IV.
AKTIVITAS ANTIOKSIDAN @INYAK FRAKSINYA SECARA IN VlTRO
r
6 KATUL
BWET
E W DAMAYANTHI. A secara In Vjtm. Di b pembimbing, FRANSISKA RUN SYARIEF dan DJOKO SAID D
terdapat pada tana bekatul padi mem aktivitas antioksi dengan konsentrasi yang di terhadap oksidasi LDLNLDL dan limfosit. Untuk mempelajari aktivitas antiokbid LDU(3-VLDL manusia, plasma darah nha bekatul IR-64, fraksi tak tersabunkan, Q, oryzanol standard dengan konsentrasi bert pglml plasma, atau tanpa suplementasi diisolasi menggunakan metode ultrasentri dan dioksidasi oleh CuS045 pM. Hasil malonaldehid LDL dan Pada sistem limfosit, lama inkub ekstrak uji pada kultur limfosit ditentuk bekatul dan fraksinya dilakukan. Minya dan oryzanol standar terdiri atas berdasarkan pada konsentrasi minu 2.132,O pglml ; fraksi tak tersabunk pglml ditambahkan pada media kultu Jumlah sel yang hidup yang tidak dipengaruhi oloh jenis dan ko H202 3 mM ke dalam kultur menu kan tanpa penambahan H202. Kapasitas Relatif (KR), menunjukkan KR minyak (3,88) te tak tersabunkan (2) dalam melindu bahwa untuk aspek komersial, mi sebagai antioksidan karena ren ditunjukkan oleh nilai KR.
I
Kata kunci : oryzanol, stres oksidatif, LDWLDL-oxidiz d dan limfqsit
DAN ,
A. ABSTRACT
EVY DAMAYANTHI. Antioxidant Activity of Stabilized Rice Bran and Its Fraction In Vitro. Under the guidance of DEDDY MUCHTADI as the chairman, FRANSISKA RUNGKAT ZAKARIA, HIDAYAT SYARIEF, C. HANNY WIJAYA, and DJOKO SAID DAMARDJATI as advisory committee members.
Reactive oxygen species are related with pathogenesis of human diseases, one of them is atherosclerosis. Under oxidative stress, the body needs exogenous antioxidant which could be found in plants. Some researches indicated that oryzanol had antioxidant activiiy, however, the information about the oryzanol role in low density lipoprotein (LDL) and very low density lipoprotein (PVLDL) prevention from oxidation and human lymphocyte under oxidative stress in v h was still limited. The objective of this study was to investigate the antioxidant activity of oryzanol at the concentration based on rice bran beverage model through oxidized LDUVLDL and lymphocyte. Human PVLDL and LDL isolates, oxidized with CuSO, 5 pM, obtained from plasrr~asupplemented with rice bran oil (RBO) and its fraction, were collected by ultracentrifuge and dilute until 200 pg proteinlml. The samples that were supplemented into plasma were RBO, unsaponifiable matter and oryzanol IR-64, oryzanol IR-64 3x and oryzanol standard with the concentration of 308.3, 22.2, 5.2, 10.4 and 10.4 1.tglml, respectively. The length of incubation, H202 concentration, the period of sample supplemented into human lymphocyte culture were determined before the antioxidant activity of RBO and its fraction in lymphocyte was carried out. The samples used in the lymphocyte and antiproliferation cancer line experiment were RBO IR-64, unsaponifiable matter IR-64, and oryzanol standard with 5 levels of concentration at the range, for RBO, were 133.2 2,132.0 pglml, unsaponifiable matter 9.6 153.6 pglml, oryzanol standard 2.4 37.7 pglml. The result showed that malonaldehyde concentration in human LDL and P VLDL. were significantly decreased (a=0.05), 15 41% and 39 56 % from the control, respectively. The absorbance of living lymphocyte cell in culture was not influenced by the kind and concentration of RBO and its fraction. The addition of hydrogen peroxide (H202)3 mM into culture significantly lowered the absorbance compared to culture without H202.
-
-
-
-
-
Keywords : oryzanol, oxidative stress, LDLNLDL-oxidized and lymphocyte
B. PENDAHULUAN
Senyawa antioksidan alami dari berbagai tanaman telah banyak digali dan dibuktikan khasiatnya dalam mencegah berbagai kerusakan oksidatif dan penyakit yang melibatkan reaksi radikal bebas. Radikal bebas dan senyawa oksigen reaktif
(SOR) terlibat dalam pathogenesis berbagai macam penyakit, termasuk atherosklerosis (Kehrer, 1993).
Senyawa antioksidan tersebut antara lain asam
kafeat yang terdapat pada biji kopi (Moon dan Terao, 1998), ekstrak jahe (Fuhrman
et a/. 2000; Septiana, 2001), senyawa kurkumin pada kunyit (Masuda et al. 1998), bangle (Nagano et a/. 1997). Bahan-bahan yang berpotensi menyehatkan itu sangat baik jika digunakan menjadi produk makanan dan minuman nutraceutical.
Hal ini karena ada
kecer~derunganpada masyarakat untuk menjaga kesehatan tubuhnya dengan mengkonsumsi makanan dan minuman yang berkhasiat bagi kesehatan. Produk sepe~qiini disebut dengan pangan fungsional. Bentuk pangan fungsional yang populer adalah minuman. Dalam ha1 ini termasuk pemanfaatan minyak bekatul di dalam makanan dan minuman (Ellott, 1999; McCaskill dan Zhang, 1999). Penelitian ini mempelajari aktivitas antioksidan y-oryzanol, salah satu antioksidan alami yang terkandung dalam minyak bekatul. Antioksidan alami di dalarn minyak bekatul lainnya adalah vitamin E. Xu et a/. (2001) menunjukkan aktiv~~tas antioksidan y-oryzanol lebih kuat dibandingkan vitamin E pada oksidasi kolesterol secara in vitro. Penelitian y-oryzanol pada binatang percobaan dan man~~sia membuktikan bersifat hipokolesterolemik (Kahlon dan Chow, 1997), tetapi inforrnasi mengenai aktivitas antioksidan y-oryzanol untuk melindungi oksidasi
lipoprotein dan sifat perlindungan terhadap sel hidup dari penderitaan akibat stres oksidatif belum ada. Dalam penelitian ini mula-mula dicoba efek perlindungany-oryzanol terhadap LDL dan VLDL yang oksidasinya diinisiasi oleh CuS04. Halliwell(1992) menyatakan Cu bersifat prooksidan lebih kuat dibandingkan Fe. Sutanto (1996) menggunakan k~nsentrasi5 pM di dalam penelitian oksidasi LDL.
Kemudian dicoba efek
perlindungan y-oryzanol terhadap sel hidup limfosit manusia di bawah kondisi tanpa dan dlengan stres oksidatif yang diinduksi oleh H202menggunakan metode MTT untuk menentukan apakah y-oryzanol mempunyai aksi perlindungan pada sel hidup di dalam kultur sel.
Bentuk y-oryzanol yang digunakan
adalah murni (hasil
persiapan dengan Kolom Lapis Tipis dan standar), setengah murni (persiapan menggunakan reaksi penyabunan) dan berada di dalam minyak kasar. Konsentrasi ketiga bahan di atas dihitung berdasarkan konsentrasi yang setara terdapat di dalam minurnan bekatul model, yaitu komposisi bekatul dan air pada segelas minuman bekalul yang dikonsumsi sehari. Kemudian konsentrasi dibuat bertingkat.
C. BAHAN DAN METODE 1. Tampat, Waktu, Bahan dan Alat a. Tempat dan Waktu
Penelitian ini berlangsung di laboratorium kimia-biokimia Pusat Studi Pangan dan Gizi , laboratorium analisis umum PAU llmu Hayati, laboratorium analisis zat gizi
tli
Jurusan Gizi Masyarakat dan Sumberdaya Keluarga, laboratorium virologi
dan lipid pada Pusat Studi Satwa Primata di Jalan Lodaya Bogor yang seluruhnya beratja di lnstitut Pertanian Bogor dan laboratorium imunologi pada US-Namru 2 di Jakarta. Penelitian berlangsung dari Mei 2001 sampai dengan Agustus 2001.
b. Bahan Pada isolasi LDL dan VLDL dibutuhkan 150 ml darah segar seorang laki-laki dewasa sehat dan bahan kimia NaCI, Na-EDTA, KBr, NaHC03. Untuk analisis protein isolat digunakan serum albumin sapi (BSA), Na2C03,NaOH, CuS04.5H20, kaliurrl tartrat, reagen folin-ciocalteau. Untuk analisis malonaldehid (MDA) isolat diguniakan 1,I ,3,3 - tetraetoksipropana (TEP), asam tiobarbiturat (TBA), buffer fosfat pH 3 tjan 1 butanol. Kondisi stres oksidatif isolat digunakan inisiator CuS04. Pada isolasi limfosit dibutuhkan darah segar manusia dan histopaque. Untuk kultur sel limfosit dan analisis MTT dibutuhkan H202air steril (pro injection), medium serbuk RPMI-1640 (Gibco BRL), serum janin sapi (SJS) (Sigma, USA), PBS, Gentamisin atau penisilin-streptomisin, NaHC03,Tripsin (Sigma, USA), EDTA, tryphan blue (Gurr), MTT reagen (Sigma, USA), HCI isopropanol. c. Alat
Peralatan yang digunakan tabung konikal 50,15 dan 10 ml, sentrifuse, penangas air suhu 37 OC, tabung ultrasentrifuse poialomer (Beckman, 14 x 95 mm), ultrasentrifus Beckman XL-90 dengan rotor SW40, pisau pengiris tabung, kantung dialisis, membran milipore 0'22 pm, spektrofotometer UV-Vis dan
Untuk pemeliharaan sel dan kultur sel diperlukan sentrifuse, inkubator Con 5% 317°C(NAPCO), hemasitometer, Spectmfotometric Elisa Plate Reader, laminar flow hood, flask 50 ml (Costar), mikroskop, lempeng mikrokultur 96 sumur dasar datar dan membran 0,22 pm.
2. Minuman Model dan Persiapan Ekstrak Uji Minuman model disusun berdasarkan komposisi bekatul awet dan air sebanyak 220 ml (1 gelas).
Kriteria yang digunakan adalah keenceran dari
campuran bekatul dan air tersebut secara subyektif.
Dari hasil pengamatan
diperoleh 14 g bekatul awet digunakan untuk uji aktivitas antioksidan minyak bekatul dan fraksinya pada dan 12 g untuk uji pada sel limfosit. Bekatul sebanyak 12-14 g ini kemudian dihitung berapa kandungan fraksi tak tersabunkan dan oryzanol. Minyak diekstrak dari bekatul awet padi varietas IR-64 derajat sosoh 13 % sesuai tahap lll.C.3.c metode Xu dan Godber (1999), sedangkan fraksi
tak
tersabunkan diperoleh dari pemisahan minyak sesuai tahap lll.C.3.d. menggunakan metode Bourgeois (1992). Oryzanol yang disuplementasi pada uji menggunakan sel limfosit manusia merupakan oryzanol standard Rice Grower's Australia, sedangkan oryzanol yang disuplementasi ke isolat LDL dan VLDL adalah hasil semipurifikasi menggunakan KLT (111.3.e) dan oryzanol standard.
3. Petmbuatan dan Suplementasi Minyak Bekatul dan Fraksinya Setelah diperoleh minyak, fraksi tak tersabunkan dan oryzanol, maka dilakukan perhitungan konsentrasi sampel.
Perhitungan konsentrasi sampel
~nenggunakanasumsi bahwa minuman bekatul model dikonsumsi seseorang lalu diencierkan oleh darah tubuh sebanyak 6 liter. Konsentrasi tersebut setara dengan jumlah ekstrak yang masuk ke dalam 8 ml plasma darah manusia (uji menggunakan isolal: LDL dan VLDL) atau 175 pl larutan kultur sel (uji menggunakan sel lirnfosit)
-
(Lampiran 24 27). Konsentrasi tersebut merwpakan konsentrasi C2 (Tabel 5). Konsentrasi untuk uji pada isolat LDL dan VLDL lainnya adalah C3 (setara 2 x konsumsi minuman bekatul) untuk oryzanol IR64 dan oryzanol standard
(lamp~lran24).
Konsentrasi untuk uji menggunakan sel limfosit lainnya adalah
bertinlgkat yaitu C l (setara '% x konsumsi minuman bekatul), C3 (setara 2 x konswmsi minuman bekatul), C4 (setara 4 x konsumsi minuman bekatul), dan C5
-
(setara 8 x konsumsi minuman bekatul) (Lampiran 25 27). Untuk percobaan menggunakan isolat LDL dan VLDL minyak dilarutkan d,alarn etanol sehingga mencapai konsentrasi tertentu, sedangkan fraksi tak tersabunkan dan oryzanol dilarutkan ke dalam kloroform. Sampel seluruhnya berjurnlah 6 buah termasuk kontrol (tanpa ekstrak uji), yaitu : 1. Kontrol 2. Minyak bekatul awet IR-64, C2 = 308,3 pglml plasma 3. Fraksi tak tersabunkan IR-64, C2 = 22,2 pglml plasma 4. Oryzanol IR-64, C2 = 5,2 pglml plasma 5. Oryzanol IR-64, C3 = 10,4 pglml plasma 6. Oryzanol standar, C3 = 10,4 pglml plasma Untuk percobaan menggunakan sel lirnfosit minyak dilarutkan dalam etanol (residu pada kultur 0,06 %), sedangkan fraksi tak tersabunkan dan oryzanol dilarutkan dalam etil asetat (residu pada kultur 0,72 %). Setelah itu bahan dilarutkan ke dalam RPMI-1640 sehingga konsentrasi bahan di dalam larutan sesuai dengan perhitungan. Konsentrasi akhir sampel di dalam sumur untuk C1, C2, C3, C4 dan C5 berturut-turut untuk minyak adalah 133,2 ; 2663 ; 533,O ; 1.066,O dan 2.132.0 pglml ;
untuk fraksi tak tersabunkan 9,6 ; 19,2 ; 38,4 ; 76,8 dan 153,6 pglml ;
untuk oryzanol2,4 ; 4,7 ; 9,4 ; 18,8 dan 37,7 pglml. Pada uji aktivitas antioksidan menggunakan isolat LDL dan VLDL, mula-mula dilakukan pemisahan plasma dari darah ssgar.
Plasma tnasing-masing 8 ml
dima~sukkanke dalam 6 buah tabung reaksi, lalu disuplementasi dengan 100 pI
ekstrak uji dan tween 20 sebesar 1 %. Plasma yang telah disuplementasi ekstrak diinkubasi pada 37 O C 3 jam dan setelah itu siap diisolasi untuk mendapatkan LDL dan VLDL. Pada uji menggunakan sel limfosit, suplementasi dilakukan dengan menambahkan sampel sebanyak 25 pl ke dalam 175 pl kultur limfosit . 4. Krrrakhristik Darah Psngambilan darah segar dan penuukuran profil darah serta urln
-
Dfarahsegar untuk uji aktivitas antioksidan pada PVLDL dan LDL diperoleh dari seorang laki-laki dewasa sehat yang telah berpuasa 12 jam sebelumnya (8uzukawa et a/. 1994; Septiana, 2001).
- Darah dan urin dianalisis profil glukosa; darah dianalisis profil kolesterol dan trigliserida. Semua analisis dilakukan di klinik uji.
- Satu jam setelah analisis profil darah, dilakukan pengambilan darah kembali sebanyak 150 ml untuk uji aktivitas antioksidan menggunakan syringe steril dan jarum berukuran 21 G oleh dokter di PMI Bogor. Darah segar ditambahkan NaCl 0,9 %-EDTA 5 % agar tidak menggumpal. Darah disentrifuse 2700 rpm 30 menit 4°C. Plasma darah dipisahkan dan kemudian akan dipakai dalam isolasi VLDL dan LDL (Lampiran 28).
- Darah segar untuk uji aktivitas antioksidan pada sel limfosit diperoleh dari seorang perempuan dewasa sehat yang dilakukan oleh staf peneliti di lab. lmunologi US Namru 2, Jakarta.
- Pengambilan darah, isolasi dan persiapan suspensi limfosit dilakukan sesuai dengan metode Immunology Series No. 8-Procedural Guide (1978).
5. Persiapan Pengujian Aktivitas Antioksidan dengan P-VLDL dan LDL
manusia a. lsolasi PVLDL dan LDL manusia (Sulistiyani dan St. Clair, 1991) Ke dalam masing-masing plasma yang telah disuplementasi berbagai ekstrak dan d~iinkubasipada 37 OC 3 jam (Tahap 3) ditambahkan 5 ml NaCl0,9 % - EDTA 0,01 '% (wlv). Contoh disentrifuse 36.000 rpm 4°C 20 jam. Fraksi PVLDL berada pada bagian atas tabung, sedangkan fraksi LDL dan HDL berada di lapisan lebih bawah. Fraksi PVLDL diambil setelah tabung polialo.mer dipotong dengan pisau pada bagian batas bawah. Tabung contoh tanpa fraksi PVLDL dipindahkan pada tabunlg berskala sehingga dapat diketahui volumenya dan ditambahkan bubuk KBr 0,1109 glml larutan sampel. sampai terlarut seluruhnya. Larutan dipipet 9 ml ke tabung ultrasentrifuse polialomer yang baru dan ditambahkan 4 ml larutan KBr yang mengandung 0,9 % NaCl dan 0,01 % EDTA. Larutan disentrifuse 36.000 rpm 24 jam. Fraksi LDL berada pada bagian atas tabung, sedangkan fraksi HDL berada di lapisan bawah. Fraksi LDL diambil setelah tabung polialomer dipotong dengan pisau~pada bagian batas bawah. Masing-masing fraksi LDL yang didapat kemudian dimasukkan ke dalam kantilng dialisis yang berbeda-beda.
Lalu setiap kantung dialisis diikat dan
ditempelkan pada mulut gelas beaker ukuran 2 L. Ke dalam gelas beaker dituang
-
larutan dialisis I yaitu NaCl 0,9 % EDTA 0,01 % pH 7,4 sebanyak 2 liter. Gelas beaker yang berisi fraksi LDL dan larutan dialisis disimpan ke dalam refrigerator suhu 4°C sambil diaduk dengan magnetik stirer. Larutan dialisis diganti setiap 6 jam. Dialisis ini dilakukan 72 jam. Selanjutnya contoh diambil dengan syringe untuk disaring dengan membran milipore 0,45 pm. Contoh yang telah disaring
90
diambil secukupnya dan dimasukkan ke dalam vial untuk analisis kadar protein dengan menggunakan metode Lowry et a/. (1951). Sisa contoh dimasukkan ke dalarri kantung dialisis yang baru. Kantung dialisis yang berisi contoh didialisis kembali dengan larutan dialisis II y,aitu NaCl 0,9 % - NaHC03 1 mM pH 7,4 pada suhu 4°C 72 jam. Selama proses isolasi LDL ini diupayakan kondisi di bawah gas nitrogen dan dalam keadaan gelap. lsolat LDL yang diperoleh dianalisis kadar protein dengan metode Lowry et a/.
-
(1951) dan diencerkan dengan larutan NaCl9 % 1 mM NaHC03pH 7.4 sehingga isolat LDL mengandung protein 200 pg protein. lsolat V L D L dan LDL ini siap untuk dianalisis kadar malonaldehid (MDA). Rancangan percobaan adalah rancangan acak lengkap, untuk percobaan menggunakan isolat LDLIEVLDL. Rancangan percobaan adalah rancangan acak lengkap. Data diolah menggunakan program SAS. b. Pangukuran Kadar Protein PVLDL dan LDL Manusia (Metode Lowry et a/. 1951)
Pereaksi-pereaksiyang perlu dipersiapkan untuk analisis protein ini: 1. Pereaksi A: 2 % Na2C03dalam 0,l % NaOH (5 g Na2C03 & I g NaOH) dilarutkan dalarrr 250 ml air bebas ion).
Reagen ini disimpan di dalam
refrigerator. 2. Pereaksi 6: 0,5 % CuS04, 5 H20 dalam 1% kalium tartrat (2 rnl stok 1 % C;uSQ4, 5 H20 ditambah 2 ml stok 2 % kalium tartrat dalam wadah reagen C). Ciampuran ini dibuat segar setiap kali melakukan analisis. 3. Pereaksi C. 200 ml pereaksi A di tambah 4 ml pereaksi B. 4. F'ereaksi Folin Ciocalteau: pereaksi folin ditambah air bebas ion dengan perbandingan 1:1.
5. Larutan 0,9 % NaCl0,OI % EDTA PH 7,4 (9 g NaCl dan 0,l g EDTA dilarutkan dalarn 1 liter air bebas ion dan pH diatur rnenjadi 7,4). 6. Larutan standar Bouvine Serum Albumin (BSA) 1 rnglrnl: 25 rng BSA dilarutkan dengan NaCl0,9 % EDTA 0,01 % s.d. 25 rnl.
7. Larutan blanko: 0,5 rnl larutan NaCl0,9 % EDTA 0,01 % pH 7,4. Larutan standar protein dibuat dengan rnernipet sebanyak 0,25; 0,5; 1; 1 5 ; 2; 3; 4; 5 dan 6 rnl larutan standar BSA 1 rnglrnl ke dalarn labu ukur 25 rnl. Selanjutnya ditarnbahkan dengan 0,9 % NaCl 0,01 % EDTA 25 rnl. Jadi masingrnasirlg larutan tersebut rnengandung 2,5; 5; 10; 15; 20; 30; 40; 50 dan 60 pg BSAl250 pI. Sarnpel LDL yang dianalisis dipersiapkan dengan rnernipet 20 pI sarnpel ke dalarn tabung reaksi, kernudian diencerkan dengan larutan 0,9 % NaCl 0,01 '% EDTA hingga volume rnenjadi 0,5 rnl. Sebanyak 0,5 rnl sarnpel atau standar dlipipet ke dalarn tabung reaksi. Setiap tabun~gditarnbah dengan 2 rnl pereaksi C, kernudian divorteks dan didiarnkan selarna 10 rnenit. Masing-masing tabung ditarnbah 0,2 rnl pereaksi Folin Ciocalteau, divorteks dan didiaarnkan selarna 1 jam. Selanjutnya larutan sarnpel atau standar dibaca absorbansinya pada h 700 nrn. Hasil pernbacaan absorbansi standar kemudian diplotkan dalarn kurva standlar antara nilai absorbansi dengan konsentrasi protein. Persarnaan kurva standar digunakan untuk rnenentukan kadar protein yang terdapat pada sarnpel LDL.
Berdasarkan kadar protein LDL yang diperoleh dilakukan pengenceraan
terhadap sarnpel LDL sehingga kandungan protein rnenjadi sebesar 200 pg protein per nil (Hirano et a/. 1997). Pengenceran LDL: 0,9 % NaCl 1rnM NaHC03 pH 7,4.
c. Pengujian Aktivitas Antioksidan dengan Isslat P-VLDL dan LDL
Pengujian aktivitas antioksidan
dengan
lsolat p-VLDL dan
LDL
menggunakan pengukuran kadar MDA.
Pengwkuran Kadar Malonaldehld (MDA) (Sutanto, 1996; Conti et a/. 1991). Contoh P-VLDL dan LDL (volume total LDL dan CU'* adalah 1 ml) dipindlahkan ke dalam tabung reaksi dengan konsentrasi 200 pg proteinlml dalam larutan 0,9 % NaCI-1 mM NaHC03 pH 7,4.
lsolat W L D L dan LDL dioksidasi
sesuai dengan prosedur Sutanto (1996) yaitu dengan CuS04 5 pM. Stok cu2' dari CuSCI4 dibuat dengan konsentrasi 0,5 mM dengan menggunakan pelarut 0,9% NaCI -1 mM NaHC03pH 7,4. Sebanyak 10 pI CU'~0,5 mM ditambahkan ke dalam isolat sehingga konsentrasi akhir CuS04 adalah 5 pM. Setelah semua tabung diisi, kemudian dimasukkan ke dalam penangas air bersuhu 37°C selama 4 jam untuk proses oksidasi. Reaksi oksidasi dihentikan dengan menambahkan EDTA sehingga konsentrasi final 100 pM. Setelah proses oksidasi selesai sampel dianalisis kadar MDA-nya menggunakan spektrofluorometer (Conti et a/. 1991). Persiapan standar Buffer fosfat
: Dilarutkan 10,2 g KH2P04(BM = 136'09 glrnol) dalam air bebas ion
.+
1 liter (75 mmolll).
Kemudian ditambahkan asam fosfat
sampai pH 3. Pereaksi TBA : Dilarutkan 1,4415 g TBA (= 10 mmol, BM TABA = 144,15 glmol) dalam 1 liter buffer fosfat (75 mmolll, pH 3). Larutan induk : Dilarutkan 30 p1 1,1,3,3 tetraetoksipropana (TEP) dengan air bebas ion hingga volumenya menjadi 50 m1(2,5 mmolll). Larutan ini disimpan pada suhu dingin pada tempat yang gelap.
9.
93
Larutan kerja
: Larutan induk sebanyak 50 pl lalu diencerkan sampai volumenya 5 ml (100 x), dari larutan ini diambil 1 ml lalu diencerkan sampai 5 ml (5 x ) sehingga konsentraasi menjadi 5 fl
Larutan standar : Dibuzt satu seri standar dengan mengencerkan larutan kerja menggunakan air bebas ion dengan komposisi sebagai berikut:
i
Sebanyak 50 pl sampel maupun standar, 1 ml TBA (10 mmol dalam 75 mmoWl buffer fosfat) divorteks 5 detik. Kemudian diinkubasi pada 95 OC dalam penangas air 60 menit, didinginkan 5 menit. Ditambahkan 5 ml butanol, lalu divorteks 1 menit, disentrifus 4000 rpm 10 menit. Fase bagian atas diambil, lalu diukur dengan spektrofluorometer pada h eksitasi 515 nm dan h emisi 553 nm. Pengukuran sampel dilakukan triplo. Perhntungan
: Konsentrasi MDA sampel (prnol/) = A x 20.000 A = konsentrasi sampel dalam pmolI5Opl
6. Persiapan Pengujian Aktivitas Antioksidan dengan Limfosit
Tujuan penelitian ini adalah untuk mempelajari efek proteksi fraksi minyak bekatul awet terhadap aktivitas proliferasi limfosit pada dua kondisi kultur (tanpla dan dengan stres oksidatif) secara in vitro. a. Persiapan media cuci, media tumbuh, la~rutanPHA dan HzOz
-
Serum-Free Medium untuk pencucian sel dibuat dengan RPMI-1640 bubuk, aqua bidestilata steril, NaHC03 dan gentamisin.
Media komplit untuk
pertumbuhan dan pemeliharaan dibuat dengan menggunakan media di atas
dengan penambahan 10 % serum janin sapi (SJS). Campuran larutan tersebut disterilisasi dengan filter 0,22 pm.
-
konsentrasi mitogen PHA yang diguna~kanpada kultur limfosit : Konsentrasi PHA = 5 pg Iml = 1 pg I175 pL (volume sumur) Stock PHA = 100 pg Iml. Isi 10 pI PHA = 10 11000 x 100 pg
1 ug.
b. lsolasi dan Kultur Limfosit Manusia
- Darah di dalam vacutainerdisentrifuse 1500-2000 rpm 10 menit 27°C.
Kemu-
dian lapisan bumcoat diisolasi dan dicampur media RPMI, sebelum dilewatkan di atas ficoll-hypaque kemudian disentrifuse 1500 rpm 30 menit 27 O C .
- Pencucian
limfosit dilakukan dengan sentrifuse suspensi sel yang telah
dicampur lagi dengan media RPMl1640 pada 1000 rpm 7 menit sebanyak dua kali. Suspensi sel yang didapat mengandung kemurnian sel limfosit yang tinggi dan jumlah sel hidup > 95 % sehingga siap dikulturkan.
- Penghitungan sel menggunakan hemasitometer, dan mikroskop perbesaran 100 x, dibantu dengan pewarna biru trifan. Perbandingan volume suspensi sel dengan biru trifan adalah 1:l (10 pl suspensi sel ditambahkan dengan 10 pI biru trifan).
Set mati bewarna biru, sedangkan sel hidup jernih.
Rumus
penentuan jumlah sel dalam setiap ml suspensi dari hasil perhitungan pada dua bidang pandang adalah sebagai berikut : Jumlah sel per mililiter = XI2 x 2 x 10 XI2
= rata-rata jumlah sel terhitung dari dua bidang pandang
2
= faktor pengenceran oleh penambahan 10 pl biru trifan pada 10 pl suspensi sel
10
= 1 ml per kapasitas hemasitometer, yaitu 10 -4 ml
95
- Jumlah
sel limfosit ditepatkan 2,3 x 10' sellml dengan media tumbuh.
!3ebanyak 100 pl suspensi sel dimasukkan ke dalam lempeng mikrokultur dasar datar 96 sumur. Kemudian ditambahkan PHA 10 pi, H202 pi, RPMl yang rnengandung SJS 12,l % (konsentrai akhir 10 %) dan ekstrak yaitu minyak bekatul, fraksi tak tersabunkan dan oryzanol sebanyak 25 pi sehingga volume total di sumur adalah 175 pi.
Kultur diinkubasi pada inkubator 37OC, 5 %
GO2RH 90 % 5 hari. 7. Penentuan Kondisi Kultur Sel Limfosit a.
Penentuan Lama lnkubasi Kultur Sel Limfosit
-
Kultur sesuai 4b dengan kondisi tanpa dan dengan H202, konsentrasi H202 6x
lom2m~
- Pada inkubasi kultur hari ke 0, 2 dan 5 jumlah sel limfosit hidup dan mati dihitung dengan metode biru trifan. b. Penentuan Konsentrasi HIOz yang Toksik untuk Kultur Limfosit
- Konsentrasi H202 : 0; 0,06 ; 0,3 ; 1; 3 dan 10 mM di dalam aquabidest steril. - Stok larutan Hz02 selalu dibuat segar, 10 pl ditarnbahkan ke kultur (Lampiran 29).
- Kultur sesuai 4b. Setiap perlakuan dicoba tiga kali ulangan. - Penghitungan jumlah sel yang hidup diukur menggunakan metode 0
MTT
(Coligan et a/. 1992), yaitu : Enam jam sebelum masa inkubasi berakhir kultur ditambahkan 10 pl larutan
MTT 0,5 % (dilarutkan dalam PBS). Setelah masa inkubasi berakhir 100 pl HCI 0,04 N di dalam isopropanol ditambahkan pada setiap sumur. Kemudian absorbansi masing-masing sumur diukur dengan Elisa Reader pada h 570 nm.
Konsentrasi H202yang toksik untuk kultur limfosit ditentukan dari perhitungan lndeks Stimulasi (IS) dergan rumus : IS =
OD vann distimulasi dennan ekstrak OD pada kontrol
Rancangan acak lengkap dengan perlakuan konsentrasi H202. 4
c. Penentuan Waktu Suplementasi Ekstrak Uji pada Kultur Stres Oksidatif
- Suspensi sel disuplementasi dengan fraksi tak tersabunkan (konsentrasi akhir di kultur C4 = 76,8 pglml) lalu diinkubasi selama 0, 10, 20, 30, 40, 50 dan 60 menit sebelum ditambahkan H20252,5 mM sebanyak 10 pI.
-
Selanjutnya kultur sel limfosit dilakukan sama dengan 4b. Pengukuran dan perhitungan IS sama dengan 5b.
-
Rancangan percobaan rancangan acak lengkap dengan perlakuan waktu suplementasi ekstrak uji. Setiap perlakuan dicoba tiga kali ulangan.
8. Uji Aktivitas Antioksidan Minyak Bekatul dan Fraksinya pada bimfosit
-
ktultur limfosit sama dengan 4b dimana volume ektrak uji 25
CJ.
Ekstrak uji
yang dicoba adalah minyak, tak tersabunkan dan oryzanol pada konsentrasi bertahap (lihat bagian C3 di atas). Volurne total kultur 175 pl. Kultur dibuat dengan dan tanpa H202.
-
F'engukuran dan perhitungan IS sama dengan 5a.
Perhitungan Kapasitas Relatif :
Dihitung dengan membandingkan hasil masing-masing parameter dari mlnyak dan fraksi tak tersabunkan terhadap oryzanol dan rendemen minyak dan fraksi tak tersabunkan terhadap rendemen oryzanol.
Parameter yang dimaksud dalam penelitian ini adalah aktivitas antioksidan yarlg ditunjukkan oleh hasil pengukuran kandungan MDA pada isolat LDL dan VLDL, sehingga rumus perhitungan Kapasitas relatif di atas menjadi sebagai berikut ; Perhitungan Kapasitas Relatif untuk Aktivitas Antioksidan (MDA) :
= (rasio pengurangan kadar MDA perlakwan dengan oryzanol bekatul padi IR 64 5,2 pglml plasma) x (rasio rendemen perlakuan dengan oryzanol bekatul padi IR-64 5,2 pglml plasma). di mana : % pengurangan kadar MDA = ( [ I MDA ekstrak
- [IMDA kontrol) x 100 %.
Untuk perhitungan kapasitas relati pada uji menggunakan isolat LDWLDL oryzanol bekatul padi IR-64 5,2 pglml plasma sebagai patokan.
-
Rancangan acak lengkap faktorial dilakukan dengan tiga kali ulangan. Data absorbansi diolah dengan pendekatan persamaan regresi dengan program SAS.
D. HASlL PENELlTlAN DAN PEMBAHASAN
Konsentrasi minyak dan fraksinya yang digunakan dalam penelitian ini didasarkan minuman model. Penelitian poduk pangan yang terbuat dari bekatul kebamyakan dalam bentuk subsitusi pada kukis atau kue. Di samping itu, produk pangan kesehatan yang paling populer adalah minuman (Goldberg, 1994). Oleh karerta itu dalam penelitian ini digunakan minuman bekatul sebagai model. Model dibuat dengan menggunakan kriteria perkiraan keenceran cairan secara kualitatif dan subjektif, yaitu cairan tidak terlalu kental. Dari model ini diperoleh bahwa 12-14 g di dalam 220 ml cairan (1 gelas) merupakan komposisi yang cukup keencerannya. Penelitian ini berupaya untuk mendekatkan ke aplikasi sehari-hari,
I
I
yaitu pada banyaknya bekatul yang terdapat dalam segelas minuman kesehatan yang diminum sehari. Rendemen ektraksi minyak dan fraksinya, serta konsentrasi masing-masing bahan uji untuk yang setara dengan konsumsi per hari dapat dilihat pada Tabel 5. Jumlah bekatul pada pengujian dengan VLDULDL 14 g, sedangkan pada limfosit sebanyak 11,6 g. Tabell 5. Rendemen ektrak minyak bekatul dan fraksinya, serta konsentrasi masingmasing bahan uji
X
Sampel
Rendemen (%)
d lsolat VLDULDL 1 13,72 % dari bekatul Minyak 7,20 % dari minyak Tak tersabunkan atau 0,95 % dari bekatul Oryzanol 1,7 % dari minyak
C2 (mglml) [ ] di sampel
I
24,68 1,86
d limfosit : Minyak Tak tersabunkan Oryzanol
1
13,22 % dari bekatul 7,20 % dari minyak atau 0,95 % dari bekatul 1,7 % dari minyak atau 0,22 % dari bekatul
I
I ] di Plasma 309,OO 22,20 5,24
0,42
a
C2 (~r91mI)
I
[ I di Sumur 1,87
266,50
I I-C2 : k.onsentrasisampelIyang setara dengan yang minuman bekatul model sehari C1, C3, C4, C5 = (IM,2 , 4 , 8 ) x C2
lsolasi PVLDLILDL dilakukan berdasarkan perbedaan berat jenis inenggunakan ultrasentrifus. Pada pemisahan pertama penambahan NaCl0,9 %
-
EDTA 0,01 % (wlv) ke dalam plasma bertujuan sebagai larutan pemisah densitas. Fraksi PVLDL yang berdensitas antara 0,96-1,006 glrnl akan berada pada bagian atas tabung yang tampak berupa larutan keruh (berawan), sedangkan fraksi LDL dan HDL (densitasnya > 1,006 glrnl) berada di lapisan lebih bawah yang jernih. Penambahan bubuk KBr ke dalarn tabung contoh tanpa fraksi PVLDL akan menghasilkan larutan berberat jenis 1,080.
Pada pemisahan kedua larutan
pemisah densitas yang digunakan KBr dengan berat jenis 1,603 glrnl sehingga
setelah ultrasentrifuse akan diperoleh fraksi LDL berdensitas < 1,063 glml berada pada bagian atas tabung, sedangkan fraksi HDL (densitasnya > 1,125 glml) berada U
di lapisan bawah. Pada dialisis fraksi PVLDL tidak digunakan larutan dialisis NaCl 0,9 %EDTA 0,01% pH 7,4 karena fraksi WLDL tidak mengandung KBr. Sebaliknya pada dialisis fraksi LDL digunakan larutan dialisis NaCl0,9 %-EDTA 0,01% pH 7,4 karena fraksi WLDL mengandung KBr. Fraksi WLDL dan LDL sama-sama didialisis menggunakan larutan NaCl 0,9 %-NaHC03 1 mM pH 7,4 dengan tujuan menghilangkan reagen pengkelat EDTA. Keberadaan EDTA pada isolat akan mengganggu analisis MDA yang menggunakam CuS0, sebagai prooksidan. Modifikasi LDL dalam penelitian ini diinduksi oleh Cu. Pada konsentrasi akhir 5 pM, Cu telah mampu mengkatalisis oksidasi setara dengan konsentrasi yang lebih tinggi (Moon dan Terao, 1998; Sutanto, 1996). Zat lain yang dapat digunakan adalah 4-hydroxynonenal (HNE) yang merupakan produk propagasi yang terbentuk selama peroksidasi lipid, dengan konsentrasi sampai 7,5 mM (Hoff eta/. 1989) atau 2,2' azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride (Xu et al. 2001). Antioksidan ciapat berperan dalam melindungi lipoprotein densitas rendah (LDL) dan sangat rendah (PVLDL) dari reaksi oksidasi. Asam kafeat dan asam dehidrokafeat sama-sama berpengaruh dalam melindungi oksidasi LDL, namun ikatan rangkap 2,3 pada asam kafeat mempengaruhi aktivitas antioksidan tergantung pada lingkungan tejadinya oksidasi (Moon dan Terao, 1998). Komponen antioksidan di dalam bekatul, selain tokoferol adalah oryzanol. Total oryzanol telah diketahui terdiri atas 5 senyawa (Diack dan Saska, 1994), bahkan 10 senyawa saat ini (Xu dan Godber, 1999). Xu et a1 (2001) menyatakan bahwa
masing-masing jenis oryzanol menunjukkan aktivitas antioksidan yang berbeda-beda secaria nyata. Aktivitas antioksidan paling tinggi adalah 24-methylenecycloartanyl ferulate. Efek penurunan kolesterol pada plasma secara in vivo telah pula dilakukan dengan menggunakan tepung bekatul, minyak bekatul, fraksi tak tersabunkan dan oryzanol (Kahlon et a/. 1996, Seetharamaiah dan Chandrasekhara, 1993). Oryzanol berada pada fraksi tak tersabunkan dari minyak bekatul sehingga perlu diketahui bagaimana pengaruh minyak dan fraksinya dalam menghambat oksidasi LDL dan VLDL plasma. 1. Profil Lipid Responden
Profil lipid responden perlu dianalisis untuk memberikan gambaran status kesehatan responden, khususnya potensi menderita penyakit atherosklerosis. Kadar glukosa di darah orang yang dipuasakan, kadar glukosa di urin orang yang di puasakan, kadar kolesterol total, kolesterol LDL, kolesterol HDL dan trigliserida resoponden terlihat pada Tabel 6. Analisis kimia terhadap lipid tersebut dilakukan 1 jam sebelum isolasi darah yang digunakan untuk isolasi LDL.
Tabel 6
memperlihatkan bahwa glukosa puasa, glukosa urine puasa, kolesterol total, koleslterol LDL dan trigliserida normal, sedangkan kolesterol HDL di bawah nilai rujukan. AHA (2002) menyatakan bahwa kolesterol HDL di bawah 40 mgIdL merupakan faktor resiko utama penyakit jantung. Namun darah ini dapat digunakan dalarn penelitian karena kolesterol LDL dan total dalam batas normal. lnkubasi sampel ke plasma mengikuti metode Esterbauer et a/. (1991), Suzukawa et a/. (1994), Septiana (2001). Setelah itu plasma baru diisolasi LDL-nya. Romanchik et a/. (1995) melaporkan bahwa distribusi karotenoid dan a-tokoferol,
*.
Tabel 6. Profil da'rah responden Pemeriksaan
I
Hasil
I
Nilai Ruiukan I Nilai Normal I Keterangan (mgldl) (mg/bl) Pengeldaan DM : 70-100 80-109 : Baik 110-139 : Sedang >I40 : Buruk Glukosa Darah Puasa (GDP)Terganggubila: 110 <=GDP<126 dan GTT 2 jam : 4 4 0 Konsensw DM
Kadar glukosa di darah orang yang dipuasakan
85
Kadar glukosa di urin orang yang dipuasakan
Negatif
Negatif
154 104 36 68
< 200 < 130 >= 45 <200
-
Konsensus Lipid
I
Kolesterol Total Kolesterol LDL Kolesterol HDL Trigliserida
150-200 0-150 26-63 40-160
Konsensus Lipid Konsensus Lipid Konsensus Lipid Konsensus Lipid
-
Sumber: Hasil pemeriksaan di Laboratorium Klinik Bogor Prodia 14 Agustus 2001 0
suatu zat antioksidan gizi yatlg suka lemak dipengaruhi oleh relatifitas polaritas dari antioksidan tersebut. Pada suplementasi plasma dengan a-tokoferol maka diketahui a-tokoferol tersebar berikatan dengan LDL, HDL dan VLDL sebanyak 43 %, 26 % dan :27 %. Oleh karena itu pada sampel yang disuplementasi ke plasma lebih mendekati keadaan secara in vivo dibandingkan jika sample disuplementasi pada isolat lipoprotein.
-
2. Lipoprotein Densitas Sangat Rendah (P VLDL) a. Kadar Protein
Apoprotein beragam di dalam struktur dan fungsinya pada binatang yang berbeda. Protein ini dibentuk di dalam hati. Fungsi utama semua apoprotein adalah untuk mengikat dan transpor lipid di dalam darah. Apoprotein B-100 merupakan
protein dominan yang terdapat pada P - VLDL. Apo B-100 sangat tidak larut dan membentuk agregat di dalam air. Apo 8-100 bersifat unik karena menunjukkan kandungan yang tinggi akan p-sheet. Apo 8-100 dan apo E merupakan molekul pengenal untuk reseptor membran khusus (seperti reseptor LDL) yang terletak pada perm~ukaanmembran plasma sel yang mengambil dan menggunakan lipoprotein (Marinetti, 1990). Setiap molekul LDL mengandung satu molekul apoprotein 8-100 yang mencakup 11 % dari total massa LDL. Apoprotein B-100 mengandung 4563 residu asam amino dan mempunyai berat molekul 514.000. Selain itu apo B-100 juga mengandung 8-10 % karbohidrat (Marinetti, 1990). Tujuan analisis kadar protein pada
P - VLDL maupun LDL adalah untuk
P - VLDL
dan LDL untuk analisis selanjutnya.
menyleragamkan jumlah partikel
Meskipun darah yang digunakan untuk penelitian ini berasal dari satu responden lelaki yang sehat, tetapi kadar protein p - VLDL dan LDL yang diperoleh benrariasi. Kadar protein berkisar antara 1.480- 2.189 pglml (Gambar 20 dan Lampiran 30). 3,000
1
O'C3
K
M
T
OC2
Mlnyak Bekatul dan tmkslnya
OC3
K=kontrd + Cu, O'C3= oryzanol standar 10,4 Clglml plasma , T= tak tersabunkan 22,2 pg/ml plasma, OC2 = oryzanol IR-64 5,2 @ml plasma, OC3 = oryzanol IR-64 10,4 puml plasma
-
Gambar 20. Kadar protein P VLDL plasma darah manusia yang disuplementasi dengan minyak bekatul dan fraksinya
--
103 I
Hasil sidik ragam (ct=0,05) menunjukkan bahwa perlakuan pemberian minyak beka1:ul dan fraksinya berpengaruh sangat nyata terhadap kadar protein W L D L (Lampiran 31).
lsolat W L D L dengan perlakuan oryzanol standar 10,4 pglml
plasma, minyak 309 pglml plasma, ta k tersabunkan 22,2 pglml plasma, oryzanol IR-64 5,2 pglml plasma dan oryzanol IR-64 10,4 pglml memiliki kadar protein
p - Vl-DL yang lebih rendah secara nyata bila dibandingkan dengan kontrol (a=0,05) (Lampiran 31a). Kandungan protein p - VLDL yang disuplementasi lebih rendah dibandingkan kontrol (tanpa suplementasi). Keragaman kadar protein pada PVLDL ini b
kemu~ngkinandisebabkan oleh pengenceran selama menggunakan larutan NaCl0,9 %
-
proses dialisis dengan
NaHCOs 1 mM pH 7,4.
Modifikasi apoprotein 8-100 terjadi melalui reaksi produk peroksidasi lipid (aldehid reaktif) dengan asam amino penyusun domain protein yang terlibat pada pengikatan ke reseptor LDL. Residu lisin merupakan komponen penting dari domain ini dan siap bereaksi dengan aldehid. Residu lisin menyumbangkan muatan positif pada protein, reaksi dengan aldehid menghapus muatan positi ini dan membuat muatan protein net negatif dalam domain ini. Hal ini menyebabkan partikel bersifat elektronegatif. Penghilangan sekitar 20 % group lisin sudah cukup untuk merubah domain pengikatan sehingga tidak mengenal reseptor LDL. Partikel ini dapat diikat oleh reseptor scavenger yang mempunyai afinitas yang tinggi terhadap molekul dan partihrel bermuatan negatif (Sevanian dan Bolger, 1996). Senyawa oksigen reaktif akan mengoksidasi secara umum, yaitu lemak atau protein dan DNA. Kelebihan uji aktivitas antioksidan menggunakan isolat PVLDL dan I-DL adalah mempelajari aktivitas antioksidan minyak dan fraksinya terhadap
semua komponen yang menyusun LDL dan W L D L , yang akan dirusak oleh radikal bebas yaitu lemak dan protein. Kerusakan semua komponen ini dapat berbahaya bagi kesehatan tubuh (Halliwell dan Aruoma, 1997). LDL normal bersifat tidak toksik terhadap sel pembuluh darah bahkan pada konsantrasi yang setara pada penderita hiperkolesterolemia. Sebaliknya LDL teroksidasi bersifat toksik. Perlakuan pada sel endotelial manusia dengan 20 pglml LDL- menyebabkan luka akut dan kematian dalam 24 jam. LDL termodifikasi secara
In vivo kurang teroksidasi dibanding in vitm dan juga kurang sitotoksik (Sevanian dan Holger, 1996) . lsolat W L D L yang telah diketahui kadar proteinnya, kemudian dilakukan pengenceran dengan larutan NaCl 0,9 %
- NaHC03 1 mM pH 7,4 sehingga
konsentrasi protein menjadi 200 pglml. PVLDL ini selanjutnya siap dioksidasi dan dilakukan uji aktivitas antioksidan minyak bekatul awet dan fraksinya. b. Penghambatan Pembent~kanMalonaldehid (MDA) Oleh Minyak Bekatul Padi Awet dan Fraksinya
Minyak bekatul, bahan tak tersabunkan dan oryzanol diekstrak dan difraksinasi dari bekatul awet menggunakan khromatografi lapis tipis (KLT). Ekstrak di atas kemudian disuplementasikan pada plasma yang akan diisolasi LDL-nya.
Prosedur suplementasi ekstrak telah dilakwkan oleh Suzukawa et a/. (1994) menggunakan antioksidan a-tokoferol dan Septiana (2001) menggunakan ekstrak jahe. Hasil analisis konsentrasi malonaldehid dari
P - VLDL dapat dilihat pada
Gambar 21, Tabel 7 dan Lampiran 32. Konsentrasi malonaldehida
P - VLDL dari
kontrol, plasma yang mendapat oryzanol standar 10,4 pglml plasma, tak
K=kontrol + Cu. 01C3= oryzanol standar 10,4 pglml plasma, T= tak tersabunkan 22,2 pllml plasma, OC2 = oryzanol IR-64 5,2 pglml, OC3 = oryzanol IR-64 10,4 pglml plasma
Gambar 21. Efek perlindungan fraksi minyak bekatul terhadap pembentukan malonaldehid (MDA) pada oksidasi PVLDL manusia yang disuplementasi dengan minyak bekatul dan fraksinya Tabel 7. Konsentrasi malonaldehid dari WLDL yang disuplementasi minyak bekatul dan fraksinya minyak bekatul di
konsentrasi MDA dari kontroI(%)
Yield Kapasitas relatif (%)
-
-
2. Oryzanol standar 1' 0,4 pglml plasma
0,22
1,21
3. 'rak tersabunkan 22,2 pglml plasma
0,95
6,20
4. Oryzanol IR-64 5,2 pglml plasma
0,22
1
5. Oryzanol IR-64 10,4 pglml plasma
0,22
1,28
1. Kontrol + Cu
tersabunkan 22,2 pglml plasma, oryzanol IR-64 5,2 pglml plasma, oryzanol IR-64 10,4 pglml plasma berturut-turut 6,22; 3,33; 2,76; 3,81 dan 3,14%. Pengurangan kadar malonaldehid dari kontrol berkisar antara 38,75
- 55,63%.
106
Hasil sidik ragam (a = 0.05) menunjukkan bahwa perlakuan pemberian fraksi minya~kbekatul berpengaruh sangat nyata terhadap kadar malonaldehid PVLDL. (Lampiran 33). Malonaldehid EVLDL yang diberi perlakuan oryzanol standar 10,4 ullml plasma, tak tersabunkan 22,2 &ml plasma, oryzanol IR-64 5,2 pglml plasma dan oryzanol IR-64 10,4 pglml plasma memiliki kadar malonaldehid V L D L yang lebih rendah secara nyata bila dibandingkan dengan kontrol (a=0.05). Perlakuan oryzanol standar 10,4 pglml plasma, tak tersabunkan 22,2 Clglml plasma, oryzanol IR-64 5,2 pglml dan oryzanol IR-64 10,4 pglml memiliki kadar malonaldehid VLDL yang sama satu sama lain (a=0,05) (Lampiran 33). Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa penambahan fraksi minyak bekalul pada VLDL dapat mengurangi konsentrasi malonaldehid dari VLDL teroksidasi dibandingkan kontrol. Pemberian fraksi tak tersabunkan dan oryzanol menu~njukkanpengaruh yang tidak berbeda satu dengan lainnya. Atau dengan kata lain bahwa pemberian fraksi minyak bekatul dapat melindungi oksidasi PVLDL. Rendahnya kadar malonaldehid secara nyata pada VLDL yang telah diberi oryzanol standar 10,4 pglml plasma, tak tersabunkan 22,2 pglml plasma, oryzanol IR-64 5,2 pglml plasma, oryzanol IR-64 10,4 Clglml plasma dibanding kontrol, menunjukkan aktivitas antioksidan oryzanol ysng terkandung pada semua sampel tersebut dari oksidasi yang diawali oleh Cu. Xu et a/. (2001) melaporkan bahwa komponen y-oryzanol (cycloartenyl ferulate, 24-methylenecycloartanyl ferulate dan campesteryl ferulate) yang dipurifikasi dari bekatul menunjukkan aktivitas antioksidan yang nyata dalam menghambat oksidasi kolesterol in vitro. Penelitian menggunakan sistem oksidasi kolesterol dipercepat oleh 2, 2'- azobis
(2-
methylpropionamidine) dihydrochloride. Aktivitas antioksidan tertinggi ditemukan
pada cycloartenyl ferulate, 24-methylenecycloiertanyl ferulate, campesteryl ferulate. Ketiga komponen y-oryzanol tersebut mempunyai aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan 4 komponen vitamin E (a-tokoferol, y-tokoferol dan y-tokotrienol). Karena jumlah y-oryzanol lebih tinggi beberapa kali dibanding vitamin E di dalani bekatul maka y-oryzanol merupakan antioksidan yang lebih penting di dalam menurunkan aksidasi kolesterol dibanding vitamin E pada bekatul. Karena itulah mengapa barangkali hasil penelitian ini menunjukkan aktivitas antioksidan baik pada oryzanol saja dan dalam bentuk tak tersabunkan sama. Aktivitas antioksidan dari oryzanol disebabkan oleh group hidroksi fenolik dalam bagian ferulat dari strukturnya (Xu et a/. 2001). fbVLDL mengandung protein 7-10 % dan total lipid 90-93% (Marinetti, 1990). Protein terutama ditemukan dalam bentuk apoprotein B yang mempunyai residu lisin bebas yang mudah teroksidasi oleh prooksidan (CuS04). Apoprotein B adalah protein pada reseptor PVLDL sehingga reaksi oksidasi lisin tersebut akan mengakibatkan sisi penqenal pada PVLDL tidak dikenal oleh sel makrofag. Pada 3khirtnya ha1 ini akan mengarah pada penumpukan sel busa yang menuju ke atherosklerosis (Sevanian dan Bolger, 1996). Kapasitas Relatif aktivitas antioksidan $-VLDL pada suplementasi fraksi tak tersabunkan adalah 6,20 yang berarti 6 kali lebih baik dibandingkan oryzanol sebagai bahan baku fungsional. 3. Lipoprotein Densitas Rendah (LDL)
a. Kadar Protein Kadar protein pada LDL berkisar antara 852,20
- 2734,7 pglml (Gambar 22
dan I-ampiran 34). Kadar protein yang beragam pada LDL ini kemungkinan
Fraksi Minyak Bekatul K:=kontrol+ Cu. O'C3= oryzanol standar 10,4 pg/ml plasma, M= minyak 309 pg lml plasma, T= tak tersabunkan 22,2 pdml plasma, OC2 = oryzanol IR-64 5,2 pglml, OC3 = oryzanol IR-64 10,4 pg/ml plasma
Ganibar 22. Kadar protein LDL plasma darah manusia yang disuplementasi dengan minyak bekatul dan fraksinya
diseblabkan oleh pengenceran selama proses dialisis dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 % EDTA 0,01 % pH 7,4. Tujuan dialisis ini adalah untuk menghilangkan KBr dari sampel yang jika tidak akan menganggu isolasi LDL selanjutnya. LDL yang telah diketahui kadar. proteinnya, kemudian dilakukan pengenceran dengan larutan NaCl0,9 % -NaHC031 mM pH 7,4 sehingga konsentrasi protein menjadi 200 pglml. KBr dari sampel yang jika tidak akan menganggu isolasi LDL selanjutnya. LDL yang telah diketahui kadar proteinnya, kemudian dilakukan pengenceran dengan larutan NaCl0,9 % -NaHC03 1 mM pH 7,4 sehingga konsentrasi protein menjadi 200 pglml. LDL ini selanjutnya siap dioksidasi dan dilakukan uji proteksi i'raksi minyak bekatul pada oksidasi LDL. Hasil sidik ragam (a=0.05) menunjukkan bahwa perlipkuan pemberian minyak bekatul dan fraksinya berpengaruh sangat nyata terhadap kadar protein LDL
(Lampiran 35). LDL yang diberi perlakuan minyak bekatul dan fraksinya semuanya memiliki kadar protein yang sama dengan kontrol (a=0.05), kecuali yang diberi perlakuan oryzanol IR-64 pada konsentrasi 5,2 dan 10,4 pglml plasma (Lampiran 35). Kadar protein yang beragam pada W L D L ini kemungkinan disebabkan oleh pengenceran selama dila kali proses dialisis dengan menggunakan larutan NaCl0,Q% - EDTA 0,01 % dan NaCl0,Q% - NaHC031 mM pH 7,4. Dialisis pertarna bertujuan untuk
menghilangkan
KBr,
sedangkan
kedua
untuk
menglhilangkan EDTA. lsolat LDL yang telah diketahui kadar proteinnya, kemudian dilakukan pengenceran dengan larutan NaCl0,9 % -NaHC03 1 mM pH 7,4 sehingga konsentrasi protein menjadi 200 pglml. LDL ini selanjutnya siap dioksidasi dan dilakukan uji proteksi fraksi minyak bekatul pada oksidasi LDL.
b. Pernghambatan Pembentukan Malonaldehid Oleh Minyak Bekatul Padi Awet dan Fraksinya Hasil analisis konsentrasi malonaldehid dari LDL yang oksidasinya dilakukan menggunakan logam Cu dapat dilihat pada Gambar 23, Tabel 8 dan Lampiran 36.
M
T
Fraksi Minyak ~ekatul K=k.ontrol+ Cu. O'C3= oryzanol standar 10,4 ullml plasma, M=minyak 309 d m 1 plasma, T= tak tersabunkan 22,2 pg/ml plasma, OC2 = oryzanol IR-64 5,2 pglml, OC3 = oryzanol IR-64 10,4 Clglml plasma
Gambar 23. Efek perlindungan fraksi minyak bekatul terhadap pembentukan malonaldehid (MDA) pada oksidasi LDL manusia yang disuplementasi dengan minyak bekatul dan fraksinya
Tabel 8. Konsentrasi malonaldehid dari LDL yang disuplementasi minyak bekatul dan frakfsinya ~lConsentrasi ~raksi minyak bekatul di sampel
CI
1. Kontrol + Cu
1
1
Konsentrasi MDA (pmol MDAlg protein) 2 SDV
22,44 20.31
I
1
Penauranaan I Yield k o n s e h a s i h ~ ~ (%) dari kontrol (%)
-
1 Kamsitas ;elatif
I
1 - 1
-
0.22
1,32
1
2. Oryzanol standar 1' 0,40 pglml plasma
13,24 2 0,57
41.00
3. Minyak 309 pglml plasma
17,99 2 0,46
19,83
13,2
3,88
4. Tak tersabunkan %2,2pglml plasma
19,12 2 4,65
14,80
0,95
2,09
5. Oryzanol IR-64 5,2 pglml plasma
151512 Ol50
30,88
0,22
1
6. Oryzanol IR-64 10,4 pglml plasma
15,51 2 2,81
30,88
0,22
1
Konsentrasi malonaldehid pada kontrol, oryzanol standar 10,4 pglml plasma, minyak 309 j.~g/ml,tak tersabunkan 22,2 pglml plasma, oryzanol IR-64 5,2 pglml plasma, uryzanol IR-64 10,4 pglml plasma betturut-turut 22,44; 13,24; 17,99; 19,12; 15,51 dan 15,51%. Pengurangan kadar malonaldehid dari kontrol berkisar antara 14,80-41,00%. Pengurangan kadar malonaldehid dari kontrol terjadi pada LDL yang terendah adalah yang diberi perlakuan tak tersabunkan 22,2 pglml plasma. Hasil sidik ragam ( ~ ~ 0 . 0menunjukkan 5) bahwa perlakuan konsentrasi fraksi minyak bekatul di sample berpengaruh sangat nyata terhadap kadar malonaldehid LDL (Lampiran 37). Malonaldehid LDL yang diberi perlakuan oryzanol standar 10,4 pglml plasma, minyak 309 pglml plasma, oryzanol IR-64 5,2 pglml plasma dan oryzanol IR-64 10,4 pglml plasma memiliki kadar malonaldehid LDL yang lebih
111
rendah secara nyata bila dit andingkan dengan kontrol, sedangkan rnalonaldehid LDL kontrol dan rnalonaldehid yang diberi perlakuan tak tersabunkan 22,2 pglml plasrrla memiliki kadar rnalonaldehid yang sarna (a=0.05). Malonaldehid LDL yang diberi perlakuan oryzanol standar 10,4 pglrnl plasma, oryzanol :R-64 5,2 pglml plasma dan oryzanol IR-64 10,4 pglrnl plasma rnerniliki kadar malonaldehid LDL yang sarna satu sarna lain (a=0.05). Sedangkan rnalonaldehid pada tak tersabunkan dlengan rninyak tidak berbeda nyata (Larnpiran 37). Hasil penelitian rnenunjukkan bahwa sernua fraksi rninyak bekatul dapat rnenglharnbat oksidasi LDL narnun dengan kernarnpuan yang tidak sarna. Kernampuan pengharnbatan ini paling besar ditunjukkan oleh fraksi y-oryzanol yang telah disernipurifikasi dari bahan tak tersabunkan.
Kemarnpuan antioksidan
tarnpaknya lebih efektif jika dalam keadaan rnurni dibandingkan dalarn bentuk tak tersabunkan atau rninyak dalarn konsentrasi oryzanol yang sarna. Hal ini rnungkin pada bentuk rninyak rnalonaldehid dapat pula berasal dari rninyak bekatul yang rusak:, sedangkan pada tak tersabunkan kandungan vitamin E yang tinggi dapat juga bersifat sebagai prooksidan. Di samping itu diduga ada komponen lain yang belurn diketahui pada bekatul rnurni yang mempunyai sifat dapat rneningkatkan aktivitas antioksidan. Fuhrrnan et a/. (2000) dan Septiana (2001) melaporkan bahwa konsurnsi ekstr'ak jahe dapat rnenurunkan kolesterol plasma, rnengharnbat oksidasi LDL dan rnengurangi pernbentukan atherosklerosis pada tikus apolipoprotein E-deficien (EO). Pemberian ekstrak jahe pada konsentrasi 2,5 rng/L rnengharnbat perrnulaan peroksidasi lipid LDL selarna 60 rnenit, sedangkan pada 10 rng/L pengharnbatan inisiasi oksidasi LDL yang diinduksi oleh Cu naik rnenjadi 120 rnenit. Pernbentukan
TBAHS (thiobarbituric acid reactive substance) dan peroksida lipid juga dihambat dengan nilai lCsoberturut-turut 5,O dan 5,4 mg1L. Pengukuran penghambatan oksidasi selain dengan mengukur pembentukan hasil oksidasi sekunder, seperti malonaldehid, dapat pula berdasarkan pengukuran fase jag. Fase lag adalah fase sebelum atau mulai terjadinya oksidasi (Hirano, et a/. 1997). Fase lag diperpanjang 2,9 kalinya (38 menjadi 109 menit) dan kecepatan propagasi pada LDL yang disuplementasi menurun 113 dari LDL yang tidak disupllementasi vitamin E (23,2 dan 8,14 nmol diena 1 menit per mg protein) (Suzukawa et al. 1994). Antioksidan pada bekatul dapat bereaksi sebagai scavenger radikal peroksil (ROC)*) dan merupakan scavenger yang kuat terhadap radikal hidroksil (OH*) (Aruama et al. 1997). Mungkin mekanisme reaksi radikal hidroksil (OH*) dan radikal peroksil (ROO*) dengan antioksidan oryzanol mungkin 'mirip dengan a-tokoferol (Schuler, 1990) yaitu sebagai berikut: OH* + AH2
-+
H20 + AH*
ROO* + AH2
+
ROOH +AH*
OH* yang tertangkap antioksidan oryzanol (AH$ diubah menjadi H20 dan ROO* yang tertangkap AH2 diubah menjadi ROOH. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa antioksidan oryzanol pada bekatul dapat digunakan untuk mencegah atau menghambat oksidasi LDL. ~ntioksidanini akan menangkap radikal bebas yang dihasilkan selama tahap propagasi dari lemak atau minyak dengan cara mendonasikan hidrogen sehingga radikal lemak tidak aktif melaksanakan tahap propagasiyang akan menrsak lemak. Kemampuan antioksidan untuk mendonasikan hidrogen mempengaruhi aktivitasnya (Hudson, 1990)
-
-
113
LDL mengandung protein sebanyak 21 % dan lipid 79 % (Marinetti, 1990). Apoprotein 8-100 merupakan protein utama pada LDL yang dapat teroksidasi oleh prooksidan yang digunakan dalam penelitian ini dan oleh radikal bebas dalam prodwk peroksidasi lipid seperti hidroperoksida asam lemak, produk aldehid dari dekornposisi hidroperoksida (Sevanian dan Bolger, 1996). LDL yang termodifikasi oleh oksidasi ini akan bertanggung jawab pada awal mula terjadinya atherosklerosis. Kapasitas relatif protein LDL pada suplementasi minyak 309 pglml paling tinggi (3,88). Hal ini menunjukkan bahwa minyak 4 kali lebih baik digunakan sebagai baha~ibaku fungsional dibandingkan komponen bioaktif yang telah dipurifikasi (oryzanol). Demikian pula fraksi tak tersabunkan (2.09) lebih baik 2 kali dibandingkan oryzanol sebagai bahan baku fungsional. 4. Sel Limfosit
Radikal bebas dan SOR dapat menyerang s6l hidup sehingga mengakibatkan kerusakan sel hidup atau bahkan kematian.
Penelitian
menggunakan sel hidup yang selanjutnya dikulturkan telah banyak dilakukan. i
M (konsentrasi akhir) (Ostrovidov et a/.
2000) atau 3mM
(konsentrasi akhir) (Masuda et a/. 1998).
a. Lama lnkubasi Optimal untuk Kultur Sel Limfosit Manusia Untuk mengetahui waktu inkubasi kultur limfosit yang optimal dilakukan percabaan pendahuluan. Kultur limfosit diberi perlakuan dengan dan tanpa H202 baik pada kultur yang tanpa atau dengan diberi mitogen PHA. Jumlah sel yang hidup dan mati pada hari ke 0,2 dan 5 disajikan pada Gambar 24 dan Lampiran 38.
€4 Kontrd
- Hidup -
Kontrol Mati
- Hidup
DH202
-
H202 Meti
0
2
5
Lama inkubasi (hari)
Gambar 24. Pengaruh waktu inkubasi kultur limfosit terhadap jumlah sel yang hidup dan mati dengan dan tanpa H202 Hasil uji pendahuluan di atas menunjwkkan bahwa jumlah sel limfosit yang hidupl pada keadaan normal (hanya suspensi sel atau dikatakan perlakuan kontrol) menjadi berkurang dengan bertambahnya hari. Hal ini disebabkan pada hari ke 5 jumlah sel yang mati meningkat hampir 7 kalinya dibandingkan pada hari ke 2. Tidak; seperti pada sel kanker yang dapat berploriferasi, sel limfosit dalam keadaan normal tidak dapat berploriferasi, kecuali dalam status blast. Sel yang hidup pada hari Ice 5 adalah 86 %, sedangkan yang mati sebesar 13 %. Terawaki et a/. (1997) menyatakan bahwa Karasurin-A memiliki aktivitas imunosupresif pada respon mitogenik dari splenosit tikus in vitro. Pada uji aktivitas mitogenik proliferasi sel diukur dengan metade MTT. Enam jam sebelum kultur berakhir, 10 pl larutan MTT (10 mg/ml PBS) ditambahkan ke masing-masing sumur
dan sel dilanjutkan kulturnya hingga akhir kultur.
Kultur dihentikan dengan
penambahan 10 % SDS (sodium dodecyl sulfat) ke dalam setiap sumur lalu OD dibaca pada 577 nm menggunakan Model 450
Micro Plate Reader
(Bio-Had, CA,USA). H202yangdigunakan dalam percobaan ini adalah 6 XIO-~ mM. Jumlah sel yang hidup pada hari ke 5 adalah sebesar 61 % (0,6) dan jumlah ini relatif cukup tinggi. Nagano et a/. (1997) menggunakan relatif set yang hidup sebesar 0,6. Oleh karena it11 untuk penelitian selanjutnya masa inkubasi kultur sel limfosit yang digunakan adalah 5 hari. b. Pengaruh Konsentrasi HzOz Terhadap Jumlah Limfosit yang Mampu Bertahan Hidup
Nilai lndeks Stimulan (IS) sel limfosit pada kultur yang diberi perlakuan H202 dan dibandingkan dengan kontrol disajikan pada Lampiran 39 dan Gambar 25. Dari Gambar 25 terlihat tejadi penurunan nilai IS sejalan dengan bertambahnya konsentrasi H202. Namun pada konsentrasi yang paling rendah (0,06 mM) indeks
Konsentrasi H202(mM) Gambar 25. Pengaruh konsentrasi H202terhadap lndeks Stimulasi sel limfosit
stimuliasi justru lebih tinggi dibandingkan tanpa H202.Hal ini mungkin karena H202 pada konsentrasi 0,06 mM menjadi bersifat stimulan bagi limfosit karena dianggap sebagai antigen dan belum bersifat sitotoksik bagi limfosit.
Namun untuk
konsentrasi yang lebih tinggi H2Q2menjadi bersifat beracun bagi sel dan persentase penghambatan proliferatif menurun secara nyata hingga 3 mM. Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa konsentrasi H202berpengaruh terhadap IS (Lampiran 40).
Perlakuan pemberian H202 pada konsentrasi
0,06 .- 1 mM memberikan IS yang tidak berbeda, namun lebih rendah secara nyata dibandingkan kontrol.
IS pada 3 mM dan 10 mM tidak berbeda nyata
(Lampiran 40). Oleh karena itu ditetapkan konsentrasi Hz02 sebesar 3 mM sudah optimal bersifat toksik bagi limfosit. Tejasari (2000) menyatakan bahwa penggunaan paraquat pada konsentrasi 1 mM masih bersifat stimulan, dan pada 3 mM menunjukkan hasil respon proliferasi sel B paling rendah. Suprijono (2001) menyatakan bahwa H202 pada konsentrasi
"
10 sudah memberikan sifat toksik yang optimal bagi sel limfosit. Namun penelitian tersebut diaplikasikan untuk viabilitas limfosit yang diinkubasi 37OC 10 menit.
c. Pengaruh Lama lnkubasi Fraksi Tak Tersabunkan dari Minyak Bekatul Padi Awet terhadap Limfosit dalam Kondisi dengan dan tanpa Stres Oksidatif Hasil lndeks Stimulasi sel limfosit yan~gdikultur dengan H202 saja adalah 0,87, sedangkan untuk dengan sampel dengan H202 adalah 0,97. Hasil ini menunjukkan bahwa sampel fraksi tak tersabunkan bekatul awet 16,56 pglml dapat melindungi dari kondisi stres oksidatif pada kultur limfosit. Untuk mengetahui berapa lama inkubasi sampel yang paling optimal untuk melindungi kultur limfosit terhadap serangan H202dapat dilihat pada Gambar 26 dan Lampiran 41.
I
0
10
20
30
40
50
60
Waktu (menit)
Gambar 26. Pengaruh waktu inkubasi fraksi tak tersabunkan minyak bekatul sebelum kultur H202terhadap lndeks Stimulasi sel limfosit Hasil uji ragam menunjukkan waktu 30 menit memberikan indeks Stimulasi tertinggi secara nyata dibandingkan perlakuan waktu lainnya (Lampiran 42). Hal ini menunjukkan bahwa waktu 30 menit tersebut merupakan waktu yang optimal agar sampel masuk ke dalam sel sehingga melindungi sel dari kerusakan oleh H202. d. Pengaruh Minyak Bekatul Avuet dan Fraksinya terhadap Limfosit dalam Kondisi dengan dan tanpa Stres Oksidatif. Stimulasi limfosit dengan antigen atau mitogen mengakibatkan berbagai reaksi biokimia di dalam sell di antaranya fosforilasi nukleoprotein, pembentukan
DNA dan RNA, serta peningkatan metabolisme lemak dan lain-lain. Aktivitas sel T dan H berproliferasi ini dapat diukur melalui lndeks Stimulasi (Zakaria eta/. 2000). Stimulasi adalah proses perbanyakan sel melalui pembelahan sel melalui pembelahan sel atau mitosis sebagai respon terhadap antigen atau mitogen. Pada proses tersebut dihasilkan sel-sel efektor aktif yang berperan pada respons spesifik dan atau non spesifik untuk eliminasi mikroorganisme patogen dan zat asing lainnya.
Stimulasi merupakan fungsi dasar biologis limfosit (Rosse et at. 1994) dan respons stimulasi secara in vitm dapat menggambarkan fungsi limfosit. lndeks Stimulasi sel limfosit adalah rasio antara nilai absorbansi limfosit yang mampu bertahan hidup di dalam kultur setelah diberi mitogen, minyak bekatul dan fraksinya masing-masing pada kondisi tanpa dan dengan stres oksidatif setelah diinkubasi selama 5 hari dengan nilai absorbansi kontrol (hanya media RPMI saja). Suplamentasi ekstrak uji dilakukan dengan menambahkan 25 pl ekstrak ke dalam kultur limfosit, lalu menepatkan volume total kultur menjadil75 pl dengan RPMI.
-
Konsentrasi sampel dari C1 C5 di dalam sumur berturut-turut untuk minyak adalah 133,4!5; 266,51; 533,02; 1070 dan 2130 pglml, untuk fraksi tak tersabunkan 2,07; 4,14; 8,28; 16,56; 33,12 pglml, untuk oryzanol 1,62; 3,24; 6,48; 12,96; 2592 pglml. Nilai absorbansi berasal dari formazan yang berasal dari aktivitas enzim suksinat dehidrogenase mitokondrial dalam sel hidup.
Kandungan suksinat
dehidrogenase adalah relatif konstan di antara berbagai sel dengan tipe spesifik, sehingga jumlah formazan yang diproduksi adtalah proporsionalterhadap jumlah set. Formazan terbentuk dari reaksi reagen MTT dengan enzim. Metode MTT ini cukup mudah dan valid untuk menghitung banyaknya zat warna forrnazan yang terbentuk. Hasil respon stimulasi limfosit yang ditunjukkan dengan lndeks Stimulasi (IS) akibat pemberian fraksi minyak bekatul pada kondisi tanpa dan dengan Hz02 ditunjukkan pada Gambar 27 dan Lampiran 43.
Limfosit mampu memberikan
respon terhadap stimulasi oleh mitogen phyto hemaglutinin (PHA). lndeks stimulasi untuk etanol dan etil menunjukkan hasil yang mendekati dengan tanpa etanolletil, sehingga disimpulkan bahwa etanol dan etil pada konsentrasi yang digunakan pada kultur limfosit ini tidak bersifat berbahaya.
a. Dengan H202
-
u,
2.0
,
0Minyak Bekatul
NTak Tersabunkan
13 Oryranol
b. Tanpa H202 Minyak Bekatui
83 Tak Tersabunkan
O Oryzanol
Konsontnrl (ug/ml)
Keterangan: C2 = Konsentrasi akhir bahan di dalam kultur yang setara dengan konsumsi minuman Bekatul model per hari mengandung 11,6 g bekatul Cl, C3, C4 dan 65 berturut-turut H, 2 . 4 dan 8 kali C2 C2 minyak = 267 pg/ml ; C2 tak tersabunkan = 19,2 pglml ; C2 oryzanol = 4,7 pg/ml
Gambar 27. Pengaruh fraksi minyak bekatul awet terhadap limfosit dalam kondisi dengan (a) dan tanpa H202(b) lndeks Stimulasi (IS) pada perlakuan pemberian minyak bekatul berkisar antara 1,52
- 1,86.
Dibandingkan dengan RPMl + etanol yaitu 1,76, pemberian
minyak cenderung sediki menekan proliferasi limfosit. IS pada perlakuan pemberian bahan tak tersabunkan berkisar antara
1,22 - 1,61, dibandingkan dengan RPMl + etil asetat yaitu 1,73, pemberian bahan
tak tersabunkan sedikit lebih besar menekan proliferasi limfosit dibanding pada pemberian minyak.
IS pada pemberian 'oryzanol berkisar antara 1,67
- 1,88.
IS pada RPMl + pelarut etanol atau etil asetat jika dibandingkan antara dengan dan tanpa pemberian H202,terlihat IS yang diberi H202 lebih rendah dibandingkan tanpa Hz02 Hal ini menunjukkan bahwa H202bersifat toksik terhadap sel limiosit. H202 suatu senyawa oksigen reaktif yang non radikal bersifat dapat menembus membran sel dengan mudah dan clapat menyerang beberapa sasaran di sel. Peningkatan adanya H202akan menyebabkan kerusakan DNA. Yang lebih penting lagi adalah kemungkinan dari Hz02 menghasilkan senyawa yang lebih berbahaya lagi in vivo yaitu terbentuknya radikal hidroksil, misalnya reaksi dengan adanya ion logam transisi. Stres oksidatif dapat menghasilkan perubahan metabolisme di dalam tubuh, seperti perubahan DNA, peningkatan ca2' bebas di intraseluler, kerusakan tranporter ion membran dan protein spesifik dan peroksidasi lipid. H202akan menyerang merusak secara langsung dengan mengoksidasi grup tiol.
Kelebihan peningkatan ca2' dapat mengaktifasi protease (yang dapat
menyerang sitoskleton) dan nuclease (memotong DNA) (Halliwell et a/. 1992). Hasil analisis regresi (Lampiran 44) menunjukkan bahwa hanya kondisi kultur dengan dan tanpa stress oksidatif berpengaruh secara nyata terhadap IS (a=0.05). Kondisi stres oksidatif menurunkan secara nyata IS kultur limfosit. Mekanisme kerusakan sel yang dimediasi oleh oksidan H202 (hidrogen peroksida) telah dilaporkan oleh Hyslop et a/. 1988). Sel P 388 D l yang dipapar H202 mengalami kerusakan melalui terjadinya penghambatan fosforilasi ADP oleh glikolisis dan mitokondria. Glikolisis spesifik dihentikan aktivitas pada tahap gliseraldehid-3-fosfat dihidro-genase oleh 3 mekanisme yang tidak tergantung : a) inaktivitas langsung
121
enzirrl intraseluler, b) reduksi konsentrasi intraseluler dan potensial redoks dari kofaktor nikotinamid, dan c) pH sitosolik optimal dari enzim. Pemberian minyak bekatul padi dan fnksinya pada konsentrasi bertingkat menunjukkan tidak berpengaruh secara nyata terhadap IS dibandingkan dengan kontrol (RPMI + PHA) (a = 0,05). Sebenarnya banyak yang telah melaporkan bahwa bahan antioksidan alami yang terdapat pada berbagai tumbuhan dapat melindungi limfosit dari kerusakan stress oksidatif. Nurrahman et a/. (1999) melaporkan bahwa mengkonsumsi sari jahe setiap hari selama 30 hari berpengaruh pada peningkatan aktivitas sel T dan daya tahan limfosit terhadap paraquat.
Konsumsi sari jahe tidak berpengaruh terhadap
penulnrnan kadar MDA limfosit, peningkatan aktivitas sel B dan penurunan persentase CD3.
Nagano et a/. (1997) melaporkan bahwa komponen baru
kurkuminoid yaitu cassumunin A dan cassumunin B yang diisolasi dari bangle (Zingjber cassumunar ) dapat melindungi sel timosit tikus dari stress oksidatif menggunakan 3 mM H202. Pengamatan itu menggunakan alat Flow-Cytometric. Sebagai kontrol digunakan antioksidan alami kurkumin. Bahkan untuk Cassumunin
A dan B yang disintesis dari o-vanilin dilaporkan memiliki efek aktivitas perlindungan yang lebih kuat melawan kematian sel timosit tikus yang diinduksi hidrogen peroksida dibandingkan kurkumin (Masuda et a/. 1998). Metode menggunakan alat Flow--Cytometric untuk skrining antioksidan merupakan teknik yang banyak digurlakan saat ini (Ostrovidov et a/. 2000). Dari penelitian ini ditunjukkan bahwa pemberian minyak bekatul dan fraksinya belum memberikan pengaruh terhadap lndeks Stimulasi sel limfosit manusia.
Minyak bekatul padi dan fraksinya (fraksi tak tersabunkan dan oryzanol) II
i
yang diperoleh dari ekstraksi bekatul awet pada konsentrasi setara dengan segelas minuman bekatul model terbukti dapat menghambat oksidasi W L D L dan LDL manusia secara in vitro.
Hal ini ditunjwkkan oleh rendahnya kandungan
malonaldehid W L D L dan LDL yang plasmanya telah disuplernentasi minyak bekatul dan fraksinya dibandingkan kontrol. Aktivitas antioksidan oryzanol lebih tinggi dibandingkan fraksi tak tersabunkan dan kemwdian minyak. Tetapi kapasitas relatif aktivitas antioksidan paling besar ditunjukkan oleh minyak kasar, disusul fraksi tak tersabunkan dan oryzanol. Minyak bekatul padi dan fraksinya dalam penelitian ini pada konsentrasi 8 kali konsentrasi setara dengan segelas minuman bekatul model belum dapat menstimulasi proliferasi sel limfosit manusia in vitro. Pada kultur yang dengan dan .tanpa H,02,
suplementasi minyak bekatul den fraksinya tidak bersifat sitotoksik
terhadap limfosit manusia.
Namun pemberian H202, sebesar 3 mM bersifat
,sitotoksik bagi sel limfosit.
F. DAFTAR PUSTAKA AHA. 2002. Cholesterol, Lowering the Level. http://www. American heart.org. , 2 Februari. Apriyantono A, Fardiaz Dl Puspitasari NL, Yasni S, Budiyanto S. 1988. Penuntun Praktek Analisis Pangan. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi lnstitut Pertanian Bogor. Bogor. Aruoma 01 et a/. 1997. Characterization of Food Antioxidants, Illustrated Using Commercial Garlic and Ginger Preparation. Food Chem. 60 (i) : 149-156. Bourgeois C. 1992. Determination of Vitamin E : Tocopherols and Tocotrienols. London : Elsevier applied science. hlm 15-18.
Coligan JE, Kruisbeek AM, hhrgulies DH, ~hevachEM, Strober W, editor. 1992. Current Protocols in Immunology. Volume ke-I. National Institutes of Health. New York: John Wiley & Sons.Bagian 6,3,6. Conti MI Morand PC, Levillain PI Lemonier A. 1991. Improved Fluorimetric Determination of Malonaldehide. Clin Chem. 37: 1273-1275. DiacE; MI Saska M. 1994. Separation of vitamin E dan g-oryzanols from rice bran by Normal-Phase Chromatography. J. Am. Oil Chem. Soc. 71:1211. Ellot JG. 1999. Application of antioxidant vitamins in foods and beverages. Food Technology. 53 (2) : 46-49. Esterbauer HI Rotheneder Dl Striegl MI Waeg G. 1991. Role of Vitamin E in Preventing the Oxidation of Low Density Lipoprotein. Clinical Nutrition Journal. 53 : 314. Fuhrman B, Rosenblat MI Hayek TI Coleman R, Aviram M. 2000. Ginger Extract Consumption Reduces Plasma Cholesterol, Inhibits LDL Oxidation and Attenuates Development of Atherosclerosis in Atherosclerotic, Apolipoprotein E-Deficient Mice. American Society for Nutritional Sciences. P:1124-1131. Halliwell B, Gutteridge JMC, Cross CE. 1992. Free radicals, antioxidants and human disease: Where are we now ? J. Lab. Clin Med. 119 (6) : 598 620.
-
Halliwell B, Aruoma 10. 1997. Free radicals and antioxidants: The Need for in vivo markers of oxidative stress. Di dalam Aruoma 01. Antioxidant Methodology. hlm 1-22. Hirano R, Kondo K, lwamoto TI lgarashi 0, ltakura H. 1997. Effects of antioxidants on the oxidative susceptibility of lowdensity lipoprotein. J. of Nutr. Sci. Vitaminol. 43 : 435-444. Hoff HF et a/. 1989. Modification of low density lipoprotein with 4-Hydroxynonenal induces uptake by macrophages. Arteriosclerosis. 9(4) : 538-549. Hudson BJF. 1990. Food Antioxidants. London and New York. Elsevier Applied Science. Hyslop PA et a/. 1988. Mechanisms of oxidant-mediated cell injury. The glycolytic and mitochondria1 pathways of ADP phosphorylation are major intracellular targets inactivated by hydrogen peroxid@. J. Biol.Chem. Feb 5;263 (4):16657 E
Goldberg 1. 1994. Introduction. Di dalam Goldberg I. Functional Foods. New York: Chapman dan Hall. hlm 1-16. I I
Kahlon TS, Chow FI. 1997. Hypercholeteroliemic Effects of Oat, Rice and Barley Dietary Fibers and Fractions. Cereal Foods World. 42 (2) : 86-92.
Kehrer JP. 1993. Free radicals as mediator of tissue injury and disease. Critical Reviews in Toxicology 23(1) : 21-48. Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Randall RJ. 1951. Protein measurement with folin phenol reagen. J. Biol. Chem. 193 : 265. Marinetti GV. 1990. Disorder of Lipid Metabolism. New York : Plenum Press. Mash~udaT, Matsumura H, Oyama Y, Takeda Y, Jitoe A, Kida A, Hidaka K. 1998. Synthesis of (+J cassuminins A and B, new curcuminoid antioxidants having protective activity the living cell against oxidative dagmage. J. Nat. Prod. 61 : 609-613.
-
McCaskill DR, Zhang F. 1999. Use of rice bran oil in foods. Food Technology. 53 (2) : 50-53. Moorl JH , Terao J. 1998. Antioxidant activity of caffeic acid and dihydrocaffeic acid in lard and human low-density lipoprotein. J. Agric. Food Chem. 46 : 50625065. Nagano T et a/. 1997. New curcuminoid isolated from Zingiber cassumunar protect cell suffering from oxidative stress: A flow-cytornetric study using rat thymocytes and H202. J. Pharmacol. 75 : 363-370. Nurrahman FR, Zakaria, Sajuthi Dl Sanjaya. 1999. Pengaruh,konsumsi sari jahe terhadap perlindungan Limfosit dari Stres Oksidatii padd Mahasiswa Pondok Pesantren Ulil Albab. Prosiding Seminar Nasional Teknologi Pangan di Jakarta 12-13 OMober1999. Perhimpunan Ahli Teknologi Pangan Indonesia (PATPI) bekerjasama dengan Kantor Menteri Negara Pangan dan Hortikultura Rl. Ostravidov S et a/. 2000. Screening of new antioxidant using flow cytometry. J. Medical Chemistry. 43 :1762-1769. Romanchik JE, Morel DW, Harrison EH. 1995. Distributions of carotenoids and atocopherol among lipoproteins do not change when human plasma is incubated in vitro. American Institute of Nutrition. P : 2610-2617. Rosse NR, de Macario EC, Fahey JL, Friedman HI Penn GM. 1994. Manual of Clinical Laboratory Immunology. Washington, D.C : American Society for Microbiology. Schuler P. 1990. Natural Antioxidant Exploited Commercially. Di dalam : Hudson BJF (eds). Food Antioxidants. London and New York : Elsevier Applied Science.
125 Septiana AT. 2001. Aktivitas Ekstrak Jahe (Zingiber Officnale Roscoe) dalam Pencegahan Oksidasi Lipoprotein Densitas Rendah (LDL) dan Akumulasi Kolesterol pada Makrofag secara In Vitm. [Disertasi]. lnstitut Pertanian Bogor, Program Pascasarjana. Sevanian A, Bolger MB. 1996. Dietary approaches to lowering cholesterol. http :/I www.usc.edu/hsc/~harmacv/ced/dietchol/dietchl2.htm. [14 Februari 20021. Sulisltiyani St. Clair, RW. 1991. The method of Isolation of primary cells and their statement of LDL receptors on pigeon and chicken embrio cells in culture. Atherosclerosis 91 : 123-135. Suprijono MM. 2001. Effects of ginger extract on the hybrido~naand leukocyte cells in the oxidative stress condition. vhesis]. Postgraduate program. Bagor Agricultural University, Bogor. Sutanto J. 1996. Pengaruh isoflavon pada resistensi lipoprotein berdensitas rendah (LDL) terhadap oksidasi kimiawi. [Skripsi]. Jurusan Kimia, FMIPAIPB. Bogor. Suzukawa M, Abey M, Clipton P, Nestel PJ. 1994. Effect of suplementing with vitamin E on the uptake of low density lipoprotein and the stimulation of cholesteryl ester formation in Macrophages. Atherosclerosis Journal. April 110 : 77-86. Tejasari. 2000. Efek Proteksi Komponen Bioaktif Oleoresin Rimpangjahe (Zingiber officinale Roscoe) terhadap Fungsi Limfosit secara In Vitm. [Disertasi]. lnstitut Pertanian Bogor, Program Pascasarjana. Terawaki K, Nose M, Kondo T, Kojima K, Miukami H, Ogihara Y. 1997. Effect of karasurin-A on nttric oxide production by murine macrophages and mitogenic response of murine splenocytes in vitro. Bio. Pharm. Bull. 20 (4) : 435-437. Xu Z, Godber JS. 1999. Purification and identification of components of y-oryzanol in rice bran oil. J. Agric. Food Chem. 47 : 2724-2728. Xu Z, Hua and Godber JS. 2001. Antioxidant Activity of Tocopherols, Tocotrienol, and Gamma-Oryzanol Components from Rice Bran against Cholesterol Oxidation Accelerated by 2,2'-Azobis (2-methylpropionamidine) Dihydrochloride. J. Agric. Food Chem. 49 : 2077-2081. Zakaria FR, lrawan B, Pramudia SM, Sanjaya. 2000. lntervensi sayur dan buah pembawa vitamin C dan Vitamin E meningkatkan sistem imun populasi buruh pabrik di Bogor. Bul. Teknol. dan Industri Pangan. 11(2) : 21-27.
*
