KAPOSVÁRI EGYETEM ÁLLATTUDOMÁNYI KAR Élettani és Állathigiéniai Tanszék
Doktori iskola vezetője:
Dr. Horn Péter az MTA rendes tagja
Témavezető:
Dr. Kovács Melinda az MTA doktora
A FUMONIZIN B1 KINETIKÁJÁNAK VIZSGÁLATA SERTÉS SZERVEZETÉBEN
Készítette:
FODOR JUDIT KAPOSVÁR
2007
1
TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS ....................................................................................................................... 1 1.1. A DISSZERTÁCIÓ CÉLKITŰZÉSEI ................................................................................... 4 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS............................................................................................... 5 2. 1. A FUMONIZINEK ELŐFORDULÁSA, ÉLELMISZERBIZTONSÁGI KOCKÁZATA................ 5 2. 1. 1. A fumonizinek előfordulása növényi eredetű élelmiszerekben, takarmányokban 5 2. 1. 2. A fumonizinek állati eredetű élelmiszerekben való megjelenése .......................... 9 2. 2. A FUMONIZINEK HATÁSA ........................................................................................... 10 2. 2. 1. A fumonizinek hatása háziállatainkra................................................................ 10 2. 2. 2. A fumonizinekkel összefüggésbe hozható humán megbetegedések..................... 15 2. 3. A FUMONIZINEK TERMELŐDÉSE/TERMELÉSE TERMÉSZETES ÉS LABORATÓRIUMI KÖRÜLMÉNYEK KÖZÖTT.................................................................................................... 17 2. 4. A FUMONIZINEK KÉMIAI SZERKEZETE, SEJTSZINTŰ HATÁSMECHANIZMUSUK........ 21 2. 4. 1. A fumonizinek kémiai szerkezete, kimutatásuk analitikai lehetőségei................ 21 2. 4. 2. A fumonizinek hatásának biokémiai és sejtbiológiai háttere ............................. 22 2. 5. A FUMONIZIN B1 METABOLIZMUSA, KINETIKÁJA...................................................... 26 2. 5. 1. Ismert metabolitok szerkezete, kialakulása ........................................................ 26 2. 5. 2. Toxikokinetikai vizsgálatok ................................................................................ 31 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ....................................................................................... 36 3.1. A FUMONIZIN B1 LABORATÓRIUMI ÚTON TÖRTÉNŐ ELŐÁLLÍTÁSA .......................... 36 3. 1. 1. F. verticillioides gombatenyészet előállítása, toxintermeltetés körülményei ..... 36 3. 1. 2. Mintavételek....................................................................................................... 37 3. 1. 2. Kémiai analízis................................................................................................... 37 3. 2. A FUMONIZIN B1 SZERVEZETEN BELÜLI ELOSZLÁSÁNAK ÉS KIÜRÜLÉSÉNEK TANULMÁNYOZÁSA (I. ÁLLATKÍSÉRLET) .......................................................................... 38 3. 2. 1. A kísérleti állatok takarmányozása és kezelése.................................................. 38 3. 2. 2. Hematológiai és biokémiai vizsgálatok.............................................................. 39 3. 2. 3. A toxin kiürülésének vizsgálata.......................................................................... 39 3. 2. 4. A szervek, a bélsár és a vizelet fumonizin tartalmának meghatározása............. 39 3.3. A FUMONIZIN B1 FELSZÍVÓDÁSÁNAK, SZERVEZETEN BELÜLI BIOTRANSZFORMÁCIÓJÁNAK ÉS KIÜRÜLÉSÉNEK TANULMÁNYOZÁSA (II. ÁLLATKÍSÉRLET)................................................................................................................ 42 3. 3. 1. A kísérleti állatok takarmányozása és kezelése.................................................. 42 3. 3. 2. Hematológiai és biokémiai vizsgálatok.............................................................. 42 3. 3. 3. A fumonizin B1 felszívódásának vizsgálata ........................................................ 42 3. 3. 4. A toxin kiürülésének vizsgálata.......................................................................... 43 3. 3. 5. A szervek, a bélsár, a chymus és a vizelet fumonizin és metabolitjai tartalmának meghatározása ............................................................................................................... 44 3.3.6. A FB1 konverzió fokának megállapítása .............................................................. 46 3. 4. IN VITRO KÍSÉRLET ..................................................................................................... 47 3. 4. 1. A kísérlet menete ................................................................................................ 47 3. 4. 2. A fumonizin B1 és metabolitjainak meghatározása ............................................ 47 3.4.2. A FB1 konverzió fokának megállapítása............................................................... 47 3. 5. STATISZTIKAI ANALÍZIS ............................................................................................. 48
2
4. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ........................................................................... 49 4. 1. FUMONIZIN B1 LABORATÓRIUMI ELŐÁLLÍTÁSÁRA IRÁNYULÓ KÍSÉRLET EREDMÉNYEI ...................................................................................................................... 49 4. 2. A FUMONIZIN B1 SZERVEZETEN BELÜLI ELOSZLÁSA ÉS KIÜRÜLÉSE (I. ÁLLATKÍSÉRLET EREDMÉNYEI)......................................................................................... 52 4. 2. 1. Klinikai tünetek .................................................................................................. 52 4. 2. 2. Hematológiai és biokémiai eredmények............................................................. 52 4. 2. 3. Kórbonctani vizsgálatok eredményei ................................................................. 53 4. 2. 4. A vizsgált szervek fumonizin koncentrációja...................................................... 53 4. 2. 5. A toxin kiürülése ................................................................................................ 57 4.3. A FUMONIZIN B1 FELSZÍVÓDÁSA, BIOTRANSZFORMÁCIÓJA ÉS KIÜRÜLÉSE (II. ÁLLATKÍSÉRLET EREDMÉNYEI)......................................................................................... 61 4. 3. 1. Klinikai tünetek .................................................................................................. 61 4. 3. 2. Hematológiai és biokémiai eredmények............................................................. 61 4. 3. 3. Kórbonctani vizsgálatok eredményei ................................................................. 61 4. 3. 4. A fumonizin B1 felszívódására irányuló vizsgálatok eredményei ....................... 61 4. 3. 5. A vizsgált szervek fumonizin koncentrációja...................................................... 63 4. 3. 6. A toxin kiürülése ................................................................................................ 66 4.4. IN VITRO KÍSÉRLET EREDMÉNYEI ............................................................................ 72 5. KÖVETKEZTETÉSEK, JAVASLATOK ...................................................................... 76 6. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK ............................................................................ 78 7. ÖSSZEFOGLALÁS .......................................................................................................... 79 7. 1. FUMONIZINEK LABORATÓRIUMI ÚTON TÖRTÉNŐ ELŐÁLLÍTÁSA ............................. 79 7. 2. IN VIVO KÍSÉRLETEK .................................................................................................. 80 7. 3. A FUMONIZIN B1 METABOLIZMUSÁRA IRÁNYULÓ IN VITRO KÍSÉRLET ..................... 81 8. SUMMARY........................................................................................................................ 83 8. 1. FUMONISIN PRODUCTION UNDER LABORATORY CONDITIONS .................................. 83 8. 2. IN VIVO EXPERIMENTS ................................................................................................ 84 8. 3. IN VITRO EXPERIMENT FOCUSED ON THE METABOLISM OF FUMONISIN B1............... 85 9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS........................................................................................... 87 10. IRODALOMJEGYZÉK ................................................................................................. 88 11. A DISSZERTÁCIÓ TÉMAKÖRÉBŐL MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK .............. 100 12. A DISSZERTÁCIÓ TÉMAKÖRÉN KÍVÜL MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK ...... 102 13. SZAKMAI ÖNÉLETRAJZ .......................................................................................... 103 14. MELLÉKLETEK.......................................................................................................... 104
3
1. BEVEZETÉS A takarmány- és élelmiszer-alapanyagokat fertőző mikroszkópikus gombák számos mikotoxint termelnek, amelyek a talaj-növény-állat-ember táplálékláncba kerülve ma még pontosan fel nem becsülhető közegészségügyi veszély forrásai. A rendszerint kis molekulasúlyú, antigénhatással nem rendelkező és környezeti hatásokkal szemben igen ellenálló molekulák a fonalas gombák másodlagos anyagcseréje folytán keletkeznek. Az ember a mikotoxinokat főleg szennyezett növényi táplálékkal (korpa, liszt stb.) vagy élvezeti cikkekkel (kávé, sör), közvetlenül veszi fel. Ritkábban és kis mennyiségben állati eredetű élelmiszerrel is hozzájut, az ún. „carry over” (átjuttatás) révén. A legtöbb mikotoxin a környezetben is stabil, hőnek, savnak ellenáll. Az élelem konyhai kezelése, illetve a takarmányok előkészítése ezeket a toxinokat nem teszi ártalmatlanná, vagy csak nagyon csekély mértékben csökkenti toxicitásukat. A mikotoxinok kémiai szerkezetüktől függően rákkeltő, teratogenikus, mutagén, citotoxikus, ösztrogén-mimetikus és immunszupresszív hatással rendelkeznek, károsítják az idegrendszert és a parenchimás szerveket. A Fusarium verticillioides (korábbi taxonómiai besorolás szerint: F. moniliforme) és a vele rokon gombafajok által termelt fumonizineket 1988-ban fedezték fel (Gelderblom és mtsai, 1988). A ma ismert 12 fumonizin (FBs) közül a fumonizin B1-nek (továbbiakban: FB1) van a legnagyobb állat- és humánegészségügyi jelentősége. A fumonizin B1 fajonként eltérő kórképeket alakít ki: lovakban encephalomalaciát okoz és hepatotoxikus (Marasas és mtsai, 1988), sertésekben máj- és veseelfajulást, valamint tüdővizenyőt (Harrison és mtsai, 1990), patkányban máj-, veseelfajulást és hepatocellularis karcinomát idéz elő (Gelderblom és mtsai, 1988), illetve összefüggésbe hozták a Dél-Afrika és Kína egyes területein endémiásan emberekben fellépő nyelőcső (oesophageal cancer, OC) - és májrák (a deoxynivalenollal együtt) kialakulásával is (Thiel és mtsai, 1992; Marasas és mtsai, 1993). A felmérések alapján megállapítható, hogy a fumonizinek a világ összes országában, ahol termesztenek kukoricát, szennyezik azt és előidézhetnek toxikózist (Dutton, 1996). Mivel Magyarországon a kukorica meghatározó jelentőségű a takarmányozásban, hazánk már a felfedezést követően bekapcsolódott a fumonizinek előfordulásának, hatásmechanizmusának megismerését célzó kutatásokba. Hazánkban a kukoricatermékek fogyasztása jelenleg kismértékű, de nő az igény az étkezési kukorica iránt. Nagyobb mértékű fogyasztása lisztérzékenyek vagy vegetáriánusok esetében figyelhető meg (Kovács, 2001). A mikotoxinok
1
táplálékba kerülésének kockázata fokozottan nő a modern táplálkozás elterjedésével. Külön probléma a biotermékek kérdése, ugyanis a hatékony növényvédőszerek túlnyomó többségének felhasználása az e termékek előállítása során tiltott. A gyenge mérgeknek számító, gyorsan lebomló fungicideknél százszor-ezerszer mérgezőbb és igen ellenálló gombatoxinok elkerülték a bioélelmiszereket előállító szervezetek és felhasználók figyelmét, és ezzel pontosan az a lakossági réteg vált kiemelten veszélyeztetetté, amelyik a természetes élelmiszerekben bízik (http://www.kfki.hu/chemonet/osztaly/ eloadas/mesterhazya.html). A környezeti terheléshez hasonlóan, a mikotoxinok kis dózisú, hosszantartó fogyasztása is káros hatású emberre, állatra egyaránt (Kovács, 2001). A mikotoxinokkal kapcsolatban általánosan elmondható, hogy a mikrodózisokban (µg/kg) folyamatosan felvett toxin a szervezetben halmozódhat. Felszívódásának helye a vékonybél, ahonnan a vér- és nyirokárammal a májba jut. A toxin egy része változatlanul halad át a májon és az epével visszakerül a bélcsatornába, másik része ugyancsak változatlan formában a vérrel a célszervekhez jut, ahol kifejti káros hatását. További része a tejjel, a tojással, a vizelettel, esetleg a seminalis plazmával elhagyja a szervezetet. Az egészséges szervezet a mikotoxinok egy jelentősebb részét át is alakítja. A felszívódott mikotoxinok, mint xenobiotikus vegyületek, első lépésben a májban alakulnak át. A májsejtek mikroszomális xenobiotikumtranszformáló enzimrendszere által katalizált folyamatban detoxikáció vagy olyan oxidációval, redukcióval és más kémiai folyamatokkal jellemezhető metabolikus útvonal indul el, amelynek során a kiindulási molekulánál toxikusabb, biológiailag aktívabb vegyületek is keletkezhetnek (Mézes, 2003). Így a szervekben, illetve az exkrétumokból kimutatható toxinkoncentrációt annak metabolizmusa is befolyásolja. Néhány mikotoxin eredeti kémiai formáját az intesztinális mikrobiota is képes átalakítani, amely jelentősen befolyásolhatja az eredetileg elfogyasztott toxin bélsárban megjelenő mennyiségét. Korábbi kísérletünkben (Kovács és mtsai, 2004) az állati eredetű élelmiszeralapanyagokban megjelenő fumonizin B1 kimutatása céljából a viszonylag rövid ideig (5 és 10 napig) tartó, nagy dózisú (100 mg/állat/nap) FB1 expozíció hatását vizsgáltuk választott malacokban (n=13). A toxinnak a szervek közötti megoszlása egyedenként nagyon eltérő volt, általánosságban megállapítható volt azonban, hogy a legtöbb a vesében (81,6-4762,4 µg/kg) és a májban (73,6-709,6 µg/kg) volt kimutatható. A fogyasztásra leginkább kerülő izom és zsír nem tartalmazott számottevő mennyiségű FB1-et. A kísérletünk eredménye számos kérdést vet fel, mint pl. történik-e metabolizmus, azaz molekukáris átalakulás a szervezetben, amely esetleg befolyásolja a toxin szervekből történő kimutatását.
2
A FB1 metabolizmusáról – annak tényéről, helyéről, mértékéről – kevés adat ismert, amelyek mindemellett ellentmondásosak is (Marasas és mtsai, 2000). Mivel a FB1 kinetikájával foglalkozó kísérletekben a toxint általában 14-es atomsúlyú radioaktív szénizotóppal jelölték (a molekula gerincét képező aminopentol 12-es és 16-os szénatomján), így a metabolizmus helye és pontos mértéke ismeretlen maradt. Az emberre extrapolálható ok-okozati összefüggések csak indirekt módon, főként állatkísérletek eredménye alapján közelíthetők meg, amelyek közül a sertéseken végzett kísérletek eredményei vonatkoztathatók legjobban az emberre (Kovács és Ványi, 1993). A fumonizin kutatások nem képzelhetők el széles körű interdiszciplináris szakmai összefogás nélkül. Vizsgálatainkat mi is több hazai és külföldi intézménnyel együttműködve végezzük (Debreceni Állategészségügyi Intézet, Debrecen; Müncheni Műszaki Egyetem, Állathigiéniai Tanszék, Németország, München; SZIE Mezőgazdaságés Környezettudományi Kar, Takarmányozástani Tanszék, Gödöllő; Állattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet, Élettani osztály, Herceghalom; KE Diagnosztikai és Onkoradiológiai Intézet laboratóriuma, Kaposvár).
3
1.1. A disszertáció célkitűzései Saját kísérletes eredményeinket és a szakirodalmi adatokat áttekintve számos kérdés maradt tisztázatlanul a FB1-nek a szervezeten belüli eloszlására, átalakulására, valamint kiválasztására vonatkozóan. A kutatómunka során kitűzött céljaim a következők voltak: •
Az állatkísérletek kivitelezéséhez nélkülözhetetlen, kellő mennyiségű fumonizin B1 toxin előállítása, kontrollált laboratóriumi körülmények között
•
Sertésekkel in vivo a következő kérdések megválaszolása: 1. milyen mértékben szívódik fel a toxin a vékonybélből, 2. milyen mértékű átalakuláson megy keresztül a toxin a vakbélben folyó mikrobiális fermentáció következtében, 3. alacsonyabb dózisú, hosszabb ideig tartó toxinexpozíció hatására hogyan alakul a toxinnak és főbb metabolitjainak a szervezetben való eloszlása, az egyes szervekben való kimutathatósága, továbbá, hogy 4. a felszívódott toxin milyen formában, mely exkrétummal és milyen arányban ürül ki a szervezetből.
•
In vitro módszert alkalmazva célunk volt meghatározni, hogy milyen mértékű átalakuláson megy keresztül a FB1 a sertés emésztőkészülékében folyó mikrobiális fermentáció során.
4
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS A fejezet első részében áttekintést szeretnék adni a fumonizinek, különös tekintettel a fumonizin B1 előfordulásáról, illetve élelmiszerbiztonsági vonatkozásairól, tekintettel arra, hogy a kutatások végső célja az emberi egészség védelme. Az irodalmi összefoglalásban ezután a toxin élő szervezetekre gyakorolt hatásaival kapcsolatos kutatásokat rendszerezem. A következő részben a fumonizinek természetes és laboratóriumi körülmények között történő termelődéséről kívánok áttekintést nyújtani. Ezt követően a fumonizinek kémiai szerkezetét, kimutatását tekintem át, majd hatásának biokémiai és sejtbiológiai hátterét, illetve a szervezeten belüli metabolitok kialakulásának elméleti kérdéseit tárgyalom. Végezetül az eddigi, fumonizinekre irányuló toxikokinetikai vizsgálatok eredményeit ismertetem.
2. 1. A fumonizinek előfordulása, élelmiszerbiztonsági kockázata 2. 1. 1. A fumonizinek előfordulása növényi eredetű élelmiszerekben, takarmányokban Ma már több mint ezer toxikus gombametabolit ismert, közülük közel száz káros hatását bizonyították. Kiemelkedő humán- és állategészségügyi jelentőséggel mindössze 15-20 mikotoxin rendelkezik. A penészgombák közül vannak, amelyek toxinjaikkal már a szántóföldön szennyezik a növényeket (növekedésükhöz több vizet igényelnek, ún. szántóföldi penészgombák), vannak, amelyek raktározás közben termelnek toxinokat (raktári penészgombák). Az előbbiek csoportjába tartoznak a Fusarium fajok, amelyeknek állat- és humánegészségügyi szempontból fontosabb toxinjaik a zearalenon (F-2 toxin, ZEA), a trichotecének (T-2 toxin, HT-2 toxin, nivalenol [NIV], deoxynivalenol [DON], diacetoxyscirpenol [DAS], fusarenon-X [FX]) és a fumonizinek (FBs). A raktári penészgombák főbb képviselői az Aspergillus és a Penicillium fajok, amelyek a következő fontosabb toxinokat termelik: aflatoxinok (AB1, AM1), ochratoxin-A (OTA), citrinin, patulin, rubratoxin B. Említést érdemelnek még a leggyakrabban a Claviceps purpurea faj által termelt ergot toxinok, amelyek ma már csak igen ritkán okoznak állat-és humánegészségügyi problémát. Ma Claviceps purpurea fajhoz tartozó törzsekkel és egyéb, Aspergillus és Penicillium nemzetséghez tartozó fajokkal gyógyszeripari felhasználásra termeltetnek ergot alkaloidokat. A Fusarium nemzetségbe tartozó gombák Magyarországon is nagymértékben fertőzik a szántóföldi növényeket (Fazekas, 1998). A monokultúrás termesztés elterjedésével a fertőzöttség nagymértékben nőtt, mert a szántóföldön visszahagyott szárrészek (betakarítás időpontjának elhúzódása, szántás hiánya) fertőzésforrást és jó táptalajt jelentenek szaporodásukhoz. A Debreceni
5
Állategészségügyi Intézet Kémiai Osztályának munkatársai a legmodernebb analitikai eljárásokkal rendszeresen vizsgálják a térségből származó, szemmel láthatóan nem fertőzött, illetve a penészes gabonaminták mikotoxintartalmát. A penészes mintákban jelentős arányú és mértékű F-2, T-2, DON és fumonizin szennyezettség is kimutatható (Fazekas, 1998). A fumonizineket 1988-ban a Fusarium verticillioides MRC 826 jelű törzs kukoricán elszaporított tenyészetéből izolálták (Gelderblom és mtsai, 1988; Cawood és mtsai, 1991), illetve szerkezetüket tisztázták (Bezoidenhout és mtsai, 1988). A fumonizin analógok 4 csoportba sorolhatóak: A, B, C és P; toxikológiai szempontból a B széria tagjai közül a FB1, FB2 és FB3 a legjelentősebb (Marasas és mtsai, 2000). A fumonizinek természetes előfordulását először az USA-ban, lovak agylágyulását okozó kukoricamintában (Norred és mtsai, 1989), a FB1 előfordulását pedig egy évvel később Dél-Afrikában, Transkei tartományból származó kukoricamintában (Sydenham és mtsai, 1990) mutatták ki. DélAfrikában végzett széles körű felmérés során 249 vizsgált minta közül 187-ben találtak fumonizineket (cit. Dutton, 1996). Ezután az USA-ban végeztek nagyszámú vizsgálatot, melyeknek során 1988-91 között a termesztett kukoricában FB1, FB2 és FB3 szennyezettséget mutattak ki Iowaban, Illinoisban, Wisconsinban, illetve Indianaban (Binkerd, 1993, Murphy és mtsai, 1993). A kukoricán kívül Brazíliában a „fekete zab”-ban (Scott, 1993), Új-Zélandon zöldtakarmányban (Mirocha és mtsai,1992) mutattak ki fumonizineket. Az 1992-1997 között végzett felmérő, illetve tájékozódó vizsgálatok során a legtöbb európai országban is, ahol kukoricát termesztenek, fumonizinszennyezettséget állapítottak meg (Visconti és mtsai,1995; Shephard és mtsai, 1996a), sőt egyes országokban, pl. Olaszországban és Franciaországban magas arányú és nagymértékű fumonizin-szennyezettséget detektáltak. A felmérések eredményeképpen megállapították, hogy a fumonizineket termelő gombafajok (F. verticillioides, F. proliferatum és még néhány kisebb jelentőségű gombafaj) világméretű elterjedésével párhuzamosan a fumonizinek világszerete szennyezik a kukoricát. A szemmel láthatóan penészes mintákban gyakran nagyon magas a FB1 koncentráció, mely elérheti akár a 330 mg/kg értéket is. A látszólag egészséges kukorica is szennyezett lehet fumonizinekkel, de a penészes mintákhoz képest jóval alacsonyabb koncentrációban (1 mg/kg) (Shephard és mtsai, 1996a). Az élelmezési célokat szolgáló kukorica, illetve kukoricatermékek még a fejlett országokban (USA, Olaszország, Franciaország) is tartalmaznak fumonizineket (Sydenham és mtsai, 1991; Bullerman és Tsai, 1994; Doko és Visconti, 1994; Visconti és mtsai,1995; Bullerman, 1996). A F. verticillioides a hazai kukoricát is gyakran fertőzi (Mesterházy és Vojtovics, 1977; Mesterházy, 1993; Szécsi, 1994; Szigeti és mtsai,1995), így
6
nem meglepő, hogy a kukorica hazánkban is gyakran szennyezett fumonizinekkel. Magyarországon az 1993-96 közötti időszakban a penészes minták 70%-ában fordult elő FB1 (átlagos koncentráció 2,6-8,6 mg/tak.kg; max. koncentráció: 19,8-75,1 mg/tak.kg). Ebben az időszakban a rossz minőségű, penészes kukorica mellett a szemmel láthatóan egészséges, átlagos minőségű kukorica minták fumonizin B1 szennyezettségét is vizsgálták. Ezek szennyezettsége sokkal alacsonyabb volt, mint a penészes mintáké (Fazekas, 1998). 1997-ben az emberi fogyasztásra kerülő kukoricatermékek FB1 szennyezettségét is vizsgálták Magyarországon. A vizsgált minták kétharmada tartalmazott FB1et, 0,016-0,058 mg/kg koncentrációban, amely szennyezettség alacsonyabb más európai országok értékeihez képest (Fazekas, 1998). A legfrissebb jelentés (SCOOP) 2003 áprilisában látott napvilágot, amely 13 EU tagállam felméréseiből készült el, az adott országok élelmiszereinek Fusariumtoxin szennyezettségét tekintve (EC, 2003). Ezen országok közül 12 gyűjtött adatokat az élelmiszereinek trichotecén, 9 a fumonizin (1. táblázat) és szintén 9 a zearalenon szennyezettségéről. A FBs szennyezettséget felmérő országok között a következők szerepeltek: Ausztria, Belgium, Franciaország, Németország, Olaszország, Hollandia, Norvégia, Svédország, Egyesült Királyság. 1. táblázat Pozitív minták száma a fumonizin-szennyezettségre irányuló felmérésekben (EC, 2003)
FB1 FB2 FB3
Felmérést végző országok száma 9 6 1
Minták száma 3863 1010 239
Pozitív minták (%) 46 42 36
A FB1 pozitív minták 68,3%-a Franciaországból, a FB2 pozitív minták 88,9%-a pedig Olaszországból származott. Összességében a FB1 pozitív minták 79%-a kukoricalisztből és (nyers, feldolgozatlan) kukoricából származott, a legnagyobb szennyezettség Olaszországban volt mérhető, 10200 µg/kg. A kukorica esetében a pozitív minták átlagos toxinkoncentrációja 730,5 µg/kg volt. A mikotoxinok – beleértve a fumonizineket is – táplálékból vagy takarmányból való eltávolítására, illetve a szennyezettség mérséklésére számos eljárást kíséreltek meg alkalmazni. A betakarítás során kirostált szemtörmelékek („screenings”) magasabb koncentrációban tartalmazzák a fumonizineket, mint az ép, sértetlen, élelmezési célra felhasznált kukorica. A szeparáció és a rostaalja eltávolítása ugyan csökkenti a fumonizin-szennyezettség szintjét már a tárolás
7
előtt, de a kirostált törmeléket a takarmányozásban hasznosítják. Egyéb, malomipari technológiák esetében is, az alkalmazott tisztítási módszerrel a fumonizinek vagy egyéb mikotoxinok az állatok takarmányozására használt frakcióba kerülnek. A fumonizinek határozottan hőstabilak, koncentrációjuk csak akkor csökken szignifikánsan, ha a hőkezelési eljárás során 150 oC-ot meghaladó hőmérsékletet alkalmaznak. A fermentáció során történő koncentráció-csökkentést egyrészt az eljárással előállított bioetanol termelése kapcsán (szennyezett takarmány újrahasznosítása), másrészt pedig a hatékony dekontamináció érdekében kezdték vizsgálni. Természetes úton kontaminálódott kukorica alkoholos (etanol) erjedése során (élesztőgomba hozzáadásával) <5%os koncentráció csökkenést tapasztaltak a végtemékben. (cit. EFSA, 2005). A szerzők ugyanakkor nem mérték a hidrolizálódott fumonizin származékok megjelenését. A fermentációs folyamat során keletkező metabolitok tényét Mokoena és mtsai (2005) közleménye sejteti, amelyben a mért FB1 koncentráció-csökkenés ellenére a humán sejttenyészetre gyakorolt toxicitás nem csökkent. Úgy tűnik tehát, hogy a mikotoxinok (beleértve a fumonizineket is) soha nem távolíthatók el teljességgel a táplálékból, sajnos ezekkel együtt kell élnünk. Ezért kockázatbecslésre van szükség, amely során meg lehet és meg is kell határozni az elfogadható élelmiszerminőség követelményeit, a tolerálható méreganyag szintet, vagyis azt, amely még nem károsítja az ember egészségét. FB1 esetében a toxikológiai vizsgálatok eredménye alapján megállapított NOEL (NOEL=no observed effect level) érték 0,2 mg/testsúly kg/nap, az ez alapján pedig emberek számára kalkulált TDI (TDI=tolerable daily intake) érték 2 µg/testsúly kg/nap (SCF, 2000). Európában a napi kukoricafogyasztás átlagosan 8,8 g/fő. A kukorica átlagos szennyezettségét figyelembevéve ez napi 12 µg/fő (0-210 µg/fő) FB1 felvételt jelent. Olyan esetekben azonban, ahol a kukorica a kizárólagosan fogyasztott gabonaféleség (pl. lisztérzékenyek) a toxinfelvétel elérheti a napi 310 µg/fő mennyiséget (2. táblázat). Dél-Afrika egyes területein, ahol magas a nyelőcsőrák előfordulási aránya (pl. Transkei tartomány), ennél jóval magasabb expozíciós szintet találunk (Marasas, 1996). 2. táblázat A kukoricafogyasztás kockázata (Marasas, 1996) Napi kukoricafogyasztás (g/fő) Európa
8,8
Dél-Afrika
110
Napi átlagos FB1 felvétel (µg/fő) 12 (0-210) 310 840-26.400
8
Az EU tagállamok által elvégzett, SCOOP tanulmány (EC, 2003) kalkulációja alapján, az említett országokban a lakosság (összpopuláció) a naponta tolerálható FB1 felvétel 0,8-13%-át, ezen belül a felnőtt lakosság 0,1-14%-át, a kisgyermekek pedig 23%-át veszik fel a megszokott étrenddel. Főként azok az élelmiszerek (a gyerekek által Németországban nagyon kedvelt: szója, spárga, fűszerezett szósz) jelenthetnek veszélyt a gyerekek számára, amelyet rendszeresen fogyasztanak, és amelyekben rendszerint detektálható fumonizin, ugyanakkor viszonylag kis mennyiségben. Norvégia adatai szerint a gyerekek 430 ng/tt kg/nap FB1 + FB2-t vesznek fel, főleg a bébiételekből. A felvétel ezesetben is elmarad a kalkulált TDI értéktől (EC, 2003), bár az eredmények aggályosnak tekinthetők. 2. 1. 2. A fumonizinek állati eredetű élelmiszerekben való megjelenése Az állati eredetű élelmiszer-alapanyagok FB1-el való szennyeződésének első lépése a toxinnak a háziállataink tápcsatornájából történő felszívódása, bejutása a vérkeringésbe, majd eljutása a perifériás szövetekbe. Szemben a DON, vagy az ochratoxin-A 50-65%-os biológiai hozzáférhetőségével („bioavailability”), a FB1 esetében ez irodalmi adatok szerint mindössze 0-6% (Galtier, 1998). Számos tanulmány készült a fumonizinek lehetséges „carry-over” (takarmányból az állati termékbe kerülése) szerepének vizsgálata céljából. Prelusky 1995-ben [14C]-FB1-et orálisan (1 vagy 5 mg FB1/tt kg), illetve intravénásan (i.v.) (0,05 vagy 0,2 mg FB1/tt kg) tejelő teheneknek adagolva azt találta, hogy FB1 reziduum elhanyagolható (5-6 µg/l) mennyiségben volt detektálható a tejben. Richard és mtsai (1996) FB1, FB2, FB3 tartalmú gombatenyészetet kevert két tejelő tehén takarmány adagjához. A tehenek átlagosan 3 mg/ttkg FB1-et vettek föl a takarmánnyal, 14 napon keresztül, de fumonizint nem detektáltak (limit of detection, LOD = 5 µg/l) a naponta begyűjtött tejmintákban. Hammer és mtsai (1996) vizsgálatukban három tehénnek, naponta 30 mg FB1-et adagoltak (i.v.), azonban a pozitív tejminták aránya elhanyagolható volt (0,11%). Spotti és mtsai (2001) izolált szarvasmarha tőgyben (ex vivo) vizsgálták a FB1 „carry-over” tulajdonságát, perfúziós módszerrel. 2 mg FB1-et injektáltak a perfúziós folyadékhoz, és a FB1 átvitel arányát 0,001-0,004%-ban állapították meg. Sertésekkel 100 mg/kg FB1 tartalmú takarmány két hétig tartó etetését követően (átlagos toxinfelvétel: 198 mg/állat/nap) sem lehetett a kocatejből toxint kimutatni, bár a szerzők leszögezték, hogy a kimutatási határ 30 µg/l volt. (Becker és mtsai, 1995). Átlagosan 300 mg/állat/nap toxinfelvételt követően
9
ugyanakkor a toxin 18,0-27,5 µg/kg mennyiségben (LOD: 2 µg/l) kimutatható volt a kocatejből (Zomborszky-Kovács és mtsai, 2000). 30 hetes tojótyúkoknak Vudathala és mtsai (1994) i.v. és szájon át 2 mg/ttkg 14 C-el jelzett FB1-et adagoltak. A mérések azt mutatták, hogy a radioaktív anyag szinte maradéktalanul visszanyerhető volt az exkrétumokból, a különböző szervek és szövetek FB1 koncentrációja azonban elhanyagolható volt (<10-15 µg FB1/kg szövet), kivéve a máj (530 µg/kg) és a vese (210 µg/kg) egyes területeit. A tojások sárgájában, fehérjében és héjában a reziduum szintjei szintén nagyon alacsonyak voltak (< 10-15 µg fumonizin/kg). Prelusky és mtsai (1996a,b) 24 napig 2-3 mg/kg mennyiségben jelölt ([14C]) FB1 toxint tartalmazó takarmány etetését követően a legmagasabb toxinszintet (160 és 65 µg/kg) a májban és a vesében mérték, sertésben. Az izom- és zsírszövet a detektálhatósági szint alatt maradt. A táp toxinmentesre történő lecserélését követően a szöveti toxinkoncentráció 9 napon belül, gyorsan lecsökkent. Hazai (Kovács és mtsai, 2004), sertéseken végzett vizsgálatokban a toxinnak a szervek közötti megoszlása egyedenként nagyon eltérő volt, tendenciájában megállapítható volt azonban, hogy a legtöbb a vesében (81,6-4762,4 µg/kg) és a májban (73,6-709,6 µg/kg) volt kimutatható. A fogyasztásra leginkább kerülő izom és zsír nem tartalmazott számottevő mennyiségű FB1-et. A legfrissebb, sertéseken végzett vizsgálat szerint 22 mg FB1/tak.kg, 5 hónapon keresztüli etetése után a vesében nem tudtak FB1-et kimutatni (LOD 5 µg/kg) (DeLiguoro és mtsai, 2004). Marhahúsból (máj: 2070 µg/kg; vese: 23,4 µg/kg; izom: 97,3 µg/kg) 300 mg/kg FB1 tartalmú kukoricadara etetését követően (30 nap) lehetett kimutatni a toxint (Smith és Thakur 1996). Úgy tűnik tehát, hogy a takarmánnyal szájon át felvett FB1 nem jelent élelmiszerbiztonsági kockázatot az állati eredetű élelmiszerek fogyasztása során, míg manapság a reformkonyha keretében felhasznált élelmiszerek elterjedése növeli a mikotoxinok (így a fumonizinek) táplálékláncba való bekerülésének esélyét, kockázatát.
2. 2. A fumonizinek hatása 2. 2. 1. A fumonizinek hatása háziállatainkra Bár a fumonizinek felfedezése csak nemrég történt meg, a F. verticillioides által előidézett toxikózisokról már több mint 150 éve születtek leírások. Az akkor „penészes kukoricamérgezés” („moldy corn poisoning”) vagy a „kergekór” („blind staggers”) néven ismert háziállat-betegséget elsőként az
10
Egyesült Államokban, 1850-ben észlelték. A kórokozó ágens ismeretlen maradt, mígnem Sheldon (1904) a F. verticillioides-t azonosította. Később fény derült a toxin, illetve a lovakon, teheneken, öszvéren, sertésen és a csirkéken jelentkező bizonyos betegségek közötti összefüggésre, Nebraskaban (cit. Munkvold és Desjardins, 1997). Szoros összefüggést tapasztaltak a penészes kukorica etetése, illetve a lovaknál, szamaraknál, öszvérnél és nyulak esetében diagnosztizált agylágyulás (equine leucoencephalomalacia, ELEM) között (Wilson és Maronport, 1971; Nelson és mtsai, 1993). A lovak esetében ez a betegség pár nappal a tünetek megjelenését követően elhullással végződött. 1971-ben Wilson és Maronport kísérletet végeztek az ELEM reprodukálása céljából F. verticillioides gombatenyészettel kevert takarmánnyal lovakon, amely bizonyította e betegség okozó ágensét. Tisztított FB1-gyel először Dél-Afrikában reprodukálták a betegséget (Marasas és mtsai, 1988), és kiderült, hogy a lovak rendkívül érzékenyek a FB1-re. Az ELEM előfordulási helyein (Észak-Amerika, Dél-Afrika és Ázsia) átlagosan 0,2 - 126 mg FB1/kg koncentrációt határoztak meg a takarmányokban (Marasas, 1996). Pónikkal végzett kísérlet alapján megállapították azt a legkisebb toxin koncentrációt (8 mg/kg), amely már előidézi az ELEM-t (Wilson és mtsai,1992). Természetesen nem a ló az egyetlen állatfaj, amelyben a toxin károsító hatásai kimutathatók. Kriek és mtsai (1981) F. verticillioides gombával fertőzött takarmány (szájon át) hatását vizsgálták kükönböző állatfajokon, köztük sertésen is. A tipikus kórképnek a fatális kimenetelű tüdőödéma bizonyult. Később, 1989-ben, összefüggést észleltek a F. verticillioides-el fertőzött, illetve fumonizinekkel szennyezett takarmány fogyasztása és a sertés tüdőödéma (PPE, porcine pulmonary edema) kialakulása között az Egyesült Államok középső területén és Georgiában (Harrison és mtsai, 1990). Georgia Állam kutatói bizonyították a tisztított FB1 i.v. adagolásának PPE kiváltó hatását (Haschek és mtsai, 1992). Vizsgálták a takarmány FB1 tartalmát azokon a területeken, ahol magas volt a PPE előfordulási aránya (Észak és Dél-Amerika) és 2-330 mg/kg FB1-et találtak a takarmánymintákban (Marasas, 1996). Magyarországon az 50-es évek elején tömegesen észlelték az „új” kukorica fogyasztását követően a kóroktanilag nem tisztázott tüdővizenyő járványszerű előfordulását, sertésben. A betegséget Domán és Petrás írták le 1952-ben, és mint a sertések „hizlalási vagy sajátos tüdővizenyője” vált ismertté. Az 50-es években Magyarországon észlelt betegség lefolyásának, a kialakuló klinikai tüneteknek és a kórbonctani képnek az USA-ban, az 1980-as években fumonizin B1 toxikózis okaként leírt PPE-val való nagyfokú hasonlósága felvetette a kérdést, nem azonos kóroktanú megbetegedésekről van-e szó (Kakuk, 1995). A betegséget Fazekas és mtsai (1997) kísérleti állatetetéssel reprodukálták. Két 10-
11
12 kg testtömegű malaccal 330 mg/tak.kg FB1 etetését követően az állatok az ötödik napra elhullottak. Mellvízkór, tüdővizenyő, májelváltozás és sárgaság, agyödéma, illetve kezdődő körülírt agylágyulás volt diagnosztizálható. A kísérleti etetés tehát bebizonyította, hogy a hazánkban is előforduló hizlalási tüdővizenyőt a fumonizin B1 mikotoxin idézte elő. A FB1 tüdővizenyőt kiváltó hatásának bebizonyosodása után megindultak a kutatások a fumonizin B1 toxikózis kialakulásának, klinikumának és kórtani elváltozásainak tanulmányozására. Általánosságban elmondható, hogy a fumonizin toxikózis sertésben pulmonális, kardiovaszkuláris és hepatikus szimptómákkal jellemezhető. Ezen kívül oesophagitis, gyomorfekély és a szív hipertrófiája is jellemző (Gumprecht és mtsai, 1998; Smith és mtsai, 1999). Harrison és mtsai (1990) kimutatták a FB1 necrosist kiváltó hatását a vesében és a pancreasban. Alacsony dózis (0,88, 1 és 15 mg/kg/nap FB1) 4, illetve 9 napig tartó i.v. bevitele enyhe és időszakos klinikai tüneteket (szapora légzés és szívverés) eredményezett, enyhe, csak kórszövettani vizsgálattal kimutatható tüdőödéma alakult ki a 6-13 kg súlyú malacokban. A májsejtek degeneratív elváltozása, majd fokozott regenerációja is megfigyelhető volt. Azok a kísérleti állatok, amelyeknél a napi FB1 bevitel elérte vagy meghaladta a 15 mg-ot, súlyos tüdővizenyőben 3-4 nap alatt elpusztultak. Az ennél kevésbé szennyezett takarmányon tartott, első napokat túlélt állatok a súlyos tüdővizenyő mellett visszautasították a takarmányt, lesoványodtak, és májdisztrófia, illetve sárgaság jelentkezett (Haschek és mtsai, 1992; Motelin és mtsai, 1994). Letális tüdővizenyőt és mellvízkórt figyeltek meg malacokban > 12 mg FB1/ tak.kg dózis eredményeként (ez 0,6 mg/ttkg/nap dózisnak felel meg). Kórbonctani vizsgálatok súlyos tüdővizenyőt tártak fel megszélesbedett interlobularis sövényekkel, de gyulladásos jelek nélkül (Haschek és mtsai, 2001). Nyolc héten keresztül történő FB1 terhelés során, < 1 mg FB1/tak.kg is kiváltott proliferációt a kötőszövetben, elsősorban a nyirokerek körül és a subpleuralis, illetve interlobularis kötőszövetben. Ezeket az elváltozásokat azonban nem kísérték klinikai tünetek (Zomborszky-Kovács és mtsai, 2002). Feltételezik, hogy a tüdő károsodását kardiovaszkuláris abnormalitások és a tüdőbeli haemodinamikus változások (a kisvérkörben a vérnyomás emelkedése), illetve a bal szívfél elégtelensége előzi meg (Smith és mtsai, 1999). Fumonizin terhelés hatására májkárosodás (nekrózis) is fellépett, epepangás kíséretében. Az állatok étvágytalanná váltak, agyi elfajulást mutattak, testtömegük csökkent, és a máj egyes területein, szórtan hyperplasia jelei mutatkoztak. Ezeket az elváltozásokat a szérum biokémiai paramétereiben történő változások is követték, beleértve az epesavak és a bilirubin koncentrációjának növekedését. A szérum aszpartát aminotranszferáz (AST),
12
alkalikus foszfatáz (ALP), gamma-glutamil transzferáz (GGT), laktátdehidrogenáz (LDH) aktivitása is megnőtt (Zomborszky-Kovács és mtsai, 2002). Ez a hatás a dózis nagyságától és idejétől függő volt. Motelin és mtsai (1994) 101, illetve 175 mg/kg FB1 tartalmú takarmányt etettek malacokkal. A toxintartalmú takarmány fogyasztását követően a szérum bilirubin, illetve koleszterin szint, valamint a GGT, ALP, alanin-aminotranszferáz (ALT), AST és argináz aktivitás eltért a fiziológiástól, habár csak a bilirubin (5. napon), a GGT és ALT (14. nap) paraméterek eredményei voltak szignifikánsan magasabbak (a nagyobb FB1 tartalmú tápot fogyasztó csoportban) a kontroll csoportban mért eredményektől. Zomborszky-Kovács és mtsai (2002) etetési kísérletében csak a szérum AST aktivitás volt szignifikánsan magasabb a 4. héten (csoportok: 20, 40 mg FB1/tak.kg). Az ALP, AST és az ALT esetében a fiziológiás szintet meghaladó értékeket csak néhány állat esetében figyeltek meg az 5 és 10 mg FB1/tak.kg dózissal kezelt csoportban, amit a tüdő patológiás elváltozásai is kísértek. Ezzel ellentétben, Rotter és mtsai (1996) már 1 mg tisztított FB1/tak.kg (2. héten) terhelés esetében is megfigyeltek emelkedést a szérum koleszterin koncentrációjában, bár 8 hét elteltével ez az elváltozás nem volt szignifikáns sem az 1, sem pedig a 10 mg FB1/tak.kg dózissal terhelt csoportban. A vizsgálatokból kiderült, hogy a tisztított FB1 kisebb koncentrációban is előidézi az elhulláshoz vezető tüdővizenyőt, mint a természetesen képződött vagy tenyésztett kultúrák etetésével bevitt FB1. A természetes úton kontaminálódott takarmányt fogyasztó állatoknál a pulmonáris ödéma mellett nagyobb valószínűséggel alakult ki májkárosodás (Harrison és mtsai, 1990; Haschek és mtsai, 1992). Ez utóbbi oka lehet a természetesen kontaminálódott takarmány (vagy takarmányalapanyag) egyéb fumonizin (FB2, FB3) tartalma is, illetve más mikotoxinokkal (pl. a fuzarium-sav, „Fusaric acid”) való szinergista hatása. Előbbit kizárja Howard és mtsai (2002) munkája, mely szerint a különböző fumonizin B csoport származékait (FB1, FB2, FB3) külön-külön etetve csak a fumonizin B1 okozott májkárosodást. A fumonizin hatásában megfigyeltek ivartól függő eltéréseket is. Rotter és mtsai (1996) a takarmányhoz kevert, tisztított FB1 hatását vizsgálták választott malacokkal végzett kísérletükben. Hat hetes (6-12 kg élősúlyú) malacokkal 8 héten át etettek különböző dózisokban (0,1, 1 és 10 mg/tak.kg) FB1 toxint tartalmazó takarmányt. A kasztrált hím és a nőivarú állatok nem egyformán reagáltak a toxinhatásra. Míg az ártány malacoknak a 4.-6. héten mért testsúlygyarapodása a toxin emelkedő koncentrációjával lineárisan csökkent, addig a nőivarú állatokban nem volt kimutatható különbség. A testsúlygyarapodás az első 4 hétben mindkét ivarban jelentősen ingadozott, majd a második 4 hetes periódusban kiegyenlítettebbé vált. A vérszérum AST aktivitása és koleszterinszintje megemelkedett a 10 mg/tak.kg-os csoportokban, a hasnyálmirigy és mellékvesék tömege a toxint fogyasztott ártányokban a
13
kontrollhoz képest nagyobb lett, valamint a máj, a tüdő és a vese szfinganin:szfingozin aránya a 10 mg/tak.kg-os csoportokban ivartól függően megnövekedett. Az ivarral összefüggésbe hozható eltérő érzékenység oka még ma sem tisztázott. Egerek esetében az ivarral összefüggő hepatotoxicitás mértékét a szabad szfingoid bázisok arányában mutatkozó eltéréssel és a májban a szöveti makrofágok által szintetizált citokinek (interferonok, interleukinek) expressziójának módosításával magyarázták (Bhandari és mtsai, 2001). A krónikus etetési kísérletekből tehát kitűnik, hogy az alacsony dózis, amely esetleg nem is okoz szemmel látható tüneteket, kórszövettani és metabolikus, illetve enzimatikus elváltozásokat idéz elő, amelyek jelzik a toxin folyamatos terhelő hatását. A fumonizin toxikózis biomarkere, a szfinganin:szfingozin (Sa:So) arány a tüdő, a máj és a vese szöveteiben, már az 5 mg FB1/tak.kg-ot (2 héten keresztül) fogyasztó állatok esetében is megváltozott (Riley és mtsai, 1993). Ugyanezen szerzők a szabad szfinganin emelkedését tapasztalták a szervekben 23 mg FB1+FB2/tak.kg dózisnál, míg a szérumban a Sa:So arány megváltozását már 5 mg-os terhelés esetében is megfigyelték. Rotter és mtsai (1996) 10 mg/kg FB1 etetésekor a szervekben magasabbnak találták a Sa:So arányt, míg az 1 mg/kg tisztított FB1-el való terheléskor ilyen változásokat nem észleltek. Hasonlóképpen, Zomborszky-Kovács és mtsai (2002) 5 mg FB1/tak.kg etetésekor a szérum Sa:So arányában emelkedést tapasztaltak, míg az 1 mg FB1/tak.kg dózissal terhelt csoportban nem volt ilyen irányú eltérés. Riley és mtsai (1993) megállapították, hogy a Sa:So arány megváltozása az egyetlen, fumonizin toxikózist igazoló marker, amely a diagnózis felállításánál figyelembe vehető. Jelzőértékkel bír a fumonizin toxikózis esetén a tüdő szöveteiben a makrofágok megjelenése is, mivel ez a fertőzési ágens elleni első védelmi vonalnak tekinthető (Martinova és mtsai, 1995). Colvin és mtsai (1993) szerint a toxin hatására megváltozott szfingolipid metabolizmus abnormalitásokat idéz elő az endothel sejtek membránjában, amely membránkárosodás, mint szignál, aktiválja a szöveti makrofágokat (pulmonary interstitial macrophage; PIM). Ez utóbbi munkacsoport, más nézőpontból vizsgálva azonban megjegyzi, hogy sertés tüdejében a kapilláris térfogat kb. 25%-át az intravaszkuláris makrofágok teszik ki, ami egyedülálló faji sajátosság. Az aktivált makrofágok felelősek lehetnek a vazoaktív aminok felszabadulásáért, amelyek feltehetően szerepet játszanak a tüdőkárosodás kialakulásában. A fumonizin immun-modulátor hatását írták le sertésben, de csirkében és rágcsálókban is (cit. EFSA, 2005). Összefoglalva, a legalacsonyabb dózis, amely esetében már elváltozás tapasztalható a Sa:So arányban, 5 mg FB1/tak.kg (0,2 mg/ttkg/nap). Tüdőkárosodás, amely a fumonizin toxikózis tipikus kórképe, sertésben már 0,4 mg/ttkg/nap dózis alkalmazásánál is kialakul (Riley és mtsai, 1993; Zomborszky-Kovács és mtsai, 2002).
14
Vemhes kocákat fumonizin B1 (300 mg/kg) tartalmú takarmánnyal etetve a magzatok is károsodtak (Zomborszky-Kovács és mtsai,1997b). A baromfifajok közül a házityúk és a pulyka viszonylag rezisztensnek mondható a FB1-re, noha napos brojlercsirkékben (Kubena és mtsai, 1997) és pulykapipékben a magas dózisú FB1 (kb. 200 mg/kg) növekedésben való elmaradást, májkárosodást, angolkórt idézett elő (Bermudez és mtsai, 1997). In vitro vizsgálatok viszont azt mutatták, hogy a FB1 a baromfifajokban immunszupresszív hatású (Li és mtsai,1999). A viziszárnyasok FB1 érzékenységéről viszonylag keveset tudunk. A kacsa érzékeny a toxinra, amelyet az is bizonyít, hogy fiatal kacsákat több kutató is használt- a fumonizinek felfedezését megelőzően- teszt-állatként az egyes Fusarium verticillioides törzsek toxicitásának vizsgálatára (Vesonder és Wu, 1998). A ludak FB1 érzékenységére vonatkozóan jelenleg nem áll rendelkezésünkre adat. A kérődző állatok is viszonylag rezisztensnek mondhatók (Smith és Thakur, 1996). Növendék szarvasmarhákkal több héten át etetett magas FB1 tartalmú (kb. 200 mg/kg) takarmány súlygyarapodás csökkenést és májelfajulást idézett elő (Osweiler és mtsai, 1993). Ausztráliában őshonos, vadonélő szarvasokban (Oducoileus virginianus) jelentkező megbetegedés során májelfajulásra utaló magas AST szintet mértek. Az állatok takarmányát képező fűfélékben jelentős mennyiségben mutattak ki FB1-et, amely feltételezhetően szerepet játszott a megbetegedések kialakulásában (Howerth és mtsai, 1989). Juhokban kísérletesen előidézett FB1 toxikózis máj- és veseelfajulást idézett elő (Edrington és mtsai, 1995). Összefoglalva megállapítható, hogy a fumonizin a toxin koncentrációjától, a toxinbevitel és a kontamináció módjától (természetesen kontaminálódott vagy tisztított toxin), a hatás időtartamától, az állatfajtól, stb. függően meglehetősen változatos kórképet alakít ki. 2. 2. 2. A fumonizinekkel összefüggésbe hozható humán megbetegedések Az ember mikotoxikózisairól aránylag keveset tudunk, annak ellenére, hogy már évszázadokkal korábban leírtak súlyos „járványokat”. A penészes élelmiszerek fogyasztásának betegséget okozó hatásai azonban már régóta ismertek (Hendry és Cole, 1993). Az ergotizmus vagy anyarozsmérgezés már az időszámításunk előtti időkben is előfordult, az első írásos feljegyzés egy kiterjedt európai endémiáról (Szent Antal tüze) az 1090-es évekből maradt ránk. A történelem során számos, mikotoxinok okozta tömeges megbetegedés fordult elő világszerte. A
15
betegségeket a kiváltó élelmiszerek („sárgarizs”) vagy a tünetek alapján („részeg kenyér”) nevezték el. A XIX. század eleje óta több jelentős emberi fuzariotoxikózis eset vált ismertté (Uzoni betegség, alimentáris toxikus aleukia), melyeknek ezrek estek áldozatul még az 1940-es években is, főként TávolKeleten és Kelet-Szibériában (cit. Munkvold és Desjardins, 1997). Érthető tehát, hogy a 60-as évektől kezdődően a fejlett technikával rendelkező országokban (USA, Japán, Anglia, Izrael, Németország) igen széles körű vizsgálatok folynak a toxinok kimutathatóságát szolgáló módszerek kidolgozására és a toxinok hatásának megismerésére. Már 1971-ben összefüggésbe hozták a F. verticillioides-el fertőzött kukorica humán fogyasztását a Dél-Afrikában egyre növekvő arányban előforduló nyelőcsőrákkal (Booth, 1971). Később ugyanezt az összefüggést találták Kína egyes területein is, ahol szintén magasabb arányban fordult elő nyelőcsőrák és primér májrák. A F. verticillioides által termelt toxinok közül először a moniliformint, a fusariocin C-t, majd később a fusarin C-t azonosították (Shier, 2000). A konklúzió, miszerint ezek a toxinok nem lehetnek felelősek a F. verticillioides toxikus és karcinogén hatásáért, Gelderblom és mtsai-t (1988) arra ösztönözte, hogy további származékokat kutasson. 1988-ban egy, a már 1975ben Tatematsu és mtsai által is használt törzs tenyészetéből (F. verticillioides MRC 826) izolálták a fumonizin B1-et. A fumonizin B1 szerkezetének meghatározását követően, észrevették egy már korábban azonosított mikotoxin csoporttal, az AAL-toxinokkal (Alternaria alternata) való strukturális hasonlóságokat. A világ különböző laboratóriumaiban, számos fumonizin analógot azonosítottak, azonos vagy más gombafajok tenyészetében (cit. Shier, 2000). Az OC-érintett területeken élők nap mint nap kukorica alapú ételeket fogyasztanak étrendjük fő részeként. A kukoricát a családok saját célra, házilag termesztik és kezdetleges módon tárolják. Transkeiben a penészes kukoricát a penésszel járó sajátos íz miatt sörfőzéshez használják (Marasas és mtsai, 1979). Az OC kóroktanának kutatása alapvető szerepet játszott a fumonizinek (FB1, FB2, FB3, FB4) felfedezésében. Az 1991-95 közötti időszakban a világ számos országában (Argentinától Japánig, köztük hazánkban is) termesztett kukoricában megállapították a fumonizinek előfordulását (2.1.1. fejezet). A vizsgálatok alapján úgy találták, hogy szoros, pozitív korreláció van a nyelőcsőrák előfordulási gyakorisága, és a kukorica alapú élelmiszerek FB1 tartalma között (Rheeder és mtsai, 1992; Marasas és mtsai, 1993; Chu és Li, 1994). Miután a tisztított FB1 hozzáférhetővé vált, megindultak a kísérletek az állategészségügyi és humán betegségek tisztázása céljából, de elsősorban annak karcinogén hatását vizsgálták (Gelderblom és mtsai, 1988, 1992). Akár
16
szántóföldekről származó kukoricát, akár a szántóföldről izolált F. verticillioides gombatenyészetét használták, azok jó- és rosszindulatú tumort indukáltak patkány májában (Gelderblom és mtsai, 1988). A megfigyelésekre alapozva 1993-ban a F. verticillioides tenyészetéből származó toxinokat lehetséges karcinogénekként (2B) jelölték meg (IARC,1993). Mivel sem laboratóriumi, sem háziállatokon nem tudtak az emberi nyelőcsőrákhoz hasonló kórképet előidézni – mint később kiderült a toxin fajspecifikussága miatt – , elkezdődtek a főemlősökön végzett kísérletek. Az FB-k izolálását megelőzően, egy – a F. verticillioides toxikus kivonatai hatását vizsgáló – kísérlet során Kriek és mtsai (1981) azt találták, hogy páviánoknál májzsugor alakul ki. Az izolálást követően egy másik kísérletben 4 hím és 7 nőstény vervet majmot etettek FB1, FB2 és FB3 tartalmú táplálékkal (Fincham és mtsai, 1992). A táplálás időtartama 40-től 573 napig tartott a „magas” dózisú és 310-től 748 napig az alacsony dózisú kísérleti beállításban. Az etetett össz. FB mennyiség 392-814 µg/állat/nap volt. A hypercholesterolaemia megjelenése mellett, krónikus hepatotoxicitást figyeltek meg. Egyéb állatfajban (házinyúl) sem alakult ki nyelőcsőrák (Bucci és mtsai, 1996). Bár a tudományos közvélemény általánosan elfogadottnak tekinti, hogy kukorica fumonizin tartalmának oktani szerepe van az emberi nyelőcsőrák kialakulásában, a főemlősökön végzett kísérletekkel e betegséget nem tudták előidézni. A fumonizin-kutatás nemzetközi szinten jelenleg is intenzíven folyik, ami részben a fumonizinek széleskörű elterjedésével, másrészt a humán-expozíció kockázatbecslés fontosságával magyarázható.
2. 3. A fumonizinek termelődése/termelése természetes és laboratóriumi körülmények között Csaknem minden növényi termék szubsztrátként szolgálhat a gombák növekedéséhez a betakarítás, tárolás és feldolgozás folyamán. A toxin termeléséhez szükség van ezen kívül megfelelő hőmérsékletre, oxigénre és fajonként eltérő mennyiségben – hozzáférhető, szabad vízre is. Fontos tudni azonban, hogy a toxintermelés genetikailag szabályozott folyamat, kizárólag környezeti tényezők nem indítják el, annak csak mennyiségi viszonyait befolyásolhatják. A mikotoxinok bioszintézisét számos toxin esetében vizsgálták már korábban. A legtöbb mikotoxin bioszintézisének génjei klaszterekben helyezkednek el (pl. aflatoxinok, trichotecének, ergot alkaloidok, fumonizinek). Ez felveti annak a lehetőségét, hogy ezek a gének egységként, horizontális géntranszfer révén átadódhatnak más fajokba. Ez magyarázhatja azt, hogy egyes
17
mikotoxinokat számos, egymással nem rokon gombafaj is termelhet (pl. aflatoxint az A. flavus és rokonai mellett A. ruber, A. ochraceoroseus és Emericella; ochratoxin A-t mind Penicillium, mind Aspergillus fajok termelnek) (Varga és mtsai 2002). A gomba szaporodása, a nagy micéliumtömeg, tehát maga a gomba-szennyezettség nem jelent feltétlenül toxinképzést is (Varga és mtsai, 2000). Hasonlóan a többi szántóföldi gombához, a Fusarium-fajok is rendszerint a vetésterületen, a betakarítás előtt fertőzik a növényeket és törnek be a magvakba, erősen befolyásolva az alapanyag kiindulási mikrobiológiai minőségét. A természetes fumonizin képződés pontosan még nem ismert, de feltételezhető az adott év időjárásának befolyása is (Fazekas, 1998). A fumonizineket a Fusarium nemzetség Liseola-szekciójába tartozó gombafajok termelik, leggyakrabban a Fusarium verticillioides és a Fusarium proliferatum, ritkábban a velük rokonságban lévő egyéb Fusarium-fajok, mint a F. napiforme, F. dlamini és a F. nygamai (US-NTP, 1999). Ma 13 különböző penészgomba fajról ismert fumonizin termelő képessége (Marasas és mtsai, 2000). Ezek a fajok még az egészségesnek tűnő kukoricából is izolálhatók (Bacon és Williamson, 1992). Természetes kontamináció során a fumonizinek közül a FB1 termelődik a legnagyobb mennyiségben (70-80%), míg a FB2 általában ennél jóval kisebb mennyiségben (15-25%), a FB3 pedig csak 3-8%-a az összesen termelődött fumonizinnek (Marín és mtsai, 1995). Szubsztrátként a gabonák szolgálnak, azonban mint abiotikus faktor, a nedvességtartalom és a hőmérséklet is fontos tényező a F. verticillioides növekedése és toxintermelése során (Cahagnier és mtsai, 1995). A fumonizintermelés minimális, maximális és optimális hőmérsékleti paramétere vitatott, bár optimális hőmérsékleti tartományként számos szerző a 20-28 oC közötti értéket határozta meg (Alberts és mtsai, 1990). Ismert továbbá, hogy a 22% alatti nedvességtartalmú szubsztráton fumonizintermelés nem történik (Le Bars és mtsai, 1994). Több kutatócsoport (Le Bars és mtsai, 1994; Nelson és mtsai, 1994) szerint a fumonizinek 20-25oC között és 30-32% nedvességtartalomnál termelődnek a legnagyobb mennyiségben. Marín és mtsai (1995) megvizsgálták a hőmérséklet és a vízaktivitás (aw) F. verticillioides és F. proliferatum fumonizin termelésére gyakorolt hatását és megállapították, hogy mindkét faktor értékének növelése (hőmérséklet 26oC; aw 1,0) magasabb fumonizin termelést produkál. Laboratóriumi körülmények között, steril, magas nedvességtartalmú kukorica toxinogén F. verticillioides törzzsel történő beoltásával, nagy FB1 tartalmú gombatenyészet érhető el. Természetesen a toxin mennyiségét nagyban befolyásolja az alkalmazott törzs toxintermelő képessége is (Doko és Visconti, 1994).
18
Mivel a fumonizinek csak 1988 óta ismertek, hiányosak ismereteink azok toxikológiai hatását illetően. A hosszú ideig tartó állatkísérletekhez egyrészt használhatunk tisztított toxint, másrészt a természetben szennyeződött takarmányt. Ez utóbbi az állatkísérletekhez szükséges mennyiséget általában nem tartalmazza, illetve homogenitása nem éri el a kívánatos mértéket. A tisztított toxin használatát pedig annak kereskedelmi ára korlátozza nagymértékben. Ezért olyan állatkísérletek tervezése indokolt, amelyben tenyésztett kultúrát használunk fel. Jónéhány F. verticillioides törzs képes toxint termelni, azonban nagyobb hányaduk nem, vagy csak kis mennyiségben termel fumonizint laboratóriumi körülmények között (Rheeder és mtsai, 2002). Azok az izolátumok, amelyek jó toxintermelők, nehezen hozzáférhetők, különösen, ha azok kategorizálatlanok a vonatkozó irodalomban (Castellá és mtsai, 1999). Az MRC 826 jelű F. verticillioides törzset eredetileg 1975-ben Transkei régiójában, vagyis DélAfrikának azon a területein, ahol a humán nyelőcsőrák magas arányban fordult elő, kukoricából izolálták (Marasas és mtsai, 1984). E törzs tenyészetéből azonosították először a fumonizineket, majd szerkezetüket is meghatározták (Gelderblom et al., 1988). Alberts és mtsai (1990) nem sokkal azután, hogy a fumonizin-kutatások világszerte megindultak azt közölték, hogy saját módszerükkel (3. táblázat) egészszemű kukoricát F. verticillioides (MRC 826) törzzsel beoltva, illetve azt 20oC-on, 13 hétig inkubálva, 17900 mg FB1/kg termelt mennyiséget értek el. Hasonló eredményt értek el az MRC 826 jelű törzzsel Vismer és mtsai (2004) is, folyékony és szilárd táptalajon egyaránt, azonban sokkal rövidebb idő alatt (3. táblázat). Fazekas (1998) a módszerében (3. táblázat) a 14/A jelű törzset használta fel, szintén kukoricán elszaporítva. Azóta ennek a törzsnek a termelése elsőként csökkent, később megszűnt, feltehetően a folyamatos átoltások következtében (Fazekas 2004, szóbeli közlés). Laboratóriumi körülményeink között a fent említett módszerek (Alberts és mtsai, 1990; Vismer és mtsai, 2004) eredményei nem voltak reprodukálhatók (Fodor és mtsai, 2006). Azonos körülményeket és törzset használva, a detektált FB1 koncentráció alacsony volt (244,4 ± 102,5 és 370,0 ± 175,2 mg/kg ), összehasonlítva azokat az eredeti közlésekkel. Valószínűleg ez az első esetben a darált kukorica használatának volt köszönhető, második esetben pedig a médium nagy mennyiségének. Mindkét esetben a tenyészetek befülledtek (Fodor és mtsai, 2006).
19
3. táblázat A vonatkozó módszerek paramétereinek összehasonlítása Módszerek
Alberts és mtsai,1990
Vismer és mtsai, 2004
14/A Czapek-agaron 2 héten keresztül
MRC 826
MRC 826
-
-
Ismeretlen spóraszám
Ismeretlen spóraszám
200 g szemes kukorica és 100 ml víz Egy éjszakán át
400 g szemes kukorica és 400 ml víz 1 óra 1 óra, 121oC, 120 kPa, 2 egymást követő nap 2 literes gyümölcs befőző üveg, inkubátorban 25oC sötét 17 hét Nincs információ
Vonatkozó publikációk
Fazekas, 1998
Törzs A törzs felszaporítása agaron Oltóanyag
Közeg Áztatás Autoklávozás A médium előkészítése
Hőmérséklet Fényviszony Időtartam
2 literes gyümölcs befőző üveg, zárt helységben 25oC Sötét 4 hét
Felrázatás
1 hétig naponta
Termeltetés eszköze
Kondíciók
1 óra, 121oC, 120 kPa, 2 egymást követő nap
Fumonizin termelés 4 hét alatt (mg/kg)
7300
9300
Standardizált spóraszám (1x106 spora/ml) 30 g darált kukorica és 30 ml víz 1 óra 1 óra, 121oC, 120 kPa, 2 egymást követő nap 18 cm átmérőjű petri csésze, inkubátorban 25oC Sötét 2 hét ≈ 8000 (14 nap alatt)
A különböző toxikológiai vizsgálatok lebonyolítása elképzelhetetlen az ezekhez szükséges és megfelelő mennyiségű fumonizin nélkül, ezért szükség lenne egy költség-hatékony, laboratóriumi körülmények között reprodukálható fumonizintermeltetési módszerre.
20
2. 4. A fumonizinek kémiai szerkezete, sejtszintű hatásmechanizmusuk 2. 4. 1. A fumonizinek kémiai szerkezete, kimutatásuk analitikai lehetőségei Az 1988-ban izolált toxin kémiai szerkezetére is fény derült (Bezoidenhout és mtsai, 1988). A fumonizinek egymással szoros rokonságban lévő poláros jellegű vegyületek. Jelenleg 12 fumonizinszármazék ismert. A FB1 kémiailag 1,2,3trikarballilsav,1,1’-[(12-amino-4,9,11-trihidroxi-2-metiltridecil)-2-(1-metilfenil)1,2-etándiyl] észter, (C34H59NO15. Molekula tömeg: 721.838) (Marasas és mtsai, 2000). Molekulaszerkezetet tekintve (1. ábra) a fumonizinek egy húszatomos, nyíltláncú szénvázból épülnek fel, ezen a láncon három hidroxilcsoport, két trikarballilsav-csoport (TCA) és egy aktív aminocsoport helyezkedik el. A TCAcsoportok lúgos hidrolízissel részlegesen vagy teljesen eltávolíthatók (Maragos, 1997). A fumonizin B1, B2, B3 és B4 toxinban a második szénatomon aminocsoport található, a fumonizin A1, A2 toxinokban pedig acetil-amino-csoport van (Bezoidenhout és mtsai, 1988; Cawood és mtsai, 1991). Később vált ismertté a fumonizin BC1 szerkezete, ahol az első metilcsoport hiányzik. 1996-ban fedeztek fel egy újabb típusú fumonizin-csoportot; első tagját FP1-3-nak nevezték el, melyet F. verticillioides tenyészetéből izoláltak. E vegyület jellemzője, hogy a 2-es szénatomon az aminocsoport helyett 3hidroxipiridin gyűrű helyezkedik el (EFSA, 2005). A F. verticillioides toxintermelése során különböző arányban képződik FB1, FB2 és FB3. Vizsgálatok alapján kukoricában a természetes kontamináció során a FB1-FB2 3:1 arányban, a FB1-FB3 pedig 12:1 arányban képződik (Weidenbörner, 2001). O
COOH COOH
OH
NH2
14
H3C OH
OH
CH3
CH3 O
CH3
15 O
COOH O
COOH
1. ábra A fumonizin B1 kémiai szerkezete
21
A dél-afrikai PROMEC csoport által kifejlesztett HPLC módszer bizonyult a leghatékonyabbnak kukorica, illetve kukoricatartalmú takarmányok, valamint élelmiszerek fumonizin-szennyezettségének meghatározására (Shephard és mtsai,1996a). A módszert az AOAC szervezete 1996-ban hivatalosan is elfogadta (Sydenham és mtsai,1996). Az extrahálást metanol-víz eleggyel végzik, a kivonatot meghatározott SAX („strong anion exchanger”) SPE- (solid phase extraction) oszlopon tisztítják. A fumonizineket o-ftáldialdehiddel (OPA) való származékképzést követően fordított fázisú (reverz phase, RP) analitikai oszlopon választják el. Az erősen fluoreszkáló fumonizin-származékokat fluoreszcenciás detektoron határozzák meg. Ezzel a módszerrel lehetővé vált takarmányokban, illetve élelmiszerekben az FB1, FB2, FB3 0,05 mg/kg pontossággal történő meghatározása (Sydenham és mtsai,1996). A fumonizinek meghatározására gázkromatográfiás eljárásokat is kidolgoztak. A módszer érzékenysége növelhető, ha detektorként tömegspektrométert alkalmaznak. Mivel ez a módszer igen bonyolult és költséges, rutinszerű alkalmazása korlátozott. A módszer további hátránya, hogy a gázkromatográfiás elválasztáshoz a fumonizin-molekulát hidrolizálni kell (Plattner és mtsai, 1990; Sydenham és mtsai, 1990; Wilson és mtsai, 1990). Az antigén-antitest reakción alapuló immunkémiai módszerek, mint pl. az ELISA (enzim-immunanalitikai) technika mikotoxinok gyors szűrővizsgálatára külföldön már elfogadott és elterjedt. Előnye az egyszerű mintaelőkészítés, a sorozatvizsgálat lehetősége és az előbbi módszerekhez képest sokkal olcsóbb műszerek (pl. fotométer) használata (Barna-Vetró és mtsai, 2000). 2. 4. 2. A fumonizinek hatásának biokémiai és sejtbiológiai háttere A fumonizin B1 hatásmechanizmusának tisztázására számos vizsgálat zajlott, bár az teljes egészében a mai napig sem ismert. Elsőként Wang és mtsai (1991) írták le, hogy a FB1 a szfinganin szerkezeti analógja, majd ez a megfigyelés vezetett el ahhoz a felfedezéshez, hogy a FB1 specifikus támadáspontja a szfinganin- és szfingozin-N-acetiltranszferáz (ceramidáz vagy ceramid szintáz). A szfingolipidek a membránok szerkezetének a felépítésében, és ezzel igen nagyszámú sejtfunkcióban és ezek szabályozásában vesznek részt (Bell és mtsai, 1993). A szfingolipidek csaknem minden sejt membránjában jelen vannak, legnagyobb mennyiségben a központi idegrendszer fehérállományában (Ádám és mtsai, 1996). A szfingolipidek közös tulajdonsága, hogy vázukat a szfingozin alkotja (1,3-dihidroxi, 2-amino vegyület) (2. ábra). A komplex szfingolipidekben a szfingozinhoz amid formában egy zsírsav és egy
22
poláros feji rész (amely lehet egy egyszerű foszfo-diészter és egy komplex szénhidrát is) kapcsolódik (Merrill és Sweeley, 1996). A szfingolipidek szintézisének első lépése a szerin kapcsolódása a palmitinsavat vagy sztearinsavat szállító CoA-val (palmitinsav:sztearinsav=5:1), és a keletkező 3-ketoszfinganin redukálódik szfinganinná, NADPH közreműködésével. A szfinganin ezután acilálódik dihidroceramiddá, ceramid szintáz enzim által, különböző zsírsav-acil-CoA-t (sztearinsav>lignocerilsav>palmitinsav>olajsav) használva. Ezt követően különböző kémiai vegyületek kapcsolódhatnak az αhidroxil csoporthoz. A 4-es és 5-ös szénatom közötti kettős kötés a dihidroceramid-dehidrogenáz enzim által azután alakul ki, hogy a szfinganin amino csoportjának acilezése már megtörtént (Michel és mtsai, 1997). A szabad szfingozin nem egy közbenső láncszeme a de novo szfingolipid bioszintézisnek, hanem a ceramid lebomlása kapcsán alakul ki (Merrill, 1991; Rother és mtsai, 1992). A ceramid szintáz interakcióba léphet a FB1-el, egyrészt a szabad aminocsoporton, másrészt a két trikarballilsav-csoporton keresztül is (Merrill és mtsai, 1996; Humpf és mtsai, 1998). A ceramid szintáz gátlása (3. ábra) különböző úton tudja megváltoztatni a sejtek normál működését. Ismert módon a membrán stabilitásért elsődlegesen a szfingomielin felelős, amelyet az is bizonyít, hogy a membránban szfingomielináz hatására a szfingomielin lebomlása a sejt lízisét idézi elő. Így, a szfingomielin szintézisének gátlása eredményezheti a késleltetett nekrózis mechanizmusát, úgy, mint az ELEM és a PPE esetében is. A szfingomielinek szintézisébe történő beavatkozást támasztja alá az is, hogy a toxin sejttoxikus hatásához legalább 24 óra inkubációs idő szükséges (Shier, 1992), mivel a szfingomielin sejtből való kiürítése, illetve a metabolitok akkumulációja is viszonylag hosszú időt igényel, noha a FB1 nem mindegyik biológiai hatása késleltetett. Így például Wattenberg és mtsai (1996) azt tapasztalták, hogy az ún. mitogén-aktivált protein (MAP) kináz már 10 percen belül aktiválódott. Pinelli és mtsai (1998) hasonlóan gyors hatását figyelték meg, amikoris a FB1 az arachidonsav-kaszkádba avatkozott be. Ezek a rendkívül gyors beavatkozások nem a szfingomielinnel lehetnek kapcsolatban. Ismertek egyéb mechanizmusok is a FB1 hatásának kiváltására. A szfingozin másodlagos messenger szerepet tölt be (Hannun és mtsai,1989), szabályozva ez által olyan folyamatokat, mint pl. a fehérje foszforiláció. A szfingozin felszaporodása gátolja a protein-kináz C-t (Hannun és mtsai, 1986). A ceramid szintáz termékei, a ceramidok a szfingozin N-zsírsav származékai, amelyek szintén szekunder messenger szerepet töltenek be, és feltételezik, hogy tumorszuppresszor lipidként funkcionálnak (Hannun és mtsai, 1993). FB1 hatására nemcsak a szfingoid bázisok aránya változik meg, de a ceramidok szöveti
23
koncentrációja is lecsökken, tehát ezek együttes koncentrációjának, illetve arányainak megváltozása állhat a másodlagos közvetítő szerepük csorbulásának hátterében. A fumonizin nemcsak a szfingolipidek koncentrációjának megváltoztatásában játszik közvetlenül szerepet, de mint szfingozin analóg is kifejthet káros hatást. Ez a tény magyarázatul szolgálhat az említett nagyon rövid idő alatt (10 perc) is kifejtett hatására (Wattenberg és mtsai, 1996). A legújabb megfigyelés szerint a hidrolizált FB1 (HFB1) átalakulhat egy ceramid analóggá (2.5. fejezet), amely kifejezettebb sejttoxicitást mutat (Humpf és mtsai, 1998); ez újabb magyarázatként szolgálhat hatásmechanizmusának megfejtésében. Kevés adat ismert erről a ceramid analógról, de feltételezik, hogy antagonistája a tumor-szuppresszor ceramidoknak (Humpf és mtsai, 1998). Ez a mechanizmus csak a hidrolizált FB1 esetében (HFB1) képzelhető el, hiszen ez a ceramid analóg a szfingolipidek bioszintézise közben, a FB1 teljesen hidrolizált metabolitjából alakul ki (2.5. fejezet) (Shier, 2000). Számos vizsgálat azt jelzi, hogy a szabad szfinganin és szfingozin arány növekedése hasznos biomarker az állatok fumonizin felvételének igazolására (Wang és mtsai, 1992; Riley és mtsai, 1993, 1994).
H C=C
Szfingozin H CH
Szfinganin
CH
OH
H
OH
C
C
CH2
H H
NH3+
OH
H
OH
C
C
CH2
H H
NH3+
2. ábra A szfingozin és szfinganin kémiai szerkezete
24
3. ábra A szfingolipid metabolizmus gátlása FB1 által A 2.2.1. fejezetben már részletesen kifejtettem, hogy a fumonizinek idő- és koncentrációfüggően károsítják a szfingolipid metabolizmust, amelyeknek fajonként –kissé meglepő módon– eltérő következményei vannak. Az egyetlen közös vonás a különböző állatfajokban jelentkező kórképekben, hogy valamennyi állatfajban az adott betegséget jellemző specifikus kórkép (agylágyulás, tüdővizenyő) mellett, enyhébb-súlyosabb formában májkárosodás is kialakul. Ez valószínűleg a máj magas ceramidáz enzim tartalmával hozható összefüggésbe. A FB1-toxikózis legkorábbi és legérzékenyebb indikátora, a szabad szfinganin mennyiségének megemelkedése, amely a már 10 éve kidolgozott analitikai módszereknek köszönhetően (Shephard és mtsai, 1996b) szövet-, vizelet- és vérminták viszonylag kis mennyiségéből kimutatható. Számos in vivo vizsgálatot végeztek, többek között fumonizintartalmú takarmánnyal etetett lovak szérumának szfingozin és szfinganin szintjét mérték (Wilson és mtsai, 1990; Ross és mtsai, 1991, 1992; Wang és mtsai, 1992; Wilson és mtsai, 1992). Mindkét marker szintje a FB1 bevitel arányában emelkedett, de a szfingoziné sokkal kisebb mértékben. A változások előbb észlelhetők voltak, mint a máj érintettségére utaló szérum enzim aktivitásának az emelkedése. A Sa:So arány esetében hasonlót tapasztaltak a szérumban és szövetekben (máj, tüdő, vese) egyaránt.
25
Van der Westhuizen és mtsai (1999) összehasonlítást végeztek olyan területen élő emberek vérplazmájának és vizeletének Sa:So arányára vonatkozóan, akik magas toxinkoncentrációjú (580 µg/kg) kukoricát fogyasztanak (Transkei tartomány keleti partvidéke), azokon a területeken élőkkel (dél-afrikai Kwa Zulu-Natal körzet, kenyai Bomet körzet) összevetve, ahol a kukorica szennyezettsége minimális (< 10 µg/kg). A vizsgálatok eredményei szerint nem volt szignifikáns különbség a Sa:So arányban. A szerzők szerint a Sa:So arány humán vonatkozásban nem diagnosztikai biomarker, feltehetően az embert érő jóval alacsonyabb mértékű expozíció miatt (Van der Westhuizen és mtsai, 1999).
2. 5. A fumonizin B1 metabolizmusa, kinetikája 2. 5. 1. Ismert metabolitok szerkezete, kialakulása A fumonizin B1-nek ma már több metabolitja is ismert (4. ábra). Arra vonatkozóan azonban csak utalások ismertek, hogy fumonizintartalmú takarmány vagy élelmiszer fogyasztását követően az eredeti fumonizin molekula az emésztőkészülék mely szakaszában alakul át. Kevés információ áll rendelkezésre atekintetben is, hogy milyen mértékben alakul át, illetve, hogy az esetlegesen kialakuló metabolitok felszívódnak–e, valamint hogy a fumonizin és annak metabolitjai milyen arányban ürülnek ki a szervezetből. Mivel a FB1 kinetikájával foglalkozó kísérletekben a toxint általában 14C-el jelölték, így a metabolizmus helye és pontosan meghatározott mértéke ismeretlen. Ismertek azonban olyan eredmények is, amelyek azt valószínűsítik, hogy a FB1 a bélben metabolizálódik. Ennek tárgyalása előtt ismertetem a FB1 eddig leírt és azonosított metabolitjait (Shephard és mtsai, 1994a, 1995; Humpf és mtsai, 1998): az aminopentol (AP1 vagy HFB1; fully hydrolyzed FB1), amelyben a FB1 mindkét trikarballilsav (TCA; tricarballylic acid; 1,2,3-propán-trikarbonsav) csoportja hidrolizálódott, a monoészter C22-amino-alkohol (részben hidrolizált forma; PHFB1; partially hydrolyzed FB1); két formája ismert: az egyik formája (PHFB1a) úgy alakul ki, hogy az eredeti FB1 molekulában a 14. szénatomon lévő TCA-csoport hidrolizálódik, míg a másik forma (PHFB1b) kialakulásakor a 15. szénatomon helyet foglaló TCA-csoport hidrolizálódik, az N-palmitoil-AP1 (PAP1), amely az AP1-ből úgy alakul ki, hogy az amino-csoporthoz palmitinsav kapcsolódik. a szabad amino-csoport eltávolításával (monoamino-oxidáz) kialakuló származék.
26
Az eddigi tapasztalatok alapján ez utóbbi kialakulása a szervezetben nem jellemző. Kialakulásakor a FB1 gyakorlatilag inaktívvá válna, mivel a szabad amino-csoport kulcsszerepet játszik a biológiai aktivitásában (Shier, 2000). A fent felsorolt, többi metabolit azonban élelmiszer- és takarmánykezelési eljárások során, illetve kérődző és monogasztrikus állatok emésztőkészülékében, továbbá a máj xenobiotikum-transzformáló enzimrendszere által is kialakulhat.
4. ábra A fumonizin B1 ismert metabolitjai A metabolitok közül először az aminopentol vált ismertté. Az aminopentol a FB1 teljes mértékben hidrolizált származéka, amely gyorsan és hatékonyan kialakulhat bizonyos élelmiszer-, illetve takarmánykezelési eljárások során is. A Közép- és Észak-Amerikában, Mexikóban és Dél-Afrikában alkalmazott és nixtamalizációnak nevezett kezelés során a kukoricát először lúgos közegben (kalcium-hidroxid) főzik, majd áztatják, legvégül pedig a négyszer-ötször tiszta vízzel átöblített terméket („nixtamal”) egyes helyeken le is őrlik („masa vagy tortilla liszt”). Az eljárás a „nixtamal” terméket jobb hatékonysággal őrölhetővé
27
teszi és a „masa”, mint az őrlés végterméke a tésztakészítés számára ideálisan ragacsos, struktúráját tekintve kedvezőbb, majd a sütés után kevésbé szakadékony lesz (Gelderblom és mtsai,1992). Korán ismertté vált, hogy a perikarpium eltávolítása (a nixtamal esetében is) a kiindulási termék mikotoxin tartalmát jelentősen csökkenti, viszont az csak később derült ki, hogy egyes mikotoxinok (pl. a fumonizin B1) a körülmények hatására metabolizálódnak. Palencia és mtsai (2003) vizsgálata alapján az eljárással 50%-ra redukálható a kukorica eredeti fumonizin B1 tartalma, de a termékben maradt fumonizin 100%ban teljesen hidrolizált formában (aminopentol) van jelen. 1998-ig a figyelem csak a FB1-re és az AP1-ra irányult. Ellentétes közlések születtek arról, hogy melyik vegyület toxicitása nagyobb, melyik szívódik fel nagyobb mértékben. Norred és mtsai (1993) 0,5 mg/kg dózisban FB1-et patkánnyal etetve a felszívódás mértékét magasabbnak találták, mint Shephard munkacsoportja (1992a), akik 7,5 mg/kg mennyiséget alkalmaztak. Általában a poláros és az ionos jellegű anyagok felszívódása transzport fehérjék nélkül gyenge (Rosman és Klaassen, 1996). A FB1 molekula egyetlen tiszta negatív töltése valószínűtlenné teszi a passzív felszívódásának lehetőségét a membrán lipidfázisán keresztül. A legvalószínűbb transzportprotein a FB1 esetében az epesavakat szállító fehérje (Wong és mtsai, 1994). Ha a FB1 biológiai hozzáférhetősége limitált a transzport fehérjék hozzáférhetőségéből adódóan, az abszorpció telítetté válhat és alacsony mértékű felszívódást idézhet elő (Shier, 2000). Ez magyarázatként szolgálhat a dózis-függő felszívódás esetén tapasztalt csökkenő tendenciára a fent említett kísérletekben (Shephard és mtsai, 1992a ; Norred és mtsai, 1993). Korábban viszont a FB1 felszívódását egyszerű diffúziós folyamatként írták le, mivel vese LLC-PK1 sejt [14C] FB1 felvétele már 4-6 óra elteltével megközelítette az extracelluláris [14C] FB1 koncentrációt. Gelderblom és mtsai (1992) azt feltételezték, hogy a HFB1 (AP1) kisebb mértékben szívódik fel, mint a FB1. Ezt azzal magyarázták, hogy a két trikarballilsav oldalláncnak nagy szerepe lehet a felszívódásban. Hopmans és mtsai (1997) viszont azt közölték, hogy mivel az AP1 kevésbé poláros a két trikarballilsav-csoport hiánya miatt, ezért az könnyebben szívódik fel. A HFB1 egy pozitív töltéssel rendelkezik. A pozitív töltése, illetve a mérsékelten apoláros karaktere a P-glikoprotein potenciális szubsztrátjává teszi, amely egy fontos „efflux” transzporter a kefeszegély membránokban. A P-glikoprotein megakadályozza az alkaloidok és más pozitív töltésű amfipatikus anyagok vérbe kerülését, azáltal, hogy azokat visszapumpálja a bél lumenjébe (Hunter és Hirst, 1997). Nagy valószínűséggel a HFB1 viszonylag alacsony hozzáférhetőségét is a P-glikoprotein által mediált „efflux” okozza (Caloni és mtsai, 2005).
28
A két vegyület toxikusságát, illetve a vegyületek e tekintetben való különbségeit vizsgálták in vivo, in vitro, rövid és hosszú ideig alkalmazott terhelés esetében is. A HFB1 megtartja biológiai aktivitását (Abbas és mtsai, 1993), bár –a FB1-el ellentétben– nem hatékony a ceramid szintáz gátlásában. A ceramid szintáz interakcióba lép a FB1-el egyrészt a szabad amino-csoporton, másrészt a két trikarballilsav-csoporton keresztül. Ebből kifolyólag a FB1 jobb inhibitora a ceramid szintáz enzimnek, mint a hidrolizált fumonizin B1 (Merrill és mtsai, 1996). Van der Westhuizen és mtsai (1998) in vitro, patkány primer hepatocitákon vizsgálták a két vegyületnek a ceramid szintázra gyakorolt hatását. 1 µM FB1-et és AP1-et adagoltak a sejttenyészetekhez és 40 órán keresztül inkubálták, majd HPLC-vel mérték a produkált Sa és So szinteket. Az FB1 esetében a Sa mennyisége emelkedett, ami a ceramid szintáz erős gátlását jelzi. AP1 esetében viszont csak a So koncentrációja nőtt, ezért úgy gondolták, hogy a TCA-csoport hiánya csökkenti a származék ceramid szintáz gátló képességét. Norred és mtsai (1997) megfigyelték, hogy rövid idejű terhelés (max. 40 óra) esetében az AP1 30-40%-kal gyengébb hatást tudott kifejteni a ceramid szintázra. Voss és mtsai (1996) arról számoltak be, hogy patkányoknak 4 héten keresztül adagolt 58 mg HFB1 (AP1)/tak.kg nagyobb mértékű máj- és vesekárosodást okozott, mint 71 mg/kg FB1, azonos ideig adagolva. Ezt a váratlan eredményt nem tudták magyarázni. Shephard és mtsai (1995) megállapították, hogy a PHFB1 a FB1-HFB1 átalakulásban egy átmeneti vegyületként (PHFB1a, PHFB1b) jelenik meg; egyensúlyi állapotban arányuk PHFB1a:PHFB1b = 55:45. Később Humpf és mtsai (1998) beszámoltak egy új metabolitról. Megállapították, hogy a FB1 nem acilálódik a ceramid szintáz által, de ha a TCA oldalláncok hidrolizálódnak (ezáltal kialakul az aminopentol vagy AP1), átalakul a FB1, mint inhibitor, szubsztráttá. Az AP1 elfoglalja a szfingoid bázisok helyét és a CoA a szállított zsírsavat az AP1 molekula aminocsoportjához köti, miáltal létrejön egy új származék, az N-palmitoil-AP1 (PAP1) (5. ábra).
29
5. ábra A szfinganin acilációjának gátlása AP1 által, az AP1 acilációja, majd a ceramid szintáz gátlása a PAP1 származékkal (Humpf és mtsai, 1998) Ezután kezdődtek meg a különböző metabolitok és analógok hatásainak mélyebb vizsgálatai. Kiderült, hogy a szintetikus PAP1 minden eddig ismert származéknál toxikusabb és karcinogénebb. Ezutóbbi mechanizmusa nem ismert, de a legegyszerűbb magyarázat az lehet, hogy a PAP1 interakcióba léphet a hidrofób kötőhelyekkel (Humpf és mtsai, 1998). Ez okozhatja, hogy az AP1-et hosszabb ideig (4 hét) patkányoknak adagolva, az súlyosabb máj- és vesekárosodást idézett elő már alacsonyabb dózisban is, mint az FB1 (Voss és mtsai, 1996) annak ellenére, hogy ezt a hatást sejttenyészeteknél egyáltalán nem sikerült kimutatni. Néhány afrikai régióban a tortillában 185 mg/kg AP1-et detektáltak (Meredith és mtsai, 1999). Ha a PAP1 az AP1 mennyiségének arányában alakul át a szervezetben, akkor érthető, miért szignifikánsan magasabb a nyelőcsőrák előfordulása ezekben a régiókban. A PAP1 hidrofób tulajdonságokkal rendelkezik (szemben a többi FBs származékkal), így akkumulálódhat a zsírszövetben is. Ha a FB1 nem a vastagbélben, hanem pl. a májban vagy a vékonybélben metabolizálódna (először tehát AP1-é), akkor hosszú idejű terhelésnél sokkal nagyobb toxicitásra utaló tüneteket tapasztalnánk, mivel az AP1 bizonyos idő alatt átalakulna a fent említett, sokkal toxikusabb termékké. A FB1 valószínűleg a vastagbél egyik szakaszában alakul át AP1-é (ahonnan viszont már nem szívódik fel). Ugyanakkor in vivo kísérletekben általában (a következő néhány kivételtől eltekintve) nem detektáltak metabolitokat. Rice és Ross (1994) szerint jelentős különbség van kérődző (szarvasmarha, juh; n=5) és nem kérődző (patkány; n=5) állatfajok bélsárral történő FB1 származékok kiürítési arányában. A szerzők szerint kérődzők esetében a bélsárban detektált összes fumonizin származék 60-90%-a hidrolizált (részlegesen és/vagy teljesen). Ez alapján azt feltételezték, hogy a bendő mikroflórája a metabolitok kialakítása révén csökkentheti a FB1 biológiai hozzáférhetőségét. Patkány bélsarában a
30
változatlan FB1 forma volt a domináns (65%). Rice és Ross (1994) a metabolitok kimutatására kevert standardokat használtak, így a különböző metabolitok (AP1, PHFB1) arányát a kromatogramokon észlelt csúcsok helye és területe alapján csak becsülni tudták. Caloni és mtsai (2000) modell bendőt használva, illetve bendőfolyadékban FB1et 72 órán át inkubálva egyáltalán nem tudtak metabolitokat kimutatni. Shephard és mtsai (1994a, c; 1995) [14C]-FB1-et adagoltak i.v. és intragasztrikusan vervet majmoknak. Az aktivitás mellett a bélsár és az epe FB1 és annak metabolitjai tartalmát is analizálták, és ezek mennyiségét külön értékelték. Eredményeik szerint (24 órás mintagyűjtést követően) a bélsár egyaránt tartalmazott FB1-et, illetve annak részlegesen hidrolizált származékát (PHFB1a), míg aminopentolt csak nyomokban tudtak analizálni. Az epe nem tartalmazott metabolitokat, amiből arra következtettek, hogy a FB1 csakis a bélben metabolizálódhat. A fent említett, vervet majmokkal végzett kísérlettel ellentétben patkányok esetében a bélsár nem tartalmazott metabolitokat (Shephard és mtsai, 1992b). Meg kell említeni, hogy már a takarmány előkészítése során is kialakulhatnak olyan származékok, amelyek biológiai hozzáférhetősége nagyobb, majd ezek felszívódását követően a szervezeten belül visszakonvertálódhatnak az eredeti formába. Shier és mtsai (1997; 1999) foglalták össze, hogy a kukorica hőkezelése során FB1-fehérje komplex alakul ki. Első lépésként pörkölés során egy vízmolekula lép ki az egyik trikarballilsav oldalláncról, amelynek eredményeképpen kialakul egy FB1-anhidrid. Az anhidrid rész ezután reakcióba léphet szabad aminocsoportokkal, amely leggyakrabban egy lizin molekulából származik (Shier, 2000). Izotópos vizsgálatok alátámasztották, hogy a kukorica FB1 tartalmának kb. 25-50%-a kovalens kötést létesít fehérjékkel (cit. Shier, 2000). Az említett FB1-fehérje (vagy aminosav, általában lizin) komplexek élelmiszerbiztonsági kockázata nagyobb, mint az eredeti FB1-é, ugyanis ezek sokkal könnyebben felszívódnak az oligopeptid transzporterek közvetítése révén (Tsuji és Tamai, 1996). Természetesen a kinetikai kísérletekben a jelölt vagy a jelöletlen FB1-et nem a pelletálás előtt keverték a takarmányhoz, egyrészt, mert a takarmány gyártó gépek szennyeződhetnek, másrészt pedig, mert a legkisebb pelletálásra használt méret is túl nagy a tipikus toxikokinetikai vizsgálatokban alkalmazottakhoz. 2. 5. 2. Toxikokinetikai vizsgálatok A FB1 kinetikájával kapcsolatos kevés és ellentmondásos információ alapján nehéz értékelni a FB1 szervezeten belüli útját, továbbá az onnan történő kiürülését; ezáltal a kockázatbecslés is nehézségekbe ütközik.
31
Szarvasmarhán, baromfin, sertésen és majmokon végzett vizsgálatok szerint a FB1 szinte alig szívódik fel a tápcsatornából (elhanyagolható, kisebb, mint 4%-a a bevitt dózisnak), gyorsan eléri a maximális koncentrációt a vérben, majd rövid idő alatt kiürül a szervezetből (Galtier, 1998). A FB1 toxikokinetikája 1992-1996 között az aktívan tanulmányozott területek közé tartozott, Dél-Afrikában, Kanadában és az USA-ban is. A legtöbb ezzel kapcsolatos közleményt Gordon S. Shephard munkacsoportja adta közre. Az első ilyen munka 1992-ben jelent meg, amikor Shephard és mtsai (1992a) a jelöletlen FB1 (intraperitoneális adagolás; 7,5 mg/kg) alacsony mértékű, de gyors felszívódását tapasztalták patkányokban. A maximális, plazmában mérhető koncentrációt 20 percben, a toxin felezési idejét pedig 18 percben határozták meg. Még ugyanebben az évben ez a munkacsoport jelölt (14C) FB1-et használva, intraperitoneális injektálás (7,5 mg/kg) után 24 órával, szintén patkányoknál, a beadott dózis 66%-át a bélsárban, 32%-át a vizeletben, 1%-át a májban és csak csekély hányadát találták a vesében és az egyéb szervekben (Shephard és mtsai, 1992b). Norred és mtsai (1993) hasonló eredményeket kaptak patkánynál, bár nagyobb koncentrációban detektáltak toxint a szövetekben. 96 órával a gyomorszondán keresztüli adagolást követően (5 mg/kg) a beadott mennyiség 80%-át a bélsárban, 3%-át a vizeletben, 0,5%-át a májban, 0,2%-át pedig a vérben, illetve az egyéb szövetekben mérték. Ezzel szemben 96 órával i.v. adagolás után (22,5 mg/kg), a toxin 35%-a a bélsárban, 10%-a a vizeletben, 25%-a a májban és 7%-a a vesében volt jelen. Az epevezetékbe kanült ültettek, hogy meghatározhassák az epén át történő ürülés mértékét. Vemhes patkányt i.v. [14C]-FB1-el kezelve 1 órával a beadás után a teljes beadott dózis 14,5%-át a májban, 4%-át a vesében, míg 0,24-0,44%-át a méhben, 0,04%-át a placentákban (egyenként), 0,015%-át pedig a magzatokban (magzatok/anya) mérték (Voss és mtsai, 1996). A toxin placentán való átjutását Collins és mtsai (1998a,b) (patkány) és LaBorde és mtsai (1997) (házinyúl) nem tudták igazolni. Ezzel szemben egy hazai kísérlet során vemhes kocákat fumonizin B1 (300 mg/kg) tartalmú takarmánnyal etetve a magzatok károsodtak (Zomborszky-Kovács és mtsai,1997b). Shephard munkacsoportja (1994b) jelölt FB1-et 7,5 mg/kg dózisban patkányoknak intraperitoneálisan adagolt, nagy figyelmet fordítva az epén keresztüli eliminációra. Megfigyelték, hogy 24 órás időszak alatt 67% ürült az epén keresztül, ennek 88%-a az első 4 órában, 95%-a változatlan kémiai formában. Ezzel ellentétben, a szervezetbe juttatott dózisnak csak 0,2%-a ürült az epével, ha a toxint gyomorszondán keresztül adagolták. Ugyanez a munkacsoport (Shephard és Snijman, 1999) a [14C]-FB2 kinetikáját is tanulmányozta patkányokban (7,5 mg/kg) és vervet majmokban (2 mg/kg) is. A FB2 esetében a FB1-gyel végzett kísérletek eredményeihez hasonlókat
32
tapasztaltak. Az FB2-nek kisebb a biológiai hozzáférhetősége, mint a FB1-nek, és ezzel arányban, alacsonyabb mennyiségben ürül az epével is (Shephard és Snijman, 1999). Shephard és mtsai (1994a) hasonló eredményeket kaptak a [14C]-FB1 (1,6 mg/kg; i.v.) esetében, vervet majmokat vizsgálva. Intravénás adagolás után a toxin plazmában mért felezési ideje 40 perc volt. 5 nap után összesen 47%-ot nyertek vissza az exkrétumokkal, ennek 72%-a a bélsárban, 28%-a pedig a vizeletben volt mérhető. A bélsár FB1 tartalma részben hidrolizált volt. Ezzel ellentétben 3 nap alatt a gyomorszondán keresztüli adagolást ([14C]-FB1) követően (8 mg/kg) 60% a bélsárban, 12% az intesztinális tartalomban, 1,2% a vizeletben, 1% az izomban és 0,4% a májban, illetve nyomnyi mennyiség az egyéb szervekben volt jelen. A hiányzó hányad hollétét nem tudták meghatározni. A bélsárban mért összes FB1 egyharmada részlegesen hidrolizált volt. Shephard és mtsai (1995) [14C]-FB1 iv. (egyszeri dózis; 1,72 mg/kg; n=2) adagolása után 24 órával 1,92%ot a májban, 0,62%-ot az izomban, 0,14%-ot a vesében, összesen 64%-ot pedig a bélsárban, epében és a béltartalomban találtak. Ezzel ellentétben, ha a toxint (egyszeri dózis; 6,42 mg/kg; n=2) gyomorszondán keresztül juttatták a szervezetbe, 0,64% volt a májban, 0,14% az izomban, 0,03% a vesében, és összesen 68% a bélsárban, az epében és a béltartalomban. Az epében vizsgált FB1 változatlan formájú volt, a bélsár viszont részlegesen hidrolizált metabolitot (PHFB1a) is jelentős mennyiségben tartalmazott. Ezzel ellentétben nagyságrendekkel kevesebb teljesen hidrolizált FB1 volt kimutatható a bélsárban. A hidrolizált formák megjelenését a bél mikroorganizmusainak tevékenységével magyarázták. Prelusky és mtsai (1994) a FB1 kinetikáját sertésben vizsgálták. 0,4 mg/kg ([14C]-FB1) toxint i.v. adagolva 72 óra elteltével a bélsár a beadott mennyiség 58%-át tartalmazta, a vizelet annak a 21%-át, míg a szövetek a 20%-át. A malacokat epekanüllel látták el, így vizsgálhatóvá vált a toxin enterohepatikus forgalma. I.v. terhelés után a beadott dózis 71%-a jelent meg az epében. A [14C]FB1 orális adagolását követően (0,5 mg/kg) 6%-os biológiai hozzáférhetőséget írtak le. A szervekben azonban csak a tizedére csökkent le a toxinkoncentráció összevetve azt az i.v. adagolás után a szervekben mért koncentrációval. A sertéseken végzett következő vizsgálatukban Prelusky és mtsai (1996b) 24 napig 2-3 mg/kg mennyiségben jelölt (14C) FB1 toxint tartalmazó takarmány etetését követően a legmagasabb toxinszintet (160 és 65 µg/kg) a májban és a vesében mérték sertésben, míg az izom- és zsírszövet toxinmentes maradt. A táp toxinmentesre történő lecserélését követően a szöveti toxinkoncentráció 9 napon belül, azaz relatív gyorsan lecsökkent. Prelusky és mtsai (1995) vizsgálták a toxin kinetikáját szarvasmarha esetében is. Gyomorszondán keresztüli adagolás után (1 és 5 mg/kg) FB1 nem volt
33
detektálható a plazmában, továbbá nem volt elváltozás a plazma Sa:So arányában sem, ami kérődzőknél a toxin alacsony biológiai hozzáférhetőségére utal. Húsmarhákat F. verticillioides gombatenyészettel (530 mg/kg FB1+FB2) etetve Smith és Thakur (1996) azt találták, hogy az adagolt fumonizin túlnyomó része nem-metabolizálódott formában visszanyerhető volt a bélsárban, elhanyagolható mennyiség volt detektálható a vérben és a vizeletben. Mivel a FB1 hidrolizált származéka(i) (HFB1) létrejöhet(nek) az emésztési folyamat során, Hopmans és mtsai (1997) a HFB1 kiválasztását értékelték, összehasonlítva azt a FB1-el, Fischer-344 patkányban. Minden FB1-rokon vegyületet detektáltak a vizeletben és a bélsárban, és arra a következtetésre jutottak, hogy a hidrolizált metabolitok jobban abszorbeálódnak, mint a FB1. Nőstény (Fischer 344NHsd) patkány esetében a beadott hidrolizált [14C]- HFB1nek a 17%-a, a [14C]-FB1-nek pedig a 0,7%-a ürült ki a vizelettel. Ez utóbbi szerzők is arra a következtetésre jutottak, hogy a hidrolizált FB1 nagyobb mértékben szívódik fel, mint a FB1, bár az epén keresztül történő kiürítése a két formának hasonló (Dantzer és mtsai,1999). Caloni és mtsai (2002) humán intesztinális sejttenyészeteken (Caco-2) vizsgálták a FB1-nek és metabolitjainak (HFB1, PHFB1a, PHFB1b) felszívódását, illetve toxicitását. Vizsgálatukban a HFB1 in vitro nagyobb mértékben szívódott fel és proliferációt váltott ki. Az irodalomban fellelhető adatokat összegezve: 1. A FB1-nek orális adagolást követően nagyon alacsony a biológiai hozzáférhetősége patkányban, sertésben, baromfiban, kérődzőkben és majmokban. 2. Majdnem mindegyik (szájon át, i.v., i.p.) tipusú terhelés után rendkívül gyorsan eliminálódik (enterohepatikus forgalom jelentős) a toxin, a bélsár FB1 tartalma nagyrészt változatlan formájú. 3. Még a 12 napot meghaladó etetési kísérleteknél is, a toxin elhanyagolható mennyisége volt kimutatható a májban és a vesében, és ennél is kevesebb volt az egyéb szervekben, szövetekben. 4. HFB1 felszívódása nagyobbnak bizonyult a FB1-hez képest és kiderült, hogy a szervezetben ebből a vegyületből egy rendkívül nagy toxicitással bíró metabolit alakulhat ki. Általánosan elfogadott, hogy a F. verticillioides-fertőzött takarmány fogyasztása az ELEM és a PPE kialakulását váltja ki háziállatokban. A kórképeket házi- és laboratóriumi állatokon egyaránt tisztított FB1-el is reprodukálták. Ennek ellenére nagyszámú, főleg [14C]-FB1-el végzett tanulmány arra enged következtetni, hogy a FB1 felszívódása etetés után nagyon alacsony. Shier (2000) úgy fogalmazott, hogy „ez az állítás abszurd vagy önmagának ellentmondó, de
34
gyakorlatilag tényleges adatokon alapul”. A vita tárgyát „fumonizin paradoxon”ként lehetne megfogalmazni (Shier, 2000), amely kifejezi azt a láthatólag ellentmondó tényt, miszerint a felszívódása alacsony ugyan, mégis jól definiálható, súlyos állat- és humánegészségügyi problémát képes okozni. Shier (2000) 5 pontban foglalta össze a paradoxon lehetséges magyarázatait: 1. Egy ismeretlen, biológiai hozzáférhetőségét tekintve, könnyebben felszívódó toxin áll a hatásmechanizmus hátterében. 2. Dózis-függő felszívódás. 3. Dózisfüggő metabolizmus. 4. A toxin(ok) bioakkumulációja. 5. Olyan FB1 származékok kialakulása, amelyeknek nagy a biológiai hozzáférhetősége. Meg kell azonban jegyezni, hogy szinte minden metabolizmusra irányuló vizsgálatot jelölt és tisztított toxinnal végeztek. A kísérletek során kis egyedszámmal (pl. n = 2 vagy 5) dolgoztak és rövid, esetleg csak egyszeri dózist alkalmazó vizsgálatokat állítottak be. A metabolitok in vivo meghatározását mindössze két munkacsoport kísérelte meg: Rice és Ross, 1994; Shephard és mtsai, 1992b; 1994 a, c; 1995. Shephard és mtsai 1995-ben végzett kísérlete az előzőekhez képest annyiban biztosított több információt, hogy a FB1-et egy sokkal nagyobb (50 kBq/mg) specifikus aktivitással bíró radioaktív anyaggal jelölték. A kísérletek során csak a bélsár, a vastagbéltartalom és a vizelet fumonizin-tartalmát mérték. Shephard és mtsai egyik kísérletükben (1995) ugyan célul tűzték ki a vékonybél különböző szakaszaiból nyert chymus toxintartalmának meghatározását is, de ez meghiúsult, mivel az állatok leölésekor fellépő stressz, illetve a leölés előtti 24 órás koplaltatás a vékonybelek kiürülésével járt együtt. Így a vékonybéltartalomban (ahonnan a metabolitok, főleg a HFB1 még felszívódhat) esetlegesen előforduló metabolizmus ismeretlen maradt. Nem elhanyagolható tény továbbá az sem, hogy a 90-es évek derekán végzett kísérletekben az analitikai módszerek érzékenysége nagyságrendekkel kisebb volt (0,5-1 µg/g, ma kb. 2-10 µg/kg). Egyetlen kísérlet (Shephard és mtsai, 1995) során használtak csak tisztított és nem „elegy” („mixture”) standardokat a metabolitok külön-kölön történő meghatározása céljából. A kísérleteket legtöbbször patkányokkal és/vagy majmokkal végezték; sertésben ilyen irányú komplex, átfogó vizsgálat eddig nem történt. Saját kísérletsorozatunkban törekedtünk minden fent említett hiányosságot kiküszöbölni, hogy választ kapjunk a célkitűzésben megfogalmazottakra.
35
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. A fumonizin B1 laboratóriumi úton történő előállítása A toxintermeltetés célja az állatkísérletek kivitelezéséhez nélkülözhetetlen, kellő mennyiségű fumonizin B1 toxin előállítása volt. 3. 1. 1. F. verticillioides gombatenyészet előállítása, toxintermeltetés körülményei Laboratóriumi körülményeink között a szakirodalomban (2.5. fejezet; 3. táblázat) fellelhető fumonizin-termeltetési módszerek (Alberts és mtsai, 1990; Fazekas, 1998; Vismer és mtsai, 2004) eredményei nem voltak reprodukálhatók, így a már előzetes tapasztalatok alapján, illetve az említett módszerek módosításával megkíséreltük a fumonizinek kukorica szubsztrátumon történő előállítását. A toxintermeltetés során az eljárásunk alapját minden esetben a Fazekas-féle módszer (Fazekas, 1998) képezte, azonban az általunk használt törzs az 1975ben Transkeiben, Dél-Afrikában izolált, F. verticillioides MRC 826 (South African Medical Research Council, MRC) (Marasas és mtsai, 1984), és nem pedig az eredeti módszerben közölt 14/A jelű volt. Magyarországon a törzset a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében tartják fenn. A kísérletek során három nélkülözhetetlen, a toxintermelést nagyban befolyásoló tényezőt vettünk figyelembe, amelyeket bizonyos konstans értékekre beállítva, egy kísérletsorozatban teszteltünk. A vizsgált tényezők (faktorok) a következők voltak: 1. Médium mennyisége: 50 g; 2. Standard spóra szám: 1·106/ml; 3. Heti vízpótlás: 10 ml [aw=0,984, 23 oC-on]. A fent említett tényezőket a következő kísérleti beállításban teszteltük: 1. Széria. (1. faktor) 50 g szemes kukoricát és 50 ml vizet (>50% nedvességtartalom; aw ≈ 1,00) egy éjszakán át tartó áztatást követően 1,7 literes széles szájú, gyümölcs befőző üvegben (átmérő: 11 cm), vászon és vattadugó felhasználásával a szokásos módon lezárva, 2 egymást követő napon, 1 órán keresztül 120 oC-on (1kPA) autoklávoztunk. Az előkészített kukoricát (felszín/térfogat arány ≈ 5:2) a törzs Czapek-agaron való felszaporítása folytán (2 hét) fejlődő spórákkal oltottuk be. Ezután az üvegek tartalmát összerázással homogenizáltuk. A beoltott kultúrákat elősterilizált inkubátorban (LP-122, LABOR MIM, Budapest), légbeáramlásos üzemmódban, sötétben, 25 oC-on 5 héten keresztül inkubáltuk. A befülledés és
36
az esetleges erjedés elkerülése érdekében minden üveget és annak tartalmát 7-8 napon keresztül naponta felráztuk. 2. Széria. (az 1. és a 2. faktor együtt alkalmazva) Kiegészítésül a fentieket (megtartva az 50 g-os médiumot), a kukoricát standard spóra szuszpenzióval oltottuk be. A liofilizátumok spóraszámát Czapek-agaron tízszeres hígítási sorozat készítésével határoztuk meg és 106 spóra/ml értékre állítottuk be. Jelen körülmények között ez a liofilizátumok 10 ml steril fiziológiás sóoldattal való hígítását jelentette. Az előkészített kukoricát az említett spóraszuszpenzióból 1 ml mennyiséggel oltottuk be. 3. Széria. (az 1., a 2. és a 3. faktor együtt alkalmazva) Követve az előbbi kondíciókat (50 g médium + 106/ml spóraszám), az előzetes vizsgálataink alapján, a megfelelő vízaktivitás fenntartása érdekében (aw 0,980,93; Cahagnier és mtsai, 1995) 10 ml steril desztillált vizet adagoltunk hetente minden kultúrához. A vízaktivitás értékét Vas és Csontos (1956) módszere alapján, kristályelfolyósítási módszerrel (KH2PO4; 23oC, ERP% = 98,4) ellenőriztük. 3. 1. 2. Mintavételek A módszerfejlesztési munka során minden kezelést úgy értékeltünk, hogy egy adott szériából kivett, 3 üveg homogenizált tartalma („in triplicate”) képezett egy-egy adatot. A mintavételt három ismétlésben végeztük el (egy széria = 3 x 3 üveg tartalmából nyert adat). A hetenkénti toxintermelés növekedésének vizsgálatára 3 üveg tartalmát gyűjtöttünk be alkalmanként. Az inkubálási időszak (5 hét) végén a gombatenyészeteket szobahőmérsékleten légszáraz állapotig szárítottuk, majd daráltuk, és -18oC-on tároltuk a fumonizintartalom meghatározásáig. 3. 1. 2. Kémiai analízis A gombatenyészet FB1-tartalmának meghatározása úgy történt, hogy oftáldialdehidet és merkaptoetanolt felhasználva származékot képeztünk, majd azt nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) elválasztás után fluoreszcenciásan detektáltuk (Fazekas és mtsai, 1997, Fazekas, 1998). A meghatározás során gyárilag tisztított (98%) és kereskedelmi forgalomban kapható toxint használtunk fel (Sigma, Schnelldorf, Németország). A fumonizinek kimutatási határára a következő volt: FB1: 0,05 mg/kg. FB2 0,1 mg/kg és FB3 0,1 mg/kg.
37
3. 2. A fumonizin B1 szervezeten belüli eloszlásának és kiürülésének tanulmányozása (I. állatkísérlet) 3. 2. 1. A kísérleti állatok takarmányozása és kezelése A kísérlet a KE-ÁTK Takarmányozástani Tanszékének kísérleti állatházában végeztük el. A vizsgálatba összesen tizenöt magyar nagy fehér, 8 hetes ártányt állítottunk be. A malacokat egyedileg, 80 x 80 cm alapterületű anyagcsere ketrecben helyeztük el, amelyben az állatok szabad mozgását nem korlátoztuk. A kísérleti terem hőmérsékletét és relatív páratartalmát Kovács (1990) ajánlása szerint állítottuk be. A kísérlet 5 napos akklimatizációs és 22 napos (vizelet- és bélsár-) gyűjtési szakaszból állt. A kísérleti állatok élőtömegét az akklimatizációs szakasz végén, valamint a gyűjtés során hetente mértük meg. A kísérletbe vont állatok kereskedelmi forgalomban kapható, életkoruknak megfelelő alaptakarmányt fogyasztottak. Az alaptakarmány összetétele és táplálóanyagtartalma a 2. mellékletben látható. A vizsgálat során két kezelést állítottunk be. A kontroll csoport (n=5) állatai a kísérlet teljes ideje alatt az alaptakarmányt fogyasztották. A kísérleti csoport (n=10) állatainak takarmánya azonos összetételű volt a kontroll csoport állatainak takarmányával, de ahhoz az ötnapos akklimatizálódási periódus után Fusarium verticillioides gombatenyészetet kevertünk. Ez utóbbit Fazekas (1998) állította elő az általa kifejlesztett módszerrel, az akkor még termelő, 14/A jelű F. verticillioides törzset használva. A gombatenyészet FB1 koncentrációja 7300 mg/kg, az FB2 koncentrációja 2750 mg/kg, az FB3 tartalma pedig 750 mg/kg volt. A kívánt toxinkoncentrációt (50 mg FB1/állat/nap) a takarmányhoz megfelelő mennyiségben hozzáadott gombatenyészettel biztosítottuk (680 g gombatenyészet/100 kg takarmány). A kísérleti és kontroll takarmány mikotoxintartalmát (T-2, F-2, DON, OTA, fumonizin B1, B2, B3) minden esetben ellenőriztük (Fazekas és mtsai, 1997). A toxintartalmú takarmány etetése naponta kétszer történt (azonos adagokban), az el nem fogyasztott takarmányt visszamértük. Ivóvíz ad libitum állt az állatok rendelkezésére. A kísérletet lebonyolítása az állatvédelmi törvény idevonatkozó előírásainak megfelelt. A kísérlet engedélyezési száma: MÁB-11/2002; KÁ-16/2001.
38
3. 2. 2. Hematológiai és biokémiai vizsgálatok A kísérleti táp etetését megelőzően vért vettünk az állatoktól (vena jugularis) és meghatároztuk a kiindulási állapotra jellemző hematológiai és klinikai kémiai paramétereket. A FB1 etetésének megkezdését követően hetenként vettünk vért. A vérmintákból standard hematológiai vizsgálatokat végeztünk: vörösvértestek száma (vvt), fehérvérsejtszám, hemoglobin koncentráció (Hb), hematokrit érték (PCV), a vörösvértest térfogata (MCV), a vörösvértest hemoglobintartalma (MCH), a vörösvértest hemoglobinkoncentrációja (MCHC) és a thrombocyták száma. A méréseket CELL-DYN 3500 típusú hematológiai analizátorral végeztük (ABBOTT, Németország). A vérplazma összfehérje, albumin, kreatinin és bilirubin koncentrációját, illetve az aszpartát aminotranszferáz (AST), alanin aminotranszferáz (ALT), gamma-glutamil transzferáz (GGT), laktát dehidrogenáz (LDH) és alkalikus foszfatáz (ALP) aktivitását Vettest 8008 biokémiai analizátorral határoztuk meg (IDEXX Cergy Pantoise Cedex, Libourne, Franciaország), Eastman Kodak tesztlemezek (Eastman Kodak Company for IDEXX Laboratories, Inc., Maine, USA) felhasználásával. 3. 2. 3. A toxin kiürülésének vizsgálata A fumonizin analógok kiürülésének meghatározása céljából a kísérlet 3. hetében (a toxintartalmú táp etetésének megkezdését követő 13. és 17. nap között) 5 napig gyűjtöttük a vizelet és a bélsár teljes mennyiségét. A bélsár és a vizelet elkülönítését a végbélnyílás köré felerősített gyűrű alakú műanyag fenéklap, illetve az erre hézagmentesen illesztett polietilén tasak tette lehetővé. A bélsárgyűjtés a nap teljes időszakában folyamatosan történt. A bélsár teljes mennyiségét elsőként lehűtöttük (+4oC), majd a nap végén a napi teljes mennyiség lemérése és homogenizálása után a mintákat lefagyasztottuk. Az állatok vizeletét egyedileg, műanyag kannába gyűjtöttük. A reggeli etetéseket követően meghatároztuk a napi teljes mennyiséget, majd homogenizálást követően a mintákat -18oC-on tároltuk az analízisig. 3. 2. 4. A szervek, a bélsár és a vizelet fumonizin tartalmának meghatározása A kísérlet végén az állatokat bódítás (1 ml/20 ttkg Stresnil injekció; Anivet, Budapest) után elvéreztettük. Kórbonctani vizsgálatot végeztünk, majd lemértük a tüdő, a szív, a máj, a vese, a lép és az agyvelő súlyát. Vizsgáltuk az állatok különböző szerveiben kimutatható toxin mennyiségét, nevezetesen a máj, a tüdő, a vese, az agy, a lép, a szív, valamint az izmok közül a m. longissimus dorsi, és a m. psoas major izmokat. Meghatároztuk továbbá a
39
hasűri (abdominalis) és a bőr alatti (subcutan) zsírszövet, illetve az epe toxintartalmát. A szervek fumonizin tartalmának meghatározása a Müncheni Műszaki Egyetem Állathigiéniai Tanszékén történt HPLC (Waters 2690 Separations Module, Milford, MA) - MS (VG Platform 2) rendszerre adaptált módszer alkalmazásával (Meyer és mtsai, 2003), Az eljárás az extrakcióval kezdődik, melynek során a szervek 1 g-ját liofilizálás után metanol-víz 3:1 arányú keverékével (8 ml) rázatják (30 perc), üveggyapotszűrőn átszűrik (Whatman, Maidstone, UK), majd 2 ml hexánnal való elkeverés után (vortex) centrifugálják (2000 g; 3 perc). A hexán réteg eltávolítása (40 oC-os nitrogénben) után az egész folyamatot mégegyszer megismétlik. Az elegy tisztítása ioncserélő kártyák (Phenomenex, Aschaffenburg, Németország) segítségével megy végbe. A HPLC-s vizsgálathoz C18 oszlopot használnak (Waters, Eschborn, Németország). Tisztított FB1 és FB2 (F 1147; Sigma, Schnelldorf, Németország) szolgált standardként. Az eredetileg kidolgozott módszerben (Meyer és mtsai, 2003) némi módosítást végeztünk az extrakcióban (mikrohullám által gyorsított), amely nagyobb analitikai pontosságot eredményezett, különösen a zsírszövet esetében. A mikrohullámú roncsoló (CEM Model MARS-X, Matthews, USA) alkalmazására, illetve a módszerben történt módosításra elsősorban a hatékony sejtroncsolás miatt volt szükség, amely a többi minta esetében nem volt problémás egyszerűsített formában (csak liofilezés) sem. A mikrohullámmal elért előnyök között említhetjük még, hogy az extrakció magas hőmérsékleten történt, amely ugyancsak javította annak hatékonyságát. A minta 1 g-jához 4 ml metanolt adtunk, majd egy speciális, nagy nyomásnak ellenálló mintatartóba helyeztük. A minta ezt követően került a roncsolóba. Hűtést követően az extraktumot üvegszálas szűrőn (Whatman GF A, Dassel, Németország) leszűrtük, majd a szűrlet 1,5 ml-ét 2 ml hexánnal kevertük (30 sec, vortex), centrifugáltuk (1000 g, 3 perc, 20 oC). A zsírtalanítás folyamatát kétszer ismételtük. A mintaelőkészítés ezt követően megegyezett a többi (szerv) minta előkészítésével. A liofilezett bélsárminták (0,5 g) fumonizin tartalmát 0,1 M etilén-diamintetraacetát (EDTA) és metanol (8 ml; 4/1 v/v) elegyével vontuk ki, 30 perc alatt. Az extraktumot üvegszálas szűrőn (Whatman GF A, Dassel, Németország) leszűrtük, majd az abból vett mintát LC/MS rendszeren analizáltuk. A vizeletminták esetében az eljárás 2 ml metanollal való összerázással (30 perc) kezdődött, majd az így előkészített mintát 10 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk. Ezután centrifugáltuk (160 g, 3 perc, 20 oC), majd a felülúszó 1,5 ml-ét 2 ml hexánnal kevertük (30 perc, vortex), centrifugáltuk (1000 g, 3 perc, 20 oC).
40
A zsírtalanítás folyamatát kétszer ismételtük, majd a hexánréteget vákuumcentrifugában eltávolítottuk. A visszanyerési vizsgálatokat, illetve a kimutatási határ meghatározását a 3. 3. 5. fejezetben és a 3. mellékletben mutatom be részletesen. Figyelembevéve a FB3 takarmányban mért alacsony koncentrációját (összehasonlítva a többi analóggal), illetve –az előzetes vizsgálatok szerinti– kimutatási határ alatti megjelenését a vizsgált mintákban, ennek a paraméternek a meghatározása nem volt célunk.
41
3.3. A fumonizin B1 felszívódásának, szervezeten belüli biotranszformációjának és kiürülésének tanulmányozása (II. állatkísérlet) 3. 3. 1. A kísérleti állatok takarmányozása és kezelése A kísérletbe állított állatok (kísérleti /n=10/, kontroll /n=6/) tartása (egyedi anyagcsere ketrecben való elhelyezés) és takarmányozása a 3.2.1. fejezetben leírtakkal mindenben megegyezett azzal a különbséggel, hogy a hasonló koncentrációban fumonizineket tartalmazó takarmány etetése 10 napon keresztül történt. A fumonizineket a 3.1.1 fejezetben leírtak szerint (3. széria) állítottuk elő, az MRC 826 jelű F. verticillioides törzset használva. A gombatenyészet FB1 tartalma 3370 mg/kg, a FB2 tartalma 650 mg/kg, a FB3 tartalma pedig 350 mg/kg volt, így 100 kg alaptakarmányra számítva 1,5 kg gombatenyészet bekeverésével értük el a kívánt toxinkoncentrációt. A kísérleti és kontroll takarmány mikotoxintartalmát, a 3.2.1. fejezetben leírtak szerint ellenőriztük. A takarmány a meghatározott mennyiségű fumonizineken (FB1: 45 mg/kg, FB2: 8,6 mg/kg, FB3: 4,5 mg/kg) kívül jelölő anyagot, azaz Cr2O3-t (0,5%) is tartalmazott. Hasonlóan az I. állatkísérletben leírtakhoz, az el nem fogyasztott takarmányt naponta visszamértük. A kísérletet lebonyolítása az állatvédelmi törvény idevonatkozó előírásainak megfelelt. A kísérlet engedélyezési száma: MÁB-11/2002; KÁ-16/2001. 3. 3. 2. Hematológiai és biokémiai vizsgálatok A toxin etetésének megkezdése előtt, valamint a 10 napos toxinetetést követően, illetve a FB1 etetésének megszüntetése utáni 10. napon lemértük az állatok testtömegét, illetve vért vettünk. A vérparaméterek meghatározása a 3.2.2. fejezetben leírtakkal mindenben megegyezett. 3. 3. 3. A fumonizin B1 felszívódásának vizsgálata A kísérletbe Tossenberger és mtsai (2000) módszerét alkalmazva speciális Tkanüllel (PVTC; post valve T-cannula) ellátott malacokat állítottunk be, amely lehetővé tette a króm-oxiddal jelölt kísérleti tápból a FB1 felszívódott mennyiségének meghatározását. A műtét után az állatok számára 1 hétig biztosítottunk regenerációs időt. Krómmeghatározás céljából a mintaelőkészítést a Christian és Coup (1954) által ajánlott eljárással, az azt követő koncentrációmérést pedig atomabszorpciós módszerrel végeztük (műszer: Shimadzu AA-6701F; láng: levegő-acetilén;
42
hullámhossz: 357,9 nm). A számítások során figyelembe vettük a Cr visszanyerhetőségét (PVTC-kanül; ileum végső szakasza; Cr visszanyerhetőség: kontroll diéta: 90,8±4,38%; szemiszintetikus diéta: 106,4±2,80; átlagosan: 98,6%), Köhler (1993) vizsgálatait alapul véve. Az FB1 etetésének időszakában (10 nap) a PVTC-kanülön keresztül naponta kétszer vettünk mintát (a reggeli és a délutáni etetés után 1 órával) a chymusból. Az első adag kísérleti táp fogyasztása után a felszívódott mennyiség számítása során korrigáltunk az epével visszaürülő toxinmennyiséggel (irodalmi adatok; Dantzer és mtsai, 1999-1,4%). A vékonybéltartalom FB1, FB2, illetve PHFB1 és AP1 meghatározását a Müncheni Műszaki Egyetem Állathigiéniai Tanszékén végeztük el, a 3.3.5. fejezetben leírtak szerint. 3. 3. 4. A toxin kiürülésének vizsgálata A toxin kiürülésének meghatározása céljából a toxintartalmú táp etetésének megkezdését követően a kísérlet teljes időtartama alatt (20 nap) gyűjtöttük a vizelet és a bélsár teljes mennyiségét. A mintavételeket a 3.2.3. fejezet szerint végeztük. A mintákból FB1, FB2, illetve a PHFB1 és HFB1 meghatározás történt (3.3.5. fejezet).
0.
kanülözés (PVTC) 5.
akklimatizáció
vérvétel, testtömeg mérés 12.
regeneráció
vérvétel, testtömeg mérés, 5+3 állat kórbonctani vizsgálata, szerv mintavétel béltartalom gyűjtés 22.
kísérleti takarmány etetése, FB1 felszívódás vizsgálata
32. nap
származékok eliminációjának vizsgálata
bélsár- és vizeletgyűjtés
6. ábra A II. állatkísérlet folyamata
43
3. 3. 5. A szervek, a bélsár, a chymus és a vizelet fumonizin és metabolitjai tartalmának meghatározása A FB1 és metabolitjai, valamint a FB2 meghatározása jelen esetben is a Müncheni Műszaki Egyetem Állathigiéniai Tanszékén működő folyadékkromatográfiás-tömegspektrometriás berendezés alkalmazásával történt (Perkin-Elmer HPLC 200-API 3200 LC/MS; USA). A szerv- (mintavétel: 6. ábra) és a vizeletminták feldolgozását változtatás nélkül az I. állatkísérletnél leírtak szerint végeztük, a bélsárminták előkészítését azonban a liofilizálás mellőzésével egyszerűsítettük. A kivonószer a módosított eljárásban 2 g bélsárra számítva 8 ml 0,1 M EDTA-metanol elegy (3:1 v/v), az extrakciós idő pedig szobahőmérsékleten 60 perc volt. A nyers chymusmintákat (5 g) 0,1 M EDTA és metanol 3/1 arányú keverékével (8 ml) extraháltuk, 60 perc alatt. Centrifugálást követően az extraktumot üvegszálas szűrőn (Whatman GF A, Dassel, Németország) leszűrtük, majd az abból vett mintát LC/MS rendszeren analizáltuk. Hasonlóan az előző kísérletben leírtakhoz (3.2.4. fejezet), a FB1 és FB2 meghatározásához tisztított (98%) toxint használtunk (Sigma, F 1147; F 3771; Sigma, Schnelldorf, Németország). A PHFB1 standardot Stephen M. Poling (Mycotoxin Research, National Center for Agricultural Utilization Research, United States Department of Agriculture, Peoria, U.S.A.) állította elő az általa leírt módszerrel (Poling és Plattner, 1999), mely a két részlegesen hidrolizált forma egyensúlyi elegye („equilibrium mixture”) volt. Az aminopentol standardot Pagliuca és mtsai (2005) módszere alapján állítottuk elő, némi módosítással. 400 µg tisztított fumonizin B1–et (F 1147; Sigma, Schnelldorf, Németország) 2 ml metanolban oldottuk fel, majd 2 ml 1 mólos KOH-oldatot adtunk hozzá. A művelet zárt fiolában zajlott. Ezután az oldatot vízfürdőben 70 oC-ig melegítettük, majd ezt a hőfokot 1 órán keresztül tartottuk. Lehűtés után az oldat pH-ját 0,1 M HCl oldattal 4,5-re állítottuk be. Az elegyet 8 ml etilacetáttal extraháltuk (vortex, rövid idejű centrifugálás), majd bepároltuk. Az előállított tiszta aminopentolt acetonitril/víz 1:1 arányú keverékében oldottuk fel. Tömegspektrométert használva az ellenőrzéskor megállapítottuk, hogy az eljárás során a FB1 100%-ban aminopentollá hidrolizálódott. Mindegyik standardot 1 ml acetonitril-víz (1:1) oldatával hígítottuk. FB2 metabolitok analitikai standardjainak hiányában ezek meghatározáról le kellett mondanunk. A módszer pontosságát ún. visszanyerési vizsgálatokkal ellenőriztük. A visszanyerési vizsgálatok során a vizsgálandó anyag (FB1, FB2, AP1, PHFB1) ismert mennyiségét adtuk hozzá a mintához, majd az egyes minták esetében a vonatkozó fejezetekben leírt módszerrel határoztuk meg a hozzáadott anyag(ok)
44
koncentrációját. Az ellenőrzés során használt minta minden esetben már előzőleg bemért, a vizsgálandó anyag(ok) szempontjából negatív mintákat takart, amelyek a kontroll csoportból származtak. Minden szövetféleség, illetve a bélsár, a vizelet és a chymus esetében három hozzáadott koncentráció (magas, közepes és alacsony) mérése történt meg (n=5): máj, tüdő és vese: 10, 100 és 500 µg/kg; zsír, agy, izom és lép: 1, 10, 100 µg/kg; bélsár, vizelet és béltartalom: 10, 100 és 1000 µg/kg. A hozzáadott anyag(ok) koncentrációját a LOD, illetve a várható érték alapján választottuk meg. A hozzáadott anyagokat minden esetben a tisztított toxinokból állítottuk elő úgy, hogy az egyes származékok adott koncentrációját tartalmazó elegyből 100 µl-t nitrogén alatt bepároltunk, majd a nyers, vak mintákat ezekkel szennyeztük. A kimutatási és a meghatározási határ megállapítása céljából minden esetben 5 vakkísérletet végeztünk. A kimutatási határt (LOD, limit of detection) a standard deviáció háromszorosaként, míg a meghatározási határt (LOQ, limit of quantification) a standard deviáció kilencszereseként definiáltuk és az alábbi képletek szerint számítottuk ki (Pungor és mtsai, 1987): LOD = 3Z/S LOQ = 9Z/S ahol Z a vakminta válaszjelének tapasztalati szórása vagy standard deviációja S az analitikai érzékenység, vagyis a kalibrációs görbe iránytangense A visszanyerési vizsgálatok eredményeit, illetve a kimutatási és meghatározási határok értékeit a 3. melléklet mutatja be.
45
3.3.6. A FB1 konverzió fokának megállapítása A fumonizin B1-et α-val, az aminopentolt β-val, a részlegesen hidrolizált FB1-et pedig γ-val jelölve, a fumonizin B1-aminopentol konverzió:
λα → β =
mβ / Mβ mβ Mα × = mα / Mα mα Mβ
a fumonizin B1-részlegesen hidrolizált FB1 konverzió:
λα → γ =
mγ / Mγ mγ Mα × = mα / Mα mα Mγ
ahol m minden esetben az 1 g mintában lévő vegyület tömegét, M pedig a relatív molekulatömegét jelenti. (Az utóbbi értéke az α-val, β-val és γ-val jelölt anyag esetében 721 g/mol; 405 g/mol; 563 g/mol.)
46
3. 4. In vitro kísérlet 3. 4. 1. A kísérlet menete A mikrobiális fermentáció hatására kialakuló FB1-biotranszformáció tanulmányozására in vitro kísérletet végeztünk. Vágóhídon (Kokasmajor Kaposterneró Kft.) frissen leölt állatok (n=4) vakbéltartalmát használtuk fel a kísérlet során. A vakbéltartalom begyűjtése (kb. 50 g/állat) steril körülmények között történt, majd ezt követően a béltartalomminták laboratóriumba való szállítását Anaerocult edény és Anaerocult-A gázfejlesztő tasak (Merck KGaA, Darmstadt, Németország) felhasználásával oldottuk meg. Az egyes állatoktól származó mintákat első lépésként homogenizáltuk, majd egy-egy kémcsőben 3,3 g béltartalmat (szárazanyag: 30%) pre-inkubált (24h/37oC/anaerob körülmények) McDougall (9,8 g NaHCO3/l; 9,3 g Na2HPO4·12H2O/l; 0,57 g KCl/l; 0,47 g NaCl/l; 0,12 g MgSO4·7H2O/l; 0,04 g CaCl2; 1000 ml-re desztillált vízzel való feltöltés; pH 8,3) pufferben (Kollarczik és mtsai, 1994) szuszpendáltunk (10%os szuszpenzió). Egy újabb 4 órás pre-inkubációs (37 oC/anaerob körülmények) periódust követően, egy 50 µg/ml koncentrációban tisztított FB1 (F 1147; Sigma, Schnelldorf, Németország) toxint tartalmazó oldatából 1 ml-t adtuk minden kémcső (20) tartalmához, így a szuszpenzió 5 µg FB1-et tartalmazott mililiterenként. Homogenizálást (vortex) követően a kémcsöveket ismét anaerob inkubátorba helyeztük és a kezdeti időpontban (0 időpont), illetve 12, 24, 48 és 72 óra elteltével, időpontonként 4-4 kémcsövet távolítottunk el. Ezt követően a kivett mintákat centrifugáltuk (2000 g, 20 perc) (MLW, Modell: Janetzki T23, VEB MLW Zentrifugenbau Engelsdorf, NDK), majd a felülúszót és a leülepedő fázist azonnal lefagyasztottuk (-20oC). A teljes kísérletet változatlan körülmények mellett két ismétlésben végeztük el. 3. 4. 2. A fumonizin B1 és metabolitjainak meghatározása A mintákból a FB1, AP1 és PHFB1 meghatározás az állatkísérletekben leírtakkal (3. 3. 5. fejezet; felülúszó esetében a vizelettel, míg a leülepedő fázis esetében a chymus mintákkal azonos előkészítés) megegyezett. 3.4.2. A FB1 konverzió fokának megállapítása A konverzió fokának megállapítását az állatkísérletben leírtakkal megegyezően végeztük (3.3.6. fejezet).
47
3. 5. Statisztikai analízis A kísérletekből származó alapadatokból elsőként a kiugró értékeket (“outlier”, a kétszeres szórástávolságon kívül eső egyedi adatok) vizsgáltam meg, majd a szakmailag is megalapozott esetekben kizártam azokat (kivéve a szervek toxintartalmának statisztikai értékelése). Ezt követően normalitás vizsgálatot végztem. A kísérletek eredményeinek értékelésekor a csoportok közötti szignifikanciát egytényezős (“oneway”) varianciaanalízissel, illetve Tukey „post hoc” teszttel (P≤0,05) vagy LSD („Least Significant Difference”) típusú „post hoc” teszttel (P≤0,05) értékeltem. A kontroll és kezelt csoportba tartozó állatok paramétereinek átlaga közötti különbséget kétmintás független t-próbával (5%-os szignifikancia szinten) mutattam ki. Több ízben (az in vivo és in vitro kísérletekben is) végeztem korrelációanalízissel összefüggés-vizsgálatot, P≤ 0,05 valószínűségi szinten. Az adatfeldolgozáshoz és a matematikai statisztikai számítások elvégzéséhez az SPSS for Windows 10.0 (1999) szoftver „Compare Means”, „Correlate” és „Descriptive Statistics” moduljait használtam (SPSS Inc., Chicago IL, USA), valamint az EXCEL 7.0 táblázatkezelő és ábraszerkesztő programjait.
48
4. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 4. 1. Fumonizin B1 laboratóriumi előállítására irányuló kísérlet eredményei A kísérletsorozat eredményeit a 4. táblázat szemlélteti. Megállapítható, hogy a három faktor együttes alkalmazásával értük el a legnagyobb toxinkoncentrációt, amely g/kg dimenzióban volt mérhető. A kezelések közül az optimálisnak tűnő biotikus és abiotikus környezetben (1., 2. és 3. faktor, együtt alkalmazva) az átlag és a standard hiba értékei a következőképpen alakultak: 4454 ± 624 mg/kg FB1. Nem volt szignifikáns különbség az 1. és 2. széria eredményei között, míg ez utóbbiakat a 3. széria eredményeihez hasonlítva a különbség P <0,05 szinten szignifikáns volt. Meg kell azonban jegyezni, hogy bár a vízaktivitás szerepe tűnik a legjelentősebbnek, az összes faktor meghatározó értékkel bír a toxintermelés során.
4. táblázat FB1 termelés a kísérletsorozatban Alkalmazott faktorok*
1. faktor
1. és 2. faktor
1.,2. és 3. faktor
621,4
1600
4110
942,1
2185,7
3609
611,8
1059,2
5645
Átlag
725,1a
1614,9a
4454,6b
±SE
110,5
331,3
624,0
**FB1 koncentráció (mg kg-1)
*Faktor 1.Médium mennyisége: 50 g; Faktor 2. Standard spóra szám: 1·106/ml; Faktor 3. Heti vízpótlás: 10 ml (aw=0,984, 23 oC-on). **adott kezeléshez tartozó minden adapat 3 üveg homogenizált tartalmának a koncentrációját mutatja a, b P ≤0,05; SE: standard hiba
A vonatkozó publikációk hőmérsékletre vonatkozó értékeit nem változtattuk (25 o C). Korábbi tapasztalatainkat figyelembevéve (Fodor és mtsai, 2006), a médium mennyisége (1. faktor) Fazekas (1998) és Alberts és mtsai (1990) módszerében is túl soknak bizonyult, ezért ezt a paramétert 50 g-ra csökkentettük. A felszín/térfogat (5:2) arány ebből kifolyólag jelentősen nőtt. Fontosnak véltük a standard spróramennyiséget tartalmazó inokulumok (2. faktor) alkalmazását, mivel ellenkező esetben (nagyobb spóraszám) egyrészt a termelés negatív
49
irányban (termelés-csökkenés) befolyásolható (Vismer és mtsai 2004), másrészt pedig az egyes üvegekben lévő gombatenyészetek toxintermelése standardizálás nélkül nagy szórást mutat. A fumonizin termelés függ a vízaktivitás (aw) értéktől is (3. faktor). Az aw értékében bekövetkező 10% csökkenés, pl. 1-ről 0,9-re, 1/300-adára csökkenti a termelést (Nelson és mtsai, 1993). Ezt, illetve a vízaktivitásban mért csökkenést alapul véve folyamatosan pótoltuk az elpárolgó vízmennyiséget (10 ml/hét). Az alkalmazott vízpótlással (1., 2., és 3. faktor együtt) közel háromszoros toxinkoncentrációt értünk el, összehasonlítva azzal a termeltetési eljárással, amelyben csak a médium mennyiségét és a spóraszámot (1. és 2. faktor együtt) vettük figyelmbe. LeBars és mtsai (1994) vizsgálatai szerint a 2. héten mért és addig termelődött toxin mennyisége a 3. heti koncentrációhoz képest magasabb volt; az eltelt idővel párhuzamos koncentráció-csökkenés feltehetően az oxigén-fogyás miatt következett be. A gombák ugyanis képesek a már általuk megtermelt toxin lebontására is (LeBars és mtsai, 1994), feltehetően a molekula enzimatikus hasítása révén vagy más molekulává való konvertálás eredményeképpen (Alberts és mtsai 1990). Az oxigénhiányos mikroklíma – és az emiatt bekövetkező termelés-csökkenés – elkerülése érdekében az inkubáció időtartalmát 5 hétben határoztuk meg. A toxintermelés már az első héten megindult (7. ábra), ellentétben azzal a közléssel, mely szerint a fumonizinek csak a 2. héten kezdenek termelődni (Alberts és mtsai, 1990). Ez feltehetően abból adódott, hogy a standard (és viszonylag nagy) spóraszám alkalmazásából kifolyólag korábban kialakultak azok a depressziós feltételek (szubsztrátum nem fedezi a növekvő gombamassza tápanyagszükségletét), amelyek a másodlagos anyagcserét megindítják. 5000
4110
mg/kg
4000
2819,4
3000
2121,5 1400
2000 1000
383,3
0 1
2
3
4
5
hetek
7. ábra A toxintermelés időbeni változása (átlag±SE)
50
Kiegészítő jelleggel elvégeztük a 3. szériából származó gombatenyészetek FB2 és FB3 analízisét is. A mért koncentrációk arra utalnak, hogy a F. verticillioides MRC 826 jelű törzs a természetben előforduló arányban (FB1: 80%; FB2: 15%; FB3: 5%) termeli a két fent említett analógot. A bemutatott módszer, illetve az alkalmazott törzs tehát alkalmasnak bizonyult a fumonizinek állatkísérleti célú előállítására. Hangsúlyozni szükséges azonban, hogy a célunk nem az irodalomban található eredmények felülmúlása volt, hanem egy egyszerű, könnyen elvégezhető, olcsó eljárás kidolgozása, az adott törzs alkalmazásával. A toxin előállítására kevés idő állt rendelkezésre, hiszen az állatkísérletek elvégzése volt az elsődleges célunk, ezért az optimális termeltetési körülmények kidolgozása jelenleg is folyik. Fontosnak tartom megemlíteni, hogy bár az általunk elért toxinkoncentráció hozzávetőlegesen fele, mint például az Alberts és mtsai (1990) által közöltek, a megközelítően 5 g FB1/kg koncentráció ideálisnak tekinthető az in vivo (sertéseken végzendő) kísérletek elvégzése szempontjából. A koncentrált gombatenyészet kis%-ban történő alaptakarmányhoz keverése nem okoz íz- és szaghibát, így az állatok takarmányfogyasztása ezáltal nem befolyásolt. Továbbá a kísérleti anyag kb. 1-2%-át képező gombatenyészet alaptakarmányhoz keverése a homogén kísérleti táp előállítása szempontjából is megfelelő. Az ennél koncentráltabb gombatenyészet alkalmazásakor ugyanis a homogenitást már feltehetően csak egy sokkal alaposabb darálással, porítással érhetnénk el, amely kedvezőtlenül befolyásolhatja mind a takarmányfogyasztást, mind pedig az általános egészségügyi státuszt (poros takarmány).
51
4. 2. A fumonizin B1 szervezeten belüli eloszlása és kiürülése (I. állatkísérlet eredményei) 4. 2. 1. Klinikai tünetek A kísérleti tápot fogyasztó állatok klinikai tüneteket nem mutattak. Takarmányfogyasztásuk a kísérlet teljes időtartama alatt kiegyensúlyozott volt, toxinhatásra utaló takarmány visszautasítás nem volt tapasztalható. Egy állat (277) esetében mutatkozott két alkalommal átmeneti takarmány felvétel csökkenés. 4. 2. 2. Hematológiai és biokémiai eredmények A kísérleti állatok esetében a hematológiai paraméterekben nem találtunk eltérést sem a fiziológiás értékekhez (Friendship és Henry, 1992), sem pedig a kontroll csoport adataihoz képest. A kezelt állatok klinikai kémiai paraméterei (5. táblázat) szintén a fiziológiás határértékek (Friendship és Henry, 1992) között mozogtak. Feltehetően a májban és a tüdőben kialakuló kóros folyamatok jelzéseként a kontroll állatokhoz képest szignifikáns emelkedést tapasztaltunk a kísérleti állatok ALT (mind a négy vizsgálati időpontban) aktivitásában. Az ALP aktivitás is szignifikánsan eltért a két csoportban az utolsó vizsgálati időpontban, azonban ez az eltérés a kontroll csoport értékeiben tapasztalt csökkenésnek és nem pedig a kísérleti csoportban mutatkozó emelkedésnek volt köszönhető, így a különbség csak látszólagos. 5. táblázat A kísérleti állatok klinikai kémiai paraméterei a kontroll csoport adataihoz képest (átlag ± SE) ALT (U/l) Kontroll Kezelt AST (U/l) Kontroll Kezelt CREA (mmol/l) Kontroll Kezelt ALP (U/l) Kontroll Kezelt * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,08
1. nap * 44±1,8 53±2,9
7. nap ** 50±4,0 62±4,0
14. nap ** 72±6,1 87±5,1
21. nap * 61±9,7 89±5,5
25±1,5 26±2,3
37±6,36 34±3,0
42±6,9 38±4,4
35±7,0 46±5,0
67±3,9 68±2,4
86±4,0 86±3,0
80±5,5 92±4,1
643±67,3 699±19,4
609±39,1 647±14,3
530±59,1 674±52,1
88±5,5 91±3,7 * 379±70,0 639±31,7
52
4. 2. 3. Kórbonctani vizsgálatok eredményei A fumonizinekkel szennyezett takarmány fogyasztásának toxikus hatására kialakuló tipikus kórkép, a tüdőödéma minden állatban kialakult. A tüdő csúcsés szívlebenyei enyhébb-kifejezettebb mértékű ödémát mutattak, tömött tapintatúak voltak. Néhány állat esetében a mellüregben kisebb mennyiségű (1550 ml), enyhén sárgás színű, alvadásra hajlamos folyadék volt fellelhető. A gyomor nyálkahártyájának pontszerű bevérzése, illetve kiterjedt nyálkahártya lemaródás (kezdődő fekély) minden állat esetében előfordult. A májban, a szívben és a vesében is találtunk kóros elváltozásokat. Ezek közül figyelmet érdemelő elváltozás volt pl. a megnagyobbodott, szakadékony, fakó, sárgás színű máj, a szintén fakó színű vese foltszerű elhalásos területekkel, illetve a szívburokban észlelt kevés, pelyhes folyadék. A szervek tömege között nem volt statisztikailag kimutatható különbség. A kontroll állatokban toxinhatásra utaló elváltozást nem találtunk. 4. 2. 4. A vizsgált szervek fumonizin koncentrációja A 6. és 7. táblázat a különböző szervek fumonizin koncentrációját mutatja be a toxintartalmú takarmány fogyasztása után. Az eredményeket a kísérlet időtartama alatt felvett összes, illetve az 1 kg testtömegre számított összesen felvett fumonizin mennyisége alapján értékeltük. Az 1 kg testtömegre számított összes FB1-felvétel a 22 napos toxinetetési periódus alatt állatonként 51,7 ± 1,0 mg volt. A legtöbb FB1 a májban és a vesében volt kimutatható. Az 8. a, b ábra a FB1, illetve a FB2 különböző szövetekben való megjelenését ábrázolja. FB2 sokkal alacsonyabb koncentrációban volt kimutatható a szervekből, összehasonlítva azt a FB1 koncentrációval (8. a, b ábra). Viszonylag magas FB1 mennyiség volt mérhető a szívizomban és a lépben, míg minimális volt a koncentrációja a tüdőben. Eredményeink nagyban hasonlítanak Prelusky és mtsai (1994, 1996b) által elvégzett kísérlet eredményeihez, mely szerint a 24 napig tartó, jelölt FB1 tartalmú (2-3 mg/kg) takarmány etetését követően a legmagasabb toxinszintet a májban és a vesében lehetett mérni sertésben. Az agyvelőben egy esetben sem lehetett kimutatni a toxint. Korábbi vizsgálatunkban (Meyer és mtsai, 2003; Kovács és mtsai, 2004) 100 mg/állat/nap FB1 etetését követően az esetek többségében a toxin kimutatható volt az agyvelőből. A súlyos klinikai tünetek között elhullott állatok agyvelejében általában magasabb koncentrációban volt jelen a toxin, mint a toxinhatást túlélt, levágott állatokban. Ez feltehetően az elvéreztetés hiányából eredt.
53
µg/kg
200
100
0
Tüdõ
Vese Máj
Szívizom Lép
M.p.m.
M.l.d.
Subcut.zsír
Abdom.zsír
8. a. ábra A FB1 megjelenése a különböző szövetekben (Boxplots)a
µg/kg
20
10
0
Tüdõ
M.p.m. Máj
Subcut.zsír Abdom.zsír
8. b. ábra A FB2 megjelenése a különböző szövetekben (Boxplots)a a
Grafikus megjelenítés: Mellőzve a kiugró értékeket, a téglalapok alsó és felső oldalának megfelelő ordináta minden esetben a legkisebb, illetve a legnagyobb értéket jelenti. A terjedelemnek (range) értelemszerűen ezek különbsége felel meg. A téglalap alakú terület alsó és felső széle közötti távolság az ún. interkvartilis (inter quartile range; IQR), amelybe a vizsgált változó adatainak pontosan az 50%-a esik. A mezőben látható vastag fekete vonal a mediánt jelöli. A kiugró (IQR kétszeresét meghaladó, illetve ezen felüli) értékek a legfelső vízszintes vonal felett * és o szimbólumokkal kerültek ábrázolásra.
54
55
56
Az emberi fogyasztás szempontjából legfontosabb izom- és zsírszövet többsége nem tartalmazott kimutatható mennyiségű FB1-et, kivéve egy állatot, amelynek abdominális zsírszövetében 111,2 µg/kg toxint mértünk. Bár a legtöbb esetben az abdominális és bőr alatti zsírszövet elhanyagolható mennyiségű FB2 toxint tartalmazott, ezekben a szövetekben a FB2 átlagos megjelenési aránya magasabb (4/1) volt, mint a többi szövet esetében (FB1/FB2=19/1). Jelen esetben szoros összefüggés (r=0,997; P<0,05) volt kimutatható az abdominális zsírszövetben mért FB1 és FB2 koncentrációja között. A kontroll állatok szerveiben nem volt kimutatható toxinmennyiség. 4. 2. 5. A toxin kiürülése A mikotoxinok forgalmára jellemző, hogy a felszívódott toxin egy része az epén keresztül a tápcsatornába kiválasztódik, ahonnan a bélsárral kiürül (Shephard és mtsai, 1994a). Az állatok közül csak a 277-es számú egyed epéje tartalmazott toxint, az viszont jelentős mennyiségben (322,8 µg/kg). A kísérlet 13. és 17. napja között gyűjtött bélsárminták FB1 tartalma átlagosan 49 µg/g volt, míg a vizelet 305 µg/l FB1-et tartalmazott. A szervezetből távozó exkrétumok mennyiségét figyelembevéve, a napi 50 mg FB1 5 napon át tartó fogyasztása alatt (250 mg/állat/5 nap) a vizelettel kiürült összes FB1 átlagosan 4,5 mg, míg a bélsárral távozó összes FB1 mennyisége átlagosan 28,2 mg volt. Következésképpen, az 5 nap alatt felvett összes toxin (2,25 mg/ttkg) átlagosan 13%-a ürült ki a bélsárral és a vizelettel, ennek kb. 86%-a a bélsárral és csak 14%-a vizelettel (8. táblázat).
57
58
A felvett FB2-ből jóval kevesebb ürült ki ezen az úton (vizeletben: 0,5%; bélsárban: 2,1%) (9. ábra). Erre vonatkozó eredményeink megegyeznek Shephard és Snijman (1999) eredményével, mely szerint vervet majmok esetében az egyszeri beadást követően 7 nap alatt 0,2% FB2 jelent meg a vizeletben. A toxin nagyobb hányadban a bélsárral ürült ki, elsősorban változatlan vagy részlegesen hidrolizált formában (Shephard és Snijman, 1999). Általánosan megállapítható, hogy a bélsárban, illetve a vizeletben a FB1 9- és 14szeres mennyiségben volt kimutatható, összehasonlítva azt a FB2-vel. A takarmányban a FB1-FB2 arány 2,6:1 volt, míg a FB1-FB2 kiürülési aránya 13:1. A két fumonizin analóg ürülésében megfigyelt különbség feltehetően nem csak az eliminációs időben keresendő (FB2 hosszabb eliminációja), hanem az eltérő mértékű metabolizmus is számba vehető. A vizelettel és a bélsárral kiürült összes FB1 mennyisége között nem volt statisztikailag igazolható összefüggés. 16 14 12 10
FB1
(%) 8
FB2
6 4 2 0 1
2
3 4 vizelet- és bélsárgyűjtési periódus napjai
5
9. ábra A fumonizin B1 és B2 átlagos kiürülése az 5 napos periódusban (a napi toxin felvétel százalékában) Összefoglalva tehát eredményeink azt mutatják, hogy a folyamatos toxinterhelés során a naponta felvett FB1 13-15%-a ürül ki a szervezetből a bélsárral és a vizelettel. Ezzel ellentétben patkányokon végzett vizsgálatok szerint a 14C-el jelölt FB1 szinte teljes egészében visszanyerhető volt a bélsárban és a vizeletben. A 14C izotóppal jelölt, orálisan adagolt FB1 túlnyomó része (kb. 90%) a bélsárral és kevesebb, mint az 1%-a vizelettel ürül ki (Prelusky és mtsai, 1994, 1996a). Ugyanakkor a patkány kísérletekben kapott eredmények sertésre történő adaptálhatósága kétséges, ugyanis egy vizsgálat szerint az elimináció és a testtömeg fordított arányban áll egymással; pl. egér és patkány esetében az
59
elimináció gyors, míg pl. emberből- feltételezések szerint- lassabban ürül ki a toxin (Delongchamp és Young, 2001). Alátámasztja ezt a feltételezést az a közlés is, amely szerint sertések esetében 2 héttel a 2-3 mg/tak.kg dózis alkalmazása után is fellelhető volt a FB1 a májban és a vesében, túlnyomó részben változatlan kémiai formában (Prelusky és mtsai, 1996b). Az izotóppal jelölt FB1-el végzett vizsgálatok eredményeinek összehasonlítása saját eredményeinkkel azonban jó alapot szolgálnak arra vonatkozóan, hogy azt feltételezzük, hogy a FB1 jelentős része átalakul a szervezetben. A szervekben, illetve az exkrétumokból kimutatható toxinkoncentrációt annak metabolizmusa is befolyásolhatja, ugyanis néhány mikotoxin eredeti kémiai formája megváltozhat a máj xenobiotikum-transzformáló enzimredszere, illetve az intesztinális mikrobiota által is. A FB1 metabolizmusáról kevés adat ismert. In vitro kísérletekben patkány máj- és vesehámsejtekben nem történt molekuláris átalakulás (Niel, 1998), azonban emlősökkel végzett kísérlet alapján feltételezhető, hogy a toxin bizonyos hányada a bélben átalakul. Vervet majmokkal végzett kísérletben a FB1 főleg a bélsárral távozott a szervezetből, nagyrészt eredeti formában, illetve annak részlegesen hidrolizált származékaként (Shephard és mtsai, 1995). A szerzők a fumonizinek alacsony biológiai hozzáférhetőségének ismeretében azt feltételezték, hogy a hidrolízis a bélcsatornában történt meg, intesztinális észteráz enzimek vagy mikroorganizmusok tevékenysége által (Shephard és Snijman, 1999). Kérődzőkön végzett vizsgálatok szerint a bélsárban megjelent összes toxin 6090%-a szintén hidrolizált (Rice és Ross, 1994). Mivel saját kísérletünk eredményei csak a FB1 változatlan kémiai formájára vonatkoznak, így a szakirodalmi adatok alapján feltételezhető, hogy a toxin nagyobb hányada részben és/vagy teljesen hidrolizált formában ürült ki a szervezetből.
60
4.3. A fumonizin B1 felszívódása, biotranszformációja és kiürülése (II. állatkísérlet eredményei) 4. 3. 1. Klinikai tünetek Az I. állatkísérletben tapasztaltakhoz hasonlóan a toxintartalmú takarmány fogyasztása nem okozott klinikai tüneteket, valamint ezesetben sem tapasztaltunk takarmányfelvétel csökkenést. 4. 3. 2. Hematológiai és biokémiai eredmények A kezelt állatok hematológiai és klinikai kémiai paraméterei a fiziológiás határértékek (Friendship és Henry, 1992) között mozogtak, illetve azokban a kontroll állatok paramétereihez képest sem tapasztaltunk szignifikáns emelkedést. 4. 3. 3. Kórbonctani vizsgálatok eredményei Az I. állatkísérletben feltüntetett kórbonctani eredmények (4.2.3. fejezet) szinte mindenben megegyeznek a jelen esetben, első ízben (10 napos toxinterhelés utáni; n=5) elvégzett kórbonctani vizsgálatban tapasztaltakkal. A 4.2.3. fejezetben feltüntetetteken kívül és ezzel ellentétben, a szívburokban 2-7 ml savós folyadékot, illetve néhány állat esetében hyperplasias lépet figyeltünk meg. A megfigyelhető tüdőödémát enyhe vagy közepes mértékűnek ítéltük. A második alkalommal elvégzett (10 napos kiürülési időszak utáni; n=5) kórbonctani vizsgálatok során 4 állat boncolásakor észleltünk savós folyadékot (8-9 ml) a szívburokban, illetve minden állat vizsgálatakor szembetűnő volt az enyhe fokú tüdőödéma. Egy állat esetében tapasztaltunk egyéb elváltozást (fakó, sárgás színű vese). 4. 3. 4. A fumonizin B1 felszívódására irányuló vizsgálatok eredményei A fumonizin B1 felszívódása, a takarmány és a béltartalom FB1 (illetve annak metabolitjai) és Cr tartalmának egymáshoz viszonyított aránya alapján kvantitatív módon meghatározható volt. A kísérleti táp Cr, illetve fumonizin B1 koncentrációjának ellenőrzése során a takarmányban 3,8 g/kg krómot és 45 mg/kg FB1-et határoztunk meg. A fumonizin B1 felszívódásának értékelésekor -a takarmány Cr-FB1 arányából következtetve- a Cr:FB1=85:1 arányszámítást, illetve az ettől az aránytól való eltérést vettük alapul.
61
A számítások során figyelembe vettük a Cr visszanyerhetőségét, illetve – a toxinetetés első napjának kivételével – korrigáltunk az epével történő eliminációval is (3.3.3. fejezet). 9. táblázat A fumonizin B1 becsült felszívódási aránya Abszorpció aránya* (%) Értékelt chymusEgyedek minták száma (n) T1 9 T2 10 T3 6 T4 8 T5 7 T6 8 T7 8 T8 8 T9 6 T10 10 Σ 80
a
Átlag
±SEa
8,2 2,6 3,4 0,8 1,9 6,1 2,0 5,7 4,0 5,1 3,9
1,7 0,6 0,8 0,2 0,6 1,5 0,6 1,1 0,4 0,9 0,7
Standard hiba *A számítás során figyelembe vettük a chymusban megjelent metabolitok relatív molekulatömegét. Az értékelés során 8 adatot kiugró érték gyanánt kivettünk az adatsorból, 12 esetben pedig technikai okok miatt meghiúsult a mintavétel.
A 9. táblázat a 10 napos felszívódásra vonatkozó vizsgálat eredményeit mutatja, egyedenként. A 80 chymus mintából származó adatsor alapján megállapítható, hogy a fumonizin B1 akkumulatív felszívódása az ileum végéig maximum 8,2±1,7% volt. Az átlagosan 4%-os felszívódási arány azonban nem ad információt arra vonatkozóan, hogy ez az érték valójában mely származék(ok) abszorpciójának következménye. Ennek megállapításához további vizsgálatok szükségesek. Alacsony mértékű metabolizmust tapasztaltunk, azaz az eredeti fumonizin B1 molekulatömege alapján számított konverzió 1 (aminopentol), illetve 3,9% (részlegesen hidrolizált fumonizin B1 (PHFB1a és b)) volt. A FB1 átalakulásának aránya a különböző napokon gyűjtött chymusmintákban nem tért el szignifikánsan. Az állatok által naponta felvett toxin mennyisége és a felszívódott toxin aránya között sem volt statisztikailag kimutatható összefüggés.
62
Eddig egzakt, méréseken alapuló adat a fumonizin B1 felszívódására vonatkozóan az irodalomban nem volt elérhető. Szájon át történő egyszeri kezelés (10 mg/kg) után 3,5%-os biológiai hozzáférhetőséget becsültek, a vér, a máj és a vese toxintartalma alapján (Martinez-Larranaga és mtsai, 1999). Vérplazma és kiürülési adatok alapján (intragasztrikus adagolás) más szerzők (Prelusky és mtsai, 1994) magasabb, 3-6%-os FB1 hozzáférhetőséget ítéltek meg. Az irodalomban eddig nem volt arra vonatkozó kvantitatív adat, hogy történik–e a vékonybélben FB1 átalakulás. Shephard és mtsai egyik kísérletükben (1995) ugyan célul tűzték ki a vékonybél különböző szakaszaiból nyert chymus toxintartalmának meghatározását is, de ez meghiúsult, mivel az állatok leölésekor fellépő stressz, illetve a leölés előtti 24 órás koplaltatás a vékonybelek kiürülésével járt együtt. Így a vékonybéltartalomban (ahonnan a metabolitok, főleg a fumonizin B1 teljesen hidrolizálódott származéka még felszívódhat) esetlegesen előforduló metabolizmus mértéke ismeretlen maradt. Shephard és mtsai (1995) az epe toxintartalmát vizsgálva hidrolizált terméket (aminopentol) nem detektáltak. E tényt figyelembevéve azt feltételezték, hogy a hidrolízis csakis a bélben (nem pedig a májban) történhet meg. 4. 3. 5. A vizsgált szervek fumonizin koncentrációja A 10. táblázatban látható, hogy a célszervekben/szövetekben mért FB1 koncentráció jelentősen kisebb értékeket mutat, mint az I. állatkísérletben. Ez feltehetően egyrészt a rövidebb toxin-etetési periódusnak (10 nap), másrészt pedig a naponta átlagosan felvett toxin alacsonyabb mennyiségének (36 mg) köszönhető. Az előző állatkísérlettel ellentétben azonban az izomminták minden esetben 5-10-szeres mennyiségben tartalmazták a fumonizin B1 toxint, mindemellett a parciálisan hidrolizált forma koncentrációja is magasnak mondható. A musculus psoas major esetében még a toxinterhelés megszüntetése után is jelentős mennyiségeben volt kimutatható az aminopentol, sőt, arányát tekintve meghaladta az eredeti molekula moláris koncentrációját. A többi vizsgált szövet esetében ilyen irányú arányeltolódásról nem beszélhetünk. A két állatkísérlet eredményeit összevetve a célszervekben (tüdő, máj), illetve az izomban megjelent toxin mennyiségében, illetve relációjában (toxinfelvétel – koncentráció a célszervekben és a periférián: egyenes, illetve fordított arány) jelentős eltéréseket tapasztaltunk. Ez feltehetően abból adódott, hogy a hosszabb expozíció hatására a májeredetű védelmi funkció felerősödött, illetve bizonyos fokig alkalmazkodott a folyamatos, nagy mértékű, szervezetet terhelő hatáshoz. Ez okozhatta azt a jelenséget, hogy a toxint hasonló dózisban, de hosszabb ideig (I. állatkísérlet) etetve a májban magasabb, míg periférián alacsonyabb
63
koncentrációban volt mérhető a toxin, összehasonlítva a II. állatkísérlet eredményeivel (rövidebb expozíció). A fumonizin B1 toxin – ez esetben is – a májban jelent meg a legmagasabb koncentrációban, mindkét vizsgált időpontban. Mindenképp figyelemre méltók a vesében mért értékek, hiszen azon túl, hogy a máj után a vese tartalmazta a legmagasabb koncentrációban a FB1-et, mindkét mintavételi időpontban magas aminopentol koncentrációt is mértünk. A FB1 konverziója aminopentolra átlagosan 30%-os, míg a részlegesen hidrolizálódott metabolitokra vonatkozóan 20%-os volt. A vizsgált szövetek többsége 10 nappal a toxinterhelés megszüntetése után is tartalmazott FB1-et (50%) és aminopentolt (50%). Korábbi kísérleteinkben (I. állatkísérlet, Meyer és mtsai, 2003) az elvéreztetett állatok agyvelőmintáiban nem vagy csak nagyon alacsony koncentrációban találtunk FB1-et, míg ebben a vizsgálatban mindkét időpontban mérhető mennyiségben jelen volt az aminopentol. Feltételezésünk szerint az aminopentol megjelenése az agyban, apoláros jellegének, illetve jelentősen kisebb molekulatömegének köszönhető, amely a vér-agy gáton való átjutását segítheti.
64
10. táblázat A fumonizinek szervekben mért koncentrációja (µg/kg), illetve a FB1 molekula konverziója Szervek/Szövetek
Tüdő
Máj
Vese
Agy
Lép
M. longissimus dorsi
M. psoas major
Abdominális zsírszövet
Subcut. zsírszövet
FB1 AP1 PHFB1 FB2 FB1 AP1 PHFB1 FB2 FB1 AP1 PHFB1 FB2 FB1 AP1 PHFB1 FB2 FB1 AP1 PHFB1 FB2 FB1 AP1 PHFB1 FB2 FB1 AP1 PHFB1 FB2 FB1 AP1 PHFB1 FB2 FB1 AP1 PHFB1 FB2
Fumonizinek koncentrációjaa* és a FB1 konverziója 10 napos expozíció után, 10 napos kiürülési időszak közvetlenül (n=5) után (n=5)
Átlag
±SE
4,59 0,56 0,25 0,53 17,4 0,38 2,45 0,86 9,95 7,53 1,5 0,53 0,2 0,57 ND5 ND5 4,2 1 0,55 0,27 11,2 0,72 8,8 7,9 4,75 0,35 1,92 4,06 1,2 5,6 1,5 ND5 2,58 0,47 1,12 0,3
1,9 1,1 0,23 0,44 1,7 0,73 1,03 0,22 0,3 3,2 0,04 0,242 0,22 0,42 0,5 0,3 0,05 0,1 1,2 0,31 1,8 1,3 1,5 0,1 0,32 1,41 0,2 3,2 0,8 0,7 0,33 0,83 0,32
% 17,0 5,4
3,1 14,9
53,1 7,6
83,6
23,3 9,2
5,4 47,7
7,9 31,0
76,1 14,7
17,2 29,7
Átlag
±SE
0,93 0,31 ND5 ND5 8,25 0,16 ND5 ND5 3,62 2,1 ND5 0,34 ND5 0,25 ND5 ND5 0,41 0,18 0,04 ND5 0,95 0,03 ND5 0,23 1,41 2,59 ND5 0,28 0,9 3,6 0,5 ND5 0,3 0,1 ND5 ND5
0,1 0,281 0,5 0,23 0,1 0,9 0,22 0,11 0,12 0,043 0,02 0,22 0,022 0,13 0,1 1,5 0,14 0,13 0,7 0,1 0,12 0,12 -
*A felső indexben található számok azoknak a mintáknak a számát jelzik, amelyekben toxin nem volt detektálható. a ND nem detektálható SE: standard hiba
65
% 37,5
3,3
51,0
41,2 6,6
5,3
76,7
80,6 8
37,5
4. 3. 6. A toxin kiürülése A 20 napig tartó, teljes kísérleti periódus alatt 240 bélsár és ugyanennyi vizelet mintát gyűjtöttünk. A vizelet és a bélsár elkülönítése néhány esetben nem volt teljes, így természetesen ezeket a mintákat kizártuk az értékelésből. A toxinetetés időszakában (10 nap) a napi átlagos FB1 felvétel 36,6 ± 2,1 mg (2 mg/ttkg) volt, amely tendenciájában csak enyhe (5%) emelkedést mutatott. A bélsárminták FB1 koncentrációja a toxin adagolását követő első 5 napban folyamatosan nőtt, majd az 5.-től a 10. napig 55 µg/g érték körül mozgott. Ez utóbbi megegyezik az I. állatkísérletben mért értékek átlagával (50 µg/g). Az aminopentol bélsárban mért koncentrációja a 3. napot követően nem változott és viszonylag alacsony (6 µg/g) volt. A 3. napon gyűjtött minták aminopentol koncentrációjának átlagában mutatkozó emelkedést két állat egyedi értéke okozta. A PHFB1a és b együttes értéke ebben a periódusban tendenciáját és koncentrációját is tekintve nagyban hasonlított a FB1 értékekhez (10. ábra).
20 18
mg
16 14 12
FB1 AP1
10 8 6 4
PHFB1
2 0 1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
nap
10. ábra A toxinterhelés időszakában a bélsárban visszanyert metabolitok mennyisége (átlag±SE); n=10
66
A származékok moláris koncentrációját figyelembevéve a 11. táblázatban jól látható, hogy a FB1 és metabolitjainak aránya a bélsárban az 5. napot követően csak kis mértékben változott, azaz megjelenési arányuk (a fumonizin származékok összegét 100%-nak véve) FB1:AP1:PHFB1 = 41:12:47. Ez alapján megállapítható, hogy folyamatos toxinterhelés során az eredeti fumonizin B1 molekula átlagosan 60%-a hidrolizálódott a béltraktusban. 11. táblázat A fumonizin B1 konverziója (%)a* Mintavételi időpontok (nap) 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Aminopentol 16,5 24,6 11,1 11,4 11,9 10,0 10,2 11,5 18,9 Fumonizin 36,1 33,1 40,5 41,9 41,4 47,4 42,4 37,9 36,3 B1 Részlegesen hidrolizált FB1 47,4 42,3 48,4 46,7 46,7 42,7 47,5 50,6 44,8 (PHFB1a+b) a
Az első napon <1 mg fumonizin B1-et detektáltunk a bélsárban * Az átalakult és a változatlanul maradt FB1 moláris koncentrációjának összege= 100%
Az első tíz nap alatt a naponta felvett FB1 átlagosan 58%-a (21,7 mg) ürült ki a bélsárral, eredeti vagy metabolit formában. Hasonlóan az előző kísérlethez, a naponta felvett FB1 kb. 20%-a ürült ki változatlan formában. Az 5. nap és a 10. nap között viszont a naponta etetett toxin 72%-át (27,3 mg) nyertük vissza a bélsárban, a metabolitokkal együtt. A FB1 eliminációs profilja megegyezett Prelusky és mtsai (1996) által tapasztaltakkal, miszerint sertésnél, folyamatos, viszonylag hosszú idejű toxinterhelés során 24 órával az első toxintartalmú táp fogyasztása után jelent meg fumonizin a bélsárban. Ezt követően a kísérlet 4.-5. napjában tetőzött a visszanyert fumonizin mennyisége, majd ezután a naponta felvett és kiürült toxin mennyiségének vonatkozásában ún. kvázistacioner állapotot tudtak leírni. A toxin adagolásának időszakában a FB1 és PHFB1 bélsárban mért koncentrációja között közepesen szoros, negatív korrelációt találtunk (r= -0,4; P≤0,05), míg a FB1 és AP1 koncentrációja között statisztikailag kimutatható korreláció nem volt.
67
Már három nappal a kísérleti takarmány toxinmentesre történő lecserélését követően észlelhető volt a bélsár FB1 koncentrációjának és ezzel együtt a vizsgált metabolitok koncentrációjának jelentős mértékű csökkenése. A metabolitok kiürülésének arányával kapcsolatban elmondható, hogy a 13. nap után a PHFB1 az összesen kiürült fumonizin származék mennyiségéhez viszonyítva nagyobb arányban fordult elő a bélsárban, mint a FB1. A 15. napot követően már < 1 mg fumonizin származék ürült az állatok napi teljes bélsarával. A 11.a, és b ábrán jól látható, hogy a bélsár még 10 nappal a toxinterhelés megszüntetése után is tartalmazott kimutatható mennyiségű FB1-et és metabolitokat. 7000 6000 5000 AP1
4000 µg
FB1 PHFB1
3000 2000 1000 0 11.
12.
13. nap
14.
15.
70 60 50 AP1
40 µg
FB1 PHFB1
30 20 10 0 15.
16.
17.
18.
19.
20.
nap
11 a, b. ábra Naponta a bélsárral kiürült fumonizin B1 és metabolitjainak mennyisége a kísérleti takarmány megvonását követő 10 napban (n=5)
68
Korábbi, vervet majmokon végzett kísérletben (Shephard és mtsai, 1995), i.v. és szájon át történő adagolást követően is hasonlóan gyors FB1 eliminációt figyeltek meg a bélsáron keresztül, habár az egyedek adatai között a dózis teljes visszanyerésére vonatkozóan nagyfokú eltéréseket találtak. Nagy szórás mutatkozott az egyedek között a hidrolizált formák megjelenésének arányában is, de a részlegesen hidrolizálódott forma jelent meg fő metabolitként, míg az aminopentol alacsony részarányt képviselt az exkrétumban. A bélsárral kiürült FB1 arányával összevetve a kísérlet alatt felvett összes FB2 (átlagosan 68,8 mg) jóval kisebb hányada (23%) volt visszanyerhető ebben az exkrétumban (12. táblázat). Ugyanakkor Shephard és mtsai (1999) egyszeri dózist követően (vervet majmok) az adagolt toxin 8%-át nyerték vissza (7 napos kiürülési időszakot vizsgálva) eredeti formában. 12. táblázat A bélsárral kiürült FB2 mennyisége, napi felbontásban Naponta kiürült FB2 mennyisége (µg) Napok Átlag ±SE* Napok (n=10) (n=5) 1. 10,9 3,1 11. 2. 330 93,5 12. 3. 1421 405,1 13. 4. 1643 437,7 14. 5. 1851 480,3 15. 6. 1880 542,2 16. 7. 1688 420,0 17. 8. 2031 545,4 18. 9. 2367 522,5 19. 10. 2062 498,0 20. Toxinetetési Eliminációs 1530 395,7 periódus átlaga ±SE periódus átlaga ±SE
Átlag ±SE 660,3 658,3 234,0 104,6 15,3 10,5 4,3 5,4 3,3 4,2
59,0 54,2 61,7 48,8 5,1 2,0 1,3 1,5 1,0 1,3
170,0 23,6
*SE: standard hiba
Hasonlóan az I. állatkísérletben (4.2 fejezet) tapasztaltakhoz, jelen esetben is jelentősen magasabb volt a FB1/FB2 arány a bélsárban (10:1), mint a takarmányban (5:1). Figyelembevéve azonban a FB1 metabolitjait is, ez az arány (20:1) még inkább a FB1 javára tolódik el.
69
70
A vizeletben mért fumonizin koncentráció alapján megállapítható, hogy a kísérlet első periódusában állatonként összesen 5 mg FB1 származék ürült. A kísérlet második felében a vizelettel összesen kiürült FB1 mennyisége nem haladta meg a 0,5 mg-ot. A vizelettel kiürült FB1 a teljes kísérlet alatt etetett FB1 1,5%-a volt. Ezzel összehasonlítva az intakt FB2 sokkal kisebb arányban (0,6%) ürült a vizelettel (13. táblázat). A toxinetetés periódusában (1.-10. nap) a vizeletben mért származékok koncentrációja alapján a fumonizin B1 molekula konverziója 7%, illetve 18% volt az aminopentolra és az aminopoliolokra vonatkozóan. A FB1 75%-a eredeti formában távozott a szervezetből. Az ezt követő időszakban a vizelettel kiürült származékok aránya jelentősen megváltozott; 55% eredeti formában, 25% AP1ként és 30% PHFB1 formában ürült. Összességében megállapítható, hogy a 10 nap alatt elfogyasztott (átlagosan) 360 mg FB1-ből – a toxinetetés időszakát, illetve az ezt követő kiürülési periódust együtt értékelve (összesen 20 nap) – 247,5 mg FB1 származékot (69%) nyertünk vissza a bélsárral és a vizelettel. A kísérlet első 10 napjában 222 mg (90%), míg az ezt követő periódusban 25,5 mg (10%) FB1 származék eliminálódott az exkrétumokkal. Ez utóbbi arra enged következtetni, hogy a már felszívódott toxin mindkét exkrétummal (vizelettel és az epén át a bélsárral) ürül, eredeti vagy hidrolizálódott formában. Eredményeink nagyban hasonlítanak Prelusky és mtsai (1996) kísérletében tapasztaltakhoz, ahol a toxinetetés első 10 napjában az etetett 14C-FB1 teljes mennyiségének a 60%-át (< 1% ürült a vizelettel) nyerték vissza.
71
4.4. In vitro kísérlet eredményei Az in vivo kísérletben tett megállapításokat jól alátámasztják az in vitro vizsgálat eredményei. A 12. ábrán a különböző metabolitok molekulatömegében jelentkező eltérést kiküszöbölve az egyes származékok moláris koncentrációját tüntettem fel (felülúszó hányad). Látható, hogy a FB1 szuszpenzióban mért koncentrációja már a kísérlet 12. órájában jelentősen lecsökkent, ezzel párhuzamosan pedig nőtt a részlegesen hidrolizálódott formává átalakított toxin moláris koncentrációja. Az AP1-é konvertált toxin koncentrációja a kísérlet teljes időtartama alatt állandó értéken mozgott. Az aminopentollá történő konverzió foka jelentősen alacsonyabbnak mondható, mint az a részlegesen hidrolizálódott forma esetében. Gurung és mtsai (1999) által elvégzett in vitro kísérlet eredményei ellentétesek a fent említett eredményeinkkel, mivel a szerzők vizsgálata során a FB1 koncentrációja 24 órás inkubációt követően először jelentősen lecsökkent, majd az eltelt inkubációs idővel párhuzamosan nőtt. A kísérletük utolsó vizsgálati időpontjában (72 h) közel 100%-ban nyertek vissza fumonizin B1-et. Ezt a jelenséget a metabolitok standardjainak hiányában nem tudták kellőképpen megmagyarázni. Az ábra a két, egymást követően megismételt kísérlet adatait együtt értékeli. Jól látható, hogy az időpontonként gyűjtött, összesen 8 minta adataihoz, illetve azok átlagához alacsony szórás értékek párosulnak. A 12. és a 24. órában gyűjtött minták felülúszó hányadában a visszanyerhető toxin mennyiségében csökkenést tapasztaltunk. A felülúszóban megjelent összes toxin mennyiségében tapasztalt csökkenés okát megmagyarázta az – utólag elvégzett – üledék („sediment”) toxintartalmának méréséből származó eredmények (1100 ± 86 és 795 ± 102 µg/kg a 12. és a 24. órában). Feltételezésünk szerint ez a változás a leülepedő részben helyet foglaló baktériumok tevékenységével hozható összefüggésbe. Ennek pontos magyarázata azonban további vizsgálatokat igényel. A 48. és a 72. órában a leülepedő részben kevesebb, mint 60 µg/kg FB1 származékot mértünk.
72
6000 5000
µg/l
4000
bd
bce c
a
ac a
3000
FB1-AP1 ad
bd d
2000
FB1
a
FB1-PHFB1 e
össz FB1
c b
1000 0
ade
a cd
ab
ad
ad
bc
0
12
24
48
72
inkubálás időtartama (h)
12. ábra A fumonizin B1 metabolizmusa, in vitro (időpontonként n=8) a* a
Az egyes származékok esetében feltüntetett értékek azzal a fumonizin B1 mennyiséggel egyenértékűek, amelyből azok keletkeztek. * Az eltérő jelölések az egyes származékok különböző időpontokban mért koncentrációjában talált szignifikáns különbségeket mutatják, ahol a, b, c, d, e P ≤ 0,05
14. táblázat A fumonizin B1 konverziója, in vitro (%)a*
Aminopentol (AP1) Fumonizin B1 Részlegesen hidrolizált FB1 (PHFB1a+b)
Mintavételi időpontok (h) 0.a 12. 24. 48. 72. 1,8 0,9 0,6 0,5 0,9 96,7 77,3 66,2 52,1 50,2 1,4
21,7
33,1
46,4 48,8
a A 0. időpont a minimális 4 órás inkubációt követően vett mintát jelenti (A pozitív minták (n=4) átlagosan 4979±52 µg/l fumonizin B1-et tartalmaztak) * Az átalakult és a változatlanul maradt FB1 moláris koncentrációjának összege= 100%
Az egy-egy vizsgálati kémcsőben mért származékok koncentrációjából számított FB1 konverzió nagyban hasonlít az in vivo kísérletben tapasztaltakhoz (14. táblázat). A 48. vizsgálati időpontban a FB1 konverzió PHFB1-re vonatkozóan megközelítette az eredeti FB1 formában való megjelenés arányát, amely a 72. órában még kifejezettebb volt. A leülepedő részben (12. és 24. óra) mért metabolitok aránya a felülúszóban számított arányoktól szignifikánsan nem tért el. Az állatkísérlettel ellentétben, az in vitro vizsgálat adataiból számított
73
aminopentollá történő átalakulás mértéke viszont jóval alacsonyabb értéket mutatott, tendenciáját tekintve pedig megegyezett azzal. Az egyes időpontokban mért FB1 és PHFB1 (moláris) koncentrációk között közepesen szoros negatív korrelációt (r= -0,603; P≤ 0,05) állapítottunk meg, míg a FB1 és AP1 koncentrációja között nem találtunk összefüggést. Nagyfokú egyezőség fedezhető fel a 4.3. fejezetben leírtakkal, a bélsárban megjelent metabolitok mennyiségét illetően. A fent említett szoros negatív korrelációból arra lehet következtetni, hogy a legvalószínűbb biotranszformációs lépés emlős emésztőcsatornájában az egyik propán-1,2,3-trikarballilsav-csoport eltávolítása, azaz, hogy elsősorban a PHFB1 forma kialakulása domináns a metabolizmus során. Megállapítható továbbá, hogy az aminopentollá történő átalakulás nem jelentős a metabolizmus folyamán, mivel koncentrációja standard módon alacsony maradt a kísérlet teljes időtartama alatt. Ez élelmiszerbiztonsági szempontból mindenképp előnyös, hiszen több ízben igazolták az AP1, illetve az ebből a metabolitból kialakuló ceramid-származék toxikológiai veszélyét (Humpf és mtsai, 1998). Meg kell azonban jegyezni, hogy mind a bélsárban, in vivo (4.3. fejezet), mind pedig in vitro az aminopentol mérhető mennyiségben jelen volt. Elmondható, hogy az irodalomban közöltekkel legszorosabb egyezőséget az aminopentollá történő konverziót illetően találtunk. A 4.3. fejezetben már említett Shephard és mtsai (1995) vervet majmokkal végzett kísérletében a fumonizin metabolitok közül a fő megjelenési forma a részlegesen hidrolizált FB1 volt, míg aminopentolt csak csekély mennyiségben detektáltak a bélsárban. Az in vitro kialakult metabolitok kockázatának megítélését megnehezíti, hogy igen kevés információ áll rendelkezésünkre azok toxicitására, illetve biológiai hozzáférhetőségére vonatkozóan. Caloni és mtsai (2002) humán Caco-2 sejteket használva azt tapasztalták, hogy a különböző koncentrációban FB1-el, PHFB1-el és AP1-el kezelt (48 h) sejtek életképessége az intakt fumonizin B1 hatására változott meg leginkább. A celluláris abszorpciót vizsgálva, FB1-et és annak PHFB1a and b formáját egyetlen alkalommal sem detektáltak a sejtekben, míg az aminopentol dózis-függő abszorpciót mutatott. Következtetésképpen a szerzők úgy fogalmaztak, hogy az aminopentol biológiai hozzáférhetősége („bioavailability”) jóval nagyobb, mint az eredeti FB1 molekuláé, majd hangsúlyozták, hogy az aminopentol humán- és állategészségügyi szempontból is releváns rizikó faktor. Dantzner és mtsai (1999) [14C]-FB1 és [14C]-hidrolizált FB1 (AP1) kiürülését patkányokon vizsgálva azt tapasztalták, hogy nagyobb mértékű a [14C]hidrolizált FB1 vizelettel való kiürülése, összehasonlítva azt a [14C]-FB1 forma
74
ezen értékével, amely hozzáférhetőségét.
feltételezi
az
75
aminopentol
nagyobb
biológiai
5. KÖVETKEZTETÉSEK, JAVASLATOK A disszertációban megnevezett Fusarium verticillioides MRC 826 jelű törzs toxin-termelő képessége alapján megfelelőnek bizonyult fumonizin B1 laboratóriumi előállítására. A bemutatott módszer alkalmas a nagy koncentrációban fumonizineket tartalmazó gombatenyészet állatkísérleti célú előállítására. A módszer kidolgozása nélkülözhetetlen volt az állatkísérletek elvégzéséhez, mivel az irodalomban fellelhető eljárások reprodukálhatósága nem volt megfelelő. Tekintve a tisztított FB1 toxin kereskedelmi árát (1 mg 115 Euro; 2007. február), annak állatkísérleti célra történő felhasználása elérhetetlennek tűnik. A gombatenyészet előállítása előnyösebbnek bizonyul a tisztított toxin használatával szemben abban a vonatkozásban is, hogy az a természetben előforduló tenyészetekhez hasonló arányban tartalmazza a FB1, FB2 és FB3 toxinokat. Az elvégzett állatkísérletek arra engednek következtetni, hogy per os, 10 és 22 napig etetett, fumonizineket nagy dózisban (kb. 50 mg/kg FB1) tartalmazó takarmány sem okozott klinikai, illetve takarmány-visszautasítással vagy takarmányfogyasztás csökkenésével együtt járó tüneteket. Ezen kívül a hematológiai és a klinikai kémiai paraméterek sem mutattak eltérést a fiziológiáshoz képest. Kórbonctani elváltozás viszont mind a 22 napos, mind pedig a 10 napos terhelést követően is kialakult, elsősorban a tüdőben és a májban. A második ízben elvégzett állatkísérletben, 10 nappal a toxinterhelés megszüntetése után is szembetűnő elváltozások voltak megfigyelhetők. Az első körben elvégzett in vivo kísérletben, az intakt fumonizin B1 molekula meghatározásának birtokában nagyarányú hiányt véltünk felfedezni a vizelettel és bélsárral kiürült összes toxin mennyiségében, figyelembevéve azt az irodalmi közlést, miszerint a fumonizin B1 legfeljebb 0-6%-a hozzáférhető („bioavailable”). Részben erre alapozva végeztük el a következő állatkísérletet, amelyben már a metabolitokra is nagy figyelmet fordítottunk. Ez utóbbi állatkísérletet in vitro vizsgálatokkal is kiegészítve arra a következtetésre jutottunk, hogy a sertés emésztőcsatornájában élő mikrobiota képes az intakt fumonizin B1 molekulát hasonló toxicitású (parciálisan hidrolizálódott FB1), vagy attól nagyobb toxicitású (teljesen hidrolizálódott FB1, aminopentol) metabolitokká transzformálni. Az említett két metabolit közül az aminopoliol származékok kialakulása lényegesen nagyobb mérvű volt in vivo és in vitro is. Az aminopentol toxicitását (tízszer toxikusabb, mint az eredeti molekula), illetve molekulatömegét és apoláros jellegét (hatékonyabb felszívódás) tekintve könnyen belátható, hogy a vékonybélben lezajló aminopentollá történő átalakulás állat- és humánegészségügyi szempontból sem hagyható figyelmen
76
kívül. A vékonybéltartalomban mért jelölő anyag és a fumonizin B1 (és metabolitjai) koncentrációja alapján számított, átlagosan 4%-os akkumulatív felszívódási arány azonban nem ad információt arra vonatkozóan, hogy ez az érték valójában mely származék(ok) abszorpciójának következménye. Tekintve, hogy az összesen felvett fumonizin B1 70%-át nyertük vissza a bélsárral és a vizelettel, továbbá, hogy a toxin alacsony koncentrációban jelent meg a vizsgált szervekben/szövetekben, a hiányzó hányad sorsát illetően többféle magyarázat képzelhető el. Feltételezhető (1) újabb, még ismeretlen metabolit(ok) kialakulása; továbbá (2) egy (vagy több) eddig nem vizsgált szervben/szövetben való lokalizálódás; nem utolsó sorban (3) feltehetően hosszabb eliminációs periódus szükséges a fumonizin B1 (és metabolitjai) szervezetből való maradéktalan kiürüléséhez. A fentiekből kiindulva olyan további vizsgálatok elvégzése indokolt, amelyek egyrészt a vékonybél mikrobiota fumonizin B1 biotranszformációjában betöltött szerepére, másrészt az aminopentol felszívódására, illetve toxicitásának megállapítására (önmagában etetve) irányulnak. Továbbá szükségesnek tartom a parciálisan hidrolizálódott származék mélyebb vizsgálatát is, habár ez komoly technikai, analitikai nehézségeket támaszt. Ez utóbbi metabolitot önállóan etetve még nem történt vizsgálat, de in vitro elvégzett kísérletek szerint toxicitása megegyezik az eredeti molekula toxicitásával. Nem mellőzhetőek a fumonizin-kutatás területén olyan állatkísérletek sem, amelyek a toxin esetleges dózis-függő metabolizmusát és felszívódását célozzák. Fontosnak tartom a hosszú ideig (min. 4 hét) tartó etetési kísérletek beállítását, amelyekben az eddig leírt összes metabolit (beleértve az N-palmitoilaminopentolt is) a vizsgálat tárgyát képezné. A legfontosabb feladatnak azonban az új metabolit(ok) keresését, illetve a FB2 és FB3 toxinok in vivo átalakulásának a meghatározását tartom.
77
6. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1. Megállapítottam, hogy sertésben a szájon át szervezetbe juttatott intakt (2-2,2 mg/ttkg) és az emésztőcsatornában metabolizálódott fumonizin B1 akkumulatív felszívódása az ileum végéig átlagosan 4%-os. A chymusban az összes fumonizin B1 kevesebb, mint 5%-a volt jelen hidrolizált formában. 2. Vizsgálataim során megállapítottam, hogy a sertés szerveiben/szöveteiben az akkumulálódott FB1 átlagosan 50%-a változatlan kémiai formában, 30%-a aminopentolként, illetve 20%-a aminopoliolként jelent meg. 3. Kísérleteim eredményei alapján megállapítottam, hogy a folyamatos toxinterhelés során a FB1 átlagosan 60%-a hidrolizálódott a növendék sertések bélcsatornájában. A hidrolizált termékek közül az aminopoliol jelent meg nagyobb arányban a bélsárban (összes FB1 származék 48%-a). A vizeletben jelentősen alacsonyabb (40%) volt a FB1 metabolitok aránya. 4. Megállapítottam, hogy a sertések szöveteinek többsége, továbbá a bélsár és a vizelet 10 nappal a toxinterhelés megszüntetése után is tartalmazott FB1-et (illetve annak metabolitjait), valamint FB2-t. 5. In vitro, sertés vakbéltartalom modellrendszerben végzett vizsgálataim során megállapítottam, hogy a fumonizin B1 (5 µg/ml) az inkubálás előrehaladtával növekvő mértékben hidrolizálódott; 72 órás inkubálást követően a részlegesen hidrolizálódott toxin moláris koncentrációja közel azonos volt az intakt FB1 koncentrációjával, míg a fumonizin B1 kevesebb, mint 1%-a alakult át aminopentollá.
78
7. ÖSSZEFOGLALÁS A mikotoxinok kis dózisú, hosszantartó fogyasztása, mint környezeti terhelés, humán- és állategészségügyi vonatkozásban is rendkívül káros hatású. Az egészséges szervezet a mikotoxinok, mint xenobiotikus vegyületek egy jelentősebb részét képes átalakítani. Ennek során történhet detoxifikáció, de létrejöhetnek a kiindulási molekulánál toxikusabb, biológiailag aktívabb vegyületek is. A fumonizin B1 (FB1) metabolizmusáról –annak tényéről, helyéről, mértékéről– kevés adat ismert, amelyek mindemellett ellentmondásosak is. Kísérletes munkámban a következő célokat tűztem ki: 1) az állatkísérletek kivitelezéséhez nélkülözhetetlen, kellő mennyiségű fumonizin B1 toxin előállítása; 2) a FB1 szervezetben (in vivo) történő eloszlásának, átalakulásának, illetve kiválasztásának nyomon követése; 2) a FB1 metabolizmusának in vitro meghatározása. Ezen kísérletek jelentősége részben abban áll, hogy a sertés jól felhasználható a humán szervezetben történő metabolizmus prognosztizálására, másrészt az in vitro elvégzett kísérletekkel komplex képet alkothattunk a fumonizin B1 molekula biotranszformációjáról. A disszertációban bemutatott kísérletek módszertani szempontból három részre tagolódtak, bár céljukat tekintve megegyeztek; a fumonizin B1 molekula szervezeten belüli átalakulásának meghatározására irányultak. Az eredményeket a három fő kísérletes iránynak megfelelően foglaltam össze.
7. 1. Fumonizinek laboratóriumi úton történő előállítása Három, az irodalomban megtalálható módszer reprodukálásának tapasztalatai alapján –különös figyelmet fordítva Fazekas (1998) munkájára–, módszerfejlesztést végeztem a rendelkezésünkre álló Fusarium verticillioides MRC 826 jelű törzs fumonizin termeltetésére irányulóan. Ennek során három nélkülözhetetlen faktort (1.Médium mennyisége: 50 g; 2. Standard spóra szám: 106/ml; 3. Heti vízpótlás: 10 ml [aw=0,99, 23 oC-on]) vettem figyelembe, amelyeket egy kísérletsorozatban teszteltem. A kísérletek alapján megállapítható volt, hogy bár a legjelentősebbnek a vízaktivitás szerepe tűnt, a faktorok komplex módon befolyásolják a toxintermelést. A három faktort együttesen alkalmazva, a toxintermelés az első héten megindult, majd az inkubációs idő végéig lineáris növekedést mutatott. A módszerrel a toxint nagy koncentrációban (4454 ± 624,0 mg/kg FB1) tartalmazó gombatenyészetet állítottam elő.
79
A módszer nélkülözhetetlen volt az állatkísérletek elvégzéséhez, mivel az irodalomban fellelhető módszerek reprodukálhatósága nem volt megfelelő az adott törzsre vonatkozóan.
7. 2. In vivo kísérletek A szájon át történő fumonizin-terhelést (2-2,2 mg/ttkg) mindkét kísérletben nyolchetes kezdő életkortól 22, illetve 10 napon át végeztük, azonos genotípusba tartozó, ártány malacokon. A vizsgálatok célja a folyamatos fumonizinterhelés hatására történő szervezeten belüli eloszlás, illetve a kiürülés jellemzése volt. Ennek megfelelően ötnapos alkalmazkodási időszak után a kísérleti állatok takarmányába Fusarium verticillioides gombatenyészetet kevertünk, majd 5 napon keresztül (I. kísérlet), illetve a kísérlet teljes időtartama (20 nap) alatt (II. kísérlet) gyűjtöttük a vizelet és a bélsár teljes mennyiségét. A kísérlet végén az állatokat, bódításukat követően leöltük, majd kórbonctani vizsgálat után szerveikből/szöveteikből mintát vettünk. A második kísérleti beállításban speciális T-kanüllel (PVTC) láttuk el a malacokat, amely lehetővé tette a krómoxiddal (0,5%) jelölt kísérleti takarmányból a felszívódott FB1 mennyiségének meghatározását. Mindkét kísérletben az analízisek LC-MS rendszerre épültek. Az első kísérleti beállításban csak az intakt FB1 és FB2 analízisére került sor, míg a második kísérletben a fumonizin B1 metabolitjait (részlegesen hidrolizált FB1 [aminopoliol, “partially hydrolysed FB1” PHFB1]; teljes mértékben hidrolizálódott FB1 [aminopentol, AP1]) is meghatároztuk. A 2 mg FB1/ttkg 22 napig tartó etetését az állatok tünetmentesen túlélték. A vizsgált szervek közül a máj (99,4±11,8 µg/kg) és a vese (30,6±3,2 µg/kg) tartalmazta a legtöbb toxint. A humán táplálkozás szempontjából fontos izom és zsírszövet nem, vagy csak kis mennyiségben tartalmazott FB1-et (izom: 0,6±0,3; zsírszövet: 8,0±4,0 µg/kg). Az 5 nap alatt felvett toxinmennyiség átlagosan 13%a ürült ki a bélsárral és a vizelettel, ennek kb. 86%-a a bélsárral és 14%-a vizelettel. Ebben a kísérleti beállításban csak az intakt FB1 meghatározása történt meg, így a szakirodalmi adatok alapján, melyek szerint a fumonizin B1 alacsony mértékű (2-6%) felszívódással, illetve gyors, jelentős (70-90%) mértékű kiürüléssel jellemezhető, feltételeztük, hogy a toxin nagyobb hányada részben vagy teljesen hidrolizált formában ürült ki a szervezetből. A fent említett hipotézisünket egy újabb állatkísérlet beállításával vizsgáltuk meg. Megállapítottuk, hogy az intakt és az emésztőcsatornában metabolizálódott fumonizin B1 akkumulatív felszívódása (az ileum végéig) átlagosan 4%. A mérések során a béltartalomban visszanyert FB1 származék 95,1%-a eredeti
80
formában, 1%-a aminopentolként és 3,9%-a részlegesen hidrolizált metabolitként jelent meg. A célszervekben (máj, vese, tüdő) az előző kísérletben mért koncentrációk átlagához képest alacsonyabb értékeket (legnagyobb koncentráció a májban) mértünk, amely minden bizonnyal az átlagosan, naponta felvett toxin mennyiségében való eltérésnek és a toxinterhelés eltérő hosszának a következménye. A vizsgált szövetekben a FB1 átlagosan 50%-a változatlan kémiai formában jelent meg. A FB1 konverzió az aminopentolra átlagosan 30%os, míg a részlegesen hidrolizálódott metabolitokra vonatkozóan 20%-os volt. A vizsgált szövetek többsége 10 nappal a toxinterhelés megszüntetése után is tartalmazott FB1-et (50%) és aminopentolt (50%). A FB1 és metabolitjai bélsárban való megjelenésének aránya az 5. napot követően csak kis mértékben változott, azaz a bélsárban visszanyert összes fumonizin B1 származék átlagosan 60%-a részlegesen (48%) vagy teljesen (12%) hidrolizálódott metabolitként jelent meg. A toxin adagolásának időszakában a FB1 és PHFB1 bélsárban mért koncentrációja között közepesen szoros, negatív korrelációt találtunk (r= – 0,4; P≤ 0,05), míg a FB1 és AP1 koncentrációja között statisztikailag kimutatható összefüggés nem volt. Három nappal a kísérleti takarmány toxinmentesre történő lecserélését követően, a bélsárban a parciálisan hidrolizálódott forma jelent meg túlsúlyban (75%). A bélsár 10 nappal a toxinterhelés megszüntetése után is tartalmazott kimutatható mennyiségű FB1-et és metabolitokat. Az etetett FB1 1,5%-a ürült ki a vizelettel; ennek átlagosan 65%-a intakt, 16%-a aminopentol, 24%-a pedig aminopoliol formában, míg a felvett FB2 23%-a ürült ki a bélsárral, és 0,6%-a a vizelettel, eredeti kémiai formában.
7. 3. A fumonizin B1 metabolizmusára irányuló in vitro kísérlet A mikrobiális fermentáció hatására kialakuló biotranszformáció vizsgálata céljából in vitro kísérletet végeztünk, amelyben sertések vakbéltartalmát McDougall pufferben, tisztított fumonizin B1 (5 µg/ml) hozzáadásával, 72 órán keresztül (37oC, anaerob körülmények) inkubáltuk. A kezdeti időpontban (0. időpont), illetve 12, 24, 48 és 72 óra elteltével, időpontonként 4-4 kémcsövet távolítottunk el. A teljes kísérletet változatlan körülmények mellett két ismétlésben végeztük el. A mikotoxin-analízis a 7.2. fejezetben leírtak szerint történt. Az inkubáció idejének növelésével párhuzamosan, az intakt fumonizin B1 molekula növekvő mértékben hidrolizálódott; 72 órás inkubálás hatására a parciálisan hidrolizálódott metabolit moláris koncentrációja közel azonos volt (49%) az eredeti FB1 koncentrációjával. In vitro a fumonizin B1 kevesebb, mint 1%-a alakult át aminopentollá. Az egyes időpontokban mért FB1 és PHFB1
81
koncentrációja között közepesen szoros negatív korrelációt (r= –0,603; P≤ 0,05) állapítottunk meg, míg a FB1 és AP1 koncentrációja között statisztikailag nem találtunk összefüggést. Az állatkísérleteket in vitro vizsgálatokkal is kiegészítve arra a következtetésre jutottunk, hogy a sertés emésztőcsatornájában élő mikrobiota képes a fumonizin B1 molekulát hasonló toxicitású (parciálisan hidrolizálódott FB1), vagy attól nagyobb toxicitású (teljesen hidrolizálódott FB1, aminopentol) metabolittá transzformálni. Az említett két metabolit közül az aminopoliol kialakulása nagyobb mérvű in vivo és in vitro is. A fumonizin B1-aminopentol transzformáció alacsony mértéke ellenére is figyelmet érdemel, hiszen a keletkezett molekula mind toxicitását (tízszer toxikusabb, mint az eredeti molekula), mind pedig apoláros jellegét (hatékonyabb felszívódás) tekintve újabb kockázati tényezőt jelent, állat- és humánegészségügyi szempontból egyaránt. Eredményeink új adatokat szolgáltatnak a fumonizin B1 in vivo (sertés szervezetében) és in vitro metabolizmusára vonatkozóan. A disszertáció összeállítása során a szerzőben új igényként fogalmazódott meg a további metabolitok felderítése és az önmagukban etetett származékok szerepének meghatározása.
82
8. SUMMARY Prolonged consumption of mycotoxins in low doses, as an environmental factor, compromises both animal and human health markedly. A healthy organism is able to convert most of the mycotoxins handling those as xenobiotics compounds. During this, detoxication or such a metabolic activity starts, in which more toxic and biologically active compounds develop. Only a few and paradoxical data have been reported about the metabolism of fumonisin B1 (FB1), namely about its fact, location and degree. The present experimental work was aimed (1) to produce fumonisin B1 toxin in sufficient quantities, being essential for animal toxicological experiments, than (2) to investigate the distribution, transformation and elimination of FB1 in vivo, moreover (3) to determine its metabolism in vitro. The impact of these trials is partly that the swine, like human model shows highly similar reactions to those of humans. On the other hand, trials on animals were complemented with an in vitro experiment, to obtain a more complex view of fumonisin B1 biotransformation. Experiments presented in the Ph.D. thesis can be sub-orded into three main parts from a methodological point of view. However, all of them had a common goal, namely the investigation of the biotransformation of FB1 in the organism. Studies carried out are summarized below according to the three divergent aspects.
8. 1. Fumonisin production under laboratory conditions Studies were performed to improve the earlier published fumonisin toxin production methods for the strain Fusarium verticillioides MRC 826, on the basis of three methods, laying special emphasis on the method of Fazekas (1998). During this process three factors (Factor 1. Quantity of medium: 50 g; Factor 2. Standardized spore suspension from the lyophilized conidia: 106 /ml; Factor 3. Water added weekly to flask: 10 ml) were taken into account. These were set to pre-defined values and the toxin production was tested. It was stated that even if the water activity had the most pronounced effect on improving yield, all the investigated factors affected production with similar efficiacy. Applying Factors 1, 2 and 3 together, the toxin production started on the first week and continued to increase linearly after this phase. With the developed method, fungal cultures containing high levels of FB1 (4454 ±624.0 mg/kg FB1) were prepared.
83
Taking the lack of adaptability of the earlier published methods for the toxin production with the above mentioned strain into consideration, the developed method seems to be essential for animal experiments.
8. 2. In vivo experiments The oral fumonisin load (2-2.2 mg FB1/kg b.w.) was performed on weaned barrows (Hungarian Large White) from the age of 8 weeks, in 10 and 22-day trial periods. The main purpose of these investigations was to characterize the effects of continuous toxin load on the toxin localization within the body and on its elimination. Accordingly, after a 5-day adaptation period, a Fusarium verticillioides fungal culture was mixed into the diet of experimental animals, and the total quantity of urine and faeces was collected either for 5 (experiment I.) or for 22 (experiment II.) days. At the end of the experiments, piglets were sacrificed after sedation and than after gross pathological examinations several organs were sampled. In the second in vivo experiment, special T-cannulas (PVTC) were implanted into weaned piglets, in order to determine the absorption of FB1 from the diet marked by Cr2O3 (0.5%). Analyses were carried out by LC-MS technique (Institute of Animal Hygiene of the Technische Universität München). In the first experiment only the intact FB1 and FB2, while in the second one, also the metabolites of FB1 (partially hydrolyzed FB1 [aminopolyol or PHFB1] and aminopentol [AP1]) were analyzed. The application of 2 mg FB1/kg b.w. did not cause clinical symptoms in the experimental animals. The highest toxin concentrations were found in the liver (99.4±11.8 µg/kg) and kidneys (30.6±3.2 µg/kg). Fumonisin B1 could not be detected or could only be found in very low concentrations in muscle and fat samples (muscle: 0.6±0.3 µg/kg; fat: 8.0±4.0 µg/kg), i.e. in the tissue types most widely used for human consumption. On average, 13% of the FB1 quantity taken up during the 5 days was excreted with the faeces and urine together, about 86% with the faeces and only 14% with the urine. These examinations apply only to the unchanged chemical form of FB1. Therefore – comparing the results to background literature data, the low (2-6%) absorption and rapid (70-90%) excretion – it was supposed that the major part of the toxin was excreted in partly or totally hydrolyzed form. Our above-mentioned hypothesis was tested in another in vivo experiment. It was established that the accumulative absorption of intact fumonisin B1 and that of its metabolites formed in the small intestine (till the end of ileum) is 4% in average. In the digesta, 95.1% of the total recovered fumonisin B1 compounds
84
were determined in an intact molecular form, while 1% and 3.9% of those were aminopentol and partially hydrolyzed FB1, respectively. With respect to the toxin content of target organs (liver, kidney, lung), much lower FB1 concentrations (maximum level in the liver) were measured, as compared to those in our earlier experiment. This was probably due to the difference between the daily feed intake and the length of the toxin load in the two trials. In the tissues investigated, 50% of the recovered FB1 was chemically unchanged. The efficiency of the FB1 conversion into aminopentol and partially hydrolyzed FB1 was 30% and 20%, respectively. In most of the organs, detectable amounts of FB1 (50%) and its metabolite, aminopentol (50%) were measured even 10 days after the dosage of the non-contaminated diet. The alteration of the percental ratio of FB1 to its metabolites in the faeces after the 5th day was only minor, namely 60% of the total fumonisin B1 compounds recovered in the faeces was determined as partially (48%) or totally (12%) hydrolyzed metabolites. During the toxin exposure, a relatively close correlation (r = –0.4, P<0.05) was found between the concentration of FB1 and PHFB1 in the faeces samples, while there was no statistically significant correlation between the FB1 and AP1 concentrations. Three days after the cessation of toxin feeding, PHFB1 was the dominant compound (75%) in the faeces. Detectable amounts of FB1 and its metabolites were measured in faeces even 10 days after the feeding of the noncontaminated diet. 1.5% of the FB1 quantity taken up was excreted with the urine, about 65% in original, 16% in totally hydrolyzed and 24% in partially hydrolyzed form, while 23% of the FB2 consumed during the trial was eliminated by the faeces and 0.6% via urine, in an unchanged chemical form.
8. 3. In vitro experiment focused on the metabolism of fumonisin B1 In vitro experiments were carried out to determine the metabolism of FB1 by the intestinal microbiota. For this purpose, suspensions of caecal contents in McDougall buffer solution were incubated anaerobically (37oC) with pure FB1 (5 µg/ml) for 72 h. The tubes (4 tubes each time) were sampled after 0, 12, 24, 48 and 72 h. The experiment in the above-described form was performed in two repetitions. Mycotoxin analysis was carried out according to chapter 8.2. Along the incubation the hydrolysis of the intact FB1 form increased; after 48 hours, the conversion of FB1 into PHFB1 (46%) was near to the percental ratio of FB1, while in the 72nd h it reached 49%. Less then 1% of the original FB1 was converted to aminopentol throughout the 72 h-long incubation.
85
A relatively close negative correlation (r= –0.603; P≤ 0.05) was found between the concentration of FB1 and PHFB1 determined at the different sampling times, while there was no significant correlation between the concentrations of FB1 and AP1. From the in vivo animal experiments complemented with the in vitro approach, we could draw a conclusion that the intestinal microbiota of pigs is able to transform the intact FB1 to a similarly toxic substance (partially hydrolyzed FB1) or to a more toxic metabolite (aminopentol). As a general conclusion, from the two metabolites, aminopolyol has priority during the metabolic process, in vivo and in vitro, as well. The conversion of FB1 to AP1 is notable even despite of its little amount, because this new compound means a new risk from the viewpoint of animal- and human health as well, taking into account that aminopentol appears to be tenfold toxic than the FB1, and that it is hydrophobic molecule (more effective absorption). Results may provide new data in field of fumonisin research, mainly from the aspects of judgement of fumonisin metabolism in the organism. Further studies are needed to explore new metabolites, and to determine the role of the derivatives after their separate feeding.
86
9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Hálás köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Kovács Melinda professzor asszonynak, aki pótolhatatlanul értékes tanácsokkal látott el a doktori képzés során, valamint támogatta tevékenységemet és a disszertáció elkészítését. Köszönettel tartozom Dr. Horn Péter akadémikus úrnak, a Doktori Iskola vezetőjének, hogy támogatta és lehetővé tette doktori témám elfogadását. Köszönetemet fejezem ki Dr. Babinszky László professzor úrnak, a Kaposvári Egyetem rektorának folyamatos szakmai segítségéért és a kísérleti lehetőségek biztosításáért, továbbá Dr. Johann Bauer professzor úrnak (Müncheni Műszaki Egyetem, Állattudományi Tanszék) az analitikai lehetőségek megteremtéséért. Ezúton is köszönetet szeretnék mondani az Élettani és Állathigiéniai Tanszék összes munkatársának önzetlen és odaadó szakmai támogatásáért. Tiszteletemet és köszönetemet szeretném kifejezni Oláh Editnek (SzIE, ÁOTK, Könyvtár) a számtalan, szakirodalom beszerzése során nyújtott segítségéért. Hálásan köszönöm Dr. W.C.A. Gelderblom és Dr. Gordon S. Shephard professzor úr (Medical Research Council, PROMEC Unit, Tygerberg, DélAfrika) odaadó segítségét, amely nélkül a dolgozat nem készülhetett volna el. Nagyrabecsülésemet és köszönetemet fejezem ki Dr. Stephen M. Poling úrnak (Mycotoxin Research, National Center for Agricultural Utilization Research, United States Department of Agriculture, Peoria, U.S.A.) a PHFB1 standard önzetlen felajánlásáért. Külön köszönettel tartozom Dr. Fazekas Bélának (Országos Állategészségügyi Intézet, Debrecen), Dr. Sarudi Imre professzor úrnak és Dr. Mézes Miklós professzor úrnak (SzIE Gödöllői Kar) szerteágazó, elméleti és gyakorlati téren egyaránt nyújtott segítségéért. Köszönettel és hálával tartozom Dr. Szabó Andrásnak és Dr. Molnár Tamásnak (Kaposvári Egyetem, ÁTK) a szakmai és a számtalan, lektorálásban nyújtott segítségükért. Ezúton szeretnék köszönetet mondani Családom tagjainak, hogy megértők és türelmesek voltak hozzám, és áldozatkész segítségükkel lehetővé tették, hogy ez a dolgozat elkészüljön.
87
10. IRODALOMJEGYZÉK 1.
2.
3. 4. 5.
6.
7. 8.
9.
10.
11. 12. 13.
14. 15.
Abbas, H. K., Gelderblom, W. C. A., Cawood, M. E., Shier, W. T. 1993. Biological Activities of Fumonizins, Mycotoxins from Fusarium moniliforme, in Jimsonweed (Datura stramonium L.) and Mammalian Cell Cultures, Toxicon. 31:345–353. Alberts, J. F., Gelderblom W. C. A., Thiel P. G., Marasas W. F. O., Van Schalkwyk D. J., Behrend Y. 1990. Effects of temperature and incubation period on the production of fumonizin B1 by Fusarium moniliforme. Appl. Environ. Microbiol. 56:17291733. Ádám, Faragó, Manchovich, Mandl, 1996. Orvosi biokémia. Semmelweis Kiadó. Bacon, C.W., Williamson, J.W., 1992. Interactions of Fusarium moniliforme, its metabolites and bacteria with corn. Mycopathologia. 117: 65–71. Barna-Vetro, I., Szabo, E., Fazekas, B., Solti, L., 2000.Development of a sensitive ELISA for the determination of fumonizin B-1 in cereals J. Agr. Food. Chem. 48: 2821-2825 Becker, B.A., Pace, L., Rottinghaus, G.E., Shelby, R., Misfeldt, M. Ross, P.F. 1995. Effects of feeding fumonizin B1 in lactating sows and their suckling pigs. Am. J. Vet. Res. 56:253–1258 Bell, R.M., Hannun. Y.A., Merrill, A.H. 1993. Advances in lipid research: sphingolipids and their metabolites. Orlando, Florida, Academic Press, vol 25-26. Bermudez, A.J., Ledoux, D.R., Rottinghaus, G.E., Bennett, G.A. 1997. The individual and combined effects of the Fusarium mycotoxins moniliformin and fumonizin B1 in turkeys. Avian Dis. 41: 304-311. Bezoidenhout, S. C., Gelderblom, W. C. A., Gorstallman, C. P., Horak, R. M., Marasas, WFO, Spiteller, G. and Vleggaar, R. 1988. Structure elucidation of the fumonizin mycotoxins from Fusarium moniliforme. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 11:743-745 Binkerd, K.A., Scott, D.H., Everson, R.J., Sullivan, J.M., Robinson, F.R. 1993. Fumonizin contamination of the 1991 Indiana corn crop and its effects on horses. J. Vet. Diagn. Invest. 5:653-655. Booth, C. 1971. The genus Fusarium. Commonwealth Mycol. Inst. Kew, Surrey, 237 pp. Bucci, T.J., Hansen, D.K., LaBorde, J.B. 1996. Leukoencephalomalacia and hemorrhage in the brain of rabbits gavaged with mycotoxin fumonisin B1. Nat. Toxins. 4: 51-52. Bullerman, L.B., and Tsai, W.Y. 1994. Incidence and levels of Fusarium verticillioides, Fusarium proliferatum and fumonizins in corn and corn-based foods and feeds. J. Food Protection. 57:541-3. Bullerman, L.B. 1996. Occurence of Fusarium and fumonizins on food grains and in foods. Adv.Exp. Med. Biol. 392:27-38. Cahagnier, B., Melcion, D. and Richard-Molard, D. 1995. Growth of Fusarium moniliforme and its biosynthesis of fumonizin B1 on maize grain as a function of different water activities. Lett. Appl. Microbiol. 20:247 251.
88
16. Caloni, F., Spotti, M., Auerbach, H., Op den Camp, H., Gremmels, J.F., Pompa, G. 2000. In vitro metabolism of fumonizin B1 by ruminal microflora. Vet. Res. Commun. 24:379-87. 17. Caloni, F., Spotti, M., Pompa, G., Zucco, F., Stammati, A., De Angelis, I. 2002. Evaluation of Fumonizin B(1) and its metabolites absorption and toxicity on intestinal cells line Caco-2. Toxicon. 40:1181-188. 18. Caloni, F., Stammati, A.L., Raimondi, F., De Angelis, I. 2005. In vitro study with Caco2 cells on fumonizin B1: aminopentol intestinal passage and role of Pglycoprotein.Vet. Res. Commun. Suppl. 2:285-7. 19. Castellá, G., Bragulat, M.R., Cabañes, F.J. 1999. Fumonizin production by Fusarium species isolated from cereals and feeds in Spain. J. Food Prot. 62:811-813. 20. Cawood, M.E., Gelderblom, W.C.A., Vleggaar, R., Behrend, Y., Thiel, P.G., Marasas, W.F.O. 1991. “Isolation of the fumonizin mycotoxins: a quantitative approach”, J. Agric. Food Chem. 39:1958-1962. 21. Christian, K. R., Coup, M. R. 1954. Measurement of feed intake by grazing cattle and sheep. VI. The determination of chromic oxide in faeces. N.Z. J. Sci. Technol. 36:328-30. 22. Chu, F.S., Li, G.Y. 1994. Simultaneous occurrence of fumonizin B1 and other mycotoxins in moldy corn collected from the People’s Republic of China in regions with high incidences of esophageal cancer. Appl. Environ. Microbiol. 60: 847-852. 23. Collins, T.F., Shackelford, M.E., Sprando, R.L., Black, T.N., Laborde, J.B., Hansen, D.K., Eppley, R.M., Trucksess, M.W., Howard, P.C., Bryant, M.A., Ruggles, D.I., Olejnik, N., Rorie, J.I. 1998a. Effects of fumonizin B1 in pregnant rats. Food Chem. Toxicol. 36:397-408. 24. Collins, T.F., Sprando, R.L., Black, T.N., Shackelford, M.E., Laborde, J.B., Hansen, D.K., Eppley, R.M., Trucksess, M.W., Howard, P.C., Bryant, M.A., Ruggles, D.I., Olejnik, N., Rorie, J.I. 1998b. Effects of fumonizin B1 in pregnant rats. Part 2.Food Chem. Toxicol. 36:673-85. 25. Colvin, B.M., Cooley, A.J., Beaver, R.W. 1993. Fumonisin toxicosis in swine: clinical and pathologic findings. J. Vet. Diagn. Invest. 5:232-41. 26. Dantzer, W.R., Hopper, J., Mullin, K., Hendrich, S., Murphy, P.A. 1999. Excretion of (14)C-fumonizin B(1), (14)C-hydrolyzed fumonizin B(1), and (14)C-fumonizin B(1)-fructose in rats. J. Agric. Food Chem. 47:4291-6. 27. De Liguoro, M., Petterino, C., Mezzalira, G., Tenti, S., Ravarotto, L. 2004. Field observations in pigs exposed to fumonizin B1 contaminated feed.Vet. Hum. Toxicol. 46:303-5 28. Delongchamp, R.R., Young, J.F. 2001. Tissue sphinganine as a biomarker of fumonisininduced apoptosis. Food Addit. Contam. 18:255-61. 29. Doko, M.B., Visconti, A. 1994. Occurence of fumonizin B1 and B2 in corn and cornbased human foodstuffs in Italy. Food Addit. Contam. 11:433-439. 30. Dutton, M.F., 1996, Fumonizins, mycotoxins of increasing importance: their nature and their effects. Pharmacol. Ther. 70:137-161. 31. EC (European Commission), 2003. SCOOP task 3.2.10. „Collection of occurrence data of Fusarium toxins in Food and assessment of dietary intake by the population of
89
32.
33.
34.
35. 36.
37. 38.
39. 40.
41. 42.
43. 44.
EU member states”, Subtask III: Fumonizins. European Commission, DirectorateGeneral Health and Consumer Protection, Brussels, 485-577. http://europa.eu.int/comm/food/fs/scoop/task3210.pdf. Edrington, T.S., Kamps- Holzapple, C.A., Harvey, R.B., Kubena, L.F., Elissalde, M.H., Rottinghaus, G.E. 1995. Acute hepatic and renal toxicity in lambs dosed with fumonizin-containing culture material. J. Anim. Sci. 73:508-515. European Food Safety Authority (EFSA) 2005. Opinion of the CONTAM Panel related to fumonizins as undesirable substances in animal feed. (EFSA-Q-2003-040). The EFSA Journal. 235:1-32. Fazekas, B., Bajmócy, S., Glávits, R., Fenyvesi, A. 1997. Fumonizin mikotoxikózisok Magyarországon: lovak agylágyulása, sertések hízlalási tüdővizenyője. Magy. Áo. Lapja. 119:137-139. Fazekas, B. 1998. A kukorica FB1 és fuzariotoxin szennyezettsége, fumonizin mikotoxikózisok. PhD értekezés, Keszthely. Fincham, J.E., Marasas, W.F.O., Taljaard, J.J.F., Kriek, N.P.J., Badenhorst, C.J., Gelderblom, W.C.A., Seier, J.V., Smuts, C.M., Faber, M., Weight, M.J., Slazus, W., Woodroof, C.W., van Wyk, M.J., Kruger, M., Thiel, P.G. 1992. Atherogenic effects in a non-human primate of Fusarium verticillioides cultures added to a carbohydrate diet. Atherosclerosis. 94:13-25. Fodor, J., Kametler, L., Kovács, M. 2006. Practical aspects of fumonisin production under laboratory conditions. Mycotoxin Research, Vol. 22. (in press). Friendship, R.M., Henry, S.C. 1992. Cardiovascular System, Hematology, and Clinical Chemistry In: Leman, A.D. editor. Diseases of Swine. 7th edition. Iowa State University Press, Ames, Iowa, pp. 3–11. Galtier, P. 1998. Biological fate of mycotoxins in animals. Revue. Méd. Vét. 149:549554. Gelderblom, W.C.A., Jaskiewicz, K., Marasas, W.F.O., Thiel, P.G., Horak, R.M., Vleggaar,R., Kriek, N.P.J., 1988. Fumonizins-novel mycotoxins with cancerpromoting activity produced by Fusarium verticillioides. Apppl. Environ. Microbiol. 54:1806-1811. Gelderblom, W.C.A., Semple, E., Marasas, W.F.O., Farber, E., 1992. The cancerinitiating potential of the fumonizin B mycotoxins. Carcinogenesis. 13:433-437. Gumprecht, L.A., Beasley, V.R., Weigel, R.M., Parker, H.M., Tumbleson, M.E., Bacon, C.W., Meredith, F.I., Haschek, W.M. 1998. Development of fumonizin-induced hepatotoxicity and pulmonary edema in orally dosed swine: morphological and biochemical alterations. Toxicol. Pathol. 26:777-88. Gurung, N. K., Rankins, D. L., Jr, Shelby, R. A. 1999. In vitro ruminal disappearance of fumonisin B1 and its effect on in vitro dry matter disappearance. Vet. Human Toxicol. 41:196–199. Hammer, P., Blüthgen, A., Walte, H.G. 1996. Carry-over of fumonizin B1 into the milk of lactating cows. Milchwissenschaft. 51:691-695.
90
45. Hannun, Y. A., Loomis, C. R., Merrill, A. H., Jr., Bell, R. M., 1986. Sphingosine Inhibition of Protein Kinase C Activity and of Phorbol Dibutyrate Binding In Vitro and in Human Platelets, J. Biol. Chem. 261:12604–12609 46. Hannun, Y.A., Bell, R.M., 1989. Functions of sphingolipids and sphingolipid breakdown products in cellular-regulation. Science. 243: 500-507 47. Hannun, Y. A. and Bell, R. M. 1993. The Sphingomyelin Cycle: A Prototypic Sphingolipid Signalling Pathway, Adv. Lipid Res. 25:27–41 48. Harrison, L.R., Colvin, B.M., Greene, J.T., Newman, L.E., Cole, J.R., 1990. Pulmonary edema and hydrothorax in swine produced by fumonizin-B1, a toxic metabolite of Fusarium verticillioides. J. Vet. Diagn. Invest. 2:217-221. 49. Haschek, W.M., Motelin, G., Ness, D.K., Harlin, K.S., Hall, W.F., Vesonder, R., Peterson, R., Beasley, V.R., 1992. Characterisation of fumonizin toxicity in orally and intravenously dosed swine. Mycopathologia. 117:83-96. 50. Haschek, W.M., Gumprecht, L.A., Smith, G., Tumbleson, M.E., Constable, P.D. 2001. Fumonizin toxicosis in swine: an overview of porcine pulmonary edema and current perspectives. Environ Health Perspect. 109 Suppl 2:251-7. 51. Hendry, K. M., Cole, E. C., 1993. A review of mycotoxins in indoor air. J. Toxicol. Environ. Health. 38:183-198. 52. Hopmans, E.C., Hauck, C.C., Hendrich, S., Murphy, P.A., 1997. Excretion of fumonizin B1, hydrolyzed fumonizin B1, and the fumonizin FB1-fructose adduct in rats. J. Agric. Food Chem. 45: 2618-2625. 53. Howerth, E.W., Wyatt, R.D. Hayes, D.A. 1989. Equine leucoencephalomalacia in white tailed deer from North Carolina. J. Wildl. Dis. 25 pp. 384–387. 54. Humpf, H.-U., Schmelz, E.-M., Meredith, F.I., Vesper, H., Vales, T.R., Menaldino, D.S., Liotta, D.C., Merrill, A.H. Jr., 1998. Acylation of naturally occurring and synthetic 1-deoxysphinganines by ceramide synthase: formation of N-palmitoylaminopentol (PAP1) produces a toxic metabolite of hydrolyzed fumonizin (AP1), and a new category of ceramide synthase inhibitor. J. Biol. Chem. 273:1906019064. 55. Hunter, J. Hirst, B. H., 1997. Intestinal Secretion of Drugs. The Role of P-glycoprotein and Related Drug Efflux Systems in Limiting Oral Drug Absorption, Adv. Drug Deliv. Rev. 25:129–157. 56. IARC, 1993. Toxins derived from Fusarium verticillioides: Fumonizins B1 and B2 and fusarin C. In: Some naturally occurring substances: Food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins. Lyon, International Agency for Research on Cancer, pp 445-466 (IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans, Volume 56). 57. Kakuk, T., 1995. A sertések sajátos hízlalási tüdővizenyőjének kóroktana napjaink mikotoxinkutatásának tükrében. Egy régi kórkép új értelmezése? Magy. Áo. Lapja. 50:405-406. 58. Kollarczik, B., Gareis, M., Hanelt, M. 1994. In vitro transformation of the Fusarium mycotoxins deoxynivalenol and zearalenone by the normal gut microflora of pigs. Nat. Toxins. 2:105-10.
91
59. Kovács, F. 1990. Állathigiénia. Mezőgazda Kiadó. Budapest 60. Kovács, F., Ványi, A., 1993. Egyes nehézfémek, a nitrátok és a mikotoxinok mozgása a táplálékláncban. Magy. Áo. Lapja. 48:197-201. 61. Kovács, F., 2001. Penészgombák-mikotoxinok a táplálékláncban. A Magyar Tudományos Akadémia Agrártudományok Osztálya, Budapest. 62. Kovács, M., Fodor, J., Meyer, K., Mohr, K., Bauer, J., Repa I., Vetési, F., Horn, P., Kovács, F. 2004. A fumonizin B1 kimutatása sertés szöveteiben, nagy toxintartalmú takarmány etetését követően. Magy. Áo. Lapja. 126:146-154. 63. Köhler,T. 1993. Evaluation of techniques to collect ileal digesta in pigs. Ph.D.thesis of Anim. Nutr. Dept. Wageningen Agric. Univ. 64. Kriek, N.P.J., Kellerman, T.S., Marasas, W.F.O. 1981. A comparative study of the toxicity of Fusarium verticillioides (= F. verticillioides) to horses, primates, pigs, sheep and rats. Onderstepoort J. Vet. Res. 48:129-131. 65. Kubena, L.F., Edrington, T.S., Harvey, R.B., Buckley, S.A., Phillips, T.D., Rottinghaus, G.E., Casper, H.H. 1997. Individual and combined effects of fumonizin B1 present in Fusarium verticillioides culture material and T-2 toxin or deoxynivalenol in broiler chicks. Poult. Sci. 76:1239-1247. 66. LaBorde, J.B., Terry, K.K., Howard, P.C., Chen, J.J., Collins, F.X., Shackelford, M.E. Hansen, D.K. 1997. Lack of embryotoxicity of fumonizin B1 in New Zealand white rabbits. Fundam. Appl. Toxicol. 40:120–128. 67. Le Bars, J., Le Bars, P., Dupuy, J., Boudra, H., Cassini, R. 1994. Biotic and abiotic factors in fumonizin B1 production and stability. J. AOAC Int. 77:517-521. 68. Li, Y.C., Ledoux, D.R., Bermudez, A.J., Fritsche, K.L., Rottinghaus, G.E. 1999. Effects of fumonizin B-1 on selected immune responses in broiler chicks. Poult. Sci. 78: 1275-1282. 69. Maragos, C.M. 1997. Measurement of mycotoxins in food with a fiber-optic immunosensor. J. Clin. Lig. Assay. 20:136–140. 70. Marasas, W.F.O., Kriek, N.P.J., Wiggins, V.M., Steyn, P.S., Towers, D.K., Hastie, T.J. 1979. Incidence, geographic distribution and toxigenicity of Fusarium species in South African corn. Phytopathology. 69:1181-1185. 71. Marasas, W. F. O., Nelson, P. E., Toussoun, T. A. 1984. Toxigenic Fusarium species. Identity and mycotoxicology. Pennsylvania State University Press, University Park, Pa. 72. Marasas, W.F.O., Kellerman, T.S., Gelderblom, W.C.A., Coetzer, J.A.W., Thiel, P.G., Van der Lugt, J.J. 1988. Leukoencephalomalacia in a horse induced by fumonizin B1 isolated from Fusarium verticillioides. Onderstepoort J. Vet. Res. 55:197-203. 73. Marasas, W.F.O., Thiel, P.G., Gelderblom, W.C.A., Shephard, G.S., Sydenham, E.W., Rheeder, J.P. 1993. Fumonizins produced by Fusarium verticillioides in maize: Foodborne carcinogens of Pan African importance. Afr Newslett Occup Health Saf, 2/93(suppl): 11-18. 74. Marasas, W. F. O. 1996. Fumonizins: history, worldwide occurrence and impact. Adv. Exp. Med. Biol. 392:1-17.
92
75. Marasas, W. F. O., Miller, J. D., Riley, R. T., Visconti, A. (eds). 2000. Fumonizin B1, International Programme on Chemical Safety (IPCS, UNEP, ILO, and WHO). Environmental Health Criteria 219 (Geneva: WHO) 76. Marín, S., V. Sanchis, I. Vinas, R. Canela, N. Magan. 1995. Effect of water activity and temperature on growth and fumonizin B1 and B2 production by Fusarium proliferatum and F. moniliforme in grain. Lett. Appl. Microbiol. 21:298-301. 77. Martinez-Larranaga, M.R., Anadon, A., Diaz, M.J., Fernandez-Cruz, M.L., Martinez, M.A., Frejo, M.T., Martinez, M., Fernandez, R., Anton, R.M., Morales, M.E. Tafur, M. 1999. Toxicokinetic and oral bioavailability of fumonisin B1. Vet. Hum. Toxicol. 41:357–362. 78. Martinova, E.A., Merrill, A.H. 1995. Fumonizin B1 alters sphingolipid metabolism and immune function in BALB/c mice: immunological responses to fumonizin B1. Mycopathologia. 130:163-70. 79. Meredith, F.I., Torres, O.R., Riley, R.T., Merrill, A.H. 1999. Fumonizin B1 and hydrolyzed fumonizin B1 (AP1) in tortillas and nextamalized maize (Zea mays L.) from two different geographical locations in Guatemala. J. Food Protect. 62:12181222. 80. Merrill, A.H. 1991. Cell regulation by sphingosin and more complex sphingolipids. J. Bioenerg. Biomembr. 23:83-104. 81. Merrill, A.H., Jr., Sweeley, C.C. 1996. Sphingolipids: metabolism and cell signaling. In: Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes (Vance DE, Vance JE, eds). New York: Elsevier. 3-73. 82. Merrill, A.H., Jr., Grant, A.M., Wang, E., Bacon, C.W. 1996. Lipids and lipid-like compounds of Fusarium. In: Lipids of Pathogenic Fungi (Prasad R, Ghannoun, eds). Boca Raton, FL:CRC Press. 199-217. 83. Mesterházy, Á., Vojtovics, M. 1977. A kukorica Fusarium ssp. Okozta fertőzöttségének vizsgálata 1972-1975-ben. Növénytermesztés. 26:367-378. 84. Mesterházy, Á. 1993. A mycotoxinkérdés Magyarországon, különös tekintettel a Fusarium genusra. OMFB tanulmány. 85. Meyer, K., Mohr, K., Bauer, J., Horn, P., Kovács, M. 2003. Residue formation of fumonizin B1 in porcine tissue. Food Addit. Contam. 20:639–647. 86. Mézes, M. 2003. Vitaminok és mikotoxinok kölcsönhatásai baromfifajokban. A baromfi: baromfi- és nyúltenyésztők lapja. 4:28-30. 87. Michel, C., Van Echten-Deckert, G., Rother, J., Sandoff, K., Wang, E., Merrill, A.H. Jr. 1997. Characterization of ceramide synthesis. J. Biol. Chem. 272: 22432-22437. 88. Mirocha, C.J., Mackintosh, C.G., Mirza, U.A.,Xie, W., Xu, Y., Chen, J. 1992. Occurence of fumonizin in forage grass in New Zealand. Appl. Env. Micr. 58: 3196-3198. 89. Mokoena, M.P., Chelule, P.K., Gqaleni, N.: 2005. Reduction of fumonisin B1 and zearalenone by lactic acid bacteria in fermented maize meal. J. Food Prot. 68:20959. 90. Motelin, K., Haschek, W.M., Ness, D.K., Hall, W.F., Harlin, K.S., Schaeffer, D.J., Beasley, V.R. 1994. Temporal and dose response features in swine fed corn screenings contaminated with fumonizin mycotoxins. Mycopatology. 126:27-40.
93
91. Munkvold, G. P., Desjardins., A. E. 1997. Fumonizins in maize. Can we reduce their occurrence? Plant Dis. 81:556-565. 92. Muphy, P.A., Rice, L.G., Ross, P.F., 1993. Fumonizin B1, B2 and B3 content of Iowa, Wisconsin and Illinois corn and corn screenings. J. Agric. Food Chem. 41:263-266. 93. Nelson, P. E., Desjardins, A. E., Plattner., R. D. 1993. Fumonizins, mycotoxins produced by Fusarium species: biology, chemistry and significance. Annu. Rev. Phytopathol. 31:233-252. 94. Nelson, P.E., Juba, J.H., Ross, P.F., Rice, L.G. 1994. Fumonizin production by Fusarium species on solid substrates. J. AOAC Int. 77:522- 524. 95. Niel, G.E., 1998. Participation of animal biotransformation in mycotoxin toxicity. Rev Revue. Med. Vet. 149:555–560. 96. Norred, W.P., Plattner, R.D., Voss, K.A. 1989. Natural occurence of fumonizins in corn associated with equine leukoencephalomalatia (ELEM). Toxicologist. 9:258-260. 97. Norred, W.P., Plattner RD, Chamberlain WJ. 1993. Distribution and exretion of ([14C]) fumonizin B1 in male Sprague – Dawley rats. Nat. Toxins. 1: 341-346. 98. Norred, W.P., Plattner, R.D., Dombrink-Kurtzman, M.A., Meredith, F.I., Riley, R.T. 1997. Mycotoxin-induced elevation of free sphingoid bases in precision-cut rat liver slices: specificity of the response and structure-activity relationships. Toxicol. Appl. Pharmacol. 147: 63-70. 99. Osweiler, G.D., Kehrli, M.E., Stabel, J.R., Thurston, J.R., Ross, P.F. Wilson, T.M., 1993. Effects of fumonizin-contaminated corn screenings on growth and health of feeder calves. J. Anim. Sci. 71:459–466. 100. Pagliuca, G., Zironi, E., Ceccolini, A., Matera, R., Serrazanetti, G.P., Piva, A. 2005. Simple method for the simultaneous isolation and determination of fumonisin B1 and its metabolite aminopentol-1 in swine liver by liquid chromatographyfluorescence detection. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 819:97103. 101. Palencia, E., Torres, O., Hagler, W., Meredith, F.I., Williams, L.D., Riley, R.T. 2003. Total fumonisins are reduced in tortillas using the traditional nixtamalization method of mayan communities. J. Nutr. 133:3200-3. 102. Pinelli, E., Pipy, B., Castegnaro, M., Miller, D. J., Pfohl Leszkowicz, A., 1998. Fumonizin B1 Stimulates Arachidonic Acid Cascade by Activation of Mitogenactivated Protein Kinase, Revue Med. Vet. 149:651-9. 103. Plattner, R.D., Norred, W.P., Bacon, C.W., Voss, K.W., Peterspn, R., Shackelford, D.D., Weisleder, D. 1990. A method of detection of fumonizins in corn samples associated with field cases of equine leukoencephalomalacia. Mycologia. 82: 698702. 104. Poling, S.M., Plattner, R.D. 1999. Rapid purification of fumonisins and their hydrolysis products with solid-phase extraction columns. J. Agric. Food Chem. 47:2344-2349. 105. Prelusky, D.B., Trenholm, H.L., Savard, M.E. 1994. Pharmacokinetic fate of [14C]labelled fumonizin-B1 in swine. Nat. Toxins. 2:73-80. 106. Prelusky, D.B., Savard, M.E., Trenholm, H.L. 1995. Pilot study on the plasma pharmacokinetics of fumonizin B1 in cows following a single dose by oral gavage or intravenous administration. Nat Toxins. 3: 389-394.
94
107. Prelusky, D.B., Trenholm, H.L., Rotter, B.A., Miller, J.D., Savard, M.E., Yeung, J.M., Scott, P.M., 1996a. Biological fate of fumonizin B1 in food-producing animals. Adv. Exp. Med. Biol. 392: 265-278. 108. Prelusky, D.B., Miller, J.D., Trenholm, H.L. 1996b. Disposition of [14C]-derived residues in tissues of pigs fed radiolabelled fumonizin-B1. Food Add. Cont. 13:155-162. 109. Pungor, E., Bányai, É., Pólos, L.: Analitikusok kézikönyve. Műszaki Könyvkiadó, Bp., 1987. p. 380. 110. Rheeder, J.P., Marasas, W.F.O., Thiel, P.G., Sydenham, E.W., Shephard, G.S., van Schalkwyk, D.J. 1992. Fusarium verticillioides and fumonizins in corn in relation to human esophageal cancer in Transkei. Phytopathology. 82: 353-357. 111. Rheeder, J.P., Marasas,W.F.O., Vismer, H. F. 2002. Production of Fumonizin Analogs by Fusarium Species. Appl. Environ. Microbiol. 68: 2101-2105 112. Rice, L.G., Ross, P.F. 1994. Methods for detection and quantitation of fumonizins in corn, cereal products and animal excreta. J. Food Prot. 57: 536-540. 113. Richard, J. L., Meerdink, G., Maragos, C. M., Tumbleson, M., Bordson, G., Rice, L. G., Ross, P. F. 1996. Absence of detectable fumonizins in the milk of cows fed Fusarium proliferatum (Matsushima) Nirenberg culture material National Center for Agricultural Utilization Research, USDA/Agricultural Research Service, Peoria, IL 61604, USA 114. Riley, R. T., An N. H., Showker J. L., Yoo H. S., Norred W. P., Chamberlain W. J., Wang E., Merrill A. H., Motelin G., Beasley V. R., Haschek W. M. 1993. Alteration of Tissue and Serum Sphinganine to Sphingosine Ratio: An Early Biomarker of Exposure to Fumonizin-Containing Feeds in Pigs. Toxicol. Appl. Pharmacol. 118: 105-112. 115. Riley, R.T., Wang, E., Merrill, A.H. Jr. 1994. Liquid chromatographic determination of sphinganine and sphingosine: Use of the free sphinganine-to-sphingosine ratio as a biomarker for consumption of fumonizins. J. Assoc. Off. Anal. Chem. Int. 77: 533540. 116. Ross, P.F., Rice, L.G., Reagor, J.C., Osweiler, G.D., Wilson, T.M., Nelson, H.A., Owens, D.L., Plattner, R.D., Harlin, K.A., Richard, J.L., Colvin, B.M., Banton, M.I. 1991. Fumonizin B1 concentrations in feeds from 45 confirmed equine leukoencephalomalacia cases. J. Vet. Diagn. Invest. 3: 238-241. 117. Ross, P.F., Rice, L.G., Osweiler, G.D., Nelson, P.E., Richard, J.L., Wilson, T.M., 1992. A review and update of animal toxicoses associated with fumonizin-contaminated feeds and production of fumonizins by Fusarium isolates. Mycopathologia. 117: 109-114. 118. Rotter, J., Van Echten, G., Schwarzmann, G., Sandhoff, K. 1992. Biosynthesis of sphingolipids: Dihydroceramide and not sphinganine is desaturated by cultured cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 189: 14-20. 119. Rotter, B.A., Thomson, B.K., Prelusky, D.B., Trenholm, H.L., Stewart, B., Miller, J.D., Savard, M.E. 1996. Response of growing swine to dietary exposure to pure fumonizin-B1 during an eight-week period: growth and clinical parameters. Nat. Toxins. 4:42-50.
95
120. Rozman, K. K., Klaassen, C. D. 1996. Absorption, Distribution, and Excretion of Toxicants, In: Casarett & Doul’s Toxicology. The Basic Science of Poisons, 5th Ed., editted by C.D. Klaassen, McGraw-Hill, New York, pp. 91–112. 121. SCF (Scientific Committee on Food), 2000. Opinion of the scientific committee on food on fusarium toxins - part 3: Fumonizin B1 (FB1), expressed on 17 October 2000. http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scf/out73_en.pdf 122. Scott, P.M. 1993. Fumonizins (Mini-review). Int. J. Food Microbiology. 18:257-270. 123. Shephard, G.S., Thiel, P.G., Sydenham, E.W. 1992a. Initial studies on the toxicokinetics of fumonizin B1 in rats. Food Chem. Toxicol. 30: 277-279. 124. Shephard, G.S., Thiel, P.G., Sydenham, E.W., Alberts, J.F., Gelderblom, W.C.A., 1992b. Fate of a single dose of the [14C]-labelled mycotoxin fumonizin B1, in rats. Toxicon. 30:768-770. 125. Shephard, G.S., Thiel, P.G., Sydenham, E.W., Vleggaar, R., Alberts, J.F. 1994a. Determination of the mycotoxin fumonizin B1 and identification of its partially hydrolysed metabolites in the faeces of non-human primates. Food Chem. Toxicol. 32: 23-29. 126. Shephard, G.S., Thiel, P.G., Sydenham, E.W., Alberts, J.F. 1994b. Biliary excretion of the mycotoxin fumonizin B1 in rats. Food Chem. Toxicol. 32: 489-491. 127. Shephard, G.S., Thiel, P.G., Sydenham, E.W., Alberts, J.F., Cawood, M.E. 1994c. Distribution and excretion of a single dose of the mycotoxin fumonisin B1 in a nonhuman primate. Toxicon. 32:735-741. 128. Shephard, G.S., Thiel, P.G., Sydenham, E.W., Savard, M.E. 1995. Fate of a single dose of [14C]-labelled fumonizin B1 in vervet monkeys. Nat. Toxins. 3: 145-150. 129. Shephard, G.S., Thiel, P.G., Stockenström, S., Sydenham, E.W. 1996a. Worldwide survey of fumonizin contamination of corn and corn-based products. J. Assoc. Off. Anal. Chem. Int. 79: 671-687. 130. Shephard, G.S., van der Westhuizen, L., Thiel, P.G., Gelderblom, W.C.A., Marasas, W.F.O., Van Schalkwyk, D.J. 1996b. Disruption of sphingolipid metabolism in non-human primates consuming diets of fumonizin-containing Fusarium verticillioides culture material. Toxicon. 34: 527-534. 131. Shephard, G.S., Snijman, P.W. 1999. Elimination and excretion of a single dose of the mycotoxin fumonizin B2 in a non-human primate. Food Chem. Toxicol. 37:111– 116. 132. Shier, W.T., 1992. Sphingosine analogues: an emerging new class of toxins that includes the fumonizins. J. Toxicol. Toxin Rev. 11:241–257. 133. Shier, W. T., Abbas, H. K., Badria, F. A. 1997. Structure-activity Relationships of the Corn Fungal Toxin Fumonizin B1: Implications for Food Safety, Nat. Toxins. 6: 225–242. 134. Shier, W. T., Abbas, H. K. 1999. Current Issues in Research on Fumonizins, Mycotoxins Which May Cause Nephropathy, J. Toxicol.-Toxin Rev. 18:323–335. 135. Shier, W.T. 2000. The fumonizin paradox: a review of research on oral bioavailability of fumonizin B1, a mycotoxin produced by Fusarium moniliforme. J. Toxicol. 19:161187.
96
136. Smith, J. S., Thakur, R. A. 1996. Occurrence and fate of fumonizins in beef. Adv. Exp. Med. Bio. 392:39-55. 137. Smith, G.W., Constable, P.D., Tumbleson, M.E., Rottinghaus, G.E., Haschek, W.M. 1999. Sequence of cardiovascular changes leading to pulmonary edema in swine fed culture material containing fumonizin. Am. J. Vet. Res. 60:1292-300. 138. Spotti, M., Caloni, F., Fracchiolla, L., Pompa, G., Vigo, D., Maffeo, G. 2001. Fumonizin B1 carry-over into milk in the isolated perfused bovine udder. Vet. Hum. Toxicol. 43:109-11 139. SPSS for Windows, ver. 10.0., 1999, SPSS Inc., Chicago, IL, USA. 140. Szécsi, Á., 1994. A Liseola –szekcióba tartozó fuzáriumok előfordulása hazai kukoricakultúrákban 1991 és 1992 évben. Növényvédelem. 30:313-317. 141. Szigeti, G., Konda, L., Nagy, G., Szécsi, Á. 1995. Fusarium eredetű gombaanyagcseretermékek a kukoricában. Magy. Áo. Lapja. 50:679-680. 142. Sydenham, E.W., Gelderblom, W.C.A., Thiel, P.G., Marasas, W.F.O. 1990. Evidence for the natural occurence of fumonizin-B1, a mycotoxin produced by Fusarium verticillioides, in corn. J. Agric. Food Chem. 38:285-290. 143. Sydenham, E.W., Shephard, G.S., Thiel, P.G., Marasas, W.F.O., Stockenstrom., S. 1991. Fumonizin contamination of commercial corn-based human foodstuffs. J. Agric. Food Chem. 39:2014–2018. 144. Sydenham, E. W., Shephard, G. S., Thiel, P. G., Stockenström, S., Snijan, P. W., Van Schlwyk, D. J. 1996. Liquid chromatographic determination of fumonizin B1, B2 and B3 in corn: AOAC-IUPAC collaborative study. J. AOAC Int. 79:688-696. 145. Thiel, P.G., Marasas, W.F., Sydenham, E.W., Shephard, G.S., Gelderblom, W.C. 1992. The implications of naturally occurring levels of fumonizins in corn for human and animal health.Mycopathologia. 117:39-45. 146. Tossenberger, J., Fébel, H., Babinszky, L., Gundel, J., Halas, V., Bódis-Garbacz, Z. 2000. Az aminosavak ileális emészthetősége sertésekben. 1. Közlemény: Az ileális emészthetőség meghatározása különböző módszerekkel. Állattenyésztés és takarmányozás. 49:375-384. 147. Tsuji, A., Tamai, I., 1996.Carrier-mediated Intestinal Transport of Drugs. Pharm. Res. 13:963–977. 148. US NTP. 1999. NTP technical report on the toxicology andcarcinogenesis studies of fumonizin B1 (CAS No. 116355-83-0) in F344/N rats and B6C3F1 mice (feed studies). Research Triangle Park, North Carolina, US Department of Health and Human Services, National Toxicology Program (NTP TR 496; NIH Publication No. 99-3955). 149. Van der Westhuizen, L., Shephard, G.S., Snyman, S.D., Abel, S., Swanevelder, S., Gelderblom, W.C.A. 1998. Inhibition of sphingolipid biosynthesis in rat primary hepatocyte cultures by fumonizin B1 and other structurally related compounds. Food Chem. Toxicol. 36: 497-503. 150. Van der Westhuizen, L., Brown, N.L., Marasas, W.F.O., Swanevelder, S., Shephard, G.S. 1999. Sphinganine/sphingosine ratio in plasma and urine as a possible biomarker for fumonizin exposure in humans in rural areas of Africa. Food Chem. Toxicol. 37:1153-98.
97
151. Varga, I., Matyasovszky, K., Sohár, J. 2000. Élelmiszerek mikotoxin szennyezettségének jelentősége, adatok a hazai szintekről. Egészségtudomány. 44: 225-241. 152. Varga, J., Rigó, K., Tóth, B., Mesteházy, Á., Téren, J. 2002. A mikotoxin kutatás újabb eredményei. Élelmezési Ipar. 56:139-145. 153. Vas, K., Csontos, É. 1956. A hidratúra méréséről és jelentőségéről, Agrokémia és Talajtan. 5: 411–422. 154. Vesonder, R.F., Wu, W. 1998. Correlation of moniliformin, but not fumonizin B1 levels, in culture materials of Fusarium isolates to acute death in ducklings. Poult Sci. 77: 67-72. 155. Visconti, A., Boenke, A., Doco, M.B., Solfrizzo, M., Pascale, M. 1995. Occurence of fumonizins in Europe and BRC-measurements and testing projects. Nat. Toxins. 3: 269-274. 156. Vismer, H.F., Snijman, P.W., Marasas, W.F.O., van Schalkwyk, D.J. 2004. Production of fumonizins by Fusarium verticillioides strains on solid and in a defined liquid medium - Effects of L-methionine and inoculum. Mycopathologia. 158:99-106 157. Voss, K.A., Bacon, C.W., Norred, W.P., Chapin, R.E., Chamberlain, W.J., Plattner, R.D., Meredith, F.I. 1996. Studies on the reproductive effects of Fusarium verticillioides culture material in rats and the biodistribution of [14C]fumonizin B1 in pregnant rats. Nat. Toxins. 4: 24-33. 158. Vudathala, D.K., Prelusky, D.B., Ayroud, M., Trenholm, H.L., Miller, J.D. 1994. Pharmacokinetic fate and pathological effects of [14C]-fumonizin B1 in laying hens. Nat. Toxins. 2: 81-88. 159. Wang, E., Norred, W.P., Bacon, C.W., Riley, R.T., Merill, A.H. 1991. Inhibition of sphingolipid biosynthesis by fumonizins: Implications for diseases associated with Fusarium verticillioides. J. Biol. Chem. 266:14480-14490. 160. Wang, E., Ross, P.F., Wilson, T.M., Riley, R.T., Merrill, A.H. Jr. 1992. Increases in serum sphingosine and sphinganine and decreases in complex sphingolipids in ponies given feed containing fumonizins, mycotoxins produced by Fusarium verticillioides. J. Nutr. 122: 1706-1716. 161. Wattenberg, E. V., Badria, F. A., Shier, W. T., 1996. Activation of Mitogenactivated Protein Kinase by the Carcinogenic Mycotoxin Fumonizin B1, Biochem. Biophys. Res. Commun. 227:622–627, 162. Weidenbörner, M. 2001. Foods and fumonizins. Eur. Food Res. Technol. 212:262-273. 163. Wilson, B. J., Maronport, R. R. 1971. Causative fungal agent of leucoencephalomalacia in equine animals. Vet. Rec. 88:484- 486. 164. Wilson, T.M., Ross, P.F., Rice, L.G., Osweiler, G.D., Nelson, H.A., Owens, D.L., Plattner, R.D., Reggiardo, C., Noon, T.H., Pickrell, J.W. 1990. Fumonizin B1 levels associated with an epizootic of equine leukoencephalomalacia. J. Vet. Diagn. Invest. 2: 213-216. 165. Wilson, T.M., Ross, P.F., Owens, D.L., Rice, L.G., Green, S.A., Jenkins, S.J., Nelson, H.A. 1992. Experimental reproduction of ELEM. A study to determine the minimum toxic dose in ponies. Mycopathologia. 117 :115–120.
98
166. Wong, M. H., Oelkers, P., Craddock, A. L. and Dawson, P. A. 1994. Expression Cloning and Characterization of the Hamster Ileal Sodium-dependent Bile Acid Transporter. J. Biol. Chem. 269:1340–1347. 167. Zomborszky-Kovács, M., Vetesi, F., Repa, I., Kovács, F., 1997a. Investigation into the effect of toxins produced by Fusarium verticillioides in pigs - I. Definition of tolerance limit values in weaned piglets - Preliminary publication. Magy. Áo. Lapja. 119: 759-762 168. Zomborszky-Kovács, M., Vetési, F., Horn, P., Kovács, F. 1997b. Investigation into the effect of toxins produced by Fusarium verticillioides in pigs - II. Examination of perinatal toxicosis in pregnant sows and newborn piglets - Preliminary publication Magy. Áo. Lapja. 119: 763-764 169. Zomborszky-Kovács, M., Vetési, F., Kovács, F., Bata, Á., Tóth, Á., Tornyos, G. 2000. Examination of the harmful effects to fetuses of fumonizin-B1 in pregnant sows. Teratog. Carcinog. Mutagen. 20:293-299. 170. Zomborszky-Kovács, M., Vetési, F., Horn, P., Repa, I., Kovács, F. 2002. Effects of prolonged exposure to low-dose fumonizin B1 in pigs. J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public. Health. 49:197-201. 171. http://www.kfki.hu/chemonet/osztaly/eloadas/mesterhazya.html
99
11. A DISSZERTÁCIÓ TÉMAKÖRÉBŐL MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK Közlemények idegen nyelvű referált folyóiratban: Fodor, J., Bauer, J., Horn, P., Kovács, F., Kovács, M.: Effect of different dietary fumonisin B1 exposure on the toxin content of porcine tissues. Italian Journal of Animal Science. 2005. 4: 73-78. Fodor, J., Meyer, K., Riedlberger, M., Bauer, J., Horn, P., Kovács, F., Kovács, M.: Distribution and elimination of fumonisin analogues in weaned piglets after oral administration of Fusarium verticillioides fungal culture. Food Additives and Contaminants, 2006.23(5):492-501. Fodor, J., Kametler, L., Kovács, M.: Practical aspects of fumonisin production under laboratory conditions. Mycotoxin Research. 2006. (nyomdában) Fodor, J., Németh, M., Kametler, L., Pósa, R., Kovács, M., Horn, P.: Novel methods of Fusarium toxins’ production for toxicological experiments. Acta Agraria Kaposváriensis. 2006. 10. (2):277-285. Kametler, L., Fodor, J., Kovács, M., Horn, P.: Biomarker in the detection of fumonisin toxicosis in pigs. Acta Agraria Kaposváriensis. 2006. 10. (2): 285-291. Fodor, J., Meyer, K., Gottschalk, C., Mamet, R., Kametler, L., Bauer, J., Horn, P., Kovács, F., Kovács, M.: In vitro microbial metabolism of fumonisin B1. Food Additives and Contaminants, 2007. (accepted) Közlemények magyar nyelvű referált folyóiratban: Kovács, M., Fodor, J., Meyer, K., Mohr, K., Bauer, J., Repa, I., Vetési, F., Horn, P., Kovács, F.: A Fumonizin B1 kimutatása sertés szöveteiben magas toxintartalmú takarmány etetését követően. Magyar Állatorvosok Lapja. 2004. 126. 146-154. Fodor, J., Meyer, K., Riedlberger, M., Bauer, J., Pósa, R., Horn, P., Kovács, F., Kovács, M..: Fumonizinanalógok Fusarium verticillioides gombatenyészet szájon át való adagolását követő eloszlása a sertés szervezetében és eliminációjuk. Magyar Állatorvosok Lapja. 2006. 128. 334-342.
100
Előadások magyar nyelven: Kovács, M., Meyer, K., Mohr, K., Horn, P., Fodor, J.: A fumonizin B1 kimutatása sertés szöveteiben magas toxintartalmú takarmány etetését követően. MTA Állatorvos-tudományok Bizottsága, Budapest, 2003. Fodor, J., Kovács, M.: A fumonizin B1 kimutatása sertés szöveteiben humán egészségügyi kockázat becslése céljából. Ifjúsági Tudományos Fórum, Keszthely. 2004. (CD kiadvány) Fodor, J., Bauer, J., Horn, P., Kovács, F., Kovács, M.: A fumonizin B1 forgalmának vizsgálata választott malacokban. MTA Állatorvostudományok Bizottsága, Budapest, 2005. Fodor, J., Kovács, M.: A fumonizin B1 forgalmának vizsgálata választott malacokban. ITF, Keszthely. 2005. (CD kiadvány) Előadások idegen nyelven: Kovács, M., Fodor, J., Meyer, K., Mohr, K., Bauer, J., Repa, I., Vetési, F., Horn, P., Kovács, F.: Determination of fumonisin B1 content of porcine tissues after feeding diet of high toxin concentration for the sake of risk assessment. 55th Annual meeting of the European Association for Animal Production, Bled, 5-9 September 2004. Fodor, J., Bauer, J., Horn, P., Kovács, F., Kovács, M.: Effect of different dietary fumonisin B1 exposure on the toxin content of porcine tissues. 13th International Symposium of Animal Science Days Agripolis, Padova, 12 - 15 September 2005. Fodor, J., Mamet, R., Kametler, L., Bauer, J., Kovács, M.: In vivo and in vitro metabolism of fumonisin B1. XXIIth International IUPAC Symposium on Mycotoxins and Phycotoxins, Istanbul, 21-25 May 2007.
101
12. A DISSZERTÁCIÓ TÉMAKÖRÉN KÍVÜL MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK Közlemények idegen nyelvű referált folyóiratban: Tornyos, G., Kovács, M., Rusvai, M., Fodor, J., Horn, P., Kovács, F.: Effect of dietary fumonisin B1 on certain immune parameters of weaned pigs. Acta Veterinaria Hungarica, 2003. 51. 2. 171-179. Közlemények magyar referált folyóiratban: Kovács, M., Szendrő, Zs., Bóta, B., Donkó, T., Tornyos, G., Csutorás, I., Orova, Z., Fodor, J.: A tejtáplálás és az elválasztás hatása házinyúl növekedésére, néhány emésztés-élettani paraméterére. I. A tejtáplálás és az elválasztás hatása a növekedésére. Magyar Állatorvosok Lapja 2003. 125. 600-607. Kovács, M., Szendrő, Zs., Bóta, B., Donkó, T., Bencs Köllő, Z., Pintér, K., Tornyos, G., Csutorás, I., Orova, Z., Fodor, J.: A tejtáplálás és az elválasztás hatása házinyúl növekedésére, néhány emésztés-élettani paraméterére. II. A tejtáplálás és az elválasztás hatása néhány emésztésélettani paraméterre. Magyar Állatorvosok Lapja 2003. 125. 661-667. Proceedings-ben teljes terjedelemben megjelent közlemények: Kovács, M., Szendrő, Zs., Bóta, B., Donkó, T., Bencs Köllő, Z., Pintér, K., Fébel, H., Csutorás, I., Orova, Z., Fodor, J.: Emésztésélettani vizsgálatok 21 napos korban elválasztott házinyúlban. 15. Nyúltenyésztési tudományos napok. Kaposvár 2003. 97-103. Kovács, M., Orova, Z., Fodor, J.: A fumonizin B1 magzatkárosító hatásának vizsgálata házinyúlban. 16. Nyúltenyésztési tudományos napok. Kaposvár 2004. 119-122.
102
13. SZAKMAI ÖNÉLETRAJZ 1979. június 28-án születtem Kazincbarcikán, általánosiskolai tanulmányaimat szülővárosomban, középiskolai tanulmányaimat (1993-98) a Gyárfás József Mezőgazdasági Szakközépiskolában, Abaújszántón végeztem (állattenyésztő és állategészségügyi technikus szak; érettségi bizonyítvány, technikusképesítő bizonyítvány). 1998-ban nyertem felvételt a Kaposvári Egyetem Állattudományi Karára, ahol 2003-ban kiváló minősítéssel állattenyésztési szakirányú agrármérnöki diplomát, majd 2004-ben kitüntetéses agrár-mérnöktanári oklevelet szereztem. 2002-ben németből, majd 2006-ban angol nyelvből középfokú „C” típusú nyelvvizsgát tettem. 2003-tól 2006-ig az „Állattenyésztési tudományok” Ph.D. programhoz kapcsolódva Ph.D. tanulmányaimat végeztem a Kaposvári Egyetem Állattudományi Karán.
2006 szeptembertől decemberig tanszéki mérnök beosztásban dolgoztam a Kaposvári Egyetem Állatudományi Karának Élettani és Állathigiéniai Tanszékén. 2007 januártól tagja vagyok a Magyar Tudományos Akadémia Támogatott Kutatóhelyek Irodája (MTA TKI) 5 évig (2007-2011) tartó támogatásában részesülő Állattenyésztési és Állathigiéniai Kutatócsoportnak (MTA TKI „A táplálékláncba bekerülő, környezetterhelő toxikus anyagok állat- és népegészségügyi veszélyeinek elemzése”), tudományos segédmunkatársként. Részt veszek az Állattan-Állatélettan I. tantárgy oktatásában. Jelenleg résztvevője vagyok egy hazai (NKFP 4/024/2004; „Nagy hozzáadott értékű, egészséges táplálkozást szolgáló, környezetkímélő állattenyésztési termékek előállításának fejlesztése”) és egy nemzetközi (MÖB-DAAD 20062007/4) pályázatnak. A nemzetközi pályázat keretén belül 2006 júniusában 1 hónapos tanulmányúton vettem részt a Müncheni Műszaki Tudományos Egyetem Állattudományi Tanszékén.
103
14. MELLÉKLETEK 1. melléklet A disszertációban használt rövidítések jegyzéke FB1 AP1, HFB1 PHFB1 PAP1 TCA OC i.v. i.p. M.p.m. M.l.d. Subcut. Abdom. i.g. aw ERP [14C] LOQ LOD SE ELEM PPE Sa:So HPLC LC-MS LLC-PK1 Caco-2 AST ALT ALP GGT CREA
fumonizin B1 mikotoxin „fully hydrolyzed FB1, aminopentol” A FB1 teljesen hidrolizált metabolitja „partially hydrolysed FB1, aminopolyol” A FB1 részlegesen hidrolizált metabolitja, amelyet a szakirodalomban gyakran aminopoliolként neveznek meg „N-palmitoil-AP1” az aminopentol származéka „tricarballylic acid” trikarballilsav csoport „oesophageal cancer” humán nyelőcsőrák „intravenous” „intraperitoneal” musculus psoas major (nagy horpaszizom) musculus longissimus dorsi (hosszú hátizom) subcutan, bőr alatti abdominális, hasűri „intragastric” „water activity” vízaktivitás egyensúlyi relatív páratartalom radiokarbonnak nevezett radioaktív szénizotóp „limit of quantification” „limit of detection” standard hiba „equine leucoencephalomalacia” agylágyulás „porcine pulmonary edema” tüdőödéma szfinganin-szfingozin arány „High Performance Liquid Chromatography” „Liquid Chromatography-Mass Spectrometery” „pig kidney epithelial cell line” Sertés vese hámszövetének sejttenyészete „Human Caucasian colon adenocarcinoma” humán intesztinális sejttenyészet aszpartát aminotranszferáz alanin aminotranszferáz alkalikus foszfatáz gamma-glutamil transzferáz Kreatinin
104
2. melléklet Az állatkísérletekben alkalmazott WeanProTM starter takarmánykeverék (Purina) részletes összetétele Összetevők Tak.búza Tak.árpa Kukorica Szója (46%) Koncentrátum Kémiai összetétel Szárazanyag Nyersfehérje Nyers zsír Nyers rost Lizin Metionin Metionin+Cisztin ME DE Ca P Na A-vitamin D-vitamin E-vitamin
% % % % %
WeanProTM starter 30 20 15 10 15
% % % % % % % MJ/kg MJ/kg % % % NE/kg NE/kg mg/kg
86,0 17,8 4,7 5,0 1,2 0,3 0,63 13,38 13,65 0,9 0,7 0,18 12000 1700 30
105
3. melléklet A fumonizin származékok átlagos visszanyerési és LOD értékei Minta Bélsár, chymus
Vizelet
Tüdő
Máj
Vese
Lép
Agy
Izom (m.l.d., m.p.m.) Zsír (subcutan, abdominális) a
FB1 FB2 AP1 PHFB1 FB1 FB2 AP1 PHFB1 FB1 FB2 AP1 PHFB1 FB1 FB2 AP1 PHFB1 FB1 FB2 AP1 PHFB1 FB1 FB2 AP1 PHFB1 FB1 FB2 AP1 PHFB1 FB1 FB2 AP1 PHFB1 FB1 FB2 AP1 PHFB1
Átlagos visszanyerés ±SDa (%) (n=5) 140,0±14,7 107,2±11,7 123,9±19,2 106,3±16,2 98,2±11,0 101,3±9,3 104,7±14,0 101,7±11,8 92,1±4,2 84,1±12,5 98,1±9,1 67,9±13,3 90,3±3,9 44,1±2,5 93,6±19,6 47,9±6,0 60,3±13,3 54,7±1,4 115,2±8,2 47,2±5,7 90,2±4,7 72,2±3,7 86,7±8,0 65,7±5,0 92,6±12,6 91,08±6,8 97,1±15,9 69,9±10,2 87,5±11,0 60,4±7,2 91,3±8,6 84,3±15,0 84,4±4,2 35,1±2,7 109,0±20,1 89,2±19,9
szórás „limit of quantification” meghatározási határ c „limit of detection” kimutatási határ b
106
LOQb (µg/kg) (n=5) 100 1000 100 100 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 1 10 1 1 10 10 1 1 1 10 1 1 10 10 10 10 1 100 1 1
LODc (µg/kg) (n =5) 38,6 155,1 56,0 35,6 1,2 3,6 1,9 1,2 1,4 2,2 1,3 0,9 1,2 2,1 1,4 0,8 0,9 1,4 0,8 0,8 1,0 1,3 0,7 0,5 0,6 2,3 0,8 0,4 0,6 1,2 0,6 0,4 0,7 3,9 0,6 0,6
