6 (University of Groningen) dan amplifikasi gen 18S rRNA pada DNA metagenomik madu yang berasal dari Desa Seraya Tengah, Kabupaten Karangasem dengan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Pemilihan gen 18S rRNA dalam tahap PCR disebabkan perannya sebagai marka (marker) dalam penentuan filogeni suatu spesies acak (random target) dalam suatu biodiversitas. Desain primer dilakukan menggunakan partial sekuen gen 18S rRNA yang diperoleh dari situs www.ncbi.nlm.nih.gov (GenBank Accession number: AY012393.1; AB126807.1; AJ307465.1; AY703484.1; U89834.1; AY169434.1). Hasil desain diperoleh sepasang primer terbaik dan diuji secara in vitro menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer tersebut meliputi primer forward dengan sekuen 5’CTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’ dan primer reverse dengan sekuen 5’TTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCA-3’ dengan ukuran produk sekitar 113 pb. Kondisi optimum untuk amplifikasi diperoleh sebagai berikut: denaturasi awal pada 95°C selama 3 menit, dilanjutkan dengan 30 siklus amplifikasi (denaturasi pada suhu 95°C selama 1 menit, annealing pada 55°C selama 1 menit dan elongasi pada 72°C selama 2 menit), dan diakhiri dengan extension pada 72°C selama 5 menit. Penelitian ini berguna dalam pengembangan penerapan analisis DNA metagenomik madu dengan teknik PCR yang dapat digunakan untuk penelitian lebih lanjut, salah satunya sebagai database awal untuk menentukan karakteristik madu berdasarkan gen 18S rRNA sel eukariot DNA metagenomik madu. Kata kunci: DNA metagenomik madu, Polymerase Chain Reaction,gen 18S rRNA, desain primer
iv
ABSTRACT The research about in silico designing best pair primer using Clone Manager Suite 6 software (University of Groningen) and amplification of 18S rRNA gene from honey’s metagenomic DNA using Polymerase Chain Reaction (PCR) method has been done. Honey sample is collected from Seraya Tengah village, Karangasem regency. The 18S rRNA gene chosen in PCR method because of its function as a marker of phylogeny in determination of random target in biodiversity. The primer was designed using partial sequences of 18S rRNA obtained from www.ncbi.nlm.nih.gov (GenBank Accession number: AY012393.1; AB126807.1; AJ307465.1; AY703484.1; U89834.1; AY169434.1). The best results of primer design was continued to in vitro test using PCR method. The forward and reverse primer sequences 5’CTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’ and 5’TTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCA-3’, produced 113 bp. The optimum conditions for amplification process was obtained as follows: pre denaturation at 95oC for 3 minutes and continued with 30 of amplification cycle (denaturation at 95°C for 1 minutes, annealing at 55°C for 1 minutes and elongation at 72°C for 1 minutes) and the last step continued with extension process at 72°C for 2 minutes. The result of this study hopefully can be applied in the future reseacrh to develop the database to identify honey characteristics from it’s 18S rRNA gene.
Keyword: Honey’s metagenomic DNA, PCR, 18S rRNA gene, primer design
v
KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Allah SWT, Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan karunia-Nya sehingga skripsi dengan judul “Amplifikasi Gen 18S rRNA Pada DNA Metagenomik Madu dari Desa Seraya Tengah, Karangasem dengan Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction)” dapat terselesaikan tepat waktu. Dalam penyusunan skripsi ini, penulis mendapatkan banyak bantuan, semangat, dan dorongan positif dari semua pihak baik secara langsung maupun tidak langsung. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Bapak Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si. selaku dosen Pembimbing I dan Ketua Jurusan Kimia yang senantiasa meluangkan waktu untuk memberikan bimbingan, saran, dan motivasi secara moral untuk menyeleseaikan skripsi ini. 2. Bapak Drs. I Wayan Suarsa, M.Si. selaku Pembimbing Akademik sekaligus menjadi Pembimbing II yang senantiasa memberikan bimbingan serta saran dalam menyempurnakan penyusunan skripsi ini. 3. Orang tua penulis Bapak Suratman dan Ibu Ni Nyoman Suriati yang selalu mendukung dan mendoakan penulis, kakak tercinta Satriya Wibawa Rachman dan Hanifatun Saidah yang terus memberi semangat dan dukungan, keponakan tercinta Syahnaz Farihatul yang selalu membuat penulis semangat dan termotivasi, serta semua pihak yang telah memberikan semangat terutama Ni Kadek Enna Katalina atas motivasinya yang selalu mengingatkan, senantiasa mendampingi, dan tempat bercerita hingga skripsi ini dapat terselesaikan. 4. Sahabat penulis kak Mahendra yang senantiasa bersedia untuk meluangkan waktu dan menyumbangkan kritik serta masukan-masukan positif untuk skripsi ini. Sahabat satu perjuangan Krishna, Putra, Ita, Yuli, Arie Kusuma, Febri, Olivia, Widya Chibi, Mery, Eka Anggara, Yunita, Dahliani, dan teman-teman angkatan 2012 yang selalu membantu dan memberi semangat. 5. Terakhir penulis mengucapkan terimakasih kepada beasiswa Bidikmisi yang telah membiayai pendidikan dan kehidupan penulis selama menempuh di perguruan tinggi. Penulis menyadari dalam penulisan skripsi ini jauh dari sempurna, sehingga kritik dan saran konstruktif dari semua pihak sangat diharapkan untuk evaluasi dan penyempurnaan ke depan. Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pembaca dan pihak yang membutuhkan. Bukit Jimbaran, 20 Juni 2016
Penulis
vi
DAFTAR ISI Halaman LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................... n ii TEAM PENGUJI SIDANG SKRIPSI ................................................................... iii ABSTRAK ............................................................................................................. iv ABSTRACT ........................................................................................................... v KATA PENGANTAR ........................................................................................... vi DAFTAR ISI .......................................................................................................... vii DAFTAR TABEL .................................................................................................. ix DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. x DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... xi BAB I PENDAHULUAN ..................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang Penelitian .................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah ................................................................................ 4 1.3 Tujuan Penelitian.................................................................................. 4 1.4 Manfaat Penelitian................................................................................ 5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA.......................................................................... 6 2.1 Madu..................................................................................................... 6 2.2 Metagenomik ........................................................................................ 7 2.3 Metagenomik Madu ............................................................................. 8 2.4 Isolasi DNA Metagenomik................................................................... 9 2.5 Polymerase Chain Reaction (PCR) ...................................................... 12 2.5.1 Prinsip PCR ................................................................................ 12 2.5.2 Pelaksanaan PCR........................................................................ 14 2.6 Elektroforesis Gel Agarosa .................................................................. 18 BAB III METODOLOGI PENELITIAN .......................................................... 20 3.1 Rancangan Penelitian .......................................................................... 20 3.2 Waktu dan Lokasi Penelitian................................................................ 21 3.3 Bahan dan Peralatan Penelitian ............................................................ 21 3.3.1 Bahan penelitian ......................................................................... 21 3.3.2 Bahan kimia................................................................................ 21 3.3.3 Alat penelitian ............................................................................ 21 3.4 Metode Penelitian ................................................................................. 22 3.4.1 Desain dan pemilihan primer ..................................................... 22 vii
3.4.2. Pengambilan sampel madu ........................................................ 22 3.4.3 Isolasi DNA metagenomik ......................................................... 23 3.4.3.1 Isolasi DNA metagenomik dengan lisis sel secara langsung ......................................................................... 23 3.4.3.2 Isolasi DNA metagenomik dengan PowerSoil Isolation Kit dari MO BIO Laboratories, Inc ................ 24 3.4.3.3 Isolasi DNA metagenomik menggunakan metode Kit dengan preparasi sampel .......................................... 25 3.4.4 Amplifikasi DNA hasil isolasi ................................................... 27 3.4.5 Analisis DNA total dengan elektroforesis gel agarosa............... 28 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 29 4.1 Hasil Desain dan Pemilihan Primer .................................................... 29 4.2 Hasil Pengambilan Sampel Madu ....................................................... 35 4.3 Hasil Isolasi DNA Metagenomik Madu .............................................. 36 4.4 Hasil PCR DNA Metagenomik Madu ................................................. 38 4.4.1 Amplifikasi isolat DNA metagenomik hasil lisis sel secara langsung .......................................................................... 39 4.4.2 Amplifikasi isolat DNA metagenomik hasil Kit ........................ 40 BAB V SIMPULAN DAN SARAN ..................................................................... 43 5.1 Simpulan.............................................................................................. 43 5.2 Saran .................................................................................................... 43 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 44 LAMPIRAN .......................................................................................................... 47 CURICULLUM VITAE ...................................................................................... 65
viii
DAFTAR TABEL Halaman n Tabel 2.1 Kelebihan dan Kekurangan dari Metode Lisis Sel Secara Langsung dan Tidak Langsung .................................................................................. 10 Tabel 4.1 Hasil Desain Primer Forward dan Reverse dengan Program Clone Manager Suite 6 untuk Amplifikasi Gen 18S rRNA ............................... 30 Tabel 4.2 Hasil Analisis Primer Forward dan Reverse dengan Program Clone Manager Suite 6 ........................................................................................ 31 Tabel 4.3 Hasil PCR In Silico dengan Program Clone Manager Suite 6 ..................... 35 Tabel 4.4 Kondisi PCR untuk Amplifikasi Gen 18S rRNA DNA Metagenomik ....... 39
ix
DAFTAR GAMBAR Halaman n Gambar 2.1 Bagan Proses Polymerase Chain Reaction (PCR) ................................... 13 Gambar 3.1 Skema Rancangan Penelitian ................................................................... 20 Gambar 4.1 Pengambilan Sampel Madu ...................................................................... 36 Gambar 4.2 Hasil Isolasi DNA Metagenomik Madu ................................................... 38 Gambar 4.3 Hasil Amplifikasi DNA Metagenomik Madu Lisis Sel Secara Langsung ................................................................................................. 39 Gambar 4.4 Hasil Amplifikasi DNA Metagenomik Madu Isolat Kit .......................... 40 Gambar 4.5 Hasil Amplifikasi DNA Metagenomik Madu Isolat Kit Dengan Preparasi Sampel..................................................................................... 41
x
DAFTAR LAMPIRAN Halaman n Lampiran 1. Partial Sekuen Gen 18S rRNA ................................................................ 47 Lampiran 2. Desain Primer Dengan Program Clone Manager Suite 6 ........................ 51 Lampiran 3. Skema Kerja Isolasi DNA Metagenomik Dengan Lisis Sel Secara Langsung ..................................................................................... 54 Lampiran 4. Skema Kerja Metode Isolasi DNA Metagenomik Dengan PowerSoil DNA Isolation Kit Dari MO BIO Laboratories, Inc. ............. 56 Lampiran 5. Skema Kerja Isolasi DNA Metagenomik Menggunakan Metode Kit Dengan Preparasi Sampel ................................................................. 58 Lampiran 6. Deteksi Hasil Isolasi DNA Total Dengan Elektroforesis Gel Agarosa ................................................................................................... 59 Lampiran 7. Pembuatan Larutan .................................................................................. 60 1. Pembuatan 100 mL Larutan Alkohol 70% Dari Alkohol 95% ............... 60 2. Pembuatan Larutan Natrium Asetat 3 M Sebanyak 100 mL ................... 60 3. Pembuatan Gel Agarosa .......................................................................... 60 4. Pembuatan 1 L Buffer TE pH 8 .............................................................. 61 5. Pembuatan Larutan Natrium Klorida 0,1M Sebanyak 100 mL ............... 62 6. Pembuatan 50 mL Buffer TEN ................................................................ 63 7. Pembuatan 100 mL Buffer TENS (Kuske et al., 1997)........................... 64
xi
