ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER DARI KULIT BATANG TUMBUHAN TURI (Sesbania grandiflora (L.) Pers. ) SERTA UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI Escherichia coli RESISTEN TERHADAP KLORAMFENIKOL (Skripsi)
Oleh Arif Nurhidayat
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2016
ABSTRACT
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF THE SECONDARY METABOLITES COMPOUND FROM THE STEMBARK OF TURI ( Sesbania grandiflora (L.) Pers.) AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY AGAINTS Escherichia coli RESISTENT TOWARDS CHLORAMPHENICOL
By
Arif Nurhidayat
Sesbania grandiflora (L.) Pers. is a traditional medical plant which was known the local nama, turi. This plant is belong to family Fabaceae and the third largest families of flowering plants. All parts of turi are traditionally used as medicine including antiinflamation, hepatitis, and the various of infection diseases. This study was aimed to isolate and identify the secondary metabolites compound from S. grandiflora stembark collected from Labuhan Ratu area, Lampung. The stambark of this plant were airdried, powdered, extracted with solvents by gradient polarity, and separated by repeated coloumn chromatography on silica gel to afford a new arilbenzofuran compound as a the yellowish needlle (m.p.. 214℃ - 216℃). The isolated compound was determined by using spectroscopic methodes such as UV-Vis, IR, and NMR analysis. Based on the spectroscopy data, the purified compound was identified as 6-methoxy-2-(2’,3’-dihyroxy-5’methoxyphenyl)-1-benzofuran-3-carbaldehide (5mg). The isolated compound was assayed againts E. coli resistent toward chloramphenical. The results showed that the tested compound had no antibacterial activity. Keyword: 2-arilbenzofuran, Escherichia coli, Sesbania grandiflora, Turi.
ABSTRAK
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER DARI KULIT BATANG TUMBUHAN TURI (Sesbania grandiflora (L.) Pers.) SERTA UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI Escherichia coli RESISTEN TERHADAP KLORAMFENIKOL
Oleh
Arif Nurhidayat
Sesbania grandiflora (L.) Pers. atau turi merupakan salah satu tanaman obat tradisional Indonesia yang termasuk dalam famili Fabaceae. Keseluruhan bagian dari turi memiliki manfaat diantaranya sebagai antiinflamasi, hepatitis, dan beberapa penyakit yang disebabkan infeksi. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalam kulit batang turi yang diambil di daerah Labuhan Ratu, Bandar Lampung serta untuk mengetahui aktivitas antibakteri isolat yang didapat. Penelitian ini dilakukan dimulai dengan pengumpulan dan preparasi sampel, ekstraksi, isolasi, serta pemurnian dengan menggunakan metode Kromatografi Cair Vacum dan Kromatografi Kolom sedangkan elusidasi struktur dilakukan dengan menggunakan spektroskopi UV-Vis, IR, serta NMR. Isolat yang didapat pada penelitian ini berupa kristal kuning berbentuk jarum dengan titik leleh 214℃ – 216℃. Berdasarkan intrepetasi data spektroskopi menunjukkan bahwa isolat yang didapat diidentifikasikan sebagai 6-metoksi-2-(2’,3’-dihidroksi-5’-metoksifenil)1-benzofuran-3-karbaldehid sebanyak 5,0 mg dari kulit batang tumbuhan turi (S. grandiflora). Uji aktivitas antibakteri Escherichia coli resisten terhadap kloramfenikol menunjukkan hasil negatif. Kata kunci: 2-aribenzilfuran, Escherichia coli, Sesbania grandiflora, Turi. .
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER DARI KULIT BATANG TUMBUHAN TURI (Sesbania grandiflora (L.) Pers.) SERTA UJI ANTIBAKTERI Escherichia coli RESISTEN TERHADAP KLORAMFENIKOL
Oleh
ARIF NURHIDAYAT
Skripsi
Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mencapai Gelar SARJANA SAINS Pada Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2016
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Panaragan Jaya, Tulang Bawang Barat pada tanggal 01 November 1993, sebagai anak bungsu dari 2 bersaudara hasil pernikahan ayahanda Zaenal Arifin dan Ibunda Siti Hidayatun(Almh).
Penulis mengenyam pendidikan dimulai dari Taman Kanakkanak (TK) Swadek Indah Panaragan jaya yang diselsaikan pada tahun 1999, kemudian dilanjutkan di SD Negeri 04 Panaragan jaya sampai tahun 2005. Pendidikan SMP Negeri 04 Pulung Kencana diselsaikan pada tahun 2008 pada tahun 2011 penulis menyelesaikan pendidikan tingkat atas di SMA PGRI 01 Tumijajar. Penulis dinyatakan sebagai mahasiswa jurusan kimia fakultas matematika dan ilmu pengetahuan alam (FMIPA) pada tahun 2012 melalui jalur PMPAP (Penerimaan Mahasiswa Perluasan Akses Pendidikan).
Selama menjadi mahasiswa penulis pernah mengikuti organisasi, dimulai dari KAMMI (Kader Muda Himaki) 2012, Anggota Biro Kesetariatan (2013), Anggota Muda Unit Kegiatan Mahasiswa Penelitian (2012), Anggota Biro Usaha
Mandiri (2014), Kepala Departemen Pendidikan Unit Kegiatan Mahasiswa Penelitian (2013).
Selama menjalani perkuliahan penulis pernah menerima beasiswa BBM (Bantuan Beasiswa Mahasiswa) pada tahun 2012-2013, BBP- PPA (Beasiswa Bantuan Pendidikan Peningkatan Prestasi Akademik) pada tahun 2013-2014 serta pada tahun 2014-2015. Penulis juga pernah menjadi asisten praktikum diantaraya: asisten praktikum Sains Dasar jurusan Ilmu Komputer (2014), asisten praktikum kimia dasar jurusan peternakan 2014, asisten praktikum kimia medik jurusan Kedokteran (2014), asisten praktikum kimia I bidang kimia organik jurusan kimia (2015), asisten praktikum kimia II bidang kimia organik (2016).
Motto
Maka, nikmat Tuhanmu manakah yang kamu dustakan? (QS. Ar-Rahman:13)
Dream, Belive, and Meka it Happen (Agnez Mo)
Jangan Pernah Ragu untuk Bermimpi yang Tinggi, dan Jangan Takut Untuk Jatuh dariMimpi yang diciptakan
(Arif Nurhidayat)
Persembahan
Tulisan sederhana karya kecil ini kupersembahkan untuk Ibunda Siti Hidayatun (Almh) serta Ayahanda Zaenal Arifin tercinta Kakanda Moch. Lukman Asrosi serta Evi Ibu Noviany, S.Si., M.Si., Ph.D. yang telah memberikan do’a semangat dan motivasi Teman-teman Untuk seseorang yang kelak akan menjadi makmumku dan ibu dari anak-anakku serta Almamater tercinta.
SANWACANA
Segala puja dan puji syukur hanyalah milik Allah SWT, karena atas rahmat, hidayah, dan kehendak-Nya penulis bisa menyelesaikan skripsi dengan judul : “Isolasi dan Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder dari Kulit Batang Turi (Sesbania grandiflora) serta Uji Aktivitas Antibakteri Escherechia coli Resisten Terhadap Kloramfenikol” Shalawat beriring salam selalu tercurah kepada Nabi Muhammad SAW, beserta keluarga, sahabat, dan para pengikutnya hingga akhir zaman nanti.
Bersamaan dengan selesainya skripsi ini, penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Ayah Zaenal Arifin dan ibuku Siti hidayatun(almh) yang tersayang, atas curahan kasih sayang, do’a, dan bimbingan yang tak ternilai harganya, kalian adalah inspirasi dan semangat hidupku. 2. Ibu Noviany, S.Si., M.Si., Ph.D. selaku Pembimbing Utama atas kesediaanya untuk memberikan ilmu, bimbingan, kritik dan saran dalam proses penyelesaian skripsi ini serta bimbingan dalam penyelesaian studi.
3. Ibu Prof. Dr. Tati Suhartati, M.S. selaku pembimbing kedua yang telah memberikan bimbingan, masukan dan kritikan dalam proses penyelesaian skripsi ini. 4. Bapak Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, M. T., selaku pembahas dan sekaligus Ketua Jurusan Kimia Fakultas MIPA Universitas Lampung, yang telah banyak memberi kritikan, masukan, dan saran dalam proses penyelesaian skripsi ini. 5. Bapak Prof. Dr. Jhon Hendri, M.s. serta ibu Dr. Zipora Sembiring, M.S. selaku Pembimbing Akademik, terimakasih atas bantun yang diberikan selama penulis menyelesaikan studi. 6. Bapak Prof. Dr. Warsito, S.SI., DEA., selaku Dekan Fakultas MIPA Universitas Lampung. 7. Seluruh Dosen Kimia FMIPA Unila terimakasih atas limpahan ilmu yang dberikan. 8. Kakakku tercinta Moch. Lukman Asrori serta kakak iparku satu-satunya mbak Evi yang selalu memberikan motivasi selama penuis menyelesaikan pendidikan. 9. my partner Noviany’s research Ayu Setianingrum (Ningrum), dan Radius Uly Artha (Kokom) terimakasih atas bantuan, dukungan, serta motivasi untuk penulis selama ini. 10.
Adik – adik Noviany’s research Erva Alhusna (Erva), Nita Yulian (Nita), Nessia Kurnia (Ines), Anggun Ferliasari (Anggun), dan Wahyuni Dewi terimakasih atas kerja sama serta supportnya selama ini.
11. Sahabat – sahabatku SMP anggota Chippss; Dion Alfiansyah (Dion),Syaiful Hamid (Hamid), dan Sujud Subekthi (Sujud) Terima kasih atas keceriaan kegilaan yang telah kalian ciptakan dalam hidupku. 12. Sahabat – sahabatku SMA ; Catur Rohmanto (Chatur), Citra Retno Dwi Aristya (Ciyex), Dhelly Adelia (Dhelly) Terimakasih atas warna yang kalian torehkan kedalam hidupku. 13. Terimakasih Arya Rifansyah telah bersedia menjadi sahabat sekaligus keluarga, bersedia menjadi pendengar keluh kesah penulis selama kuliah, terimakasih juga atas kritik, saran, serta masukan untuk penulis. Suatu saat kita akan bertemu dengan kesuksesan kita masing- masing. 14. Sahabat – sahabatku Feby Rinaldo Pratma Kusuma (Peby), Tiand Reno (Renoo), Edi Suryadi (Eyank uzur), Tri Marital (Maritul) dan Derry Vardella (Derry) Terimakasih atas persahabatan yang terjalin selama ini. Mari kita jemput kesuksesan kitaaa. 15. My Sponsorship mbak Ratu Dwi Gustianda Rasyidi, S.Pd. Terimakasih atas bantuan financial, kritik, saran, serta masukan untuk penulis. 16. Temen – temen angkatan 2012: Organic’s group; Tri Marital (Maritul), Ajeng Wulandari, S.Si (Ajeeng), Ayu Setianingrum (Ningrum), Dewi Aniatul Fatimah, S.Si., Ismi Khomsiah, S.Si (Khom), Intan Mailani, S.Si (Hj. ida), Putri Ramadhona (Dona), Radius Uly Artha (Kokom), Susi Isnaini Hasanah, S.Si., Tiara Dwi Astuti (Ara), Yepi Triapriani, S.Si (nyepii), Tazkia Nurul,S.Si. Anorganic’s group; sukamto,S.Si (kamto), Murni Ftria, S.Si (Murni), Adi Setiawan, S.Si (Adii), Jean Pitaloka, S.Si (jeje), Tiand reno (Reno), Khoirul Anwar (Anwer), Nila Amalin Nabilah (Komeng 1), Siti Aisah
(Ais), Rifki Khusnul khuluk, Siti Nurhalimah (Imah), Indry Yani Saney (Indry), Indah Wahyu P. (Iin), Analitic’s group : Eka Hurwaningsih (kutil), Ulfatun Nurun (Upeh), Yunsi’U, S.Si, Riandra P, S.Si., Rizal Rio S, Dwi Anggraini, S.Si., Apri Welda, Wiwin Sarwita, Febita glisenda, Elsa Zulha, Atma Istanami, Derry Vardella, Deborah Jovita (Deby), Adityan Sulung S, Zubaidi(Ubay), Agus Ardiyansyah (Adam), Physic’s group : Fenti Visiamah, S.SI., Tiurma Debora S, S.Si., Ferdiand H, Ruliana Juni A, Sopin Sumilat R, S.Si., Edi Suryadi, S.Si., Arya Rifansyah, S.Si., Suwarda Dua Imatu dela, S.Si., Feby Rinaldo P (Tazlem), Ana Maria K. Biochemistry’s group : Fifi Adriyanthi, Rizki Putriana, Syatira Assegaf, Diani Iska M (Didi), Meta Fosfi B, Ayu Imani (A’im), Rizal Robbani. 17. Moch. Reynaldo Nedya (Aldo), Yusuf Hadi Kurniawan (Ucup), Fikri Muhamad, Bagus Satrio, Heris terimakasih atas bantuannya selama penulis mengerjakan penelitian... thank you so much... 18. Punggawa – punggawa Wisma Erlangga : Cukamto gadis termanis, Sopian Sumilat Rizki ustadz wisma, Rifki khusnul , Novanda Bambang (Pecinta tidur) Moch. Reynaldo Nedya Adek gua yang paling begajulan, Awan Sugandi Adek yang paling Cantik, M. Basri, Wahyu, Regie Andica Putri 19. Teman-teman kerja di Laboratorium Kimia Organik : Ningrum, Kokom, Erva, Nita, Ines, Wahyuni, Anggun, Ajeng, Ismi, Susi, kak Rio, Dona, Inggit, Badi, Nurul, Vickha, Arni, Yepi, Tiara, Tazkia, Siti, Aul, Shela, Dona’13, khalimatus, Kak Nawan, kak Ridho, mbak Ratu, Mbak Endah. 20. Mbak Wiwit Kasmawati selaku laboran kimia organik terimakasih atas bantuan yang diberikan.
21. Teman – teman 2010, 2011, 2013, 2014, dan 2015. 22. Rekan-rekan KKN desa Kanoman Acmad Fibriansyah, Cindy Felixia, Heni Novianti, Siti Nurhayati, Vera Puspita Ningrum, Wahyu Olan Saputra terimakasih atas rasa kekeluargaan yang kalian ciptakan. 23. Terimakasih kepada keluarga besar bpk. Azhari Patnoto serta ibu Eli Setiawati, ibu Lis atas bantuan, kriktik, masukan, dan saran yang telah diberikan. Akhir kata, penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan, akan tetapi sedikit harapan semoga skripsi ini dapat berguna dan bermanfaat bagi kita semua. Amiin. Bandar Lampung, November 2016 Penulis
Arif Nurhidayat
i
DAFTAR ISI
Halaman DAFTART ISI .......................................................................................................... i DAFTAR TABEL .................................................................................................... iv DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ v
I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang .................................................................................................. 1 B. Tujuan Penelitian .............................................................................................. 5 C. Manfaat Penelitian ............................................................................................ 5
II. TINJAUAN PUSTAKA A. Fabaceae .......................................................................................................... 6 B. Turi (Sesbania grandiflora) .............................................................................. 7 C. Efek farmakologi .............................................................................................. 10 D. Kandungan metabolit sekunder ....................................................................... 11 1. Terpenoid ..................................................................................................... 12 2. Flavonoid ...................................................................................................... 14 3. 2-arilbenzofuran ............................................................................................ 17 E. Isolasi senyawa metabolit sekuder ................................................................... 17 1. Aspek umum ................................................................................................ 17 2. Ekstraksi ...................................................................................................... 18 3. Pemisahan senyawa secara kromatografi .................................................... 19 4. Analisis kemurnian ...................................................................................... 21 F. Identifikasi Spektroskopi ................................................................................... 22
ii
1. Spektroskopi UV-VIS .................................................................................... 23 2. Spektroskopi Inframerah .............................................................................. 24 3. Spektrometri RMI ......................................................................................... 25 4. Spektrometri HSQC ...................................................................................... 26 5. Spektrometri HMBC ..................................................................................... 27 G. Bakteri ........................................................................................................... 27 H. Antibakteri ................................................................................................... 28 I. Metode uji ..................................................................................................... 30 1. Metode dilusi ............................................................................................... 30 2. Metode difusi ............................................................................................... 30
III. METODE PENELITIAN A. Waktu dan tempat penelitian ......................................................................... 32 B. Alat dan Bahan ............................................................................................... 32 1. Alat-alat yang digunakan ........................................................................... 32 2. Bahan-bahan yang digunakan .................................................................... 33 C. Prosedur Penelitian ........................................................................................ 33 1. Pengumpulan dan persiapan sampel .......................................................... 33 2. Ekstraksi denagan berbagai pelarut............................................................ 34 3. Kromatografi cair vakum .......................................................................... 34 4. Kromatografi lapis tipis ............................................................................ 35 5. Kromatografi kolom................................................................................... 35 6. Analisis kemurnian ................................................................................... 36 7. Spektroskopi ultraungu-tampak ................................................................ 36 8. Spektroskopi inframerah ........................................................................... 36 9. Spektroskopi Resonansi Magnetik nuklir ................................................. 37 10. Uji aktivitas terhadap E. coli resisten terhadap kloramfenikol ................ 37
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Preparasi sampel ........................................................................................... 39 B. Ekstraksi ........................................................................................................ 39 C. Isolasi dan Pemurnian .................................................................................... 40
iii
1. Kromatografi Cair Vacum (KCV) .......................................................... 40 2. Kromatografi Kolom Gravitas (KKG) .................................................... 44 D. Analisis Kemurnian ........................................................................................ 46 E. Penentuan Struktur Senyawa Hasiol Isolasi ................................................... 47 1. Spektroskopi ultraviolet-tampak (UV-Vis)............................................. 47 2. Spektroskopi Fourier Transformer Infrared Spektrocopy (FTIR) ......... 48 3. Spektroskopi Nuclier Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) ......... 49 F. Uji Bioaktivitas Antibakteri ............................................................................ 53
V. SIMPULAN DAN SARAN A. Simpulan ........................................................................................................ 56 B. Saran ............................................................................................................... 57
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................... 58 LAMPIRAN .............................................................................................................. 65
DAFTAR TABEL
Tabel
Halaman
1. Penggolongan kromatografi ..............................................................................19 2. Karakteristik frekuensi uluran beberapa gugus fungsi ......................................25 3. Nilai geseran kimia untuk 1H dan 13C NMR Nilai geseran kimia untuk 1H dan 13C NMR .....................................................................................26 4. Korelasi Hidrogen dan Karbon (HSQC) ...........................................................49 5. Data korelasi jarak jauh (HMBC) senyawa AR-1A..........................................51
6. Perbandingan data NMR antara eryvarins P dan AR-1A..................................52 7. Ukuran zona hambat dari senyawa hasil isolasi terhadap bakteri Escherechia coli ................................................................................................54
v
DAFTAR GAMBAR
Gambar
Halaman
1. Bagian-bagian dari tumbuhan turi......................................................................9 2. Senyawa diterpenoid yang telah terisolasi dari famili Fabaceae .....................13 3. Senyawa triterpenoid yang telah terisolasi dari famili Fabaceae .....................14 4. Senyawa-senyawa fenolik yang terisolasi dari famili Fabaceae ......................16 5. Kerangka dasar 2-arilbenzofuran .....................................................................17 6. Jenis radiasi elektromagnetik dan panjang gelombang....................................23 7. Kromatogram KLT ekstrak kasar etil asetat menggunakan eluen etil asetat/n- heksan 2 ; 8.................................................................................40 8. Kromatogram KLT KCV etil asetat menggunakan eluen etil asetat/n-heksan 2 ; 8..................................................................................42 9. Kromatogram KLT 9 fraksi KKV menggunakan eluen aseton/ n-heksan 3 ; 7 ...................................................................................................43 10. KKG fraksi B9, B10, C11, dan C12 menggunakan eluen aseton/n-heksana ... 44 11. Kristal senyawa AR-1A ...................................................................................44 12. Kromatogram hasil KLT AR-1A .....................................................................45 13. Kromatogram KLT kristal AR-1B dari fraksi B (sub-fr.13-15) setelah disemprot dengan serium sulfat .........................................................46 14. Kromatogram KLT senyawa AR-1A dengan 3 sistem eluen: (a) aseton/n heksana:3/7; (b) etilasetat/aseton: 9/1; (c) kloroform/metanol: 99/1.............................................................................46 15. Spektrum UV-Vis senyawa AR-1A .................................................................48
vi
16. Spektrum IR senyawa AR-1A..........................................................................49 17. Struktur-6-hidroksi-2-(4-hidroksi-2,5-dimetoksifenil)-1-benzofuran-3karbaldehid (eryvarins P) .................................................................................51 18. Senyawa AR-1A {6-metoksi-2-(2,3-dihidroksi-5-metoksifenil)-1 benzofuran3-karbaldehid}..................................................................................................52 19. Pengamatan uji antibakteri setelah 2 x 24 jam.................................................54
1
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Bakteri merupakan suatu mikroorganisme yang dapat dikelompokkan kedalam golongan makhluk hidup prokariotik atau organisme yang tidak memiliki selubung inti. Berdasarkan pewarnaan gram, bakteri dapat diklasifikasikan dalam 2 golongan yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif ( Jawatz , 2005). Secara sederhana bakteri dapat dibagi dalam dua golongan besar yakni patogen yang artinya menunjuk pada bakteri penyebab penyakit serta nonpatogen yang menunjuk pada bakteri yang tidak menyebabkan penyakit.
Bakteri yang masuk kedalam kelompok patogen secara klasik diduga memiliki sifat-sifat tertentu yang memperkuat kemampuan bakteri tersebut menimbulkan penyakit (Shulman, 1994). Banyak penyakit yang disebabkan oleh bakteri, seperti contohnya gangguan pada pencernan seperti tifus, dan diare, pnemunia serta bakteri yang menyerang paru – paru seperti tuberkulosis (TBC). Bervariasinya bakteri yang menyebabkan berbagai penyakit manusia, memaksa para peniliti mengembangkan gagasan pemikiran untuk menangani penyakit yang disebabkan oleh bakteri.
2
Telah ditemukan cara yang saat ini mampu untuk mengatasi perkembangan penyakit yang disebabkan oleh bakteri yakni dengan mengonsumsi antibiotik. Antibiotik adalah zat biokimia yang diproduksi oleh mikroorganisme yang dalam jumlah kecil dapat menghambat pertumbuhan atau membunuh mikroorganisme lain. Namun, penggunaan antibiotik yang tidak tepat dapat menimbulkan permasalahan yang cukup serius. Penggunaan antibiotik yang tidak tepat dosis dapat menggagalkan terapi pengobatan yang sedang dilakukan. Selain itu dapat menimbulkan bahaya seperti Resistensi, ialah tidak terganggunya sel mikroba oleh antibiotik yang merupakan suatu mekanisme alami untuk bertahan hidup. Suprainfeksi yaitu infeksi sekunder yang timbul ketika pengobatan terhadap infeksi primer sedang berlangsung dimana jenis dan infeksi yang timbul berbeda dengan infeksi primer (Tjay dan Rahardja, 2007). Melihat efek samping yang ditimbulkan oleh antibiotik, pengembangan metode untuk mengatasi infeksi bakteri harus terus dilakukan seperti contohnya memanfaatkan bahan alam.
Dewasa ini penggunaan bahan alam untuk pengobatan lebih ditekankan, hal ini dikarenakan sedikit bahkan hampir tidak ada efek negatif yang ditimbulkan dari penggunaan obat yang bersumber dari bahan alam. Kemampuan bahan-bahan alami untuk menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang dapat memberikan efek farmakologis menjadikan bahan alami tersebut sering digunakan sebagai salah satu sumber alternatif untuk menyembuhkan penyakit tertentu.
Senyawa metabolit sekunder merupakan suatu senyawa yang disintesis atau dihasilkan oleh suatu makhluk hidup bukan untuk memenuhi kebutuhan dasarnya, akan tetapi untuk mempertahankan eksistensinya dalam berinteraksi dengan
3
ekosistem. Secara umum senyawa metabolit sekunder dibagi dalam beberapa golongan alkaloid, terpenoid, steroid, dan flavonoid (Ahmad, 2004). Salah satu tumbuhan yang belum dikaji secara intensif di Indonesia adalah tumbuhan yang termasuk dalam famili Fabaceae. Famili Fabaceae ini memiliki bioaktivitas yang cukup menarik seperti antioksidan, antimalaria, antikanker, serta antibakteri. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan pada beberapa spesies yang termasuk dalam famili Fabaceae seperti A. greggii (akasia) dan D. regia (flamboyan) yang menyatakan bahwa ekstrak etanol A. greggii (akasia) dan D. regia (flamboyan) pada konsentrasi 5 mg/mL memiliki aktivitas paling baik sebagai antiradikal bebas dengan IC50 masingmasing 2,19 dan 4,03 mg/mL. Sementara itu penelitian pada spesies yang lain yaitu C. senna menunjukkan bahwa ekstrak metanol dari daun C. senna memiliki aktivitas sitotoksik yang cukup tinggi (Hossain et al., 2012). Secara umum kandungan kimiawi dalam satu spesies dengan spesies lain dalam satu genus atau famili memiliki kandungan yang hampir sama secara kualitatif. Perbedaanya hanya terdapat pada kuantitas dari senyawa yang dihasilkan, faktor yang mempengaruhi adalah ekosistem tempat tumbuh, geografis, iklim, topologi, dan bagian tumbuhan yang digunakan (Venkataraman et al., 1972). Jenis lain dari tumbuhan yang masih satu famili dengan C. senna, B. purpurea (kupu-kupu), A. greggii (akasia), P. indicus (angasana), D. regia (flamboyan) yaitu Sesbania grandiflora (turi).
S. grandiflora atau turi merupakan tumbuhan yang termasuk dalam famili Fabaceae. Tumbuhan ini memiliki waktu hidup yang cukup panjang dan banyak ditemukan di daerah Asia. Kajian fitokimia dan efek farmakalogi tumbuhan turi
4
telah dilakukan sebelumnya oleh beberapa peneliti menyatakan bahwa bagian bunga tumbuhan turi dapat digunakan sebagai sumber vitamin C dan kalsium, serta memiliki kandungan saponin yang bersifat pencahar. Sedangkan menurut Reji dan Alphonse (2013), secara umum tumbuhan turi memiliki kandungan karbohidrat, protein, flavonoid, alkaloid, tanin, dan glikosida . Uji aktivitas antijamur dilakukan pada ekstrak akuades, etanol, dan aseton dari daun S. grandiflora (turi), hasilnya menunjukkan bahwa ketiga ekstrak sampel menunjukkan aktivitas antijamur, namun aktivitas antijamur yang paling baik ditunjukkan oleh ekstrak etanol dibandingkan dengan ekstrak akuades dan aseton. Sementara itu, ekstrak etanol menunjukkan adanya kandungan alkaloid, tanin, saponin, steroid, dan glikosida yang cukup tinggi (Padmalochana dan Rajan, 2014).
Baru - baru ini telah dilakukan skrining fitokimia pada beberapa jaringan tumbuhan S. grandiflora (turi). Uji pendahuluan yang dilakukan menunjukkan bahwa pada bagian batang turi mengandung flavanoid, terpenoid, saponin, serta tanin (Nurhidayat, 2015). Beberapa senyawa jenis isoflavanoid telah berhasil diisolasi pertama kali dari akar tumbuhan S. grandiflora (turi). Semua senyawa isolat yang diperoleh menunjukkan aktivitas anti-TB terhadap M. tuberculosis (Hasan et al., 2012). Berdasarkan pemaparan informasi di atas penulis tertarik untuk meneliti kandungan senyawa metabolit sekunder dari kulit batang turi. Mengingat tumbuhan turi memiliki potensi sebagai agen anti-TB, maka pada penelitian ini akan dilakukan isolasi dan identifikasi pada bagian kulit batang tumbuhan turi dilanjutkan dengan pengujian aktivitas biologisnya terhadap bakteri lain selain bakteri M. tuberculosis seperti bakeri Escherichia coli.
5
B. Tujuan Penelitian
Tujuan dilakukan penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa metabolit sekunder dari kulit batang tumbuhan turi (S. grandiflora). 2. Menguji bioaktivitas senyawa hasil isolasi terhadap bakteri E. coli reisten pada kloramfenikol.
C. Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini diharapkan memberikan informasi tentang kandungan metabolit sekunder dari kulit batang turi (S. grandiflora) serta dapat digunakan sebagai database tambahan sumber alami tumbuhan yang berpotensi sebagai agen antibakteri.
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Fabaceae
Fabaceae atau Leguminosae merupakan salah satu dari tiga famili tumbuhan terbesar setelah famili Orchidacea dan Asteraceae yang termasuk dalam divisi Angiospermae atau tumbuhan berbunga. Famili Fabaceae terdiri atas 730 genus dan 19.400 spesies. Genus terbesar dari famili ini yaitu Astragalus memiliki sekitar 2000 spesies, Acacia terdiri dari ± 900 spesies, sekitar 700 spesies untuk genus Indigofera, Crotalaria dengan 600 spesies, dan kurang lebih 500 spesies termasuk dalam genus mimosa.
Famili Fabaceae dikelompokkan kedalam 3 subfamili yaitu Mimosoidae, Caesalpiniodeae, dan Papilionoideae. Pengelompokkan ini didasarkan pada morfologi bunga khususnya pada bentuk kelopaknya. Famili Fabaceae merupakan salah satu famili tumbuhan yang banyak dijumpai di lingkungan sekitar atau Indonesia. Fabaceae bersifat kosmopolitan karena dapat dijumpai dari daerah yang bersuhu dingin sekali hingga sampai hangat, sub-tropis dan tropis. Famili Fabaceae mempunyai ciri khas yang mudah diamati yaitu terdapatnya buah polong dan dengan adanya sifat-sifat serta karakteristik
7
pada bunganya. Famili ini dibagi menjadi tiga subfamili yaitu mimosoideae, papilionoideae, dan caesalpinoideae dibawah ordo fabales (Tjitrosoepomo, 2013).
Beberapa penelitian telah dilakukan dan menyatakan bahwa famili Fabaceae memiliki kandungan metabolit primer seperti lectin, kitin, dan inhibitor - amilase serta memiliki kandungan metabolit sekunder contohnya alkaloid, terpenoid, tanin, dan senyawa fenolik (Carlina and Grossi-de- Sá, 2002; Sotheeswaran and Pasupathy, 1993; Wink and Mohammed, 2003). Selain itu, famili ini dikenal juga sebagai sumber lipid, dan memiliki kandungan asam omega 3 lemak tak jenuh yang telah banyak dikaitkan dengan manfaat kesehatan. Sebagian besar masyarakat menggunakan tanaman famili fabeceae sebagai obat tradisional atau pengobatan herbal seperti gangguan pada ginjal, diabetes, sakit mata, sakit gigi, dan disentri (Neto et al., 2008; Roosita et al., 2008; Vitor et al., 2004; and Watjen et al., 2007). Kajian farmakologi pada sejumlah senyawa yang berhasil diisolasi dari beberapa spesies tumbuhan Fabaceae mengindikasikan bahwa isolat yang diperoleh menunjukkan aktivitas sebagai antimikroba dan antimalaria (Hawas et al., 2011).
B.
Sesbania grandiflora
S. grandiflora merupakan pohon yang memiliki ukuran relatif kecil dengan tinggi mencapai 10 m. Tumbuhan ini diyakini berasal dari Asia Selatan dan Asia Tenggara dan sekarang telah tersebar diberbagai belahan dunia. S. grandiflora termasuk dalam famili Fabaceae subfamili papilionoideae, dan dikenal dengan tuwi (Bali), turi (Jawa), dan toroy (Madura). Tumbuhan ini banyak tersebar
8
dibeberapa negara seperti India, Malaysia, Indonesia, Myanmar, dan Filipina. Tanaman ini memiliki umur yang panjang dengan pertumbuhan yang cepat serta cabangnya menggantung (Heering and Gutteridge, 1992).
Dalam taksonomi, tumbuhan ini diklasifikasikan sebagai berikut : Kerajaan : Plantae Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Ordo : Fabales Famili : Fabaceae Sub-famili : Faboideae Genus : Sesbania Spesies : S. grandiflora Nama binomial: Sesbania grandiflora (L.) Poiret (Sumber :Kementrian Pertanian, 2010). Tanaman turi (S. grandiflora) memiliki ciri-ciri fisik secara umum berdasarkan jaringannya, diantaranya memiliki sedikit cabang dengan tinggi sekitar 8-15 m dan berdiameter 25-30 cm. Kulit luar batangnya berwarna abu-abu kehitaman, kasar, terdapat retakan vertikal yang panjang selebar 1-2 cm. Kulit kayu bila ditoreh akan mengeluarkan lender berwarna kuning kemerahan (Gambar 1a). Daun pada tanaman turi ini memiliki ciri yaitu majemuk menyirip sepanjang 30 cm dengan jumlah anak daun genap (berpasangan) sekitar 2050 anak daun pertangkai serta berbentuk lonjong atau oval (Gambar 1b). Sementara pada bagian bunga memiliki bentuk tandan, tumbuh pada ketiak daun.
Kelopak bunga berbentuk bulan sabit dan mahkota bunga menggantung seperti lonceng. Berdasarkan varietasnya, mahkota bunga dibagi menjadi 2 macam, yaitu berwarna merah dan berwarna putih. Penampakan dari bunga tanaman turi ditunjukkan pada Gambar 1c. Selain jaringan diatas tumbuhan ini
9
juga memiliki buah. Polongnya menggantung berbentuk ramping dan lurus dengan ujung meruncing. Ukuran panjang polong 30-50 cm dengan lebar 1-1,5 cm. Ketika masih muda, polong berwarna hijau, kemudian setelah tua berwarna kuning. Polong dari tumbahan turi ditunjukkan pada Gambar 1d. (Kementrian Pertanian, 2010). 1a
1b
1c
1d
Gambar 1. Bagian-bagian dari tanaman turi (a) Batang (b) Daun (c) Bunga (d) Biji (Kementrian Pertanian, 2010).
10
C. Efek Farmakologi
Tumbuhan turi telah dikenal sebagai tumbuhan yang memiliki manfaat dalam bidang pengobatan, hal ini dikarenakan kemampuan tumbuhan turi dapat digunakan sebagai oabt tradisional atau obat herbal. Seluruh bagian dari tumbuhan turi diyakini memiliki manfaat sebagai obat baik pada bagian batang, bunga, akar serta pada bagian daunnya. Bidang kedokteran di India telah menggunakan daun turi sebagai media penyembuhan penyakit epilepsi (Kasture et al., 2002). Selain itu penelitian yang dilakukan oleh Doddola et al (2008) menyatakan bahwa jus daun turi dapat digunakan sebagai pemecah batu ginjal yang cukup efektif. Tidak hanya itu saja daun dari tumbuhan turi dapat digunakan sebagai media penyembuhan keputihan pada wanita serta pada bagian buah atau biji dapat digunakan sebagai obat hepatitis. Bagian akar secara umum digunakan sebagai antiinflamasi dan penurun demam (Wagh et al., 2009). Selain akar, jaringan lain seperti batang turi juga dimanfaatkan sebagai obat. Di Filipina, bubuk batang turi digunakan sebagai obat borok atau bisul yang terdapat dalam mulut dan sistem pencernaan, sedangkan di Combodia potongan batang turi digunakan untuk menyembuhkan penyakit kudis, sementara itudi pulau Jawa bubuk batang turi digunakan sebagai obat sariawan, polio, dan sakit perut (Wagh et al., 2009). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Serti et al., (2001) dinyatakan bahwa ekstrak etanol dari batang turi menunjukkan aktivitas antiinflamasi yang cukup baik. Penelitian lain pada tumbuhan turi dilakukan oleh Romesh and Begum (2006); Romesh et al (2007); Romesh (2010) menyatakan bahwa suplemen daun turi menunjukkan pencegahan oksidasi yang dapat merusak paru-paru, hati, dan
11
ginjal. Juga telah diujikan pada mencit, sehingga dapat disimpulkan bahwa daun tumbuhan turi memiliki potensi sebagai antioksidan. Investigasi juga dilakukan oleh Shareef et al (2012) menyatakan bahwa turi memiliki kemampuan sebagai anti-inflamasi, antiseptik, analgesik, serta antioksidan. Pada bagian bunga dan daun memiliki efek antioksidan (Gowri and Vasantha, 2010). Efek antioksidan dari turi kemungkinan dikarenakan adanya senyawa flavonoid oleh adanya penangkapan radikal bebas melalui donor proton hidrogen dari gugus hidroksil flavonoid (Amic et al., 2003). Aktivitas antioksidan flavonoid terutama dipengaruhi oleh substitusi gugus hidroksi pada posisi orto dan para terhadap gugus OH dan OR (Pertiwi, 2006).
Metabolit sekunder merupakan senyawa kimia yang terdapat dalam suatu organisme yang tidak terlibat secara langsung dalam proses pertumbuhan, perkembangan atau reproduksi organisme. Berbeda dengan metabolit primer yang ditemukan pada seluruh spesies dan diproduksi dengan menggunakan jalur yang sama, senyawa metabolit sekunder tertentu hanya ditemukan pada spesies tertentu. Tanpa senyawa ini organisme akan menderita kerusakan atau menurunnya kemampuan bertahan hidup. Fungsi senyawa ini pada suatu organisme diantaranya untuk bertahan terhadap predator, kompetitor, dan untuk mendukung proses reproduksi (Herbert, 1996).
D. Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder
Kandungan metabolit sekunder yang terdapat pada tanaman famili ini cukup banyak dan beragam, dari susunan molekul sederhana hingga molekul yang paling
12
rumit sekalipun ada pada famili ini. Secara garis besar senyawa metabolit sekunder dikelompokkan menjadi dua jenis yaitu senyawa fenolik dan non-fenolik. Salah satu metabolit sekunder non-fenolik yaitu kelompok terpenoid. Kelompok terpenoid ini ditemukan dalam berbagai variasi misalnya diterpen dan triterpen glikosida yang disebut dengan saponin.
1.
Terpenoid
Terpenoid merupakan komponen yang biasa ditemukan dalam minyak atsiri. Sebagian besar terpenoid mengandung atom karbon yang jumlahnya merupakan kelipatan lima. Terpenoid mempunyai kerangka karbon yang terdiri dari dua atau lebih unit C5 yang disebut unit isopren (Achmad, 1986). Berdasarkan jumlah atom C yang terdapat pada kerangkanya, terpenoid dapat dibagi menjadi hemiterpen dengan 5 atom C, monoterpen dengan 10 atom C, seskuiterpen dengan 15 atom C, diterpen dengan 20 atom C, triterpen dengan 30 atom C, dan seterusnya sampai dengan politerpen dengan atom C lebih dari 40 (Nagegowda, 2010; Dewick, 2009). Linn et al (2005) telah berhasil mengisolasi senyawa pada Fabaceae yaitu senyawa diterpen berupa senyawa furanoditerpen tipe cassane. Senyawa jenis ini atau furanoditerpen merupakan senyawa yang telah diselidiki memiliki kemampuan sebagai antimalaria, senyawa furanoditerpen ini banyak ditemukan pada genus Caesalpinia. Tidak hanya furanoditerpen yang telah diisolasi dari famili Fabaceae, contoh lain senyawa yang telah diisolasi yaitu norcaesalpinin E (1), caesalpinin C (2), caesalpinin D (3) yang ketiganya telah diselidiki memiliki kemampuan sebagai antimalaria . Struktur- struktur dari ketiga senyawa ditunjukkan pada Gambar 2.
13
Gambar 2. Senyawa diterpen yang telah diisolasi dari Fabeceae (Linn et al., 2005)
Selaian senyawa terpen dengan jenis monoterpen atau diterpen yang telah dijelaskan diatas terdapat juga jenis terpenoid yang lain yaitu triterpen. Jenis senyawa terpenoid yang lain adalah triterpen. Senyawa triterpen sering ditemukan dalam bentuk saponin. Misalnya pada genus Astragalus ditemukan gleditsiosida N, O, dan P yaitu saponin yang terikat dengan monoterpen, senyawa tersebut diperlihatkan pada Gambar (4-6). Gleditsiosida N dan O terikat dengan dua unit monoterpen sedangkan gleditsiosida P terikat dengan tiga unit monoterpen yang terasetilasi pada C3 dan C6 dari gugus glikosidanya (Zhang et al., 1999), sedangkan dari Astragalus kahiricus telah berhasil diisolasi kahirikosida II yang disajikan pada Gambar (7) (Radwan et al., 2004).
14
R3
(4) R1 = CH2OH
R2 = H
(5) R1 = CH3, 6= S
R2 = H
(6) R1 = CH3, 6= S
R2 = R3
(7) Gambar 3. Senyawa triterpen yang diisolasi dari Fabecea (Zhang et al.,1999;Radwan et al., 2004)
2.
Flavonoid
Flavonoid merupakan salah satu kelompok senyawa bahan alam yang banyak ditemukan pada tumbuhan. Flavonoid pada umumnya mempunyai kerangka flavon C6-C3-C6, dengan tiga atom karbon sebagai jembatan antara gugus
15
fenil yang biasanya juga terdapat atom oksigen. Senyawa ini biasanya terdapat sebagai pigmen tumbuhan untuk menarik pollinators, atau sebagai bahan pertahanan bagi tumbuhan untuk melawan serangga dan mikroorganisme (Rosa, Emilio, and Gustavo, 2010). Senyawa fenolik juga ditemukan dan telah diisolasi dari famili ini. Senyawa fenolik yang banyak ditemukan pada Fabaceae adalah flavonoid. Misalnya dari Guibourtia coleosperma, senyawa flavonoid yang dihasilkan adalah flavonoid yang terikat dengan glikosida misalnya epikatecin- (4b - 8)- 7-O-β-D- xyloppiranosilepikatecin (8) yang berupa dimer dan 7-O-β-D- xyloppiranosil-epikatecin (9) yang berupa monomer (Bekker et al., 2006).
Berbeda dengan genus Caesalpinia, flavonoid yang dihasilkan berupa homoisoflavonoid misalnya bonducellin (10) yang diisolasi dari Caesalpinia Pulcherima (Zhao et al., 2004). Genus Milletia menghasilkan senyawa flavonoid yang berbeda dengan dua spesies sebelumnya, genus Milletia ini menghasilkan senyawa flavonoid berupa isoflavon yang terprenilasi. Milletia papchycarpa diketahui mengandung millewanins G (11), millewanins H (12), dan furowanin B (13) (Ito et al., 2006). Senyawa lain yang pernah diisolasi adalah bauhiniastatin 1-2 (14-15) yang diisolasi pada Bauhinia purpurea. Bauhinisantin 1 (14) juga diketahui memiliki aktivitas sitotoksik yang tinggi terhadap sel murin leukimia (Pettit., 2006).
16
(8)
(9)
(10)
(11)
(13)
(12)
(14)
(15)
Gambar 4. Senyawa fenolik yang diisolasi dari Fabeceae (Zhao et al., 2004; Ito et al., 2006; Pettit., 2006).
17
3.
2-Arilbenzofuran
Benzofuran merupakan senyawa heterosiklik yang terdiri dari cincin benzena dan furan yang berlebur. Struktur benzofuran merupakan induk dari senyawa terkait yang berstruktur dan lebih kompleks. Benzofuran dibuat dengan O alkilasi salilsilaldehida dengan asam kloroasetat, diikuti dengn dehidrasi eter yang , diikuti dengn dehidrasi eter yang diikuti. Secara biosintesis, senyawa 2-arilbenzofuran berasal dari siklisasi senyawa stilbenoid. Siklisasi terjadi antara gugus hidroksil pada C-2’ dengan gugus olefin membentuk cincin furan (Andriyani, 2012).
Gambar 5. Kerangka Dasar 2-Arilbenzofuran
E. Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder
1. Aspek Umum Isolasi merupakan suatu proses yang untuk memisahkan senyawa aktif atau kompenen tertentu dari komponen lain yang tidak diinginkan. Seiring perkembangan, teknik isolasi berkembang menjadi ekstraksi, pada dasarnya ekstraksi memiliki pengetian yang hampir sama dengan isolasi. Ekstraksi yaitu suatu metode yang digunakan untuk memisahkan senyawa aktif atau komponen tertentu dari komponen lain yang tidak diinginkan berdasarkan prinsip
18
perpindahan massa komponen zat ke dalam pelarut yang dimulai dari pelapisan antar muka kemudian berdifusi masuk kedalam pelarut (Harborn, 1987). Hu zhide et al., (2012) menyatakan dalam jurnalnya bahwa tidak terdapat metode yang baku untuk ekstraksi suatu bahan alam dikarenakan banyaknya variabel yang berpengaruh. Oleh karena itu, modifikasi pada metode perlu dilakukan untuk bahan yang akan diekstraksi. Banyak faktor yang berpengaruh dalam ekstraksi suatu senyawa metabolit sekunder diantaranya adalah waktu ekstraksi, suhu, jenis, dan komponen pelurut serta perbandingan pelarut terhadap bahan yang akan diekstraksi (Satishkumar et al., 2008).
2.
Ekstraksi
Terdapat macam-macam metode ekstraksi. Secara garis besar ekstraksi dibagi menjadi dua yaitu ekstraksi panas dan ekstraksi dingin. Pada penelitian ini digunakan ekstraksi dingin yaitu menggunakan metode maserasi. Maserasi merupakan suatu teknik ekstraksi dengan melakukan proses perendaman sampel dengan pelarut organik yang sesuai serta dilakukan pada temperatur ruangan. Proses ini sangat menguntungkan dalam isolasi senyawa bahan alam karena dengan perendaman sampel tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel sehingga senyawa metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstrasi senyawa akan sempurna karena dapat diatur lama perendaman yang dilakukan (Lenny, 2006). Menurut Markham (1988) proses ini dilakukan beberapa kali dengan tujuan untuk mendapatkan hasil yang lebih maksimal dan ekstrak kemudian disatukan lalu diuapkan dengan menggunakan penguap-putar vakum.
19
3.
Pemisahaan Senyawa secara Kromatografi
Kromatografi merupakan salah satu teknik pemisahaan suatu senyawa yang didasarkan atas perpindahaan dari komponen-komponen dalam campuran. Pemisahaan dengan menggunakan teknik ini dilakukan dengan cara memanfaatkan sifat-sifat fisik dari suatu sampel, seperti kelarutan, absorbansi, serta kepolaran kelarutan merupakan kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan. Adsorpsi adalah kecendrungan molekul untuk melekat pada permukaan halus (Johnson and Stevenson, 1991). Berdasarkan jenis fasa diam dan fasa gerak yang dipartisi, kromatografi digolongkan menjadi beberapa golongan (Tabel 1). Tabel 1. Penggolongan kromatografi berdasarkan fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam
Fasa gerak
Padat
Cair
Cair-adsorpsi
Padat
Gas
Gas-adsorpsi
Cair Cair Gas Cair (Sumber: Johnson and Stevenson, 1991).
Sistem kromatografi
Cair-partisi Gas-partisi
Dalam perlakuan kromatografi ini digunakan eluen. Eluen adalah pelarut yang dipakai dalam proses migrasi/pergerakan dalam membawa komponen-komponen zat sampel atau fasa yang bergerak melalui fasa diam dan membawa komponenkomponen senyawa yang akan dipisahkan. Urutan kromatografi diawali dari eluen yang memiliki tingkat kepolaran rendah kemudian kepolarannya ditingkatkan secara perlahan-lahan (Hosstetmann, 1995). Berikut ini merupakan urutan eluen pada kromatografi berdasarkan penurunan tingkat kepolarannya menurut Gritter et al., (1991):
20
Air Metanol Asetonitril Etanol n-propanol Aseton Etil asetat Kloroform Metolen Klorida Toluena Benzena Karbon tetraklorida Sikloheksana n-heksana
kepolaran menurun
Dalam penelitian ini akan digunakan beberapa jenis metode kromatografi serta analisis kemurnian. Kromatografi kolom adalah jenis kromatografi cair. Fase gerak cair disebut dengan eluen sedangkan fase diam padatan yang dikenal dengan absorben sehingga prinsip kerjanya adalah adsorpsi atau cair prinsip kerjanya adalah partisi. Kromatografi kolom diterapkan secara luas untuk pemisahan senyawa-senyawa hasil alam khususnya metabolit sekunder. Pemisahan dapat terjadi dikarenakan perbedaan daya serap atau partisi fase diam terhadap komponen-komponen sampel yang akan dipisahkan yang digerakkan oleh fase gerak (eluen). Komponen yang berinteraksi lemah dengan absorben akan keluar terlebih dahulu sedangkan komponen yang interaksinya kuat akan keluar paling akhir dari dalam kolom (Ibrahim and Sitourus, 2013). Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan salah satu metode yang melibatkan pendistribusian campuran dua atau lebih senyawa antara fase diam dan fase gerak. Fase diam dapat berupa lapisan tipis dari penyerapan plat, dan fase gerak adalah cairan pengembang yang (Gritter et al., 1991). Teknik KCV dilakukan dengan suatu sistem yang bekerja pada kondisi vakum secara kontinu, sehingga diperoleh
21
kerapatan kemasan yang maksimum atau dengan menggunakan tekanan rendah untuk meningkatkan laju alir fasa gerak. Urutan eluen yang digunakan dalam kromatografi cair diawali mulai dari eluen yang mempunyai tingkat kepolaran rendah kemudian kepolarannya ditingkatkan secara perlahan-lahan. Urutan eluen yang digunakan dalam kromatografi diawali dari eluen yang mempunyai tingkat kepolaran rendah kemudian kepolarannya ditingkatkan secara perlahan-lahan (Hostettmann et al., 1995).
4.
Analisis Kemurnian
Kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dan uji titik leleh. KLT dilakukan dengan mengelusi larutan sampel yang ditotolkan pada lempeng silika gel 60 F254 dengan fase gerak berupa eluen etil asetat-heksana (4 : 6). Bercak yang ada diamati dengan sinar tampak, UV 254 nm dan UV 366 nm kemurnian senyawa ditetapkan secara semi kuantitatif dengan densitometer pada λ maks = 347 nm (Margono dan Zendrato, 2006). Senyawa hasil analisis dikatakan murni apabila memberikan noda tunggal pada KLT dengan berbagai fase gerak (Setyowati et al., 2007). Sedangkan titik leleh merupakan ciri penting senyawa organik padat. Titik leleh memiliki arti penting dalam identifikasi dan pengukuran kemurnian. Penggunaan untuk identifikasi didasarkan pada fakta bahwa semua senyawa murni mempunyai titik leleh yang tajam ketika berubah sempurna dari padat ke cair. Selain itu, penggunaan titik leleh untuk identifikasi juga didasarkan pada fakta bahwa senyawa yang tidak murni menunjukkan 2 fenomena, pertama yaitu suhu leleh yang lebih rendah, dan kedua memiliki jarak leleh yang lebih lebar. Alat yang digunakan untuk menguji titik leleh suatu senyawa adalah termopan. Untuk
22
identifikasi kualitatif, titik leleh merupakan tetapan fisika yang penting terutama untuk suatu senyawa hasil sintesis, isolasi, maupun kristalisasi. Titik leleh suatu kristal padat adalah suhu ketika padatan mulai berubah menjadi cairan pada tekanan udara 1 atm. Jika suhu dinaikkan, molekul senyawa akan menyerap energi. Semakin tinggi suhu maka akan semakin banyak energi yang diserap sehingga akan menaikkan gerakkan vibrasi dan rotasi molekul (Hadiprabowo, 2009).
F. Karakterisasi Senyawa Secara Spektroskopi
Spektroskopi merupakan ilmu yang mempelajari tentang cara menganalisis spektrum suatu senyawa dan interaksi antara radiasi elektromagnetik. Teknik spektroskopi dapat digunakan untuk menentukan struktur dari senyawa organik tersebut (Fessenden and Fessenden, 1999). Radiasi elektromagnetik tersebut dapat berupa radiasi sinar γ, sianar-X( X-ray), UV-Vis (ultra ungu-tampak), infra merah (IR), gelombang mikro, dan gelombang radio (Harvey, 2000). Berdasarkan panjang gelombang radiasi elektromagnetik dapat dibagi menjadi beberapa jenis yang ditunjukkan pada Gambar 6.
23
Gambar 6. Jenis radiasi elektromagnetik dan panjang gelombangnya (Harvey, 2000). Metode spektroskopi yang dipakai pada penelitian ini antara lain, spektroskopi ultraungu-tampak (UV-Vis), spektroskopi inframerah, spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR).
1.
Spektroskopi UV-Vis
Dalam spektoskopi UV-VIS penyerapan sinar tampak dan ultraviolet oleh suatu molekul akan menghasilkan transisi diantara tingkat energi elektronik molekul tersebut. Transisi tersebut pada umumnya antara orbital ikatan, orbital non-ikatan atau orbital anti-ikatan. Panjang gelombang serapan yang muncul merupakan ukuran perbedaan tingkat-tingkat energi dari orbital suatu molekul (Sudjadi,1983). Spektroskopi UV mempunyai kisaran sinar dengan panjang gelombang 200-400 nm, sedangkan sinar tampak adalah panjang gelombang sekitar 400-900 nm. Spektro ini digunkan untuk tujuan analisi kuantitatif maupun kualitatif. Dengan menggunakan data yang diperoleh dari analisis berdasarkan spektrofotometer ultraungu- tampak ini kita dapat mengetahui absorptivitas molar senyawa yang
24
diperoleh. Absorptivitas molar senyawa dihitung dengan menggunakan persamaan Lambert-Beer berikut : A = ε b c atau ε = Keterangan:
A ε b c
= absorbansi = absorptivitas molar = tebal sel (cm) = konsentrasi (mol/liter)
.
Absorbansi (A) ini diperoleh dari data spektrum yang terdapat pada puncakpuncak serapannya. Tebal sel (b) adalah ketebalan sel dalam alat yang digunakan, sedangkan konsentrasi (c) dapat diperoleh dengan menggunakan persamaan :
Konsentrasi (c) =
=
.
Keterangan:
g = Massa senyawa hasil isolasi (gram) BM = Berat molekul relatif (gram/mol) L = Volume larutan yang digunakan (L) (Ibrahim and Sitourus, 2013).
2.
Spektroskopi IR
Spektroskopi inframerah (infrared/IR) merupakan suatu analisis senyawa organik dan anorganik yang berdasarkan pada interaksi antara gelombang elektromagnetik infra merah (IR) dengan materi. Dengan adanya energi dari gelombang elektromagnetik menyebabkan terjadinya vibrasi molekul pada materi tersebut. Ada tiga jenis vibrasi pada spektroskopi infra merah (IR) yaitu rotasi, regangan, dan guntingan (Gauglitz and Vo-Dinh, 2003). Analisis secara spektroskopi inframerah digunakan untuk menganalisis gugus fungsi yang terdapat pada zat yang diuji. Setiap gugus fungsi akan memberikan puncak-
25
puncak yang tetap, informasi inilah yang digunakan untuk menganalisis secara kualitatif pada zat tersebut. Misalnya gugus fungsi C=O akan memberikan puncak pada bilangan gelombang 1650 cm-1 sebagai asam karboksilat, 1700 cm-1 sebagai keton, dan 1800 cm-1 sebagai halida asam (klorida asam) (Harvey, 2000).
Tabel 2. Karakteristik frekuensi uluran beberapa gugus fungsi Serapan (cm-1)
Gugus
OH
3600
CH 2
N H2
3400
CH
3300
H
3060
Gugus
Serapan (cm-1) 2930 2860
Ar
C H2
C
C
N
O
3030 2870 1460 1375
1200-1000
1470 1200-1000
C
O
C
C
1650
C N
1600
C
C
1200-1000
1750-1600
Sumber : Banwell and McCash (1994).
3.
Spektroskopi Resonansi Magnetik Nuklir (RMI)
Spektroskopi resonansi magnetik nuklir adalah teknik yang memanfaatkan sifat magnetik dari inti tertentu. Instrumen yang paling umum dan paling populer digunanakan adalah spektroskopi proton RMI dan karbon-13 RMI. Metode spektroskopi jenis ini didasarkan pada penyerapan energi oleh partikel yang sedang berputar di dalam medan magnet yang kuat. Energi yang dipakai dalam pengukuran dengan metode ini berada pada daerah gelombang radio 75-0,5 m
26
atau pada frekuensi 4-600 MHz, yang bergantung pada jenis inti yang diukur (Silverstein et al., 2005). Informasi yang diberikan oleh sinyal-sinyal pada resonansi magnetik nuklir ini cukup banyak. Pada dasarnya metode ini digunakan untuk mengidentifikasi suatu struktur senyawa atau rumus bangun molekul senyawa organik. Beberapa pergeseran kimia senyawa organik dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3. Pergeseran kimia untuk proton dan karbon dalam molekul organik (Sudjadi, 1983). Jenis Senyawa Monosubtituen Disubtituen alkana Siklopropil R__CH2__NR2 R__CH2__SR2 R__CH2__PR2 R__CH2__OH R__CH2__NO2 R__CH2__F R__CH2__Cl R__CH2__Br R__CH2__I Epoksida Nitril Alkena Allilik Alkuna Aromatik
1H-NMR (ppm) 2-5 -0.5-0.5 2-3 2-3 2.2-3.2 3.5-4.5 4-4.6 4.2-5 3-4 2.5-4 2-4 2.2-2.7 4.5-7.5 1.6-2.1 2-3 6-9 2.2-2.8
13
C-NMR (ppm) 25-65 0-10 42-70 20-40 50-75 50-75 70-85 70-80 25-50 10-30 -20-0 35-45 100-120 100-150 18-30 75-95 110-145 18-30-
4. HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) HSQC merupakan uji NMR 2D yang memiliki sensitivitas tinggi untuk menjelaskan hubungan atau korelasi sistem 1H yang terikat secara langsung (satu ikatan) dengan inti lain seperti 15N atau 13C. Skema dasar uji ini melibatkan transfer magnetisasi proton ke pada inti kedua, yaitu 15N atau 13C, melalui tahap INEPT (Insensitive nuclei enhanced by polarization transfer). Setelah waktu
27
tertentu (t1), magnetisasi ditransfer kembali keproton melalui tahap retro-INEPT dan signal dicatat oleh perekam. Pada HSQC, serangkaian eksperimen dicatat dimana t1 bertambah. Signal 1H dideteksi dalam dimensi pengukuran secara langsung dalam tiap eksperimen, sementara pergeseran kimia dari 15N atau 13C dicatat dalam dimensi tidak langsung yang terbentuk dari serangkaian eksperimen (Gauglitz and Vo-Dinh, 2003).
5. HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Coherence) HMBC merupakan pengukuran proton yang memiliki korelasi karbon dengan jarak 2 sampai 3 ikatan dari proton tersebut. Tidak hanya korelasi jarak jauh yang dapat dideteksi dengan HMBC namum juga dapat mengidntifikasi korelasi karbon kuartener. Interpretasi data HMBC memerlukan fleksibilitas karena kita tidak selalu menemukan apa yang diharapkan. Tergantung pada hibridisasi karbon dan faktor lain, beberapa korelasi dua (2JCH) atau tiga (3JCH) ikatan terkadang tidak nampak. Variasi korelasi yang ditemukan disebabkan oleh variasi perbesaran konstanta kopling 2JCH, 3JCH, dan 4JCH (Silverstein et al., 2005).
G. Bakteri
Bakteri adalah salah satu golongan organisme prokariotik (tidak memiliki selubung inti). Bakteri sebagai makhluk hidup tentu memiliki informasi genetik berupa DNA, tapi tidak terlokalisasi dalam tempat khusus (nukleus) dan tidak ada membran inti. Bentuk DNA bakteri adalah sirkuler, panjang dan biasa disebut nukleoi. Pada DNA bakteri tidak mempunyai intron (urutan nukleotida yang terdapat dalam gen antara ekson) dan hanya tersusun atas ekson saja. Bakteri juga
28
memiliki DNA ekstrakromosomal yang tergabung menjadi plasmid (DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi) yang berbentuk kecil dan sirkuler ( Jawetz, 2005).
Berdasarkan pewarnaan Gram, bakteri dapat dibedakan menjadi dua golongan, yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif zat lipidnya akan larut selama pencucian dengan alkohol, pori-pori pada dinding sel akan membesar, permeabilitas dinding sel menjadi besar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan kuman menjadi tidak berwarna. Sedangkan pada bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi protein pada dinding selnya oleh pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan kaku, pori-pori mengecil, permeabilitas kurang sehingga kompleks ungu kristal jodium dipertahankan dan sel kuman tetap berwarna ungu. Contoh bakteri gram positif diantaranya adalah Staphyloccocus aureus dan Bacillus subtilis sedangkan bakteri gram negatif di antaranya adalah E. coli dan Pseudomonas ( Staf Pengajar FKUI, 1993 ) .
H.
Antibakteri
Antibakteri adalah obat atau senyawa kimia yang digunakan untuk membasmi bakteri, khususnya bakteri yang bersifat merugikan manusia. Beberapa istilah yang digunakan untuk menjelaskan proses pembunuhan bakteri yaitu germisid, bakterisida, bakteriostatik, antiseptik, desinfektan. Zat antibakteri dapat bersifat bakterisidal (membunuh bakteri), bakteriostatik (menghambat
29
pertumbuhan bakteri), dan germisidal (menghambat germinasi spora bakteri). Kemampuan suatu zat antimikroba dalam menghambat pertumbuhan bakteri dipengaruhi oleh berbagai faktor, diantaranya: konsentrasi zat antimikroba; jenis, jumlah, umur, dan keadaan mikroba; suhu; waktu; dan sifat-sifat kimia dan fisik makanan termasuk kadar air, pH, jenis dan jumlah komponen didalamnya (Agustrina, 2011). Berdasarkan cara kerjanya, antibakteri dibedakan menjadi bakteriostatik dan bakterisidal. Antibakteri bakteriostatik bekerja dengan cara menghambat pertumbuhan bakteri, sedangkan antibakteri bakterisidal bekerja dengan cara mematikan bakteri secara langsung. Bakteriostatik dapat bertindak sebagai bakterisidal dalam konsentrasi tinggi (Pelczar dan Chan, 2005). Antibakteri yang sangat toksik yang membahayakan inangnya bukan merupakan antibiotik yang baik dan dianggap beracun. Antibakteri yang baik adalah antibakteri yang mampu menyembuhkan penyakit tanpa menimbulkan efek samping terhadap inangnya dan juga harus memiliki sifat toksisitas selektif yang tinggi.
Zat antibakteri dalam melakukan efeknya harus dapat mempengaruhi bagian-bagian vital sel seperti membran sel, enzim-enzim dan protein struktural. Menurut Pelczar dan Chan (2005) cara kerja senyawa antibakteri dalam melakukan efeknya terhadap mikroorganisme adalah dengan merusak dinding sel, mengubah permeabilitas membran sel, kerusakan sitoplasma, menghambat kerja enzim dan menghambat sintesis asam nukleat protein. Senyawa antimikroba yang berasal dari tanaman, sebagian besar diketahui merupakan metabolit sekunder tanaman, terutama golongan fenolik dan terpenoid dalam minyak atsiri. Beberapa senyawa yang bersifat antimikroba alami berasal dari tanaman diantaranya adalah
30
fitoleksin, asam organik, minyak esensial (atsiri), fenolik dan beberapa kelompok pigmen tanaman atau senyawa sejenis (Mawaddah, 2008).
I.
Metode Uji Aktivitas Antibakteri
Penentuan kepekaan bakteria patogen terhadap antibakteri dapat dilakukan dengan salah satu dari dua metode pokok yaitu dilusi atau difusi. Penting sekali menggunakan metode standar untuk mengendalikan semua faktor yang mempengaruhi aktivitas antibakteri.
1. Metode Dilusi Metode ini menggunakan antibakeri dengan kadar yang menurun secara bertahap, baik dengan media cair atau padat. Kemudian media diinokulasi bakteri uji dan dieramkan. Tahap akhir dilarutkan antimikroba dengan kadar yang menghambat atau mematikan. Uji kepekaan cara dilusi agar memakan waktu dan penggunaannya dibatasi pada keadaan tertentu saja (Jawetz et al, 2001).
2. Metode Difusi Metode yang paling sering digunakan adalah metode difusi agar. Cakram kertas saring berisi sejumlah tertentu obat ditempatkan pada permukaan medium padat yang sebelumnya telah diinokulasi bakteri uji pada permukaannya. Setelah inkubasi, diameter zona hambatan sekitar cakram dipergunakan mengukur kekuatan hambatan obat terhadap organisme uji. Metode ini dipengaruhi oleh beberapa faktor fisik dan kimia, selain faktor antara obat dan organisme (misalnya sifat medium dan kemampuan difusi, ukuran molekular dan stabilitas obat).
31
Meskipun demikian, standarisasi faktor-faktor tersebut memungkinkan melakukan uji kepekaan dengan baik (Jawetz et al, 2005).
32
III. METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret - Agustus 2016, bertempat di Laboratorium Kimia Organik Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Lampung. Analisis spektroskopi yang digunakan meliputi spektroskopi ultraungu-tampak (UV-Vis) dilakukan di Laboratorium Kimia Anorganik FMIPA Universitas Lampung, Spektroskopi Infra Merah dilakukan di Laboratorium Kimia Organik Jurusan Kimia FMIPA Universitas Islam Negeri Yogyakarta. Spektroskopi resonansi magnetik inti (NMR) di Laboratorium NMR dilakukan di Institut Teknologi Bandung (ITB). Pengujian antibakteri dilakukan di Laboratorium Biokima FMIPA Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan 1. Alat-alat yang digunakan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas, penguap putar vakum, satu set alat kromatografi cair vakum (KCV), satu set alat kromatografi kolom (KK), pengukur titik leleh, lampu UV, pipet kapiler,
33
inkubator, spektrofotometer FT- Infra Merah, spektrofotometer ultraungu-tampak (UV-VIS), spektrofotometer NMR Agilent frekuensi 500 MHz 1HNMR, laminar air flow, autoclave, lemari pendingin, oven, petri disk, dan mikropipet. 2. Bahan-bahan yang digunakan Bahan yang digunakan adalah kulit batang tumbuhan turi (S. grandiflora) yang telah dikeringkan dan dihaluskan, diperoleh dari daerah stasiun kereta api Labuhan Ratu, Bandar Lampung. Bakteri Escherichia coli . Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi dan kromatografi berkualitas teknis yang telah didestilasi sedangkan untuk analisis spektrofotometer berkualitas pro-analisis. Bahan kimia yang dipakai meliputi etil asetat (EtOAc), metanol (MeOH), n-heksana (n-C6H14), aseton (C3H6O), akuades (H2O), toluen, benzen ( C6H6), serium sulfat 1,5% dalam asam sulfat (H2SO4) 2 N, diklorometana (CH2Cl2), silika gel Merck G 60 untuk impregnasi, silika gel 60 GF 254 (35-70 Mesh), plat KLT. Bahan uji bakteri yang diperlukan selain bakteri tersebut diatas yakni Nutrien agar, amoksilin, dan akuades.
C. Prosedur Penelitian
1. Persiapan sampel Kulit batang tumbuhan turi (S. grandiflora) . Determinasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriensis bidang Botani Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong, Jawa Barat. Kulit batang turi dicuci bersih dengan air dan diiris kecil-kecil kemudian dikeringkan dengan cara dijemur di bawah panas sinar matahari selama kurang lebih satu minggu. Kulit batang
34
yang telah kering lalu digiling hingga menjadi serbuk halus, serbuk halus ini yang kemudian digunakan sebagai sampel dalam penelitian ini.
2. Ekstraksi dengan Berbagai Pelarut Serbuk halus kulit batang turi ditimbang sebanyak 1500 gram kemudian direndam dengan menggunakan beberapa pelarut seperti n-heksana selama 1x 24 dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan, perlakuan yang sama juga dilakukan menggunakan pelarut etil asetat dan metanol. Ketiga ekstrak hasil perendaman masing - masing disaring dengan kertas saring. Masing-masing filtrat dari berbagai pelarut yang didapat lalu dipekatkan dengan (penguap rotari evaporator) rotary evaporator ekstrak pekat yang didapat lalu ditimbang.
3. Kromatografi Cair Vakum (KCV) Ekstrak kasar kemudian difraksinasi dengan KCV. Terlebih dahulu fasa diam silika gel halus sebanyak 3 kali berat sampel dimasukkan ke dalam kolom. Kemudian kolom dikemas kering dalam keadaan vakum menggunakan alat vakum. Eluen yang kepolarannya rendah, dimasukkan ke permukaan silika gel halus terlebih dahulu kemudian divakum kembali. Kolom dihisap sampai kering dengan alat vakum dan siap digunakan. Ekstrak kasar yang telah dilarutkan dalam aseton dan diimpregnasikan kepada silika gel kasar, kemudian dimasukkan pada bagian atas kolom yang telah berisi fasa diam dan kemudian dihisap secara perlahan-lahan ke dalam kemasan dengan cara memvakumkannya. Setelah itu kolom dielusi dengan etil asetat/n-heksana 0% sampai dengan etil asetat 40%. Kolom dihisap dengan vakum sampai kering pada setiap penambahan eluen (tiap kali elusi dilakukan). Kemudian fraksi-fraksi
35
yang terbentuk dikumpulkan berdasarkan pola fraksinasinya. Fraksinasi sampel dengan teknik KCV dilakukan berulang kali dengan perlakuan yang sama seperti tahapan KCV awal di atas.
4. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Uji KLT dilakukan terhadap fraksi-fraksi yang akan difraksinasi dan juga fraksifraksi yang didapat setelah perlakuan fraksinasi. Uji KLT dilakukan menggunakan sistem campuran eluen menggunakan pelarut n-heksana, etilasetat, aseton, metanol, dan diklorometana. Hasil kromatogram tersebut kemudian disemprot menggunakan larutan serium sulfat untuk menampakkan bercak/noda dari komponen senyawa tersebut. Ketika diperoleh fraksi yang lebih sedikit bercak/noda dilihat dibawah lampu UV setelah dilakukan elusi terhadap plat KLT. Setiap fraksi yang menghasilkan pola pemisahan dengan Rf (Retention factor) yang sama pada kromatogram, digabung dan dipekatkan sehingga diperoleh beberapa fraksi gabungan yang akan difraksinasi lebih lanjut.
5. Kromatografi Kolom (KK) Setelah dihasilkan fraksi-fraksi dengan jumlah yang lebih sedikit, tahapan fraksinasi selanjutnya dilakukan menggunakan teknik kromatografi kolom. Adsorben silika gel Merck (35-70 Mesh) dilarutkan dalam pelarut yang akan digunakan dalam proses pengelusian. Slurry dari silika gel dimasukkan terlebih dahulu ke dalam kolom, fasa diam diatur hingga rapat (tidak berongga) dan rata. Selanjutnya sampel yang telah diimpregnasi dimasukkan pada silika gel ke dalam kolom yang telah berisi fasa diam. Pada saat sampel dimasukkan, kolom diusahakan tidak kering/kehabisan pelarut karena akan mengganggu fasa diam
36
yang telah dikemas rapat, sehingga proses elusi tidak akan terganggu (Gritter et al., 1992).
6. Analisis Kemurnian Uji kemurnian dilakukan dengan metode KLT dan uji titik leleh. Uji kemurnian secara KLT menggunakan beberapa campuran eluen. Kemurnian suatu senyawa ditunjukkan dengan timbulnya satu noda dengan berbagai campuran eluen yang digunakan, kemudian disemprot menggunakan larutan serium sulfat untuk menampakkan bercak/noda dari komponen senyawa tersebut. Untuk kristal yang berukuran besar, kristal terlebih dahulu digerus hingga berbentuk serbuk kemudian kristal yang akan ditentukan titik lelehnya diletakkan pada lempeng kaca, diambil sedikit dengan menggunakan pipet kapiler, alat dihidupkan dan titik leleh diamati dengan bantuan kaca pembesar. Suhu pada saat kristal pertama kali mulai meleleh sampai semua zat meleleh, itulah titik leleh dari senyawa tersebut.
7. Spektroskopi Ultraungu–tampak (UV-VIS) Sampel berupa kristal murni sebanyak 0,0001 gram dilarutkan dalam 10 mL metanol. Larutan ini digunakan sebagai persediaan untuk beberapa kali pengukuran. Pertama, sampel diukur serapan maksimumnya dalam metanol lalu sampel kristal tersebut dilarutkan dalam 10 mL metanol kemudian larutan diukur serapan maksimumnya.
8. Spektroskopi Inframerah Sampel kristal hasil isolasi yang telah murni dianalisis menggunakan spektrofotometer inframerah. Kristal yang telah murni dibebaskan dari air kemudian digerus bersama-sama dengan halida anorganik, KBr. Gerusan kristal
37
murni dengan KBr dibentuk menjadi lempeng tipis atau pelet dengan bantuan alat penekan berkekuatan 8-10 ton per satuan luas kemudian pelet tersebut diukur puncak serapannya.
9. Spektroskopi Resonansi Magnetik Nuklir (NMR) Sampel berupa kristal murni yang akan diidentifikasi dilarutkan ke dalam pelarut aseton, kemudian ditambahkan sedikit senyawa acuan. Larutan ini ditempatkan dalam tabung gelas tipis dengan tebal 5 mm di tengah-tengah kumparan frekuensi radio (rf) di antara dua kutub magnet yang sangat kuat kemudian energi dari kumparan rf ditambah secara terus-menerus. Energi pada frekuensi terpasang dari kumparan rf yang diserap cuplikan direkam dan memberikan spektrum NMR.
10. Uji Bioaktivitas tarhadap Bakteri (E. coli) Resisten Terdapat langkah utama yang tidak boleh terlupkan pada tahap uji antibakteri yaitu sterilisasi alat dan media dengan menggunakan autoclave selama 15 menit. Mempersiapkan bahan yang akan digunkan pada uji ini yaitu Nutrien Agar (NA). Sebanyak 3 gram NA dilarutkan dalam 100 mL akuades dan dipanaskan selama 15menit hingga homogen. Dibutuhkan sekitar 9 tabung reaksi yang digunakan untuk menampung sebanyak 15 mL NA / tabung reaksi sebanyak tiga tabung reaksi, 5 mL media/ tabung reaksi sebanyak 3 tabung reaksi, serta tiga tabung reaksi digunkan untuk menampung akuades. Selanjutnya, bahan yang disiapkan distrerilisasi selama 15 menit. Senyawa hasil isolasi yang telah didapatkan dari tumbuhan turi (S. grandiflora) selanjutnya diuji bioaktivitasnya terhadap bakteri E. coli resisten menggunakan metode difusi agar. Dibuat sebanyak tiga variasi konsentrasi yaitu 0,15 mg/disk;
38
0,10 mg/disk; 0,05 mg/disk. Kristal sebanyak 1,5 mg dilarutkan dalam 500 µL, setelah itu diambil 50 µL; 33,3 µL; 16,7 µL untuk dimpreknasikan kedalam paper disk hal yang sama juga dilakukan terhadap kontrol positif. Seluruh alat dan bahan yang telah disiapkan disterilisasi kemudian dimasukkan kedalam laminar air flow. Media sebanyak 15 ml NA dimasukkan kedalam cawan petri dan ditunggu sampai kering, kemudian dimasukkan media agar 5 ml dengan akuades serta bakteri 1 ose. Setelah itu, paper disk yang telah diimpreknasikan larutan uji, kontrol positif, dan kontrol negatif dimasukkan kedalam cawan petri kemudan ditutup dengan menggunakan plastic wrap dan dibalut kertas dan diletakkan dalam inkubator selama 24 jam.
56
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Dari pembahasan hasil penelitian yang telah dilakukan maka diperoleh kesimpulan sebagai berikut: 1.
Pada penelitian ini telah diisolasi dan diidentifikasi senyawa 6-metoksi-2-(2,3-dihidroksi-5-metoksifenil)-1-benzofuran-3-karbaldehid. pada fraksi semi polar dari kulit batang tumbuhan turi (Sesbania grandiflora).
2.
Senyawa hasil isolasi berupa kristal berbentuk jarum berwarna kuning sebanyak 5,0 mg dengan titik leleh 214o C - 216o C.
3.
Senyawa hasil isolasi memiliki aktivitas antibakteri terhadap E. coli resisten kloramfenikol dengan kategori sangat lemah pada pengamatan 2x 24 jam.
57
B. Saran
Dari penelitian yang telah dilakukan, terdapat saran untuk penelitian selanjutnya yaitu; 1. Melakukan penambahan sampel kulit batang tumbuhan turi turi (S. grandiflora) agar didapat kristal lebih banyak. 2. Melakukan uji bioaktivitas dengan konsentrasi yang lebih tinggi untuk mendapatkan zona bening yang baik serta dilakukan pada bakteri E. coli yang tidak resisten. 3. Melakukan uji aktivitas biologis lain seperti uji antituberkulosis. 4. Penelitian lebih lanjut terhadap sampel kulit batang tumbuhan turi (S. grandiflora) perlu dilakukan agar didapat informasi lain tentang senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalamnya.
58
DAFTAR PUSTAKA
Achmad, S.A. 1986. Buku Materi Pokok Kimia Organik Bahan Alam. Karunika Universitas Terbuka. Jakarta. Hlm. 39. Agustrina G. 2011. Potensi Propolis Lebah Madu Apis Mellifera Spp Sebagai Bahan Antibakteri. Departemen Biokimia Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor. Bogor. Hlm 1-2, 5-7. Ambarwati. 2007. Efektivitas Zat Antibakteri Biji Mimba ( Azadirochta indica) untuk Menghambat Pertumbuhan Salmonella thyposa dan Staphylococus aureus. Biodiversitas. 8. Hlm 320-325 Amic, D. Dusanka., D. A. Beslo., and Trinastjia. 2003. Structure- Radical Scavenging Activity Relenship of Flavanoid. Croatia. Chem. Acta. 76. Hlm 55-61 Andiyani. 2012. Isolasi dan Uji Antioksidan Flavonoid Terprenilasi dari Daun Erythrina crista-galli. (Skripsi). Universitas Airlangga. Surabaya. Bakker, M., Bekker, R., and Brandt, E. 2006. Two Flavonoid Glycosides and a miscellaneous flavan from the Bark of Guibourtia Coleosperma. Phytochemistry 67: 818-823. Banwell, C.N. and E.M. McCash. 1994. Fundamental of Molecular Spectroscopy. Mc Graw-Hill Book Company. London. Hlm 1204-1206. Carlina, C. R., and Grossi-de-Sá, M. F. 2002. Plant Toxic Protein with Insecticidal Properties. A Review on Thare Potentialities as Bioinsecticides. Toxicon. 40(11). Hlm 1515-1539 Dewick, Paul M. 2009. Medicinal Natural Products Isolation: A Biosynthetic Approach, 3rd Edition. Jhon Wiley & Sons Ltd. Wiltshire. Pp 8-166 Doddola, Sujatha., H. Pasupulati., B. Koganti., Koganti V., S. R. G. Prasad. 2008. Evaluation of Sesbania grandiflora for antiurolithiatic and antioxidant properties. J Nat Med. 62. Hlm 300–307 Fessenden, R.J. dan J. S. Fessenden. 1999. Kimia Organik Jilid I. Erlangga. Jakarta. Hlm 525.
59
Gauglitz, G., and T. Vo-Dinh. 2003. Handbook of Spectroscopy. WileyVCH.Weinheim, Jerman.Hlm. 89;125;129;dan347 Gowri, Shyamala and K. Vasantha. 2010. Free Radical Scavenging and Antioxidant Activity of Leaves from Agathi (Sesbania grandiflora ) (L.) Pers. American-Eurasian Journal of Scientific Research. 5. Hlm 114-119 Gritter, R.J., J.M. Bobbitt, dan A.E. Schwarting. 1991. Pengantar Kromatografi. Alih Bahasa Kosasih Padmawinata. Institut Teknologi Bandung. Bandung. Hlm 266. Hadiprabowo, T. 2009. Optimasi Sintesis Analog Kurkumarin 1,3-Bis- (4Hidroksi-3-Metoksi Benzilidin) Urea pada Rentang pH 3-4. (Skripsi). Universitas Muhammadiyah Surakarta. Surakarta. Hlm 10-11. Hasan, N., H. Osman., S. Mohamad., W.K. Chang. 2012. The Chemical Components of Sesbania grandiflora Root and Their Antituberculosis Activity. Pharmaceuticals. 5. Hlm 882-889. Harborn, J. B. 1987. Metode fitokimia. Terbitan ke- II. Terjemahan Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung. Hlm 75-80. Harvey, David.2000. Modern Analitical Chemistry.McGraw-Hil. USA. Hlm. 369; 372; dan 402. Hawas. U. W., S. A. Eltomy., S. Abauzid., G. A. El-Hosany and R. M. Nassif. 2012. Lipid Content and antimicrobial Activity of Some Egyption Leguminoseae Plants. Joural of Medical Plants Research. 6(44). Hlm 5606-5608. Heering, J. H., and Gutteridge, R. C. 1992. Sesbania grandiflora (L.) Poitret. In : Mannetje, L. And Jones, R. M. (eds) Plant Resources of South East Asia. Pudoc Scientific Publishers. Wageningen, Netherlands. Pp. 196-198. Herbert, R.B. 1996. Biosintesis Metabolit Sekunder. Alih Bahasa Bambang Srigandono. IKIP Semarang Press. Semarang. Hlm 103-123. Harmita dan Radji, M. 2008. Kepekaan Terhadap Antibiotik. Dalam: Buku Ajar Analisis Hayati, Ed.3. EGC. Jakartar. Hlm 1-5. Hu Zhide., Liu Huitao., Wang Ketai., Xu Hangping. 2002. Application of Experimental Design and Artifical Neural Network to separation and Determination of Active Component by Capillary Electrophoresis. Chromatograihia. 55. Hlm 579-583. Hossain, Kamal., M. Hasan., M. N. Parvin., M. Hasan., S. Islam., A. Haque. 2012.
60
Antimicrobial, Cytotoxic and Thrombolitic Activity of Cassia senna Leaves (Family : Fabacee). Journal of Applien Pharmacetical science. 06. Hlm 186-190. Hostettman, K., M. Hostettman, dan A. Manson. 1995. Cara kromatografi Preparatif Penggunaan pada Senyawa Bahan Alam. Alih bahasa Kosasih Padmawinata. Institut Teknologi Bandung. Bandung. Hlm 27-34. Ibrahim, S. dan Sitourus, M. 2013. Teknik Laboratotium Kimia Organik. Graha Ilmu. Yogyakarta. Hlm 20-23. Ito Chihiro., Tomiyasu Murata., Masataka Itoigawa., Keisuke Nakao.,Minako Kumagai., Norio Kaneda., and Hiroshi Furukawa . 2006. Induction of Apoptosis by Isoflavonoids From the Leaves of Millettia Taiwaniana in Human Leukemia HL-60 Cells. Planta Med 72 (5), 424-429. 4 Jawetz, M. 2005. Mikrobiologi Kedokteran. edisi 23. Alih Bahasa: Huriwati Hartanto dkk. Jakarta, Penerbit Buku Kedokteran ECG.Hlm 375-379. Johnson, L.E. dan R. Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Alih bahasa Kosasih Padmawinata. Institut Teknologi Bandung. Bandung. Hlm 365. Kasture V. S., V. K. Deshmukh., and C. T. Chopde. 2002. Anxiolytic an Anticonvulsive Activity of Sesbania grandiflora Leaves in Experiment al Animals Phytother. Res.16. Hlm 455–460. Kementrian Peternakan. 2010. Keunggulan turi sebagai pakan ternak. Palembang. Hlm 1-41. Ketaren. 1987. Minyak Atsiri, UI Press, terjemahan : Guenther. E., 1947. Essential Oils, Vol 1. John Willey and Sons. New York, Hlm 21- 25 Lenny, S. 2006. Senyawa Flavonoid, Fenilpropanoid, dan alkaloid. Karya ilmiah. Departemen Kimia. FMIPA. Universitas Sumatera Utara. Medan. Hlm 7. Lestari, Puji. 2011.Isolasi dan Identifikasi Komponen Kimia Ekstrak Etanol Buah Merah (Pandanus conodeus Lam.). (Skripsi). UNS. Surakarta. Linn, T.Z., S. Awale, Y. Tezuka, A.H. Banskota and S.K. Kalauni et al., 2005. Cassane- and norcassane-type diterpenes from Caesalpinia crista of Indonesia and their antimalarial activity against the growth of Plasmodium falciparum. J. Nat. Prod. 68. Hlm 706-710. Margono, S.A. dan R.N. Zendrato. 2006. Sintesis Diasetil Gamavuton-0 dengan menggunakan Asetil Klorida sebagai Acylating agent. M. Far Indo. 17. (1). Hlm 25-31.
61
Markham, K.R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Alih Bahasa Kosasih Padmawinata. Institut Teknologi Bandung. Bandung. Hlm 117. Maulida, Ria dan Gauntarti, Any. 2015. Pengaruh Ukuran Partikel Beras Hitam (Oriza sativa L.) terhadapa Rendemen Ekstrak dan Kandungan Total Antosianin. Pharmaciana. 01. Hlm 9-16. Mawaddah, R. 2008. Kajian Hasil Riset Potensi Antimikroba Alami dan Aplikasi dalam Bahan Pangan di Pusat Informasi Teknologi Pertanian Fateta IPB. Skripsi. Fakultas Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor: Bogor. Nagegowda, Denis. A. 2010. Plant Volatile Terpenoid Metabolism : Biosynthetic Genes, Transcriptional Regulation and Subcellular Compartmentation. FEBS Latter. Hlm 2965-2973. Neto, M. M., Neto, M. A., Filho, R. B., Lima. M. A. S., and Silveira, E. R. 2008. Flavanoids and Alkaloids from Leaves of Bauhinia ungulate L. Biochem. Syst. Ecol., 36. Hlm 227-229. Nurhidayat, Arif. 2015. Skrining Fitokimia, Uji Kromatografi Lapis Tipis, dan Antioksidan Kandungan Metabolit Sekunder Ekstrak Metanol Daun, Kulit Batang dan Biji Tanaman Alpukat(Persea americana Mill), Rambutan (Nephelium lappaceum L), serta Turi (Sesbania grandiflora ). Laporan Praktik Kerja Lapangan. Bandar Lampung. Padmalochana, K and M.S. Dhana Rajan. 2014. Antimicrobial activity of Aqueous, Ethanol and Acetone extracts of Sesbania grandiflora leaves and its phytochemical characterization. IJPSR. India. Pelczar Michael J. ECS Chan. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta. Hlm 711-712 dan 867-868. Pertiwi. 2006. Nilai Peroksida dan Aktivitas Anti Radikal Bebas DPPH Ekstrak Metanol Knema laurina. Puslit Biologi. Bogor. Pettit. G.R., Numata. A.,Iwamoto. C., Usami. Y., Yamada. T., Ohishi. H. and Cragg. G.M. 2006. Antineoplastic Agents. Isolation and Structures of Bauhiniastatins 1-4 from Bauhinia purpurea. J. Nat. Prod.69:323-327. Rachmawati Syukur, Gemini Alam, Mufidah, Abdul Rahim, Rosany Tayeb.2011. Aktivitas Antiradikal Bebas Beberapa Ekstrak Tanaman Familia Fabaceae. JST Kesehatan. Indonesia. 1. Hlm 61 – 67. Radwan., El-Sebakhy NA., Asaad AM., Toaima SM., and Kingston DG. 2004. Kahiricosides II-V Cycloartane Glycosides from an Egyption Collection of Astragalus Khiricus. Phytochemistry. 65: 2909-2913. Ramesh, T., and Begum, V. 2006. Hypolipidemic Effect of Sasbania grandiflora
62
On Membran- Bond ATPasess in Cigarette Smoke Exposed Rats. Pharmacologyonline. 3. Hlm 309-323 Ramesh, T., Mahesh, R., and Begum, V. H. 2007. Effect of Sasbania grandiflora on Cigarette Smoke Exposed Rats. J Pharmacol Toxicol. 2. Hlm 559-566. Ramesh, T., Sureka, C., Bhuvana, S., and Hazeena, B. V. 2010. Sesbania grandiflora Diminishes Oxidative Stress and Ameliorates Antiocidant Capacity in Lever and Kidney of Rats Exposed to Cigarette Smoke. J. Phys. Pharm. 61. Hlm 467. Reji. A. F, and N. R. Alphonse. 2013. Phytochemical study on Sesbania grandiflora. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 5. Hlm 196-201. Rizqina, N. 2014. Uji Efektivitas Antibakteri Infusum Daun Jambu Biji ( Psidium guajava L.) Terhadap Pertumbuhan Bakteri Penyebab Karies Sroptocococus mutans Secara Invitro (skripsi). Universitas Andalas. Padang. Roosita, K., Kusharto, C. M., Sekiyama, M., Fachrurozi, Y., and Ohtsuka, R. 2008. Medical Plants Used by the Villeagers of a Sundanese Comunity. J. Ethnopharm. 115. Hlm 72-81. Rosa, Laura A. De al, Emilio Aluarez-Parrilla, & Gustavo A. Gonzalez-Aguilar. 2010. Fruit and Vegetable Phytochemical: Chemistry, Nutritional Value, and Stability. Wiley-Blackwell. Iowa. Hlm 53. Sumaryono, W. 1996. Pengkajian Metabolit Sekunder dan Prospeknya dalam Perkembangan Industri Nasional. Kuliah Tamu pada Forum Himpunan Mahasiswa Kimia FMIPA-ITS-Surabaya. Sub Direktorat MedikaDirektorat Pengkajian Ilmu Dasar dan Terapan BPPT. Jakarta. Pp. 448. Sathiskhumar, T., Baskar., R. Shanmugam., S. Rajasekaran., P. Sadasivam. and V. Manikandan. 2008. Optimization of Flavanid Extraction from The Leaves of Tabrnamantana heyneana, Wall, using L16 Orthogonal Design. J. Nature and Science 6(3). Shareef, H., Rizwani, G. H., Zia-Ul-Haq, M., Ahmad, S., and Zahid, H. 2012. Tocopherol and Phytosterol Profie of Sasbania grandiflora (Linn.) Seed Oil. J Med. Plants Res. 6(18). Hlm 3478-3481. Shulman, dkk. 2004.Dasar Biologis Dan Klinis Penyakit Infeksi edisi Keempat. gadjah mada univesty press. Yogyakarta. Hlm 70-74. Setyowati, E. P., U. A. Jenie, Sudarsono, B. Kardono, R. Rahmat, dan E. Meiyanto. 2007. Isolasi Senyawa Sitotoksik Spons Kaliasis. M. Far. Indo. 18. (4). Hlm 183-189.
63
Serti, J. A., Wieze, G., Woisky, R. G., and Carvalho, J. C. 2001. Antiulcer Activity of the Etanol Extravt of Sasbania grandiflora. Brazilian J. Pharm. Sci. 37. Hlm 107-111. Silverstein, B. dan Morcill. 1986. Penyelidikan Spektrometrik Senyawa Organik. Alih bahasa Drs. A. J. Hartomo. ITS. Semarang. Hlm 191-195. Sotheeswaran, S., and Pasupathy, V. 1993. Distribution of Resveratrol Oligomer in Plants. Phytochemistry. 32. Hlm 3478-3481. Staf Pengajar FKUI. 1993. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran, Edisi Revisi. UI Press. Depok. Hlm: 192. Sudjadi. 1983. Penentuan Struktur Senyawa Organik. Ghalia Indonesia. Jakarta. Hlm 283. Tanaka, H., Hirata, M., Etoh, H., Sako, M., and Sato, M. 2004. Six New Constituents from The Roots of Erythrina variegate. Chemistry and Biodiversity. 1. Hlm 1101-1108. Tjitrosoepomo, G. 1993. Taksonomi Tumbuhan Obat-obatan. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. Hlm 447. Tjay, Tan Hoan dan Kirana Rahardja. 2007. Obat-obat Penting Khasiat,Penggunaan dan Efek-efek Sampingnya Edisi Keenam. Elex Media Komputind. Jakarta. Hlm 66-68. Vitor, R. F., Mota-Filipe, H., Teixeira, G., Borges, C., Rodrigues, A. I., and Paulo, A. 2004. Flavanoids of an Extract of Pterospartum tridentatum Showing Endothelial Protection Against Oxidative Injury. J. Ethnopharm. 93. Hlm 363-370. Venkataraman, K. 1972. Wood Phenolic in the Chemotaxonomy of the Moraceae. Phytochemistry. 11. Hlm 1571 -1586. Watjen, W., Kulwalik, A., Suckow-Schnitker, A. K., Chovolou, Y., Rohrig, R., Ruhl, S., Kampakotter, A., Addae-Kyereme, J., Wright, C. W., and Passreiter, C. M. 2007. Pterocarpans Phaseollin and Neurautenol Isolation from Erythrina addisaniae Induce Apoptatic Cell Death Accompanied by Inhibition of ERK Phosporilation. Toxicol. 242. Hlm 71-79. Wagh, V. D., Wagh, K.V., Tandale, Y. N., and Salve, S. A. 2009. Phytochemical, Pharmacological, and Phytopharmaceuitcs Aspects of Sasbania grandiflora (Hadga) : A Riview. J. Pharm Res. 2 (5). Hlm 889-892. Wink, M., and Mohamed. G. I. A. 2003. Evaluation of Chemical Defents Traits in The Leguminoseae: Mepping of Distribution Patterns of Secondary Metabolits on a MolecularPhylogeny Inferred from Nucleotide Sequances of The rbcl Gene. Biochem. Syst. Ecol. 31(8). Hlm 897-917.
64
Zhang., Shen JP., Zhu SH., Huang DK., Ding Y., and Zhang XL. 1999. Effect of Astragalus on Experimental Liver Injury. Yao Xue Xue Bau 27: 725-736. Zhao P, Iwamoto Y, Kouno I, Egami Y, Yamamoto H. Stimulating the production of homoisoflavonoids in cell suspension cultures of Caesalpinia pulcherrima using cork tissue. Phitochemistry. 65.
.
