ŽIVOT jako DÌDIÈNÉ SMRTELNÉ ONEMOCNÌNÍ pøenášené POHLAVNÍMI BUÒKAMI (Vývoj jedince a jeho patologie, oxidaèní stres, stárnutí, regenerace) - 2

Prof. MUDr. Jaroslav Masopust, DrSc. 2. lékaøská fakulta UK Praha, Ústav klinické biochemie a patobiochemie

ŽIVOT jako DÌDIÈNÉ SMRTELNÉ ONEMOCNÌNÍ pøenášené POHLAVNÍMI BUÒKAMI (Vývoj jedince a jeho patologie, oxidaèní stres, stárnutí, regenerace) - 2. èást 3. Stárnutí Vše, co vznikne, také zanikne; rozdílný je èasový interval mezi vznikem a zánikem; záleží na kategorii objektù. Hovoøíme-li o vesmíru jako celku (makrokosmos), pak je to pøibližnì 13,7 miliard let, máme-li na mysli jednotlivé živé organismy (èlovìk), pak jsou to vìtšinou roky až desítky let, ale zkoumáme-li mikrokosmos (stavební èástice hmoty), dostaneme se øádovì i do zlomkù sekund. Srovnáme-li vývoj vesmíru (kosmogeneze) s vývojem lidského jedince (ontogeneze) nalezneme pøi urèitém zjednodušení zdánlivou paralelu: (1) Zaèátek je „velký tøesk“ (prostor, èas, záøení a hmota nerozlišitelné, teplota 1032 stupòù Kelvina, hustota 1094 g/cm3), to je „Planckùv èas“ trvající 10-44 sec - u èlovìka je to fertilizace. (2) Vznik prvních nukleonù, dosud volné kvarky se formují do protonù a neutronù (èas 10-4 sec) - odpovídá to asi rýhování oplozeného vajíèka; vznik moruly. (3) Tvorba prvních elementù (100 sec): vodík a helium, kolize fotonù a elektronù → vznik plazmatu - odpovídá to vzniku gastruly se zárodeèným terèíkem a formování a dalšímu vývoji embrya (embryogeneze). (4) Konec éry záøení, hmota vzrùstá, ves4

Labor Aktuell 02/09

mír se ochlazuje na 30 000 stupòù Kelvina (10 000 let); vesmír se stává prùhledným, kosmické záøení je pozorovatelné (380 000 let). Vznikají kvazary a èerné díry, první stálice - odpovídá to vývoji fétu. (5) Vznik planet a života (1010 let) - odpovídá to porodu a novorozeneckému a kojeneckému období. (6) Souèasný vesmír (pøed 3 miliardami let poèátek života na naší planetì, pøed 600 000 lety se objevuje Homo sapi-

ens) - odpovídá to dìtství a dospívání → dospìlý jedinec. (7) Slunce zaèíná stárnout (pøechází do stádia „èerveného obra“; hvìzdy pohasínají (1014 let); Mléèná dráha se mìní v „èernou díru“ (1017 let); vesmír potemní - odpovídá to postupnému stárnutí èlovìka, vyhasínání nìkterých funkcí, nárùst chorob spojených se stáøím; umírání. (8) Konec vesmíru (zánik i „èerných dìr“ (10100 let) - odpovídá to smrti èlovìka.

Tab. 3: Klasifikace lidského vìku po narození do nìkolika èasových období (WHO)

Stárnutí lidských jedincù by bylo možné definovat jako období dalšího vývoje po dosažení dospìlosti. WHO rozdìluje život èlovìka do nìkolika období (Tab. 3). Lidská populace na této planetì èítá asi 7 miliard jedincù, 7 miliard individualit; nikdo není úplnì stejný, ani jednovajeèná dvojèata. Mají sice shodný genom, ale ten mùže zaznamenat epigenetické zmìny na všech úrovních pøenosu genetické informace vlivem okolních podmínek (Obr. 9). Stárnutí bunìk je univerzální proces, který zaèal se vznikem života na této planetì, tj. asi pøed 3,5 miliardou let. Akumulace rùzných nepøíznivých vlivù vzniklých v prùbìhu stárnutí vede k postupnému narušování správné funkce bunìk a tkání, které smìøují v koneèných dùsledcích k zániku celého organismu. Tzv. oèekávaná prùmìrná délka života lidského novorozence (average life expectancy at birth = ALE-B) se v prùbìhu vývoje lidstva mìnila. Zatímco v dobì Starého Øíma pøed 2000 lety to bylo 30 let, v souèasných rozvinutých zemích se tento parametr zvýšil na 80 let. Pøedpokládá se, že limit ALE-B je kolem hodnoty 85 a maximální délka života (MLS) 122 let (Harman D.D., 2001). Podle posledních studií (Lutz W., 2008) je vývoj stárnutí globální populace specifická kombinace klesající fertilizace a nárùstu oèekávané délky života. Stárnutí celosvìtové populace se bude do poloviny 21. století zrychlovat, pak zpomalovat. Autoøi kalkulují medián vìku celosvìtové populace (bez vlivu hodnoty oèekávané délky života) v roce 2000 na 26,6 let, v roce 2050 na 37,7 let v roce 2100 na 45,6 let. Vezmou-li se však v úvahu i oèekávané délky života, medián vìku svìtové populace bude v uvedených èasových obdobích 26,6 - 31,3 a 32,9 let. Budou však regionální rozdíly. (Obr. 10) Pøíkladem farmakogenetických vlivù na terapii onemocnìní mùže být nedávná randomizovaná studie (Collet J.P., 2009), která ovìøovala nepøíznivý úèinek aplikace protidestièkového antitrombotika klopidogrelu u pacientù po akutním infarktu myokardu. Jedinci s variantní alelou genu ABCB1 (TT → CC v nukleotidu 3435) mají vyšší riziko výskytu kardiovaskulární pøíhody do jednoho roku než jedinci s alelou normální. Podobnì tomu je u pacientù

Obr. 9: Úrovnì možných epigenetických zmìn základní genetické informace

s nefunkèní alelou CYP2C19*2, která ovlivòuje pøemìnu klopidogrelu na aktivní metabolity. Dalším problémem je polyfarmacie, tj. souèasné užívaní nìkolika lékù, ev. spolu s nutrièními doplòky (vitaminy, minerály nebo rùznými extrakty z rostlin). Dochází zde k lékové interakci, která mùže zmìnit jejich žádoucí úèinek v nežádoucí až velmi škodlivý (gastrointestinální krvácení, renální dysfunkce, porušení elektrolytové rovnováhy, hypertenze, hypotenze, bradykardie, arytmie, toxický úèinek nebo nedostateèný léèebný úèinek). Tato interakce se mùže dít na úrovni absorpce, biotransformace, farmakodynamiky, transportu v plazmì. V USA v prùmìru 4 % seniorù je takto ohroženo (Qato D.M., 2008, viz též Hines L. 2009, MedScape). Stárnutí v širším slova smyslu, tj. zmì-

ny v èasovém prùbìhu ontogeneze, je možno datovat už od èasných fází embryogeneze, kdy kromì bunìk proliferujících a diferencujících nìkteré buòky (už pro další vývoj nepotøebné) zanikají apoptózou. Vlastní stárnutí se však obvykle klade až po dosažení dospìlosti. Definuje se jako fyziologický vývojový proces se zmìnami na molekulové, subcelulární, celulární i úrovni celého organismu, které smìøují v koneèné fázi ke smrti. Stárnutí je charakterizováno stochastickým nahromadìním molekulových poškození, progresivním selháváním udržování a oprav poškozovaného organismu v dùsledku nemocí vztažených k vìku (Rattan S.I., 2008). Pøi studiu tohoto procesu je tøeba oddìlit projevy od dùsledkù a mechanismy od pøíèin. Pøíèiny stárnutí možno sledovat na úrovni (a) chromosomù (b) subcelulárních složek (c) bunìk a tkáòových systémù (d) celého organismu. Na úrovni chromosomù byly objeveny (mutace) alterace jako jsou geny (pøedèasného) zrychleného stárnutí: CKN1 (Cocainùv syndrom), WRN (Wernerùv syndrom), Lamin A (Hutchinson-Gilfordùv syndrom) a dále gen Klótho. Na druhé stranì byl i prokázán gen prodlužující život - ApoA 1 Milano, který udržuje nízkou hladinu cholesterolu tím, že potencuje reverzní transport cholesterolu ze subintimy do jater, kde je metabolizován a vylou-

Obr. 10: Možnosti ovlivnìní biotransformace lékù (farmakometabolom) v prùbìhu ontogeneze jedince

Labor Aktuell 02/09

5

èen do žluèe ve formì žluèových kyselin. Rovnìž ApoE gen je sdružen s dlouhovìkostí (Schachter F., 1994). V poslední dobì je velký zájem o geny rodiny FOXO a rodiny Sirtuin (Jacobs K.M., 2008). FOXO kóduje rodinu transkripèních faktorù (FOXO1, FOXO3a, FOXO4 a FOXO6), které jsou lidskými homology genu daf-16 u hlístu C. elegans, kde reguluje délku života. FOXO transkripèní faktory regulují øadu intracelulárních procesù zahrnujících metabolismus a rezistenci vùèi rùzným formám oxidaèního stresu. FOXO3a iniciuje signální dráhy ovlivòující neurodegeneraèní onemocnìní provázející stárnutí jako jsou neuromuskulární choroby, dále lupus erythematodes, mozková mrtvice nebo komplikace diabetu mellitu (Maiese K., 2008). Geny rodiny Sirtuin jsou potenciálními ochránci bunìèných organel. Jimi kódovaný protein na vnitøní mitochondriální membránì Sirt3 hraje zøejmì významnou roli pøi stárnutí a oxidaèním stresu. Kontroluje a minimalizuje škodlivý uèinek reaktivních forem kyslíku (zejména superoxidový anion = O2.-), který vzniká pøi mitochondriálním transportu elektronù. FOXO3a a Sirt3 tvoøí funkèní komplex (Vahtola E., 2008). Gerontogeny, které ovlivòují délku života, byly identifikovány zatím hlavnì u nižších živoèichù jako je banánová muška (Drosophila melanogaster), hlíst (Caenorhabditis elegans), kvasnice (Saccharomyces cerevisiae), myš (Mus musculus)

nebo na bunìèných lidských kulturách (fibroblasty) (Obr. 11). Do jaké míry ovlivòují homology tìchto genù též dlouhovìkost u èlovìka, bude nutno ještì prokázat. V modelovém experimentu bylo zjištìno, že lidský homolog kvasnicového genu LAG1, lokalizovaný v oblasti 19p12, mùže nahradit funkci pro dlouhovìkost, je-li aplikován u kvasnic (Jazwinski S.M., 2000). Geny hrají roli nejen pøi dlouhovìkosti, ale též pøi udržování dobrého zdraví. Jsou geny predisponující k chorobám a geny chránící zdraví. Tak kupø. gen pro hydroxylaci aromatických slouèenin (tabákový kouø obsahuje asi 4000 vìtšinou toxických slouèenin jako jsou aromatické uhlovodíky, nitrosamin, arylaminy apod). Kuøáci, kteøí mají gen pro arylhydroxylázu, která mìní tyto látky na mnohem toxiètìjší, umírají v dùsledku kouøení už ve vìku 30 let, kdežto ti, kteøí tento enzym nemají, se mohou dožít i osmdesátky. Mechanismus alterace DNA, která ovlivòuje expresi genù, se dìje methylací DNA (deoxycytosin se mìní na deoxymethylcytosin za katalýzy DNA-methyltransferázy). Modifikovány jsou tak zejména „CpG-ostrùvky“, tj. vazebná místa èetných transkripèních faktorù (hlavnì „ochránci genomu“), a dále demethylací, a to buï inhibicí DNA-methylázy (kupø. 5-azacytidinem) nebo aktivací DNA-demethylázy. Methylace snižuje transkripèní

Obr. 11: Gerontogeny identifikované u nìkterých živoèišných druhù

6

Labor Aktuell 02/09

aktivitu kódujících genù, hypomethylace snižuje expresivitu kódujících genù. Na úrovni bunìèných proteinù mùže dojít k deamidaci, izomerizaci nebo racemizaci (Obr. 12). Dalším mechanismem je oxidace a glykace (glyko/oxidace) jako je tvorba AGE (koneèné produkty pokroèilé glykace) nebo tvorba lipofuscinu, které se usazují v tkáních, kde negativnì ovlivòují správnou funkci bunìk (Obr. 13). V poslední dobì (Robert I., 2008) se klade dùraz na elastin, respektive na jeho „stárnutí“ spoèívající v nahromadìní kalcia, v ukládání lipidù a v elastolytické degradaci. Alterace elastinu ovlivòují správnou funkci kardiovaskulárního a respiraèního systému. Také „crosslinking“ kolagenu (kolagenových vlákének) koneènými produkty pokroèilé glykace (AGE) pøispívají ke ztuhnutí (ridifikace) kardiovaskulárního systému. Na úrovni subcelulární jde o zmìny týkající se pøedevším mitochondrií. Tyto organely hrají klíèovou úlohu nejen pro rùzné metabolické pochody, vèetnì dodávky vìtšiny ATP buòkám pomocí oxidaèní fosforylace, ale také pro složité procesy jako je vývoj, apoptóza nebo stárnutí (Yau-Huei Wei, 2002). Mitochondrie tvoøí ATP propojením protonového gradientu vytváøeného v respiraèním øetìzci s fosforylací ADP pohánìnou protonem prostøednictvím F0, F1 ATPázy. Fungování oxidaèní fosforylace zajišuje 1000 polypeptidù, kódovaných 37 mitochondriálními DNA (mtDNA), ostatní kóduje jaderná DNA. Proto integrita mitochondrií je naprosto nezbytná pro dodávku energie buòkám. Bylo identifikováno 50 bodových mutací a kolem 100 „rearrangement“ mtDNA sdružených s výskytem rùzných nemocí. Mitochondrie produkují nejen ATP, ale také jako vedlejší produkt reaktivní formy kyslíku ROS. Hlavním zdrojem je respiraèní enzymový komplex I a proton-motivní Q cyklus v komplexu III. Vzniklé ROS, tj. superoxidový aniont = O2.- a z nìho odvozené další, jako hydroxylový radikál = .OH- nebo H2O2, oxidují membránové fosfolipidy, proteiny, poškozují DNA a vyvolávají odpovìï projevující se kupø. chronickou zánìtlivou reakcí. V mitochondriích normálních pokusných potkanù se uvolòuje asi 3x107 superoxidového aniontu dennì

Obr. 12, 13: Alterace proteinù v prùbìhu stárnutí

Obr. 14: Mitochondriální oxidaèní stres a poškození buòky

(Yau-Huei Wei, 2002). S pøibývajícím vìkem klesá tvorba ATP a stoupá produkce ROS. Endogenní nadprodukce ROS v mitochondriích poškozuje pøedevším mitochondriální DNA (mtDNA), která je nejblíže zdroji produkce ROS respiraèním øetìzem a která není chránìna histonovými proteiny a má omezený opravný mechanismus. Poškozené podjednotky mitochondriálního respiraèního øetìzce uvolòují ještì více ROS, a tak vzniká bludný kruh. Dùsledkem poškození jsou patologické stavy spojené zejména s poruchou energetického metabolismu ve svalech (myokard, kosterní svalstvo) (Tsutsui H., 2006). Dá se øíci, že choroby spojené se stáøím jsou cenou, kterou platíme za kontrolu redox-systému expresí „stresových“ genù (Lane N., 2003). Øada degenerativních chorob je zpùsobena mutacemi mitochondriálních genù zakódovaných v mitochondriální DNA (mtDNA) nebo v nukleární DNA (nDNA). Genetické defekty, jejichž dùsledkem je inhibice oxidaèní fosforylace s následným pøesmìrováním vyššího poètu elektronù (než obvykle) na produkci ROS, zvyšuje oxidaèní stres. Pokles produkce mitochondriální energie a zvýšený oxidaèní stres otvírá póry mitochondriální membrány, což navozuje proces apoptózy. Interakce tìchto procesù je podkladem patofyziologie degenerativních chorob postihujících CNS, kosterní nebo srdeèní svalstvo, ledvinový, endokrinologický nebo hematologický systém. Oslabení správné funkce mitochondrií je dùležitým faktorem ovlivòujícím stárnutí (Wallace D.C., 2001). Bunìèné stárnutí jako základní chování bunìk bylo poprvé popsáno a formováno v roce 1961 Hayflickem (Hayflick L., 1961), který prokázal na bunìèných kulturách, že pìstované buòky neproliferují donekoneèna, ale že po urèité dobì se jejich rùst zpomalí, až se bunìèný cyklus dìlení úplnì zastaví, buòky neodpovídají na mitogenní stimuly a podléhají morfologickým zmìnám. Dalšími autory (ref. BenPorath I., 2004) bylo prokázáno, že molekulovými aktivátory stárnutí bunìk jsou geny kódující p53, Rb a p16/Ink4a a že stárnutí probíhá jako „tumor-suprimující“ mechanismus. V posledních letech se pøisuzuje znaèný vliv na procesy stárnutí mechanismu oznaèovanému jako hormesis. Jde o vliv Labor Aktuell 02/09

7

stres. Intenzita stresu mùže tedy mít diametrálnì rozdílný úèinek; každý jedinec mùže také reagovat rozdílnì. Allostasis (alostáza) je termín, kterým se oznaèuje mezní schopnost normálního fyziologického systému pøi adaptaci na požadavky potøebné pro organismus ke zdolání výkyvù (zmìn) vnìjšího prostøedí. Primárními systémovými alostatickými regulátory jsou hormony (kortizol, inzulín, IGF-1, rùstový hormon, androgeny); na bunìèné úrovni jsou to èetné mechanismy, regulující stresovou odpovìï (cytokiny, adipokiny, ...). (Obr. 16).

Obr. 15: Schematické znázornìní vztahu ROS, poškození mtDNA a dysfunkce respiraèního øetìzce v mitochondriích

opakovaného malého stresu na buòky. Tyto stresové podnìty navozují obrannou reakci, do níž patøí tzv. „odpovìï na teplotní šok“ (heat shock response = HS). Jde o evoluènì velmi starý mechanismus, kdy extracelulární stresové podmínky (stejnì jako intracelulární stres z denaturovaných proteinù) navozuje øadu po sobì jdoucích procesù zaèínajících signální transdukcí, aktivací a translokací do bunìèného jádra tzv. „heat shock faktorù“ (HSF), jejich vazbu na urèitou sekvenci DNA s následnou transkripcí HS-genù a preferenèní translací HS-proteinù (kupø. HSP70), realizujících rùzné biologické funkce (pøedevším opravné a regeneraèní mechanismy) pùsobící proti stárnutí (Rattan S.I., 2006). Signalizaèní dráhy, které biologické funkce v buòkách navozují, nejsou zatím plnì objasnìny. Uvažuje se o aktivaci urèité skupiny proteinkináz jako jsou stresem aktivované proteinkinázy SAPK1 (=JNK), SAPK2 (p38) nebo mitogenem aktivovaná proteinkináza (MAPK) nebo extracelulárními signály regulované kinázy ERK1 a ERK2. Signální dráhy tìchto kináz se uplatòují pøi mechanismech pøežití nebo apoptózy v odpovìdi na stres. Kupø. aktivace SAPK2 (p38) se objevuje velmi èasnì v prùbìhu stresu a vede k fosforylaci HSP27. V tìchto drahách se postupnì aktivují další kinázy jako MKK3/6 a MAPKKK (= apoptózový signál regulující ASK-1). „Teplotní šok“ (=HS) aktivuje též receptor epidermálního rùstového faktoru (EGFR) a fosforyluje syntázu 8

Labor Aktuell 02/09

oxidu dusnatého (NOS), zvyšuje expresi Fas/CD95 a k tomu navozuje zvýšení [Ca2+], [Na+], intracelulární pH (pHi), cAMP a inositol-1,4,5-trisfosfátu. Na druhé stranì naopak znaèný stres nebo chronická zátìž (fyzická, mechanická, metabolická, psychologická,...) ovlivòuje negativnì rùznými mechanismy zdraví a urychluje stárnutí (Epel Elisa L., 2009). Chronický stres vede k pøejídání, spolupùsobí na zvýšení sekrece kortizolu a inzulínu, potlaèuje urèité anabolické hormony. Takovýto metabolický stres podporuje abdominální obezitu se všemi jejími negativními dùsledky, jako je systémová zánìtlivá reakce a chronický oxidaèní

Na úrovni celulární jsou to zejména alterace bunìèného cyklu dìlení (replikaèní stárnutí), apoptóza, snížení odpovìdi na teplotní šok. To vše omezuje reparaèní a regeneraèní procesy. Ukazuje se, že èasomírou života jsou telomery, velmi specializované úseky polynukleotidového øetìzce stejného složení (5´-TTAGGG-3´), opakující se a zakonèující molekulu DNA; konec je chránìn jakousi „èepièkou“ (cup), což je nukleoproteinový komplex, vytváøející T-klièku (obsahující specifické bílkoviny jako TRF1, TRF2 a POT1). Pøi každém bunìèném dìlení se odštìpuje 1 telomer; jejich poèet se pøi dìlení buòky progresivnì snižuje, až buòka nemá schopnost se dále dìlit (z pùvodní délky 10-20 kb na 5-10 kb u vìtšiny bunìèných typù) (viz Ben-Porath I., 2004). Krácení telomerù se urychluje vlivem chorob provázejících stárnutí; zvláštì to je

Obr. 16: Odpovìï organismu na nadmìrný (dlouhodobý) stres

ným vìkem 74,2 rokù byla namìøena 6,3 (SD. 0,62) kilobazí párù (Fitzpatrick A.L., 2006). Zkrácení o 1 kb zvyšuje riziko výskytu infarktu myokardu 3krát.

Obr. 17: Nadmìrný stres a stárnutí (mechanismus ovlivnìní cyklu dìlení)

Dalším mechanismem, který je ovlivnìn stárnutím, je cirkadiánní fotorecepce. Jde o pùsobení 1 % retinálních gangliových bunìk, které mají schopnost fotorecepce. Fotosenzitivní gangliové buòky v lidské sítnici byly objeveny nedávno (Berson D.M., 2002). Ukázalo se, že tyto fotoreceptory hrají dùležitou úlohu v lidské fyziologii a pøi udržování zdraví (Turner P.L., 2008). Vysílají neuvìdomované informace o intenzitì a kvalitì okolního svìtla, které jsou zpracovávány v nonvizuálních mozkových centrech jako „body master“ biologických hodin v suprachiasmatickém nukleu pøedního hypothalamu, který øídí a optimalizuje fyziologické mechanismy pøi geofyzikálním støídání dne a noci prostøednictvím nervových a hormonálních signálù. (pokraèování)

Obr. 18: Alterace na bunìèné úrovni

kardiovaskulární onemocnìní a rakovina. Rizikovými faktory jsou obezita, hypertenze, kouøení, diabetes mellitus, zvýšená koncentrace interleukinu 6, stejnì jako nezdravý zpùsob života. (Suzan Mayor, 2009). Mechanismem urychlujícím krácení telomerù je oxidaèní stres a èasté zánìty. Pouze embryonální kmenové buòky a kmenové buòky adultní, stejnì jako proliferující nádorové buòky, mají aktivní DNA polymerázu (s katalytickou podjednotkou - telomerázou = „human telomerase reverse transcriptase“ - hTERT), která je schopna konec telomerù obnovit. V prùmìru se ztrácí asi 21 telomerù každý

rok. Mìøení délky telomerù (telomere restriction fragment = TRF), kupø. v leukocytech, mùže být mìøítkem biologického stárnutí a zvýšeného rizika kardiovaskulárních chorob (Fitzpatrick A.L., 2006). Bylo zjištìno, že zkrácení poètu telomerù koreluje s výskytem diabetu mellitu, hladinou glukózy, koncentrací inzulínu nalaèno, diastolickým krevním tlakem, tlouškou vzdálenosti media-intima u karotid nebo koncentrací IL-6 a CRP, s nadváhou. Podstatnì více u lidí se sedavým povoláním, s minimální fyzickou aktivitou. Prùmìrná hodnota TRF u skupiny 419 pacientù s rùznými onemocnìními, s prùmìrLabor Aktuell 02/09

9