Izotópok alkalmazása az orvostudományban
Kísérleti állatok radioizotópos leképezése
kutatás anyagcsere folyamatok sejtosztódás nyomjelzés térfogatmérés koncentráció mérés biokémiai folyamatok gyógyszerkutatás
Dr. Márián Teréz NUKLEÁRIS MEDICINA INTÉZET DEOEC
diagnosztika funkcionális vizsgálatok anyagcsere folyamatok tumor diagnosztika izotópeloszlás térkép kétdimenziós térkép háromdimenziós térkép
terápia sugárterápia radionuklid terápia
2010 1
2
3
4
Új izotóppal jelzett ligandok biológiai tesztelése Gyógyszerkutatás Orvostudomány
Állatkísérletek: In vitro: receptor kötıdési vizsgálatok Ex vivo: szervi megoszlásos vizsgálatok autoradiográfia In vivo: Funkcionális:PET, Mini-PET, SPECT, Anatómiai: CT, MRI
Az állatkísérlet végzésének törvényi feltételei
Feltételek
Hol? a létesítményt a hatóságnak (területi Állategészségügyi Állomás) nyilvántartásba kell vennie
(2) Állatkísérlet kizárólag nyilvántartásba vett intézményben és engedély alapján végezhetı. (Ávt. 25. §)
(állatok tartása és gondozása, állatházi viszonyok, személyzet, berendezések, stb.)
Miért?
(1) Állatkísérlet kizárólag olyan felelıs személy vezetésével végezhetı, aki külön jogszabályban meghatározott végzettséggel és gyakorlattal rendelkezik, és ismeri az állatkísérletek etikai elveit, jogi szabályait.
a kutatási tevékenységet (projektet) engedélyeztetni kell a hatósággal (célja, indoka, tudományos alapjai, módszertana)
(2) Állatkísérletet az végezhet, a kísérleti állatot az gondozhatja, felügyelheti, aki erre képesítı oktatásban részesült. (Ávt. 30. §)
Hogyan? a kísérleti eljárásokat a MÁB-nak jóvá kell hagynia (mint elıbb, csak részletesebben, állatok faja és száma; fájdalom, szenvedés, tartós nélkülözés és károsodás értékelése; ezek megszüntetésére vagy minimalizálására tett intézkedések; a kísérlet idıtartama; stb.)
Kísérleti célra állatot tenyészteni (szaporítani), tartani, szállítani, valamint forgalomba hozni a tartás helye szerinti állategészségügyi hatóság engedélyével szabad. (Ávt. 31. § (1) bek.)
Ki? a kísérletet vezetı illetve abban résztvevı személyeknek megfelelı, a hatóság által elismert végzettséggel ill. gyakorlattal kell rendelkezniük 5
Munkahelyi Állatkísérleti Bizottság (MÁB)
6
Állatkísérletek engedélyeztetése Etikai engedély
34. § (1) A MÁB feladata az intézmény a) állatkísérleti szabályzatának (etikai kódexének) elkészítése; b) állatkísérleti szabályzata végrehajtásának ellenırzése; c) állatkísérleteinek szakmai-etikai felügyelete. A MÁB feladata továbbá az intézményben az állatkísérlet végzésére jogosult személyek oktatásának, képzésének szervezése.
Csak erre a célra tenyésztett állatokkal szabad kísérletezi Egér Patkány Nyúl
(2) A MÁB az intézmény belsı állatkísérleti szabályozásának megsértése esetén jogosult - az állat-egészségügyi hatóság egyidejő értesítése mellett - a kísérlet azonnali leállítására. (Ávt. 34. §)
Macska Kutya Sertés
(4) A MÁB nyilvántartást vezet az általa jóváhagyott kísérletekrıl, valamint az intézményben folyó állatvédelmi oktatásról (az oktatás tematikája, a résztvevık névsora). (Korm. rend. 9. §)
Majom 7
8
Állatkísérletek izotóppal jelölt biomolekulákkal
Az autoradiográfia nagy múltú technika Niepce St. Victor in 1867 – ben mutatta ki, hogy az uránium só feketedést okoz az ezüst klorid/bromid sót tartalmazó emulzión.
In vitro autoradiográfia
Ex vivo autoradiográfia, szervi megoszlásos vizsgálatok
In vivo
molekuláris képalkotó technikák
9
10
11
12
1904 E.H. London készítette az elsı makroautoradiográfiát, ahol egy békát rádium izotóppal jelölt meg, és rádium sugárzást, ami a békából jött leképezte egy filmre.
Autoradiográfia-Fotoemulziós eljárás
Autoradiográfia szerepe a biológiai kutatásokban
A sugárforrás lefényképezése két vagy három dimenzióba egy fotográfiai emulzió segítségével
Az izotóppal jelölt biológiailag aktív molekulák szervezetben, szervekben, sejthalmazon, sıt egyes sejteken belüli lokalizációja meghatározható
A sugárzásnak a fotoemulzióra gyakorolt hatása denzitométerrel mérhetı
Gyógyszerkutatás
Denzitométer: speciális fotométer, amely a fotoemulziók feketedését határozza meg, és széles tartományban arányos a sugárzás intenzitásával.
Élettani folyamatok nyomon követése Molekuláris biológiai izotópos módszerek (génexpresszió, membrán fehérjék kimutatása, izotópos antitest jelölésekkel stb)
Kvantitálás (mennyiségi kiértékelés): a vizsgálandó emulzió feketedését un. normálsorozat feketedésével hasonlítjuk össze.
Kémiai analitikai módszerek
13
Autoradiográfia
14
A metszetek fagyasztva szárítása
Izotóp injektálása Állatok elıkészítése a metszésre A beágyazó anyag elıkészítése Beágyazás Metszés Elımetszés Metszés A metszetek kezélése (fagyasztva szárítás) A szeletek elıkészítése a detektáláshoz A szeletekben feldúsult radioaktivitás megjelenítése, film vagy foszfor imager technikával. Kiértékékelés
15
16
Izotópeloszlás detektálása sugárérzékeny filmen,vagy beta imager technikával
LEICA CM 3600 cryomacrotom 17
18
Egésztest autoradiográfia Tumordiagnosztika,
Anatómia kép
terápia hatékonyságának kimutatása állatkísérletekben
Patkány modell 18FDG
Megelızı Orvostani Intézet TTK Molekuláris Biológiai Intézet
19
20
21
22
Anatómiai kép (felsı) és emissziós FDG-PET kép (középsı) fúziója (alsó kép)
A radioaktivitás detektálása film autoradiográfiával
A radioaktivitás detektálása film autoradiográfiával
Látens kép kialakítása AgBr kristály
keletkezı Ag atomok a látens kép prekurzorai
AgBr kristályból Ag kiválás a radioaktív sugárzás hatására
Zselatin
Ag+ + e- = Ag folyamatban
Instabil állapot
Radioactív halmozás
Látens kép stabilizálása: az expoziciót -70 oC-on végezzük
Minta (metszet)
A fényérzékeny anyag (film) egy szilárd hordozóra felvitt zselatinba ágyazott AgBr. Ha fény, vagy radioaktív sugár éri a kristályt, egy elektron kilökıdik, továbbhalad, majd egy hibahelyen befogódik. 23
24
Elıhívás
Fixálás
Az elıhívó oldat az AgBr szemcsék kémiai redukcióját végzi, amelyet az ezüst atomok katalizálnak.
AgBr----Ag Látens kép ----- ezüst szemcse Elıhívás ------ itt jelenik meg gyorsabban a látható kép
Autoradiogram
Az elıhívott kép rögzítése: Az elıhívás után a visszamaradó, redukálatlan AgBr-ot a fixirfürdıben eltávolítjuk
A látens kép láthatóvá tétele
Mosás: sók eltávolítása a zselatinból 25
26
Érzékenység: egységnyi aktivitás által egységnyi felületen (1 cm2) létrehozott Ag szemcsék száma
Felbontóképesség: az a minimális távolság amikor még két különálló pont helyét meg tudjuk különböztetni a filmen
Optimalizálás Denzitométerek: a filmen létrejött feketedések értékelése
A felbontóképesség függ:
Probléma: a feketedési értékek nem lineárisan változnak az aktivitással
az izotóp energiájától a minta rétegvastagságától a fotoemulzió rétegvastagságától
Preflash– elıvilágítási technika
a minta és a film közötti távolságtól az expoziciós és elıhívási idıtıl stb.
27
28
18F In vitro állatkísérletek: autoradiográfia
NECA kötıdése egéragyban
100 nM 18FNECA
100 µM hideg FNECA
A szervekbıl készített szövettani metszetek jelölése a membránhoz kötıdı specifikus izotóppal jelölt ligandokkal: Receptor-ligand kötıdés Kompetíciós vizsgálatok Specifikus – nem specifikus jelölıdések
Coronális metszetek
29
Radioluminescencia detektálása detektálása
George Luckey 1975-ben fejlesztette ki- Gyors, regenerálható detektálása a radioaktiv felhalmozódásnak az egyes metszetekben, gélekben, szeletekben stb.
BaFBr:Eu 2+
30
Az izotóppal jelölt biológiailag aktív molekulák szervezeten belüli felhalmozódásának, kiürülésének, kötıdésének vizsgálata szervi megoszlásos ex vivo állatkísérletekben
- Állatok injektálása a radiofarmakonnal -Expoziciós idı eltelte után az állatok leölése
Kiolvasás lazer fénnyel
-Szervek kipreparálása Szervek tömege és a radioaktivitás mérése
Energia csapda
Gamma számláló, folyadék szcintillációs berendezés ID%= 1 g szervben mért aktivitás normálva a beadott aktivitásra és a teljes tömegre
31
32
Szerv
10perc
30perc
45perc
60perc
plazma
0,339±0,060
0,268±0,002
0,198±0,069
0,195±0,029
vérsejt
0,266±0,100
0,189±0,050
0,097±0,030
0,104±0,040
lép
0,390±0,050
0,684±0,177
0,250±0,140
0,638±0,192
agy
0,506±0,100
0,350±0,040
0,280±0,060
0,205±0,030
tüdı
0,778±0,131
0,641±0,080
0,518±0,190
0,494±0,075
szív
1,687±0,314
0,914±0,039
0,747±0,092
0,572±0,039
gyomor
1,450±0,087
1,873±0,849
0,223±0,047
0,243±0,070
vastagbél
0,359±0,204
0,386±0,147
0,307±0,132
0,372±0,051
vékonybél
1,593±0,417
6,907±1,877
3,336±0,131
7,390±2,511
vizelet
1,036±0,411
2,846±1,508
1,779±0,922
4,282±1,347
máj
2,611±0,450
2,959±0,520
2,665±0,519
2,105±0,547
Kutatási szintek egy biológiailag aktív molekula (ligand, gyógyszer) életében Klinikai trial I, II, III
Alap kutatás Betegség Gyógyszer Preklinikai kutatás felfedezés vizsgálatok
Nem szabályozott
GLP
GCP
Gyártás
GMP
n= 3 (átlag±S.D.) (Good clinical practice) (Good manufacturing practice)
2.táblázat: [11C]ISC szervekben, szövetekben történı akkumulációja, egér modellben 33
34
A legfontosabb pozitron-sugárzó radionuklidok
In vivo állatkísérletek PET kamerával
nuklid T1/2 11C
E alkalmazás keV 20.4 960 Gyors szintézisben a perc legtöbb szerves vegyületbe beépíthetı. Nincs gyógyszertani különbség a jelzett és a jelzetlen molekula között. Az izotóp effektus elhanyagolható.
35
A legfontosabb pozitron-sugárzó radionuklidok
A legfontosabb pozitron-sugárzó radionuklidok
nuklid T1/2 13N
36
E alkalmazás keV 10 1190 Gyors szintézis szükséges. perc N-tartalmú vegyületek esetén a jelzett és jelzetlen vegyület biológiai szempontból azonos. Fı alkalmazása ammónium ionként történik, szívizom perfuzió vizsgálatában.
nuklid T1/2 15O
E alkalmazás keV 2.05 1720 Igen gyors szintézis perc szükséges. Alkalmazás oxigén gázként, vízként, széndioxidként és nbutanolként az agy és a szívizom vérellatásának vizsgálatában.
37
Funkcionális vizsgálatok PET izotóppal jelölt biomolekulákkal
A legfontosabb pozitron-sugárzó radionuklidok nuklid T1/2 18 F
38
E alkalmazás keV 110 635 A legkisebb pozitron perc energiájú PET izotóp. Igen szép a képalkotás. A fiziológiai folyamatok kvantitatív értékelését is lehetıvé teszi. Sokféle molekulába beépíthetı.
Metabolikus anyagforgalom nyomjelzıi: 18FDG, 11 C-kolin, 11C-metionin,
Targetspecifikus biomolekulák: jelzett receptor-ligandok Perfúziós tracerek: 15O-butanol 13N-ammónia 99mTc-MIBI
39
(SPECT) 40
vese
szív
MiniPET-2 kamera
béltraktus
szív
hólyag
tüdı
béltraktus
2. ábra: A receptor ligand aktivitás eloszlása dinamikus PET vizsgálat alatt, nyúlban (szaggitális sikok, transzmissziós vizsgálatra helyezett emissziós képek). 41
DEOEC NMI ATOMKI MEDISO KFT
közös fejlesztés 42
MiniPET-2 kamera Tulajdonságai: hálózat alapú adatgyőjtés teljes győrős, 5 cm axiális látóterő kamera szoftveresen mozgatható ágy felbontás:
~1mm
kristálytípus:
LYSO
kristályméret:
1.27 x 1.27 x 12 mm3
kristályszám:
35 x 35
detektorszám:
12
axiális látómezı :
~50mm 43
44
Patkány agy CT-FDG 45
A radioaktivitás mértékegységei • Aktivitás (bomlás/másodperc) • [Bq] Becquerel •SI mértékegység, 1Bq 1bomlás /másodperc • [Ci] Curie •1gram tiszta 226Ra aktivitása 1Curie=3,7x1010Bq 10mCi=400MBq 1MBq= 27uCi 37MBq=1mCi
47
46
