Prosiding Skripsi Semester Genap 2009/2010
SK - 08
KARAKTERISASI EKSTRAK KASAR ENZIM INVERTASE YANG DIAMOBILISASI DENGAN NA-ALGINAT Elok Nur Isro’ul Hasanah*, Surya Rosa Putra1 Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember ABSTRAK Invertase merupakan katalis pada hidrolisis sukrosa menghasilkan glukosa dan fruktosa (gula invert). Pada penelitian ini dilakukan amobilisasi enzim invertase dengan agen pengamobil Ca-alginat. Proses ini menggunakan metode penjebakan enzim (entrapment) pada kondisi optimum enzim invertase amobil. Hasil amobilisasi enzim invertase dapat meningkatkan stabilitas enzim dengan penurunan aktivitas enzim. Hasil optimum karakterisasi enzim invertase amobil diperoleh pada kadar Na-alginat 5 gr, konsentrasi substrat (sukrosa) 0,25 M, pH 4,5, suhu 30oC, dan waktu inkubasi 60 menit. Pengukuran aktifitas enzim invertase dilakukan dengan metode spektrofotometri menggunakan reagen Nelson-Somogyi. Dari hasil pengukuran diperoleh aktifitas enzim invertase amobil sebesar 37,52 μmol/ml.menit dengan enzim invertase yang terjebak dalam matriks Ca-alginat sebesar 94,85%. Nilai konstanta Michaelis, KM diperoleh sebesar 0,0881 dengan Vm sebesar 0,0158 μmol/ml.menit. Amobilisasi dapat meningkatkan stabilitas pengulangan dan penyimpanan pada ekstrak kasar enzim invertase. Stabilitas enzim invertase amobil terhadap pengaruh pengulangan mengalami penurunan aktifitas sebesar 15% setelah pengulangan ke-5. Sedangkan, stabilitas enzim invertase terhadap pengaruh penyimpanan pada suhu 4oC dalam larutan buffer sitrat 0,2 M (pH 4,5), mengalami penurunan aktifitas sebesar 40,8% setelah hari ke-10 penyimpanan. Kata kunci : Saccharomyces ceriviseae, ekstrak kasar invertase, ammobilisasi enzim, entrapment.
ABSTRACT Invertase is a catalyst for sucrose hydrolysis that producing glucose and sucrose (invert sugar). Immobilization of invertase enzyme by alginate as immobile agent was performed in this research. This process used entrapment method in optimum condition of crude invertase. The immobilization result of crude invertase increases the stability by decreasing its activity. The optimum characterization of immobilized crude invertase results were found at 5 gr of Na-alginate amount, 0,25 M of substrat concentration, 4,5 of pH, 30oC of temperature, and 60 minutes of incubation time. The activity of immobilized crude invertase was measured by spectrofotometric method using Nelson-Somogyi reagent. The measuring result was 37,52 μmol/ml.minute with the 94,83% trapped crude invertase on Ca-alginate matrix. The value of Michaelis constant (KM) was found about 0,0881 μmol/ml with 0,0158 μmol/ml.minute maximum rate (Vm). Immobilization improved the re-used and storage stability of crude invertase. Immobile crude invertase stability of the reuse effect was decreasing by 15% after the fifth repetition. Whereas, the stability towards saving effects at 4oC in citrate buffer 0,2M (pH 4,5) was decreasing by 40,8% at the 10th day of storage. Keyword : Saccharomyces ceriviseae, crude invertase, immobilization of enzym, entrapment. I.
PENDAHULUAN Invertase, dikenal sebagai βfructofuranoside fructohydrolase (EC 3.2.1.26) merupakan sebuah katalis untuk hidrolisis sukrosa yang menghasilkan fruktosa dan glukosa (gula * Corresponding author Phone : 085732778776 e-mail:
[email protected] 1 Alamat sekarang : Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Institut Teknologi 10 Nopember, Surabaya.
Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
invert). Enzim invertase banyak ditemukan pada ragi roti yang mengandung khamir Saccharomyces ceriviseae. Kemampuan enzim dalam mengkatalisis reaksi kimia dipengaruhi oleh kondisi lingkungan yang meliputi pH, temperatur, waktu inkubasi, dan konsentrasi substrat. Enzim invertase yang dihasilkan oleh Saccharomycees ceriviceae
mempunyai aktivitas paling tinggi pada pH 4,5 dan temperatur 30oC (Reis et al., 2003). Sedangkan pemanfaatan enzim invertase banyak dilakukan dalam industri makanan dan minuman khususnya pada pengolahan selai, permen, produk gula-gula, dan produksi asam laktat dari fermentasi sirup tebu. Invertase juga digunakan untuk memproduksi etanol dari sukrosa sebagai sumber karbon (Lee Huang, 2000). Secara umum enzim larut dalam air, sehingga banyak enzim tidak ekonomis untuk digunakan pada pengoperasian tipe batch dalam skala besar di industri, karena hanya dapat digunakan satu kali proses dengan biaya yang cukup mahal. Tetapi dalam tahun-tahun belakangan ini berbagai teknik telah ditemukan untuk memperbaiki kerja enzim, yaitu dengan cara mengikatkan enzim pada bahan-bahan yang tidak larut dalam air, dimana bahan-bahan tersebut dapat dipisahkan dari produk dengan mudah. Hal itu memungkinkan penggunaan kembali bahan-bahan tak larut yang mengandung enzim tersebut. Teknik ini disebut dengan amobilisasi enzim (Acosta et al., 2000). Teknik amobilisasi pada enzim merupakan suatu teknik yang dapat meningkatkan kemampuan hidup enzim sehingga dapat digunakan kembali. Teknik tersebut merupakan metode terbaik untuk mengurangi pengeluaran biaya dalam proses enzimatik secara kontinu khususnya dalam industri makanan dan minuman. Enzim amobil mempunyai banyak manfaat karena : a. bisa digunakan kembali beberapa kali dan tetap aktif, b. ammobilisasi menjaga aktivitas enzim dari kondisi yang tidak diinginkan, c. pemisahan dan pembentukan kembali enzim mudah dilakukan karena enzim terpisah dari substratnya d. aplikasi dari enzim amobil dapat menurunkan biaya operasi (Bayramolu et al., 2003). Metode amobilisasi yang digunakan pada penelitian ini adalah entrapment (penjebakan enzim dalam suatu matriks). Sedangkan agen pengamobil yang digunakan adalah alginat dikarenakan tidak beracun, mekanisme kestabilannya tinggi, porositasnya tinggi, memerlukan prosedur yang sederhana untuk ammobilisasi, dan harganya murah (Bucke, 1987). II. BAHAN DAN METODE 2.1 Bahan Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah ragi roti, NaHCO3 0,1 M, sukrosa 0,25 M, gula invert 0,0025 M, reagen Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
Somogy-Nelson, Arsenomolibdat, buffer sitrat 0,2 M (pH 4,5), alginat, CaCl2 0,25 M, reagen Bradfod, BSA, dan aquadest. 2.2 Isolasi Ekstrak Kasar Enzim Invertase Ragi roti ditimbang sebanyak 55 gram kemudian ditambah larutan NaHCO3 0,1 M sebanyak 150 ml dan diaduk. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam tabung homogenizer kemudian diletakkan pada alat homogenizer. Pencampuran dilakukan dengan kecepatan 7000 rpm selama 5 menit. Hasil campuran yang telah homogen dimasukkan ke dalam erlemeyer lalu ditutup dengan kapas yang dilapisi kasa dan alumunium foil serta diinkubasi pada suhu 40oC selama 24 jam. Campuran yang telah diinkubasi kemudian dilakukan pemecahan sel menggunakan alat ultrasonikator dengan kuat getaran sebesar 16 rms selama 20 menit. Kemudian disentrifuge dengan kecepatan putaran 3500 rpm, pada suhu 10oC selama 15 menit. Hasil yang diperoleh berupa filtrat (supernatan) dan residu. Filtrat dipisahkan dari residunya dengan cara didekantasi. 2.3 Pembuatan Kurva Standar Gula Invert Kurva standar gula invert dibuat dengan menggunakan larutan standar gula invert 0,0025 M. Variasi volume dilakukan sebanyak 4 ml; 5 ml; 6 ml; 7 ml; 8 ml; 9 ml; dan 10 ml kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Semua tabung dijadikan volumenya sebesar 10 ml dengan penambahan aquades. Larutan gula invert hasil pengenceran diambil masing-masing sebesar 0,5 ml. Selanjutnya, campuran Nelson A dan B sebanyak 0,5 ml ditambahkan dan dipanaskan selama 10 menit dalam air mendidih. Setelah campuran dingin kemudian larutan Arsenomolibdat dan aquades ditambahkan masing-masing sebesar 0,5 ml dan 3,5 ml. Pengukuran absorbansi dilakukan secara spektroskopi pada panjang gelombang (λ) 540 nm. Kurva standar gula invert dibuat antara hubungan konsentrasi gula invert (C) terhadap absorbansi (A). 2.4 Penentuan Kandungan Protein (Enzim) 2.4.1 Pembuatan Larutan Standar BSA BSA ditimbang sebanyak 100 gram lalu ditambahkan 25 ml aquades dan diaduk (bukan dikocok). Campuran tersebut diencerkan sampai volume 50 ml. Larutan hasil pengenceran ini digunakan pada penentuan panjang gelombang maksimum (λmaks) dan pembuatan kurva standar BSA.
2.4.2
Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λmaks) Larutan BSA 2000 ppm diambil sebanyak 5 ml dan ditambah reagen Bradfoard sebanyak 3 ml lalu diencerkan dengan aquades sampai volume sebesar 10 ml. Larutan hasil pengenceran kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu 30oC. Larutan standar BSA diukur absorbansinya secara spektroskopi pada panjang gelombang antara 560-620 nm dengan interval sebesar 5 nm, kemudian ditentukan λmaks. 2.4.3
Pembuatan Kurva Standar BSA Larutan BSA 2000 ppm diambil sebanyak 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml; 2 ml; 2,5 ml; 3 ml; dan 3,5 ml kemudian masing-masing tabung diencerkan sampai 10 ml dengan penambahan aquades. Masing-masing larutan hasil pengenceran diambil sebanyak 7 ml dan ditambah dengan 3 ml reagen Bradfoard. Campuran diinkubasi selama 5 menit pada suhu 30oC. Blanko yang digunakan adalah aquades sebanyak 7 ml yang ditambah dengan reagen Bradfoard sebanyak 3 ml. Pengukuran absorbansi dilakukan secara spektroskopi pada panjang gelombang 595 nm dan dibuat kurva antara konsentrasi larutan BSA (C) terhadap absorbansi (A). 2.4.4
Penentuan Kandungan Protein Enzim Invertase Ekstrak kasar enzim invertase diambil sebanyak 1 ml lalu diencerkan dengan penambahan aquades dalam labu ukur 10 ml. Enzim invertase hasil pengenceran diambil sebanyak 7 ml dan ditambah 3 ml reagen Bradfoard. Sebelum dilakukan pengukuran menggunakan spektrofotometer, larutan diinkubasi dahulu selama 5 menit. Setelah waktu inkubasi, absorbansi larutan enzim invertase diukur pada panjang gelombang 595 nm sebanyak dua kali (duplo) pengukuran. Data absorbansi yang diperoleh kemudian dikonversikan pada persamaan garis dari kurva standar BSA yang telah dibuat, sehingga dapat dihitung kandungan protein (mg) enzim invertase bebas. 2.5 Amobilisasi Enzim Invertase Na-alginat sebanyak 0,5 gram dilarutkan dalam 9 ml larutan buffer sitrat pH 4,5 dan diaduk. Selanjutnya gel diautoklaf pada suhu 121oC selama 5 menit lalu didinginkan. Ekstrak kasar enzim invertase sebanyak 1 ml ditambahkan ke dalam gel alginat kemudian diaduk sampai homogen. Gel alginat yang mengandung enzim invertase diteteskan ke dalam larutan CaCl2 0,25 M sebanyak 30 ml dengan menggunakan pipet tetes berdiameter 3-5 mm kemudian didiamkan selama 2 jam supaya mengeras. Larutan CaCl2 0,25 M disiapkan dengan cara CaCl2 sebanyak Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
2,7745 gram dilarutkan dengan menggunakan larutan buffer sitrat pH 4,5 sampai volume 100 ml. Sebelum digunakan, butiran Ca-alginat dicuci terlebih dahulu dengan menggunakan buffer sitrat pH 4,5 sebanyak 3x. Perlakuan yang sama dilakukan pada kadar Ca-alginat 6 dan 7 gr. 2.5.1
Penentuan Jumlah Enzim Yang Terjebak Dalam Matriks Ca-lginat Ca-alginat yang telah didiamkan selama 2 jam di dalam larutan CaCl2 0,25 M kemudian dipisahkan antara butiran Ca-alginat dan filtratnya. Filtrat tersebut digunakan untuk penentuan jumlah enzim yang terjebak di dalam matriks Ca-alginat, dimana penentuan jumlah enzim invertase yang tidak terjebak dalam matriks Ca-alginat sama seperti penentuan kandungan protein enzim invertase. Data absorbansi hasil pengukuran kemudian dikonversikan pada persamaan garis kurva standar BSA, sehingga diperoleh jumlah enzim yang tidak terjebak dalam matriks dan dapat dihitung jumlah enzim invertase yang terjebak dalam matriks Ca-alginat. Uji ini juga dilakukan kadar Ca-alginat 6 dan 7 gr. 2.6 Penentuan Aktifitas Enzim Invertase Amobil 2.6.1 Pengaruh Konsentrasi Substrat Pengaruh konsentrasi substrat (sukrosa) terhadap aktifitas enzim invertase amobil dilakukan dengan cara memasukkan butiran Caalginat yang mengandung enzim invertase ke dalam 8 buah erlenmeyer yang berisi larutan sukrosa (pH 4,5) sebanyak 25 ml yang telah divariasikan konsentrasinya sebesar 0 M; 0,0125 M; 0,05 M; 0,075 M; 0,125 M; 0,175 M; 0,20 M; dan 0,25M. Masing-masing erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil dan diinkubasi dengan cara dishaker pada kecepatan 60 rpm, selama 60 menit (30oC). Setelah diinkubasi, larutan sukrosa yang telah terdegradasi oleh Ca-alginat diambil dan dipanaskan selama 10 menit dalam air yang mendidih. Kemudian larutan diambil sebanyak 10 µl lalu diencerkan sebesar 1000 µl. Hasil pengenceran diambil sebesar 0,5 ml dan campuran Nelson A dan B ditambah sebanyak 0,5 ml. Kemudian dipanaskan selama 10 menit dalam air yang mendidih dan didinginkan. Selanjutnya, campuran tersebut ditambah dengan Arsenomolibdat dan aquades masing-masing sebanyak 0,5 ml dan 3,5 ml lalu dikocok. Masingmasing fraksi ditentukan konsentrasi gula invert, aktifitas enzim invertase amobil, dan laju pembentukan gula invert dengan cara diukur absorbansi secara spektroskopi pada panjang gelombang 540 nm. Nilai konstanta Michaelis (KM) dan Vm dihitung dengan menggunakan persamaan Lineweaver-Burk.
2.6.2
Pengaruh Pengulangan (Durability) Enzim invertase amobil (kadar Caalginat 5 gr) dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 25 ml sukrosa 0,25 M. Kemudian campuran diinkubasi dengan cara dishaker selama 60 menit, 60 rpm pada 30oC. Filtrat diuji aktifitas enzim invertase amobil pengaruh kadar substrat dan butiran Ca-alginat dilakukan pengulangan dengan perlakuan yang sama sebanyak 5 kali. Setiap kali pengulangan ditentukan aktifitas enzim invertase amobil. 2.6.3
Pengaruh Penyimpanan (Storage) Enzim invertase amobil (kadar Caalginat 5 gr) dimasukkan ke dalam erlenmeyer, lalu ditambah larutan buffer sitrat 0,02 M (pH 4,5) sebanyak 20 ml. Selanjutnya penyimpanan dilakukan selama 0 – 10 hari pada suhu 4oC dan diukur aktifitasnya enzim invertase amobil setiap 2 hari sekali. III. HASIL DAN DISKUSI 3.1 Isolasi Ekstrak Kasar Enzim Invertase Ragi roti digunakan sebagai sumber enzim invertase pada isolasi ekstrak kasar enzim invertase karena ragi banyak mengandung khamir Saccharomyces cereviseae. Isolasi diawali dengan mencampurkan ragi roti sebanyak 55 gram dan pelarut NaHCO3 sebanyak 150 ml lalu diaduk. Selanjutnya, campuran tersebut dihomogenasikan dengan menggunakan homogenizer supaya lebih merata. Campuran dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang diberi tutup kapas-kasa dan dilapisi dengan alumunium foil serta diberi lubang angin. Proses ini untuk meminimalkan kontak dengan udara luar sehingga diperoleh hasil inkubasi yang lebih sempurna. Inkubasi ragi dilakukan selama 24 jam dengan suhu inkubasi sebesar 40oC. Suhu diatur sebesar 40oC karena jika suhu terlalu panas maka mikroorganisme penghasil enzim invertase akan mati, sehingga enzim tidak akan diperoleh. Inkubasi dilakukan selama 24 jam agar proses inkubasi lebih optimal. Pemecahan sel dilakukan setelah proses inkubasi. Hal ini dikarenakan enzim invertase termasuk enzim yang berada di dalam sel (intraseluler), maka perlu dilakukan proses pemecahan dinding sel untuk mengeluarkan enzim di dalam sel supaya dihasilkan enzim yang lebih banyak. Proses pemecahan sel ini dilakukan dengan cara keras, yaitu menggunakan alat ultrasonikator dengan kuat getaran 16 rms selama 20 menit. Prinsip dari alat ultrasonikator adalah menggunakan getaran ultrasonifikasi untuk memecah sel. Selama proses ini, ragi hasil inkubasi harus diletakkan di dalam beker gelas yang berisi air dingin, hal ini dilakukan untuk menstabilkan suhu enzim invertase karena proses Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
pemecahan sel dengan metode ini dapat menghasilkan panas (kalor) sehingga dikhawatirkan akan merusak enzim. Selanjutnya, pemisahan enzim dilakukan dengan cara disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm pada suhu 10oC selama 15 menit. Hal ini berguna untuk memisahankan pecahan dindingdinding sel dari supernatannya. Prinsip dari metode sentrifuge ini, yaitu proses pemisahan ekstrak enzim yang didasarkan pada berat molekul dengan menggunakan gaya sentrifugal. Sehingga nantinya berat molekul yang ringan akan berada diatas dan yang berat berada dibawah (Koolman, 2000). Setelah disentrifuge, supernatan didekantasi dari residu/pecahan dinding-dinding sel, maka hasil yang diperoleh berupa ektrak kasar enzim invertase yang berwarna cokelat. Berdasarkan komposisi tersebut maka jumlah ekstrak kasar enzim invertase yang diperoleh sebanyak 55 ml. Ekstrak kasar enzim invertase hasil optimasi ditentukan kandungan proteinnya menggunakan metode Bradford, diukur aktifitas secara spektroskopi, dan dilakukan amobilisasi enzim menggunakan Ca-alginat dengan pengaruh konsentrasi substrat (sukrosa), pengulangan, dan penyimpanan. 3.2 Pembuatan Kurva Standar Gula Invert Gula invert 0,0025 M dengan beberapa variasi volume diambil lalu dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi dan ditambah aquades hingga volumenya menjadi 10 ml. Masing-masing konsentrasi larutan gula invert hasil pengenceran diambil sebanyak 0,5 ml dan campuran Nelson A dan B ditambahkan sebanyak 0,5 ml. Kemudian, campuran tersebut dipanaskan dalam air mendidih selama 10 menit untuk memperjelas warna yang terjadi. Setelah dipanaskan, campuran didinginkan dalam penangas yang berisi air dingin dengan hasil diperoleh berupa padatan berwarana biru sampai biru kehijauan. Semakin tinggi konsentrasi gula invert, maka warna hijau semakin dominan. Untuk melarutkan padatan tersebut maka larutan Arsenomolibdat ditambahkan sebanyak 0,5 ml pada masing-masing tabung dan dikocok. Warna larutan yang diperoleh, yaitu semakin tinggi konsentrasi gula invert maka warna larutan semakin biru pekat. Supaya campuran lebih encer dan bisa diukur absorbansinya, aquadest ditambahkan sebanyak 3,5 ml. Pengukuran absorbansi dilakukan secara spektroskopi pada panjang gelombang (λ) sebesar 540 nm. Kurva standar gula invert seperti pada gambar 2.1 dibuat dengan mengalurkan absorbansi (A) terhadap konsentrasi larutan gula invert (M). Nilai absorbansi mengalami kenaikan dengan semakin besarnya konsentrasi larutan gula
invert sehingga diperoleh persamaan garis antara konsentrasi dan absorbansi yaitu y = 977,231x. Persamaan tersebut akan digunakan untuk menghitung konsentrasi gula invert yang terbentuk.
Bradford sehingga menghasilkan larutan hijau kecoklatan.
Gambar 2.2 Kurva Absorbansi dan Variasi Panjang Gelombang Gambar 2.1 Kurva Standar Gula Invert Melewati Titik (0,0)
3.3 Penentuan Kandungan Protein (Enzim) 3.3.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan menggunakan larutan BSA stok 2000 ppm. Larutan diambil sebanyak 5 ml lalu ditambahkan dengan reagen Bradford sebanyak 3 ml dan diencerkan hingga 10 ml, sehingga dihasilkan larutan BSA stok 1000 ppm. Larutan BSA stok dibuat dari 100 mg BSA yang dilarutkan dalam aquades sebanyak 25 ml dan diaduk, kemudian diencerkan menjadi 50 ml. Larutan BSA stok 1000 ppm diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Proses inkubasi bertujuan untuk menyempurnakan reaksi antara reagen Bradford dan protein, dengan reaksi, sebagai berikut : H+ (H3PO4) Coomassine Blue + Protein Kompleks (warna biru) Kompleks yang terbentuk yaitu berwarna biru, dimana pada awalnya reagen Bradford berwarna hijau kecoklatan tetapi dengan adanya penambahan BSA, maka membentuk larutan berwarna biru. Suhu ruangan 30oC adalah suhu optimum terjadinya reaksi antara reagen Bradford dengan protein karena panas berlebih akan menyebabkan denaturasi protein. Larutan BSA yang telah diinkubasi dengan reagen Bradford dilakukan pengukuran absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 560620 nm. Hal ini didasarkan karena warna komplementer atau warna yang diserap oleh larutan adalah biru, dimana warna biru memiliki daerah panjang gelombang antara 580-595 nm (Khopkar, 1995). Larutan blanko yang digunakan adalah 7 ml aquades ditambah 3 ml reagen Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
Kurva pada Gambar 2.2 menunjukkan kenaikan absorbansi hingga mencapai puncak pada panjang gelombang 595 nm, kemudian turun seiring dengan bertambahnya panjang gelombang. Panjang gelombang yang diperoleh sama dengan yang dilakukan oleh A.A Bradford (1976), yaitu sebesar 595 nm. Absorbansi ini dihasilkan karena terjadi pengabsorbsian sinar tampak oleh kompleks Commassine Brilliant Blue-Kasein. Pada panjang gelombang maksimum diperoleh kepekaan analitis yang tinggi dan pengukuran sebanyak tiga kali akan memberikan kesalahan yang kecil. Panjang gelombang yang diperoleh akan digunakan pada pengukuran kandungan protein pada enzim invertase amobil. 3.3.2
Pembuatan Kurva Standar BSA Larutan BSA stok 2000 ppm diambil sebanyak 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml; 2 ml; 2,5 ml; 3 ml; dan 3,5 ml kemudian diencerkan sampai 10 ml dengan penambahan aquades. Masing-masing larutan hasil pengenceran diambil sebanyak 7 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Lalu, reagen Bradford ditambahkan sebanyak 3 ml dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 595 nm.
Gambar 2.3 Kurva Standar BSA Melewati Titik (0,0)
Kurva standar pada gambar 2.3 dibuat dengan mengalurkan absorbansi sebagai ordinat (sumbu-Y) dan konsentrasi larutan BSA sebagai absis (sumbu-X). Nilai absorbansi mengalami kenaikan dengan semakin bertambahnya konsentrasi larutan BSA sehingga diperoleh persamaan garis, yaitu y = 0,001339 x. dan faktor korelasi sebesar 0,998. Persamaan yang diperoleh digunakan untuk menentukan kandungan protein yang terjebak pada enzim invertase amobil. 3.4 Amobilisasi Enzim Invertase Alginat sebanyak 0,5 gr dilarutkan dalam 9,0 ml larutan buffer sitrat pH 4,5 kemudian diaduk sampai larut. Alginat digunakan untuk menjebak enzim karena kemampuannya untuk membentuk gel cukup besar sehingga enzim yang berukuran besar dapat terjebak di dalamnya. Selain itu, alginat dipilih sebagai agen pengamobil karena tidak beracun, harganya murah, mekanisme kestabilannya cukup tinggi, porositasnya tinggi, dan prosedur penggunaannya realtif sederhana (Bucke, 1987). Pelarutan alginat dilakukan dengan menggunakan larutan buffer sitrat pH 4,5 bertujuan untuk mengkondisikan keasaman di luar pengamobil (alginat) agar sama dengan keasaman di dalam pengamobil, sehingga pada saat dilakukan pendegradasian substrat diusahakan pada kondisi yang sama. Selanjutnya gel alginat diautoklaf pada suhu 121oC selama 5 menit, kemudian didinginkan. Pemanasan pada suhu 121oC dengan autoklaf dapat menyempurnakan kelarutan alginat dengan larutan buffer dan menyebabkan gel alginat menjadi lebih encer sehingga mudah untuk dipipet menghasilkan bentuk bulat beraturan. Penambahan ekstrak kasar enzim invertase sebanyak 1 ml dilakukan setelah alginat dingin agar tidak terjadi kerusakan pada enzim. Gel alginat yang mengandung ekstrak kasar enzim invertase diteteskan pada 30 ml larutan CaCl2 0,25 M dengan menggunakan pipet tetes berdiameter 3-5 mm kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu ruang supaya mengeras dan proses pembentukan Na-alginat menjadi Caalginat lebih sempurna. Hasil dari amobilisasi enzim invertase dalam gel Ca-alginat menunjukkan bahwa pada kadar Na-alginat 5 gr banyaknya enzim invertase yang terjebak sebesar 94,85% setelah dilakukan penentuan kandungan protein dengan metode Bradford (dengan kandungan protein enzim invertase bebas sebesar 10,87 mg). Hal ini menunjukkan bahwa enzim yang digunakan pada amobilisasi tidak secara sempurna terjebak di dalam matrik gel Ca-alginat. Beberapa molekul enzim invertase didistribusikan pada permukaan Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
butiran Ca-alginat yang terdifusi ke dalam larutan CaCl2 selama pembentukan butiran gel. Larutan CaCl2 berfungsi sebagai pembentuk Na-alginat menjadi Ca-alginat sehingga teksturnya berubah menjadi lebih keras dan tidak lunak seperti gel. Pembentukan Caalginat inilah yang dapat menjebak enzim invertase di dalam matriksnya. Reaksi pembentukan Ca-alginat adalah sebagai berikut:
Gambar 2.5 Reaksi Pembentukan Ca-alginat
Hasil amobilisasi pada penelitian ini tidak sesuai dengan hasil penelitian dari Vu, T. K. H dan Le, V. V. M (2008), dimana hasil amobilisasi alginat diperoleh antara 50% sampai 85%. Hal ini dikarenakan penggunaan konsentrasi alginat pada penelitian mereka hanya sebesar 2,5% (b/v). Penggunaan konsentrasi alginat yang semakin besar akan berpengaruh pada jumlah enzim yang akan terjebak. Semakin besar konsentrasi alginat maka akan diperoleh matriks yang semakin rapat sehingga kemungkinan kebocoran semakin kecil tetapi akan terjadi penurunan pada aktifitas enzim amobil yang akan dihasilkan. Amobilisasi enzim memiliki keuntungan yaitu enzim dapat digunakan berulang-ulang karena dalam bentuk tidak terlarut dengan substratnya, enzim juga tidak mengalami perubahan selama reaksi berlangsung, dan menjaga aktifitas enzim dari kondisi yang tidak diinginkan, misalnya pH terlalu basa atau terlalu asam, dan suhu yang terlalu tinggi (Bucke, 1987). Dengan cara amobilisasi ini, enzim dapat dengan mudah dipisahkan dari produk tanpa mengurangi aktivitas katalitiknya. Amobilisasi enzim ini dapat meningkatkan stabilitas enzim walaupun terjadi penurunan aktifitas. Penentuan aktifitas enzim invertase amobil dilakukan dengan pengaruh konsentrasi substrat (sukrosa), pengulangan, dan penyimpanan. 3.5
Penentuan Aktifitas Ekstrak Kasar Enzim Invertase Amobil 3.5.1 Pengaruh Konsentrasi Substrat (Sukrosa) Konsentrasi substrat merupakan faktor yang dapat mempengaruhi kerja enzim, dimana substrat akan membentuk kompleks dengan enzim sebelum melepaskan diri kembali dengan membentuk enzim dan produk. Untuk mengetahui besarnya pengaruh konsentrasi substrat maka
perlu dilakukan variasi konsentrasi substrat terhadap penambahan enzim yang sama, dimana variasi konsentrasi yang digunakan pada penelitian ini yaitu sebesar 0 M; 0,0125 M; 0,05 M; 0,075 M; 0,125 M; 0,2 M; 0,25 M. Faktor lain yang juga berpengaruh pada kerja enzim adalah konsentrasi matriks pengamobil (Ca-alginat), dimana matriks Ca-alginat membatasi kontak antara sisi aktif enzim dengan substrat sehingga dapat mempengaruhi jumlah kompleks enzimsubstrat [ES] yang terbentuk. Konsentrasi alginat juga mempengaruhi aktifitas enzim amobil bila dibandingkan dengan aktifitas enzim bebas. Variasi kadar alginat yang digunakan pada amobilisasi enzim invertase adalah sebesar 5, 6, dan 7 gr. Larutan sukrosa (pH 4,5) dengan variasi konsentrasi diambil sebanyak 25 ml dan ditambah dengan enzim invertase amobil dengan kadar Caalginat sebesar 5 gr. Kemudian, perlakuan yang sama juga dilakukan pada variasi konsentrasi Caalginat 6 dan 7 gr. Larutan tersebut diinkubasi pada suhu kamar selama 60 menit menggunakan shaker berkecepatan 60 rpm. Selanjutnya, filtrat dan butiran Ca-alginat dipisahkan lalu filtrat dipanaskan selama 10 menit dalam air mendidih untuk menghentikan kerja enzim, sehingga enzim tidak lagi menghidrolisis sukrosa. Kemudian penentuan aktifitas enzim invertase amobil dilakukan dengan pengaruh konsentrasi substrat (sukrosa). Penentuan aktifitas enzim invertase amobil pengaruh substrat dilakukan dengan cara sukrosa hasil inkubasi dengan enzim amobil diambil sebanyak 10 μl, lalu diencerkan menjadi 1000 μl. Hasil pengenceran tersebut diambil sebanyak 0,5 ml dan ditambahkan 0,5 ml campuran Nelson A dan B. Selanjutnya, campuran dipanaskan di dalam air mendidih selama 10 menit kemudian didinginkan dalam penangas yang berisi air dingin. Proses pemanasan dilakukan untuk mempertegas warna yang menunjukkan adanya gula invert. Hasil yang diperoleh berupa padatan berwarna antara biru sampai biru kehijauan. Adanya gula invert ditandai dengan semakin hijaunya warna padatan. Setelah dingin, padatan ditambah dengan 0,5 ml larutan arsenomolibdat, dimana larutan ini digunakan untuk melarutkan padatan. Supaya larutan tidak terlalu pekat sehingga bisa diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer maka ditambah 3,5 ml aquades lalu dikocok. Sampel akan berwarna antara biru sampai biru kehitaman, dimana semakin tinggi konsentrasi substrat, warna sampel akan semakin pekat karena jumlah gula invert yang dihasilkan semakin besar. Blanko yang digunakan berupa larutan selain substrat yang digunakan dengan komposisi dan perlakuan yang sama. Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
Larutan sampel dan blanko kemudian diukur absorbansi secara spektroskpi pada panjang gelombang 540 nm dan diperoleh aktifitas enzim invertase amobil yang dinyatakan dalam satuan Unit. Satu Unit aktifitas enzim merupakan banyaknya μmol gula pereduksi yang dihasilkan oleh 1 ml enzim dalam setiap menit (Bayramolu et al., 2003). Pengukuran aktivitas enzim dilakukan dengan mengkonversikan nilai absorbansi yang diperoleh ke dalam persamaan linier kurva standar gula invert dan dihitung aktifitas enzim invertase amobil. Berdasarkan kurva 2.6 dapat dilihat bahwa penggunaan konsentrasi alginat yang besar akan menghasilkan aktifitas enzim invertase amobil yang semakin kecil. Sedangkan pada konsentrasi alginat yang kecil akan menghasilkan aktifitas enzim invertase amobil yang semakin besar. Hal ini terjadi karena semakin besar konsentrasi alginat, maka semakin besar pula kerapatan matriks Ca-alginat saat menjebak enzim, sehingga kontak antara sisi aktif enzim yang teramobil dengan substrat semakin kecil. Sebaliknya, semakin besar kerapatan matriks Caalginat, maka semakin kecil pori-pori pada permukaan matriksnya, sehingga semakin terbatasnya kontak antara enzim di dalam matriks Ca-alginat dengan substrat.
Gambar 2.6 Kurva Hubungan Pengaruh Konsentrasi Substrat (Sukrosa) terhadap Aktifitas Enzim Invertase Amobil
Sedangkan untuk pengaruh konsentrasi substrat, juga bisa dilihat bahwa konsentrasi substrat sebanding dengan aktifitas enzim invertase amobil. Pada konsentrasi substrat rendah maka aktifitas enzim invertase amobil juga rendah, sehingga produk gula invert yang dihasilkan sedikit. Demikian juga dengan konsentrasi substrat yang semakin tinggi, maka sisi aktif enzim akan semakin banyak mengikat sustrat, sehingga produk gula invert yang dihasilkan semakin banyak. Aktifitas enzim invertase amobil diperoleh sebesar 37,52 μmol/ml.menit pada konsentrasi substrat 0,25 M dan kadar pengamobil 5 gr. Perhitungan aktifitas
enzim invertase amobil menggunakan persamaan, yaitu : x.V.fp Ae = p.q dimana : Ae = Aktifitas Enzim Invertase Amobil (μmol/ml.menit) x = Konsentrasi Gula Invert (μmol/ml) V = Volume Total Sampel (ml) p = Jumlah Enzim (ml) q = Waktu Inkubasi (menit) fp = Faktor Pengenceran (Lehninger, 1997).
Gambar 2.8 Kurva Hubungan antara 1/v dengan 1/[S] pada Enzim Invertase Amobil untuk Kadar Na-alginat 5 gr.
Harga Vm dan KM hasil penelitian berbeda dengan hasil penelitian dari Vu, T. K. H dan Le, V. V. M (2008) yang diperoleh sebesar 0,00597 M/menit dan 0,13919. Hal ini disebabkan oleh ada beberapa metode yang digunakan berbeda dan juga enzim yang digunakan berbeda kadar kemurniannya.
Jika dibuat hubungan antara laju (V) dengan konsentrasi substrat [S] sesuai gambar 2.7, maka penambahan konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi dikarenakan aktifitas enzim invertase semakin besar. Akan tetapi pada batas konsentrasi tertentu tidak akan terjadi kenaikan kecepatan reaksi walaupun konsentrasi substrat diperbesar dikarenakan enzim sudah jenuh dengan substratnya. Atau dengan kata lain tidak terdapat lagi sisi aktif enzim karena hampir semua enzim telah membentuk kompleks enzimsubstrat [ES]. Harga Vm dan KM dapat ditentukan dengan menggunakan persamaan LineweaverBurk (Lehninger, 1997), sebagai berikut : 1
1 =
Vo
+ Vm
KM Vm
3.5.2
1 . [S]
Gambar 2.7 Kurva Hubungan antara Laju (V) dengan Konsentrasi Substrat [S] pada Enzim Invertase Amobil
Berdasarkan kurva hubungan 1/V dengan 1/[S] untuk kadar alginat 5 gr pada gambar 2.8, maka diperoleh intersep sebesar 63,1873 dan slope sebesar 5,5681 sehingga diperoleh nilai Vm sebesar 0,0158 μmol/ml.menit dan KM sebesar 0,0881. Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
Pengaruh Pengulangan Seperti telah diungkapkan sebelumnya, bahwa keunggulan dari amobilisasi enzim salah satunya adalah enzim amobil dapat digunakan berulang kali karena dalam bentuk tidak terlarut dengan substratnya, tetapi tentu saja dengan aktifitas yang menurun. Hal ini sangat bermanfaat bagi penggunaan skala besar secara kontinu karena dapat menekan biaya produksi. Penurunan aktifitas disebabkan oleh faktor tidak kuatnya ikatan antara enzim dengan matrik Ca-alginat, sehingga setelah digunakan beberapa kali dimungkinkan terjadi pelepasan enzim atau terjadi kebocoran enzim invertase amobil. Kecilnya nilai aktifitas enzim invertase amobil juga bisa disebabkan karena pengaruh dari matriks Ca-alginat yang membatasi proses difusi/kontak substrat dengan enzim yang terjebak di dalam matriks Ca-alginat. Hal ini menyebabkan kontak antara enzim dengan substrat semakin sedikit sehingga kompleks enzim-substrat yang terbentuk juga sedikit. Lain halnya pada enzim invertase bebas yang tidak dibatasi oleh matriks Ca-alginat sehingga proses difusi/kontak antara enzim dengan substrat semakin besar sehingga kompleks enzim-substrat [ES] yang terbentuk semakin banyak. Berdasarkan penjelasan tersebut diketahui bahwa adanya amobilisasi enzim pada matriks Ca-alginat dapat menurunkan aktifitas enzim akibat pengaruh difusi.
buffer pH 4,5, yaitu sebesar 69 % dengan waktu penyimpanan selama 30 hari pada suhu 2-4oC. Perbedaan waktu penyimpanan yang menyebabkan adanya perbedaan hasil yang diperoleh.
Gambar 2.9 Kurva Aktifitas Enzim Invertase Amobil Pengaruh Pengulangan
Gambar 2.9 merupakan kurva aktifitas enzim invertase amobil pengaruh pengulangan dimana engulangan pemakaian enzim invertase amobil dilakukan sampai aktifitasnya menurun secara signifikan. Tetapi pada penelitian ini, aktifitas enzim invertase amobil pengaruh pengulangan hanya bisa diukur sampai pengulangan kelima dikarenakan pada pengulangan keenam sudah terjadi kebocoran enzim invertase amobil yang ditandai dengan pecahnya matriks Ca-alginat. Pada pengulangan kelima terjadi penurunan aktifitas sebesar 15% dari aktifitas pengulangan pertama, yaitu sebesar 1,305331 μmol/ml/menit. 3.5.3
Pengaruh Penyimpanan Enzim biasanya mengalami ketidakstabilan apabila disimpan di dalam larutan dengan aktifitas enzim akan hilang atau berkurang secara bertahap. Pengaruh penyimpanan dilakukan untuk mengetahui kemampuan enzim dalam mendegradasi substrat menghasilkan produk setelah dilakukan penyimpanan dalam larutan. Karena salah satu manfaat amobilisasi enzim, adalah dapat meningkatkan kestabilan enzim, menjaga enzim dari kondisi yang tidak diinginkan diluar enzim, dan menurunkan deaktivasi enzim karena amobilisasi dapat mempetahankan enzim pada posisi yang tetap. Pada gambar 2.10 menunjukkan perkembangan enzim invertase amobil selama dilakukan penyimpanan di dalam larutan buffer sitrat 0,2 M (pH 4,5) pada suhu 4oC. Penyimpanan dilakukan selama 10 hari dimana setiap 2 hari dilakukan pengukuran aktifitas enzim invertase amobil. Aktifitas enzim invertase pengaruh penyimpanan diperoleh setelah penyimpanan hari ke-10 aktifitas enzim invertase amobil mengalami penurunan sebesar 30,78% dari aktifitas mulamula sebelum penyimpanan (0 hari). Hal ini dapat disebabkan oleh adanya pelepasan enzim invertase selama masa penyimpanan dan adanya suhu yang tidak konstan selama penyimpanan. Pada penelitian yang dilakukan oleh Vu, T. K. H dan Le, V. V. M (2008) diperoleh hasil penurunan aktifitas pengaruh penyimpanan di dalam larutan Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
Gambar 2.10 Kurva Aktifitas Enzim Invertase Amobil Pengaruh Penyimpanan Di Dalam Buffer Sitrat 0,2M (pH 4,5) Selama 0-10 Hari
IV. KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, diperoleh kesimpulan bahwa aktifitas enzim invertase amobil dalam menghasilkan gula invert dipengaruhi oleh konsentrasi substrat (sukrosa), pengulangan, dan penyimpanan enzim invertase amobil di dalam larutan. Hasil optimasi enzim invertase amobil diperoleh pada kadar Caalginat 5 gr, konsentrasi substrat (sukrosa) 0,25 M, suhu 30oC, pH 4,5, dan waktu inkubasi 60 menit, dengan aktifitas enzim invertase adalah sebesar 37,52 μmol/ml/menit. Sedangkan harga Vm dam KM masing-masing diperoleh sebesar 0,0158 μmol/ml.menit dan 0,0881. Amobilisasi enzim dapat meningkatkan kestabilan enzim dengan adanya penurunan aktifitas, dimana stabilitas enzim invertase pengaruh pengulangan mengalami penurunan aktifitas sebesar 15% pada pengulangan kelima dan stabilitas enzim invertase amobil pengaruh penyimpanan mengalami penurunan aktifitas sebesar 40,78% setelah hari kesepuluh penyimpanan. V. UCAPAN TERIMA KASIH 1. Bapak Dr. Surya Rosa Putra, MS., selaku dosen pembimbing atas segala diskusi, bimbingan, arahan, dan semua ilmu yang bermanfaat. 2. Kedua orang tua dan saudara-saudara terbaik di dunia atas segala doa, dorongan materiil dan spiritualnya. 3. Kurniawan Panca Wardana, ALAN’Z club, Babe, Harsa, dan Dias atas semangat dan tukar pikirannya selama ini.
4. Teman-teman seperjuangan di Kimia ITS khususnya Angkatan 2005. 5. Teman-teman kost di Keputih 1D/4. DAFTAR PUSTAKA Acosta N, Beldarrain A, Alonso Y., (2000), Characterization of recombinant invertase expressed in methylotropic yeasts, Biotechnology and Applied Biochemistry, 32: 179-187 Acquaah, G., (2004), Understanding Biotechnology. Pearson Education Inc., New Jersey, 167-169 Bayramolu, G., Akgol, S., Bulut, A., Denizli, A. and Yakup, A.M. (2003), Covalent immobilization of invertase onto a reactive film composed of 2hydroxyethyl methacrylate and glycidyl methacrylate, Biochemical Engineering Journal, 14: 117-126 Bergamasco, R., Bassetti, F.J., Moraes, F.F. and Zanin, G.M., (2000), Characterization of free and immobilized invertase regarding activity and energy of activation, Brazilian Journal of Chemical Engineering, 17: 873-880 Bucke, C., (1987), Cell immobilization in calcium alginate, Methods in Enzymology, 135: 175-189 Chibata, I., (1979), Development of Enzyme Engineering Aplication of Immobilized Cell System, Kemi-kemi, Vol. 6, No. 12, 705-713 Gary, C. D., (1994), Analytical Chemistry, Edisi ke-5, John Wiley and Son, Inc., New York Girindra, Aisjah, 1990, Biokimia I, Edisi kedua, Gramedia, Jakarta, 232-235 Khopkar, S.M., (1995), Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta Koolman, J. dan Rohm, K., (2000), Atlas Berwarna & Teks Biokimia, Terjemahan Septelia, Penerbit Hipokrates, Jakarta, 564-576 Le, V.V.M. and Vu, T.K.H., (2008), Application of immobilized invertase in invert syrup processing from sucrose, Proceedings of the 8th Asean Food Conference, pp., Hanoi, 435-439 Lee WC, and Huang CT., (2000), Modelling of ethanol production using Zymomonas mobilis ATTC 10988 grown on the media containing glucose and fructose, Biochemical Engineering Journal, 4: 217-227 Lehninger, A.L., (1978), Biochemistry, Second edition, Worth Publishers, New York Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
Lorenz, C., Lorenz, W., Mueangtoom, K., Rezic, T. & Sukyai P., (2008), Comparing Soluble and Co-immobilized Catalysts for 2-ketoaldose Production by Pyranose 2-oxydase and Auxiliary Enzymes, Journal of Biotechnology, Science Direct Narita, V, (2005), Saccharomyces cerevisiae Superjamur yang Memiliki Sejarah Luar Biasa, Kompas, Jakarta Manitto, Paolo., (1992), Biosíntesis Produk Alami, Jhon Wiley and Sons. Inc., New York, 234-237 Underwood, Day, (1994), Analisa Kimia Kuantitatif, Edisi keempat, Erlangga, Jakarta BIOGRAFI PENULIS Penulis dilahirkan di Bangkalan pada tanggal 27 Maret 1987, sebagai anak kedua dari tiga bersaudara. Penulis adalah alumnus dari TK Dharmawanita, SD Negeri Demangan 2, SLTP Negeri 2 Bangkalan dan SMA Negeri 3 Pamekasan. Setelah lulus menempuh Pendidikan Menengah Atas, penulis melanjutkan Pendidikan Tinggi di Jurusan Kimia Fakultas MIPA Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Surabaya melalui jalur Tes Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB) pada bulan Agustus 2005. Selama menempuh pendidikan tinggi di ITS, penulis pernah aktif dan berpartisipasi dalam beberapa organisasi dan kegiatan tingkat Jurusan maupun Institut antara lain Unit Kegiatan Mahasiswa (UKM) Paduan Suara Mahasiswa ITS. Penulis juga aktif mengikuti beberapa pelatihan dan seminar. Penulis juga pernah menjadi asisten laboratorium pada praktikum Kimia Dasar I dan II, Kimia Analitika I, II, dan III, Kimia Anorganik, dan Biokimia. Penulis sempat menempuh Kerja Praktek di Laboratorium Kimia-Fisika MIGAS Cepu. Penulis menamatkan studi di Jurusan Kimia MIPA dengan mengambil Tugas Akhir pada bidang Biokimia. Penulis menamatkan studi di Jurusan Kimia MIPA dengan mengambil Tugas Akhir pada bidang Biokimia dan berhasil lulus dengan predikat Sangat Memuaskan.
