ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI DALAM PROSES PEMBUATAAN SARI BUAH MENGKUDU (Morinda citrifolia, L) 1
1
Abu Amar , Edward S.P. Tampubolon , Dewi Sriwulan Triwardhani 1
2
Dosen tetap Jurusan Teknologi Industri Pertanian (TT), Fakultas Teknnologi Pertanian (FTT) Institut Teknologi Indonesia (ITI) 2 Alumni jurusan TT, FTT ITI Jalan raya Puspiptek Serpong Tangerang 15320. Telp/ Fax. (021) 7560544 , E-mail:
[email protected]
Abstrak Isolasi dan identifikasi bakteri yang terlibat di dalam proses pembuatan sari buah mengkudu (Morinda citrifolia, L) telah dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi bakteri yang tumbuh dan terlibat selama proses pembuatan sari buah yang mungkin mempengaruhi kualitas sari buah. Pengambilan sampel dilakukan pada buah sebelum pencucian, setelah pencucian, cairan buah hasil ekstraksi, cairan buah hasil filtrasi, cairan buah hasil pasteurisasi. Isolasi dan identifikasi yang dilakukan menghasilkan 8 isolat bakteri yaitu isolat A, B, C , D, E, F, G dan H yang terlibat dalam proses pembuatan sari buah mengkudu. Dari kedelapan isolat tersebut ada yang speciesnya sama. Bakteri yang ada pada buah mengkudu sebelum pencucian adalah isolat isolat A (Chromobacterium violaceum,) isolat B (Bacillus brevis), isolat C (Genus Pseudomonas ), dan isolat D ( Bacillus pantothenticus), sedangkan bakteri pada buah mengkudu setelah dicuci adalah isolat E (Serratia plymuthica), dan isolat F (Bacillus polymyxa). Jenis bakteri hasil ekstraksi dan hasil penyaringan adalah sama yaitu isolat G (Bacillus pantothenticus) dan isolat H (Serratia plymutica). Sesudah pasteurisasi tidak dijumpai adanya mikroorganisme. Bacillus ditemukan pada setiap tahapan proses pembuatan sari buah mengkudu. Hal ini dimungkinkan spora Bacillus yang tersebar diberbagai area (tanah, air dan udara). Kerja yang aseptik selama pembuatan sari buah mengkudu mutlak diperlukan untuk menjamin mutu sari buah mengkudu. Kata Kunci: Isolasi, Identifikasi, Bacillus, Sari buah mengkudu
1. Pendahuluan Mengkudu (Morinda citrifolia, L) adalah tumbuhan dari keluarga kopi-kopian (Rubiaceae). Tanaman ini tumbuh hampir di seluruh wilayah kepulauan Indonesia. Umumnya tanaman ini tumbuh liar di pantai, ladang, hutan, atau sengaja ditanam orang di pekarangan sebagai tanaman sayur atau tanaman obat. Riset medis tentang buah mengkudu setidaknya dimulai sejak tahun 1950, jurnal ilmiah Pasific Science menuliskan bahwa buah mengkudu menunjukkan sifat anti bakteri terhadap Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella dan Shigella. Lebih lanjut cairan buah mengkudu mengandung senyawa proxeronine dan xeronine yang dapat mengoptimalkan metabolisme tubuh. Hal ini ditandai dengan cairan buah mengkudu yang dapat membantu pemulihan berbagai penyakit misalnya kanker, jantung, gangguan pencernaan dan diabetes (Waha, 2000). Hasil survey yang telah dilakukan sebelumnya tentang cairan buah mengkudu yang diolah dengan cara fermentasi spontan telah banyak dipasarkan di Kabupaten Ponorogo dengan nama badeg pace. Volume produksi badeg pace ini bersifat fluktuatif tetapi selalu ada, hal ini terjadi karena produsen mengerjakannya sebagai mata pencahariannya sehari-hari. (Amar dan Handayani, 2001). Produk badeg pace ini di Ponorogo dikenal sebagai jamu yang konsumennya sebagian masyarakat yang familier dengan rasa pace. Di dalam badeg pace yang beredar di Ponorogo itu yang menggunakan fermentasi spontan artinya pembuatan badeg pace yang tidak menggunakan penambahan ragi telah diisolasi dan diidentifikasi beberapa jenis bakteri antara lain Lactobacillus
401
delbrueckii, Pediococcus sp dan Bacillus coagulans . (Amar dkk., 2002). Dua jenis bakteri yang pertama ini mampu menghasilkan asam laktat yang relatif banyak sehingga sangat penting keberadaannya di dalam badeg pace. Namun perlu diketahui pula bahwa Bacillus coagulans dapat menyebabkan kerusakan pada bahan pangan. Dengan perlakuan aseptis diharapkan keberadaan Bacillus coagulans dapat dihindari. Di Jakarta dan di kota-kota besar lainnya di Indonesia produksi cairan buah mengkudu berkembang sangat pesat sekali. Berbagai merek dagang telah beredar di masyarakat. Mengingat pentingnya kondisi yang aseptis selama pembuatan sari buah mengkudu maka pada kesempatan ini akan dieksplorasi jenis bakteri yang terlibat selama proses pembuatan cairan buah mengkudu. Proses pembuatan sari buah mengkudu yang dilakukan dalam penelitian ini sebagai berikut: pemilihan buah mengkudu, pencucian dengan air kran yang bersih, ekstraksi buah mengkudu, penyaringan dengan kain saring dan pasteurisasi. Diharapkan dengan mengetahui bakteri yang ada dan terlibat dalam proses pembuatan sari buah mengkudu kita dapat memberikan informasi yang jelas tentang cara-cara yang sehat dalam proses pembuatan sari buah mengkudu. Jika dimungkinkan diketemukan bakteri asam laktat yang potensial untuk memperkaya nilai gizi sari buah mengkudu, seperti halnya isolat bakteri Lactobacillus delbrueckii dan Pediococcus sp yang ada pada badeg pace dari Ponorogo (Amar dkk., 2002) 2. Metodologi Tempat Penelitian dan Bahan Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Teknologi Indonesia pada tahun 2002. Buah mengkudu diperoleh dari kebun yang ada di ITI Serpong. Buah yang dipetik segera dibawa ke laboratorium dengan kantong tertutup untuk dilakukan isolasi bakteri yang ada pada permukaan buah sebelum dicuci. Media yang digunakan adalah Nutrient Agar (NA) Plate Count Agar (PCA) dan media media lain serta bahan bahan untuk uji biokimiawi isolat yang ditemukan. Metode Penelitian Untuk pengambilan sampel atau contoh telah ditentukan ada lima titik yaitu: bakteri yang ada pada permukaan kulit buah mengkudu sebelum dicuci (a), bakteri pada permukaan kulit buah mengkudu yang telah dicuci (b), bakteri yang ada pada sari buah mengkudu hasil ekstraksi (c), bakteri yang ada pada sari buah mengkudu setelah disaring (d), bakteri pada sari buah mengkudu yang telah dipasteurisasi (e). Pengambilan sampel a dan b dengan swab methode (Fardiaz, 1993), sedangkan sampel c, d, e langsung dengan menggunakan pengenceran . Untuk Isolasi dan identifikasi bakteri pada semua sampel dengan pengenceran, inokulasi, inkubasi, isolasi dan identifikasi. Pada waktu identifikasi isolat bakteri dilakukan urutan sebagai berikut: pengecatan Gram dilakukan pada semua isolat yang diperoleh dan diikuti dengan uji katalase dan pengamatan spora. Dari uji yang dilakukan diperoleh dugaan genus isolat yang diperoleh. Disamping itu dilakukan enumerasi total bakteri dengan metode Total Plate Count (Fardiaz, 1993). Untuk mengidentifikasi lebih lanjut isolat mikroba digunakan prosedur sesuai dengan metoda Buchanan dan Gibbons (1974) antara lain uji biokimiawi yaitu fermentasi gula-gula, uji motilitas, uji indol, uji penggunaan MR-VP, Uji hidrolisis urea, uji nitrat, uji penggunaan sitrat serta uji-uji biokimiawi lain yang spesifik.
3. Hasil dan Diskusi Total bakteri pada buah mengkudu Jumlah total bakteri dihitung berdasarkan metode Standart Plate Count. Pada kulit buah mengkudu sebelum dicuci ternyata lebih banyak dari pada total bakteri pada kulit buah mengkudu sesudah dicuci, demikian juga dengan jumlah bakteri pada sari buah mengkudu hasil ektraksi jauh lebih banyak daripada jumlah bakteri pada sari buah mengkudu yang sudah disaring, bahkan tidak ditemukan bakteri pada sari buah setelah dipasteurisasi. Hasil ini dipaparkan pada Tabel 1 berikut.
402
Tabel 1. Populasi bakteri dalam buah dan sari buah mengkudu Sampel Media yang digunakan Jumlah Koloni/cm2 dari permukaan buah 3 (a) Nutrient Agar 3,1 x 10 3 (b) Nutrient Agar 2,5 x 10 (c) Nutrient Agar (d) Nutrient Agar (e) Nutrient Agar (a) permukaan kulit buah mengkudu sebelum dicuci (b) permukaan kulit buah mengkudu setelah dicuci (c) hasil ekstraksi buah mengkudu (d) sari buah mengkudu setelah disaring (e) sari buah mengkudu yang telah dipasteurisasi
Jumlah koloni/ml sari buah 2
6,2 x 10 2 3,6 x 10 Tidak ditemukan
Walaupun kurang relevan membandingkan jumlah total bakteri pada permukaan kulit buah dengan jumlah total bakteri pada cairan buah, nampaknya tahapan proses pengolahan buah mengkudu menjadi sari buah, jelas mengurangi populasi bakteri. Ini dapat dijelaskan bahwa dengan pencucian paling tidak bakteri yang menempel telah dihilangkan. Jika pada permukaan kulit buah mengkudu setelah dicuci masih ada juga berarti kemungkinan berasal dari air cucian yang digunakan. Dalam ekstrak buah mengkudu (c) jumlah bakteri berkurang dimungkinkan juga aktifnya zat anti bakteri yang memang ada pada sari buah mengkudu, dengan perlakuan penyaringan (d) ternyata terjadi juga penurunan jumlah bakterinya. Bahkan sari buah mengkudu yang telah di pasteurisasi (e) tidak diketemukan lagi bakteri. Dengan demikian pasteurisasi dapat membuat produk sari buah mengkudu aman diminum oleh konsumen karena tidak diketemukan lagi bakteri. Identifikasi Isolat Bakteri. Sebagai hasil isolasi ditemukan empat jenis isolat bakteri yang berasal dari permukaan kulit buah mengkudu sebelum dicuci (sampel a), isolat ini diberi kode A,B,C dan D, sedangkan pada permukaan kulit buah setelah dicuci (b) ditemukan dua isolat bakteri yaitu E dan F, pada cairan buah mengkudu hasil ekstraksi (c) dan hasil penyaringan (d) ditemukan dua isolat yang sama yaitu (G dan H). Setelah dilakukan serangkaian uji morfologi dan uji biokimiawi dapatlah disusun kriteria isolat bakteri A seperti Tabel 2 . Tabel 2. Perbandingan karakteristik isolat bakteri A dengan Chromobaacterium violaceum sebagai referensi Kriteria
Isolat Bakteri A
Morfologi Koloni
Bentuk bakteri
Pada Nutrient Agar koloni berwarna putih bundar dengan tepian bercabang elevasi cembung Batang pendek
Pengecatan Gram Endospora Uji Katalase o Pertumb.30 C Pertumb. Mc Conkey Uji sitrat-uji Urea Uji Pepton Uji Nitrat MR- VP Gelatin Uji fermentasi KH
- (negatif) Tidak ada + + + + dan + + - dan + Dilakukan (hasil dibawah ini)
403
Chromobacterium violaceum (Bucchanan dan Gibbons, 1974) Penampakan koloni lembut sampai kasar, tidak membentuk pigmen, tepian bercabang dan elevasi cembung batang, sering berada dalam bentuk batang pendek. - (negatif) Tidak ada + + + + dan +/(tumbuh tapi lambat) + - dan +
Uji fermentasi senyawa karbohidrat dilakukan pada maltosa (+), trehalosa (+) glukosa (+), sorbitol (+) sedangkan negatif pada senyawa arabinosa, laktosa, manitol, rafinosa, rhamnosa dan sukrosa. Berdasarkan perbandingan kriteria tersebut maka isolat bakteri A dimasukkan kedalam species Chromobacterium violaceum. Organisme ini banyak dijumpai di tanah umumnya di tanah tropis seperti Indonesia (Bucchanan dan Gibbons, 1974) . Organisme ini sering menimbulkan penyakit Piogenik atau infeksi septicemic. Identifikasi Isolat bakteri B, D, F dan G Hasil identifikasi isolat bakteri B, D, (berasal dari sampel a yaitu permukaan kulit buah mengkudu sebelum dicuci), F(berasal dari sampel b permukaan kulit buah mengkudu yang telah diucuci) dan G (berasal dari sampel c dan d). Keempat isolat itu termasuk kedalam genus Bacillus dengan karakteristik seperti pada Tabel 3 dibawah ini. Ada dua isolat D dan G yang berasal dari dua koloni yang secara makroskopis berbeda dari sampel a dan sampel c maupun d. Sifat morfologinya sama, sifat gram sama sama +, katalase + dan setelah melewati uji biokimiawi dan dicocokkan dengan referensi dari Bucchanan dan Gibbons, 1974 ternyata kedua isolat tersebut termasuk kedalam spesies yang sama yaitu Bacillus panthotenticus. Tabel 3. Karakteristik isolat bakteri B, D F dan G yang termasuk kedalam genus Bacillus Identifikasi Genus Bacillus (isolat B,D,F dan G) Isolat B Isolat D dan G Isolat F Morfologi koloni Filoform, tepian Tak beraturan Bentuk L, licin seperti benang, menyebar, seperti seperi tetesan cembung benang, berbukit bukit. Pengecatan gram + (batang) + (batang) + (batang) Uji katalase + + + Pewarnaan spora + (jelas ada) +(sangat jelas)T +(kurang jelas) Identifikasi lanjutan B. brevis B.panthotenticus B. polymyxa 0 Pertumb. 30 C + + *) 0 Pertumb. 40 C + + + 0 Pertumb. 50 C + Pertumb.McConkey Uiji sitrat Uji urea Uji pepton Uji nitrat + + MR dan VP - dan + - dan - dan + Gelatin + + Indol + Uji Karbohidrat Hidrolisa Pati *) + Arabinosa + Manitol + + Xylosa + Glukosa + (+/-untuk Asam) +(+ untuk Asam) +(+ untuk asam dan gas CO2, serta 2,3 butanediol).
*) tidak dilakukan. Berdasarkan identifikasi tersebut di atas dan dicocokkan dengan referensi yang ada pada Bucchanan dan Gibbons, 1974 ternyata isolat B adalah bakteri Bacillus brevis, isolat D dan G adalah sama yaitu Bacillus panthotenticus, sedangkan bakteri F adalah Bacillus polymyxa . Bakteri Bacillus dijumpai pada kulit buah mengkudu yang belum dicuci, habitat dari bakteri ini menyebar di udara tanah dan air. Bakteri ini sporanya cukup jelas, dalam glukosa menghasilkan asam atau agak lemah atau bahkan tidak menghasilkan asam.
404
Isolat bakteri D dan G adalah jenis B. panthotenticus, letak sporanya terminal dan oval atau kadang kadang speris. Sifat inilah yang menandakan bahwa isolat tersebut masuk ke dalam species B. panthotenticus. Bakteri ini juga tersebar di udara air dan tanah seperti umumnya genus Bacillus sehingga dijumpai pada sampel (a) yaitu permukaan kulit buah mengkudu yang belum dicuci, tapi dijumpai pula pada sampel c dan d yaitu pada sari buah mengkudu hasil ekstraksi maupun yang sudah disaring. Untuk isolat F yaitu B. Polymyxa dijumpai pada sampel (b) yaitu permukaan kulit buah mengkudu yang sudah dicuci. Bakteri ini mempunyai kemampuan yang jelas untuk memfermentasi glukosa dengan menghasilkan asam, gas CO2 serta acetoin dalam hal ini adalah 2,3 butanediol. Spora bakteri B. polymyxa penyebarannya sangat luas sehingga walaupun buah mengkudu sudah dicuci dengan air bersih ternyata masih ada bakteri yang dapat diisolasi dari permukaan kulitnya kemungkinan spora tersebut terdapat di dalam air . Untuk mengetahui secara menyeluruh diagram alir kerja identifikasi bakteri dalam genus ini seperti pada Gambar 1 berikut: Isolat Bakteri B,D,Fdan G I Pengecatan Gram
Isolat Bakteri C I Pengecatan Gram Gram +
Gram - Gram+ I Bentuk bakteri Bulat
Gram –
batang bulat I Uji katalase
Batang I Uji katalase
+ I Genus Pseudomonas
+ I Pengecatan Spora
Gambar 2. Alur kerja identifikasi isolat bakteri C.
Membentuk tidak membentuk I Identifikasi Genus Bacillus I Pengamatan terhadap bentuk, letak pembengkakan dan posisi dominan dari endospora. I Beberapa Uji biokimiawi I Disimpulkan ada beberapa Species antara lain B. brevis (isolat B) B. panthotenticus (Isolat D dan G) B polymyxa (Isolat F)
Isolat bakteri E dan H I Pengecatan Gram Gram + gram – I Bentuk Bakteri Bulat
batang I Uji katalase
Katalase + katalaseI Tidak membentuk spora I Identifikasi genus Serratia I Uji Biokimiawi----Serratia plymutica
Gambar 1. Alur kerja identifikasi isolat B,D,F dan G
Gambar 3. Alur kerja identifikasi isolat bakteri E dan H ternyata jenisnya sama.
405
Identifikasi isolat bakteri C Berdasarkan alur kerja pada Gambar 2, diketahui bahwa isolat bakteri C yang diperoleh pada sampel (a) termasuk ke dalam genus Pseudomonas, jenis bakteri ini bersifat Gram negatif bentuk batang kecil, bersifat motil, penampakan morfologi koloninya sebagai berikut berwarna putih, bundar dengan elevasi yang berlekuk bersifat aerob. Bakteri ini termasuk jenis mesofilik, tidak mampu memfermentasi glukosa, laktosa, maltosa manitol, sukrosa, dan xylosa. Uji katalasenya positif, tidak mampu menghidrolisa pati dan gelatin. Habitat bakteri ini adalah tanah, air tawar juga air laut (Bucchanan dan Gibbons, 1974). Peran bakteri ini sangat variatif dapat bersifat patogen maupun tidak. Oleh karena itu keberadaan jenis Pseudomonas pada permukaan kulit buah perlu diperhatikan, tetapi dengan pencucian (sampel b) sudah tidak ditemukan lagi. Bahkan diketahui bahwa zat anti bakteri sari buah mengkudu dapat melawan bakteri Pseudomonas aeruginosa yang dikenal sebagai patogen (Waha, 2000). Identifikasi isolat bakteri E dan H Alur kerja identifikasi isolat bakteri E dan H yang terdapat pada Gambar 3 yang diperoleh pada permukaan kulit buah sesudah pencucian (isolat E) dan dijumpai lagi isolat bakteri H pada sampel c dan d. Isolat bakteri E dan isolat bakteri H ternyata setelah diidentifikasi termasuk jenis yang sama yaitu Serratia plymuthica. Bakteri ini termasuk jenis Enterobacteriaceae. Bakteri ini mempunyai sifat, walaupun sudah melalui proses ekstraksi dan penyaringan ternyata bakteri Serratia plymuthica ini muncul lagi. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut resistens terhadap zat antibakteri yang ada pada sari buah mengkudu. Namun dengan adanya pasteurisasi semua jenis bakteri yang ditemukan selama proses sebelumnya tidak ditemukan lagi bahkan tidak ada satupun bakteri yang ada pada sari buah mengkudu yang telah dipasteurisasi. Produk sari buah mengkudu dengan proses yang dilakukan dalam penelitian ini mempunyai pH antara 4 - 3,7 sebenarnya termasuk kedalam produk yang relatif asam. Tetapi bakteri asam laktat yang diharapkan ada dalam produk ini tidak mampu bersaing dengan bakteri-bakteri lain untuk tumbuh dan berkembang. Pada badeg pace yang diproduksi dengan fermentasi spontan tanpa menambahkan ragi kedalamnya mempunyai nilai pH 3 - 4,0 sehingga menstimulir bakteri asam laktat tumbuh dan berkembang (Amar,dkk.,2002). Rasa sari buah mengkudu yang sangat ekstrim dan menyengat sebenarnya kurang diminati oleh masyarakat, tetapi diketahui bahwa dalam sari buah mengkudu banyak dijumpai asam lemak rantai pendek dan menengah yang potensi untuk anti virus (Nishigaki, 2001). Demikian juga menurut Priece (2004), asam lemak rantai menengah sangat potensial untuk mengoptimalkan fungsi faal organ tubuh, dan juga sebagai obat anti kholesterol.
4. Kesimpulan Jenis bakteri yang diperkirakan terlibat dalam proses pembuatan saribuah mengkudu dan berhasil diidentifikasi adalah: bakteri Chromobaacterium violceum, Bacillus brevis, Pseudomonas sp, dan Bacillus panthotenticus, Serratia plymutica dan Bacillus polymyxa. Proses pasteurisasi dapat menghilangkan semua bakteri yang ada pada sari buah mengkudu, dengan demikian sari buah mengkudu aman untuk dikonsumsi Daftar Pustaka 1. Amar, A dan A.S. Handayani, 2001. Identifikasi Teknologi untuk Pengembangan Buah Mengkudu (Morinda citrifolia, L). Institut Teknnologi Indonesia Serpong, Tangerang. 2. Amar, A., S. Sukotjo., L, Suan., 2002. Isolasi dan Identifikasi Bakteri dalam Badeg Pace dari Ponorogo Jawa Timur. Jurnal Biosains. Volume 7 No 2.pp1-7 3. Buchanan, R.E and N.E Gibbons, 1974. Bergey’s manual of Determinative Bacteriology. Eight Edition. The williams and Wilkins Company, Baltimore. 4. Fardiaz, S., 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. P.T Radja Grafindo Persada, Jakarta 5. Nishigaki, T., 2001. Pharmacology of Noni Juice. Diskusi Ilmiah Sehat dengan Mengkudu, Sabtu 24 Februari 2001, Bogor 6. Priece, M. (2004). Terapi Minyak Kelapa. Prestasi Pustaka Publisher
406
