KAJIAN KERAGAMAN GEN MYF5 DAN MSTN SERTA ASOSIASINYA TERHADAP SIFAT PERTUMBUHAN DAN PERDAGINGAN PADA SAPI BALI HIMMATUL KHASANAH

KAJIAN KERAGAMAN GEN MYF5 DAN MSTN SERTA ASOSIASINYA TERHADAP SIFAT PERTUMBUHAN DAN PERDAGINGAN PADA SAPI BALI

HIMMATUL KHASANAH

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Saya dengan ini menyatakan bahwa tesis berjudul ” Kajian Keragaman Gen Myf5 dan MSTN serta Asosiasinya terhadap Sifat Pertumbuhan dan Perdagingan pada Sapi Bali” adalah benar karya saya dengan arahan dari Komisi Pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan atau tidak diterbitkan dari Penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka pada bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Juni 2016

Himmatul Khasanah NIM D151140211

RINGKASAN HIMMATUL KHASANAH. Kajian Keragaman Gen Myf5 dan MSTN Serta Asosiasinya terhadap Sifat Pertumbuhan dan Perdagingan pada Sapi Bali. Dibimbing oleh JAKARIA, ASEP GUNAWAN dan RUDY PRIYANTO. Sapi bali (Bos javanicus) adalah sapi asli Indonesia yang merupakan hasil domestikasi dari banteng (Bibos banteng). Sapi bali memiliki keunggulan dalam sifat produksi, reproduksi dan dapat berkembang pada lingkungan marginal. Gen Myogenic Factor 5 (Myf5) dan gen Myostatin (MSTN) memiliki peranan penting dalam perkembangan myogenesis dan diketahui berhubungan dengan sifat pertumbuhan dan perdagingan. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis polimorfisme dan distribusi alel berbasis SNP (Single Nucleotide Polymorphism) pada gen Myf5 dan MSTN di sapi bali. Selain itu, tujuan penelitian ini juga mengetahui hubungan gen-gen tersebut terhadap sifat pertumbuhan dan perdagingan pada sapi bali. Sapi bali yang digunakan sebanyak 48 ekor terdiri atas 24 ekor jantan dan 24 ekor betina yang berumur 12-15 bulan yang dipelihara pada kondisi lingkingan yang sama di pusat pembibitan BPTU-HMT sapi bali Provinsi Bali. Identifikasi SNP pada gen Myf5 dan MSTN dilakukan menggunakan metode directsequencing. Polimorfisme kedua gen tersebut dianalisis berdasarkan frekuensi genotipe, frekuensi alel dan heterozigositas. Keseimbangan genotipe dalam populasi dideteksi dengan uji keseimbangan Hardy-Weinberg (χ2). Asosiasi SNP gen Myf5 dan MSTN dengan sifat pertumbuhan (bobot lahir, bobot 205 hari, bobot 365 hari, tinggi pundak, panjang badan dan lebar dada) dan sifat perdagingan yang diukur dengan USG (tebal otot longissimus dorsi, tebal lemak punggung, tebal rump, tebal lemak rump, marbling score dan persentase lemak intramuskuler) pada sapi bali dilakukan dengan uji ANOVA GLM dan dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT). Amplifikasi gen Myf5 dan gen MSTN dihasilkan panjang produk PCR yaitu masing-masing 285 bp dan 535 bp. Hasil identifikasi SNP pada kedua gen tersebut diperoleh 2 SNP polimorfik (c.1172T>A dan c.1205G>A) dan 20 SNP polimorfik (g.-8350C>T, g.-8310A>C, g.-8299G>A, g.-8283A>G, g.-8216G>A, g.-8205A>G, g.-8168A>G, g.-8109T>G, g.-8078C>T, g.-8077G>A, g.-8029T>C, g.-7799T>C, g.-7996G>C, g.-7953C>T, g.-7941C>T, g.-7930A>G, g.-7905T>C dan g.-7942C>G) pada sapi bali. SNP gen Myf5 memiliki nilai heterozigositas <0.5 dan ditemukan dalam keadaan seimbang. Adapun SNP gen MSTN memiliki nilai heterozigositas <0.5 dan ditemukan 17 SNP (g.-8350C>T, g.-8310A>C, g.8299G>A, g.-8283A>G, g.-8216G>A, g.-8205A>G, g.-8168A>G, g.-8109T>G, g.-8077G>A, g.-8029T>C, g.-7799T>C, g.-7953C>T, g.-7941C>T, g.-7905T>C dan g.-7942C>G) dalam keadaan tidak seimbang, sedangkan tiga SNP berada dalam keadaan keseimbangan (g.-8078C>T, g.-7996G>C and g.-7930A>G). Asosiasi SNP gen Myf5 dengan sifat pertumbuhan dan perdagingan pada sapi bali tidak nyata. Adapun SNP gen MSTN tidak berasosiasi nyata dengan sifat pertumbuhan, namun berasosiasi nyata (P≤0.05) dengan persentase lemak intramuskuler yaitu SNP g.-7799T>C dan g.-7941C>T. Kedua SNP pada gen MSTN tersebut dapat dijadikan sebagai kandidat marka genetik sifat perdagingan pada sapi bali. Kata kunci: gen Myf5, gen Myostatin, sapi bali, SNP.

SUMMARY HIMMATUL KHASANAH. A Study on Polymorphism Myf5 and MSTN Genes and It’s Association with Growth and Muscling Characteristics in Bali Cattle. Supervised by JAKARIA, ASEP GUNAWAN dan RUDY PRIYANTO. Bali cattle (Bos javanicus) is one of indigenous cattle of Indonesia origin that had been domesticated fom Banteng (Bos bibos). Bali cattle has good production and reproduction even in marginal environment. Myogenic Factor 5 (Myf5) and Myostatin (MSTN) genes have a role in myogenesis development and associated with growth and muscling traits. The objective of this research was to identify genetic polymorphism and allele distribution of SNP in Myf5 and MSTN genes in Bali cattle. Moreover, this research was to elucidate the association between Myf5 and MSTN genes with growth and muscling traits in bali cattle . A total 48 heads of bali cattle consisting of 24 steers and 24 heifers 12-15 months of age were maintened under same environment in bali cattle breeding center (BPTU-HMT) Bali Province. SNPs identification were analyzed using direct sequencing method. Polymorphism of Myf5 and MSTN genes were analysed by allele frequency, genotipe frequency and hetozygosity. Equilibrium of each SNP in bali cattle population was analysed using Hardy-Weinberg equilibrium (χ2). Association genotype in each SNP with growth traits (birth weight, 205 day weight, 365 day weight, average daily gain, shoulder height, body length and chest circumstance) and muscling traits (longissimus dorci thickness, back fat thickness, rump thickness, rump fat thickness, marbling score and intramuscular fat percentage) performed using ANOVA GLM and followed by Duncan Multiple Range Test (DMRT). Amplification of Myf5 and MSTN genes resulted band with length 285 bp and 535 bp, respectively. SNPs identification in Myf5 gene resulted of 2 polymorphic SNPs (c.1172T>A dan c.1205G>A) and MSTN gene resulted 20 polymorphic SNPs (g.-8350C>T, g.-8310A>C, g.-8299G>A, g.-8283A>G, g.8216G>A, g.-8205A>G, g.-8168A>G, g.-8109T>G, g.-8078C>T, g.-8077G>A, g.-8029T>C, g.-7799T>C, g.-7996G>C, g.-7953C>T, g.-7941C>T, g.-7930A>G, g.-7905T>C dan g.-7942C>G). Both of SNPs in Myf5 gene have heterozygosities value less than 0.5 and three SNP (g.-8078C>T, g.-7996G>C and g.-7930A>G) having equilibrium condition in Hardy-Weinberg analysis. Moreover, SNPs in MSTN gene have heterozygosities value less than 0.5 and 17 SNPs (g.-8350C>T, g.-8310A>C, g.-8299G>A, g.-8283A>G, g.-8216G>A, g.-8205A>G, g.-8168A>G, g.-8109T>G, g.-8077G>A, g.-8029T>C, g.-7799T>C, , g.-7953C>T, g.-7941C>T, g.-7905T>C dan g.-7942C>G) having disequilibrium condition, while three SNPs having equilibrium condition in Hardy-Weinberg analysis. Association analyses showed that Myf5 has no significant effect to growth and muscling traits. Furthermore SNPs in MSTN gene has no significant association with growth traits, while two SNPs having significant association with intramuscular fat percentage (P≤0.05). Both of SNPs in MSTN gene may be used as candidate gene for genetic marker in muscling traits in Bali cattle. Keywords: Bali cattle, Myf5 gene, Myostatin gene, SNP.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dil arang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KAJIAN KERAGAMAN GEN MYF5 DAN MSTN SERTA ASOSIASINYA TERHADAP SIFAT PERTUMBUHAN DAN PERDAGINGAN PADA SAPI BALI

HIMMATUL KHASANAH

Thesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

Penguji Luar Komisi Ujian Thesis: Dr Ir Niken Ulupi MS

Judul penelitian Nama NRP

: Kajian Keragaman Gen Myf5 dan MSTN serta Asosiasinya terhadap Sifat Pertumbuhan dan Perdagingan pada Sapi Bali : Himmatul Khasanah : D151140211

Disetujui oleh Komisi Pembimbing

Dr Jakaria, SPt MSi Ketua

Dr agr Asep Gunawan, SPt MSc Anggota

Dr Ir Rudy Priyanto Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr Dr Ir Salundik, MSi

Tanggal Ujian: 17 Juni 2016

Tanggal Lulus

PRAKATA Puji syukur Penulis panjatkan kepada Allah SWT, atas segala rahmat dan karunia-Nya Penulis berhasil menyelesaikan tesis dengan judul “Kajian Keragaman Gen Myf5 dan MSTN serta Asosiasinya terhadap Sifat Pertumbuhan dan Perdagingan pada Sapi Bali”. Shalawat dan salam Penulis sampaikan kepada Nabi Muhammad SAW dan para sahabatnya yang menjadi suri tauladan umat manusia. Tesis ini menggunakan data hasil pengukuran bobot dan ukuran tubuh serta hasil ultrasonografi pada bagian longissimus dorsi dan rump yang dilaksanakan sejak bulan Juni 2015 sampai Desember 2015 berlokasi di Kabupaten Jembrana, Bali. Penelitian bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman dan asosiasi gen Myf5 dan MSTN pada sapi bali sehingga memperkaya informasi karakteristik fenotipik dan genetik serta hubungan keduanya pada sapi bali. Terima kasih Penulis ucapkan kepada Dr Jakaria, SPt MSi, Dr agr Asep Gunawan, SPt MSi dan Dr Ir Rudy Priyanto sebagai komisi pembimbing yang telah mengarahkan dan memotivasi penulis. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr Ir Niken Ulupi MS atas kesediannya menjadi penguji luar komisi pada ujian sidang tesis dan atas masukan serta saran untuk perbaikan tesis ini. Kepada BPTU-HMT Sapi Bali Provinsi Bali penulis mengucapkan terimakasih atas bantuan dalam pemeliharaan dan pelaksanaan penelitian di lapang. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Lembaga Pengelola Dana Pendidikan (LPDP) yang telah memberikan kesempatan dan telah menjadi sponsor bagi penulis selama masa studi magister di IPB. Ungkapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada kepada Bapak Khanif (Alm), Ibu (Siti Munawaroh), keluarga dan teman-teman satu tim penelitian (Nurul dan Nawal), teman-teman Laboratorium Genetika Molekuler Ternak (Shelvi, Isyana, Alit, Furqon, Rindang, Saleh, Ami) yang telah memberikan dukungan dan doa serta terimakasih kepada Prof Dr Ir Cece Sumantri, MSc yang telah memberikan dukungan moril sehingga penulis dapat menyelesaikan program masgister. Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan tesis ini masih ada kekurangan yang harus disempurnakan. Penulis berharap kiranya ada masukan, saran, pemikiran dan gagasan untuk menyempurnakan tesis dan pelaksanaan penelitian kedepan. Penulis ucapkan terima kasih dan penghargaan atas segala masukan, saran, pemikiran dan gagasan untuk menyempurnakan penelitian ini. Bogor, Juni 2016 Penyusun

Himmatul Khasanah

DAFTAR ISI DAFTAR ISI vi DAFTAR GAMBAR vii DAFTAR LAMPIRAN vii 1 PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 PerumusanMasalah 3 Tujuan Penelitian 3 Manfaat Penelitian 3 Ruang Lingkup Penelitian 3 2 METODE 4 Waktu dan Tempat Penelitian 4 Materi 4 Prosedur 6 Analisis Data 10 3 HASIL DAN PEMBAHASAN 12 Karakteristik Sifat Pertumbuhan dan Ultrasonografi Sifat Perdagingan pada Sapi Bali 12 Amplifikasi Gen Myf5 dan MSTN pada Sapi Bali 14 Polimorfisme Gen Myf5 dan MSTN pada Sapi Bali 14 Heterozigositas dan Keseimbangan Hardy-Weinberg 18 Asosiasi gen MYF5 terhadap Sifat Pertumbuhan dan Perdagingan 19 21 Asosiasi Gen MSTN terhadap Sifat Pertumbuhan dan Perdagingan 4 SIMPULAN DAN SARAN 25 Simpulan 25 Saran 25 DAFTAR PUSTAKA 25 LAMPIRAN 31 RIWAYAT HIDUP 42

DAFTAR TABEL 1. 2. 3. 4. 5.

Primer gen Myf5 dan gen MSTN Rataan sifat pertumbuhan dan perdagingan pada sapi bali Karakteristik perdagingan sapi bali di kabupaten Barru dan Bone Frekuensi genotipe dan alel gen Myf5 dan MSTN pada sapi bali Heterosigositas dan keseimbangan Hardy-Weinberg SNP gen Myf5 dan MSTN sapi bali 6. Asosiasi pengaruh genotipe SNPs gen Myf5 terhadap sifat pertumbuhan sapi bali 7. Asosiasi pengaruh genotipe SNPs gen Myf5 terhadap sifat perdagingan sapi bali 8. Asosiasi genotipe SNP gen MSTN terhadap sifat bobot sapi bali 9. Asosiasi genotipe SNP gen MSTN terhadap ukuran tubuh sapi bali. 10. Asosiasi genotipe SNP gen MSTN terhadap sifat perdagingan sapi bali

4 13 13 16 19 20 20 22 23 24

DAFTAR GAMBAR 1. Posisi penempelan primer pada fragmen gen Myf5 (285 bp) 2. Posisi penempelan primer pada fragmen gen MSTN (535 bp) 3. Paddock pemeliharaan sapi bali di BPTU-HMT Sapi Bali Provinsi Bali pada musim hujan (kanan) dan pada musim kemarau (kiri). 4. Posisi pengukuran ultrasonografi karakteristik perdagingan otot longissimus dorsi (kiri) dan otot rump (kanan). 5. Ilustrasi USG otot longissimus dorsi pada sapi, c = kutan, sc = subkutan, tm = tebal otot, o = tulang 6. Citra Ultrasonografi pada otot longissimus dorsi rusuk ke 12-13 sapi bali (A dan B), citra USG otot rump (C dan D), lapisan lemak (a), tebal otot (b), daerah pengukuran PIMF 30x30 mm (c), tulang (d), deposisi lemak intramuskuler (e). 7. Hasil amplifikasi gen Myf5 (A) dan MSTN (B) pada elektroforesis gel 1.5%, M: Marker. 8. SNP gen Myf5 pada sapi bali 9. SNP gen MSTN pada sapi bali 10. Tidak ditemukan CpG island di sapi bali (A) dan CpG island di Bos taurus (B).

5 5 6 7 8

12 14 15 17 18

DAFTAR LAMPIRAN 1. Sekuen gen Myogenic Factor 5 (MYF5) berdasarkan genbank kode akses M95684 2. Sekuen gen Myostatin (MSTN) berdasarkan genbank AF348479.1 3. Tahapan Desain Primer dengan Primer Designing Tools NCBI

32 34 38

1

1 PENDAHULUAN Latar Belakang Sapi bali (Bos javanicus) adalah sapi asli Indonesia yang merupakan hasil domestikasi dari banteng (Bibos banteng) (Purwantara et al. 2012) dan merupakan salah satu sumber daya genetik (SDG) ternak Indonesia yang perlu dilestarikan, dikembangkan dan dimanfaatkan. Sapi bali digunakan sebagai sapi pedaging karena memiliki keunggulan dalam produksi dan reproduksi. Meskipun pada kondisi lingkungan marginal, sapi bali masih mampu berproduksi (Thalib 2002). Keunggulan pada sifat reproduksi sapi bali yaitu fertilitas tinggi dan cepat berkembangbiak (Purwantara et al. 2012). Sapi bali memiliki kemampuan dapat bertahan pada kondisi lingkungan yang kurang baik, cepat beradaptasi pada lingkungan yang baru, dan memiliki kandungan lemak karkas yang rendah (Hardiwirawan dan Subandriyo 2004). Hafid dan Rugayah (2009) menjelaskan bahwa persentase karkas sapi bali antara 52.72-57.59% lebih tinggi dibanding sapi lokal lainnya seperti PO (peranakan ongole) sebesar 46.96% (Yosita et al. 2012), sapi madura sebesar 47% (Wiyatna 2007) dan sapi SO (sumba-ongole) sebesar 55.25% (Yantika et al. 2016). Sapi bali juga memiliki lapisan lemak subkutan yang lebih kecil dibanding sapi PO (Yosita et al. 2012). Menurut USDA (2014) karkas grade yield sangat dipengaruhi oleh lapisan lemak pada area rib, loin, rump, clod, flank, cod/udder dan ribeye area. Sapi bali sebagai penghasil daging berkonstribusi terhadap pemenuhan kebutuhan daging nasional yaitu sebesar 27% dari total daging yang diproduksi lokal (Purwantara et al. 2012) dengan populasi sebanyak 4 658 781 ekor yang tersebar hampir di seluruh Indonesia (PSPK 2011). Meskipun memiliki potensi yang unggul, pemanfaatan SDG sapi bali masih belum optimal, terutama untuk menghasilkan daging baik secara kualitas maupun kuantitas. Upaya untuk meningkatkan mutu genetik dan produktivitas sapi bali khususnya terkait dengan pertumbuhan dan perdagingan, secara konvensional dapat dilakukan dengan seleksi (Thalib et al. 2003, Supriyantono dan Irianti 2007, Patmawati et al. 2013). Seleksi secara tradisional berdasarkan sifat fenotipe memiliki kelemahan yaitu adanya pengaruh lingkungan yang tidak terkontrol sebagaimana konsep P=G+L, dengan P adalah fenotipe, G adalah faktor genetik dan L adalah faktor lingkungan (Noor 2010). Pesatnya perkembangan teknologi molekuler berbasis DNA, memungkinkan seleksi didasarkan pada penciri (marker) genetik atau disebut MAS (Marker Assisted Selection) dengan harapan seleksi dapat lebih lebih akurat, efektif dan efesien (Gerbens et al. 2000, Van Werf dan Kinghorn 2003). Gen-gen potensial yang berhubungan dengan sifat pertumbuhan dan perdagingan dapat digunakan untuk seleksi pada sifat tersebut dengan basis seleksi menggunakan marka genetic atau MAS. Beberapa gen yang telah diidentifikasi antara lain adalah Myogenic Factor 5 (Myf5) dan Myostatin (MSTN) (Bentzinger et al. 2012, Muroya et al. 2009, Shibata et al. 2006). Myogenic factor 5 telah dipetakan pada sapi dan ditemukan pada kromosom lima yang terdiri dari tiga ekson dan dua intron. Gen ini merupakan anggota dari keluarga Myogenic Regulatory Factors (MRFs) yang diekspresikan paling awal diantara anggota

2

MRFs lainnya. Gen ini diatur oleh satu set enhancer pada regulatory region yang ekspresinya ditemukan pada otot dan jaringan adiposa (Ott et al. 1991, Francetic dan Li 2011). Gen Myf5 memiliki peranan penting dalam penentuan dan diferensiasi myocyte (Braun dan Gautel 2011, Li et al. 2004) dan juga mengontrol myogenesis serta pertumbuhan myoblast (sel otot yang dapat melebur dengan sel otot lain menjadi serat otot immature) selama perkembangan embrio saat prenatal (Guo et al. 2015). Ketiadaan gen Myf5 telah diidentifikasi menyebabkan kematian setelah lahir pada tikus ( et al. 1992). Gen ini juga diketahui berasosiasi dengan bobot satu tahun (Li et al. 2004), PBBH (Chung dan Kim 2005), bobot sirloin (Robakowska-Hyzorek et al. 2010), tebal lemak punggung dan tenderness (Ujan et al. 2011). Gen myostatin (MSTN) atau biasa dikenal sebagai growth and differentiation factor 8 (GDF8) merupakan anggota dari superfamili gen transforming growth factor β (TGF-β.) yang terletaak di kromosom tiga, terdiri dari tiga ekson dan dua intron. Gen MSTN ini diketahui terlibat dalam mediasi pertumbuhan dan perkembangan sel melalui signal transduksi (Lee dan McPherron 2001, Arnorld et al. 2001, Rios et al. 2002). Menurut Thomas et al. (2000) myostatin mengikat reseptor permukaan sel dan menghambat poliferasi dan dan diferensiasi myoblast (Langley et al. 2002. Rios et al. 2000). Gen myostatin menyandi 375 asam amino (Taylor et al. 2001). Asam amino menghasilkan protein myostatin dengan berat molekul sebesar 26 kDa (Taylor et al. 2001). Gen MSTN bekerja sebagai inhibitor (negative regulator) dari myogenesis dan menghambat poliferasi myoblast selama siklus sel dan diferensiasi myogenic (Thomas et al. 2000, Taylor et al. 2001, Rios et al. 2002, Langley et al. 2002, Miyake et al. 2010). Berdasarkan sturktur gen, gen MSTN memiliki daerah CpG island yaitu daerah yang kaya ulangan sekuen GC di bagian promoter (Illingworth et al. 2010). Menurut Carninci et al. (2006) yang menyatakan bahwa panjang sekuen CpG island adalah 50-100 bp dan berfungsi sebagai pengaturan transkripsi (Deaton dan Bird. 2011). Daerah CpG island ini juga berhubungan dengan pola metilasi seperti kejadian pemadatan kromatin dan gene silencing (Sellner et al. 2007). Metilasi ini dapat menurunkan atau meningkatkan tingkat transkripsi bergantung dari sifat metilasi apakah positif (suppressor) atau negatif (repressor) (Jones dan Takai 2001). Mutasi pada CpG island juga dapat merubah regulasi pola ekspresi dengan cara merubah posisi target transcriptional regulatory (Doherty et al. 2014). Beberapa penelitian telah mengidentifikasi adanya signifikansi gen Myf5 dan MSTN terhadap sifat pertumbuhan dan perdagingan pada sapi Marchiagiana, Hanwoo, Nanyang, Jiaxian, Qinchuan, Luxi, Xianan, Wagyu, Angus dan Hereford (Chung and Kim 2005, Zhang et al. 2007, Bhuiyan et al. 2009, Seong et al. 2011, Ujan et al. 2011, Sarti et al. 2014, Coles et al. 2015). Namun, kajian terhadap gen Myf5 dan MSTN pada sapi bali belum dilakukan, sehingga perlu dilakukan analisis keragaman dan asosiasi kedua gen tersebut terhadap sifat pertumbuhan dan perdagingan pada sapi bali.

3

PerumusanMasalah Upaya seleksi pada sapi bali saat ini masih dilakukan secara tradisional dengan menggunakan data fenotipe yang masih dipengaruhi oleh genetik dan lingkungan. Penggunaan marka genetik diharapkan dapat menjadi alternatif seleksi di tataran genom yang lebih akurat, efektif dan efisien. Namun data dan informasi genetik dari gen-gen pengontrol sifat pertumbuhan dan perdagingan seperti Myf5 dan MSTN pada sapi bali masih sangat terbatas dan perlu dilakukan kajian terhadap gen-gen tersebut.

Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji polimorfisme dan distribusi alel pada gen Myf5 dan MSTN berbasis SNP di daerah sumber bibit sapi bali yaitu BPTU-HMT sapi bali Provinsi Bali dengan menggunakan metode sequencing. Selain itu, tujuan dari penelitian ini juga menganalisis hubungan gen-gen tersebut terhadap sifat pertumbuhan dan perdagingan pada sapi bali.

Manfaat Penelitian Manfaat dari penelitian ini adalah sebagai data dasar informasi genetik gen Myf5 dan MSTN pada sapi bali di BPTU-HMT sapi bali Provinsi Bali. Informasi keragman genetik yang diperoleh dapat dijadikan sebagai acuan untuk menentukan arah strategi pemuliaan sapi bali. Hasil penelitian ini juga dapat dijadikan sebagai kandidat marka genetik berbasis SNP untuk seleksi bibit pada sifat pertumbuhan dan perdagingan sapi bali.

Ruang Lingkup Penelitian Penelitian ini meliputi keragaman gen Myf5 dan MSTN pada sapi bali umur 12-15 bulan, jenis kelamin jantan dan betina berlokasi di BPTU-HMT sapi bali Provinsi Bali. Data fenotipe yang diamati meliputi sifat (bobot lahir, bobot 205 hari, bobot 365 hari, PBBH, tinggi pundak, panjang badan dan lingar dada) dan perdagingan (tebal otot longissimus dorsi, tebal rump, tebl lemak rump, marbling score dan persentase lemak intramuskuler). Analisa keragaman gen Myf5 dan MSTN menggunakan metode direct-sequencing. Hasil sequencing di alligment dan di blast untuk menemukan SNP (Single Nucleotide Polymorphism) pada kedua gen tersebut. Asosiasi keragaman SNP gen Myf5 dan MSTN terhadap sifat pertumbuhan dan perdagingan pada sapi bali dilakukan dengan prosedur GLM ANOVA dan dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT).

4

2 METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Balai Pembibitan Ternak Unggul dan Hijauan Makanan Ternak (BPTU-HMT) sapi bali Provinsi Bali dan Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian Pemuliaan dan Genetika, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini berlangsung dari bulan Juli 2015 sampai dengan Maret 2016.

Materi Ternak Ternak yang digunakan adalah sapi bali sebanyak 48 ekor berumur 12 sampai 15 bulan dengan jenis kelamin jantan (24 ekor ) dan betina (24 ekor) berasal dari BPTU-HMT sapi bali, Pulukan, Kabupaten Jembrana, Provinsi Bali. Bahan Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi DNA adalah Geneaid DNA kit ekstraksi yang terdiri dari RBC lysis buffer, GT buffer, GB buffer, W1 buffer, Wash buffer dan Elution buffer. Bahan yang digunakan untuk amplifikasi fragment target adalah sampel DNA hasil ekstraksi, distilled water (DW), Promega master mix, pasangan primer forward dan reverse fragmen gen Myf5 dan MSTN, sedangkan bahan yang digunakan untuk elektroforesis adalah serbuk agarosa, 0.5 x Tris-Borax EDTA (TBE), Ethidium Bromide (EtBr), marker 100 pb. Adapun primer yang digunakan untuk mengamplifikasi fragment target pada masing-masing gen yang diamat dapat dilihat pada Tabel 1. Gambar 1 dan 2 menunjukkan ilustrasi posisi fragment target dan posisi penempelen primer gen Myf5 dan MSTN.

SNP 1) MYF5 Exon 1Intron 1 MSTN Promotor

Tabel 1 Primer gen Myf5 dan gen MSTN Genbank Sekuens Primer M95684 F: 5’- ACGACCAACCCTAACC -3’ Kromosom 5 R: 5’-CCAACTATCCACCAGTAA-3’

produk 285 bp

AF348479 F: 5’-GAGTCCCATGCATGCTCTCA-3’ Kromosom 2 R: 5’- GGCCAAAGTACCAAGT -3’

535 bp

Keterangan: F= Forward, R= reverse, 1)Ujan et al. 2011.

5

Gambar 1 Posisi penempelan primer pada fragmen gen Myf5 (285 bp)

Gambar 2 Posisi penempelan primer pada fragmen gen MSTN (535 bp)

Alat Alat-alat yang digunakan untuk pengambilan darah sampel yaitu jarum venoject dan vacutainer yang berisi EDTA, alat yang digunakan untuk pengukuran data fenotipe yaitu ultrasonografy veterinary scanner tipe WED3000V dan timbangan elektrik. Alat untuk ekstraksi DNA, amplifikasi DNA dan elektroforesis adalah tabung eppendorf 1.5 ml, satu set mikro pipet, tip pipet,

6

vortex, inkubator, rotary mixer, microsentrifuge, refrigerator, freezer, mesin PCR Applied Biosystems, dan tabung PCR 0.2 ml, satu set geltray, magnetic stirrer, microwave, power supply electrophoresis 100 volt, dan UV Transiluminator.

Prosedur Pemeliharaan Sapi Bali Seluruh sampel penelitian ditempatkan dalam satu paddock seluas ± 3 Ha dan diberi pakan rumput lapang sebanyak 10% dari bobot badan ditambah konsentrat 1% dari bobot badan serta diberi air minum secara ad libitum. Jenis rumput yang diberikan adalah rumput gajah (Pennisetum purpureum) yang diperoleh dari hasil budidaya rumput di area pastura dan rumput kompetidor (Phaspalum notatum) yang tumbuh dilahan paddock. Penempatan ternak dalam satu paddock bertujuan untuk menyeragamkan kondisi lingkungan. Paddock area pemeliharaan ditunjukkan oleh Gambar 3. Kondisi georafis BPTU-HMT Provinsi Bali terletak di Kabupaten Jembrana, Kecamatan Pakutatan, Desa Pulukan. Secara geofrafis Kabupaten Jembrana terletak pada 8°09’30” sampai dengan 8°28’02” LS dan 114°25’35” sampai dengan 114°56’38” BT. Curah hujan rata-rata sekitar 1.750 mm/tahun dengan lama hari hujan 112 hari/tahun. Suhu udara di daerah tersebut antara 20 °C sampai 39 °C dengan temperatur optimal antara 29 °C dan 32 °C dan kelembapan udara antara 74 dan 87% (Bappeda Jembrana 2011).

Gambar 3 Paddock pemeliharaan sapi bali di BPTU-HMT Sapi Bali Provinsi Bali pada musim hujan (kiri) dan pada musim kemarau (kanan).

Pengukuran Sifat Pertumbuhan dan Perdagingan Sifat pertumbuhan yang diukur adalah bobot lahir (BL), bobot sapih (BB205), bobot setahun (BB365), pertambahan bobot badan harian (PBBH), tinggi pundak (TP), panjang badan (PB) dan lebar dada (LD), sedangkan sifat perdagingan yang diamati yaitu tebal otot longissimus dorsi (TLD), tebal lemak punggung (TLP), tebal rump (TR), tebal lemak rump (TLR), marbling score (MS) dan persentase lemak intramuskuler (PIMF). Data sifat pertumbuhan diperoleh dari hasil recording BPTU-HMT Sapi Bali Provinsi Bali dan dikoreksi

7

menggunakan rumus Hardjosubroto (1994). Pengukuran bobot menggunakan timbangan elektrik dan pengukuran ukuran tubuh menggunakan pita ukur dan tongkat ukur berdasarkan BSN (2015). Rumus bobot sapih terkoreksi umur 205 hari dan bobot setahun terkoreksi umur 365 hari serta PBBH disajikan sebagai berikut: Keterangan: Bi -B0 PBBH= [ ] PBBH = Pertambahan Bobot Badan Harian umur Bi B0

= Bobot pada saat peningbangan ke-i = Bobot lahir

B205 = [

Bi -B0 x 205] +B0 umur

Keterangan: B205 = Bobot sapih terkoreksi umur 205 hari Bi = Bobot pada saat peningbangan ke-i B0 = Bobot lahir

B365 = [

Bi -B0 x 365] +B0 umur

Keterangan: B365 = Bobot sapih terkoreksi umur 365 hari Bi = Bobot pada saat peningbangan ke-i B0 = Bobot lahir

Sifat perdagingan diukur menggunkan alat ultrasonografi dengan frekuensi 6.5 Hz dan kedalaman 130 mm. Pengukuran tebal otot longissimus dorsi dilakukan pada posisi tulang rusuk ke 12-13 (Ulum et al. 2014), sedangkan pengukuran tebal otot rump dilakukan pada posisi rump diantara tulang ischium dan illium (Silva et al. 2012). Pengururan otot longissimus dorsi dan rump dilakukan secara transversal (vertikal) dan longitudinal (horizontal). Penentuan marbling score dilakukan berdasarkan AUSTRALIAN MEAT dan MSA marbling reference standard (http://www.wagyu.org.au/marbling/). Data disimpan dalam bentuk JPEG yang selanjutnya dianalisis menggunakan software ImageJ (ImageJ, NIH, USA). Pengukuran persentase lemak intramuskuler dilakukan pada gambar hasil USG yang diambil secara transversal (vertikal) pada posisi tulang rusuk ke 12-13, kemudian diambil region of interest sebesar 30 mm x 30 mm (Deaton dan Rause 2000). Posisi pengukuran sifat perdagingan pada sapi bali disajikan pada Gambar 4. Ilustrasi hasil USG otot longissimus dorsi disajikan pada Gambar 5

Gambar 4 Posisi pengukuran ultrasonografi karakteristik perdagingan otot longissimus dorsi (kiri) dan otot rump (kanan).

8

Sumber: (Ulum et al. 2014).

Gambar 5 Ilustrasi USG otot longissimus dorsi pada sapi, c = kutan, sc = subkutan, tm = tebal otot, o = tulang Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA dilakukan berdasarkan prosedur Geneaid Kit ekstraksi DNA yang dimodifikasi. Sampel darah diambil sebanyak 300 µl kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuse 1.5 ml dan ditambahkan larutan RBC lysis sebanyak 900 µl kemudian homogenkan. Setelah itu larutan didiamkan pada suhu ruang selama 10 menit kemudian sentrifuse 3 000 rpm selama lima menit dan supernatan dibuang. Sebanyak 100 µl RBC lysis dan 200 µl GB Buffer ditambahkan kemudian dihomogenkan dengan vortex. Sampel diinkubasi pada suhu 60 °C selama 10 menit dan dibalik setiap 3 menit. Kemudian Rnase sebanyak 5 µl ditambahkan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Sebanyak 200 µl ethanol asolute ditambahkan dan sampel dipindah di GD coloum kemudian disentrifuse 14 000 rpm selama 5 menit dan collection tube 2 ml dibuang. Sebanyak 400 µl larutan W1 buffer ditambahkan ke dalam GD coloum yang sudah diberi collection tube baru kemudian disentrifue 14 000 rpm selama 1 menit, supernatan dibuang dan GD coloum yang kering disentrifuse kembali. Setelah itu, tabung GD coloumn dipindahkan ke tabung mikrosentrifuse 1.5 ml dan ditambahkan 100 µl pre-heated elution buffer dan diamkan selama 3 menit kemudian disentrifuse 14 000 rpm selama 3 menit. Spektofotometri juga dilakukan untuk mengetahui konsentrasi DNA hasil ekstraksi.

9

Amplifikasi DNA Amplifikasi terhadap fragmen gen MSTN dan Myf5 dilakukan dalam mesin PCR Applied Biosystems sesuai dengan primer yang telah disajikan pada Tabel 1. Kondisi amplifikasi DNA terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi, annealing, dan ekstensi sesuai dengan kondisi PCR (Polymerase Chain Reaction) bagi masingmasing fragmen gen target. Persiapan amplikon dilakukan dengan cara sampel DNA hasil ekstraksi diambil sebanyak 1 µl kemudian dipindahkan ke tabung 0.2 ml. Pereaksi amplifikasi DNA yang terdiri dari 25 µl promega green master mix, 23.6 µl DW, 0.2 µl primer forward, 0.2 µl primer reverse, dimasukkan ke dalam tabung 1.5 µl kemudian dihomogenkan. Sebanyak 49 µl campuran pereaksi PCR tersebut didistribusikan ke masing-masing tabung yang telah berisi 1 µl sampel DNA kemudian di spin down selama 10 detik dan selanjutnya dimasukkan ke dalam mesin PCR. Amplifikasi DNA dilakukan dengan kondisi suhu predenaturasi 95oC selama lima menit, 35 siklus untuk tahapan denaturasi pada suhu 95 oC selama 10 detik, annealing pada suhu 51 oC selama 20 detik untuk gen Myf5 dan 63 oC selama 20 detik untuk gen MSTN, dan ekstensi pada suhu 72 oC selama 30 detik. Kemudian dilanjutkan tahap ekstensi akhir pada suhu 72 oC selama lima menit dalam satu siklus. Produk PCR dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1.5% untuk memverifikasi hasil PCR. Elektroforesis Pembuatan gel agarosa dilakukan dengan mencampurkan serbuk agarosea sebanyak 45 gram dan 30 ml larutan 0.5X TBE (Tris Borax EDTA) dimasukkan ke dalam gelas piala kemudian dipanaskan dalam mikrowave selama 3-5 menit. Setelah itu, larutan agarosa didinginkan dengan menggunakan stirrer berkecepatan 50 rpm sampai asap hilang (sekitar 2 menit). Kemudian EtBr sebanyak 2.5 µl dimasukkan ke dalam larutan dan ditunggu sampai homogen. Setelah homogen larutan dituang ke dalam cetakan dan sisir untuk membuat sumur dipasang, larutan didiamkan selama 20 menit pada suhu ruang. Gel yang sudah mengeras bersama dengan cetakan dipasang dalam bak elektroforesis dan direndam dalam 0.5X TBE. Amplikon sebanyak 5 µl dimasukkan ke dalam masing-masing sumur dan di migrasikan bersama 100 bp ladder dengan tegangan 100 Volt selama 40 menit. Setelah itu, gel difoto menggunakan UV Transiluminator. Sekuensing Sekuensing produk PCR sampel sapi bali dilakukan menggunakan jasa dari First Base, Malaysia. Sekuensing gen Myf5 dan MSTN baik forward dan reverse dilakukan dengan menggunakan mesin ABI PRISM Genetic Analyzer pada fragmen target. Hasil sekuensing disejajarkan dan diblast menggunakan software MEGA 6 dan Bioedit. Pensejajaran dilakukan bersadarkan ENSEMBLE dengan kode akses gen Myf5 adalah ENSBTAG00000026972 dan kode akses gen MSTN adalah MSTNENSBTAG00000011808.

10

Analisis Data Identifikasi SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Identifikasi SNP di promoter gen MSTN dianalisis berdasarkan hasil sekuen baik fragmen forward dan reverse menggunakan program BioEdit (Hall 1999), selanjutnya dilakukan pensejajaran menggunakan metode alignment clustalW dengan program MEGA6 (Tamura et al. 2011). Frekuensi Genotipe dan Alel Keragaman genotipe pada masing-masing sampel dari daerah sumber bibit sapi bali dapat ditentukan dari hasil SNP yang ditemukan. Frekuensi genotipe adalah rasio dari jumlah suatu genotipe terhadap suatu populasi dengan menghitung perbandingan antara jumlah genotipe tertentu pada setiap populasi. Rumus menghitung frekuensi genotipe menurut Nei dan Kumar (2000) sebagai berikut : Xii = Keterangan : Xii = frekuensi genotipe ke-ii nii = jumlah individu bergenotipe ii N = jumlah individu sampel

nii N

Frekuensi alel adalah rasio suatu alel terhadap keseluruhan alel pada suatu SNP dalam populasi. Frekuensi alel (Xi ) dihitung berdasarkan rumus Nei dan Kumar (2000): Xi = Keterangan : Xi = frekuensi alel ke-i nii = jumlah individu bergenotipe ii nij = jumlah individu bergenotipe ij N = jumlah individu sampel

2nii +Σnij 2N

Heterozigositas Keragaman genetik dapat diketahui melalui estimasi heterozigositas pengamatan (Ho) dan heterozigositas harapan (He) yang diperoleh dari populasi sapi bali di BPTU-HMT Provinsi Bali dengan menggunakan rumus Nei dan Kumar (2000): H0 = ∑ i≠j

nij N

Keterangan : Ho = heterozigositas pengamatan (populasi) nij = jumlah individu heterozigot N = jumlah individu yang diamati

11

q

He =1- ∑ x2i i=1

Keterangan : He = nilai heterozigositas harapan Xi = frekuensi alel q = jumlah alel

Keseimbangan Hardy-Weinberg Keseimbangan Hardy-Weinberg dianalisa menggunakan rumus Allendroft et al. (2013) dengan nilai df = (kemungkinan jumlah genotipe) – (jumlah alel). (obs-exp)2 χ=∑ exp 2

Keterangan: χ2 = Hardy-Weinberg equilibrium test obs = nilai observasi genotipe ii Exp = nilai harapan genotipe ii

Asosiasi Gen Myf5 dan MSTN terhadap sifat Pertumbuhan dan Perdagingan Hubungan keragaman gen Myf5 dan MSTN terhadap sifat pertumbuhan dan perdagingan dianalisis menggunakan prosedur rancangan acak kelompok (RAK) dan uji lanjut Duncan Multiple Range Test (DMRT) (SAS Institute Inc. 2008). Model matematika yang akan digunakan sebagai berikut: Yijk = µ+ αi +βj + εij Keterangan: Yij = nilai pengamatan

µ 𝛼𝑖 𝛽𝑗 𝜀𝑖𝑗

= nilai rataan umum = pengaruh genotipe ke-i = pengaruh jenis kelamin = pengaruh galat

12

3 HASIL DAN PEMBAHASAN Karakteristik Sifat Pertumbuhan dan Ultrasonografi Sifat Perdagingan pada Sapi Bali Hasil penelitian ini didapatkan karakteristik sifat pertumbuhan dan perdagingan sapi bali di BPTU-HMT Provinsi bali yang disajikan pada Tabel 2. Berdasarkan hasil pengukuran rataan sifat pertumbuhan sapi bali. Karakteristik fenotipe sapi bali sangat mirip dengan banteng namun berbeda dalam ukuran dan temperamen yang diakibatkan oleh domestikasi (Martojo 2012). Parameter sifat pertumbuhan hasil penelitian ini lebih rendah dibanding hasil Gunawan dan Jakaria (2011) yaitu bobot lahir mencapai 17.73-17.55 kg, bobot sapih mencapai 85.58-89.50 kg dan bobot satu tahun mencapai 130.25-142.3.25 kg sedangkan pada sapi hasil penelitian bobot lahir, bobot sapih (BB205 hari) dan bobot setahun berturut-turut sebesar 17.19 kg, 57.05 kg dan 88.10 kg Pencitraan karakteristik perdagingan pada sapi bali meliputi pengukuran tebal otot longissimus dorsi (TLD), tebal lemak punggung (TLP), tebal otot rump (TR), tebal lemak rump (TLR) dan persentase lemak intramuskuler (PIMF) yang dilakukan menggunakan alat USG. Gambar 6 menunjukkan hasil USG sifat perdagingan sapi bali.

Gambar 6 Citra Ultrasonografi pada otot longissimus dorsi rusuk ke 12-13 sapi bali (A dan B), citra USG otot rump (C dan D), lapisan lemak (a), tebal otot (b), daerah pengukuran PIMF 30x30 mm (c), tulang (d), deposisi lemak intramuskuler (e).

13

Ultrasonografi sebelumnya telah digunakan untuk memprediksi tebal lemak punggung dan lemak intramuskular (IMF) pada berbagai ternak seperti babi (Newcom et al. 2004, Jung et al. 2015), sapi (Miar et al. 2013), dan kelinci (Amalianingsih et al. 2014). Menurut Lambe et al. (2010) penentuan kualitas karkas dapat dilakukan dengan melihat karakteristik dari otot longissimus dorsi dan deposit lemak yang ada di dalam jaringan. Rataan sifat perdagingan hasil USG pada sai bali disajikan pada Tabel 2. Tabel 2 Rataan sifat pertumbuhan dan perdagingan pada sapi bali Phenotype n Rataan SD Maks Min Bobot lahir (kg) 48 17.19 1.32 22.00 15.00 BB 205 hari (kg) 48 57.05 10.91 81.02 40.57 Bobot 365 hari (kg) 48 88.10 19.44 128.65 59.71 PBBH (kg) 48 0.18 0.08 0.30 -0.05 Tinggi pundak (cm) 48 91.91 5.48 106.00 82.00 Panjang badan (cm) 48 84.47 6.76 100.00 71.00 Lingkar dada (cm) 48 108.91 9.18 133.00 94.00 Tebal otot longiisimus dorsi (mm) 31 30.02 4.88 38.52 22.26 Tebal lemak punggung (mm) 31 1.27 0.29 2.04 0.83 Tebal rump (mm) 31 36.40 4.82 46.35 28.67 Tebal lemak rump (mm) 31 0.94 0.27 1.60 0.46 Marbling score 31 1.87 0.88 3.40 0.00 Persentase lemak intramuskuler (%) 31 3.13 1.62 6.71 0.51

Hasil penelitian ini didapatkan bahwa rataan keseluruhan tebal otot longissimus dorsi sebesar 30.02±4.88 mm, tebal lemak punggung sebesar 1.27±0.29 mm lebih besar dari pada hasil pengukuran Rachma dan Harada (2010) pada umur 12, 18 dan 24 bulan (Tabel 3).

Tabel 3 Karakteristik perdagingan sapi bali di kabupaten Barru dan Bone Sifat/Umur 12 bulan 18 bulan 24 bulan 2 Luas longissimus thoracsis (cm ) 16.60-18.00 18.50-24.30 23.30-23.80 Marbling score 0.00-0.14 0.15-0.24 0.17-0.20 Tebal lemak subkutan (mm) 0.26-0.28 0.26-0.33 0.34 Tebal lemak inter muscular (mm) 0.97-1.13 1.06-1.24 1.14-1.31 Tebal rib (mm) 1.99-2.04 2.12-2.52 2.30-2.72 Sumber: Rachma dan Harada (2010).

Hasil penelitian Putri et al. (2015) menunjukkan karakteristik perdagingan tebal otot longissimus dorsi dan tebal lemak punggung sapi bali yang berumur lebih dari 3 tahun dengan genotipe GG sebesar 57.57 mm dan 2.32 mm sedangkan genotipe AG memiliki tebal otot longissimus dorsi yang lebih tinggi yaitu sebesar 63.81 mm dan tebal lemak punggung yang lebih rendah yaitu sebesar 1.935 mm. Yosita et al. (2012) melaporkan tebal lemak punggung sapi bali hasil fattening

14

pada kisaran umur 2.5 sampai 3.5 tahun sebesar 8.40 mm. Hasil penelitian ini menunjukkan nilai marbling score yang rendah dengan rataan 2.33±1.24 mm. Persentase IMF hasil USG sebesar 3.13±1.62%. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa marbling score sapi bali pada umur 12 sampai 15 bulan di BPTU-HMT Provinsi Bali tergolong dalam kategori III (1 sampai 4) (BSN 2015).

Amplifikasi Gen Myf5 dan MSTN pada Sapi Bali Amplifikasi berhasil dilakukan pada gen Myf5 dan MSTN dengan suhu annealing 51°C dan 63°C dan menghasilkan produk masing-masing sebesar 285 bp dan 535 bp. Keberhasilan amplifikasi dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu konsentrasi sampel, konsentrasi primer, suhu annealing, waktu annealing, jumlah sampel, konsentrasi dNTPs dan konsentrasi MgCl2 (Viljoen et al. 2005). Suhu annealing kisaran 50 sampai 72°C tergantung dari sekuen primer dan konsentrasi Konsentrasi MgCl2. Konsentrasi DNA sampel hasil ekstrasi antara 40-88 ng/µl dengan kemurnian kisaran 1.81-2.4. Kemurnian DNA ditentukan oleh nilai rasio (OD260/OD280) yaitu pada kisaran 1.8-2.0. Apabila nilai rasio (OD260/OD280) lebih rendah dari 1.8 mengindikasikan adanya kontaminasi protein dan apabila nilai (OD260/OD280) lebih dari 2.0 mengindikasikan kontaminasi RNA (Ghatak et al. 2013). Gambar 7 menunjukkan hasil elektroforesis gen Myf5 dan MSTN sapi bali.

M

1

2

3

4

5

M

6

7

8

9

1000 bp

1000 bp 500 bp 400 bp 300 bp

500 bp 400 bp

535 bp

285 bp 300 bp 200 bp

200 bp 100 bp

100 bp

A

B

Gambar 7 Hasil amplifikasi gen Myf5 (A) dan MSTN (B) pada elektroforesis gel 1.5%, M: Marker.

Polimorfisme Gen Myf5 dan MSTN pada Sapi Bali Identifikasi keragaman dilakukan dengan menggunakan metode direct sequencing pada fragmen target pada masing-masing gen sesuai primer Tabel 1. Hasil sekuensing dari gen Myf5 ditemukan dua SNP polimorfik pada ekson satu. Hasil analisis sekuensing dan pensejajaran pada gen MSTN ditemukan 20 SNP polimorfik pada daerah promoter. Hasil ini lebih banyak dari pada SNP yang ditemukan oleh He et al. (2013) di promoter gen MSTN yaitu sebanyak 18 SNP

15

polimorfik pada sapi qinchuan. Homologi sekuen gen Myf5 sapi bali dengan genbank disajikan pada Gambar 8.

Gambar 8 SNP gen Myf5 pada sapi bali

Frekuensi genotipe menunjukkan rasio dari jumlah suatu genotipe terhadap suatu populasi dengan menghitung perbandingan antara jumlah genotipe tertentu pada setiap populasi sedangkan frekuensi alel adalah rasio suatu alel terhadap keseluruhan alel pada suatu SNP dalam populasi (Noor 2010). SNP dikatakan polimorfik apabila memiliki frekuensi alel ≤0.99 untuk populasi yang besar dan ≤0.95 untuk populasi yang lebih kecil (Alendrof et al. 2013). Tabel 4 menyajikan frekuensi alel dan genotipe pada kedua gen yang diamati. Pada gen Myf5 SNP c.1172T>A mengalami mutasi transisi (perubahan basa purin menjadi purin) sedangkan SNP c.1205G>A mengalami mutasi transversi (perubahan basa purin menjadi pirimidin atau sebaliknya). SNP tranversi pada bagian ekson berpeluang besar dapat menyebabkan perubahan asam amino yang mengakibatkan mutasi non-synonimous (Allendrof et al. 2013). Genotipe yang ditemukan pada gen Myf5 SNP c.1172T>A yaitu AA dan TA dengan frekuensi genotipe AA sebesar 0.917 dan TA sebesar 0.083, SNP c.1205G>A terdapat tiga genotipe yaitu AA AG dan GG dengan frekuensi genotipe secara berturut-turut adalah 0.083, 0.417 dan 0.500. Pada SNP c.1172T>A frekuensi genotipe AA lebih besar dibanding TA dan genotipe TT

16

tidak ditemukan, hasil tersebut berbeda dengan Ujan et al. (2011) yang menemukan polimorfisme pada SNP c.1172T>A dengan frekuensi genotipe TT lebih besar dari AA pada sapi cina (B. taurus).

Tabel 4 Frekuensi genotipe dan alel gen Myf5 dan MSTN pada sapi bali frekuensi genotipe Frekuensi alel Gen SNP AA AB BB A B Myf5 c.1172T>A 0.083 0.917 0.043 0.957 c.1205G>A 0.500 0.417 0.083 0.713 0.287 MSTN g.-8350C>T 0.542 0.104 0.354 0.594 0.406 g.-8310A>C 0.542 0.042 0.416 0.563 0.437 g.-8299G>A 0.042 0.062 0.896 0.927 0.073 g.-8283A>G 0.042 0.104 0.854 0.094 0.906 g.-8216G>A 0.875 0.083 0.042 0.083 0.917 g.-8205A>G 0.521 0.083 0.396 0.563 0.437 g.-8168A>G 0.063 0.083 0.854 0.104 0.896 g.-8109T>G 0.542 0.458 0.542 0.458 g.-8078C>T 0.729 0.229 0.042 0.844 0.156 g.-8077G>A 0.937 0.042 0.021 0.958 0.042 g.-8029T>C 0.479 0.208 0.313 0.583 0.417 g.-8028A>G 0.354 0.292 0.354 0.500 0.500 g.-8016C>T 0.666 0.188 0.146 0.760 0.240 g.-7799T>C 0.104 0.188 0.708 0.198 0.802 g.-7996G>C 0.104 0.354 0.542 0.281 0.719 g.-7953C>T 0.063 0.104 0.833 0.115 0.885 g.-7942C>G 0.916 0.042 0.042 0.938 0.062 g.-7941C>T 0.708 0.084 0.208 0.750 0.250 g.-7930A>G 0.792 0.188 0.020 0.885 0.115 g.-7905T>C 0.542 0.458 0.542 0.458 Ket: AA = genotype referensi (Genbank), AB = genotype heterozigot, BB = genotipe mutan, A = alel referensi (Genbank), B = alel mutan.

Homologi sekuen promoter gen MSTN sapi bali dengan genbank disajikan pada Gambar 9. Hasil pensejajaran ditemukan 20 SNPs pada sekuen gen MSTN yang termasuk dalam SNP tranversi (18 SNPs) dan transisi (2 SNP). Hampir semua SNP gen MSTN memiliki tiga genotipe kecuali pada SNP g.-8109T>G dan g.-7905T>C hanya ditemukan dua genotipe homozigot genotipe heterozigot tidak ditemukan. Distribusi frekuensi alel terendah terdapat pada SNP g.-7942C>G pada alel G yaitu sebesar 0.062 sedangkan frekuensi alel tertinggi terdapat pada SNP g.-7942C>G alel C sebesar 0.938. Sarti et al. (2014) menyatakan bahwa polimorfisme pada daerah promoter gen MSTN pada sapi marchiagiana pada posisi SNP -37A>T dengan genotipe AA, AT dan TT sebesar 0.03, 0.26 dan 0.72, sedangkan pada SNP -805 bersifat monomorfik dengan genotipe GG . Berdasarkan hasil identifikasi SNP yang terdapat di promoter gen MSTN sapi bali tidak ditemukan CpG island (prediksi berdasarkan http://www.urogene.org/methprimer/) dengan kriteria: panjang basa >100bp,

17

persentase GC >50% dan Obs/Exp >0.6. Gambar 10 menunjukkan hasil prediksi CpG island pada sapi bali dan genbank. Pada daerah tersebut ditemukan 7 buah SNP yang mungkin menyebabkan CpG island di sapi bali tidak ditemukan. Daerah promoter diketahui memiliki fungsi yang menunjukkan adanya TSS (transcription start site) yang merupakan posisi awal transkripsi suatu gen (Illingworth et al. 2010). Mutasi di promoter gen MSTN dapat menyebabkan penurunan ekspresi yang berakibat pada perubahan perkembangan sel otot. Hal tersebut dapat terjadi karena perubahan pola splicing dan perubahan ekspresi gen (Santagostino et al. 2015). Adapun daerah genom yang berkaitan dengan metilasi DNA dibedakan menjadi dua bagian, 1) DNA termetilasi, sedikit CpG island, dan 2) tidak termetilasi, kaya CpG island (Deaton dan Bird 2011). Mutasi di daerah TATA box, CACCC dan AT1 secara signifikan dapat menurunkan aktivitas promoter, namun mutasi pada daerah AT2 dan PAL dapat meningkatkan aktivitas promoter (Allen dan Du 2008). Gambar 10 menunjukkan ketiadaan CpG island di promoter sapi bali (A) dan CpG island pada promoter Bos taurus (B). Ketiadaan CpG island pada sapi bali mungkin disebabkan oleh adanya 7 buah mutasi di daerah CpG island yaitu SNP g.-8078C>T, g.-8077G>A, g.-8029T>C, g.8028A>G, g.-8016C>T, g.-7799T>C, g.-7996G>C.

Gambar 9 SNP gen MSTN pada sapi bali

18

Gambar 10 Tidak ditemukan CpG island di sapi bali (A) dan CpG island di Bos taurus (B).

Heterozigositas dan Keseimbangan Hardy-Weinberg Heterozigositas menyatakan keragaman genetik suatu populasi yang dapat digunakan untuk program seleksi. Noor (2010) menjelaskan bahwa keragaman gen dapat digunakan sebagai acuan dalam menentukan program pemuliaan yaitu dilakukan seleksi apabila populasi beragam dan persilangan dilakukan apabila populasi seragam. Suatu SNP dikatakan memiliki keragaman tinggi apabila nilai heterosigositas >0.50 (Allendrof et al. 2013). Nilai heterosigositas observasi (Ho) tertinggi gen Myf5 terdapat pada SNP c.1205G>A yaitu sebesar 0.4167 sedangkan nilai heterosigositas observasi (Ho) terendah pada SNP c.1172T>A sebesar 0.0833. Heterosigositas tertinggi gen MSTN yaitu pada SNP g.-7996G>C sebesar 0.3542 dan nilai terendah pada SNP g.-8109T>G dan g.-7905T>C dengan heterosigositas sebesar 0.000. Heterosigositas 0.000 disebabkan tidak ditemukannya individu bergenotipe heterozigot. Nilai heterosigositas SNP gen Myf5 dan MSTN disajikan pada Tabel 5. Nilai Ho dan He pada SNP gen Myf5 ditemukan memiliki perbedaan yang rendah yang dapat mengindikasikan bahwa SNP tersebut dalam keadaan seimbang sesuai dengan hasil analisis chi-square (χ2). Pada gen MSTN hanya tiga SNP yang ditemukan memiliki perbedaan Ho dan He kecil yaitu pada SNP g.-8078C>T, g.7996G>C, g.-7930A>G. Nilai Ho yang lebih rendah dibanding He mengindikasikan adanya inbreeding (Nassiry et al. 2009). Hasil analisis HW (χ2) pada gen MSTN secara umum tidak seimbang (17 SNP) dan hanya tiga SNP yang berada dalam keadaaan seimbang yaitu SNP pada posisi g.-8078C>T, g.7996G>C, g.-7930A>G di promoter gen MSTN sapi bali. Menurut Noor (2010) faktor-faktor yang mempengaruhi keseimbangan gen dalam suatu populasi adalah non-random mating, seleksi, migrasi, mutasi dan genetic drift. Ketidakseimbangan SNP pada sapi bali kemungkinan besar disebabkan oleh tiga faktor yaitu non random mating, mutasi dan seleksi.

19

Tabel 5 Heterosigositas dan keseimbangan Hardy-Weinberg SNP gen Myf5 dan MSTN sapi bali Gen SNP Ho He χ2 MYF5 c.1172T>A 0.0833 0.0807 tn c.1205G>A 0.4167 0.4175 tn MSTN g.-8350C>T 0.1042 0.4875 ** g.-8310A>C 0.0417 0.5064 ** g.-8299G>A 0.0625 0.1366 ** g.-8283A>G 0.1042 0.1717 ** g.8216G>A 0.0833 0.1544 ** g.-8205A>G 0.0833 0.4974 ** g.-8168A>G 0.0833 0.1886 ** g.-8109T>G 0.0000 0.5018 ** g.-8078C>T 0.2292 0.2695 tn g.-8077G>A 0.0417 0.0807 ** g.-8029T>C 0.2083 0.4912 ** g.-8028A>G 0.2917 0.5053 ** g.-8016C>T 0.1875 0.3730 ** g.-7799T>C 0.1875 0.3208 ** g.-7996G>C 0.3542 0.4086 tn g.-7953C>T 0.1042 0.2050 ** g.-7942C>G 0.0417 0.1184 ** g.-7941C>T 0.0833 0.3789 ** g.-7930A>G 0.1875 0.2050 tn g.-7905T>C 0.0000 0.5018 ** Ket: χ2 = Hardy-Weinberg equilibrium, tn = tidak nyata, (**) significant pada α 1% (X2 obs ≥ 6.64), n: 48 heads.

Asosiasi gen MYF5 terhadap Sifat Pertumbuhan dan Perdagingan Hasil analisis menunjukkan bahwa SNP c.1172T>A dan c.12-5G>A gen Myf5 ditemukan tidak berasosiasi terhadap kedua sifat yang diamati baik pada sifat pertumbuhan maupun perdagingan (Tabel 6 dan Tabel 7). Berbeda dengan Ujan et al. (2011) bahwa pada SNP c.1172T>A memiliki asosiasi nyata dengan tebal lemak punggung dan keempukan daging. Genotipe TA pada SNP tersebut memiliki tebal lemak punggung dan keempukan yang lebih besar dibanding TT. Sebaliknya pada sapi bali genotipe AA ditemukan proporsinya lebih besar dibanding TA dan tidak ditemukan genotipe TT. Meskipun mutasi terjadi pada ekson, namun kedua SNPs yang ditemukan tidak memberikan pengaruh yang signifikan karena mutasi yang terjadi adalah synonymous (tidak merubah asam amino). Pada SNP c.1172T>A terjadi mutasi CTT/A yang sama-sama menghasilkan asam amino leusin. Sedangkan SNP c.1205G>A mengalami mutasi pada CGG/A yang menghasilkan asam amino proline. Asosiasi signifikan SNP lain ditemukan pada gen Myf5 terhadap sifat pertumbuhan, yaitu pada intron 2 yang berasosiasi nyata terhadap bobot hidup dua tahun pada sapi hanwo dengan genotipe GG lebih besar dibanding genotype AG dan AA (Bhuiyan et al. 2009). SNP tersebut juga berasosiasi nyata dengan panjang trunk, lebar dada, lebar pundak, bobot 290 hari, bobot 310 hari dan bobot 330 hari pada sapi pedaging

20

marchigiana (Sarti et al. 2014). Gen Myf5 merupakan anggota MRF Family dan salah satu gen yang terlibat dalam mekanisme pembentukan otot rangka dan pembentukan lateral sciertome derivates (Braun et al. 1992). Gen Myf5 merupakan gen pertama yang diekspresikan oleh sel-sel progenitor pada tahapan myogenic selama masa perkembangan embrio (Francetic dan Li 2011). Gen Myf5 bersama dengan MyoD adalah bagian dari myogenic basis HLH transcription factor family yang diekspresikan pada poliferasi myoblast dan myotube (serat otot immature) yang belum terdiferensiasi yang dibutuhkan untuk determinasi myogenic dari prekusor otot dan menjaga populasi sel myogenic. Tajbakhsh et al. (1996) menyatakan bahwa tikus yang mempunyai mutasi pada gen Myf5 secara total kekurangan serat otot rangka dan prekusor myoblast. Braun (1992) juga menjelaskan bahwa mutasi pada gen Myf5 dapat menyebabkan kematian pada tikus karena kesulitan bernafas pada saat setelah dilahirkan yang diakibatkan oleh tidak terbentuknya otot pada tulang rusuk janin.

Tabel 6 Asosiasi pengaruh genotipe SNPs gen Myf5 terhadap sifat pertumbuhan sapi bali SNP Genotipe (n) BL (kg) BB205 (kg) BB365 (kg) PBBH (kg) TP (cm) PB (cm) LD (cm)

c.1172T>A TA AA (4) (39) 17.75±1.32 17.13±1.31 56.75±10.48 57.05±10.90 88.00±18.71 88.18±19.43 0.19±0.052 0.19±0.054 92.96±2.69 91.75±0.85 87.11±3.30 84.15±1.05 107.75±4.58 108.97±1.45

GG (23) 17.37±1.30 56.50±10.53 88.17±18.81 0.19±0.052 91.72±1.07 84.05±1.39 109.64±1.89

c.1205G>A GA (16) 17.00±1.29 57.04±0.41 87.31±18.65 0.19±0.05 90.71±1.33 84.16±1.73 106.49±2.35

AA (4) 17.00 ±1.44 59.00±10.26 91.50±18.35 0.20±0.05 97.29±26 87.69±3.43 113.79±4.65

Ket: BL= Bobot lahir, BB205= Bobot sapih, BB365= BB 1 tahun, PBBH= pertambahan bobot badan harian, TP= Tinggi pundak, PB= panjang badan. LD= Lebar dada.

Tabel 7 Asosiasi pengaruh genotipe SNPs gen Myf5 terhadap sifat perdagingan sapi bali SNP c.1172T>A c.1205G>A Genotipe TA AA GG GA AA (n) (3) (28) (12) (15) (4) TLD (mm) 34.20±1.91 33.21±0.63 33.93±0.89 32.32±0.88 34.78±2.12 TLP (mm) 1.48±0.20 1.47±0.06 1.43±0.09 1.43±0.09 1.75±0.22 TR (mm) 39.28±2.07 40.35±0.68 40.70±1.00 39.87±0.99 39.98±2.39 TLR (mm) 0.96±0.20 1.09±0.06 1.12±0.09 1.04±0.09 1.07±0.23 MS 2.21±0.72 2.29±0.24 2.27±0.35 2.13±0.34 2.94±0.82 PIMF (%) 3.43±1.28 3.75±0.42 3.55±0.60 3.35±0.58 5.91±1.40 Ket: TLD= Tebal longissimus dorsi, TLP= Tebal lemak punggung, MS = marbling score, TR= Tebal rump, TRF= tebal lemak rump dan PIMF= Persentase lemak intramuskular.

21

Meskipun tidak terlihat perbedaan yang nyata, namun secara keseluruhan pada sifat perdagingan apabila tebal otot longissimus dorsi besar maka tebal lemak punggung kecil dan begitu juga sebaliknya. Hal ini disebabkan karena pada saat embriogenesis terjadi penurunan tingkat poliferasi pada primary skeletal muscle cells yang menyebabkan rendahnya ekspresi gen Myf5 yang berperan menjaga satelite cell pool (prekusor sel otot yang dapat menambah myonuklei pada ternak dewasa) sehingga prekusor myogenic berubah menjadi adipogenic yang dapat meningkatkan deposisi intramuscular fat pada sapi (Coles et al. 2015).

Asosiasi Gen MSTN terhadap Sifat Pertumbuhan dan Perdagingan Asosiasi SNPs pada gen MSTN dengan sifat pertumbuhan dan perdagingan disajikan pada Tabel 8, Tabel 9 dan Tabel 10. Hasil analisis tidak ditemukan asosiasi nyata antara perbedaan genotipe pada masing-masing SNPs dengan sifat pertumbuhan. Namun, hasil asosiasi SNP dengan sifat perdagingan ditemukan nyata pada persentase lemak intramuscular (PIMF) yaitu pada SNP g.-7799T>C dan g.-7941C>T (Tabel 10). Pada sapi qincuan juga tidak ditemukan asosiasi nyata pada polimorfisme gen MSTN terhadap sifat bobot lahir, bobot 6 bulan, bobot 12 bulan, bobot 18 bulan dan bobot 24 bulan, namun ditemukan asosiasi signifikan pada tinggi pundak pada umur 18 bulan (Zhang et al. 2007). Ekpresi gen MSTN pada janin sapi sangat tinggi dan akan menurun seiring dengan kelahiran dan perkembangan ternak sampai umur 10 bulan. Kemudian pada umur sekitar 13 bulan ekspresi gen MSTN akan mengalami peningkatan kembali sampai puncaknya pada umur 16 bulan dan akan menurun kembali secara perlahan (Shibata et al. 2014). Daerah promoter gen MSTN diketahui terlibat dalam ekspresi gen namun tidak mempengaruhi ekspresi gen myogenic lainnya seperti Myog, Myf5, dan MyoD. Ekspresi gen MSTN berbanding terbalik dengan ekspresi Myogenic lainnya (Xu et al. 2003). Myostatin adalah paracrine atau autocrine yang mutasinya mengakibatkan aktivitas atau ekspresi gen MSTN berubah dan menghasilkan peningkatan pada massa otot pada beberapa spesies (Allen dan Du 2008). Protein myostatin berfungsi menghambat proses proliferasi dan diferensiasi sel sehingga pertumbuhan sel yang dihasilkan tidak berlebihan dan sesuai dengan kebutuhan (Taylor et al. 2001; Bellinge et al. 2005). Adapun Han et al. (2012) menyatakan bahwa mutasi di promoter berasosiasi nyata pada indeks kualitas daging dan indeks warna lemak pada sapi hanwoo. Bellinge et al. (2005) menyatakan bahwa individu yang memiliki mutasi di gen MSTN mengalami dua sampai tiga kali perkembangan otot yang lebih besar yang diakibatkan oleh kombinasi hiperplasia (peningkatan jumlah otot) dan hiperthrophy (peningkatan massa otot) pada ternak. Selain itu, mutasi pada gen MSTN dapat mengurangi perlemakan baik lemak putih maupun lemak coklat (Li et al. 2015). Gen MSTN secara signifikan juga menghambat differensiasi dari preadipocity oleh sitokinin yang berasal dari sel otot (Li et al. 2015). Hal tersebut dikarenakan adanya hubungan otot-lemak yang akan mengatur rasio lemak dalam otot seperti PIMF yang dipengaruhi oleh aktivitas gen MSTN di otot (Sun et al. 2016). Single Nucleotide Polymorphism (SNP) yang signifikan berpotensi sebagai kandidat untuk seleksi sifat perdagingan terutama untuk persentase lemak intramuskular.

22

Tabel 8 Asosiasi genotipe SNP gen MSTN terhadap sifat bobot sapi bali SNP g.-8350C>T

g.-8310A>C

g.-8299G>A

g.-8283A>G

g.8216G>A

g.-8205A>G

g.-8168A>G

g.-8109T>G g.-8078C>T

g.-8077G>A

g.-8029T>C

g.-8028A>G

g.-8016C>T

g.-7799T>C

g.-7996G>C

g.-7953C>T

g.-7942C>G

g.-7941C>T

g.-7930A>G

g.-7905T>C

Genotype CC CT TT AA AC CC GG AG AA AA AG GG GG AG AA AA AG GG AA AG GG TT GG CC CT TT GG AG AA CC CT TT AA AG GG CC CT TT CC CT TT CC CG GG CC CT TT CC CG GG CC CT TT AA AG GG CC TT

n 26 5 17 26 2 20 43 3 2 2 5 41 2 4 42 25 4 19 3 4 41 26 22 35 11 2 45 2 1 15 10 23 17 17 14 32 9 7 34 9 5 26 17 5 3 5 40 44 2 2 34 4 10 38 9 1 22 26

BL (kg) 17.65±1.15 17.00±0.00 16.92±1.73 16.92±1.15 17.00±0.00 17.55±1.62 17.23±1.39 17.00±0.00 16.50±0.71 16.50±0.71 17.80±0.50 17.28±1.42 17.24±0.71 17.00±0.00 16.50±1.41 17.92±1.18 17.00±0.00 17.58±1.62 16.33±0.58 17.00±0.00 17.27±1.42 17.35±1.45 17.00±1.22 18.50±1.39 17.23±0.92 16.82±2.12 17.22±1.38 17.00±0.00 16.00±0.00 17.60±1.76 17.00±1.33 17.00±0.90 17.47±1.70 17.12±1.14 16.93±0.99 17.20±1.33 17.22±1.20 17.14±1.57 17.35±1.52 16.89±0.33 16.60±0.55 17.24±1.47 16.88±0.99 17.40±1.52 17.25±0.58 17.20±0.45 16.33±1.41 17.23±1.36 17.00±0.00 16.50±0.71 17.18±1.40 16.50±1.00 17.50±1.08 17.24±1.44 17.00±0.71 17.00±0.00 17.00±1.20 17.35±1.41

BB205 (kg) 57.83±12.13 63.60±11.17 53.60±7.75 57.83±12.13 57.00±15.68 56.00±9.35 56.13±9.71 63.33±15.68 64.50±10.58 64.50±9.71 62.75±12.88 56.00±10.70 64.50±10.70 62.75±12.88 56.00±9.71 57.68±12.40 62.75±12.88 54.82±8.10 64.50±9.71 62.75±12.88 56.00±10.70 57.04±9.45 57.00±12.63 57.58±10.82 54.20±10.86 62.50±16.31 57.00±0.00 57.00±15.68 58.00±11.04 55.67±10.52 59.50±11.65 56.78±11.20 56.82±10.68 59.77±11.75 54.54±10.53 56.93±10.06 58.88±12.71 55.29±13.40 55.81±10.68 58.88±10.67 62.75±13.71 55.52±9.31 57.27±13.23 63.20±9.92 64.50±9.71 59.40±13.59 56.28±10.70 56.10±10.59 68.50±11.11 71.00±0.00 57.58±11.29 59.75±12.60 53.50±8.88 57.71±10.84 56.13±10.96 41.00±0.00 57.04±12.63 57.04±9.45

BB365 (kg) 89.83±21.25 100.60±19.89 81.47±14.40 89.83±21.25 88.50±27.91 86.00±17.20 86.50±16.74 100.00±27.91 102.00±18.83 102.00±16.74 98.75±22.94 86.27±19.04 102.00±19.04 98.75±22.94 86.27±16.74 89.59±21.72 98.75±22.94 83.82±15.01 102.00±16.74 98.75±22.94 86.27±19.04 88.00±22.10 88.35±17.31 89.10±19.44 83.40±19.29 97.50±27.39 88.10±0.00 88.50±27.91 90.00±19.67 85.47±18.71 93.00±20.33 87.72±20.15 87.59±19.06 93.62±20.64 83.46±18.94 87.93±18.36 91.75±22.20 85.00±22.93 85.77±18.95 92.00±19.18 99.00±24.31 85.17±17.09 89.07±23.15 99.20±16.93 102.00±16.74 92.40±24.39 86.81±19.03 86.48±18.85 109.00±19.78 114.00±0.00 89.23±20.09 93.75±22.29 81.25±15.84 89.32±19.29 86.75±19.73 60.00±0.00 88.35±22.10 88.00±17.31

PBBH (kg) 0.23±0.06 0.20±0.05 0.18±0.04 0.20±0.06 0.20±0.08 0.19±0.05 0.19±0.05 0.23±0.08 0.23±0.04 0.23±0.04 0.22±0.06 0.19±0.05 0.23±0.04 0.22±0.06 0.19±0.05 0.22±0.06 0.20±0.06 0.18±0.04 0.23±0.04 0.22±0.06 0.19±0.05 0.19±0.05 0.19±0.06 0.20±0.05 0.18±0.05 0.22±0.07 0.19±0.05 0.20±0.08 0.20±0.00 0.19±0.05 0.21±0.05 0.19±0.06 0.19±0.05 0.21±0.06 0.18±0.05 0.19±0.05 0.20±0.06 0.19±0.06 0.19±0.05 0.21±0.05 0.23±0.07 0.19±0.05 0.20±0.06 0.22±0.04 0.23±0.04 0.21±0.07 0.19±0.05 0.19±0.05 0.25±0.05 0.27±0.00 0.20±0.06 0.21±0.06 0.17±0.04 0.20±0.05 0.19±0.05 0.12±0.00 0.19±0.06 0.19±0.05

Ket: BL= Bobot Lahir, BB205= Bobot 205 hari, BB365= Bobot 365 hari, PBBH= Pertambahan bobot badan harian, (*) n= 1 tidak disertakan dalam analisis asosiasi

23

Tabel 9 Asosiasi genotipe SNP gen MSTN terhadap ukuran tubuh sapi bali. SNP g.-8350C>T

g.-8310A>C

g.-8299G>A

g.-8283A>G

g.8216G>A

g.-8205A>G

g.-8168A>G

g.-8109T>G g.-8078C>T

g.-8077G>A

g.-8029T>C

g.-8028A>G

g.-8016C>T

g.-7799T>C

g.-7996G>C

g.-7953C>T

g.-7942C>G

g.-7941C>T

g.-7930A>G

g.-7905T>C

Genotipe

n

TP (cm)

PB (cm)

LD (cm)

CC

26

92.08±1.14

84.44±1.39

109.80±1.91

CT TT AA AC CC GG AG AA AA AG GG GG AG AA AA AG GG AA AG GG TT GG CC CT TT GG AG AA CC CT TT AA AG GG CC CT TT CC CT TT CC CG GG CC CT TT CC CG GG CC CT TT AA AG GG CC TT

5 17 26 2 20 43 3 2 2 5 41 2 4 42 25 4 19 3 4 41 26 22 35 11 2 45 2 1 15 10 23 17 17 14 32 9 7 34 9 5 26 17 5 3 5 40 44 2 2 34 4 10 38 9 1 22 26

93.54±2.41 90.97±1.44 92.06±1.15 92.52±3.94 91.54±1.34 91.43±3.73 94.73±3.05 95.84±0.85 95.82±3.68 95.44±2.63 91.26±0.85 95.82±3.68 95.44±2.63 91.26±0.85 91.82±1.14 95.46±2.68 91.07±1.32 95.82±3.68 95.44±2.63 91.26±0.85 92.30±1.13 91.37±1.21 92.33±0.96 90.32±1.70 92.53±3.87 91.66±0.84 92.58±3.86 98.31±5.41 90.72±1.40 91.39±1.70 93.07±1.30 91.65±1.32 91.87±1.51 92.13±1.54 92.46±1.01 91.26±1.90 90.17±2.02 91.36±0.97 92.22±2.02 95.04±2.66 91.45±1.10 91.23±1.38 95.75±2.39 95.84±3.76 93.27±2.43 91.44±0.89 91.50±0.82 98.45±3.74 93.31±5.39 91.84±0.99 93.73±2.70 91.05±2.00 92.32±0.92 90.41±1.88 88.26±5.46 91.37±1.21 92.30±1.13

88.15±2.95 83.17±1.76 84.42±1.42 87.38±4.87 84.10±1.65 83.81±1.05 90.37±3.75 87.21±4.58 87.19±4.55 89.93±3.26 83.68±1.06 87.19±1.06 89.93±3.26 83.68±1.06 84.23±1.40 89.95±3.28 83.37±1.61 87.19±4.55 89.93±3.26 83.68±1.06 84.91±1.40 83.88±1.50 84.60±1.20 83.55±2.13 86.17±4.85 84.19±1.06 87.41±4.84 88.01±6.78 83.69±1.77 84.32±2.15 85.10±1.63 84.53±1.63 85.25±1.87 83.50±1.91 84.52±1.27 84.47±2.39 84.05±2.55 83.39±1.18 86.13±2.46 88.99±3.24 83.68±1.40 84.99±1.76 86.21±3.05 87.20±4.59 88.88±2.96 83.65±1.08 83.98±1.02 92.57±4.65 86.33±6.70 84.17±1.22 87.20±3.34 84.04±2.48 84.70±1.12 84.71±2.29 73.42±6.65 83.88±1.50 84.91±1.40

112.31±4.05 106.24±2.41 109.76±1.95 109.71±6.68 107.60±2.27 108.04±1.45 113.51±5.17 117.32±6.31 117.28±6.21 114.95±4.45 107.73±1.44 117.28±6.21 114.95±4.45 107.73±1.44 109.33±1.93 115.01±4.53 106.76±2.23 117.28±6.21 114.95±4.45 107.73±1.44 109.23±1.93 108.44±2.07 109.50±1.60 105.41±2.83 116.46±6.44 108.65±1.46 109.51±6.66 115.54±9.34 106.72±2.40 108.95±2.91 110.56±2.22 108.62±2.26 108.90±2.58 109.12±2.63 109.12±1.75 108.19±3.28 108.58±3.50 107.88±1.65 109.94±3.44 114.23±4.52 107.41±1.87 109.05±2.36 115.01±4.07 117.30±6.30 112.58±4.07 107.86±1.49 108.03±1.37 120.29±6.24 119.36±9.00 108.53±1.68 112.16±4.61 108.49±3.42 109.75±1.54 106.59±3.17 97.08±9.17 108.44±2.07 109.23±1.93

Ket: TP= tinggi pundak, PB= panjang badan dan LD= Lingkar dada, (*) n= 1 tidak disertakan dalam analisis asosiasi

24

Tabel 10 Asosiasi genotipe SNP gen MSTN terhadap sifat perdagingan sapi bali SNPs g.-8350C>T

Genotipe n TLD (mm) TLP (mm) TR(mm) TLR(mm) MS (mm) PIMF (mm) CC 14 30.17±4.88 1.40±0.33 37.61±5.06 1.09±0.27 2.24±0.85 3.65±1.53 CT 5 32.44±2.71 1.22±0.20 36.74±4.80 0.91±0.28 2.57±0.59 4.13±1.85 TT 12 28.86±5.47 1.24±0.23 34.95±4.56 0.89±0.29 1.72±0.93 2.65±1.54 g.-8310A>C AA 14 30.17±4.88 1.40±0.33 37.61±5.06 1.09±0.27 2.24±0.85 3.65±1.53 CA 2 30.26±1.77 1.34±0.06 34.01±0.89 0.74±0.28 2.68±1.02 4.54±3.07 CC 15 29.87±5.35 1.22±0.22 35.67±4.83 0.92±0.28 1.89±0.89 2.91±1.54 g.-8299G>A AA* 1 35.11±0.00 2.41±0.00 45.94±0.00 1.02±0.00 4.00±0.00 7.24±0.00 AG 3 32.27±3.70 1.22±0.21 33.87±0.68 0.74±0.20 2.61±0.73 4.54±2.17 GG 27 29.77±4.98 1.32±0.30 36.68±5.01 1.01±0.27 2.04±0.87 3.22±1.51 g.-8283A>G AA* 1 35.12±0.00 2.41±0.00 45.94±0.00 1.02±0.00 4.00±0.00 7.24±0.00 AG 4 31.40±3.49 1.28±0.21 34.29±1.00 0.76±0.17 2.48±0.65 4.20±1.90 GG 26 29.81±5.08 1.31±0.31 36.73±5.10 1.02±0.28 2.04±0.88 3.22±1.54 g.8216G>A AA 26 31.40±5.08 1.31±0.31 36.73±5.10 1.02±0.28 2.04±0.88 3.22±1.54 AG 4 29.81±3.49 1.28±0.21 34.29±1.00 0.76±0.17 2.48±0.65 4.20±1.90 GG* 1 35.11±0.00 2.41±0.00 45.94±0.00 1.02±0.00 4.00±0.00 7.24±0.00 g.-8205A>G AA 13 30.28±5.08 1.40±0.34 37.79±5.24 1.12±0.27 2.25±0.88 3.69±1.61 AG 4 31.40±3.49 1.28±0.21 34.29±1.00 0.76±0.17 2.48±0.65 4.20±1.90 GG 14 29.41±5.23 1.28±0.23 35.82±4.98 0.93±0.29 1.84±0.91 2.78±1.53 g.-8168A>G AA* 1 35.11±0.00 2.41±0.00 45.94±0.00 1.02±0.00 4.00±0.00 7.24±0.00 AG 26 29.81±3.49 1.28±0.21 34.29±1.00 0.76±0.17 2.48±0.65 4.20±1.90 GG 4 31.40±5.08 1.31±0.31 36.73±5.10 1.02±0.28 2.04±0.88 3.22±1.54 g.-8109T>G GG 12 30.28±5.08 1.40±0.34 37.79±5.24 1.12±0.27 2.25±0.88 3.69±1.61 TT 19 29.85±4.88 1.25±0.22 35.48±4.42 0.89±0.27 1.99±0.88 3.12±1.67 g.-8078C>T CC 24 30.32±4.90 1.29±0.26 36.47±4.91 1.00±0.26 1.94±0.89 3.13±1.69 CT 4 29.19±6.45 1.28±0.39 35.99±6.13 0.88±0.41 2.14±0.55 3.08±1.57 TT 2 28.12±0.20 1.51±0.49 36.34±2.30 1.02±0.24 3.89±0.00* 6.48±0.00* g.-8077G>A AA* 1 35.11±0.00 2.41±0.00 45.94±0.00 1.02±0.00 4.00±0.00 7.24±0.00 AG 2 30.26±1.77 1.34±0.06 34.01±0.89 0.74±0.28 2.68±1.02 4.54±3.07 GG 28 30.01±5.04 1.30±0.30 36.57±4.95 1.00±0.27 2.06±0.86 3.27±1.51 g.-8029T>C CC 12 29.16±5.19 1.27±0.37 36.59±5.99 1.00±0.26 2.06±0.77 3.62±1.50 CT 5 32.53±5.35 1.40±0.25 39.50±4.73 0.88±0.32 2.90±0.26 3.33±0.91 TT 14 29.85±4.46 1.31±0.22 35.03±3.11 1.01±0.28 1.88±1.07 3.12±1.95 g.-8028A>G AA 13 29.14±5.17 1.27±0.37 35.74±5.40 0.94±0.28 2.05±0.77 3.42±1.40 AG 8 32.87±4.55 1.32±0.24 38.88±4.99 0.98±0.24 2.64±0.83 4.15±1.49 GG 10 28.81±4.24 1.34±0.24 35.21±3.49 1.03±0.32 1.78±1.04 2.72±1.76 g.-8016C>T CC 23 30.17±4.84 1.26±0.21 35.67±4.25 0.97±0.26 1.87±0.89 2.99±1.65 CT 3 30.87±5.90 1.40±0.35 40.97±5.43 0.90±0.34 3.22±0.26 3.65±0.80 TT 5 28.87±5.46 1.44±0.50 36.89±6.29 1.07±0.34 2.39±1.11 4.69±2.13 g.-7799T>C CC 24 29.64±5.03 1.31±0.32 36.19±4.92 0.96±0.28 2.08±0.91 3.31±1.57ab CT 4 31.03±4.48 1.36±0.10 39.13±4.79 1.22±0.36 1.78±0.54 2.48±0.84b TT 3 32.65±5.15 1.14±0.23 33.49±0.16 0.84±0.15 2.94±0.65 5.62±1.54a g.-7996G>C CC 18 30.10±5.13 1.29±0.26 36.24±4.81 0.96±0.30 1.92±0.87 2.86±1.48 GC 9 30.11±4.03 1.32±0.26 36.55±4.08 1.04±0.25 2.42±0.84 4.13±1.84 GG 4 29.34±7.41 1.37±0.59 36.93±8.53 0.94±0.25 2.16±1.21 3.81±2.07 g.-7953C>T CC* 1 35.11±0.00 2.41±0.00 45.94±0.00 1.02±0.00 4.00±0.00 7.24±0.00 CT 5 31.18±3.06 1.30±0.19 34.94±1.70 0.91±0.35 2.34±0.64 4.22±1.64 TT 25 29.79±5.18 1.31±0.31 36.69±5.20 1.00±0.26 2.05±0.90 3.17±1.55 g.-7942C>G CC 29 29.84±4.90 1.31±0.29 36.53±4.96 1.00±0.28 2.08±0.91 3.32±1.66 GC 2 32.54±5.31 1.22±0.34 34.57±1.37 0.78±0.08 2.29±0.26 3.85±0.96 GG 0 --------------------------------------------------------------------------------------------------g.-7941C>T CC 21 30.03±4.95 1.31±0.31 37.14±5.40 1.03±0.26 2.09±0.74 2.99±1.57b CT 4 33.15±5.00 1.29±0.22 35.62±3.05 0.91±0.17 2.66±0.66 4.81±0.84a TT 6 27.93±4.10 1.31±0.26 34.47±3.36 0.88±0.39 1.86±1.24 2.71±1.54b g.-7930A>G AA 27 30.11±4.77 1.30±0.28 36.45±4.74 0.98±0.26 2.09±0.89 3.39±1.66 AG 3 30.15±7.55 1.36±0.44 37.03±7.06 0.94±0.47 2.57±0.67 3.62±1.40 GG* 1 28.20±0.00 1.46±0.00 34.26±0.00 1.11±0.00 1.00±0.00 1.63±0.00 g.-7905T>C CC 12 30.28±5.08 1.40±0.34 37.79±5.24 1.12±0.27 2.25±0.88 3.69±1.61 TT 19 29.85±4.88 1.25±0.22 35.48±4.42 0.89±0.27 1.99±0.88 3.12±1.67 Ket: n = jumlah sampel, (*) n = 1 genotipe tersebut tidak diikutkan dalam perhitungan asosiasi, ( a,b) huruf yang berbeda menunjukkan nyata (P≤0.05), TLD = Tebal otot longissimus dorsi, TLP = tebal lemak punggung, TR = tebal rump, TLR= tebal lemak rump, MS = marbling score, PIMF = persentase lemak intramuskuler.

25

4

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan

Single Nucleotide Polymorphism (SNP) yang ditemukan pada gen Myf5 sebanyak dua buah bersifat polimorfik yaitu SNP c.1172T>A dan c.1205G>A. Kedua SNP tersebut tidak berasosiasi dengan sifat pertumbuhan dan perdagingan. Pada gen MSTN ditemukan 20 SNP yang bersifat polimorfik di promoter diantaranya 7 SNP berada di CpG island pada sapi bali di BPTU-HMT Provinsi Bali. Diperoleh 2 SNP yang berasosiasi nyata terhadap sifat perdagingan (PIMF) yaitu SNP pada posisi g.-7799T>C dan g.-7941C>T yang dapat digunakan sebagai kandidat untuk marka genetik sifat perdagingan pada sapi bali.

Saran Single Nucleotide Polymorphism (SNP) yang nyata pengaruhnya terhadap sifat perdagingan (PIMF) perlu dilakukan validasi melalui analisis ekspresi gen (qPCR) pada sapi bali dan diperlukan sampel populasi sapi bali di luar wilayah pulau Bali. Evaluasi hasil USG dengan kualitas karkas sapi bali perlu dilakukan untuk mengetahui korelasi pengukuran hasil USG dengan pengukuran langsung.

DAFTAR PUSTAKA Allen DL, M Du. 2008. Comparative functional analysis of the cow and mouse myostatin genes reveals novel regulatory elements in their upstream promoter regions. Compar Biochem and Physi. 150:432–439. Allendrof FW, G Luikart, SN Aitken. 2013. Conservation and the Genetics of Populations. 2nd Ed. Wiley-Blackwell Publishing. Chicester. UK. Amalianingsih TI. B Brahmantiyo, Jakaria. 2014. The variability of growth hormone gene associated with ultrasound imaging of longissimus dorsi muscle and perirenal fat in rabbits. Media Petern. 37(1):1-7. Arnold H, M A Della-Fera CA Baile. 2001. Review of myostatin history. physiology and applications. The Univ. of Georgia. CAES. Dept. of Animal & Dairy Sci. 2001/2002 Annual Report: 1-12. Badan Pusat Statistik. 2012. Pendataan Sapi Potong, Sapi Perah dan Kerbau 2011 (PSPK 2011). Jakarta (ID); Badan Pusat Statistik. Bappeda dan Penanaman Modal Pemerintah Kabupaten Jembrana. 2011. Profil Kabupaten Jembrana Tahun 2011. Bellinge RHS, DA Liberies, SPA Laschi, PA O’brien, GK Tay. 2005. Myostatin and its implications on animal breeding: a review. Anim Genet 36:1-6. Bentzinger CF, YX Wang, MA Rudnicki. 2012. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4(a008342):116.

26

Bhuiyan MSA, NK Kim, YM Cho, D Yoon, KS Kim, JT Jeon, JH Lee. 2009. Identification of snps in myoD gene family and their associations with carcass traits in cattle. J Livesto Sci. 126:292–297. Braun T, M Gautel. 2011. Transcriptional mechanisms regulating skeletal muscle differentiation growth and homeostasis. Nature. 12:349-361. Braun T, Rudnicki MA, Arnold HH, Jaenisch R. 1992. Targeted inactivation of the muscle regulatory gene myf-5 results in abnormal rib development and perinatal death. Cell. 71(3):369-82. [BSN] Badan Standarisasi Nasional. 2015. Bibit Sapi potong. Bagian 4: Bali. SNI 7651.4:2015. Jakarta (ID): Badan Standarisasi Nasional. Carninci P, A Sandelin, B Lenhard, S Katayama, K Shimokawa, J Ponjavic, CA Semple, MS Taylor, PG Engstrom, MC Frith. 2006. Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution. Nat Genet. 38:626–635. Chung R, WT Kim. 2005. Association of snp marker in igf-I and myf5 candidate genes with growth traits in lorean cattle. AJAS. 18(8):1061-1065. Coles CA, Wadeson J, Leyton CP, Siddle JP, Greenwood PL, White JD, McDonagh MB. 2015. Proliferation rates of bovine primary muscle cells relate to liveweight and carcase weight in cattle. Plosone. 10(4):1-14. Deaton AM, A Bird. 2011. CpG island and the regulation of transcription. Genes Dev. 25:1010-1022. Deaton AVW, G Rouse. 2000. USOFT: An ultrasound image analysis software for beef quality research. Beef research report. A.S. Leaflet R1437. Iowa (USA): Iowa University. Doherty R, O’ Farrelly C, Meade KG. 2014. Comparative epigenetics: relevance to the regulation of production and health traits in cattle. Anim Genet. 45(1):3–14. Francetic T, Li Q. 2011. Skeletal myogenesis and myf5 activation. Transcription. 2(3):109-114. Gerbens F, de koning DJ, Harders FL, Meuwissen THE, Janss LLG, Groenen MAM, Veerkamp JH, Van Arendonk JAM, Te Pas MF. 2000. The effect of adipocyte and heart fatty acid-binding protein genes on intramuscular fat and backfat content in Meishan crossbred pigs. J Anim Sci. 78:552-559. Ghatak S, Muthukumaran RB, Nachimuthu SK. 2013. A simple method of genomic dna extraction from human sample for pcr-rflp analysis. J Biomol Technique. 24:224-231. Gunawan A, Jakaria. 2011. Genetic and non-genetics effect on birth, weaning, and yearling weight of bali cattle. Media Petern. 34(2):93-98. Guo B, Greenwood PL, Café LM, Zhou G, Zhang W, Dalrymple BO. 2015. Transcriptome analysis of cattle muscle identifies potential markers for skeletal muscle growth rate and major cell types. BMC Genomics. 16 (177): 1-16. Hafid H, Rugayah N. 2009. Persentase karkas sapi bali pada berbagai berat badan dan lama pemuasaan sebelum pemotongan. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Waktu dan tempat tidak diketahui. [internet]. [waktu dan tempat pertemuan tidak diketahui]. [diunduh 2015 Agus 20] Dapat diakses pada: http://peternakan.litbang.pertanian.go.id /fullteks/semnas/pro09-13.pdf?secure:1

27

Hall TA. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for windows 95/98/NT. Nucl Acids Symp. Ser. 41: 95-98. Han SH, Cho IC, Ko MS, Kim EY, Park SP, Lee SS, Oh HS. 2012. A promoter polymorphism of mstn g.2371T>A and its associations with carcass traits in Korean cattle. Mol Bil Rep. 39:3767-3772. Hardiwirawan E, Subandriyo. 2004. Potensi keragaman sumberdaya genetik sapi bali. Wartazoa.14(3):50-60. Hardjosubroto. 1994. Aplikasi Pemuliabiakan Ternak di Lapangan. Jakarta (ID): Gramedia Widiasarana Indonesia. He YL, YH Wu, FS Quan, YG Liu, Y Zhang. 2013. Comparative analysis of myostatin gene and promoter sequences of qinchuan and red angus cattle. Genet Mo. Res. 12 (3):3398-3406. Illingworth RS, Gruenewald-Schneider U, Webb S, Kerr ARW, James KD, Turner DJ, Smith C, Harrison DJ, Andrews R, Bird AP. 2010. Orphan cpg islands identify numerous conserved promoters in the mammalian genome. PLoS Genet. 6(9):1-15. Jones PA, Takai D. 2001. The role of dna methylation in mammalian epigenetics. AAS. 293:1068-1070. Jung JH, KS Shima, CS Na, HS Choe. 2015. Studies on intramuscular fat percentage in live swine using real - time ultrasound to determine pork quality. AJAS. 28(3):318-322. Lambe NR, Heresign W, Macfarlaine J, Richardson RI, Matika O, Bunger L. 2010. The effect of conditioning periode on loin muscle tenderness in crossbred lambs with or without the texel qtl (TM-QTL). Meat Sci. 85(4):715-720. Langley B, Thomas M, Bishop A, Sharma M, Gilmour S, Kambadur R. 2002. Myostatin inhibits myoblast differentiation by down-regulating MyoD expression. J Biol Chem. 277:49831–49840. Lee SJ, McPherron A. 2001. Regulation of myostatin activity and muscle growth. PNAS. 98(16):9306–9311. Li C, Basarab J, Snelling WM, Benkel B, Murdoch B, Hansen C, Moore SS. 2004. Assessment of positional candidate genes myf5 and igf-1 for growth on bovine chromosome 5 in commercial of bos taurus. J Anim Sci. 82:1-7. Li N, Yang Q, Ryan GW, Thomas B, Min D, Buel DR. 2015. Myostatin attenuation in vivo reduces adiposity, but activates adipogenesis. Endocrinology. 157(1):1-10. Martojo H. 2012. Indigenous bali cattle is most suitable for sustainable small farming in indonesia. Reprod Dom Anim. 47(1):10–14. Miar Y, Plastow GS, Bruce HL, Moore SS, Durunna ON, Nkrumah JD, Wang Z. 2014. Estimation of genetic and phenotypic parameters for ultrasound and carcass merit traits in crossbred beef cattle. Can J Anim Sci. 94:273-280. Miyake M, Hayashi S, Taketa Y, Iwasaki S, Watanabe K, Ohwada S, Aso H, Yamaguchi T. 2010. Myostatin down-regulates the igf-2 expression via alksmad signaling during myogenesis in cattle. J Anim Sci. 81:223 –229. Muroya S, Watanabe K, Hayashi S, Miyake M, Konashi S, Sato Y, Takahashi M, Kawahata S, Yoshikawa YY, Aso H, Chikuni K, Yamaguchi T. 2009. Muscle type-specific effect of myostatin deficiency on myogenic regulatory

28

factor expression in adult double-muscled japanese shorthorn cattle. J Anim Sci. 80: 678–685. Nassiry MR, Javanmard A, Tohidi R. 2009. Application of tatistiscal procedures for analysis of genetic diversity in domestic animal populations. American J Anim Vet Sci. 4(4):136-141. Nei M, S Kumar. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York (US): Oxford Univ Pr. Newcom DW, Bass TJ, Schwab CR, Stalder KJ. 2004. Relationship between backfat depth and its individual layers and intramuscular fat percentage in swine. Animal Industry Report: AS 650. ASL R1944. Iowa (USA): Iowa University. Noor R. 2010. Genetika Ternak. Jakarta (ID): Penebar swadaya. Ott MO, Bober E, Lyons G, Aarnold H, Margaret B. 1991. Early expression of the myogenic regulatory gene myf-5. in precursor cells of skeletal muscle in the mouse embryo. Development. 111:1097-1107. Patmawati NW, Trinayani NW, Siswanto M, Wandia IN, Puja IK. 2013.Seleksi awal pejantan sapi Bali berbasis uji perforans. JIKH. (1):29-33. Purwantara B, Noor RR, Anderson G, Rodriguez-Martinez H. 2012. Banteng and bali cattle in Indonesia: status and forecasts. Reprod Dom Anim. 47(1):2-6. Putri R, Priyanto R, Gunawan A, Jakaria. 2015. Association of calpastatin (CAST) gene with growth traits and carcass characteristics in bali cattle. Med Pet. 38(3):145-149 Rachma S, Harada H. 2010. The estimation of carcass traits of bali bulls using ultrasound. JITAA. 35(1):55-62. Rios R, Carneiro I, Arce VM, Devesa J. 2002. Myostatin is an inhibitor of myogenic differentiation. American J Physi. 282:C993–C999. Robakowska-Hyzorek D, Oprza J, Zelazowska B, Olbromski R, Zwierzchowski L. 2010. Effect of the g.–723G/T polymorphism in the bovine myogenic factor 5 (myf5) gene promoter region on gene transcript level in the longissimus dorsi muscle and on meat traits of Polish Holstein-Friesian cattle. Biochem Genet. 48:450–464. Santagostino M, Khoriauli L, Gamba R, Bonuglia M, Klipstein O, Piras FM, Vella F, Russo A, Badiale C, Mazzagatti A, Raimondi E, Solomon G, Nergadze, Giulotto E. 2015. Genome-wide evolutionary and functional analysis of the equine repetitive element 1: an insertion in the myostatin promoter affects gene expression. BMC Genet . 16(126):1-16. Sarti FM, Lasagna E, Ceccobelli S, di Lorenzo P, Filippini F, Sbarra F, Giontella A. 2014. Influence of single nucleotide polymorphism in myostatin and myogenic factor 5 muscle growth-related genes on the performance traits of Marchigiana beef cattle. J Anim Sci. 92:3804-3810. SAS Institute Inc. 2008. SAS/STAT® 9.2 User’s Guide The GLM Procedure (Book Excerpt). Carolina (US): SAS Institute Inc. SAS Campus Drive. Sellner EM, Kim JW, Clure Mc, Taylor KH, Schnabel RD, Taylor JF. 2007. Board-invited review: applications of genomic information in livestock. J Anim Sci. 85:3148-3158. Seong J, Oh JD, Cheong C, Lee KW, Lee HK, Suh DS, Jeon GJ, Park KD, Kong HS. 2011. Association between polymorphisms of myf5 and pou1f1 genes

29

with growth and carcass traits in hanwoo (korean cattle). Genes Genom. 33:425-430. Shibata M, Matsumoto K, Aikawa K, Muramoto T, Fujimura S, Kadowaki M. 2006. Gene expression of myostatin during development and regeneration skeletal muscle in japanese black cattle. J Anim Sci. 84:2983–2989. Silva SL, Tarouco JU, Ferraz JBS, da C Gomes R, Leme PR, Navajas EA. 2012. Prediction of retail beef yield. trim fat and proportion of high-valued cuts in Nellore cattle using ultrasound live measurements. R Bras Zootec. 41(9):2025-2031. Sun WX, Dodson V, Jiang ZH, Yu SG, Chu WW, Chen J. 2016. Myostatin inhibits porcine preadipocyte differentiation in vitro. Domes Anim Endoc. 55: 25-31. Supriyantono A, Irianti BW. 2007. Peningkatan Mutu Genetik Sapi Bali Melalui Pengembangan Program Pemuliaan. J Prot UMM. (1):17-23. Tajbakhsh S, Rocancourt D, Buckingham M. 1996. Muscle progenitor cell falling to respond to positional cues adopt non-my ogenic fates in myf-5 nullmice. Nature. 384(21):266-270. Talib C, Siregar AR, Budiarti-Turner S, Diwyanto K. 2003. Strategies to improve bali cattle in eastern indonesia. Aciar Proceedings. Di dalam: K Entwistle. DR Lindsay. Implementation of a Breeding Program for Bali Cattle Technical issues at national and regional levels. 2002 Feb 4–7; Bali Indonesia. Canberra (AU): ACIAR. Hlm 82-85. Talib C. 2002. Sapi bali di daerah sumber bibit dan peluang pengembangannya. Wartazoa. 12(3):100-107. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood. evolutionary distance. and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol 28(10):2731–2739. Taylor WE, Bhasin S, Artaza J, Byhower F, Azam M, Jr Willard DH, Jr Cull FC, Gonzalez-Cadavid N. 2001. Myostatin inhibits cell proliferation and protein synthesis in C2C12 muscle cells. Am J Physiol Endo Metab. 280:E221– E228 . Thomas M, Langley B, Berry C, Sharma M, Kirk S, Bass J, Kambadur R . 2000. Myostatin. a negative regulator of muscle growth. functions by inhibiting myoblast proliferation. Bio Chem. 275 (51):40235–40243. Ujan JA, Zan LS, Ujan SA, Adoligbe C, Wang HB. 2011. Back fat thickness and meat tenderness are associated with a 526 T>A mutation in the exon 1 promoter region of the myf-5 gene in chinese bos taurus. GMR. 10(4):30703079. Ulum MF, Suprapto E, Jakaria. 2014. Citra ultrasonografi otot punggung (longisimus dorsi) pada sapi bali. Proceeding. Konverensi Ilmiah Veteriner Nasional ke-13 Perhimpunan Dokter Hewan Indonesia (PDHI), 2014 Nov 23-26, Padang (ID): KIVNAS PDHI XIII. Hlm 368-369. USDA. 2014. Carcass Beef Grades and Standards. [intenet] diakses tanggal 2016 Mei 20. Dapat diakses pada: https://www.ams.usda.gov/gradesstandards/carcass-beef-grades-and-standards Van Werf J, Kinghorn B. 2003. Strategies To Improve Bali Cattle In Eastern Indonesia. Aciar Proceeding. Di dalam: K Entwistle. DR Lindsay.

30

Molecular Genetics and Their Place in Breeding Systems; 2002 Feb 4–7; Bali Indonesia. Canberra (AU): ACIAR. Hlm 34-40. Viljoen GJ, Nel LH, Crowther JR. 2005. Molecular DiagnosticPCR Hanbook. Netherland (EN): Springer. Wiyatna MF. 2007. Perbandingan Indek Perdagingan Sapi-sapi Indonesia (Sapi Bali, Madura, PO) dengan Sapi Australian Commercial Cross (ACC). 7(1):22-25. Xu C, Wu G, Zohar Y, Du SJ. 2003. Analysis of myostatin gene structure. expression and function in zebrafish. J Experimen Bio. 206:4067-4079. Yantika SM, Alamsyari, Evvyernie D, Diapari D, Winaga K. 2016. performance, carcass production, and meat quality of sumba ongole bulls fed ration supplemented velvet bean (mucuna pruriens). Media Petern. 39(1):20-26. Yosita M, Santosa U, Setyowati EY. 2012. Persentase karkas, tebal lemak punggung dan indeks perdagingan sapi bali, peranakan ongole dan australian commercial cross. J Unpad. 1(1): 1-5. Zhang RF, Chen H, Lei1 CZ, Zhang CL, Lan XY, Zhang YD, Zhang HJ, Bao B. Niu H, Wang XZ. 2007. association between polymorphisms of mstn and myf5 genes and growth traits in three chinese cattle breeds. AJAS. 20(12): 1798 – 1804.

31

LAMPIRAN

32

Lampiran 1 Sekuen gen Myogenic Factor 5 (MYF5) berdasarkan genbank kode akses M95684 GenBank= M95684.1 Bos taurus myogenic factor (MYF5) gene. complete cds LOCUS BOVMYF5A 5219 bp DNA linear MAM 30-OCT-1994 DEFINITION Bos taurus myogenic factor (MYF5) gene. complete cds. ACCESSION M95684 VERSION M95684.1 GI=163403 KEYWORDS DNA-binding protein; myogenic factor; transcription factor. SOURCE Bos taurus (cattle) ORGANISM Bos taurus Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Ruminantia; Pecora; Bovidae; Bovinae; Bos. REFERENCE 1 (bases 1 to 5219) AUTHORS Barth.J.L.. Worrell.R.A.. Crawford.J.M.. Morris.J. and Ivarie.R. TITLE Isolation. sequence. and characterization of the bovine myogenic factor-encoding gene myf-5 JOURNAL Gene 127 (2). 185-191 (1993) PUBMED 7684719 COMMENT Original source text= Bos taurus (tissue library= lambda-Dash TM II (Stratagene)) adult liver DNA. FEATURES Location/Qualifiers source 1..5219 /organism="Bos taurus" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon=9913" /tissue_type="liver" /dev_stage="adult" /tissue_lib="lambda-Dash TM II (Stratagene)" regulatory 13..18 /regulatory_class="TATA_box" /gene="MYF5" gene join(39..697.1549..1624.2029..3273) /gene="MYF5" mRNA join(39..697.1549..1624.2029..3273) /gene="MYF5" exon 39..697 /gene="MYF5" /number=1 CDS join(197..697.1549..1624.2029..2219) /gene="MYF5" /codon_start=1 /product="myogenic factor" /protein_id="AAA51415.1" /db_xref="GI=163404" /translation="MDMMDGCQFSPSEYFYDGSCIPSPDGEFGDEFEPRVAAFGAHKA DLQGSDEDEHVRAPTGHHQAGHCLMWACKACKRKSTTMDRRKAATMRERRRLKKVNQA

33

FDTLKRCTTTNPNQRLPKVEILRNAIRYIESLQELLREQVENYYSLPGQSCSEPTSPT SSCSDGMPECNSPIWSRKSSSFDSVYCPDVPNVYATDKSSLSSLDCLSSIVDRITNSE QPGLPLQDPASLSPVASTDSQPATPGASSSRLIYHVL" intron exon intron exon regulatory regulatory regulatory regulatory

698..1548 /gene="MYF5" /number=1 1549..1624 /gene="MYF5" /number=2 1625..2028 /gene="MYF5" /number=2 2029..3273 /gene="MYF5" /number=3 2305..2310 /regulatory_class="polyA_signal_sequence" /gene="MYF5" 2800..2805 /regulatory_class="polyA_signal_sequence" /gene="MYF5" 3256..3261 /regulatory_class="polyA_signal_sequence" /gene="MYF5" 4207..4212 /regulatory_class="polyA_signal_sequence" /gene="MYF5"

ORIGIN 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221

cccccaagaa tgcccttgtt cagcggcgcc tgcctctctg ctacgacggc agtggctgct gcgagcaccc caaaaggaag cctgaagaag ccagaggctg ggagctgctt gcccaccagc taggaccttc agatattcag atctagatga acaggatttt cttgagatag agtgtatact tccactgtcc cccctactct ctccaacgct agtgtggctt gaattccact cagtgccctt gagtggtcag ttgccaagac agccctatct aatggtaaga ctatcaaagt gggggttttg catccatgca cactccccaa tctgtgacca aagcaaggat ataaaagctc cagagcaacc attctcaacc ctaaaaatct

tatataaaga aattaccaga aggctccggt cagacgatgg tcctgcatcc ttcggggctc acgggccacc tccaccacca gtcaaccagg cccaaggtgg agggaacagg cccacctcaa ccaactttta tggttactgg gaagagagat gtccagactt ctggctgtga accagtggac cacggtttgt gctgatgcct gccaggtttt ccttctactc ctcttctttc gcaattggtg tttatggagc ctgaaaacaa ggtccagaaa accaatgact agagtctgtt gcagggcaaa tatacacaca cttcatcccc cctgaccttt tttttttttt cttatccagc tggattgcct tgcaactcca agatcagttc

gccccagccc gacaccgacc ttctccccta acatgatgga catcccccga acaaggcaga accaggccgg tggatcggcg ctttcgacac agatcctcag tggaaaacta gttgctctga caaaaatcct tggatagttg gccacattta cctacctact atgatcagtc cttgacatac aactgaaggg ggctgaaaga aatgtgtttc caatccattt tgctgcctct aggctagccc tggtgggcaa acgccttctt gagcagcagt tcagaggagt cttccatgca ataaacacac gacgtgagct atgaattgct gggtttcaaa tttaatggtt ttggattgct ctccaggatc ggggcctcta tgccagaagg

cagcgcggca agggagctcg tctatctctc cggctgccag cggtgagttc cctgcaaggc ccactgcctc gaaggcggcc gctcaagcgg gaatgccatc ctatagcctg tggcatggta tacatctcat gctattgggg gacagatgcc ctaggtgcac agatgtttct actaacatct agaaacaaag tgttcatgca tgccttggga tgcatggtta ctcctcttct ttcctaaatc gcactgcctc ctgtgtcttt tttgacagcg ttaaagacca gtactgggaa atcttctact tttgcttgaa agatatttgt ggtggtgacc ttctccttgt tatccagcat cagcctctct gttccaggct cctattacac

gacccaggcc gcccgggatt tgctgtccag ttctcgccct ggggacgagt tcagacgagg atgtgggcct accatgcgcg tgcaccacga cgctacattg ccggggcaga agagatggct ttagaccagg ggcggggtgg agcacacaga actgaaggag ccattactca aaaggcaact aaatgcctgc ttcttttcag aagtgttctc acccagtgta ccaagcacag aaggcaataa acccgagatt tattatagcc tctactgtcc gttcaacttc gagaacagaa caaaatcctc atattaccca tgcaaatttc tgcagtttaa gtccttagta agtggatcgg ctccccagtt catctatcat aggaggaagg

gccaggcgtc tccctgccct gcccacccct ctgagtactt ttgagccgcg acgagcacgt gcaaagcatg agcggagacg ccaaccctaa agagtctgca gctgctctga ctgtacctgc tgtagcaacc ggctcaccac cagctgttga caggttgtca gtttatttcc gtctgaggcc atggccccag agggcgtttg tctctgaatt cactgctgct agattgacct aggtgattga ggagcacctt tgaatgtaac tgatgtacca agaatttagc tggtatttat ctaacagata ggtgcttctc taccaggctt gcggccgaat tatgccacgg atcaccaact gccagcaccg gtgctatgaa aggtaccaaa

34

2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 4201 4261 4321 4381 4441 4501 4561 4621 4681 4741 4801 4861 4921 4981 5041 5101 5161

aaccccaaag gttatcttgc ctttttttct ttataggggc atattgctta aatagatgta taatcttttg tttaacattt gatttcaaga aaatattctg atggtgtctt atagcatctc ctacttcaag gtaccatata aacagatttt tagaaatcat tatattaata gtgctggcat tcttcctttt tgcatgatgg gaaaatacaa tttattacct atctctatga gtttgcagtt gtactgttct tcaccagagt ttcaaaaaat acttttagca tagaaagaat gattcacttc ctagtagaac cacatgacca caagtgaata tctcagttaa agatggtgat ctcatttcca cacacatcac aatccagacc gtgatagtga gtgaacaggt ccactgacag attgggaggg gaaatgcaag ggaaattggg tcctattttt ccctaaattc tatttgaggt gtggtatttc caaatggcaa

caagacaacc cactttataa tcttttcctt cgttcatcaa tcaaaatatt aatcagttat atttatattg cttataagaa tataagagat gtttatgatt taaggtgggg gcggactcag catatttcaa acataaagtt taaacaaaaa gagttaaggt ttgtcaataa aagaaaattt cacagccttt acatgtacct caattaagtg ttgagagaga gcagataaag acgtgtaatc cagggaggtt taaaagaata actgtagcca cacagataag ccaagagggc tgttaaacag tagaaaaaaa tattgttgca aaaattaatt tataataatg caatgtatga gtggactaat atccagtcat cagaaaaatc caaaatattc gggctgccac tcaatttata ggttctctgg ttcactgggc aagtactatt tttttcatct ttcattaagg tacaacagtt tgggaatggt agtatccctg

tgtaaataaa gaaagtgtat catctttgct aggtagtttg acctctgatg agggagtttt tgttaagtaa atacattttt ttttggaaac ttgttaaaag ctgaaagtac tttaggtcct aggtgtctgc gtgtgtatgt gaatgtacaa gatatatatc aatatttaaa acacaatgta tttattttat ttttgtttat gaaaattagg tgaaaaggaa ataattgtct atcagccaaa tgcccttatt gacattattc ctgtcactct tctttcttta attataaaga tgtctcttac ggaactatct ttttaaaaaa ttactaccaa cctcaaagta ttaaagacaa ggtgaaggct ataaactttt ttcccttctc aagtaaggac taagactaca ggaaaacaag aaatgagagt ctacataggt tggaagcaag gaaaaatgca tggcattcct actagattaa attagagtac aaaatatcac

catttctttt ttaaaaagtc ttagatatat ttgcaatgct tttagtgctt aaatatattt aatataacaa aatctaagca tccaccataa aaccccctaa tgaaacagtg gttggtgtca taactaaaat ggagcaaaag tattacatca tattttccca ggtattgagt tagtaaagtg taattatatt cacttaaaaa tagtcaatca atatcattga tctcctctaa gcatatgagc tttgatatgc cataaagaaa gttagcagca tccatgattt ttcacatata ttctatgaag aaagactttt gtaagcagaa accccagttg tttagttttt tactttccat ggtatctgct tgacaggggc cacaaagtag aggattttgc tcacatccac gaaaacattc caaaagagat acataggaaa ctgttatata agtcagataa aatctgagag tgaagtaatt agctatttgt cactgaatat

ctgttgtaaa attattgcaa agttccaatg taacttatat ttttttcttt aactgtcttg tactgcctaa caaaatagta ataaaattgt tggaattggc ggttttgaag cagatgaaaa ttttctttta tagaaggtat ttataatatc aaaatacctt tgttttttcc aagcagactc ttatgattct tctcctttag ttggaagaat agcatctgag tcggttcaaa tctgctggag tttttctcct aggagagaag tgccctgata gataatgtga atttcaactt aaattggaag ttttaagttc aagctatgta cttgcaaatg cagtgctctg gatagctttg cagtaaacag ctttgggagt gggagaagag catcttacaa ctccattggt cctttcccat tcctttctcc actgagtcca gatcaaggtg aattattggc tggtatttcc caattctctg aacttcagaa tcccacactg

tttgtaaata tttatacttt atattatttc atttttataa aaaacattag cttttctctt tggtatatat ctttgtggat ttaagtgagg agtcactgat ataaatctga taccacattt tcttaatgtt tcaggacaat tatagtacat gatacattag tatcactaaa taaattactt gtgttgtgtg aaattgagat tctcacaaga ttggttgttc atttctaagg tttggcagtt gctcgtccag acaggatggg cgggatgctg ggatttgaag cagtttgagt tttgttgttc aattttaaaa atttttaatt tacttgatat gattcagtac cttaattaat ctcagcacaa ttgttacagt cagagaaaca attccttgga ggaaaacatg ttgtagtctg ttatgcctat gtgaggttat tcttgattgc tctattatgg tgaaattctc actttcagag aagccctgct tcacaaaaa

Lampiran 2 Sekuen gen Myostatin (MSTN) berdasarkan genbank AF348479.1 GenBank= AF348479.1 Bos taurus myostatin gene. partial cds LOCUS 10492 bp DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM

AF348479 DNA linear MAM 10-APR-2001 Bos taurus myostatin gene. partial cds. AF348479 AF348479.1 GI=13569587 . Bos taurus (cattle) Bos taurus Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Ruminantia; Pecora; Bovidae; Bovinae; Bos.

35

REFERENCE 1 (bases 1 to 10492) AUTHORS Sharma.M.. Jeanplong.F.. Bass.J. and Kambadur.R. TITLE Bovine Myostatin promoter and repressor sequence JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 10492) AUTHORS Sharma.M.. Jeanplong.F.. Bass.J. and Kambadur.R. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (11-FEB-2001) Animal Genomics. AgResearch. East Street. Hamilton. Waikato 2001. New Zealand FEATURES Location/Qualifiers source 1..10492 /organism="Bos taurus" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon=9913" mRNA <10403..>10492 /product="myostatin" CDS 10403..>10492 /codon_start=1 /product="myostatin" /protein_id="AAK31160.1" /db_xref="GI=13569588" /translation="MQKLQISVYIYLFMLIVAGPVDLNENSEQK" ORIGIN 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581

gaattcttct tttttttaag aaaaatttta ttaccaaaga tttgtttact agatctgttt ctaaagtaaa ttacactcag ccaatgtata tgtgggttta tgctgctgct accaggctcc cttctccaat agtgacccca gtactggagt tatatcagag caaaaagaaa aacaacagtc aataaagaaa aaaacaattt gaagccaact acactgtatt atgatccaga tacttacaaa gggggagggt taactaatat ttatgggaat cttgccttgc tcctctttgg ttggcagtct agctacagag tgagtcccat tgctgggact gagccactca agtataccta atttatcggt ttcagttcag tccctgtcta ccatccagcc atcagagtct gagtctagtc ttctttgtat agaaatcaca tgggatatta

atggctatca ggtttaaaaa agaaaaattt tccccccaga ggaaggctta ttgtcagttc ctgaactatc ttttttctca gctgcaagca gaccagaagt aagtcacttc cccgtccctg gcatgaaagt tggactgcag ggggtgccat aatctgaaac attcaagtcc aatgatttgg tgtttgagcc ttttgagaac tgattatagt tttatacact atatgcaata agggaaatag aaactgggag gaacctactg agaatccaaa ctaaacacac ctacttttga taagtagtgt tctctctgtg gcatgctctc ctctactggg gaaagcctgt ccaaaaaatc tcagttatca tcgctcagtc tcaccaactc atctcatcct tttccaatga tcttttttca tacaagtgta ttttgcagct ttatgacacg

ccatgtccaa atttaaaaat tttttaatct acaaaacccc ttaactcaat aatctatatt atgaagaaaa tttgtaaatt ggaattttat aaggatgtgg agtcgtgtcc ggattctcca gaaaagtgaa cctaccaggc tgccttctcc tccctacagg agtaaaaagg gcaaaggact tggttctcaa tcatagataa aaacaaattc gtataaatga tgcaccaaaa agtcacagat ataggaattg tatagcgcac aagagcagat acagacacac ctcagtttga cagagcaagc cagtcataga acagaactga gtgagcaaga aaatataaac agaaagttga gtaaacacat gtgtctcttt ccggcgttca ctgtcgtccc gtcaactctt atggagaaga taattaatac ttcctgaact ttgccataat

aacactacct ttttaaatta gcagaaacat aagaattgca aataagggag gtcatctgct tcagccatca taaaaaattt gccttcttaa gtgcagcaaa gactctgtgt ggcaagaaca agtgaagtcg ttctccgtcc atgacagccc ctatcttgct gctaaaatag taagtagcta tgcttgaata aagtcaaatc agctgtaaac agacactgaa actaagtttt gtagaaaaca acacatacac agaactctac atgtgtatat acagacacat cctagatagg acagtcactc tcactgagtg gagaggaggc gggaacccaa ataacaacac acttttttgt ttgggaactg gcgactccat ctcagactta cttctcctcc ctcacgaggt agaggaaacc actggagttt aatacaaaga atgaatgtca

gagtaaagaa aatttaaaat actctgtatt agattttctc agtaaagact ctggaaaccc aaatagtgaa aacttcatta tccagagagg tatgacagcc gaccccagag ctggagtggg ctcagtcgtg atgggatttt aactagagac atatgtgcat tgaatcacag tgcttatttg ataagattcc tatcacttta atttttttat gatgtaaagt ttaaatgata tacagttacc tctactatat ccaatactct gtataaactg ccattttgag acctgtgctg cctagcaagg caaaagtcca aaggacacag tagaaatgct attatgaata attcaaggga taaaaatcta gaatcgcagc cgtccatcga tgcccccaat ggccaaagta aaattataac ccatttcaga aatgcagaag tcatctcaag

ggagtcattt tgaaatctaa gagtctatgg ttgggaagtg tcaaaactaa tgagcttgtt aacgaacctc agtctgggga tgggcaatgg caactgctgc acggcagccc ttgccatttc tccgaccctc ccaggcaaga tgctataact tcaacatgaa acttttgcca ctattagtag ttttcaagga gatgtcactt aacactgtag ggtgacctgg caaatgaact tagggggacg atacactagg gtaatgacat attcacaccc atttctttcc ggtaagggct tcttattact gtgcaatgtt gaccctccag gcgaaccaca tataagtata acagtcattc atcagttcag acgccaggcc gtcagtgatg ccctcccagc ccaagtcttt ttaattttta aaggaagaag ttttgttaac actgacctga

36

2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 4201 4261 4321 4381 4441 4501 4561 4621 4681 4741 4801 4861 4921 4981 5041 5101 5161 5221 5281 5341 5401 5461 5521 5581 5641 5701 5761 5821 5881 5941 6001 6061 6121 6181 6241 6301 6361 6421 6481 6541 6601 6661 6721 6781 6841 6901 6961 7021

aaaccaaaat tccagaccag gaacctgtaa caataattat tcattaaaac tcaattgaag agtgaagacc ttccttgcta atgtaacatc taacatttct caaaagcttt tttgagaatt ccactctata aagacagtga atttgttgtt caacatgcca tgagtcactg tattttcata aagtaccaac catgcatatc agtacacatt tccaagggtc atctgactta ctctgttcct tctgtaatct atgctgttat agtgttatat tctttctctc ttcagttcag cagcaagcca atcgagtcag ccaatccctc aagtactgga ttcagaatgg caccacagtt catccataca gtaatgtctc aagcatcttt ataaagtctt cggatgccat ctttcacttt catctgcata cttccagccc atatacagtc ttctaactgt tcaggtggtc aaaggctttg ttcgatgatc agcttgaaca gagcattact ggcataccag attagaagtg tgtatattgt ctggaagaag gcagatgaca gtgaaagtgg gcatccggtc tttatttttc tgcttactcc attactttgc ggatgtgaga tggtgttgga ctgaaggaga tactttggcc attgggggca tcaatggacg gctttgattc ttactagcat ttaataacat atatgcttta tttgtaagac gccccctgag actggactcc ctcatcctag

aaaaaaaaaa atttcagtct gttagtagtt gtatcagtta aaagttacaa cagtataaaa cttttagaca ttctcatttt atcattactc catttttaat tcaggatcct actgttttag tggaagaatc ctgtttctgt gttcagctgc ggtttctctg ataccatcca aaataataag tcgcgtccaa caaggttccc tagtgaaaaa cacagtacac ctcaaggtca atactgttac attgagatca gtgaattgag caaagggcta ttttcccaca ttcagttcag ggcctccctg tgatgccatc ccagcatcag gtttcagctt actggttgga caaaagcatc tgaccacagg tgcttttcaa taatttcatg gacactgttt gatcttagtt catcaagagg tctgaggtta agtgtttctc ttgacatcct tgcttcctga aggaacatct gcatagtcaa cagcagatgt tcaggaagtt ttactagcat accaccggat gacatggaac caccctgttt cacaagctgg ccacccttat agagtgaaaa ccatcacttc tgggctccaa ttggaaggaa taacaaaggt gttggactgt gaagactctt tcagccctgg acctcatgtg ggaggagaag tgagtctgtg atggggtcac gtgtctcctc ttgggagctt tactctcaat agttgagaga tacaaagaag tgtgagaaga caacaaagtc

agagagagag accacttgag ggtaattata aaaagtatac atattaagat tgcattactc atctgtggag ctcttacgta tgtcagcaaa ttataattca gaataacttt gggatacacc tagaagattg ctgctttctc taagtcatct ctttcactat acgatctcat tgaattaata gttgaaaatc catctgagga tgtgcatata acacacatgc cataaaacgt tccctgagtc cagataatca cactatccag tcatcacaag acagactcga tccttcagtc gtccatcacc tagccatctc agtcttttcc tagcatcatt tctccttgca aattcttcgg aaaaaccata tatgctatct gctgcagtca ccactgtttc ttctgaatgt cttttgagtt ttaatatttc atgatgtact ccttttccta cctgcataca ctttcagaat taaagcagaa tggcaatttg catggttcac tacttttcac ctgcctcttg aacagactgg atttaacttc aatcaagatt ggcagaaagt agttggctta atgggaaata aatcactaca agttatgacc ccatctagtc gaagaaagct gagagtccct gatttctttg aagagctgac ggggcgacag tgaactctgg aaagagtcgg ctttttttgc ccagaatgca gttgttttga agtttgcttg aacaggggga aactgctttc ctgtccgaag

agagagagag ctgacaaaca aaacaataaa attgtctaaa gagaggactt tggggcaaag taagaactgt tatagtcgag tagaatacat ttaaatattg tcagagtaaa tcaagtgaaa aacctataat ctcagaattt ctgacttttt ctcctggagt cctctataag cagctgaaac cacatataat ttcaaccaac agtggaccca atacatgcat cagcgagaaa aagggtactt gatgttgcca tttgtttctg gaaatggcaa atttttcatg atgtccaact aactcccaga atcctctgtc aatgagtcaa ccttccaaag gtccaaggga cgctcagctt gccttgacta aggttggtca ccatttgtag cccatcttat tgagctttaa cctcttcact tcccggcaat ctgcatagaa tttggaacca ggtttctcaa ttttgacagt atagatgttt atctctggtt gtattgctga aataaactgt agaaatttgc ttccaaatag tatgcagagt tccgggagaa gcagaggaac aatctcaaca gatggggaaa aatggtgact aacctagata aaggctatgg gagtgccgaa tggactgcaa gaaggaatga tcattggaaa aggatgagat gagttggtga acacgactga cacatcatca aacagtgaaa aacgcacacc ctaccttact acgcaaactt aaagaattcc ttaggcccgc

agagaaaaaa ttggccaaat gtatatattt aaatcaccat aaagttagat tgtggtctgg tttcataaca ttttccagaa gtttgcatat atagatatga ggaatcttga gagcacgcct tgaagagtgc agcatgatgc gcaaccccat ttgctccaac acacattata tcaaacagca cttaaggtca ctcagatagt tgcaggtcaa ctctaaatga cccagaacta ttgtttttgt ctgtaggatg gctttaagtg gagtgatcag attcatcctt ctttgccacc gttcacccag gtccccttct cttttcacat aaatcccagg ctctcaagag tcttcacagt gatggacctt taactttcct tgattttgga ttcccatgca gccaactttt ttctgccata cttgattcca gttaaataag gtctgttgtt gaggcaggtc ttattgtgat ttctggaact cctctgcctt agcctggctt ggaaaattct atgcaggtca gaaaaggtgt acatcatgag atatcaataa taaaaagccc ttcagaaaac cagtggaaac gcagccatga gcatattgaa tttttcctgt gaattgatgc ggagatccaa tgctaaagct agactctgat ggctggatgg tggacaggga gcgactgatc aactcctggc ccattaatgt ccctcccctg tatggttaca caggccctgt tgggagaaat agcacccaca

aagaaaaccc gtcctctaca ctgctcctgg atttgatgtc gggaaaatat agatccctgg aagctaagat gttccatgtt gtctatattc cccacataaa gaccaaaagg catcacattt aggctttatg caggcacata gaactgcatg tcatgtccat gacattagaa taggggttac gccttggata gtagtactgc acctgcgttt aagctttgcc tattccagat tcatttttat gcagcctctc taatcagaac ataaaatgca attctaattc ccatgaatct actcacgtcc cttcctgccc gaggtggcca gctgatctcc tcttctccaa ccaactctca tgttggcaaa tccaaggagt gcccagaaaa gtgatgggac tcaatctcct agggtggtgt gcttgtgctt cagggtgaca ccatgtccag aggtggcagg ccacacagtc ctcttgcttt ttctaaaacc ggagaattta gaaagagatg ggaagcaaca tcgtcaaggc aaacgctggg cctcagatat cttgatgaaa gaagatcatg agtgtcagac aattaaaaga aagcagagac ggtcatgtat ttttgaactg ccagtccatt gaaactccag gctgggaggg catcactgac ggcctggcgt tgtctctctc aaacttcaca tttttgggaa ccgcctggtg caaacgtaag gaggaggggc tctctatgca cggcagtgaa

37

7081 7141 7201 7261 7321 7381 7441 7501 7561 7621 7681 7741 7801 7861 7921 7981 8041 8101 8161 8221 8281 8341 8401 8461 8521 8581 8641 8701 8761 8821 8881 8941 9001 9061 9121 9181 9241 9301 9361 9421 9481 9541 9601 9661 9721 9781 9841 9901 9961 10021 10081 10141 10201 10261 10321 10381 10441

ggttcctact actggagaag gacctccgga tcactgccaa gattcccgtc gtgcatttct ttcacaacca gtttttctat tggacaaaat cagtggcatt tttttgatct accgcaccct tgcctaggaa tccctaccgc aaagggtgct agctgggatc tgcttataaa aatgtgcaag gtttccttta ctagagagct catgtggagg actcaagtac tgtattattg ctcattcatt acctgagatc tgctcagaag aaaaataaat aaagactatc tgatgggcaa ttaagaattt gaggcagtaa tgaaccactg cttccccaaa tgctggctat agctaaggtt cattctctgc gagaaactgg tagcacacta ctgtgttcac accactggaa attctatgtt aaacacatcc gtcaattgaa catgagcaat acaagtttct tcttcctgaa aataaaatta agggaaaagc tataattttt aataaagttt ttttaagaag acttgtgaca tcacagatcc cagtataaaa tggcttggcg agattgtatt tatgctgatt

gctggtgaac gaaaacacgt gattggatag catgaataag agcctctggt gttttaaaat aaaggcccta gaggaaaaat atacataaca aagtacactt tctcgaattg tcctccagcc cacagccctt caccaaatgc tgctaagtat ctgtgtgttg agcactgtaa cacgggatcc ttccaggcag agcctatgtc atgaatttaa cagttatcag aattacatgc attacacagt ccaattgcta tgtatagggg ttatcaaaca tgaaatcctt atctaatgca gatgaaaatg attagtgtac cactctcttg agtagtagga atttgtttag gagagtttga tcccagacct caaaggaagt ctgagaagca aatgctccga ggctgaggaa attctaagat tctgagcaat actgaaatac ttaatattaa caaattatag taaatctgta tttttacttc atatcaactt aaagtttcac ttaatttttc tagtcaaatg gacagggttt cgacgacact gattcactgg ttactcaaaa gattttaaaa gttgctggcc

cttgctgctc tcttgaaatt agctgactct tgattcctga cacgtttttg atctttattt ttaactggaa ttttccttca tgaaactgac accttgctgt aaaactctgc ccccggcacc caacactacg acacaaaaat gagggctgaa gaagcctcaa ggattgatta atgaataacg taaggagaaa agtcggtagc ccataatctc tcacttacta ccccaacact ggcaaactga cacaattcta catatgttac aataaaactt cagggcatct ttatgtaagg cattaacttt aatgtgcgaa gggaaaaaag aaaataaatc gtttttaata tccctacaga taccccaaat actaggaggt gaaaaatggg tataatttac aactttgtta caaatagctg attaatctgc aattttcata agtaggattt cagaaaatct ttttctaatt aaatgcttac tttaagtatg atataaagat gcatgtcaca aatcagctca taacctctga tgtctcatca tgtggcaagt gcaaaagaaa ccatgcaaaa cagtggatct

cgaagccata tcttgagtac cattattcac accactgccc ttaaccaatc aatacgtact gccctgaatg gtcctgccac tattatttaa ggaactatga atctattgca accatccttc cttggggggc ataaaaagca acaaggcaga attttccatt tgaagttaag agcactgacc gcgctcacag tggcaattac aaccccctct tatgacaggc ctatgaggaa gatctgaact atcaagttaa aattataaca tataagcctg ggtttgtgtc ccattttttc tcaggctact agtagtgacc taatggatta tcctgtggcc gttcatttga ggccacttca ccctgccagg cgcacagtac cacccttcat agagggtaga cccatcataa acaatatcct aactttagga tgaataaaag tcattatgtg tttactagta atacaagact ttaaatagta aagtgtaaat gaataagatc tacagccttt cccttgactg cagcgagatt aagttggaat tgtctctcag agtaaaagga actgcaaatc gaatgagaac

ggaaggttgc ctcttaattc agtggttatg ctaggggaac aataaataac gctaattctt aagcttacat agccttcttg ctgattttaa tcaacattca cagtagcttt tttccatgac actgtaagca tggtggcata gaattgacta gttctgtgca ataaatctca atgtggaaat ggctgcctta aaactgaagc gcatgaaaca actgtactca gctgaaggtt caggtctatc aagggaaaaa ttacaaagat atctaatact tggttttcct tcaagagatg gagttgcatt taaaaaataa actctcttag tggaaacagc ttagaccttg atttagagaa tgtctgccct taggaagtag gatggtgttc taactacatt aattcactat ctttgtaata taggaagtaa atattattta ttaagaattt tcacagtctt aaaaataatt taaaatcatt taagatttat taagtgtata attattcata taacaaaata cattgtggag ataaaaagcc actgggcagg agaagtaaga tctgtttata agcgagcaga

aaatcccggc attcaatgct ttctacccaa tacaaggtta cttgttttgt caacatttgg aacacacatt cttaaaattg ctgtacagtt tctctagaac cccccatcac agtcatcctg acaggatcac tcgattgcaa ggttgacctc tacgcacaaa gcaagacata gataatcttt caccatttta agttctagtt gagactaagt acaatttaca agagaagtat caactccagg ggatttgatt ttatatgttg gctccgcaac taatctttaa tagatacctc ttagtgcact atatttgata gagtccttag ttctgtttct tggctcccaa caaaaagccc ccggtcaaat aaaaatggac ctttcccttt tttttctttt cttctaagtc aacaatgaaa cttaatacta aaagtaattc attcagggaa ttcatttaag taatataaca ttattttctg tcacttaaat tgttattgtt gatttattcc ctgtttggtg caagagccaa acttggaata cattaacgtt acaagggaaa tttacctatt ag

38

Lampiran 3 Tahapan Desain Primer dengan Primer Designing Tools NCBI 1. Tentukan fragment target dan panjang produk Tentukan fragment target (Promoter CpG island) dan masukkan pada kolom yang disediakan, tentukan berapa produk PCR yang diinginkan kemudian submit “Get Primer”

39

2. Hasil dari Primer Designing Tools NCBI Ditemukan sepuluh primer alternative, pilih primer yang mempunyai suhu tm hamper sama antara primer forward dan reverse, persentase GC lebih dari 50% dan self complementary yang rendah. Hasil dibawah dipilih pasangan primer nomor satu dengan panjang produk 535 bp.

40

3. Cek primer yang dipilih dengan Primer STAT (ww.bioinformatics.org/sms2/pcr_primer_stats.html)

Hasil pengecekan kelayakan primer di primer stat disajikan di bawah ini: Global settings: -The primers do not have a 5'-phosphate group. -Combined concentration of K+ and Na+ in the reaction = 50 millimolar. -Mg+2 concentration in the reaction = 1.5 millimolar. -Primer concentration in the reaction = 200 nanomolar. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------General properties: ------------------Primer name: foward Primer sequence: GAGTCCCATGCATGCTCTCA Sequence length: 20 Base counts: G=4; A=4; T=5; C=7; Other=0; GC content (%): 55.00 Molecular weight (Daltons): 6052.98 nmol/A260: 5.41 micrograms/A260: 32.75 Basic Tm (degrees C): 54 Salt adjusted Tm (degrees C): 49 Nearest neighbor Tm (degrees C): 64.54 PCR suitability tests (Pass / Warning): -----------------------------------Single base runs: Pass Dinucleotide base runs: Pass Length: Pass Percent GC: Pass Tm (Nearest neighbor): Warning: Tm is greater than 58; GC clamp: Pass Self-annealing: Pass Hairpin formation: Pass -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

41

General properties: ------------------Primer name: Primer sequence: Sequence length: Base counts: GC content (%): Molecular weight (Daltons): nmol/A260: micrograms/A260: Basic Tm (degrees C): Salt adjusted Tm (degrees C): Nearest neighbor Tm (degrees C):

reverse GCCAAAGTACCAAGT 15 G=3; A=6; T=2; C=4; Other=0; 46.67 4570.05 6.57 30.01 39 34 52.05

PCR suitability tests (Pass / Warning): -----------------------------------Single base runs: Pass Dinucleotide base runs: Pass Length: Pass Percent GC: Pass Tm (Nearest neighbor): Pass GC clamp: Pass Self-annealing: Pass Hairpin formation: Pass

42

RIWAYAT HIDUP Penulis adalah anak pertama dari tiga bersaudara yang dilahirkan pada tanggal 1 Oktober 1990 di Rembang. Jawa Tengah dari pasangan suami istri Khanif dan Siti Munawaroh. Pendidikan awal penulis adalah Taman Kanak-kanak SEJAHTERA yang dimulai tahun 1995 dan lulus pada tahun 1997. kemudian penulis melanjutkan pendidikan tingkat sekolah dasar yaitu di SD N 1 Kragan dan menyelesaikan studi pada tahun 2003. Pendidikan lanjut menengah pertama dimulai tahun 2003 di SMP N 1 Kragan dan diselesaikan oleh penulis pada tahun 2006. Penulis melanjutkan pendidikan SMA di SMA N 1 Rembang pada tahun 2006-2009. Setelah menyelesaikan pendidikan SMA penulis melanjutkan studi di Institut Pertanian Bogor pada tahun 2009 dan diterima di Fakultas Peternakan Departemen Ilmu Produksi dan teknologi Peternakan melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Selama kuliah di Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor penulis berkesempatan mendapatkan Beasiswa Peningkatan Prestasi Akademik (PPA) dari tahun 2009-2013. Pada tahun 2014 penulis berkesempatan melanjutkan program Magister di sekolah pascarjana Institut Pertanian Bogor. Fakultas Peternakan dengan bantuan beasiswa dari Lembaga Pengelola Dana Pendidikan (LPDP) Kementrian Keuangan Republik Indonesia. Selama studi S2 di IPB. penulis aktif dalam berbagai seminar yang diadakan oleh Fakultas. Program Studi Pascasarjana dan juga dari beberapa organisasi pascasarjanaIPB. Penulis juga tergabung dalam organisasi mahawiswa wirausaha pascasarjana (HIMAWIPA) dan Animal Breeding and Genetics Tudent Community (ABGSci). Karya ilmiah yang berjudul “Polymorphism of Myostatin (MSTN) Promoter Gene and Its Association with Growth and Muscling Traits in Bali Cattle” telah dimasukkan untuk publikasi pada jurnal Media Peternakan.