KAJIAN EFEK SINERGI ANTIMIKROBA METABOLIT BAKTERI ASAM LAKTAT DAN MONOASILGLISEROL MINYAK KELAPA TERHADAP MIKROBA PATOGEN PANGAN
ASRIANI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006
SURAT PERNYATAAN
Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa segala pernyataan dalam disertasi saya yang berjudul
KAJIAN EFEK SINERGI ANTIMIKROBA METABOLIT BAKTERI ASAM LAKTAT DAN MONOASILGLISEROL MINYAK KELAPA TERHADAP MIKROBA PATOGEN PANGAN
adalah karya saya sendiri dengan pembimbingan komisi pembimbing dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal dari atau dikutip dari karya yang diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka.
Bogor, November 2006
Asriani NRP F22601 0051
ABSTRACT ASRIANI, Antimicrobial Synergistic Effect of Metabolite of Lactic Acid Bacteria and Monoacylglycerol of Coconut Oil Mixture on Food Pathogen Microbes. Under the Supervision of: BETTY SRI LAKSMI JENIE, SEDARNAWATI YASNI, and IDWAN SUDIRMAN.
Synergistic effect of two or more kinds of antimicrobial substances usually expressed higher activity than the cumulative given by both or more antimicrobial substances. The organic acid and monolaurin have been reported to show synergism as antimicrobials in food. The lactic acid bacteria (BAL) are known as organic acid producer, mainly lactic acid, while the monoacylglycerol (MAG) of coconut oil known having antimicrobial properties due to its short and medium chains of fatty acids, especially lauric acid. Study on the synergic effect of antimicrobial activity of BAL metabolites and MAG of coconut oil mixture had been conducted using six strains of BAL i.e. Lactobacillus brevis, Lb. acidophilus, Lb. plantarum pi28a, Lb. plantarum sa28k, Lb. plantarum kik and Lb. coryneformis. The aims of the studies were: (1) to obtain BAL which have the highest synergic antimicrobial effect with MAG; (2) to obtain the optimum ratio of BAL and MAG and its MIC (minimum inhibitory concentration) for the test bacteria; (3) to analyze the mechanism of action of BAL-MAG mixture on bacterial cells; (4) to evaluate the stability of the combined BAL-MAG in different pH and heating temperatures and times. The isolates of BAL which have effect synergic with MAG and the optimum ratio of BAL and MAG were conducted by using well diffusion method, while the MIC (minimum inhibitory concentration) for the test bacteria conducted by using contact method. The action mechanism of BAL-MAG on protein and nucleic acid leakages were observed by using Spectrophotometer, K+ and Ca2+ leakages with Atomic Absorbtion Spectrophotometer, and the morphology of cells were observed by using SEM (Scanning Electron Microscope). The evaluation of stability of the combined BAL-MAG of coconut oil were conducted on pH 4, 5, 6, and 7, on room temperature of 80, 100, and 121 o C as long as 10, 20, and 30 minutes by using well diffusion. The application on food system (tofu) were conducted by soaking in 2 and 4 MIC concentrations. Among the BAL studies, Lb. plantarum kik showed the highest synergic effect with MAG against Listeria monocytogenes. The optimum ratio of BAL metabolites MAG mixture were found at 5:3. Combination of Lb. plantarum kik – MAG could inhibit the growth of all bacteria tasted with the highest activity showed against Listeria monocytogenes was 30,66 mm in diameter of inhibition zone; and the lowest activity against Escherichia coli was 20.20 mm. The MIC values found out were 1,2%, 1,4%, 2,5% and 3% for Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Salmonella Typhimurium and Escherichia coli, respectively. The reduction of Aspergillus flavus growth expressed as mycelium weight resulted by the mixture of Lb. plantarum kik metabolite-MAG was higher (0,86-2,75 mg/ml) than the individual substance (0,35-1,54 mg/ml) at the concentration 5-20 %.
The metabolite of Lb. plantarum kik - MAG of coconut oil at the concentration of 1 MIC caused less cell leakage than 2 MIC, which resulted in higher protein than nucleic acid leakages. Similar results were also obtained for ions leakage, where the leakage of Ca2+ was higher than K+. The effect of the mixture on the cell morphology of L. monocytogenes and Salmonella Typhimurium observed Under SEM (Scanning Electron Microscopo) caused some degree of cell damage according to the concentration applied. In general, the higher the concentration applied, the more were the cell damage occurred. Stability of the mixture Lb. plantarum kik metabolite-MAG was affected by different pH and heating temperature and time. At pH 4-7, the antibacterial activity of the mixture and individual MAG were quite stabil, except for the individual Lb. plantarum kik did not show antibacterial activity at pH 7. The mixture still showed bacterial activity after heating at 75 and 100 o C for 10, 20, and 30 minutes, whereas at 121 oC, bacterial activity only showed on heating for 10 minutes, either for individual substances or the mixture. Application of the metabolite of Lb. plantarum kik metabolite-MAG on soybean curd as food system model at the concentration of 4 MIC could extend the shelf life long as 6 days at room temperature. Key words: Antimicrobial synergistic effect, lactic acid bacteria (LAB), monoacylglycerol (MAG), food pathogen microbes.
ABSTRAK
ASRIANI. Kajian Efek Sinergi Antimikroba Campuran Metabolit Bakteri Asam Laktat dan Monoasilgliserol Minyak Kelapa Terhadap Mikroba Patogen Pangan. Dibawah bimbingan BETTY SRI LAKSMI JENIE, SEDARNAWATI YASNI dan IDWAN SUDIRMAN. Efek sinergi suatu senyawa antimikroba didefinisikan sebagai efek yang dihasilkan oleh campuran dari dua jenis atau lebih antimikroba yang akan memberikan pengaruh yang lebih besar dari jumlah efek kumulatif campuran kedua antimikroba tersebut. Asam organik dan monolaurin telah dilaporkan memiliki sifat sinergi dalam penggunaannya sebagai bahan antimikroba dalam bahan pangan. Bakteri asam laktat merupakan salah satu jenis bakteri yang dikenal sebagai penghasil asam organik terutama asam laktat, sedangkan monoasilgliserol dari minyak kelapa diketahui memiliki sifat antibakteri dan antikapang karena mengandung asam-asam lemak rantai pendek dan menengah terutama asam laurat. Kajian efek sinergi antimikroba campuran metabolit BAL dan MAG minyak kelapa telah dilakukan dengan menggunakan enam isolat BAL, yaitu: Lb. brevis, Lb. acidophilus, Lb. plantarum pi28a, Lb. plantarum sa28k, Lb. plantarum kik dan Lb. coryneformis. Tujuan penelitian ini adalah: (1) untuk memperoleh BAL yang memiliki efek sinergi tertinggi dengan MAG minyak kelapa; (2) untuk memperoleh rasio optimal dari campuran metabolit BAL-MAG minyak kelapa dan MIC untuk uji bakteri; (3) untuk menguji stabilitas campuran metabolit BAL-MAG minyak kelapa terhadap perbedaan pH, pemanasan dan waktu, serta aplikasinya pada sistem pangan tahu. Isolat bakteri asam laktat yang diseleksi adalah Lb. brevis, Lb. acidophilus, Lb. plantarum pi28a, Lb. plantarum sa28k, Lb. coryneformis dan Lb. plantarum kik. Pengujian aktivitas antibakteri dari campuran metabolit BAL-MAG minyak kelapa dilakukan terhadap 4 jenis bakteri yaitu Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Salmonella Typhimurium, dan Escherichia coli serta Aspergillus flavus. Seleksi BAL yang bersinergi dengan MAG minyak kelapa dan penentuan rasio metabolit BAL-MAG dilakukan dengan menggunakan metode difusi sumur, sedangkan penentuan nilai MIC dilakukan dengan metode kontak. Pengamatan terhadap mekanisme kerja dari campuran metabolit BAL-MAG minyak kelapa terhadap kebocoran protein dan asam nukleat dengan spektrofotometer, kebocoran ion Ca2+ dan ion K+ dengan AAS (Atomic Absorption Spektrofotometer), serta morfologi sel dengan SEM (Scanning Electron Microscope). Pengujian stabilitas campuran metabolit BAL-MAG minyak kelapa dilakukan pada pH 4, 5, 6, dan 7 serta suhu 80, 100 dan 121 o C selama 10, 20 dan 30 menit dengan metode difusi sumur. Aplikasi terhadap sistem pangan tahu dilakukan dengan perendaman pada konsentrasi 2 dan 4 MIC. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari ke enam isolat BAL yang diteliti ditemukan satu isolat BAL yang bersinergi kuat dengan MAG minyak kelapa, yaitu Lb. plantarum kik dengan rasio campuran metabolit BAL-MAG minyak kelapa 5:3. Campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa mampu menghambat pertumbuhan semua bakteri yang diuji dengan aktivitas tertinggi diperoleh pada Listeria
monocytogenes dengan diameter penghambatan 30,66 mm; dan aktivitas terendah diperoleh pada E. coli. dengan diameter penghambatan 20,20 mm. Konsentrasi MIC untuk masing- masing bakteri uji ditemukan sebesar 1,2%, 1,4%, 2,5% dan 3% berturut-turut untuk L. monocytogenes, B. cereus, S. Typhimurium dan E. coli. Campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa juga menunjukkan sinergi aktivitas antikapang yang cukup baik dengan mereduksi berat miselia Aspergillus flavus sebesar (0,86-2,75 mg/ml) dari pada penggunaan secara tunggal (0,35-1,54 mg/ml) pada konsentrasi 5-20%. Semakin tinggi konsentrasi campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa maka kebocoran sel makin parah, dimana kebocoran protein lebih tinggi dari pada asam nukleat. Demikian halnya dengan kebocoran ion Ca2+ lebih besar dari pada ion K+. Pengamatan dengan SEM menunjukkan metabolit Lb. plantarum kik -MAG minyak kelapa menyebabkan perubahan morfologi sel Listeria monocytogenes dan Salmonella Typhimurium pada tingkat kerusakan yang bervariasi, seperti terjadinya pembengkakan sel diikuti dengan pengkerutan pada sel L. monocytogenes dan terhambatnya gangguan pada pembentukan septa dan terbentuknya lubang pada permukaan sel S.Typhimurium Stabilitas dari campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa dipengaruhi oleh pH, dan pemanasan. Aktivitas antibakteri pada pH 4-7 cukup stabil kecuali pada penggunaan tunggal dari metabolit Lb. plantarum kik, yaitu pada pH 7 tidak menunjukkan aktivitas antibakteri. Campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa masih menunjukkan aktivitas antibakteri pada pemanasan 75 dan 100 o C selama 10, 20 dan 30 menit, sedangkan pada suhu 121 o C aktivitas antibakteri hanya diperlihatkan selama pemanasan 10 menit baik terhadap penggunaan tunggal dari metabolit Lb. plantarum kik dan MAG minyak kelapa maupun campurannya. Aplikasi metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa pada tahu sebagai model sistem pangan dengan konsentrasi 2 MIC mampu bertahan selama 4 hari dibandingkan kontrol (1 hari), sedangkan pada konsentrasi 4 MIC dapat bertahan selama 6 hari pada suhu ruang dengan sifat organoleptik (warna, bau dan tekstur) yang masih diterima oleh panelis. Kata kunci : Efek sinergi antimikroba, bakteri asam laktat (BAL), monoasilgliserol (MAG), mikroba patogen pangan.
DAFTAR ISI Halaman PRAKATA ....................................................................................................
ix
DAFTAR TABEL………………………………………………………….
xv
DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………
xvi
DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………….
xix
1 PENDAHULUAN Latar Belakang ...……………………………………………………
1
Tujuan Penelitian …………………………………………………...
4
Manfaat Penelitian..…………………………………………………
4
Hipotesis ……………………………………………………………
5
2 TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Asam Laktat………………………………………………...
6
Metabolit Hasil Produksi Bakteri Asam Laktat ....………………….
7
Monoasilgliserol……………………………………………………..
10
Sifat Antimikroba Monoasilgliserol Minyak Kelapa………………..
11
Mikroba Patogen pada Bahan Pangan ……………………………...
16
Mekanisme Kerja Senyawa Antimikroba…………………………...
19
Daftar Pustaka ………………………… …………………………...
24
3 METODOLOGI UMUM Tempat dan Waktu ……….………………………………………....
29
Bahan dan Alat ……....……………………………………………...
29
Metodologi Penelitian ........................……….........................……..
30
Daftar Pustaka.………………………………………………………
40
4 EFEK SINERGI ANTIBAKTERI BEBERAPA CAMPURAN METABOLIT BAL DENGAN M AG MINYAK KELAPA DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN Listeria monocytogenes Abstrak ..…………………………………………………………….
42
Pendahuluan ………… ..…………………………………………….
42
Metodologi .........................................................................................
44
Hasil dan Pe mbahasan….…………………………………………...
46
Kesimpulan……….………………………………………………....
59
Daftar Pustaka…………………………………………………….....
59
5 AKTIVITAS ANTIMIKROBA CAMPURAN METABOLIT Lb.plantarum kik-MAG MINYAK KELAPA TERHADAP MIKROBA PATOGEN PANGAN Abstrak……………………………………………………………....
62
Pendahuluan………………………………………………………....
62
Metodologi .........................................................................................
64
Hasil dan Pembahasan………………………………………………
67
Kesimpulan……………………………………………………..…...
77
Daftar Pustaka…………………………………………………….....
78
6 MEKANISME KERJA ANTIBAKTERI CAMPURAN METABOLIT Lb. plantarum kik-MAG MINYAK KELAPA TERHADAP BAKTERI PATOGEN PANGAN Abstrak………………………………………………………………
81
Pendahuluan ………………………………………………………...
81
Metodologi…………………………………………………………..
82
Hasil dan Pembahasan… ……………………………………………
85
Kesimpulan…………………………………………………….........
98
Daftar Pustaka…………………………………………………….....
98
7 STABILITAS AKTIVITAS ANTIMIKROBA METABOLIT Lb. plantarum kik-MAG MINYAK KELAPA SERTA APLIKASINYA PADA PRODUK TAHU Abstrak ……………………………………………………………...
101
Pendahuluan…………………………………………………………
101
Metodologi…………………………………………………………..
102
Hasil dan Pembahasan………………………………………………
105
Kesimpulan …………………………………………………………
118
Daftar Pustaka……………………………………………………….
118
8 PEMBAHASAN UMUM ……………………………………………...
121
9 KESIMPULAN DAN SARAN UMUM ................................................
130
DAFTAR PUSTAKA....................................................................................
132
LAMPIRAN…………………………………………………………..….....
134
DAFTAR TABEL Halaman 2.1
Aktivitas antibakteri dari monolaurin dan bahan pengawet pangan lainnya………………………………………………..………………
12
Aktivitas antikapang dari monolaurin dan bahan pengawet pangan lain.........………………………………………………………...........
12
2.3
Komposisi asam lemak beberapa jenis minyak nabati ........................
13
2.4
Penurunan massa sel (%) kapang dan khamir pada beberapa jenis antimikroba pada konsentrasi 1%........................................................
15
Kandungan asam-asam organik (%) berbagai metabolit isolat BAL hasil pengujian dengan HPLC .............................................................
55
Diameter penghambatan dari beberapa metabolit BAL pada pH Supernatan dan pH supernatan yang dinetralkan ................................
56
Kandungan asam-asam lemak pada MAG minyak kelapa serta campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa ............
69
2.2
4.1 4.2 5.1
DAFTAR GAMBAR Mekanisme asam lemah (organik) dalam menginaktivasi bakteri Hal (Garbutt 1997)................................................................................... am Struktur dinding sel bakteri Gram positif dan Gram negatif an2 (Kightley R, 2006)…………............................................................. .1 Bagan alir pelaksanaan penelitian .................................................... 2.2 Diameter penghambatan MAG minyak kelapa dalam berbagai konsentrasi alkohol ..........................................................................
9 21 31 47
3.1 Diameter penghambatan penggunaan tunggal metabolit (1) coryneformis; (2) sa28k; (3) MAG; (4) pi28a; (5) kik; (6) 4.1 acidophilus; (7) brevis terhadap L. monocytogenes .........................
49
Diameter penghambatan penggunaan campuran metabolit (1) kik+MAG; (2) pi28a+MAG; (3) coryneformis + MAG; (4) acidophilus + MAG; (5) sa28k + MAG; (6) brevis + MAG terhadap L. monocytogenes ..............................................................
49
Aktivitas antibakteri MAG minyak kelapa dan metabolit BAL serta Campuran metabolit BAL-MAG minyak kelapa terhadap L. monocytogenes .................................................................................
50
Aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb.plantarum kik- MAG 4.4 minyak kelapa pada berbagai rasio terhadap L.monocytogenes……
51
Aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb.plantarum kik-MAG terhadap beberapa bakteri patogen ...................................................
68
Diameter penghambatan campuran metabolit Lb.plantarum kikMAG terhadap (A) L.monocytogenes; (B) B.cereus; (C) E.coli dan 5.1 (D) S.Typhimurium ..........................................................................
71
Nilai MIC metabolit Lb.plantarum kik-MAG minyak kelapa terhadap beberapa bakteri patogen ...................................................
72
Berat kering miselia kapang Aspergillus flavus (mg/ml) yang diberi metabolit Lb. plantarum kik,MAG dan campuran metabolit 5.3 Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa ..........................................
76
Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG 5.4 minyak kelapa terhadap kebocoran protein (280 nm) dan asam nukleat (260 nm) dari sel L. monocytogenes ....................................
86
Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG 6.1a minyak kelapa terhadap kebocoran protein (280 nm) dan asam nukleat (260 nm) dari sel B. cereus ..................................................
87
Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG 6.1b minyak kelapa terhadap kebocoran protein (280 nm) dan asam nukleat (260 nm) dari sel S. Typhimurium ......................................
87
4.2
4.3
4.5
5.2
6.1c Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa terhadap kebocoran ion- ion logam dari sel L. monocytogenes..................................................................................
91
Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG 6.2a minyak kelapa terhadap kebocoran ion-ion logam dari sel B. cereus ...............................................................................................
91
Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG 6.2b minyak kelapa terhadap kebocoran ion-ion logam dari sel S. Typhimurium.....................................................................................
92
Bentuk sel normal L. monocytogenes (20.000 X)............................
93
6.2c Pengaruh campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG pada dosis 1 MIC terhadap morfologi sel L. monocytogenes (20000X) ..
94
Pengaruh campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG Minyak 6.3a kelapa pada konsentrasi 2 MIC terhadap morfologi sel L. monocytogenes (20.000X) ............................................................... 6.3b Bentuk sel normal S. Typhimurium (15.000 X) ...............................
94 96
6.3c Pengaruh campuran metabolit BAL-MAG pada dosis 1 MIC terhadap morfologi sel S. Typhimurium (15.000X) ........................
97
Pengaruh campuran metabolit BAL-MAG pada dosis 2 MIC 6.4a terhadap morfologi sel Salmonela Typhimurium (15.000X) ..........
97
6.4b Pengaruh pH terhadap aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb. Plantarum kik-MAG minyak kelapa .........................................
106
6.4c Pengaruh pH terhadap aktivitas antibakteri metabolit Lb. plantarum kik....................................................................................
108
7.1a Pengaruh pH terhadap aktivitas antibakteri MAG minyak kelapa ...
109
Pengaruh suhu dan lama pemanasan terhadap aktivitas antibakteri 7.1b campuran metabolit Lb. plantarum kik -MAG minyak kelapa .........
111
Pengaruh suhu (o C) dan lama pemanasan terhadap aktivitas 7.1c antibakteri metabolit Lb. plantarum kik ...........................................
112
7.2a Pengaruh suhu dan lama pemanasan terhadap aktivitas antibakteri MAG minyak kelapa ........................................................................
112
7.2b Pengaruh konsentrasi campuran metabolit Lb. plantarum kikMAG minyak kelapa pada berbagai MIC terhadap penurunan total mikroba (log CFU/g) pada tahu yang disimpan sampai hari ke-6 ... 7.2c Pengaruh konsentrasi campuran metabolit Lb. plantarum kikMAG minyak kelapa pada berbagai MIC terhadap skor panelis 7.3 terhadap warna tahu yang disimpan sampai hari ke-6 ..................... Pengaruh konsentrasi campuran metabolit Lb. plantarum kikMAG minyak kelapa pada berbagai MIC terhadap skor
114
116
7.4a
penerimaan panelis bau tahu yang di simpan sampai hari ke 6 ........
Pengaruh konsentrasi campuran metabolit Lb. plantarum kik7.4b MAG minyak kelapa pada berbagai MIC terhadap skor penerimaan panelis tekstur tahu yang di simpan sampai hari ke 6 ..
7.4c
116
117
