ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN PRODUKSI MISELIA Rhizopus sp. BERKADAR ASAM NUKLEAT RENDAH
RIZA FIRMANSYAH
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007
ABSTRAK RIZA FIRMANSYAH. Isolasi, Identifikasi dan Produksi miselia Rhizopus sp. berkadar asam nukleat rendah. Dibimbing oleh NAMPIAH SUKARNO dan UTUT WIDYASTUTI. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengidentifikasi dan memproduksi miselia Rhizopus sp. berkadar asam nukleat rendah yang berkualitas. Kapang merupakan bahan pangan yang mengandung protein dan asam nukleat yang tinggi. Kandungan asam nukleat pada bahan pangan yang diperkenankan ialah maksimal 2 % sedangkan kandungan asam nukleat pada kapang sekitar 8-10 %. Konsumsi asam nukleat yang tinggi dapat mengakibatkan akumulasi asam urat pada tubuh yang dapat mengakibatkan penyakit encok. Isolat Rhizopus spp. diisolasi dari 12 sampel tempe yang berasal dari berbagai daerah di Indonesia dan diidentifikasi berdasarkan ciri morfologinya. Seleksi isolat dilakukan berdasarkan pertumbuhan miselia dan produksi spora pada media PDA. Produksi massal miselia dilakukan pada media cair ekstrak kentang dengan konsentrasi 200 gr/L dan ekstrak kedelai dengan konsentrasi 333.3 gr/L serta penambahan 6 macam konsentrasi sukrosa, yaitu 0, 2, 3, 4, 5 dan 6 gr/L. Penurunan kadar asam nukleat dilakukan dengan perlakuan pemanasan pada suhu 55 oC dan 65 oC selama 15 menit. Analisis kandungan asam nukleat dilakukan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm. Pada penelitian ini di peroleh 58 isolat Rhizopus yang teridentifikasi ke dalam 3 spesies, yaitu Rhizopus oryzae, R. stolonifer dan R. oligosporus. R. oligosporus menghasilkan pertumbuhan miselia paling cepat tetapi sporulasi paling lambat dibandingkan dengan kedua spesies lainnya. Produksi miselia R. oligosporus tertinggi diperoleh pada media ekstrak kedelai dengan penambahan sukrosa 5 gr/L. Kandungan asam nukleat miselia setelah perlakuan pemanasan dengan suhu 50 oC ialah 1.82 %. Nilai ini telah melewati batas standar maksimal kandungan asam nukleat untuk bahan pangan yang aman untuk dikonsumsi menurut USDA.
ABSTRACT RIZA FIRMANSYAH. Isolation, Identification and Production of Rhizopus sp. mycelium containing low nucleic acid. Supervised by NAMPIAH SUKARNO and UTUT WIDYASTUTI. The aim of this research was to isolate, identify and produce a high quality of Rhizopus sp. mycelium containing low nucleic acid. Molds are rich in protein, but also contain a high nucleic acid which can be accumulated in the form of uric acid that related with gout disease in human. Mycelium of fungi or molds commonly contains 8-10 % of nucleic acid, whereas the maximum concentration of nucleic acid in food that permitted is not more than 2 %. Rhizopus spp. were isolated from tempeh obtaining from 12 different areas in Indonesia. Fungal identification was conducted based on morphological characteristics. Isolates were selected based on mycelial growth and production of spores on PDA. Biomass production of mycelium was carried out in soybean extract medium obtained from 200 gr/L and potato extract from 333.3 gr/L. Each medium was added 6 levels of sucrose concentration: 0, 2, 3, 4, 5 and 6 gr/L. Reduction of nucleic acid content of mycelium was used heat treatment at 50 oC and 60 oC for 15 minutes and measured by spectrophotometre at 260 nm. Fifty eight isolates that were identified into 3 species were obtained in this experiment. The 3 species of fungi were Rhizopus oryzae, R. stolonifer and R. oligosporus. R. oligosporus had higher mycelial growth and lower spore production compared with the two other spesies. R. oligosporus produced a higher mycelium biomass in the soybean extract medium with 5 gr/L additional sucrose. The nucleic acid content of the 50 oC heat treated mycelium was 1.82 %. This was lower that of a maximum standar of nucleic acid content that permitted in food by USDA.
ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN PRODUKSI MISELIA Rhizopus sp. BERKADAR ASAM NUKLEAT RENDAH
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
RIZA FIRMANSYAH
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007
Judul : Isolasi, Identifikasi dan Produksi Miselia Rhizopus sp. berkadar Asam Nukleat Rendah Nama : Riza Firmansyah NIM : G34102051
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Nampiah Sukarno NIP 131 663 017
Dr. Ir. Utut Widyastuti NIP 131 851 279
Mengetahui: Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S. NIP 131 473 999
Tanggal Lulus :
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas karunia dan hidayah-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Shalawat serta salam penulis haturkan kepada manusia panutan semua umat, Nabi Muhammad SAW. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2006 sampai dengan bulan November 2006, dengan judul Isolasi, Identifikasi dan Produksi Miselia Rhizopus sp. berkadar Asam Nukleat Rendah. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. Ir. Nampiah Sukarno dan Dr. Ir. Utut Widyastuti selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan, saran dan motivasi selama pelaksanaan penelitian sampai penulisan karya ilmiah ini serta kepada Ibu Ir. Sulistijorini, M.S. selaku penguji yang telah memberikan saran dan kritik dalam penyusunan karya ilmiah ini. Penulis mengucapkan terima kasih kepada kepala laboratorium Bagian Mikologi Departemen Biologi IPB beserta para staf, kepala Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB)-IPB beserta para staf dan bagian IPBCC yang telah memberikan fasilitas dan bantuan selama melaksanakan penelitian. Terima kasih penulis ucapkan kepada staf pengajar Bagian Mikologi dan seluruh staf pengajar di Departemen Biologi IPB yang telah memberikan saran dan bantuannya atas selesainya karya ilmiah ini. Ungkapan terima kasih juga penulis ucapkan kepada mama, papa dan adek atas segala doa, kasih, sayang, pengertian dan dukungannya. Tika atas motivasi, doa, cinta, kasih dan sayangnya; Mbak rida, Zulfitri, Juve, Kurniadi, Adiantoro dan Aditya atas segala bentuk perhatian dan semangat yang telah diberikan. Penulis ucapkan terima kasih juga kepada Lucky’38, Aris’38, Niken, Diessa, rekan-rekan bio’39 dan semua pihak yang telah membantu atas selesainya karya ilmiah ini atas semangat, dukungan, persahabatan, bantuan dan kebersamaannya saat masa-masa susah maupun senang. Semoga karya ilmiah ini dapat menambah perbendaharaan ilmu pengetahuan Indonesia
Bogor, September 2007
Riza Firmansyah
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Banyuwangi pada tanggal 13 Januari 1984 dari Bapak Gatot Afandy dan Ibu Nanik Sumarini. Penulis merupakan putra kedua dari tiga bersaudara. Tahun 2002 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Situbondo dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Ujian Saringan Masuk IPB (USMI). Penulis memilih Program Studi Biologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Biologi Dasar pada tahun 2004/2005 dan 2005/2006 serta asisten Biologi Cendawan pada tahun 2006/2007. Pada tahun 2004 penulis juga aktif dalam Himpunan Kemahasiswaan Biologi yaitu Himabio. Pada tahun 2004 penulis menjadi anggota bagian PSDM dalam Himabio dan menjadi ketua Lomba Cepat Tepat Biologi se-Indonesia, kemudian menjadi ketua bagian PSDM dalam Himabio pada tahun berikutnya. Penulis pernah mendapatkan beasiswa PPA-DIKTI pada tahun 2005-2006. Pada tahun 2005 penulis melaksanakan Praktik Lapangan dengan judul Manajemen Pembuangan Limbah dan Biosafety di Laboratarium Bagian Uji Hewan PT. Bio Farma (persero) Bandung.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL...........................................................................................................................vii DAFTAR GAMBAR ......................................................................................................................vii DAFTAR LAMPIRAN..................................................................................................................viii PENDAHULUAN.............................................................................................................................1 Latar belakang ..............................................................................................................................1 Tujuan...........................................................................................................................................1 BAHAN DAN METODE .................................................................................................................1 Isolasi dan Identifikasi..................................................................................................................1 Produksi Miselia...........................................................................................................................2 1 Pemilihan Isolat ...................................................................................................................2 2 Pemilihan Media Tumbuh dan Konsentrasi Gula................................................................2 Perlakuan Penurunan Asam Nukleat ............................................................................................3 HASIL...............................................................................................................................................3 Isolasi dan Identifikasi..................................................................................................................3 Produksi Miselia...........................................................................................................................4 1 Pemilihan Isolat ...................................................................................................................4 2 Pemilihan Media Tumbuh dan Konsentrasi Gula................................................................4 Perlakuan Penurunan Asam Nukleat ............................................................................................4 PEMBAHASAN ...............................................................................................................................5 SIMPULAN ......................................................................................................................................6 SARAN .............................................................................................................................................6 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................................................6
DAFTAR TABEL Halaman 1 Hasil pemurnian dan identifikasi Rhizopus yang berasal dari sampel tempe ..........................................................................................................................3 2 Identifikasi Rhizopus berdasarkan kunci identifikasi Rifai 1973 ...................................................3 3 Pengaruh suhu pemanasan tehadap kandungan asam nukleat........................................................5
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Diagram alir metode penelitian ......................................................................................................1 2 Produksi massal biomassa miselia R. Oligosporus ........................................................................2 3 Struktur mikroskopis Rhizopus dengan perbesaran 40x pada media air .......................................3 4 Pertumbuhan isolat di media PDA pada hari ke-4 setelah inokulasi..............................................4 5 Rata-rata pertumbuhan miselia R. oryzae, R. stolonifer dan R. oligosporus ..................................4 6 Rata-rata jumlah spora R. oryzae, R. stolonifer dan R. oligosporus...............................................4 7 Rata-rata bobot kering R. oligosporus pada media ekstrak kentang dan ekstrak kedelai................................................................................................................................4
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Tabel pengukuran pertumbuhan miselia R. oryzae, R. stolonifer dan R. oligosporus....................9 2 Tabel penghitungan jumlah spora R. oryzae, R. stolonifer dan R. oligosporus............................10 3 Tabel bobot kering R. oligosporus pada media cair ekstrak kentang dengan berbagai macam konsentrasi gula. ..........................................................................................................................11 4 Tabel Tabel bobot kering R. oligosporus pada media cair ekstrak kedelai dengan berbagai macam konsentrasi gula...............................................................................................................11
PENDAHULUAN Latar belakang Kapang dan jamur telah diketahui sebagai salah satu sumber bahan pangan berprotein tinggi, namun sampai saat ini di Indonesia kapang belum dimanfaatkan secara optimal sebagai sumber pangan yang berkualitas. Di luar negeri seperti Inggris, beberapa negara di Eropa dan Amerika Serikat, telah memproduksi dan mengkonsumsi pangan yang berasal dari miselium kapang Fusarium venetatum yang disebut “Quorn” secara besar-besaran. Di Indonesia tempe dikenal sebagai makanan sehat dan telah dikonsumsi secara rutin sejak ratusan tahun yang lalu (Slamet & Tarwotjo 1980). Tempe merupakan makanan tradisional yang dihasilkan dengan cara fermentasi menggunakan kapang Rhizopus sp. dan kacang kedelai. Hal ini menunjukkan bahwa Rhizopus sp. (kapang tempe) pada tempe merupakan kapang yang aman untuk dikonsumsi. Kapang ini juga dapat ditumbuhkan pada media sintetik dan pertumbuhannya relatif cepat. Sehingga kapang Rhizopus sendiri dapat digunakan tanpa dalam bentuk tempe sebagai sumber pangan berprotein tinggi. Disamping itu, tempe di luar negeri juga telah dikenal sebagai makanan sehat, namun banyak yang kurang menyukainya karena aroma kedelai yang kuat pada tempe. Hasil penelitian di Laboratorium Mikologi Departemen Biologi FMIPA IPB, menunjukkan bahwa aroma kedelai dapat dikurangi atau dihilangkan dari produk kapang yang tumbuh pada media kedelai bila yang dipanen ialah miselia kapangnya (Sukarno, data tidak dipublikasikan). Oleh karena itu, penelitian tentang pengembangan miselia kapang Rhizopus sp. sebagai sumber pangan berprotein tinggi dan berkualitas dapat dilakukan dan diperlukan untuk program pengembangan diversitas pangan dalam rangka meningkatkan gizi masyarakat Indonesia. Kapang merupakan bahan pangan berprotein tinggi, namun seperti halnya produk makanan yang berasal dari jamur dan ganggang, kapang umumnya mengandung asam nukleat yang tinggi. Konsumsi asam nukleat tersebut oleh manusia dapat mengakibatkan akumulasi asam urat yang dapat berakibat munculnya penyakit encok pada persendian (Lehninger 1982). Bahan pangan yang berasal dari kapang atau jamur mempunyai kadar asam
nukleat 8-10 %, padahal kandungan asam nukleat pada produk pangan yang diperkenankan ialah maksimal 2 % (USDA 1998). Oleh karena itu penurunan kandungan asam nukleat dari kapang Rhizopus sebagai bahan mikoprotein sampai pada tingkat yang aman untuk dikonsumsi perlu dilakukan. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengidentifikasi dan memproduksi miselia Rhizopus sp. yang berkualitas dan berkadar asam nukleat rendah.
BAHAN DAN METODE Bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah kentang, kedelai, sukrosa, antibubble dan tempe yang berasal dari 12 daerah yang berbeda di Indonesia (Tabel 1). Sedangkan alat yang digunakan ialah shaker, autoklaf, oven dan spektrofotometer. Kegiatan ini meliputi beberapa tahapan yang meliputi isolasi dan identifikasi; produksi miselia yang meliputi pemilihan isolat, dan pemilihan media tumbuh dan konsentrasi gula; serta perlakuan penurunan asam nukleat. Tahapan-tahapan penelitian tersebut dapat dilihat pada Gambar 1. Isolasi dan Identifikasi
Produksi Miselia
Pemilihan Isolat
Pemilihan media tumbuh dan konsentrasi gula
Perlakuan Penurunan Asam Nukleat Gambar 1 Diagram alir metode penelitian I. Isolasi dan Identifikasi. Rhizopus spp. diisolasi dari tempe yang diperoleh dari berbagai daerah di Indonesia, yaitu Aceh, Bondowoso, Situbondo, Malang, Cilegon, Yogyakarta, Jember, Bekasi, Bogor, Jakarta, Padang dan Balikpapan. Isolasi kapang Rhizopus sp. dilakukan dengan cara mengambil sekelumit hifa dari bagian dalam tempe dengan
menggunakan jarum inokulasi steril yang selanjutnya ditumbuhkan pada media PDA (Potatos Dextrose Agar) segar yang telah diberi antibiotik kloramfenikol. Cawan kemudian diinkubasi selama 5 hari pada suhu ruang. Setelah itu, isolat dipindahkan ke agar miring dalam tabung dan diinkubasi selama 5 hari. Kultur selanjutnya dimurnikan melalui isolasi spora tunggal dengan cara memasukkan air steril sebanyak 10 ml ke dalam tabung yang berisi isolat Rhizopus sp. tersebut dan di vortex hingga sporanya larut. Setelah itu, larutan spora diencerkan hingga mencapai 105 kali. Sebanyak 1 µl larutan spora disebarkan pada permukaan media Gellan gum. Kemudian spora diamati dibawah mikroskop, setiap spora tunggal yang letaknya terpisah, diisolasi dan ditumbuhkan pada media PDA segar. Spora yang tumbuh kemudian diidentifikasi berdasarkan morfologi cendawan yaitu sporangiofor, sporangium dan sporangio-spora dengan menggunakan kunci identifikasi Rifai 1973. Setelah itu, isolat dari spora tunggal dipindahkan ke dalam 2 tabung, tabung pertama digunakan untuk pengujian selanjutnya dan tabung yang kedua disimpan untuk keperluan koleksi. II. Produksi Miselia 1. Pemilihan isolat. Isolat-isolat murni yang telah diidentifikasi selanjutnya ditumbuhkan pada cawan yang berisi PDA dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 hari. Jumlah spora yang terbentuk pada masing-masing spesies diukur dengan menggunakan Hemasitometer. Ketiga isolat yang telah diidentifikasi masing-masing ditumbuhkan pada 5 ml PDA dalam tabung reaksi berdiameter 1.5 cm dan diinkubasi selama 5 hari pada suhu ruang. Pada hari ke-5, spora dipanen dengan cara memasukkan air steril sebanyak 20 ml ke dalam tabung kultur, lalu dihomogenkan hingga sporanya larut. Larutan spora selanjutnya diencerkan hingga mencapai 105 kali pengenceran. Kemudian, 0.1 ml larutan spora yang telah diencerkan dimasukkan ke dalam Hemasitometer dan di hitung jumlah sporanya di bawah mikroskop dengan perbesaran 4x10. Percobaan ini dilakukan dengan 3 kali ulangan. Koloni yang tumbuh diamati dan diukur diameternya setiap hari sampai kultur berumur 5 hari. Isolat tersebut diseleksi berdasarkan pada pertumbuhan miselia dan produksi spora. Isolat yang menghasilkan
pertumbuhan miselia paling cepat tetapi bersporulasi paling lambat atau menghasilkan spora dalam jumlah sedikit dipakai untuk pengujian selanjutnya. Percobaan ini dilakukan dengan 3 kali ulangan. 2. Pemilihan media tumbuh dan konsentrasi gula. Jenis media tumbuh dan kandungan gula media sangat mempengaruhi pertumbuhan cendawan. Dua macam media cair, yaitu ekstrak kentang dan ekstrak kedelai, dan enam penambahan konsentrasi gula , yaitu 0, 2, 3, 4, 5 dan 6 gr/L digunakan dalam penelitian ini. Gula yang digunakan ialah sukrosa teknis. a). Ekstrak Kentang Dua ratus gram kentang yang telah dikupas dipotong dadu, kemudian di rebus dalam 1 liter air selama 20 menit. Setelah itu, air rebusan disaring, lalu ditambahkan antibiotik kloramfenikol 0.03 gr/L dan ditambahkan gula sesuai dengan perlakuan, kemudian di tera hingga 1 liter. Sebelum disterilisasi, sebanyak 300 ml ekstrak kentang dituang ke dalam erlenmeyer 1 liter. Media selanjutnya disterilisasi pada suhu 121 oC dan tekanan 1 atm selama 20 menit. b). Ekstrak Kedelai Satu kilogram kedelai direbus dalam air sebanyak 3 liter selama 15 menit, kemudian dibiarkan selama 24 jam, lalu air rendaman kedelai disaring dan ditambah antibubble 0.2 ml/L dan antibiotik kloramfenikol 0.03 gr/L. Setelah itu, ditambahkan gula sesuai dengan perlakuan, dan air hingga volumenya mencapai 3 liter. Sebelum disterilisasi, 300 ml ekstrak kedelai dituang ke dalam erlenmeyer 1 liter. Media selanjutnya disterilisasi selama 20 menit pada suhu 121 oC dan tekanan 1 atm.
Gambar 2 Produksi massal biomassa miselia R. oligosporus
Isolat yang terpilih R. oligosporus, yaitu isolat yang menghasilkan pertumbuhan miselia paling cepat tetapi bersporulasi paling lambat atau menghasilkan spora dalam jumlah sedikit, ditumbuhkan pada 100 ml media PDA dalam
erlenmeyer 250 ml selama 5 hari, kemudian kultur ditambah air steril sebanyak 30 ml dan dikocok sampai sporanya larut dalam air. Setelah itu, larutan spora dituangkan ke dalam 300 ml ekstrak kedelai steril dalam erlenmeyer 1 liter dengan kondisi aseptik, lalu diinkubasi selama 5 hari dengan shaker (Gambar 2). III. Perlakuan penurunan asam nukleat. Penurunan asam nukleat dilakukan dengan cara memanaskan massa miselia selama 15 menit pada suhu 50 oC dan 65 oC dalam penangas air. Setelah itu miselia disaring dengan menggunakan kain kassa steril dan dikering ovenkan pada suhu 40 oC selama 4-5 hari. Setelah itu bobot keringnya ditimbang, sampel selanjutnya dianalisis kandungan asam nukleatnya. Miselia tanpa perlakuan pemanasan digunakan sebagai kontrol. Analisis kandungan asam nukleat dilakukan sebagai berikut, Sebanyak 1.5 gram miselia kering R. oligosporus dicuci dengan air dingin sebanyak dua kali, kemudian dihaluskan. Selanjutnya di-tambahkan 5 ml larutan PCA (Perchloric Acid) 0.5 N dingin dan larutan disentrifugasi selama 15 menit pada suhu 4 oC pada 3000 rpm. Bagian residu yang dihasilkan dilarutkan dalam 5 ml PCA 0.5 N dan dipanaskan pada suhu 100 oC selama 15 menit. Setelah dingin larutan tersebut disentrifugasi selama 15 menit pada 3000 rpm. Bagian supernatan yang dihasilkan kemudian dianalisis menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 260 nm.
Karakteristik setiap spesies Rhizopus yang berhasil diisolasi dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 1 Hasil pemurnian dan identifikasi Rhizopus yang berasal dari sampel tempe
Lokasi
Jumlah isolat
Aceh Padang
4 6
Cilegon
5
Jakarta
7
Bekasi
4
Bogor
5
Yogyakarta Malang
5 5
Jember Bondowoso
4 5
Situbondo
4
Balikpapan
4
Total Isolat
58
R. oligosporus R. oligosporus, R. stolonifer R. oligosporus, R. Stolonifer, R. oryzae R. oligosporus, R. Stolonifer, R. oryzae R. oligosporus, R. Stolonifer R. oligosporus, R. Stolonifer R. oligosporus, R. oryzae R. oligosporus, R. Stolonifer R. oligosporus, R. oryzae R. oligosporus, R. Stolonifer R. oligosporus, R. Stolonifer R. oligosporus, R. Stolonifer
Tabel 2 Identifikasi Rhizopus berdasarkan kunci identifikasi Rifai 1973 Spesies
R. oryzae
R. stolonifer
HASIL I. Isolasi dan Identifikasi Hasil isolasi dari 12 jumlah sampel tempe yang berasal dari 12 daerah di Indonesia, diperoleh 58 isolat (Tabel 1). Ke58 isolat teridentifikasi ke dalam 3 spesies, yaitu Rhizopus oryzae, R. stolonifer dan R. oligosporus berdasarkan morfologi sporangiofor, sporangium, sporangiospora dan rizoid (Tabel 2). R. oligosporus merupakan spesies yang dijumpai pada seluruh sampel tempe. R. stolonifer dijumpai pada 10 sampel tempe dan tidak dijumpai pada sampel yang berasal dari Aceh dan Yogyakarta. Sedangkan R. oryzae hanya dijumpai pada 3 sampel yang berasal dari Cilegon, Jakarta dan Yogyakarta (Tabel 1).
Hasil Identifikasi
R. oligosporus
Karakteristik Identifikasi - sporangiofor dan sporangium selalu membentuk sporangiospora. - ukuran spora berkisar 8-9 µm*. - Sporangiofor berizoid kaku dan dengan panjang dari 2-4 mm. - sporangiofor dan sporangium selalu membentuk sporangiospora. - ukuran spora berkisar 16-20 µm*. - Sporangiofor berizoid kaku dan dengan panjang dari 2-4 mm. - sporangiofor dan sporangium selalu membentuk sporangiospora. - ukuran spora berkisar 12-15 µm*. - permukaan spora halus tidak bergaris*.
*Diperoleh dari hasil identifikasi.
a S 50µm
50µm
b
c
sf st sp
50µm
Gambar 3 Struktur mikroskopis Rhizopus dengan perbesaran 40x pada media air. (a). R. oryzae., (b). R. stolonifers, (c). R. oligosporus (S) Sporangium, (sf) sporangiofor, (st) stolon, (sp) kumpulan spora
a
b
c
1.5 cm
2 cm
2 cm
Diagram rata-rata jumlah spora R. oryzae, R. stolonifer dan R. oligosporus 2 6
media air (x10 )
Jumlah spora dalam 10 ml
II. Produksi Miselia 1. Pemilihan Isolat. Pertumbuhan miselia dan spora ketiga spesies Rhizopus pada media PDA bervariasi. Ketiga spesies yang diuji menunjukkan bahwa R. oligosporus memiliki pertumbuhan miselia paling tinggi dibandingkan dengan kedua spesies lainnya. Sedangkan R. stolonifer dan R. oryzae memiliki pertumbuhan miselianya paling rendah (Gambar 4 dan Gambar 5). Pola pertumbuhan spora yang ditunjukkan dengan jumlah spora dari ketiga spesies menunjukkan hasil yang berbeda dengan pertumbuhan miselia. Jumlah spora R. oryzae lebih banyak dibandingkan dengan R. oligosporus ataupun R. stolonifer (Gambar 6). Pertumbuhan miselia dan produksi spora menunjukkan bahwa R. oligosporus memiliki pertumbuhan miselia yang cepat, tetapi mempunyai jumlah spora yang tidak terlalu banyak. Oleh karena itu, isolat tersebut dipilih untuk produksi miselia, sehingga produk yang dihasilkannya tidak berwarna gelap.
4.5 4 3.5
0.5 0
R. oryzae
R. oligosporus
2. Pemilihan media tumbuh dan konsentrasi gula untuk produksi massal miselia. Pertumbuhan miselia pada media tumbuh ekstrak kedelai lebih baik dibandingkan dengan media ekstrak kentang. Pertumbuhan miselia R. oligosporus pada media tumbuh ekstrak kedelai meningkat dengan penambahan gula hingga mencapai 5 gr/L (Gambar 7), tetapi penambahan gula lebih lanjut dapat menurunkan produksi miselia. Pertumbuhan miselia pada media tumbuh ekstrak kentang meningkat dengan penambahan gula. Namun peningkatan biomassa miselia tertinggi pada media tumbuh ekstrak kentang terjadi pada penambahan gula 4 gr/L (Gambar 7). Kurva rata-rata bobot kering R. oligosporus pada media cair ekstrak kentang dan kedelai 1
0.8
0.6
0.4
0.2
0 0
3
R. stolonifer
Gambar 6 Rata-rata jumlah spora R. oryzae, R. stolonifer dan R. oligosporus
Rata-rata bobot kering miselia R. oligosporus (gr)
Rata-rata pertumbuhan miselia (cm)
5
1
spesies
Gambar 4 Pertumbuhan isolat di media PDA pada hari ke-4 setelah inokulasi. (a). R. oryzae, (b). R. stolonifer, (c). R. oligosporus
kurva rata-rata pertumbuhan miselia R. oryzae, R. stolonifer dan R. oligosporus
1.5
1
2
3
4
5
6
Konsentrasi gula (gr/L)
2.5 2
Ekstrak kedelai
Ekstrak kentang
1.5
Gambar 7 Rata-rata bobot kering R. oligosporus pada media ekstrak kentang dan ekstrak kedelai
1 0.5 0 0
1
2
3
4
5
Hari ke-
R. oryzae
R. stolonifer
R. oligosporus
Gambar 5 Rata-rata pertumbuhan miselia R. oryzae, R. stolonifer dan R. Oligosporus
III. Perlakuan penurunan asam nukleat. Pemanasan pada suhu 50 oC sudah cukup untuk menurunkan kandungan asam nukleat miselia R. oligosporus yaitu sebesar 1.82 % dari bobot keringnya yaitu 1.5 gr, dimana batas aman kandungan asam nukleat untuk makanan ialah kurang dari 2 %. Pada penelitian ini dapat
dilihat juga bahwa pemanasan lebih lanjut lebih dapat menurunkan kandungan asam nukleatnya (Tabel 3). Tabel 3 Pengaruh suhu pemanasan tehadap kandungan asam nukleat Kandungan asam nukleat Suhu (oC) (% bobot kering) Kontrol 8.18 50 1.82 65 1.73
PEMBAHASAN Rhizopus ialah kapang yang termasuk dalam famili Mucoraceae dan ordo Mucorales (Moore-Landecker 1996). Di Indonesia kapang ini banyak ditemukan di alam karena hidupnya sebagai saprofit dan beberapa spesiesnya banyak digunakan dalam pembuatan tempe. Jenis Rhizopus yang sering ditemukan pada tempe, antara lain R. microsporus, R. oligosporus, R. rhizopodiformis, R. arrhizus, R. nigricans dan R. oryzae (Nout dan Kiers 2005). Tiga spesies yang berhasil diisolasi pada penelitian ini, ialah R. oligosporus, R. stolonifer dan R. oryzae, hal ini diduga saat mengisolasi Rhizopus sp. dari tempe, yang terisolasi hanya beberapa bagian saja atau ketiga spesies tersebut merupakan populasi yang dominan. Karakteristik unik dari R. oligosporus antara lain ialah dapat tumbuh dengan cepat pada suhu optimum 37 oC dan mempunyai aktivitas lipolitik yang tinggi (Hesseltine et al. 1963, diacu dalam Sofyan 2003). Hasil percobaan pada penelitian ini menunjukkan bahwa pertumbuhan miselia R. oligosporus lebih cepat dan produksi sporanya relatif rendah dibanding dengan R. stolonifer dan R. oryzae. Sehingga, R. oligosporus dipilih untuk produksi miselia dalam rangka pengembangan pangan berbasis kapang. Penelitian ini juga menunjukkan bahwa R. stolonifer menghasilkan spora dengan jumlah lebih sedikit dibandingkan dengan R. oligosporus. tetapi pertumbuhan miselia R. stolonifer lebih lambat dibanding dengan R. oligosporus dan menghasilkan miselia yang berwarna hitam oleh karena itu R. oligosporus tidak dapat digunakan untuk produksi massal miselia sebagai bahan pangan. Kapang R. stolonifer ini biasa disebut sebagai kapang hitam roti, karena spora yang dibentuknya berwarna hitam dan sering tumbuh pada roti (Ellis
1997). R. oryzae mempunyai pertumbuhan miselia lebih lambat dan produksi sporanya paling cepat dan banyak jika dibandingkan dengan kedua spesies lainnya. Selain itu beberapa strain R. oryzae menghasilkan toksin yang dapat menyebabkan zigomikosis (Ellis 1997). Kondisi ini menyebabkan R. oryzae dalam penelitian ini tidak digunakan untuk produksi massal miselia sebagai bahan pangan. Pertumbuhan kapang sangat dipengaruhi oleh medium substrat tumbuhnya. Salah satu faktor yang mempengaruhi pertumbuhan ialah kandungan nutrisi (Moore-landecker 1996). Kedelai (Glycine max Merr) sebagai substrat Rhizopus dalam pembuatan tempe merupakan salah satu hasil pertanian yang sangat penting artinya sebagai bahan pangan dan pakan, karena jumlah dan mutu protein yang dikandungnya sangat tinggi. Kedelai mengandung protein sekitar 40 %, kolesterol yang lebih rendah dari ikan dan susunan asam amino essensial yang lengkap sehingga protein kedelai mempunyai mutu yang mendekati mutu protein hewani. Oleh karena itu, kedelai merupakan media tumbuh yang baik untuk memproduksi miselia R. oligosporus. Hal ini dapat dilihat dari bobot kering R. oligosporus yang tumbuh pada media ekstrak kedelai hampir dua kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan yang tumbuh pada media ekstrak kentang. Hal ini diduga karena kandungan asam amino total kedelai lebih baik di-bandingkan dengan kentang, kedelai mengandung asam amino total sebesar 5.9 gr/100 gr, sedangkan kentang mengandung 4.12 gr/100 gr asam amino total. Kedelai juga mengandung protein yang dapat dicerna lebih tinggi daripada kentang, protein kedelai yang dapat dicerna adalah sekitar 94 %, sedangkan kentang hanya 40 % (USDA 1998). Kapang termasuk juga Rhizopus, memerlukan sumber karbon untuk pertumbuhannya, salah satunya ialah gula. Gula yang digunakan pada penelitian ini adalah sukrosa teknis. Penambahan gula sampai konsentrasi 4 gr/L dapat meningkatkan biomassa miselia, penambahan gula lebih lanjut sampai konsentrasi 5 gr/L dan 6 gr/L dapat menurunkan biomassa miselia (Taherzadeh et al. 2003). Sukrosa termasuk ke dalam golongan oligosakarida yang terdiri atas rantai pendek unit monosakarida yang saling berikatan kovalen (Lehninger 1982), sehingga dapat dengan mudah dipecah oleh kapang menjadi monosakarida (glukosa) yang mudah diserap dan digunakan dalam proses metabolismenya (Moore-Landecker 1996). Penggunaan sukrosa teknis ternyata dapat meningkatkan biomassa miselia. Selain itu, harga sukrosa teknis lebih
murah dibanding dengan sukrosa murni. Penggunaan sukrosa teknis dapat menekan biaya produksi yang akhirnya dapat menekan harga jual produk sehingga produk tersebut diharapkan dapat bersaing tidak saja dari segi kualitas tetapi juga dari segi harga. Kandungan asam nukleat dari miselia R. oligosporus setelah perlakuan pemanasan pada penelitian ini telah mencapai standar batas aman untuk dikonsumsi. Kandungan asam nukleat yang dicapai ialah 1.73-1.82 % sedangkan batas amannya ialah 2 % (USDA 1998). Hal ini menegaskan bahwa perlakuan pemanasan yang digunakan cukup efektif untuk menurunkan kandungan asam nukleat. Suhu dan lamanya pemanasan sangat berpengaruh terhadap kandungan asam nukleat. Pemanasan dapat merusak membran sel, sehingga komponen-komponen dalam sel tersebut larut dalam medium (Castro et al 1971) dan dapat menyebabkan enzim-enzim yang memproduksi asam nukleat terhidrolisis, sehingga enzim-enzim tersebut terdenaturasi dan menyebabkan produksi asam nukleat berkurang. Selain itu juga dapat menyebabkan hidrolisis RNA (Ohta et al 1971). Perlakuan pemanasan pada penelitian ini tidak berpengaruh terhadap organoleptik dari segi warna, bau dan tekstur miselia, namun pengaruh terhadap kandungan asam amino, isoflavon dan organoleptik lainnya belum dapat diketahui pada penelitian ini.
SIMPULAN Isolat Rhizopus yang berhasil diisolasi dari 12 daerah di Indonesia, ialah 58 isolat yang terdiri dari 3 spesies, yaitu, R. oryzae R. stolonifer dan R. oligosporus. Isolat terbaik untuk produksi miselia ialah R. oligosporus. Media ekstrak kedelai dengan konsentrasi 333.3 gr/L dan penambahan gula dengan konsentrasi 5 gr/L menghasilkan massa miselia R. oligosporus yang paling baik dibandingkan dengan ekstrak kentang dengan konsentrasi 200 gr/L dan penambahan gula dengan konsentrasi yang sama. Miselia R. oligosporus yang berkualitas tinggi mempunyai kandungan asam nukleat sebesar 1.73 % dengan dipanaskan pada suhu 65 oC selama 15 menit.
SARAN Perlu dilakukan isolasi dan identifikasi Rhizopus lebih lanjut dengan penambahan jumlah sampel tempe. Selain itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai media tumbuh dan konsentrasi gula yang digunakan serta analisis yang dilakukan tidak hanya asam nukleat tetapi juga asam amino, isoflavon dan organoleptik dari segi rasa sehingga dapat menghasilkan produk yang lebih berkualitas. Selain itu suhu pemanasan dan lamanya pemanasan perlu lebih bervariasi, sehingga diperoleh data yang lebih akurat lagi.
DAFTAR PUSTAKA [Depkes] Departemen Kesehatan, Dirjen Gizi Masyarakat dan Puslitbang Gizi. 1991. Komposisi Zat Gizi Pangan Indonesia. Jakarta : Balai Pustaka. [USDA] United State Food and Drugs Administration. 1998. Nutrient Data Base for Standard Reference. USA : Quorn Foods Inc. Castro AC, Sinskey AJ, Tannenbaum SR. 1971. Reduction of Nucleic Acid Content in Candida Yeast Cells by Bovine Pancreatic Ribonuclease A Treatment. J Appl Microbiol 22:422-427 Esaki H, Onozaki H, Kawakishi S, Osawa T. 1996. New Antioxidant Isolated From Tempeh. J Agric Food Chem 44 : 696-700. Ellis DH. 1997. Zygomycetes. Ed ke-9. London : Edward Arnold. Fardiaz S. 1992. Mikrobiologi Pangan. Jakarta : Gramedia Pustaka Utama. Hardjo, S. , 1964. Pengolahan dan Pengawetan Kedelai untuk Bahan Makanan Manusia. Bagian Gizi Fakultas Kedokteran. Jakarta : Universitas Indonesia. Harris RS, Karmas E. 1989. Evaluasi Gizi Pada Pengolahan Bahan Pangan. Ed ke-2. Bandung : ITB Bandung. Indarwaty, S. 2005. Ekspresi Subunit Biotin Kareboksilase Heteromerik Asetil-KoA Karboksilase Pada Jaringan Daun Dan Mesokarp Kelapa Sawit (Elaesis guineensis Jacq) [Skripsi]. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Karyadi D. 1985. Prospek Pengembangan Tempe Dalam Upaya Peningkatan Stabus Gizi Dan Kesehatan Masyarakat. Jakarta : Departemen Kesehatan RI. Lehninger AL. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Jilid ke-1,2. Thenawijaya M, penerjemah ;
Jakarta : Erlangga. Terjemahan dari : Principles of Biochemistry. Moore-landecker, Elizabeth. 1996. Fundamental Of The Fungi. Ed ke-4. New Jersey : Prentice-Hall Inc. Nout MJR, Kiers JL. 2005. Tempe Fermentation, Innovation and Functionality : Update Into the Third Millenium. J Appl Microbiol 98 : 789805. Ohta S, Maul S, Tannenbaum R. 1971. Characterization of a Heat-Shock Process for Reduction of the Acid Content of Candida utilis. J Appl Microbiol 22 : 415-421. Onions AHS, Allsopp D, Eggins HOW. Smith’s Introduction To 1981. Industrial Mycology. Ed ke-7. London : Edward Arnold Ltd. Rifai MA. 1973. Kunci Kerja Untuk Mendeterminasi Jenis-Jenis Rhizopus di Indonesia. Bogor : Herbarium Bogoriense. Rose AH, editor. 1982. Fermented Foods. Volume ke-7. London : Academic Press Ltd. Slamet DS, Tarwotjo Ig. 1980. Komposisi Zat Gizi Makanan Indonesia. Jakarta : Departemen Kesehatan RI. Sofyan HMI. 2003. Pengaruh Suhu Inkubasi dan Konsentrasi Inokulum Rhizopus oligosporus Terhadap Mutu Oncom Bungkil KacangTanah. Bandung : Universitas Pasundan. Suhaidi I. 2003. Pengaruh Lama Perendaman Kedelai dan Jenis Zat Penggumpal Terhadap Mutu Tahu. Medan : USU digital Library. Taherzadeh MJ, Fox M, Hjorth H, Edebo L. 2003. Production of Mycellium Biomassa and Ethanol From paper Pulp Sulfite Liquor by Rhizopus oryzae. J BioR. Tech 88 : 167-177. Wiryani E. 1991. Analisis Kandungan Limbah Cair Pabrik Tempe Kedelai Dan Upaya Pengolahannya Dengan Proses Anaerob [Tesis]. Bogor : Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Zee JA, Simard RE. 1975. Simple Process for the Reduction in the Nicleic Acid Content in Yeast. J Appl Microbiol 29 : 56-62.
