Jana Fauknerová Matějčková
analytická metoda separace nabitých molekul (např. proteiny) vlivem elektrického pole elektroforetická pohyblivost (elektromigrace) závisí na: ◦ ◦ ◦ ◦
náboji velikosti tvaru molekuly vloženém napětí
anion ◦ negativně nabitý ion, pohybuje se k anodě (+)
kation ◦ kladně nabitý ion, pohybuje se ke katodě (-)
amfolyt ◦ může mít kladný i záporný nebo nulový náboj ◦ v závislosti na podmínkách (pH)
využití elfo ◦ proteiny, izoenzymy, nukleové kyseliny, imunoglobuliny
volná elektroforéza ◦ separace probíhá pouze v kapalné fázi (pufru) ◦ bez účasti nosného média ◦ kapilární elektroforéza
elektroforéza na nosičích ◦ papír, gel (agaróza, polyakrylamid, acetátcelulóza) ◦ horizontální nebo vertikální uspořádání
pohyb nabitých molekul v elektrickém poli elektroosmotický tok (electroosmotic flow, EOF) - spontánní tok kapaliny v kapiláře v důsledku náboje (obvykle záporného) na vnitřní stěně kapiláry zdroj vysokého napětí
kapilára
detektor
horizontální uspořádání gel ◦ polyakrylamid
síť monomerů akrylamidu (CH2=CH-CO-NH2) spojených kovalentními příčnými vazbami pomocí N,N´methylylenbisakrylamidu (CH2=CHCO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2), vytváří dlouhé řetězce
◦ agaróza
síť tvořená dlouhými cukernými polymery vázanými nekovalentními vodíkovými můstky a hydrofobními vazbami elektrolyt
zdroj napětí
nativní gelová (nedenaturační) elektroforéza
◦ ◦ ◦
bez denaturačních činidel proteiny migrují gelem podle svého celkového náboje velikosti a tvaru podle velikosti pórů v gelu
SDS gelová elektroforéza
◦ ◦ ◦
proteiny denaturovány dodecylsíranem sodným (SDS) a b-merkaptoethanolem (zruší disulfidické vazby) pohyblivost závisí na molekulové hmotnosti polypeptidových řetězců vhodná pro analýzu makromolekulárních komplexů
napětí ◦ migrační rychlost je přímo úměrná napětí
čas ◦ rozlišení (vzájemné oddělení proužků) roste lineárně s časem, ale rozmytí proužků (difuze) roste se čtvercem času
nosné médium ◦ velikost pórů nosiče a endoosmóza ovlivňují migrační rychlost (výběr typu nosiče)
aplikace vzorku nastavení vhodného napětí nebo proudu ◦ ! STEJNOSMĚRNÝ PROUD ◦ gelová elektroforéza: kolem 70 - 100 V, ◦ kapilární elektroforéza: kolem 20 000 V
nastavení doby separace - řádově minuty ◦ gelová elfo proteinů séra trvá asi 30 min.
při elfo na nosičích následuje po separaci fixace a barvení vyhodnocení
kvalitativní - srovnání se standardy kvantitativní - na nosičích: densitometricky
rozdělení proteinů do frakcí - za fyziologických podmínek konstantní (poloha, intenzita) zastoupení proteinů v plazmě se při různých onemocněních mění (vzájemný poměr) specifický vzhled elektroferogramu (rozložení frakcí nebo píků)
http://www.sebia-usa.com/images/controlGel1.jpg
a2-makroglobulin haptoglobin
a1 – antitrypsin orozomukoid
imunoglobuliny IgG, IgA, IgM
transferin C3-komponent
hypergama globulinémie
normální nález
http://www.sebia-usa.com/products/proteinControl.html
A.
fyziologický nález
B.
akutní onemocnění
C.
D.
výskyt paraproteinu frakce fibrinogenu při analýze plazmy
60% 3% 9% 12% 16%
http://www.sebia-usa.com/products/hyrys2.html http://erl.pathology.iupui.edu/LABMED/GENER27.HTM
tvoří 8% hmotnosti lidského těla
složení krve ◦ buňky (erytrocyty, leukocyty) ◦ buněčné fragmenty ◦ krevní plazma
45% celk. objemu krve
hematokrit ◦ podíl objemu krve ◦ erytrocyty ◦ normální hematokrit u muže je 45%, u ženy 42%
transport kyslíku homeostáza vodní rovnováhy, tělesné teploty srážení výživa vylučování (do ledvin) acidobazická rovnováha transport hormonů, metabolitů antioxidační ochrana
vodný roztok – 90% elektrolyty – Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, HCO3-, HPO4živiny metabolity – Glc, laktát, pyruvát, urea, kreatin, amoniak, TAG, cholesterol proteiny – albuminy a globuliny vitamíny stopové prvky hormony – inzulín, glukagon, kortikoidy, atd. objem plazmy 2,5 – 3 litry
koncentrace 60 – 80 g/l 300 různých proteinů v plazmě většinou jde o glykoproteiny (mimo albuminu) enzymy – klasifikace zvlášť rozděleny do 5 tříd – dle chování během elfo ◦ ◦ ◦ ◦ ◦
albuminy a1 - globuliny a2 - globuliny b – globuliny g - globuliny
vznik ◦ většinou syntetizovány v játrech ◦ g-globuliny v plazmatických buňkách
mnoho vykazuje polymorfismus (žádný není vzácný) charakteristický poločas trávení v oběhu některé proteiny vzrůstají během akutního zánětlivého stavu ◦ proteiny akutní fáze – CRP, a1-antitrypsin, hatoglobin, a1 kyselý glykoprotein, fibrinogen
hladina se mění během akutního zánětu nebo nekrózy tkáně stimuly vedoucí ke změnám konc. reaktantů akutní fáze ◦
◦ ◦ ◦
infekce chirurgický zákrok poranění nádory
H
amfolyty - COOH ↔ - COO- + H+ - NH2 + H+ ↔ - NH3+ při fyziologickém pH ◦ převaha záporného náboje - anionty
CH NH3
COO
prealbumin
fibrinogen
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Soubor:Elektrofor%C3%A9za.jpg
podle specifické funkce ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦
transportní proteiny proteiny imunitní odpovědi proteiny aktivní při hemokoagulaci signální proteiny enzymy buněčné proteiny
◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦
kardiomarkery tumormarkery reaktanty akutní fáze buněčné enzymy hormony cytokiny
podle klinického využití
bílkovina
konc. g/l
Albumin
68 000
funkce
vazba hormonů štítné žlázy a retinol vázajícího 2 ↓ malnutrice proteinu (thyreoidální horm.) nejvýznamnější transportní protein ↓ katabolismus udržení koloidně35–53 15–19 dní ↓ hepatopatie osmotického tlaku ↓ ztráty bílkovin proteinová rezerva organismu
Prealbumin 0,2– (Transthyretin) 0,4
54 000
poločas
rozpustný ve vodě syntetizován v játrech koncentrace 45 g/l snížen při jaterních onemocnění polypeptidová řetězec 585 amk, 17 disulfidických vazeb funkce
◦ transport FA, bilirubinu, některých steroidních hormonů, vitaminů, léčiv ◦ udržování onkotického tlaku krve ◦ pufrační schopnosti
bílkovina α1-lipoprotein 180 000–360 000
konc. g/l
funkce lipoprotein o vysoké hustotě (HDL) ↓ atherosklerózy
1,0–1,6 (Apo A-I)
transport cholesterolu do jater inhibitor lyzosomálních proteáz (hlavně elastázy z polymorfonukleárních leukocytů)
α1-antitrypsin (α1-inhibitor proteáz) 54 000
0,9–2,0
α1-kyselý glykoprotein (orosomukoid) 40 000
0,5–1,2
α1-fetoprotein 69 000
poločas
↑ akutní zánět
4 vrozená deficience může být příčinou onemocnění plic (emfyzém) a jater (cirhóza) vazba lipofilních látek (např. progesteronu a některých léků)
↑ zánět
5 podílí se na regulaci imunitní odpovědi fyziologicky produkován fetálními játry a žloutkovým váčkem
< 7,5 μg/l
3,5
hlavní protein fetálního séra fyziologicky přítomen v séru těhotných žen
↑ hepatom ↑ některé malignity GIT ↑ těhotenství
rozpustné ve vodě v přítomnosti solí glykoproteiny antitrypsin a antichymotrypsin protrombin ◦ koagulační faktor
transkortin
◦ transport kortizolu
kyselý glykoprotein TBG (thyroxin-binding-protein) ◦ transport thyroxinu T4
syntetizován v hepatocytech a makrofázích tvoří 90 % a1 frakce glykoprotein, vysoce polymorfní
funkce
◦ hlavní plazmatický inhibitor serinových proteas (trypsinu, elastasy...) ◦ deficience - proteolytické poškození plic (emfyzém) ◦ vazby s proteázami se účastní methionin ◦ kouření - oxidace tohoto Met → AT přestává inhibovat → ↑ proteolytické poškození plic, zvláště pacienti s deficiencí AT
bílkovina
Haptoglobin
85 000– 1 000 000
konc. g/l
0,3–2,0
poločas
5 dní
funkce
vychytává volný hemoglobin
inhibitor proteáz (trombin, trypsin, chymotrypsin, pepsin)
α 2makroglobulin
800 000
Ceruloplasmin
160 000
1,3–3,0
0,2–0,6
5
4,5
transport malých proteinů (cytokiny, růstové faktory) a dvojmocných iontů (např. Zn2+)
↑ akutní zánět ↓ hepatopatie ↓ intravaskulární hemolýza (konzumpce haptoglobinu)
↑ akutní zánět
díky velmi vysoké molekulové hmotnosti neprojde ani poškozenou glomerulární membránou oxidoredukční aktivita ↓ Wilsonova (oxidace Fe2+ na Fe3+) choroba (hepatolentikulární vazba mědi (váže až 90 % Cu v degenerace) séru)
rozpustné ve vodě v přítomnosti solí glykoproteiny
ceruloplazmin
◦
transport Cu iontů
◦
vazba hemoglobinu
◦
vazba proteáz, transport Zn iontů
haptoglobin
makroglobulin
retinol-binding protein vitamin D-binding protein
koncentrace v plazmě 300 mgl
funkce ◦
◦ ◦
◦
přenáší 90% plazmatické mědi (měď – kofaktor různých enzymů) 1 molekula váže 6 atomů mědi váže měď pevněji než albumin, který přenáší 10% mědi albumin je asi pro přenos mědi významnější (snadněji ji uvolňuje)
a2- globulin, tetramer vyskytuje se ve 3 polymorfních formách
funkce haptoglobinu
◦
◦
◦
váže volný hemoglobin a transportuje jej do retikuloendoteliálních buněk komplex Hb-Hp neprochází glomeruly - zamezení ztráty volného Hb, a tudíž i Fe volný Hb prochází glomeruly a precipituje v tubulech - poškození ledvin
poločas 5 dní poločas Hp-Hb – 90 min. (rychleji odstraňovány hepatocyty) – neprochází do ledvin protein akutní fáze, zvýšen při zánětech ↓ při anémiích ↓ u hemolytiků
bílkovina konc. g/l Transferin 77 000
2,0–3,6
Hemopexin 0,5–1,1 57 000
poločas
7
3–7
funkce
transport a vychytávání volného železa
↑ nedostatek železa ↓ malnutrice ↓ hepatopatie ↓ zánět
vazba hemu, antioxidant lipoprotein o nízké hustotě (LDL)
0,7–0,9 β-lipoprotein (Apo B2 750 000 100)
3
transport cholesterolu k buňkám
velmi vysoká molekulární hmotnost C4 složka 0,1–0,4 komplementu 206 000
1
součást komplementu
↑ zánět ↓ autoimunitní stavy
bílkovina C3 složka komplementu
180 000
β2mikroglobulin
11 800
Fibrinogen
340 000
C-reaktivní protein
111 000
konc. g/l 0,8–1,4
poločas 1
0,001– 0,002
součást komplementu součást leukocytárních antigenů součást koagulační kaskády, prekurzor fibrinu
1,5–4,5
1,5–5 mg/l
funkce
fyziologicky jen v plazmě, není v séru 3
aktivace komplementu
↑ zánět ↓ autoimunitní stavy ↑ hematologické nádory ↓ porucha tubulární resorpce ↑ zánět
↑ akutní zánět (bakteriální)
rozpustné ve vodě v přítomnosti solí glykoproteiny
LDL transferin
◦ transport Fe iontů
fibrinogen
◦ koagulační faktor I
sex hormone – binding globulin ◦ transport testosteronu a estradiolu
CRP
◦ aktivace komplementu
koncentrace v plazmě 3 gl transport železa z odbouraného hemu a z potravy (střeva) do místa potřeby, tj. do kostní dřeně a dalších tkání 1 mol transferinu přenáší 2 moly Fe3+
pokles transferinu
◦ ◦ ◦ ◦
popáleniny infekce maligní procesy onemocnění jater a ledvin
◦
anémie z nedostatku železa
relativní nadbytek transferinu
intracelulární protein v plazmě jen malé množství(30 – 284 mg/l, ženy méně než
muži)
24 podjednotek, které obklopují 3000 – 4500 iontů Fe3+ funkce ◦ uchovává a v případě potřeby uvolňuje železo protein skladující železo v buňkách vzniká v játrech, slezině, kostní dřeni, střevní sliznici koncentrace v séru odráží zásoby železa v těle patří mezi tumorové markery primární hemochromatosa ◦ genetické onemocnění ◦ zvyšuje se absorpce železa ve střevě a to se pak hromadí ve tkáních ◦ poškození jater, kůže, pankreatu, srdce
citlivý marker zánětu rozlišení bakteriální a virové infekce zhodnocení těžkého poškození tkání monitorování průběhu nemoci, pooper. stavů sledování účinnosti antimikrobiální léčby předpověď budoucích kardiovaskulárních chorob roste při bakteriální infekci zvyšuje se během 6-12 hod. po začátku zánětlivého procesu
při virové infekci nestoupá, popř. jen málo rychlejší než sedimentace ery ◦ závisí na koncentraci pozitivně nabitých sérových proteinů (fibrinogen, Ig) za zvýšení koncentrací neutralizujících čistý negativní náboj červených krvinek
hodnoty klesají až o 50% /den, výhodné pro monitorování nemoci minimálně zvýšené hodnoty (2-3 mg/l) zdvojnásobují riziko kardiovaskulárních chorob
cyklický pentamérový sérový protein Mr 120 kDa 5 identických nekovalentně vázaných podjednotek (206 amk) syntetizován v játrech a epitheliálních buňkách za stimulace zánětlivých lymfokinů (interleukinů-6 a -1 a tumor nekrotizujícího faktoru) objeven 1930 – precipitující kapsulární C polysacharid nakterie Streptococcus pneumonie; sérový faktor identifikován a označen jako Creaktivní protein
součást nespecifického imunitního obranného mechanismu, který je schopný vázat pneumokokový kapsulární C-polysacharid, fosfocholinové skupiny membránových zbytků, chromatin v přítomnosti Ca2+ je schopný aktivovat klasickou cestu komplementu funkce jako opsonin v leukocytové fagocytóze stimuluje lymfocyty nebo aktivuje monocyty/makrofágy detekován v aterosklerotických plátech, vázaný převážně na k částečně degradovanému LDL
koncentrace CRP reflektuje stupeň syntézy tohoto proteinu v játrech syntéza je spouštěna cytokiny (interleukin-6, 1 a TNF) sekretovaný makrofágy stanovení pomocí turbidimetrie (zákal) nebo nefelometrie virová infekce CRP nezvyšuje tolik adenovirus a herpes – mohou vyvolat masivní poškození tkání, pak CRP roste syntéza po 6-12 hod. od začátku infekce
nad 100 mg/l – těžká bakteriální infekce meningitida – odlišení bakteriální a virové (virová pod 20 mg/l) pneumonie – 60 mg/l pneumonie bakteriální bronchitis – zvýšeno jen u Chlamidya pneumoniae a Mykoplasma pneumoniae bolest v krku – Spreptococcus pyogenes, pneumoniae – zvýšení, jinak ne infekce močových cest – 100 – 140 mg/l – pyelonefritida po operacích – u popálenin, transplantace, apendicitida (perforované 100 mg/l; neperforovaná nad 20 mg/l)
bílkovina IgG
150 000 IgA
160 000 IgM
900 000
konc. g/l
poločas
8,0–18,0
24
0,9–3,0
0,6–2,5
funkce pozdní protilátky
↑ (chronický) zánět
6
protilátky slizniční imunity
↑ záněty sliznic a jater
5
časné protilátky
↑ akutní zánět
rozpustné ve vodě v přítomnosti solí glykoproteiny IgA IgG – pozdní protilátky IgD IgD IgE
transferin feritin ceruloplasmin haptoglobin hemopexin (váže hem a transportuje ho do jater) odstraňují Fe2+, a tím zabraňují Fentonově reakci: H2O2 + Fe
2+
Fe
3+
+ OH· + OH-
cystatin C ◦ indikátor poruchy glomerul. funkcí (0,5 - 1,2 mg/l)
myoglobin ◦ kardiomarker s rychlou odpovědí (30 - 80 mg/l)
troponiny ◦ kardiomarkery (cTnT, cTnI)
apolipoprotein A1 - povrchový protein HDL (1 - 2 g/l) apolipoprotein B ◦ souhrnný název pro Apo B-48 a Apo B-100
lipoprotein (a) - rizikový faktor vzniku koronárních příhod tyreoglobulin - zvýšen u chorob štítné žlázy (0 - 60 mg/l) CEA ◦ karcinoembryonální antigen, tumormarker (0 - 5 mg/l)
CA ◦ skupina tumormarkerů (CA = carbohydrate antigen, cancer antigen)
koncentrace 64 – 83 g/l ovlivnění rychlost syntézy a odbourávání distribuce v tělních tekutinách ztráty do třetího prostoru eliminace z organismu hydratace organismu zakoncentrování před odběrem – poloha těla, stažení paže ◦ skladování biologického materiálu ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦
změna rychlosti sedimentace ery otoky polyurie zvýšená citlivost k infekcím odběr!
podkoží ◦ depozita albuminu
lymfa ◦ méně proteinů než plazma
likvor ◦ 200x méně než v plazmě
denně syntetizováno a sekretováno 25 g
játra ◦ většina plazmatických proteinů
plazmocyty ◦ imunoglobuliny
ostatní buňky ◦ b2-mikroglobulin
ZVÝŠENÍ
zánět hypertyroidismus hyperkotizolismus nadprodukce růst. h. deficit železa ztráty proteinů klonální produkce Ig
SNÍŽENÍ
jaterní onemocnění se parench. tkáně nutriční deficit hypotyroidismus diabetes mellitus alkoholismus
závisí na funkci proteinu ◦ nejdelší strukturní proteiny ◦ nejkratší regulační proteiny
ovlivněn ◦ distribucí ◦ rychlostí katabolismu a eliminace
filtrace v ledvinách ◦ vyloučení močí ◦ fyziologické ztráty do 150 mg/den
difúze do GIT ◦
hydrolýza nebo vyloučení stolicí
ztráty kůží
zvýšení pozitivních reaktantů akutní fáze (α1-antitrypsinu, orosomukoidu, haptoglobinu, ceruloplazminu, CRP, C3) pokles negativních reaktantů akutní fáze akutní fáze infekčních onemocnění akutní poškození tkáně (infarkt myokardu, chirurgický výkon) větší popáleniny
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Plazmatick%C3%A9_b%C3%ADl
polyklonální zmnožení imunoglobulinů
rekonvalescence po infekčním onemocnění některá revmatická onemocnění
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Plazmatick%C3%A9_b%C3%ADl
zvýšení α-globulinů svědčí o reaktivaci procesu
chronická aktivní revmatoidní artritida
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Plazmatick%C3%A9_b%C3%ADl
vázne proteosyntéza v hepatocytech nadměrná tvorba imunoglobulinů někdy se neoddělí β a γ frakce (tzv. β-γ můstek – při zvýšení IgA) chronická jaterní onemocnění – jaterní fibróza a cirhóza
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Plazmatick%C3%A9_b%C3%ADl
výrazné ztráty bílkovin močí (převládají renální ztráty albuminu) zvýšení bílkovin s největší Mr – α2-makroglobulinu a β-lipoproteinu někdy se neoddělí β a γ frakce (tzv. β-γ můstek – při zvýšení IgA) nadměrná tvorba imunoglobulinů nefrotický syndrom
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Plazmatick%C3%A9_b%C3%ADl
pokles v oblasti γ globulinů primární deficity tvorby protilátek sekundární deficit tvorby protilátek ztráty imunoglobulinů
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Plazmatick%C3%A9_b%C3%ADl
homogenní vrchol kdekoliv v oblasti β až γ benigní monoklonální gamapatie maligní monoklonální gamapatie (myelom)
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Plazmatick%C3%A9_b%C3%ADl
