Interpretace DNA profilů při určování otcovství a příbuznosti Autor: doc. Mgr. Jiří Drábek, PhD. Ilustrátor: Mgr. Jana Stránská, PhD. Ilustrátor obálky: Mgr. Kristýna Floková Recenzentky: Mgr. Anastassiya Zidkova, Mgr. Halina Šimková Tato kniha je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky z projektu CZ.1.07/2.3.00/09.0080 Vzdělávání v oblasti forenzní genetiky.
1
Obsah SEZNAM TABULEK
5
SUMMARY MOTTO
6 7
1 PŘEDMLUVA
8
2 TEORETICKÝ ÚVOD
10
2.1 SYMBOLIKA 2.2 PRAVDĚPODOBNOST 2.3 ŠANCE 2.4 ZÁKONY PRAVDĚPODOBNOSTI 2.4.1 SČÍTÁNÍ 2.4.2 NÁSOBENÍ 2.4.3 PODMÍNĚNÉ PRAVDĚPODOBNOSTI 2.5 VĚROHODNOSTNÍ POMĚR 2.6 BAYESOVA VĚTA 2.7 ALTERNATIVNÍ STATISTIKY 2.8 HARDY-WEINBERGŮV ZÁKON 2.9 MENDELOVSKÁ DĚDIČNOST
10 10 12 12 12 13 13 14 15 17 18 19
3 ODVOZENÍ VĚROHODNOSTNÍHO POMĚRU
19
3.1 VĚROHODNOSTNÍ POMĚR PŘI URČOVÁNÍ OTCOVSTVÍ U TRIA MATKA-DÍTĚ-ŽALOVANÝ RODOKMENOVOU METODOU 3.1.1 ČTYŘI RŮZNÉ ALELY V RODIČOVSKÉ GENERACI 3.1.2 MATKA I ŽALOVANÝ JSOU SHODNÍ HETEROZYGOTI 3.1.3 MATKA HETEROZYGOT, ŽALOVANÝ HOMOZYGOT 3.2 VĚROHODNOSTNÍ POMĚR PŘI URČENÍ PŘÍBUZNOSTI DVOU OSOB ALGORITMICKOU METODOU 3.2.1 OSOBY A TEORETICKÉ KOMBINACE ALEL 3.2.2 DOPLNĚNÍ GENOTYPOVÝCH FREKVENCÍ A PODMÍNĚNÝCH PRAVDĚPODOBNOSTÍ 3.2.3 ČITATEL VĚROHODNOSTNÍHO POMĚRU 3.2.4 JMENOVATEL VĚROHODNOSTNÍHO POMĚRU 3.3 VĚROHODNOSTNÍ POMĚR PŘI URČENÍ PŘÍBUZNOSTI POMOCÍ COTTERMANOVÝCH KOEFICIENTŮ PŘÍBUZNOSTI
19 20 23 24 26 27 28 29 29 30
4 JEDNOTLIVÉ KROKY ANALÝZY
31
4.1 SUBJEKTIVNÍ OHODNOCENÍ APRIORNÍ PRAVDĚPODOBNOSTI 4.2 NASTOLENÍ SROVNÁVANÝCH HYPOTÉZ 4.3 VÝBĚR DATABÁZE 4.4 VYPOŘÁDÁNÍ SE S KOMPLIKACEMI VYŠETŘENÍ 4.5 UZAVŘENÍ PŘÍPADU 4.6 VZOROVÝ PROTOKOL O VYŠETŘENÍ 4.7 VYŠETŘENÍ OTCOVSTVÍ PŘED SOUDEM 4.7.1 KLAM ZE STRANY OBŽALOBY
32 32 32 33 33 34 43 44 2
4.7.2 KLAM ZE STRANY OBHAJOBY
45
5 KOMPLIKACE VYŠETŘENÍ
45
5.1 NEDOSTUPNOST MATKY 5.2 NEDOSTUPNOST ŽALOVANÉHO 5.3 NEZNÁMÍ RODIČE, POHŘEŠOVANÉ OSOBY 5.4 SMĚS PROFILŮ 5.5 MUTACE 5.6 TŘI ALELY NA LOKUSU 5.7 CHIMÉRISMUS, MOZAICISMUS 5.8 JEDNOVAJEČNOST 5.9 UNIPARENTÁLNÍ DISOMIE 5.10 VZÁCNÁ ALELA 5.11 NULOVÁ ALELA 5.12 VAZBA 5.13 VÍCEDĚTNOST 5.14 SUBPOPULACE 5.15 PŘÍBUZNOST 5.16 IMPRINTING 5.17 CHROMOZOM Y 5.18 CHROMOZOM X 5.19 MITOCHONDRIÁLNÍ DNA 5.20 OBTÍŽNĚ ROZLIŠITELNÉ HYPOTÉZY
45 46 47 48 50 52 53 54 54 55 55 58 60 61 63 67 68 68 75 75
6 AUTOMATIZACE VYŠETŘENÍ
77
7 ZÁVĚR
79
8.1 ZADÁNÍ ÚKOL 1: BRATRANEC A SESTŘENICE ÚKOL 2: SOUROZENCI NEBO MATKA A SYN ÚKOL 3: VLIV MUTACE V ZÁRODEČNÉ LINII MATKY NA SÍLU DŮKAZU OTCOVSTVÍ ÚKOL 4: ÚPLNÍ BRATŘI, POLOVIČNÍ BRATŘI, NEPŘÍBUZNÍ ÚKOL 5: OTCEM DÍTĚTE JE ŽALOVANÝ NEBO JEHO OTEC ÚKOL 6: OTEC A DVA SYNOVÉ ÚKOL 7: ÚPLNÍ SOUROZENCI NEBO NEPŘÍBUZNÍ ÚKOL 8: BRATR ŽALOVANÉHO ALTERNATIVNÍM ŽALOVANÝM ÚKOL 9: RODIČOVSTVÍ NEBO NEPŘÍBUZNOST 8.2 ŘEŠENÍ ÚKOLŮ
81 81 81 81 81 81 82 83 83 83 84
9 SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ
88
9.1 REFERENCE 9.2 DOPORUČENÁ LITERATURA 9.3 POUŽITÉ WEBOVÉ ODKAZY
88 94 94
3
Seznam ilustrací Obrázek 1: Grafické vyjádření podmíněných pravděpodobností pomocí Vennova diagramu 15 Obrázek 2: Rodokmenové znázornění základní hypotézy otcovství a neotcovství žalovaného .................................................................................................................................................. 20 Obrázek 3: Rodokmen 1 – žalovaný otcem, čtyři alely v rodičovské generaci ....................... 21 Obrázek 4: Rodokmen 1, neznámý nepříbuzný muž otcem, čtyři alely v rodičovské generaci .................................................................................................................................................. 21 Obrázek 5: Rodokmen 2, matka i žalovaný jsou shodní heterozygoti, žalovaný otcem .......... 23 Obrázek 6: Rodokmen 2, matka i žalovaný jsou shodní heterozygoti, neznámý nepříbuzný muž otcem ................................................................................................................................ 23 Obrázek 7: Rodokmen 3, matka heterozygot, žalovaný homozygot, tři alely v rodičovské generaci, žalovaný otcem ......................................................................................................... 24 Obrázek 8: Rodokmen 3, matka heterozygot, žalovaný homozygot, tři alely v rodičovské generaci, neznámý nepříbuzný muž otcem .............................................................................. 24 Obrázek 9: Rodokmen 6, holčičky jsou úplné sestry, anebo nepříbuzné ................................. 27 Obrázek 10: Alely identické původem ve dvou osobách ......................................................... 30 Obrázek 11: Rodokmen 4, žalovaný nenese alelu biologického otce ...................................... 51 Obrázek 12: Rodokmen s podezřením na nulovou alelu .......................................................... 56 Obrázek 13: Rodokmen s více meiózami stejného chromozomu (Buckleton, 2005) .. 58 Obrázek 14: Tři rodokmeny, u kterých využijeme lokusy ve vazbě ........................................ 60 Obrázek 15: Genetické vyšetření může být informativní pro rozlišení dvou hypotéz, i když Cottermanovy koeficienty k jsou shodné ................................................................................. 77 Obrázek 16: Ovládací lišta programu familias 1.81 ................................................................. 78
4
Seznam tabulek Tabulka 1: Hummelova slovní vyjádření a odpovídající hodnoty pravděpodobnosti otcovství (při 50% výchozí pravděpodobnosti otcovství) a paternitních indexů (PI).............................. 11 Tabulka 2: Frekvence alel a frekvence genotypů ..................................................................... 19 Tabulka 3: Hodnoty PI pro kombinace DNA profilů matky, dítěte a žalovaného ................... 25 Tabulka 4: Hodnoty koeficientů příbuznosti k ......................................................................... 31 Tabulka 5: Pravděpodobnosti P(E, F) a věrohodnostní poměry pro Hp: (E, F) ~ (k0, 2k1, k2) a Hd: (E, F) ~ (1, 0, 0) pro všechny kombinace genotypů E a F za H-W rovnováhy ................. 31 Tabulka 6: Hodnoty PI a LR pro kombinace DNA profilů dítěte a žalovaného ...................... 46 Tabulka 7: Hodnoty koeficientů příbuznosti k a θ ................................................................... 47 Tabulka 8: Věrohodnostní poměr pro rodičovství k dítěti ....................................................... 48 Tabulka 9: Věrohodnostní poměr pro směsný profil matky s dítětem ..................................... 49 Tabulka 10: Věrohodnostní poměr pro směsný profil matky a žalovaného ............................ 50 Tabulka 11: Frekvence mutací u populárních autozomálních lokusů (http://www.cstl.nist.gov/strbase/mutation.htm) ...................................................................... 51 Tabulka 12: Výpočet LR při započtení nulové alely (http://dna-view.com/patform.htm) ....... 57 Tabulka 13: Rekombinační frakce na chromozomu X............................................................. 59 Tabulka 14: LR v případě sporu o dědičství po zemřelém muži (Brenner, 1997) ........ 61 Tabulka 15: Výpočet LR při subpopulaci ................................................................................ 62 Tabulka 16: Index paternity při srovnání hypotéz žalovaný versus příbuzný žalovaného. Θ je příbuzenský koeficient mezi žalovanými (Evett, 1998). ................................................ 65 Tabulka 17: Hodnoty PI pro kombinace DNA profilů matky, dítěte a žalovaného za alternativní hypotézy otcovství bratra žalovaného v subpopulaci. Matka, žalovaní bratři i biologický otec patří do stejné subpopulace. Θ se zde vztahuje k subpopulaci, ne k vztahu bratr-bratr. ................................................................................................................................ 66 Tabulka 18: Hodnoty PI pro kombinace DNA profilů matky, dítěte a žalovaného, zjednodušené při imprintingu (mateřská alela u dítěte je tučně) .............................................. 68 Tabulka 19: Výpočet LR u paternit s použitím X-STR při subpopulaci (Ayres, 2005).. 70 Tabulka 20: Pravděpodobnosti X-STR genotypů jednotlivých párů muž-žena za předpokladu jejich příbuznosti (dle nakresleného rodokmenu) .................................................................... 72 Tabulka 21: Pravděpodobnosti X-STR genotypů jednotlivých párů muž-muž za předpokladu jejich příbuznosti (dle nakresleného rodokmenu) .................................................................... 73 Tabulka 22: Pravděpodobnosti X-STR genotypů jednotlivých párů žen za předpokladu jejich příbuznosti (dle nakresleného rodokmenu) .............................................................................. 74 Tabulka 23: Autozomální STR pro určení příbuznosti (Nothnagel, 2010) .................. 76
5
Summary Forensic geneticists may encounter kinship problems both in criminal and civil law. In criminal law, it concerns paternity after rape or incest, testament fraud, mistaken identity of newborn, and parentage in infanticide or kidnapping. DNA profiling helps to return child to its biological family and/or indict a criminal from crime offence. In the same time, it can also exculpate a defendant. In the Czech civil law DNA profiling helps confirm blood bonds for alimony, last will, and body identification of victims after disaster. It may also help in immigration and/or naturalization in international cases. The same DNA profiling result may be interpreted differently, dependent on context – false positivity of the test is more socially deleterious in criminal law than in civil law. Thus, jury can designate lower prior probability of guilt and higher threshold of posterior probability for statement of “the guilt practically proven”. In the same line of thought, when in doubt, forensic genetics expert can use “conservative approach” by applying the probabilistic model that yields the lowest likelihood ratio for guilt. “Wet” part of DNA profiling is becoming routine while interpretation of result can be challenging and unique. Therefore, this book concerns interpretation of kinship DNA profiling. It enlists Bayes theorem, deriving likelihood ratio by pedigree method and algorithmic method, and calculating likelihood ratio in the case of exceptions. Also, it includes exercise questions with answers. Namely, the content is as follows: Symbols; Probability; Odds; Laws of probability: complemetarity, multiplication, and addition; Likelihood ratio; Bayes theorem; Alternative statistics Hardy-Weinberg law; Mendel´s laws Deriving likelihood ratio for mother-child-accused man trios using pedigree method Deriving likelihood ratio for kinship of two persons using algorithmic method Complications of DNA profiling: mother unavailable; accused man unavailable; unknown parents, missed persons; mutation; triallelic locus; chimerism and mosaicism; monozygous twins; rare and null allele; linked loci; multiple children; subpopulation; kinship; imprinting; Y and X chromosomes; and mitochondrial DNA Software Conclusion Exercises with answers.
6
Motto Ej tam dole na dole, níže Nových Zámků, pase Jano dva koně, ej v drobném marijánku, ej pase je tam on pase, ej až se celý třese, že mu jeho milenka, ej pacholátko nese, nenos mi ho milenko, ej nedělej mi toho, vem si svoje pachole, ej pověz na jiného, na jiného nepovím, ej pán Bůh by mě trestal, kdoví jakou nemoc by, ej na mě s nebe seslal, a tak já ti milá dám, ej čtyři sta tolarů, vezmi milá, vezmi je, ej na celou výživu, ale to já neberu, ej to je všecko málo, dávno jsi ty užíval, ej mojí lásky darmo, tak ti ještě k tomu dám, ej můj zlatý prstýnek, jestli ti to bude dost, ej za zelený vínek, ale to já neberu, ej to je všecko málo, dávno jsi ty užíval, ej mojí lásky darmo, tak ti ještě k tomu dám, ej kravičku s telátkem, jestli ti to bude dost, ej i s tvojím děťátkem, ale to já neberu, ej to je všecko málo, dávno jsi ty užíval, ej mojí lásky darmo, tak ti ještě k tomu dám, ej vraného koníčka, a na toho koníčka, ej sám sebe, Janíčka, ej to jsem já šohajku, ej tohle jsem já chtěla, abych tobě Janíčku, ej věrnou ženou byla. Pase Jano dva koně (moravská lidová, zpěvník Františka Sušila, http://www.hutka.cz/)
7
1 Předmluva S určováním pokrevní příbuznosti se forenzní genetik může setkat jak v trestním, tak v civilním kontextu. V trestní problematice bývá úkolem identifikovat otce dítěte, počatého znásilněním, pohlavním zneužíváním nebo incestem, odhalit záměnu novorozeňat nebo testamentový podvod, zjistit rodiče v případech infanticidy či opuštění dítěte z utajeného porodu nebo o únos dítěte. DNA důkaz pomáhá navrátit dítě do biologické rodiny, obvinit pachatele z trestného činu, nebo naopak - může pomoci vyvinit, omilostnit. V české civilní problematice pomáhá potvrzení pokrevních svazků pomocí DNA v řízení o alimenty, ve vypořádání závěti, popřípadě při identifikaci tělesných pozůstatků po individuálních nebo hromadných neštěstích. U zahraničních soudů může jít také o imigrační řízení a naturalizaci na základě příbuzenského svazku k občanovi země. Platí, že „…v žádném jiném forenzním odvětví nebyly před znalce předloženy tak neuvěřitelné lži a tak nestoudné požadavky jako zde“(Gottschalk, 1912). Interpretace stejného výsledku se může lišit – v trestním řízení má falešná pozitivita z celospolečenského hlediska větší negativní efekt než v civilním řízení. Stejně jako se lékař řídí pravidlem „hlavně neuškoď“ (primum non nocere), tak i v případě forenzního posudku se chceme vyhnout potrestání nevinného, proto používáme v rámci presumpce neviny takzvaný konzervativní přístup (in dubio pro reo). Doslovně to znamená „v případě pochybností ve prospěch (žalované strany)“ a v praxi se jedná o případy, kdy má forenzní genetik na výběr více rovnocenných možností, kterou hodnotu dosadit do vzorce nebo který pravděpodobnostní model použít. V souladu s uvedenou zásadou používáme takovou hodnotu nebo takový model, který je vůči žalovanému nejmírnější. Při forenzní genotypizaci je standardní laboratorní metodou vyšetření určitých délkových polymorfismů, krátkých tandemových repetic (mikrosatelitů) na autozomálních chromozomech. 1 Z nesmírného množství těchto repetic se pro testování užívá pouze několik desítek, které byly vybrány tak, aby navzájem nebyly ve vazbě, a zároveň aby nebyly asociovány s genetickými chorobami. Vyšetření se provádí pomocí PCR s fluorescenčně značenými primery a kapilární elektroforézy. Srovnávací vzorek DNA se získává neinvazivně, ze slin nebo z výtěru ústní dutiny2, a typizační soupravy jsou komerčně dodávané, takže po laboratorní stránce se jedná o rutinu. Jedná se o rutinu, ale chybovat je lidské a chybovost může dosahovat až 0,3 % (Hallenberg, 2002), což není povzbudivé, přestože chyby mohou mít rozdílnou závažnost. Možnost chyby zdůrazňuje důležitost externí kontroly (např. RTW, GEDNAP, www.4N6gen.org) jako základní podmínky kvality práce v laboratoři. Další, dnes již méně využívanou možnosti kontroly je revizní posudek. Interpretace vyšetření však naopak rutinní být nemusí. Proto účelem této publikace není podat návod k odběru biologického vzorku, izolaci DNA, multiplexní PCR (multiplex zde znamená souběžnou amplifikaci více lokusů v jediné zkumavce) a kapilární elektroforéze nebo k jiné molekulárně genetické technice, ale ukázat, jak interpretovat výsledky vyšetření příbuznosti. Jmenovitě jsem si kladl za cíl: Seznámit čtenáře s Bayesovou větou a věrohodnostním poměrem
1
Zájemce o čistě forenzní problematiku genetických stop odkazuji na stránky Československé společnosti pro forenzní genetiku www.cssfg.org a International Society for Forensic Genetics http://www.isfg.org/. 2 V případě, že vzorek DNA je získán z nedostatečného nebo hůře zachovalého biologického vzorku (vzorek z potratu, z ohořelého či tlejícího těla, z takového parafinového bločku, kde vzorek byl příliš dlouho ve formaldehydu nebo formaldehyd nebyl pufrován), vnáší se do interpretace výsledku další nejistota, tentokrát technického rázu (ohledně přítomnosti píků na elektroforeogramu a přítomnosti alel v genotypu). Tuto nejistotu lze započítat do věrohodnostního poměru.
8
Ukázat, jak správně odvodit věrohodnostní poměr při určování otcovství u tria matka-dítěžalovaný grafickou (rodokmenovou) metodou a při určování sourozenectví dvou osob algoritmickou metodou Ukázat, jak započíst do LR (likelihood ratio – věrohodnostní poměr) mimořádnosti a výjimky, se kterými se znalec může setkat. Pro ověření pochopení jsou pak pro čtenáře na konci publikace zadané příklady se vzorovým řešením. Přestože veškeré informace potřebné k intepretaci vyšetření otcovství a příbuznosti jsou přístupné v anglické literatuře, impulsem pro sepsání této knihy byla zkušenost v počátcích mé konzultační a znalecké činnosti, kdy jsem postrádal referenční publikaci, která by mě ubezpečila, že ve výpočtu postupuji správně.
9
2 Teoretický úvod Výsledkem molekulárně genetického vyšetření pomocí PCR bývá genotyp, ve forenzní praxi nazývaný DNA profil. Pokud provedeme genotypizaci polymorfních lokusů matky, dítěte a možného otce dítěte, lze z Mendelových zákonů usoudit na to, jestli důkaz svědčí pro otcovství žalovaného nebo proti němu3: pokud u dítěte identifikujeme alelu pocházející od matky, druhá alela musí nutně pocházet od biologického otce. Pokud žalovaný otcovskou alelu nenese, je to důkaz proti otcovství žalovaného. Pokud je matka i dítě shodný heterozygot, je mateřská alela jednou ze dvou alel dítěte, stejně jako otcovská alela je jednou z těchto alel. Při této konstelaci genotypu matky a dítěte (na rozdíl od všech ostatních konstelací) tedy nelze jednoznačně identifikovat otcovskou alelu a musíme pracovat s faktem, že otec může mít kteroukoli z dvojice alel dítěte. Pokud žalovaný ani jednu z dvojice těchto potenciálně otcovských alel nenese, je to důkaz proti otcovství žalovaného. Výsledek vyšetření však můžeme i kvantifikovat - určit, jak silný důkaz pro otcovství žalovaného muže je, že nebyl z otcovství genotypizací vyloučen při zjištěné konstelaci tří DNA profilů. Pro tuto forenzní (soudní, kriminalistickou) implikaci potřebujeme kromě Mendelových zákonů využít pravidlo o Hardy-Weinbergově rovnováze a Bayesovu větu. V této kapitole se seznámíme s Bayesovou větou.
2.1 Symbolika A, B, C obecně tvrzení H tvrzení, hypotéza, verze, scénář ve forenzním kontextu E jev, důkaz ve forenzním kontextu (z anglického „evidence“) neH, nonH, ~H, H negace tvrzení H a zároveň (tvar skleněného poklopu na sýry, znázorňující průnik jevů) nebo (tvar dlaní nastavených do misky, do které se vejdou všechny jevy) P pravděpodobnost ǀ
E .
za předpokladu, že. Pozor na záměnu s obyčejným zlomkovým lomítkem H
PH E podmíněná pravděpodobnost; pravděpodobnost tvrzení H, za předpokladu, že důkaz E je pravdivý. Pokud zůstaneme u obecnějšího označení tvrzení písmeny A, B, C, je nutné si vždy uvědomit, co je tvrzením a co předpokladem tvrzení.
2.2 Pravděpodobnost Považujme pravděpodobnost za měřítko pro stupeň důvěry v nějaké tvrzení nebo hypotézu, přičemž tato důvěra je založená na rozumové analýze dostupných informací (Robertson, 1995). Tato definice pravděpodobnosti nemusí souhlasit s definicí, pojatou z jiného pohledu, ale pro pochopení Bayesovy věty je důležitá. Pokud je tvrzení o skutečnostech (ne předpověď budoucích skutečností) přesné, jasné a jednoznačné, může být výhradně buď zcela pravdivé nebo zcela nepravdivé a nic mezi tím. Tvrzení nemůže být částečně pravdivé – to je jen porušena podmínka přesnosti, jasnosti a jednoznačnosti. Každý jednoznačný jev má binární povahu: jev se buď stal, nebo nestal, ale nemohl se stát jen částečně (chytrá horákyně promine, ale nelze být napůl těhotná, pokud jednoznačně definujeme těhotenství např. příchodem porodu). Jinou otázkou je však naše povědomí o pravdivosti tvrzení, kde do hry vchází nejistota. 3
Jak popíši níže, i se závěrem „vyloučení otcovství“ bychom měli být opatrní a raději používat logický postup – použití Bayesovy věty a vyjádření výsledku vyšetření věrohodnostním poměrem.
10
Naše nedostatečná informovanost nám ovšem málokdy umožní rozhodnout jednoznačně o pravdivosti anebo nepravdivosti tvrzení. Tato naše nejistota daná naší subjektivní znalostí a neznalostí může být vyjádřena pomocí pravděpodobnosti, že tvrzení je pravdivé. Tato pravděpodobnost nabývá hodnot mezi 0 a 1 anebo může být ekvivalentně vyjádřena procentuálně, rozmezím 0 % až 100 %. Nulová pravděpodobnost indikuje úplnou nedůvěru v tvrzení, zatímco pravděpodobnost rovná jedné indikuje absolutní jistotu v tvrzení. Tyto dva extrémy jsou však v reálu nedosažitelné a prakticky se k nim vždy jen přibližujeme. Pravděpodobnost 0,5 (50 %) znamená přesný střed, kdy se ohledně pravdivosti tvrzení nedokážeme přiklonit ani na jednu stranu misky vah. Soud (a ne znalec) by měl jednak stanovit, jaká je úroveň počáteční pravděpodobnosti jednotlivých hypotéz před DNA profilováním, jednak jaká úroveň pravděpodobnosti je dostatečná pro rozhodnutí o vině či nevině. Jednu z možných převodů čísel na slovní vyjádření u určování otcovství vytvořil Hummel (Hummel, 1969)(Tabulka 1). Tabulka 1: Hummelova slovní vyjádření a odpovídající hodnoty pravděpodobnosti otcovství (při 50% výchozí pravděpodobnosti otcovství) a paternitních indexů (PI) PO50 (W)
PI
slovní vyjádření dle Hummela
70,00%-79,00%
2,33 – 3,76
pouze formálně svědčí pro otcovství
80,00%-89,00%
4,00 – 8,09
náznak otcovství
90,00%-94,90%
9,00 – 18,61
otcovství pravděpodobné
95,00%-98,90%
19,00 – 89,9
otcovství velmi pravděpodobné
99,00%-99,74%
99,00 – 383,6
otcovství vysoce pravděpodobné
99,75%-
>399
otcovství prakticky prokázáno
Pravděpodobnost tvrzení závisí na informacích, které má dotyčná osoba - hodnotitel k dispozici. Naše zhodnocení pravděpodobnosti, že v našem bydlišti dnes bude pršet, bude jiné v případě, že jsme slyšeli aktuální předpověď počasí a vyhlédli z okna, než v případě, že jsme se na nebe ani nepodívali a předpověď počasí jsme neslyšeli. Každé tvrzení má svůj opak, negaci. Pro „dnes bude pršet“ to bude: „dnes nebude pršet“, pod což spadají všechny atmosférické stavy bez precipitace vody ve stavu tekutém (slunečno, mlhavo, zamračeno, ale i kroupy, sněžení). Pokud PH E =0,25, tak pak komplementárně PneH E =0,75, protože je jisté, že událost se musela buď stát nebo nestát (vždy se stal alespoň jeden jev ze všech možných jevů), což dohromady dává pravděpodobnost 1: PH E + PneH E =1 Pravděpodobnost tvrzení opačného k původnímu tvrzení se vypočte jako 1 mínus pravděpodobnost původního tvrzení (zákon úplné pravděpodobnosti nebo zákon komplementarity). Pozor ovšem na pravděpodobnosti, které dohromady jedna dávat nemusejí. Například při těhotenském testu budiž pravděpodobnost dvou zabarvených proužků, když je žena těhotná, rovna 0,90 a pravděpodobnost jednoho (kontrolního) zabarveného proužku, když žena není těhotná, 0,95. To dohromady jedna přesahuje,
11
PH E + PneH neE ≠1, protože se jedná o pravděpodobnosti s rozdílnými podmínkami.
2.3 Šance Pravděpodobnost můžeme popsat i pomocí šance. Mimo akademický svět se s šancemi nejčastěji setkáme při sázkových kurzech. Šance nám říká, kolikrát je pravděpodobnější tvrzení, než jeho opak (než jeho negace). Jinými slovy, šance je poměrem mezi pravděpodobností, že tvrzení je pravdivé a pravděpodobností, že tvrzení je nepravdivé. Pokud ohodnotíme pravděpodobnost deště 20 %, tak ekvivalentní vyjádření pomocí šance bude 0,20/(1-0,20)=1 ku 4, že bude pršet (anebo 4 ku 1, že pršet nebude). Pro převedení šance a ku b na pravděpodobnost použijeme vzoreček: a . P ab Používání šancí je výhodné, protože nahrává použití věrohodnostního poměru pro důkaz u dvou srovnávaných hypotéz a u extrémních pravděpodobností je jasněji interpretovatelné (je zřejmější rozdíl mezi 1 ku 1 000 a 1 ku 10 000 než pravděpodobnostní vyjádření stejného rozdílu 0,999 a 0,9999) (Robertson, 1995). Na druhou stranu, vyjádření váhy DNA důkazu pomocí šance je mírně náchylnější ke klamným interpretacím než je tomu u vyjádření ve formě pravděpodobnosti (viz kapitola 4.7 Vyšetření otcovství před soudem)(Kaye, 1991).
2.4 Zákony pravděpodobnosti 2.4.1 Sčítání Představme si férovou vrhací kostku za kontrolovaných podmínek (vyvážená šestistěnná kostka; není možné, aby kostka zůstala stát na hraně, vždy může padnout jen jedno číslo). Jaká je pravděpodobnost, že padne číslo menší než 3? Parafrázujeme na „padne číslo jedna nebo číslo 2“ a všimneme si spojky. „Nebo“ znamená, že ve vzorci se objeví znaménko plus. Odpovědí je součet pravděpodobností dvou vzájemně se vylučujících jevů, pravděpodobnosti, že padne 1 plus pravděpodobnosti, že padne 2 z možností 1, 2, 3, 4, 5, 6. 1 1 1 P A nebo B P A B P A PB . 6 6 3 Pokud chceme zůstat u DNA profilování, mohla by být příkladem otázka, kolik lidí má maternální alelu na lokusu TH01 menší než TH01*7. Půjde o součet pravděpodobností TH01*4 (0,0004) + TH01*5 (0,0025) + TH01*6 (0,225) = 0,2279.4 Podívejme se na další příklad. Pokud jevy A a B nejsou vzájemně se vylučující, například A znamená, že na kostce padne číslo menší než pět a B znamená, že na kostce padne liché číslo, tak vzorec nabývá obecné formy zákona sčítání: 4 3 2 5 P A B P A PB P AB 6 6 6 6 Pokud bychom pravděpodobnosti A a B jen sečetli, dopustili bychom se chyby, protože v P A je zahrnuta i alternativa, že zároveň A i B jsou pravdivé. Stejně tak v PB je zahrnuta i alternativa, že B i A jsou pravdivé. V našem příkladu s kostkou bychom čísla 1 a 3 započetli dvakrát, protože tato čísla splňují podmínky lichosti a < 5. 4
Musím ovšem pominout mikrovarianty a vzácné alely.
12
Pokud chceme zůstat u genetiky, mohlo by jít o otázku, kolik lidí má alelu HLA- B*08:01 nebo DRB1*03:01, které jsou na šestém chromozomu ve vazbě: P A B P A PB P AB 0,052 0,071 0,04 0,083 (Gonzalez-Galarza, 2011).
2.4.2 Násobení Pokud chceme zhodnotit, jak je pravděpodobné, že nastanou dva nezávislé jevy A a B (například, že na kostce padne dvakrát za sebou šestka), tak dílčí pravděpodobnosti P(A) a P(B) násobíme. Spojky „a“, „a zároveň“ znamenají, že ve vzorci se objeví znaménko krát. 1 1 1 , P A B = P AB = P A PB 6 6 36 což je pravidlo násobení. Genetickým příkladem je genotyp Penta E*17,18; CSF1PO*10,11, P A B P A PB 0,0364 0,0293 0,2764 0,2725 0,000080329 , protože lokus Penta E je na chromozomu 15 a lokus CSF1PO je na chromozomu 5, takže nejsou ve vazbě, nejsou na sobě závislé – jsou nezávislé.
2.4.3 Podmíněné pravděpodobnosti Pravidlo násobení je platné jen za předpokladu nezávislosti dvou jevů. Často se však setkáváme s jevy na sobě závislými (což nás postupně přivede k věrohodnostnímu poměru a Bayesově větě). Pravděpodobnost, že jedním vrhem kostky padne číslo menší než čtyři P(A) nebo číslo liché P(B) není rovna součinu dvou pravděpodobností, 1 1 P A B P A, B P A PB , 2 2 protože jevy A a B jsou závislé. Ke správnému vzorci se dopracujeme tak, že si představíme, že jev B již nastal (Fung, 2008). Padlo liché číslo, což je jev s pravděpodobností ½. Jaká je pravděpodobnost, že číslo je menší než 4 za předpokladu, že se jedná o liché číslo? Lichá čísla na kostce jsou 1, 3, 5, 2 z čehož 1 a 3 jsou menší než 4 (dva jevy ze tří možných, PA B ) . Takže 3 1 2 1 P A, B PA B PB . 2 3 3 Evett uvádí pro ilustraci tento genetický příklad: jaká je pravděpodobnost, že pokud náhodně vybereme člověka z celosvětové populace, tak to bude Ind (jev B) a bude mít na lokusu TH01 genotyp 8, 9.3 (jev A)? (Evett, 1998)Pokud víme, že Indové tvoří čtvrtinu celosvětové populace a výskyt genotypu TH01*8, 9.3 je v indické populaci roven 4,8 %, tak P A, B PA B PB 0,25 0,048 0,012 .
Všimněme si dvou vlastností: pokud jsou jevy nezávislé, tak
PA B P A
13
Zároveň nezáleží na pořadí jevů A a B (v našem příkladu s kostkami se dostaneme ke stejnému výsledku, pokud hledáme čísla menší než čtyři mezi lichými čísly: 1, 3, 5 anebo pokud hledáme lichá čísla mezi čísly menšími než čtyři: 1, 2, 3), takže
P A, B PA B PB PB A P A . Pokud počet jevů zvětšíme na čtyři a označíme je A, B, C, D, tak
P A, B, C, D PB, C, D A P A , kde
PB, C, D A PC, D A, B PB A , kde PC, D A, B PD A, B, C PC A, B .
Takže po rozepsání prvního násobitele dostaneme
P A, B, C, D PD A, B, C PC A, B PB A P A . Stejně tak se při podmíněné pravděpodobnosti upravuje vzorec pro zákon sčítání z:
P A B P A PB P AB na:
P A B C = PA C + PB C - PAB C .
2.5 Věrohodnostní poměr Věrohodnostní poměr, anglicky likelihood ratio, LR, je číslo, vyjadřující podíl dvou pravděpodobností. Na rozdíl od podílů šancí se jedná o podíl pravděpodobností stejného důkazu při různých hypotézách a ne o pravděpodobnosti rozdílných hypotéz při stejném důkazu (při stejných podmínkách). Je to pravděpodobnost, že daný jev (důkaz) nastane za určitých podmínek, děleno pravděpodobností, že určitý jev (důkaz) nastane za jiných podmínek, přičemž podmínky jsou vzájemně se vylučující. Při určování otcovství se pro věrohodnostní poměr používá označení index paternity, paternitní index (PI) a slovní vyjádření má formu: „Ať jsou důkazy ve prospěch H1 jakkoli velké, toto vyšetření je posiluje PI-krát.“ 5 Základním paternitním indexem je podíl pravděpodobnosti výsledků genotypizace tria matkadítě-žalovaný při hypotéze biologického otcovství žalovaného a pravděpodobnosti stejných výsledků při hypotéze biologického otcovství neznámého nepříbuzného muže. Věrohodnostní poměr nabývá jakýchkoliv hodnot větších než nula6. Pokud je LR větší než jedna, tak je důkaz pravděpodobnější při první hypotéze (důkaz přidává na misku vah „otec“); pokud je menší než jedna, tak je důkaz méně pravděpodobný při první hypotéze. Pokud je věrohodnostní 5
Další správné slovní vyjádření PI je: „Podpora genetických výsledků je (PI=X/Y) krát větší, pokud testovaný muž je biologickým otcem, než pokud náhodný neznámý muž z populace je biologickým otcem“ nebo „Genotypizační výsledky jsou (PI=X/Y) krát pravděpodobnější za předpokladu, že testovaný muž je otcem dítěte, než pokud neznámý náhodný muž z populace je otcem dítěte. Nesprávné vyjádření je například: „je (X/Y) krát pravděpodobnější, že testovaný muž je biologickým otcem dítěte, než že neznámý náhodný muž je otcem dítěte“. 6 Proto se pro přehlednost někdy používá logaritmus LR.
14
poměr roven jedné, tak je důkaz irelevantní – nepřináší žádnou použitelnou informaci, přidá na obě misky vah stejně, takže s miskami vah nepohne. Dříve se v české literatuře po německém vzoru používalo „kritické číslo“, které má ve srovnání s LR prohozený čitatel s jmenovatelem a je tedy jen převrácenou hodnotou LR. Dnes se ustálilo umístění hypotézy obžaloby (otcovství žalovaného) do čitatele a věrohodnostní poměr s hlavní hypotézou ve jmenovateli se používá jen pro výukové účely (Balding, 2005).
2.6 Bayesova věta Bayesova věta je matematický teorém, který nám umožňuje upravit naše pravděpodobnostní očekávání ve světle nových důkazů (Bayes, 1763). Může být vyjádřeno v pravděpodobnostní nebo šancové formě. V pravděpodobnostní formě se jedná o vyjádření pravděpodobnosti A za předpokladu B pomocí (inverzní) pravděpodobnosti B za předpokladu A a dvou dalších pravděpodobností: PB A . P A B P A P B Na pravé straně rovnice je P A , apriorní, výchozí pravděpodobnost (soudní ohodnocení pravděpodobnosti tvrzení A před tím, než byly získány nové důkazy genetickým vyšetřením), pravděpodobnost důkazu B za předpokladu pravdivosti A, PB A a celková pravděpodobnost důkazu B, PB . Na levé straně rovnice je aposteriorní pravděpodobnost. Pro odvození Bayesovy věty bývá nápomocné množinové vyjádření (Obrázek 1). Obrázek 1: Grafické vyjádření podmíněných pravděpodobností pomocí Vennova diagramu
Na Vennově diagramu si můžeme P(A|B) představit jako otázku: za předpokladu, že jsme v oblasti B, jaká je pravděpodobnost, že jsme v oblasti AB? P(A|B) se pak rovná podílu plochy kruhové výseče AB děleno plochou kruhu B:
P A B
P AB . PB
15
Obdobně pravděpodobnost, že jsme v oblasti AB za předpokladu, že jsme v oblasti A, je rovna
PB A
P AB . P A
V obou vzorcích figuruje P(AB), takže si ze dvou rovnic můžeme vytvořit rovnici jedinou. První rovnici upravíme vynásobením levé i pravé strany P(B) a druhou rovnici upravíme vynásobením levé i pravé strany P(A). Potom PA B PB PB A P A
a odtud vydělením obou stran rovnice P(B) dostaneme P A B P A
PB A P B
,
což je Bayesova věta. V oblasti paternit se pro označení výsledné pravděpodobnosti otcovství vžilo písmeno W (z německého Wahrscheinlichkeit) (Essen-Moller, 1938). Šancová forma Bayesovy věty vypadá následovně:
P A B
PneA B
PB A P A . PneA PB neA
První zlomek na pravé straně rovnice je apriorní poměr šancí, druhý zlomek je věrohodnostní poměr pravděpodobností pro důkaz B za dvou alternativních hypotéz A a neA. Zlomek na levé straně rovnice je aposteriorní (výsledný) poměr šancí, který vzhledem k apriornímu poměru šancí roste, pokud je věrohodnostní poměr větší než jedna, a klesá, když je věrohodnostní poměr mezi 0 a 1. Soudní rozhodnutí se však neprovádí na základě jediného důkazu. Pokud chceme důkazy kombinovat, postupujeme takto: PA BE PBE A P A . PneA BE PneA PBE neA
Druhý zlomek na pravé straně je kombinovaný věrohodnostní poměr pro dva důkazy. Dá se rozepsat vzorečkem s využitím zákona o násobení: PBE A PB A PE BA . PBE neA PB neA PE BneA
Pokud jsou důkazy nezávislé, tak PE BA PE A a věrohodnostní poměr pro dva důkazy se zjednodušuje na součin dvou dílčích věrohodnostních poměrů:
16
PBE A PB A PE A . PBE neA PB neA PE neA
Aposteriorní poměr šancí může být s příchodem nového důkazu změněn vynásobením novým věrohodnostním poměrem. V Teoretickém úvodu jsem zmínil, že interpretace stejného výsledku soudem se může lišit mezi trestním a civilním řízením. Tato subjektivita je neodstranitelná. K její objektivizaci však dochází odhalením zdrojů nejistoty znalcem a odhalením dvou subjektivních hodnot soudcem: apriorní pravděpodobnosti otcovství a prahové hodnoty, za kterou se považuje vina za prokázánou. V trestním řízení pak soudce může nastavit menší apriorní pravděpodobnost viny a vyšší prahovou hodnotu, za kterou je se považuje vina za prokázánou.
2.7 Alternativní statistiky Kromě paternitního indexu a pravděpodobnosti otcovství někteří paternitní experti (Wiener, 1966)kvantifikují výsledek DNA profilování údajem „pravděpodobnost vyloučení“ (PE, probability of exclusion)
2
n PE i 1 P A a PE 1 1 PE l . PEi odpovídá podílu mužů v populaci, kteří i l i 1 v daném lokusu nemají otcovskou alelu (nebo kteří nemají žádnou ze dvou potenciálně otcovských alel, pokud není jasné, která alela je mateřská, a která otcovská). Jediný (slabý) argument pro použití pravděpodobnosti vyloučení ve forenzní praxi místo logičtějšího věrohodnostního poměru má být, že se PE snadno počítá a snadno chápe. Psát tento údaj do výsledku není doporučováno forenzními matematiky ani International Society for Forensic Genetics. Pravděpodobnost vyloučení je ve srovnání s paternitním indexem méněcenné vyjádření - nevyužívá veškerou informaci, získanou vyšetřením. Kterou informaci pomíjí? DNA profilováním tria matka-dítě-žalovaný získáme tři dílčí informace (viz http://dna-view.com/exclusn.htm#definition): DNA profil matky DNA profil dítěte DNA profil žalovaného muže. Z těchto dílčích informací můžeme odvodit závěr, že Žalovaný muž není vyloučen. Pokud budeme mít k dispozici dílčí informace DNA profil matky DNA profil dítěte Závěr, že žalovaný muž není vyloučen. nemůžeme vyvodit DNA profil žalovaného muže, takže jsme ztratili informaci, týkající se jeho genotypu. Nemá však soudní znalec povinnost využít veškerou informaci, kterou mu správně provedené vyšetření otcovství přináší? Do pravděpodobnosti vyloučení lze započíst možnost mutace. Ovšem výpočet PE s mutací je komplikovanější než výpočet věrohodnostního poměru s mutací a za určitých okolností může falešně zvyšovat hodnotu důkazu(Buckleton, 2005). Ostatní deskriptivní statistiky vztahující se k DNA profilování (heterozygozita, homozygozita, genová diverzita, pravděpodobnost shody, diskriminační síla, informační obsah polymorfismu, průměrný index
17
paternity, haplotypová diverzita(Drabek, 2002b)) se při vyšetřování otcovství nepoužívají a vztahují se spíše k databázím nebo typizačním kitům. Pro úplnost uvádím, že existují ještě další statistické metody vyjádření výsledku vyšetření otcovství, např. Neyman-Pearsonovská pravděpodobnost otcovství (Schulte-Moentig, 1972) nebo Ihmova minimax pravděpodobnost otcovství(Ihm, 1981), které již jsou v současné době překonané, protože stejně jako pravděpodobnost vyloučení nevyužívají veškerou informaci, poskytnutou DNA profilováním. Můžeme se setkat s praktickou otázkou: kdy můžeme otcovství považovat za vyloučené? Některé laboratoře si jako kritérium stanoví určitý počet neshod mezi alelou biologického otce a alelou žalovaného. Není to nejšťastnější, protože je rozdíl, pokud jsou dvě neshody u šesti lokusů nebo dvě neshody u patnácti lokusů a některé mutace jsou méně pravděpodobné než jiné. Logickým způsobem je výsledek vyjádřit jako věrohodnostní poměr – pokud je LR větší než jedna, tak důkazy svědčí pro otcovství, nehledě na počet neshod. Pokud se budeme při slovním vyjádření „otcovství prakticky prokázáno“ odvolávat na Hummelovu prahovou hodnotu pravděpodobnosti otcovství 99,75 %, tak bychom zrcadlově pro otcovství prakticky vyloučené měli použít pravděpodobnost otcovství 0,25 %. Kromě věrohodnostního poměru lze při určování příbuznosti využít i jiný přístup – počítání sdílených a nesdílených alel (Chakraborty, 1993). Tento přístup však nevyužívá informaci o vzácnosti sdílené alely, a proto je méně výhodný než věrohodnostní poměr. Může být však využit při masových katastrofách s navzájem příbuznými oběťmi. Počítání sdílených alel může sloužit jako skríningový nástroj, filtrující nepravděpodobné hypotézy před naběhnutím počítačově náročného algoritmu, počítajícího přesný LR.
2.8 Hardy-Weinbergův zákon Hardy-Weinbergův zákon (Hardy-Weinbergovo7 ekvilibrium, HWE) je vzorec popisující populaci v rovnováze, tvrdící, že za splnění určitých podmínek (panmixie – náhodné, neasortativní páření, nekonečně velká populace bez vlivu driftu, selekce, mutace a migrace) se už po jedné generaci fixují genotypové frekvence jako funkce alelických frekvencí (Tabulka 2). Přestože tyto podmínky jsou splněny jen v neexistující ideální populaci, jsou závěry z HWE zákona v zásadě platné i pro reálné populace. Pokud pomocí statistického testu dobré shody χ2 nebo přesněji pomocí Fisherova exaktního testu seznáme, že populace v rovnováze není, můžeme výpočty LR korigovat započtením parametru příbuznosti FST (viz kapitola 5.15 Příbuznost).
7
Zřídka se uvádí název Hardy-Weinberg-Castleovo ekvilibrium, který přiznává objevitelství i třetímu autorovi.
18
Tabulka 2: Frekvence alel a frekvence genotypů Počet Názvy Frekvence Frekvence genotypů alel alel alel Genotypy p, q
(p+q)2=p2+2pq+q2 PP+PQ+QQ
2
P, Q
3
P, Q, R p, q, r
(p+q+r)2=p2+2pq+2qr+2pr+q2+r2 PP+PQ+QR+PR+QQ+RR
4
P, Q, R, S
(p+q+r+s)2=p2+2pq+2qr+2pr+2ps+2rs+2qs +q2 +r2+s2 PP +PQ +QR +PR +PS +RS +QS +QQ+RR+SS
n
P, Q, p, q, r, s, …, (p+q+r+s+…+n)2=p2+2pq+2qr+2pr+2ps+2rs+2qs+…+2(n-1)n+q2+r2+s2+…+n2 R, S, n PP+PQ+QR+PR+PS+RS+QS+QQ+RR+SS+…+NN …, N
p, q, r, s
Příklad: Známe frekvenci p (=0,01) alely P a frekvenci q (=0,03) alely Q. Můžeme vypočíst, že heterozygot PQ má populační frekvenci 2×p×q = 2×0,01×0,03 = 0,0006 (průměrně 6 lidí z 10000 bude mít náš genotyp PQ).
2.9 Mendelovská dědičnost Zákon o jednotce dědičnosti a zákon dominance zde pomíjíme, protože se na výpočtu věrohodnostního poměru nijak nepodílejí. Zákon segregace říká, že během tvorby gamet se každý pár alel rozejde (oddělí), takže libovolná gameta nese pouze jednu alelu z každého páru alel náležejících rodiči. Páry alel se obnovují (alely se znovu párují) při fertilizaci. Zákon volné kombinovatelnosti říká, že různé geny řídí různé fenotypické znaky a alely různých genů se kombinují navzájem nezávisle, pokud nejsou ve vazbě. K vazbě dochází, pokud jsou lokusy dvou genů na chromozomu blízko sebe. Geny nesmějí být ve vazbě, pokud chceme využít násobení dílčích věrohodnostních poměrů při výpočtu celkového věrohodnostního poměru. Mendelovská dědičnost se dle fenotypových projevů dělí na autozomálně dominantní, autozomálně recesívní, gonozomálně dominantní, gonozomálně recesívní. Na molekulární úrovni při genotypizaci je dominance irelevantní, protože detekujeme jak dominantní, tak recesívní alely. Rozdíl mezi gonozomem a autozomem se na výpočtu LR projeví, jak bude ukázáno níže. Mezi výjimky mendelovské genetiky řadíme kromě vazby také mitochondriální dědičnost, genomový imprinting, gonadální mozaicizmus, uniparentální disomii, polygenní dědičnost, chloroplastovou a plasmidovou dědičnost. Kromě posledních tří zmíněných typů dědičnosti jsou zmíněné výjimky popsány dále v textu, protože pokud nastanou, pozmění interpretaci výsledku DNA profilování – pozmění výpočet LR. Chloroplastová a plasmidová dědičnost se netýká lidského genomu, a proto její problematiku přeskočím. Stejně tak přeskočím polygenní dědičnost, neboťse týká fenotypu a ne genotypu, a tak se na výpočtu LR nepodílí.
3 Odvození věrohodnostního poměru 3.1 Věrohodnostní poměr při určování otcovství u tria matka-dítěžalovaný rodokmenovou metodou Nyní se dostáváme k využití věrohodnostního poměru a Bayesovy věty při určování otcovství. Genotypizační výsledek při určování otcovství může zodpovědět na otázky: „Je výsledek typizace důkazem pro nebo proti otcovství? Jak silným je důkazem?“. Nejpřesněji se tyto 19
otázky zodpoví podáním věrohodnostního poměru ve prospěch jedné z hypotéz, protože ve věrohodnostním poměru (indexu paternity) je obsažena veškerá informace, kterou genetické vyšetření otcovství může poskytnout. Mějme 3 osoby – matku, dítě a žalovaného - , u kterých genotypizací zjišťujeme DNA profil. 1. hypotéza: postulujeme, že žalovaný a matka jsou opravdu biologickými rodiči dítěte 2. hypotéza: postulujeme, že matka je rodičem, žalovaný není s dítětem v příbuzenském vztahu. Opravdovým – biologickým – otcem je neznámý muž, který není příbuzný matky ani žalovaného. Je to takzvaný náhodný muž z populace (dle genealogické terminologie „zmáčený“, viz http://cs.wikipedia.org/wiki/Abecedn%C3%AD_seznam_%C4%8Dlen%C5%AF_rodiny). Náhodou (koincidencí) má žalovaný stejné znaky jako biologický otec (Obrázek 2). Obrázek 2: Rodokmenové znázornění základní hypotézy otcovství a neotcovství žalovaného
Je nasnadě, že pokud žalovaný muž má všechny testované znaky biologického otce, není vyloučen z otcovství. Ovšem nevyloučení žalovaného při testování šesti bodových polymorfismů (Single nucleotide polymorphism, SNP, většinou jen dvě varianty na nukleotidovou pozici) je logicky mnohem slabší důkaz pro otcovství než nevyloučení v šesti systémech mikrosatelitů (tandemové repetice s vysokým počtem alel v populaci a tím pádem s vysokou diskriminační schopností). Čím jsou alely biologického otce, dedukované porovnáním genotypu dítěte a matky, vzácnější, tím silnějším důkazem pro otcovství žalovaného je, pokud právě tyto alely má.8 Pravděpodobnost otcovství (PO) je měřítko síly důvěry v hypotézu, že žalovaný je biologickým otcem. PO musí být vypočtena na základě všech důkazů (nejen genetických) v rámci případu. Negenetické, apriorní důkazy pocházejí ze svědectví matky, žalovaného a dalších svědků. Genetické důkazy pocházejí z genotypizace tria matka-dítě-žalovaný. Pojďme si odvodit paternitní index pro všechny kombinace DNA profilů na jednom lokusu u matky, dítěte a žalovaného. „Jev“ je genotypizace - zjištění genotypů - u tria matka-dítě-žalovaný. Předpoklad pro výpočet čitatele indexu otcovství (X) je, že tyto tři osoby tvoří rodokmen. Předpoklad pro výpočet jmenovatele (Y) je, že matka s dítětem tvoří rodokmen a žalovaný je mimo rodokmen. Odvození je zjednodušením Elstonova-Stewartova algoritmu, prvně popsaného Ihmem (Elston, 1992; Ihm, 1975).
3.1.1 Čtyři různé alely v rodičovské generaci Genotypizací jsme získali profily: matka AB, dítě BC, žalovaný CD (Obrázek 3). Zjednodušeně řečeno – čitatel i jmenovatel jsou pravděpodobnosti rodokmenů. Rodokmen 8
Stejně tak vzácnost markanty určuje její váhu i u DNA profilů použitých pro identifikaci nebo u jiných typů důkazů.
20
zde bereme jako grafické znázornění příbuznosti jedinců a jejich genotypů (v podobném významu, jako je genealogický rozrod). Obrázek 3: Rodokmen 1 – žalovaný otcem, čtyři alely v rodičovské generaci
Dle Mendelových zákonů matka AB a otec CD mohou mít děti se čtyřmi genotypy: AC, AD, BC, BD. Index otcovství (paternity) PI = X/Y. Čitatel X je pravděpodobnost výsledku genotypizace za předpokladu otcovství žalovaného. Pokud se podíváme na rodokmen, pak je to pravděpodobnost, že zároveň: 1) náhodně vybraná žena z populace je genotypu AB, 2) náhodně vybraný muž z populace, který není příbuzný matce, je genotypu CD, 3) jejich dítě je genotypu BC. Pokud zároveň musí dojít k několika nezávislým jevům, pak jejich kumulativní pravděpodobnost je rovna součinu jednotlivých dílčích pravděpodobností (viz 2.4.2 Násobení). Pravděpodobnost, že náhodně vybraná žena z populace je genotypu AB, je dána Hardy-Weinbergovou rovnováhou P(AB)= 2pApB. Pravděpodobnost, že náhodně vybraný muž z populace je genotypu CD, je také dána Hardy-Weinbergovou rovnováhou P(CD) = 2pCpD. Pravděpodobnost, že dítě matky genotypu AB a otce genotypu CD je genotypu BC, je dána mendelovským zákonem segregace, součinem pravděpodobností přenosu alely B od matky a alely C od otce. Matka i otec jsou heterozygoti, mají dětskou alelu jen jednou (z maxima dvou), takže je padesátiprocentní pravděpodobnost (mendelovský segregační faktor = 0,5), že ji předají. Kumulativní pravděpodobnost (pravděpodobnost, že všechny jevy nastanou současně) je rovna: X = 2pApB×2pCpD×0,5×0,5. Čitatel zlomku máme vypočtený, pojďme k výpočtu jmenovatele (Obrázek 4). Obrázek 4: Rodokmen 1, neznámý nepříbuzný muž otcem, čtyři alely v rodičovské generaci
21
Jmenovatel Y je kumulativní pravděpodobnost, že zároveň 1) náhodně vybraná žena z populace je genotypu AB, 2) náhodně vybraný muž z populace, který není příbuzný matce ani dítěti, je genotypu CD, 3) matčino dítě je genotypu BC. Za předpokladu náhodného plození je pravděpodobnost, že netestovaný náhodný muž z populace předá alelu C svému dítěti rovna alelické frekvenci pC v jeho populaci, popřípadě subpopulaci. Subpopulace definovaná genetickou podobností je přesný a nezavádějící název na rozdíl od pojmu „rasa“, který má historické a sociologické konotace a třídí lidskou populaci na základě podobnosti kulturní, společenské, geografické, náboženské, fenotypové a genotypové bez jednoznačné definice zastoupení jednotlivých hledisek. Pravděpodobnost Y = 2pApB×2pCpD×0,5×pC, takže X 2p A p B 2p C p D 0,5 0,5 0,5 1 . PI Y 2p A p B 2p C p D 0,5 pC pC 2 pC Odvodili jsme si věrohodnostní poměr pro jednu kombinaci tří DNA profilů. Předtím, než se pustíme do odvození indexu paternity pro další možné DNA profily u tria matka-dítěžalovaný, podívejme se na vlastnost věrohodnostního poměru, která jde proti selskému rozumu - fakt, že testovaný muž má alelu biologického otce, může být důkazem proti otcovství testovaného (důkazem snižujícím PO). Představme si situaci, kdy otcovská alela je X 1 1 častá, kdy pC je rovno 0,6. Potom PI 0,83 , což je méně než jedna, Y 2 pC 2 0,6 takže je to důkaz proti otcovství žalovaného. Ono totiž platí, že když má určitou alelu kdekdo, tak nositelství této alely je jako identifikační znak kontraproduktivní. Je to nález natolik proti intuici, že i slovutný genetik (Chakravarti, 1984)na základě této vlastnosti mylně zamítal paternitní index se zdůvodněním, že se jedná o zavádějící údaj. Omyl mu musel prokázat jiný proslavený genetik (Baur, 1986). Podívejme se na výpočet PI u jiného lokusu stejného tria (Obrázek 5,
Obrázek 6).
22
3.1.2 Matka i žalovaný jsou shodní heterozygoti Obrázek 5: Rodokmen 2, matka i žalovaný jsou shodní heterozygoti, žalovaný otcem
Obrázek 6: Rodokmen 2, matka i žalovaný jsou shodní heterozygoti, neznámý nepříbuzný muž otcem
U těchto DNA profilů jsou dvě možnosti vysvětlení genotypů matky a dítěte – buď matka předala alelu A (a biologický otec B), nebo matka předala B (a biologický otec A). Zatímco „a zároveň“ implikuje v teorii pravděpodobnosti součin, tak „buď/anebo“ implikuje součet dvou pravděpodobností, proto X= 2pApB×2pApB× (0,5A×0,5B + 0,5B×0,5A), Y = 2pApB ×2pApB× (0,5A× pB + 0,5B× pA) a X/Y,
PI
2p A p B 2p A p B (0,5 A 0,5 B + 0,5 B 0,5 A ) 0,25 0,25 1 2p A p B 2p A p B (0,5 A p B + 0,5 B p A ) 0,5 A p B + 0,5 B p A p B + p A
Podívejme se nyní na případ, kdy žalovaný má alelu biologického otce ve dvou kopiích (zdědil ji po otci i po matce) (Obrázek 7, Obrázek 8).
23
3.1.3 Matka heterozygot, žalovaný homozygot Obrázek 7: Rodokmen 3, matka heterozygot, žalovaný homozygot, tři alely v rodičovské generaci, žalovaný otcem
Obrázek 8: Rodokmen 3, matka heterozygot, žalovaný homozygot, tři alely v rodičovské generaci, neznámý nepříbuzný muž otcem
Pokud žalovaný má jen alelu C, tak nemůže předat nic jiného než C, proto zde bude X= 2pApB×pC2×0,5×1, Y = 2pApB×pC2×0,5×pC
2p A p B p C 0,5 1 2
X/Y= PI
2p A p B p C 0,5 p C 2
1 . pC
24
Pokud uvažujeme kodominantní alely na jednom lokusu a zároveň pomíjíme mutace, subpopulace a nulové alely, tak výše zmíněným způsobem si můžeme odvodit PI pro všechny možnosti, které jsou v triu matka-dítě-žalovaný možné (Tabulka 3). Tabulka 3: Hodnoty PI pro kombinace DNA profilů matky, dítěte a žalovaného
Matka Dítě Žalovaný Čitatel X AA AA AA 1
Jmenovatel Y pA
AA
AA
AB
0,5
pA
AA
AB
AB
0,5
pB
AA
AB
BC
0,5
pB
AB
AA
AA
0,5
0,5×pA
AB
AA
AB
0,25
0,5×pA
AB
AA
AC
0,25
0,5×pA
AB
AB
AA
1
pA+ pB
AB
AB
AB
0,5
0,5×(pA+ pB)
AB
AB
AC
0,25
0,5×(pA+ pB)
BB
AB
AA
1
pA
BC
AB
AA
0,5
0,5×pA
BC
AB
AB
0,25
0,5×pA
BC
AB
AC
0,25
0,5×pA
BD
AB
AC
0,25
0,5×pA
PI 1 pA 1 2 pA 1 2 pB 1 2 pB 1 pA 1 2 pA 1 2 pA 1 p A pB 1 p A pB 1 2 p A p B 1 pA 1 pA 1 2 pA 1 2 pA 1 2 pA
Připomeňme si, že PI
PE H1 PE H 2
se násobí apriorním podílem šancí 25
P( H1 ) , P( H 2 )
abychom dostali výsledný podíl šancí: PH1 E P( H1 ) PE H1 , PH 2 E P( H 2 ) PE H 2 což se dá převést na pravděpodobnostní formu: Pvýchozí LR . P LR Pvýchozí 1 Pvýchozí Jakou však zvolit u paternit výchozí pravděpodobnost otcovství? Správným přístupem je použít apriorní pravděpodobnost, kterou pro daný konkrétní případ určil soud. Pokud soud apriorní pravděpodobnost otcovství neudá, tak se tradičně používá Pvýchozí = 0,5 (50 na 50, tzv. flat priors), kdy se každé výchozí pravděpodobnosti dává stejná hodnota. Při Pvýchozí = 0,5 se vzoreček Pvýchozí LR P LR Pvýchozí 1 Pvýchozí zjednoduší na LR . LR 1 Pragmatismus vítězí nad poznatkem, že hodnota 0,5 může být hrubě pomýlená, nehodící se pro konkrétní případ (Birus, 2003). Popisné statistiky z českých případů vyšetření otcovství (Lenhart, 1988; Lenhartova, 1992) ukazují, že u více než 70 % případů se podezření z otcovství prokáže, takže by se nabízela Pvýchozí = 0,7. Ani tato hodnota však není vhodná, protože předchozí případy nemají mít vliv na náš konkrétní případ. Konzervativním přístupem by mohlo být použití populační frekvence dětí, zplozených z nevěry. Přestože mezi laickou veřejností kolují promiskuitní legendy, podporované mediálními sexuology, skutečná frekvence nonpaternity v manželství v evropské civilizaci bude blízká jednomu procentu a určitě nebude převyšovat čtyři procenta(Gilding, 2005). U nesezdaných partnerů může být frekvence nonpaternity vyšší(Zeman, 2006), ale nejspíš se nebude dramaticky lišit. Další otázkou může být, jakou zvolit alternativní hypotézu. Opět je správným přístupem odvolat se na alternativní scénáře, které jsou uvažovány soudem. Neznámý nepříbuzný muž (random man) nemusí být jedinou ani správnou alternativou. Z druhé strany musí mít všechny hypotézy reálné opodstatnění - přestože má žalovaný čtyři bratry, nemusí se žádný z nich do pravděpodobnosti otcovství započítávat, pokud jsou vyloučeni na základě negenetických informací (nikdy se s matkou dítěte nemohli setkat). Naopak ve chvíli, kdy alternativní hypotézou může být, že biologickým otcem jsou dva další testovaní žalovaní a jeden netestovaný žalovaný, postupuje se následujícím způsobem: stanoví se apriorní pravděpodobnost otcovství pro každou z hypotéz. Využije se multiplikativnost věrohodnostních poměrů a apriorní pravděpodobnosti otcovství se modifikují hodnotou dílčích LR a poskytnou výsledné pravděpodobnosti otcovství pro každou z hypotéz. Souhrnná pravděpodobnost otcovství (součet dílčích výsledných pravděpodobností) zůstává 100 %.
3.2 Věrohodnostní poměr při určení příbuznosti dvou osob algoritmickou metodou První postup byl sice grafický a tím snáze pochopitelný pro člověka, ale hůře programovatelný jako softwarové příkazy. Jakýkoliv jiný postup odvození, například 26
dominová metoda (Lenhart, 2001), je správný, pokud neporušuje zákony genetiky a zákony pravděpodobnosti, to znamená, že: ekvivalentní úrovně důvěry musejí být ekvivalentně vyjádřeny pro blízké úrovně důvěry musejí být použita blízká vyjádření a pro rozdílné úrovně důvěry rozdílná vyjádření pokud věřím více v A než B a více v B než v C, tak musím více věřit v A než v C. Ukážeme si proto jiný správný postup, který je přímo ve formě algoritmických kroků, zadatelných počítači (Brenner, 1997). Tentokrát půjde o stanovení příbuznosti dvou osob – otázka zní: jedná se o úplné sourozence nebo nepříbuzné osoby (Obrázek 9)? Obrázek 9: Rodokmen 6, holčičky jsou úplné sestry, anebo nepříbuzné
Nechť q je frekvence alely Q v populaci, q PQ ; z je frekvence všech alel, které nejsou přímo zmíněné, zde z 1 q , jinak obecně z 1 p q r s ... Jak už bylo postulováno výše, vertikální čára ǀ znamená: „za předpokladu, že“ a označuje podmíněnou pravděpodobnost. Osoba C i D mají genotyp QQ X=P(D je QQ, C je QQǀD a C jsou sourozenci) Y=P(D je QQ, C je QQǀD a C nejsou příbuzní) X LR . Y
3.2.1 Osoby a teoretické kombinace alel Pro zjištění příbuzenského vztahu dvou lidí je nutné přidat do výpočtu další osoby, které naše vyšetřované osoby pokrevně spojují (společné předky). V našem případě se jedná o rodiče. Vytvoříme tabulku, kde sloupcům postupně odpovídají osoby od nejstarší generace k dětem a řádkům odpovídají veškeré teoreticky možné kombinace alel na lokusu u jedné osoby – veškeré genotypy. U každého genotypu je volný sloupec pro pozdější přiřazení pravděpodobnosti.
27
Matka QQ QQ QQ QZ QZ QZ ZZ ZZ ZZ
Otec QQ QZ ZZ QQ QZ ZZ QQ QZ ZZ
Osoba C QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ
Osoba D QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ
3.2.2 Doplnění genotypových frekvencí a podmíněných pravděpodobností Do tabulky doplníme dle Hardy-Weinbergovy rovnováhy genotypové frekvence pro nejstarší generaci: Matka QQ QQ QQ QZ QZ QZ ZZ ZZ ZZ
2
q q2 q2 2zq 2zq 2zq z2 z2 z2
Otec QQ QZ ZZ QQ QZ ZZ QQ QZ ZZ
2
q 2zq z2 q2 2zq z2 q2 2zq z2
Osoba C QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ
Osoba D QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ
Řádek po řádku doplníme do tabulky podmíněné pravděpodobnosti pro osobu C a D (podmíněné pravděpodobnostmi genotypu matky a otce): Matka Otec Osoba C Osoba D 2 2 QQ q QQ q QQ 1 QQ 1 QQ q2 QZ 2zq QQ 0,5 QQ 0,5 2 2 QQ q ZZ z QQ 0 QQ 0 QZ 2zq QQ q2 QQ 0,5 QQ 0,5 QZ 2zq QZ 2zq QQ 0,25 QQ 0,25 2 QZ 2zq ZZ z QQ 0 QQ 0 ZZ z2 QQ q2 QQ 0 QQ 0 2 ZZ z QZ 2zq QQ 0 QQ 0 ZZ z2 ZZ z2 QQ 0 QQ 0
28
Věrohodnostní poměr se počítá jako zlomek, kde v čitateli je pravděpodobnost důkazu (DNA profilů genotypizovaných osob) za předpokladu první hypotézy (prvního rodokmenu) a ve jmenovateli pravděpodobnost DNA profilů za předpokladu druhého rodokmenu.
3.2.3 Čitatel věrohodnostního poměru Pravděpodobnost rodokmenu vypočteme na základě pravděpodobnostního pravidla P A B P A PB A . Pro první řádek tabulky to bude: P(matka je QQǀC a D jsou sourozenci)×P(otec je QQǀC a D jsou sourozenci a matka je QQ)×P(C je QQǀC a D jsou sourozenci a matka je QQ a otec je QQ)×P(D je QQǀC a D jsou sourozenci a matka je QQ a otec je QQ a C je QQ)= =P(matka je QQ a otec je QQ a C je QQ a D je QQǀC a D jsou sourozenci), což znamená vynásobení dílčích pravděpodobností prvního řádku tabulky: q 2 q 2 1 1 q 4 a další řádky stejným způsobem. Protože jednotlivé kombinace DNA profilů mohou nastat na sobě nezávisle (buď anebo), celkovou pravděpodobnost vypočteme součtem dílčích pravděpodobností q4+q3z/2+0+q3z/2+q2z2/4= q4+q3z+q2z2/4. Matka QQ QQ QQ QZ QZ QZ ZZ ZZ ZZ
Otec q2 q2 q2 2zq 2zq 2zq z2 z2 z2
QQ QZ ZZ QQ QZ ZZ QQ QZ ZZ
Osoba C q2 2zq z2 q2 2zq z2 q2 2zq z2
QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ
Osoba D 1 0,5 0 0,5 0,25 0 0 0 0
QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ
1 0,5 0 0,5 0,25 0 0 0 0
Pravděpodobnost rodokmenu q4 q3z/2 0 q3z/2 q2z2/4 0 0 0 0 X= q4+q3z+q2z2/4
Když za „z“ dosadíme 1-q (připomínám, že „z“ zahrnuje frekvenci veškerých dalších alel a celková pravděpodobnost musí dosáhnout 1), vzorec se nám zjednoduší z X= q4+q3z+q2z2/4 na X=q2/4+q3/2+q4/4.
3.2.4 Jmenovatel věrohodnostního poměru Pro jmenovatel Y vypadá vyplněná tabulka obdobně. Jediný rozdíl je u pravděpodobností osoby D, protože ta už není součástí rodokmenu a platí pro ni frekvence vypočtená z Hardy Weinbergovy rovnováhy.
29
Matka QQ QQ QQ QZ QZ QZ ZZ ZZ ZZ
Otec q2 q2 q2 2zq 2zq 2zq z2 z2 z2
QQ QZ ZZ QQ QZ ZZ QQ QZ ZZ
Osoba C q2 2zq z2 q2 2zq z2 q2 2zq z2
QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ
Osoba D 1 0,5 0 0,5 0,25 0 0 0 0
QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ
q2 q2 q2 q2 q2 q2 q2 q2 q2
Pravděpodobnost rodokmenu q6 q5 z 0 q5 z q4z2 0 0 0 0 Y= q6+ 2q5z +q4z2= q6+ 2q5(1q) +q4(1-q)2=q4
Do vzorce pro věrohodnostní poměr dosadíme čitatele a jmenovatele a dostaneme: q2 q3 q4 4 2 4 1 2q q 2 . LR q4 4q 2 Výše uvedená tabulka odpovídá standardnímu případu bez zvláštností. Ovšem ke zvláštnostem dochází, což činí výpočet zajímavějším, jak bude ukázáno níže.
3.3 Věrohodnostní poměr při určení příbuznosti pomocí Cottermanových koeficientů příbuznosti Při určení stupně příbuznosti mezi dvěma osobami se obecně rozhodujeme mezi dvěma hypotézami: Hp: osoby jsou příbuzné a Hd: osoby jsou nepříbuzné, přičemž Hp může být specifikována stupněm příbuznosti mezi osobami (rodič a dítě, teta a neteř, poloviční sourozenci a další). Předpokládejme populaci v Hardy-Weinbergově rovnováze a v ní osobu s genotypem E a osobu s genotypem F. Pokud počítáme s inbreedingem, tak pro dvojici osob existuje devět rozdílných možností (charakterizovaných Jacquardovými koeficienty), které alely jsou identické původem. Na obrázku jsou v prvním řádku alely osoby E a v druhém řádku alely osoby F. Alely identické původem jsou zobrazeny spojením hranou mezi uzly (Obrázek 10). Obrázek 10: Alely identické původem ve dvou osobách
E F Tři poslední možnosti v rámečku odpovídají dvojicím bez inbreedingu. Vztahují se k nim Cottermanovy koeficienty příbuznosti k0, 2k1, k2: k0 = P(žádná z alel osoby E není identická původem s alelami osoby F) 2k1=P(první nebo druhá alela E je identická původem s jednou alelou F, zatímco ta zbývající alela E není identická původem s žádnou z alel F) 30
k2=P(každá z alel E má v F alelu identickou původem). Hypotézy si můžeme přeformulovat na Hp: (E, F) ~ (k0, 2k1, k2) a Hd: (E, F) ~ (1, 0, 0) (Tabulka 4). Tabulka 4: Hodnoty koeficientů příbuznosti k
Příbuzenský vztah Rodič-dítě Úplní sourozenci Poloviční („nevlastní“) sourozenci Prarodič-vnuk Strýc/Teta-neteř/synovec Bratranci/Sestřenice 1.stupně Bratranci/Sestřenice 2.stupně Nepříbuzní
k0 0 0,25 0,5 0,5 0,5 0,75 0,9375 1
2k1 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,25 0,0625 0
k2 0 0,25 0 0 0 0 0 0
Pravděpodobnosti kombinací genotypů E a F (Tabulka 5) lze odvodit s využitím indikátorové a Kroneckerovy delta funkce, což jde za rámec této publikace (Fung, 2008) Tabulka 5: Pravděpodobnosti P(E, F) a věrohodnostní poměry pro Hp: (E, F) ~ (k0, 2k1, k2) a Hd: (E, F) ~ (1, 0, 0) pro všechny kombinace genotypů E a F za H-W rovnováhy
PE, F H d LR
E
F
P E, F H p
AA
AA
k0 p A4 2k1 p A3 k2 p A2
p A4
k0
2k1 k 2 p A p A2
AA
AB
2k0 p A3 pB 2k1 p A2 pB
2 p A3 p B
k0
k1 pA
AA
BB
k0 p A2 pB2
p A2 p B2
k0
AA AB
BC AB
2k0 p pB pC 4k0 p p 2k1 p pB 2k1 p A p 2k2 p A pB
4p p
AB
AC
4k0 p A2 pB pC 2k1 p A pB pC
4 p A2 p B pC
k0
AB
CD
4k0 p A pB pC pD
4 p A p B pC p D
k0
2 A
2 A
2 B
2 A
2 p p B pC 2 A
2 B
2 A
2 B
k0 k0 k1
p
pB k2 A 2 p A pB 2 p A pB
k1 2 pA
4 Jednotlivé kroky analýzy Pro zvážení genetických důkazů (DNA profilů) formou věrohodnostního poměru a pro výpočet aposteriorní pravděpodobnosti otcovství potřebujeme znát všechny informace, které ovlivňují výpočet pravděpodobnosti otcovstvi(Gjertson, 2007), jmenovitě: Hypotézy připadající v úvahu, Apriorní pravděpodobnosti otcovství, Populaci, ze které se rekrutuje biologický otec dítěte nebo jiná osoba, jejíž příbuzenský status sledujeme, Výjimky z obecných premis.
31
4.1 Subjektivní ohodnocení apriorní pravděpodobnosti Pravděpodobnost otcovství (popřípadě příbuznosti) před genetickým vyšetřením by měl určovat soud, aby si znalec neosvojoval pravomoci, které mu nenáleží. Během historie vyšetření paternit se na tenkém ledě negenetických důkazů tančilo dle rozmanitých choreografií. Stačí jen zmínit, že schopnost erekce a ejakulace se ve středověku prokazovala před kongresem anebo že Fortunatus Fidelis v Palermu (1550–1630) vyloučil muže z otcovství, protože velikost jeho penisu byla pro ženy smrtelným nebezpečím a neumožňovala oplodnění (Albrecht, 2004). Paušálně používaná 50% apriorní pravděpodobnost otcovství je málokdy oprávněná, takže znalec by měl být soudu nápomocen navržením výchozí pravděpodobnosti otcovství, která vyplývá z konkrétního případu (ze spisu). Nicméně znalec nesmí přestoupit svou pravomoc, což si navzájem odporuje. Praktické řešení je provést výpočet i pro apriorní pravděpodobnosti, jiné než 50 %, a výsledky umístit do tabulky (Evett, 1998) a nechat na soudci, ať si nejvhodnější apriorní pravděpodobnost otcovství vybere podle svého ohodnocení negenetických důkazů v případu. Ve chvíli, kdy přichází v úvahu kryoprezervace spermií, nemůže ani vězeňský pobyt bez vycházky posloužit jako dostatečný podklad pro vyloučení otcovství bez genetických důkazů. Pokud dojde po znásilnění k porodu dítěte a žalovaný muž je nalezen prohledáváním kriminalistické databáze DNA profilů (bez jakýchkoliv negenetických důkazů), jako zásah naslepo (cold hit), měla by být apriorní pravděpodobnost otcovství nižší než 1/(počet násilníků v kriminalistické databázi), protože ne všichni násilníci jsou v registru (Balding, 1996; Song, 2009; Stockmarr, 1999). Pokud byly již dříve vyšetřeny dědičné znaky (jiné DNA systémy, krevní skupiny), započteme sílu těchto důkazů do apriorní pravděpodobnosti otcovství před naším vyšetřením. Přitom zohledňujeme případnou genetickou vazbu (viz kapitola 5.12 Vazba).
4.2 Nastolení srovnávaných hypotéz Nejčastější soutěžící hypotézou k otcovství žalovaného je otcovství neznámého nepříbuzného muže. Ovšem vždy musíme ve spisu zkontrolovat, zda neexistují nějací další muži podezřelí z otcovství, zvláště muži v příbuzenském vztahu k žalovanému. Lze srovnat více hypotéz naráz. Soubor apriorních pravděpodobností otcovství několika hypotéz se započtením věrohodnostního poměru přemění na soubor aposteriorních pravděpodobností otcovství.
4.3 Výběr databáze Databáze populačních frekvencí (spolu s parametry: příbuznost v populaci, frekvence nulových alel, frekvence mutací) má odpovídat populaci, ze které pochází biologický otec dítěte. Populace biologického otce nemusí být shodná s populací nařčeného. Biologického otce dítěte neznáme, ale na základě negenetických znaků můžeme usuzovat na to, do které subpopulace náleží. Při použití 15-ti mikrosatelitových lokusů a srovnávání základních rodokmenů z české populace můžeme použít jakékoliv europoidní populační frekvence (např. frekvence, uváděné v manuálu k typizační soupravě), aniž bychom se dopustili velké chyby. Pro standardizaci a snazší přezkoumatelnost znaleckých posudků by bylo výhodné, kdyby znalci používali publikované české populační frekvence (Simkova, 2009), dostupné také z webových stránek http://www.cssfg.org nebo http://www.4N6gen.org. Jsou případy, kdy je záhodno použít frekvence zjištěné anebo publikované pro jiné populace (jiná etnika). Pokud Číňanka uvádí, že měla pohlavní styk jen s Vietnamci, správné populační frekvence budou vietnamské a ne čínské, i kdyby žalovaný nebyl Vietnamec. Pokud nevíme, z kterého etnika biologický otec pochází, a přitom v úvahu přichází několik etnik, provedeme výpočet pro každou z etnických populačních frekvencí, aby se ověřila robustnost závěru. 32
Alternativním postupem je použít kompozitní databázi, vzniklou sloučením dílčích databází. Pokud určujeme příbuznost u archeogenetických nálezů, můžeme naši neznalost tehdejších populačních frekvencí ošetřit dostatečně konzervativně tím, že započteme nejvyšší koeficient příbuznosti, který kdy byl pro lidskou subpopulaci zmíněn: 0,3 (Egeland, 2010). Pokud mutace anebo nulové alely nejsou nutné pro biologické vysvětlení hypotézy, neuděláme závažnou chybu, když je nebudeme započítávat do LR.
4.4 Vypořádání se s komplikacemi vyšetření Mezi mimořádné, ale známé situace patří: mutace, tři alely na lokusu, chimérismus, mozaicismus, jednovaječná vícerčata, uniparentální disomie, alela mimo databázi, nulová alela, vazba, příbuznost.9 Některé mimořádnosti lze identifikovat na základě lékařské zprávy ohledně anomálií těhotenství, porodu, plodu nebo dítěte. Trisomie chromozomů navíc osobu stigmatizuje. Nejčastější je: Downův syndrom Trisomie 21. chromozomu, mongoloidní vzhled, lebka s velmi krátkým předozadním průměrem, rozštěpy rtů a páteře, u 40 % vrozené vady srdce, krátké prsty, nedostatečný vývin a znetvoření genitálií, malý vzrůst, IQ 25-50 Edwardsův syndrom Trisomie 18. chromozomu, protažená týlní část hlavy, malá ústa, malá brada, znetvořené uši, znetvořené ledviny, u chlapců rozštěp močové trubice, kýla, u 15 % rozštěpy rtů a patra, u 85 % vrozené vady srdce, u 15 % srdce na pravé straně těla, psychomotorická retardace) Pataův syndrom Trisomie 13. chromozomu, zakrnění mozku, u 80 % malformace CNS, u 70 % rozštěpy rtů a patra, znetvořené uši, u 80 % vrozené srdeční vady, mnohočetné nezhoubné nádory cév, více prstů, anomálie urogenitálu. Jiné výjimky lze rozpoznat přímo z DNA profilů. Nejčastější mimořádností je mutace. Žádný z mutačních modelů (nejznámější jsou uniformní, proporcionální, klesající a krokový model)(Dawid, 2001) není vědeckou komunitou rozeznán jako jediný správný, proto by se v případě mutace měl ideálně výpočet provést pro všechny modely – opět aby se ověřila robustnost nálezu.
4.5 Uzavření případu Posudek zodpovídá na otázky, kladené usnesením v občanskoprávním sporu nebo orgánem, který v trestním řízení znalce přibral. V posudku musí být vyjmenovány předpoklady (premisy), ze kterých vycházíme při výpočtu. V závěru se musí objevit věrohodnostní poměr. Pokud chceme referovat také aposteriorní pravděpodobnost otcovství, musíme uvést apriorní pravděpodobnost otcovství. Jak už bylo zmíněno výše, dobrou praxí je uvést aposteriorní pravděpodobnosti podle několika apriorních pravděpodobností. Podle Hummela odpovídá aposteriorní pravděpodobnost otcovství 99,75 % slovnímu vyjádření „prakticky prokázané otcovství“. Analogicky bychom měli pravděpodobnost otcovství (100-99,75) = 0,25 % považovat za „prakticky vyloučené otcovství“. Pokud máme prahové hodnoty pro slovní vyjádření nastaveny jinak než Hummel, zapíšeme to do posudku. Při komplikovaném rodokmenu může dojít i k situaci, že DNA profilování nedokáže apriorní pravděpodobnost změnit na takovou aposteriorní pravděpodobnost, kde je závěr nade vší pochybnost. V závěrečném posudku se tato skutečnost musí objevit.
9
Jak se ukázalo i v pražské zoo, u zvířat dochází k dalším komplikacím, se kterými se u člověka nesetkáváme: například u varana může dojít k partenogenezi (Ciofi, 2011; Watts, 2006).
33
4.6 Vzorový protokol o vyšetření Předpokládám, že se každý expert snaží provést celé vyšetření, jak nejlépe umí a závěrečný posudek píše s ohledem na zákonem stanovené náležitosti znaleckého posudku(Frystak, 2009). Dopracuje se k takové verzi posudku, která nevzbuzuje pochybnosti a správnosti a úplnosti, a kterou mu zákazník (soud nebo státní zastupitelství) přijímá bez žádostí o dovysvětlení. Pokud se však budeme držet mezinárodních standardů ISO, bude výsledek vyšetření méně napadnutelný obhájci žalované strany. Bude snáze možné výsledek zkombinovat s dalším vyšetřením nebo překontrolovat jiným znalcem a výsledek obstojí i v přeshraničních případech. Uvádím zde proto protokol o výsledku triviálního vyšetření otcovství, který splňuje požadavky ČSN EN ISO/IEC 17025 Posuzování shody – Všeobecné požadavky na způsobilost zkušebních a kalibračních laboratoří, konkretizované v doporučeních International Society for Forensic Genetics (ISFG) (Gjertson, 2007)a obsahuje náležitosti českého znaleckého posudku10. Čísla v kolečku jsou za vzorovým protokolem propojena s jednotlivými odstavci normy.
10
Děkuji doc.RNDr.Radku Vrtělovi, PhD. za cenné připomínky k vzorovému protokolu.
34
1
3
DNA LABORATOŘ U dvoušroubovice 24 123 45 Genetín Tel: 123 123 123 Akreditováno ČIA dle ČSN EN ISO/IEC 17025:2005 pod č. 1111
2
xxxx
4
Okresní soud v Číslo spisu: Číslo protokolu: Žalobce: Žalovaný:
Olomouci, Tř. Svobody 685/16, 77138 Olomouc Olomouc 18.8.1878 15 C 1877 ze dne 15.12.1877Znalecký posudek 5 pro určení otcovství: MH01/78 Cipísek, zastoupený opatrovníkem Městský úřad v Jičíně Rumcajs, narozený 5.11. 1847 v Jičíně, bytem t.č. Šatlava, 506 01 Jičín
V rámci vyšetření byl dle SOP Paternity proveden odběr biologických vzorků stěrem bukální 7 sliznice, byla izolována DNA a 6s využitím polymerázové řetězové reakce a elektroforézy fluorescenčně značených amplikonů (kit Identifiler)8 byly 10.1.1878 vyšetřeny nezávislé genetické znaky bez vazby, typu mikrosatelitů♣: CSF1PO, D13S317, D16S539, D18S51, D19S433, D2S1338, D21S11, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, FGA, TH01, TPOX, vWA spolu s genem pro amelogenin u těchto osob: Matka dítěte Manka, narozena 1.2.1854 v Jičíně, bytem les Řáholec. Datum odběru vzorku: 2.1.1878, 9 číslo vyšetření JD01/78_M, Nezletilec Cipísek, narozen 5.5.1873 v Jičíně, bytem u matky. Datum odběru vzorku: 2.1.1878, číslo 9 vyšetření JD01/78_D, Žalovaný Rumcajs, narozen 5.11. 1850 v Jičíně, bytem t.č. Šatlava, 506 01 Jičín. Datum odběru vzorku: 2.1.1878, číslo vyšetření JD01/78_Ž. 9 Odběry vzorků a vyšetření bylo provedeno za pomoci konzultantů jménem MUDr. Radek Pilař a RNDr. Václav Čtvrtek. Zápisy o provedených odběrech biologických vzorků jsou přiloženy. Seznam příloh 1) Znalecká doložka 2) Protokol o odběru matky a dítěte 3) Protokol o odběru žalovaného 4) Vyúčtování 5) Potvrzení o vynaložených nákladech
Str.101 z 3
♣
Formy mikrosatelitových genů (alely) jsou pojmenovány čísly, nikoli písmeny, jak je zvykem u krevních skupin. Zkušební protokol nesmí být bez písemného souhlasu laboratoře reprodukován jinak než celý. C_F_1 24.1.2011
35
LR
12
1
Vzorec
Rumcajs
Cipísek
11
Manka
Výsledek vyšetření
AMEL CSF1PO D13S317
XX 10 12
X 12
Y 10
XY 10 10
1 1,65 1/(p10+p12)
12 11
11
11
11 11
2,90 1/p11
D16S539 D18S51 D19S433 D2S1338
13 12 15 19
12 19
13 15
13 12 15 22
1,90 1/(p12+p13) 2,41 1/(2(p15+p19))
11 11 16 17
11 17
12 17
12 12 17 18
14,47 1/p12 2,76 1/(2p17)
D21S11
23 18
18
28
28 19
3,04 1/(2p28)
D3S1358 D5S818 D7S820
12 13 14 12 10 11
13 12 11
15 12 12
15 11 12 12 12 12
2,11 1/(2p15) 2,59 1/p12 7,16 1/p12
D8S1179 FGA TH01 TPOX
12 12 20 19 9 9.3 8 10
12 19 9.3 10
13 20 6 8
13 12 20 18 6 9.3 08 11
1,52 1/(2p13) 2,27 1/(2(p19+p20)) 2,22 1/(2p6) 0,82 1/(2(p8+p10))
vWA
15 17
17
18
18 17
2,18 1/(2p18)
Str. 2 z 3
36
Interpretace Na základě genotypizace mikrosatelitů, ve smyslu Mendelových zákonů dědičnosti těchto znaků, Hardy–Weinbergovy rovnováhy a na základě použití Bayesovy věty a věrohodnostního poměru Rumcajs (1850) není vyloučen z otcovství vůči nezletilci jménem Cipísek (1873). Jeho otcovství je prakticky prokázáno.
vWA
TPOX
TH01
FGA
D8S1179
D7S820
D5S818
D3S1358
D21S11
D2S1338
D19S433
D18S51
D16S539
D13S317
CSF1PO
Dítě v daném případě muselo od svého biologického otce získat alely:
10 nebo 12 11 12 nebo 13 15 nebo 19 12 17 28 15 12 12 13 19 nebo 20 06 08 nebo 10 18
vWA
TPOX
TH01
FGA
D8S1179
D7S820
D5S818
D3S1358
D21S11
D2S1338
D19S433
D18S51
D16S539
D13S317
CSF1PO
Žalovaný Rumcajs (1850) ve svém genotypu nese alely:
10 11 12 i 13 11 12 17 23 12 15 12 13 17 06 08 18 ,
a proto jej nelze vyloučit z otcovství vůči nezletilci jménem Cipísek (1873).11 Ať jsou jiné důkazy ve prospěch otcovství14 žalovaného jménem Rumcajs vůči nezletilci 12 jménem Cipísek ve srovnání s otcovstvím neznámého nepříbuzného muže z loupežnické populace (vyjádřené jako apriorní15pravděpododobnost otcovství) jakkoli velké, toto vyšetření je posiluje 1 438 629 krát. Vyjádřeno jiným způsobem: 50% výchozí pravděpodobnost 16 otcovství žalovaného jménem Rumcajs (1850) se na základě tohoto vyšetření upravuje na aposteriorní pravděpodobnost 99,9999 %, což je možno dle Hummelovy tabulky brát jako 17 prakticky prokázané otcovství. Pokud soud stanoví výchozí pravděpodobnost otcovství jinou než 50%, tak ke zjištění aposteriorní pravděpodobnosti otcovství poslouží tato tabulka: P apriorní (%) P aposteriorní (%)
1
5
10
25
50
75
99.9931189217 99.9986793156 99.9993744083 99.9997914686 99.9999304894 99.9999768298
18 Mendelín Hrášek, Ph.D.
Mendelín Hrášek Str. 3 z 3
11
Síla důkazu se vyjadřuje číselně věrohodnostním poměrem, a to na základě zjištěných DNA profilů a srovnávaných hypotéz. Poté se věrohodnostní poměr kombinuje s apriorní pravděpodobností otcovství tak, že poskytne výslednou (aposteriorní) pravděpodobnost otcovství.
37
Příloha 1 Pro spis Okresního soudu v Jičíně 15 C 1877 ze dne 15.12.1877 Znalecká doložka Znalecký posudek jsem podal jako znalec z oboru zdravotnictví, odvětví genetika, specializace molekulární genetika a DNA diagnostika (detekce genetické variability; určování otcovství a příbuznosti) jmenovaný Ministerstvem spravedlnosti ČR, dekretem č. Spr 3433/78 pod poř. č. 3402 podle § 3 zákona č.36/1867 Sb ze dne 6.4.1867 o znalcích a tlumočnících. Znalecký úkon je evidován a účtován pod naším číslem MH01/78 znaleckého deníku.
Olomouc 18.8.1878 Mendelín Hrášek, Ph.D. Mendelín Hrášek
38
Příloha 2 Protokol o odběru matky a dítěte Okresní soud v Číslo spisu: Číslo protokolu: Žalobce: Žalovaný:
Olomouci, Tř. Svobody 685/16, 77138 Olomouc Olomouc 18.8.1878 15 C 1877 ze dne 15.12.1877 Protokol o 5odběru matky a dítěte: MH01/78 Cipísek, zastoupený opatrovníkem Městský úřad v Jičíně Rumcajs, narozený 5.11. 1847 v Jičíně, bytem t.č. Šatlava, 506 01 Jičín
Na nařízený genetický důkaz otcovství vyšetřením mikrosatelitů se dostavily dne 2.1.1878 tyto osoby: Manka, narozena 1.2.1854 v Jičíně, bytem les Řáholec, rodné číslo 545201/321, historie transplantace nebo transfúze nebyla. Totožnost byla zjištěna občanským průkazem číslo Ř12365, vydaným v Jičíně dne 3.3.1872. Cipísek, narozen 5.5.1873 v Jičíně, bytem u matky, rodné číslo 730505/7895, historie transplantace nebo transfúze nebyla.
1)
2)
Otisk palce pravé ruky nezletilce a matky 19
Stvrzuji svým podpisem, že vzorek odebraný mně a mému dítěti byl v mé přítomnosti naplněn do řádně označených zkumavek, a že souhlasím s vyšetřením a uložením genetického materiálu na nezbytně nutnou dobu. 20 ……………………………………….. Podpis matky Odběr vzorků provedl MUDr.Radek Pilař, který svým podpisem stvrzuje, že totožnost matky a dítěte byla v jeho přítomnosti zjištěna, jak je shora uvedeno. Zároveň stvrzuje, že otisk palce pravé ruky matky a dítěte byl proveden v jeho přítomnosti.
……………………………………….. Podpis osoby, která provedla odběr
39
Příloha 5 Protokol o odběru žalovaného Okresní soud v Číslo spisu: Číslo protokolu: Žalobce: Žalovaný:
Olomouci, Tř. Svobody 685/16, 77138 Olomouc Olomouc 18.8.1878 15 C 1877 ze dne 15.12.1877 Protokol5 o odběru žalovaného: MH01/78 Cipísek, zastoupený opatrovníkem Městský úřad v Jičíně Rumcajs, narozený 5.11. 1847 v Jičíně, bytem t.č. Šatlava, 506 01 Jičín
Na nařízený genetický důkaz určení otcovství vyšetřením mikrosatelitů se dostavila k odběru biologického vzorku dne 2.1.1878 tato osoba: Rumcajs, narozen 5.11. 1850 v Jičíně, bytem t.č. Šatlava, 506 01 Jičín, rodné číslo 501105/966, historie transfúze nebo transplantace nebyla. Totožnost byla zjištěna občanským průkazem dokladem Ř08356 vydaným v Jičíně dne 16.8.1968. Otisk palce pravé ruky možného otce
Stvrzuji svým podpisem, že vzorek mně odebraný byl v mé přítomnosti umístěn do řádně označených zkumavek, a že souhlasím s vyšetřením a uložením genetického materiálu na nezbytně nutnou dobu. ……………………………………….. Podpis možného otce Odběr vzorku možného otce provedl MUDr.Radek Pilař, který svým podpisem stvrzuje, že totožnost možného otce byla v jeho přítomnosti zjištěna, jak je shora uvedeno. Zároveň stvrzuje, že otisk palce pravé ruky možného otce byl proveden v jeho přítomnosti.
………………………………………………………. Podpis osoby, která provedla odběr
40
Příloha 6 Vyúčtování Okresní soud v Číslo spisu: Číslo protokolu: Žalobce: Žalovaný:
Olomouci, Tř. Svobody 685/16, 77138 Olomouc Olomouc 18.8.1878 15 C 1877 ze dne 15.12.1877 Znalecký posudek pro určení otcovství: MH01/78 Cipísek, zastoupený opatrovníkem Městský úřad v Jičíně Rumcajs, narozený 5.11. 1847 v Jičíně, bytem t.č. Šatlava, 506 01 Jičín
Účtuji za provedení genetické expertízy u 3 osob podle vyhlášky Ministerstva spravedlnosti ze dne 10.2.1993 Sb. zákonů č.77/93 a pozměněné vyhlášky č.36/1967 takto: Náklady na vyšetření 3 osob hotové a paušální Použití kancelářského zařízení a materiálu Odběr vzorků a náhrada použitého zařízení a materiálu (MUDr. Radek Pilař) Izolace DNA a náhrada použitého zařízení a materiálu (RNDr. Václav Čtvrtek) Genotypizace a náhrada použitého zařízení a materiálu (RNDr. Václav Čtvrtek)
1 zlatý 6 zlatých 15 zlatých 30 zlatých
Znalecká odměna Laboratorní vyšetření a kontrola 30 hodin ā 1 zlatý 25 grošů Studium spisu a vyhotovení posudku 3 hodiny ā 1 zlatý Statistický výpočet 1 hodina ā 1 zlatý
37 zlatých 3 zlatých 1 zlatý
Celkem
93 zlatých
Potvrzení o vynaložených nákladech je přiloženo. Odměnu znalci včetně hotových a paušálních nákladů v částce 93 zlatých proplaťte znalci na účet:
Název účtu: Mendelín Hrášek, Ph.D. Číslo účtu: 111111111/5500 Popřípadě poštovní poukázkou na adresu:
Mendelín Hrášek, Ph.D. DNA LABORATOŘ U dvoušroubovice 24 123 45 Genetín r.č.691515/1515 ženatý č.OP 15151515
41
Příloha 7 Potvrzení o vynaložených nákladech případu MH01/78 Výdejka MUDr. Radek Pilař Výdejka RNDr. Václav Čtvrtek Faktura za kancelářské zboží
42
Odkazy na odstavce normy ISO17025 a doporučení ISFG (označené výše číslem v kroužku, zde jen číslem) 1 Logo laboratoře. 2 Akreditační značka. 3 Odstavec normy 5.10.2b Název a adresa laboratoře. 4 5.10.2 g Datum provedení zkoušky. 5 5.10.2 a Název dokumentu. 6 5.10.2 e Identifikace použité metody. 7 5.10.2 h Odkaz na použité vzorkování. 8 ISFG Specifické premisy (není třeba vyjmenovávat, že osoby jsou jednoznačně identifikovány, mateřství nezpochybněno, nejde o konsagvinitu, měření bylo provedeno bez chyb). 9 5.10.2 f Popis, podmínky a identifikace testované položky. 10 5.10.2 c Identifikace stránky a konce protokolu. 11 5.10.2 i Výsledky zkoušky. 12 5.10.2 ISFG: zmíněné empirické premisy. Jednotlivá LR pro lokusy, detaily pro možnosti zopakování výpočtu, použitá databáze vhodná pro testované hypotézy 13 5.10.2 ISFG: Fundamentální premisy. 14 5.10.2 ISFG: Stanovení vzájemně se vylučujících hypotéz, představujících rozdílné rodokmeny. 15 5.10.2 ISFG: Pokud se uvádí síla důkazu, má se použít věrohodnostní poměr (paternitní index). Pokud se uvádí PO (W), tak musí být vyjmenovány všechny premisy. 16 5.10.2 ISFG: Kritéria pro jednoznačné otcovství a jednoznačné neotcovství. 17 5.10.2 ISFG: Použití několika apriorních pravděpodobností otcovství. 18 5.10.2 j Jméno, funkce, kulaté razítko, podpis osoby potvrzující protokol. 19 5.10.2 f Popis, podmínky a identifikace testované položky. Otisk palce má výrazně lepší identifikační potenciál než fotografie, přestože v případě zpochybnění identity testovaných osob bude nutno přivzít daktyloskopického znalce. 20 Takto zkrácená forma informovaného souhlasu v současné době vystačuje. Nicméně DNA zákon by požadavek informovaného souhlasu mohl nastavit striktněji.
4.7 Vyšetření otcovství před soudem Rodinné právo prochází v současné době změnou (http://obcanskyzakonik.justice.cz/cz/rodinne-pravo/co-upravuje-rodinne-pravozakoniku/urcovani-rodicovstvi.html), která se projeví i při určování rodičovství: Podle současné úpravy i nového Občanského zákoníku je matkou dítěte žena, která dítě porodila. Podle současné právní úpravy je otcovství založeno: přímo zákonem samým v případě, že se dítě narodí za trvání manželství nebo do tří set dnů po jeho zániku; souhlasným prohlášením matky a muže, který o sobě prohlásí, že je otcem dítěte; rozhodnutím soudu, který otcovství určitého muže zjistil ve zvláštním řízení. Podle navrhované úpravy se systém domněnek otcovství zachovává, ale navíc obsahuje ustanovení o otcovství dítěte, které se narodilo z umělého oplodnění. Za otce se v tomto případě bude považovat muž, který dal k umělému oplodnění své partnerky souhlas (v manželství manžel).
43
Právní úprava popírání otcovství (§ 779) prodlužuje délku popěrné lhůty matky dítěte a manžela matky. Ve výjimečných případech může dojít k popření otcovství též na návrh nejvyššího státního zástupce i poté, co rodičům uběhly jejich lhůty pro popření otcovství (§ 786). Většina civilních případů je po genetické stránce jednoduchá, vedoucí k jednoznačnému závěru „otcovství prakticky prokázáno“ nebo „otcovství prakticky vyloučeno“. Proto se málokdy stane, že by byl znalec povolán k soudu, aby vysvětloval nebo obhajoval své závěry. Platí pravidla, platná pro každého znalce – nesvědčit v případě možné podjatosti, neosvojovat si právo, které náleží soudu (rozhodnutí o vině/nevině), nevystupovat jako znalec v odvětvích, která nemá odborně podložená. Nicméně nesprávné pochopení síly důkazu se týká i vyšetření otcovství. Dvě klamná vyjádření jsou tak častá, že získala pojmenování: klam ze strany obžaloby (prosecutor´s falacy) a klam ze strany obhajoby (defense attorney´s fallacy) (Thompson, 1987), ale samozřejmě, že klamavá tvořivost nezná mezí.
4.7.1 Klam ze strany obžaloby Jádrem chybného pochopení ze strany obžaloby je záměna podmínky a důsledku (transposing the conditional, „stavění pluhu před voly“): nesprávné tvrzení, že pravděpodobnosti hypotézy za předpokladu získání důkazu je rovna pravděpodobnost důkazu za předpokladu platnosti hypotézy, přičemž PH E PE H . Pravděpodobnost, že člověk, který je pilotem, už někdy letěl v letadle, je jiná než pravděpodobnost, že člověk, který už někdy letěl v letadle, je pilotem. Pravděpodobnost, že pes má čtyři nohy, není rovna pravděpodobnosti, že čtyřnohé zvíře je pes. Pravděpodobnost, že kondom byl defektní, pokud došlo při chráněném sexu k otěhotnění, je jiná než pravděpodobnost, že došlo k otěhotnění, pokud byl kondom při chráněném sexu defektní. Pravděpodobnost, že diagnostický test zachytí nemoc, pokud je člověk nemocný, je jiná než pravděpodobnost, že je člověk nemocný, když mu diagnostický test zahlásí pozitivní nález. Pravděpodobnost, že žalovaný je biologickým otcem dítěte za předpokladu, že nese všechny alely biologického otce je jiná než pravděpodobnost, že žalovaný nese všechny alely biologického otce dítěte za předpokladu, že je otcem dítěte. Případ se psem a pilotem je snadno pochopitelný i pro ty, co neradi šlapou do psích výkalů anebo trpí aerofobií. V jiných případech se musíme zamyslet nad tím, co je podmínka a co je důsledek. Je to uvažování proti proudu intuice12. Připoměňme si zde větu, která by měla být každému forenznímu vědci mantrou: PE H , PH E PH PH alt popřípadě PH E PE H P H PneH E PneH PE neH Pokud se v obou vyjádřeních Bayesovy věty soustředíme jen na výraz PH E a PE H , vidíme, co vše je ze vzorce při použití tohoto klamu opominuto. 12
Tuto část po sobě recenzentům nechávám přečíst dvakrát, jestli jsem se zde sám nedopustil zahanbující chyby.
44
Jiná forma klamu ze strany žaloby postihuje jmenovatel věrohodnostního poměru, pravděpodobnost důkazu za předpokladu alternativní hypotézy, hypotézy koincidence, náhodné shody. Pokud je tato pravděpodobnost rovna jedné milióntině, tak to obecně neznamená, že pravděpodobnost, že biologickým otcem je někdo jiný než obviněný, je rovna jedné milióntině. Tvrzení by bylo pravdivé jen tehdy, pokud by čitatel věrohodnostního poměru byl roven jedné a apriorní pravděpodobnost otcovství by byla 50%. Dalším klamem je nesprávné vyjádření věrohodnostního poměru: fráze „Je (X/Y) krát pravděpodobnější, že testovaný muž je biologickým otcem dítěte, než že neznámý náhodný muž je otcem dítěte“ je nesprávná, protože z Bayesovy věty vybírá jen některé části: PH E PE H . PneH E PE neH Správné vyjádření věrohodnostního poměru může znít: Genotypizační výsledky jsou (PI=X/Y) krát pravděpodobnější za předpokladu, že testovaný muž je otcem dítěte, než pokud neznámý náhodný muž z populace je otcem dítěte. Podpora genetických výsledků je (PI=X/Y) krát větší, pokud testovaný muž je biologickým otcem, než pokud náhodný neznámý muž z populace je biologickým otcem. Ať jsou jiné důkazy ve prospěch H1 jakkoli velké, toto vyšetření je posiluje (PI=X/Y) krát.
4.7.2 Klam ze strany obhajoby Obhajoba se snaží klamně snížit váhu důkazů proti obviněnému všemi způsoby, které jí umožňuje zákon. Zde se podívejme na cestu ignorování dalších důkazů, častou spíše u kriminalistického využití DNA identifikace. Pokud pravděpodobnost, že náhodný muž z populace v Ciudad de México nese alely biologického otce, je rovna jedné stotisícině a Mexico City má deset miliónů mužů, tak přibližně sto mužů v mexickém hlavním městě (a přibližně dalších 34 900 mužů na celém světě) splňuje podmínku pro otcovství z našeho vyšetření. To však neznamená, že pravděpodobnost otcovství žalovaného je jedna setina (popřípadě 1/35000). Těch sto mexických mužů s DNA profilem obsahujícím alely biologického otce má určitě rozdílné apriorní pravděpodobnosti otcovství, nemluvě o čínském chlapečkovi, který nikdy nepřekročil Velkou zeď (a šourek mu nešťastnou náhodou přejela rikša). Všem těmto možným klamům se vyhneme, pokud jednoznačně, bayesovským způsobem popíšeme, jaké jsou předpoklady, co jsou srovnávané hypotézy, co je apriorní pravděpodobnost a jak je apriorní pravděpodobnost změněna výsledkem vyšetření (věrohodnostním poměrem) na aposteriorní pravděpodobnost.
5 Komplikace vyšetření 5.1 Nedostupnost matky Matka může být nedostupná, protože je po smrti nebo nezvěstná, ale také proto, že o vyšetření otcovství neví nebo s ním nesouhlasí. Anglicky se takový případ nazývá motherless case a podle anglických doporučení správné praxe(UK Departments of Health, 2008)
45
„anonymní“ testy bez vědomí matky nejsou přípustné.13 Anonymní vyšetření otcovství je eticky sporné, protože s ohledem na zájmy dítěte by ke genetickému vyšetření dítěte mělo být vyžadováno písemné svolení obou jeho zákonných zástupců nebo kolizního opatrovníka dítěte. Jiný právní pohled je, že jeden rodič stačí, stejně jako u lékařských zákroků postačuje pro rozhodnutí ve jménu dítěte jeden zákonný zástupce. V praxi je často vyšetření nabízeno i poštovní formou, kde autenticita vzorků ani podpisů není již vůbec zaručena, a k etickým zásadám se tak nepřihlíží ani zbla. Následující tabulka (Tabulka 6) uvádí index paternity pro vyšetření dua dítě-žalovaný a zároveň předbíhá problematiku kapitoly 5.15 Příbuznost tím, že uvádí věrohodnostní poměr pro alternativní hypotézu příbuzného nařčeného. Tabulka 6: Hodnoty PI a LR pro kombinace DNA profilů dítěte a žalovaného
Dítě Žalovaný PI 1 A A
LR
pA
1 2 1 2 p A
1 2 pA
1 2 21 2 p A
AB AB
p A pB 4 p A pB
1 41 2 p A p B 2 p A pB
AB A
1 2 pA
1 2 21 2 p A
AB AC
1 4 pA
1 2 41 2 p A
A
AB
5.2 Nedostupnost žalovaného Otcovství je možno určit i tehdy, pokud vzorek žalovaného není dostupný (anglicky se takový případ nazývá deficiency case). Jedná se o případy, kdy zemřelý žalovaný byl pohřben bez toho, aby byl odebrán jeho biologický vzorek pro izolaci DNA, nebo o případy, kdy žalovaný pobývá na neznámém místě (bezdomovec na ulici, narkoman měnící skvoty nebo žalovaný v zahraničí, kdy součinnost zahraničních soudů je v civilním případě málo účinná). Pokud je k testování dostupný jen příbuzný žalovaného, figuruje v čitateli LR pravděpodobnost DNA profilů za předpokladu, že otcem je specifikovaný biologický příbuzný vyšetřovaného, a ve jmenovateli pravděpodobnost DNA profilů za předpokladu otcovství neznámého nepříbuzného muže. Pokud je příbuzným žalovaného jeho bratr, říká se věrohodnostnímu poměru avunkulární (strýcovský) index (občas se v literatuře označuje jako AI) a lze jej odvodit z obecného vzorce pro příbuzné žalovaného: LR´ k1 k0 k 2 k1 LR , kde k0, k1, k2 jsou Cottermanovy příbuzenské koeficienty: P(žádná ze dvou alel na lokusu osoby X není shodná původem s alelami na tomto lokusu u osoby Y) 2k1 = P(první nebo druhá ze dvou alel na lokusu osoby X je shodná původem s jednou alelou na lokusu osoby Y) k2 = P(obě alely na lokusu osoby X jsou identické původem s alelami na lokusu osoby Y). k0 =
13
V poslední době také poučení soudci usnesením žádají po znalci vyšetření jen žalovaného a dítěte, a tím soudu šetří náklady. Nicméně vyšetření matky může být nápomocné v případech, kdy žalovaný je otcem a zároveň došlo k nějaké genetické mimořádnosti.
46
Shodnost původem (anglicky identity by descent) znamená, že alela se do genotypů dvou osob dostala od stejného společného předka (Tabulka 7). Tabulka 7: Hodnoty koeficientů příbuznosti k a θ
Příbuzenský vztah
k0
2k1
k2
Rodič-dítě Úplní sourozenci Poloviční („nevlastní“) sourozenci Prarodič-vnuk Strýc/Teta-neteř/synovec Bratranci/Sestřenice 1.řádu Bratranci/Sestřenice 2.řádu
0 1/4 1/2
1 1/2 1/2
0 1/4 0
Koeficient příbuznosti θ = P(dvě alely na stejném lokusu, jedna u osoby X a jedna u osoby Y, jsou identické původem) = (k1+k2)/2 1/4 1/4 1/8
1/2 1/2 3/4 15/16
1/2 1/2 1/4 1/16
0 0 0 0
1/8 1/8 1/16 1/64
Dosazením do vzorce pro LR´ dostaneme
k2+k1=2θ
LR´ 1 2 2 LR a dosazením hodnoty θ = 0,25 pro dva bratry dostaneme LR 1 LR´ 2 (Fung, 2008). Platnost tohoto vzorce vyžaduje absenci inbreedingu. Otestovat hypotézu otcovství bratra žalovaného vůči hypotéze neznámého muže a hypotéze s mutacemi ve spermii žalovaného má smysl i tehdy, pokud to v daném případě je biologicky validní hypotéza a zároveň jsou neshody mezi alelami biologického otce a žalovaného jen v omezeném počtu lokusů. Otcovství je možno určit i tehdy, pokud žalovaný nemá bratra ani rodiče, ale je znám DNA profil dalšího jeho prokázaně biologického dítěte. Jedná se pak prakticky o hypotézu, že děti jsou úplní sourozenci ve srovnání s hypotézou, že děti jsou poloviční sourozenci, a to pokud je matka jedna a táž (viz 5.13 Vícedětnost), případně o hypotézu, že děti jsou poloviční sourozenci ve srovnání s hypotézou, že děti nejsou vůbec sourozenci, a to pokud jsou matky různé.
5.3 Neznámí rodiče, pohřešované osoby Existují forenzní situace, kdy nejen biologický otec, ale zároveň i biologická matka jsou neznámí. Může jít například o krádež dítěte, záměnu dětí v porodnici, identifikaci biologické stopy srovnáním s rodiči pohřešovaného. Při přiřazení rodičů k dítěti (reverse parentage) se jedná o dvě hypotézy: žalovaný pár jsou biologičtí rodiče anebo jiný pár jsou biologičtí rodiče. Věrohodnostní poměry jsou uvedeny níže (Tabulka 8).
47
Tabulka 8: Věrohodnostní poměr pro rodičovství k dítěti
Dítě Možný první rodič AA AA
Možný druhý rodič AA
AA
AA
AB
AA
AB
AB
AA
AB
AC
AB
AA
AB
AB
AA
BC
AB
AB
AB
AB
AB
AC
AB
BB
AA
AB
BC
AC
AB
BD
AC
LR
1 p A2 1 2 p A2 1 4 p A2 1 4 p A2 1 4 p A pB 1 4 p A pB 1 4 p A pB 1 8 p A pB 1 2 p A pB 1 8 p A pB 1 8 p A pB
K těmto věrohodnostním poměrům lze dojít i dvoukrokově (viz http://dnaview.com/ideas/ChildBody.htm): vypočítáme index paternity pro trio matka-dítě-žalovaný stejným způsobem, jako-by šlo o klasickou paternitu, a vynásobíme jej indexem maternity (pravděpodobnost DNA profilů za předpokladu, že žena je matkou dítěte děleno pravděpodobností DNA profilů za předpokladu, že matkou je neznámá žena). U tohoto typu případů je vždy nutno zvlášť pečlivě uvážit, zda neexistují i další relevantní hypotézy – například, že došlo k záměně dětí, přičemž ale biologickým otcem dítěte nebyl manžel biologické matky dítěte, ale nám neznámý nepříbuzný muž.
5.4 Směs profilů Lze si představit situaci, že vyšetření otcovství je komplikováno směsným profilem matky a dítěte (například vyšetření vzorku placenty po abortu následujícím znásilnění nebo vyšetření otcovství z cirkulující DNA v matčině krvi před narozením dítěte) a metoda separace pomocí Laser Capture Microdissection (LCM) je nepoužitelná. Přestože se tím dostáváme do výsostné oblasti forenzních stop, které častěji dávají směsný profil než profil čistý, popíši postup pro tyto případy i zde (viz http://dna-view.com/placental.htm). Samozřejmě lze věrohodnostní poměr odvodit rodokmenovou metodou: u tria M-D-Ž: ABABC-CD v čitateli máme P(AB)×P(CD) ×P(směs za předpokladu mateřství AB a otcovství 48
CD) = 2×pA×pB×2×pC×pD×1×1/2 a ve jmenovateli P(AB)×P(CD)×P(směs za předpokladu mateřství AB a otcovství náhodné spermie) 2×pA×pB×2×pC×pD×1×pC, což po vykrácení dá 1/2pC , stejně jako u tria AB-BC-CD. Pojďme si však ještě ukázat matematický způsob řešení problému převedením na situaci, jejichž řešení je nám známé (hasič-matematik u nehořící stodoly vytáhne sirky a už je na koni). Případ vyšetření matka-směs-žalovaný převedeme na standardní trio matka-dítěžalovaný při použití dvou zásad: Pokud jsou ve směsi maximálně dvě alely, považujeme pro potřeby výpočtu tyto dvě alely za alely dítěte a počítáme jako při standardní paternitě. Pokud jsou ve směsi tři alely, tak pro dítě započteme nemateřskou alelu jako otcovskou a kteroukoliv z potenciálně mateřských alel jako mateřskou a počítáme jako při standardní paternitě (Tabulka 9). Tabulka 9: Věrohodnostní poměr pro směsný profil matky s dítětem
Matka AA
Směs AA
AA
AA
AA
AB
AA
AB
AA
AB
AB
ABC
AB
ABC
AB
ABC
AB
ABC
Žalovaný LR AA 1 pA AB 1 2 pA AB 1 2 pB BB 1 pB BC 1 2 pB BC 1 2 pC AC 1 2 pC CD 1 2 pC CC 1 pC
Další reálnou situací popsanou v literatuře je stav, kdy je k dispozici směsný profil matky a žalovaného, profil matky a profil dítěte (Liao, 2002). Případ je z Číny, směsný profil byl z vaginálního tampónu (Tabulka 10).
49
Tabulka 10: Věrohodnostní poměr pro směsný profil matky a žalovaného
Matka Směs AA AA AA
AB
AA
AB
AA
ABC
AB
AB
AB
AB
Dítě LR AA 1 pA AB p A pB p B 2 p A p B AA 1 2 pA AB 1 2 pB AB 1 p A pB AA p A pB
AB
ABC
AA
AB
ABC
BB
AB
ABC
AB
AB
ABC
AC
AB
ABCD AC
p A 2 p B p A 1 2 pA 1 2 pB 1 2 p A p B
p A p B pC pC 2 p B 2 p A pC 1 2 pC
5.5 Mutace Mutace je náhlá změna v sekvenci nukleotidů, způsobená chybou při replikaci během meiózy nebo replikace, účinkem záření, virů, transpozonů, mutagenů nebo mechanismem hypermutace. Vyšetření otcovství se týkají především mutace v germinální linii, ale není dobré zapomínat ani na případ somatické mutace u nádorů. Pokud je nesrovnalost mezi alelou biologického otce jen u malého množství lokusů, lze výsledek vyšetření vysvětlit nejen otcovstvím alternativního muže, ale také tím, že ve spermii žalovaného muže došlo k mutaci (Obrázek 11). Jak se s tím vypořádáme při výpočtu LR? Pro trio matka AA, dítě AD, žalovaného BC se paternitní index se započtením mutace rovná přibližně pat Cpat D PI B D 2 pD a pro trio matka AB, dítě AC, žalovaný AA pat mat Bmat C A C PI AC (Buckleton, 2005). pC
50
Obrázek 11: Rodokmen 4, žalovaný nenese alelu biologického otce
AABB (American Association of Blood Banks) doporučuje také používat vzorec PI
(kde pravděpodobnost vyloučení PE není případová, ale průměrná). Brenner ve PE svém krokovém modelu postuluje, že záleží kromě frekvence mutací µ (Tabulka 11) také na počtu jednorepeticových kroků „s“ a směru mutace (navýšení nebo zkrácení počtu repetic), přičemž mutace o jednu repetici je řádově (například desetkrát) pravděpodobnější než mutace o dvě repetice. Odpovídá to představě přeskakujícího řetězu kola, kdy přeskok o více zubů je méně pravděpodobný. Tabulka 11: Frekvence mutací u populárních autozomálních lokusů (http://www.cstl.nist.gov/strbase/mutation.htm)
STR lokus CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 D21S11 Penta D Penta E D2S1338 D19S433 SE33 (ACTBP2)
Frekvence mutací 0,16% 0,28% 0,01% 0,01% 0,17% 0,12% 0,11% 0,10% 0,14% 0,14% 0,11% 0,22% 0,19% 0,14% 0,16% 0,12% 0,11% 0,64%
Pokud se v našem případu D liší od C o jednu repetici směrem dolů (C je o jednu repetici kratší než D), tak čitatel věrohodnostního poměru musí kumulativně postihnout pravděpodobnost všech jevů, které by teoreticky k danému rodokmenu vedly:
51
X = P(AB)×P(DF)×0,5×P(D přeneseno)×P(mutace)×P(směru mutace)×P(mutace o s repetic)= =2pApB×2pDpF×0,5×0,5×m×0,5×(1/10)s-1 , Y = 2pApB×2pDpF×0,5×pC . Pro jednokrokovou mutaci s=1 a 2p p × 2p D p F × 0,5 × 0,5 × m × 0,5 × (1/10) 0 . PI A B 2p A p B × 2p D p F × 0,5 × p C 4 pC Pro dvoukrokovou mutaci s = 2 a PI
. 40 pC Tento dílčí paternitní index (který je menší než jedna) se násobí ostatními dílčími paternitními indexy (které jsme vypočetli pro další lokusy), aby společně poskytly celkový paternitní index. Mutačních modelů je však více: uniformní, proporcionální, klesající, krokový (Dawid, 2001)a žádný není prokázaně optimální. Navíc je známo, že: frekvence mutací je vyšší u mužských spermií než u ženských vajíček (dáno rozdílem ve spermatogenezi a oogenezi, kdy se spermatogonie mitoticky dělí před samotnou meiózou, zatímco primární oocyty vzniklé ještě ve stadiu plodu zůstávají v diplotene první meiotické profáze, dokud nedojde k ovulaci), starší rodiče mají více gametických mutací, delší mikrosatelitové alely se spíše zkracují a kratší spíše prodlužují, předpoklad nezávislosti u více mutací v jediné gametě nemusí odpovídat skutečnosti, protože defekt v mechanismech opravujících DNA nebo efekt výbuchu jaderné elektrárny se může projevit na více místech genomu (Ilnytskyy, 2011), ale náš mutační model nemusí být všepokrývající. Pro mutační model platí totéž, co u všech výpočtů – pokud postačuje k natolik přesnému odrazu skutečnosti, že se nedopouštíme jeho použitím závažné chyby, tak je pro naše účely dostačující. Samozřejmě jej v posudku musíme dostatečně dokumentovat – nejistota musí být referována. Nalhávání si do vlastní kapsy ohledně jistoty je kovbojský přístup, který může být úspěšný jen po omezenou dobu, či by alespoň měl být….
5.6 Tři alely na lokusu Příčinou přítomnosti tří alel na lokusu (pokud pomineme kontaminaci a stochastický efekt, častěji sledovatelný u degradovaných nebo nedostatečných vzorků) může být somatická mutace, trisomie a translokace. Somatická mutace v zárodečných buňkách může způsobit mozaicismus se třemi alelami (Rolf, 2002). Pokud je část spermií mutovaná, lze dle výšky píků ze směsi mutovaných a standardních spermií usuzovat na jejich podíl. Pak u tria matka DD, dítě AD, žalovaný ABC je q PI A , pA kde qA je frakce spermií s alelou A. Pokud hodnotu qA nemůžeme zjistit přímo, pomůžeme si literárně uváděnou hodnotou (Clayton, 2004). Pokud všechny tři alely ABC na jediném lokusu žalovaného vykazují stejnou výšku píku, můžeme podezřívat translokaci nebo trisomii. Trisomii můžeme potvrdit cytogenetickými metodami. Translokací mohou vzniknout na stejném chromozomu dvě stejné nebo dvě různé alely daného lokusu. Pokud se jedná o stejné kopie, tak dvakrát zvýší pík na elektroforeogramu. Pokud jsou translokované alely (stejné i různé) na chromozomu blízko sebe (jsou v silné vazbě), můžeme s nimi počítat jako s jedinou vzácnou alelou.
52
Pokud u tria matka DD, dítě ABD, žalovaný ABC vyloučíme trisomii, podezříváme lokus žalovaného z translokace. Pokud zároveň z otcovství žalovaného vůči jiným dětem víme, že alely AB jsou na stejném chromozomu, tak čitatel indexu paternity M PGC GAF , GM , H P M , 2 kde MM je pravděpodobnost přenesení mateřské alely na dítě u dané dvojice matka-dítě (mendelovský segregační faktor, u matčina genotypu DD je roven jedné). Pokud nevíme, zda AB jsou na stejném chromozomu, musíme započíst možnosti, že AC nebo BC jsou na stejném chromozomu. V tom případě je M PGC GAF , GM , H P M , 6 protože může existovat šest rozdílných spermií (AB, C, AC, B, BC, A) (Buckleton, 2005).
5.7 Chimérismus, mozaicismus Chimérismus vzniká splynutím genetických individuí - genet(Yunis, 2007). Příkladem plného chimérismu je splynutí dvojčat ve stádiu zygoty, kdy různé části těla narozeného dítěte mají různý DNA profil. Jmenovitým příkladem je Angličanka Karen Keegan, u které byl chimérismus odhalen při hledání dárce ledviny v okruhu rodiny, nebo Američanka Lydia Fairchild, jejíž dítě při vyšetření paternity neslo všechny alely žalovaného, ale neneslo některé znaky matky. Její mateřství bylo zpochybněno a málem přišla o své děti. K částečnému chimérismu (mikrochimérismu) dochází výměnou buněk mezi matkou a plodem během těhotenství a po transplantaci. Buňky alotransplantátu (štěpu z geneticky odlišného lidského jedince14) jsou detekovány nejenom v transplantovaném orgánu, ale i v dalších orgánech, do kterých se dostanou jeho buňky. Při transplantaci kostní dřeně je situace vyhraněná – původní (nemocná) kostní dřeň příjemce je nejprve vymýcena ozářením nebo chemoterapií a potom úspěšnou transplantací úplně nahrazena kostní dření dárce. V krvi je potom trvale detekovatelný profil dárce, v bukálním stěru směs profilů (díky přítomnosti leukocytů) a v biopsiích může být původní DNA profil. Teoreticky může dojít k dočasnému chimérizmu i po transfúzi. Šance je minimální, protože krev je již dnes před podáním transfúze separována (bílé krvinky jsou odstraněny a zůstávají jen bezjaderné červené krvinky nebo plazma). Se zvyšováním analytické citlivosti metod se otevírá možnost detekce přenosu volné, cirkulující DNA. Proto jako prevenci opakování vyšetření při odběru biologického vzorku osoby vyzpovídáme, zda v posledních týdnech transfúzi nedostali a zda jim nebyl v minulosti transplantován štěp. Pokud se tak stalo, zapíšeme to do protokolu a v případě smíšeného profilu budeme znát pravděpodobnou příčinu. Zmíněné vyzpovídání by nám také mělo zaručit, že případný dočasně přítomný cizí biologický materiál v ústech odebírané osoby se přinejmenším naředí, ne-li polkne (Martinez-Gonzalez, 2007). O důležitosti preanalytické fáze může svědčit případ z roku 1992. Dr. John Schneeberger je běloch, který se narodil v Zambii, studoval v Jihoafrické republice a lékařskou praxi měl v Kanadě (http://pysih.com/2010/10/05/john-schneeberger/). V kanadském Saskatchewanu silným anestetikem (Versed) zdrogoval svou pacientku a posléze ji znásilnil. Oběť si přes silné amnestické účinky drogy průběh znásilnění pamatovala a nahlásila je na policii. Opakovaným testem DNA z násilníkovy krve pro srovnání s DNA profilem ze spermií na 14
Na rozdíl od autotransplantátu, kdy je štěp odebrán z těla příjemce a posléze do těla příjemce vrácen, a xenotransplantátu, kdy štěp pochází z jiného živočišného druhu.
53
kalhotkách a z poševního výtěru byl dr.Schneeberger vyloučen, proto byl případ v roce 1994 uzavřen. Nicméně znásilněná dívka si byla jistá. Najala si detektiva, který získal použitou tyčinku jeleního loje z auta Dr. Schneebergera. DNA profil tohoto vzorku se shodoval s profilem spermií, proto byl proveden třetí oficiální test. Tento test však neposkytl vyhodnotitelný výsledek. Zvrat v případu nastal v roce 1997, kdy lékařova manželka Lisa Schneeberger zjistila, že její manžel opakovaně zdrogoval a znásilnil její 15-ti letou dceru z prvního manželství. Po nahlášení na policii byly odebrány vzorky lékařovy krve, výtěru ústní dutiny a vlasové cibulky. DNA profily všech tří typů vzorků se shodovaly se vzorky spermií z původního znásilnění. Během soudního přelíčení v roce 1999 Schneeberger na sebe vyzradil, že si vždy před odběrem krve do ramene implantoval 15 cm drén (typ Penrose), naplněný krví jiného muže a protisrážlivou látkou. Sestřičku pak zmanipuloval tak, aby jehlu vpíchla přímo do drénu (tvrdil, že má vzácnou nemoc, při které může umřít při odběru krve z prstu). Nakonec si ve vězení odseděl jen 4 roky (sic!), byl rozveden, zbaven lékařského oprávnění a vyhoštěn z Kanady. Tento případ byl extrémní, ale skutečný. Častější asi budou případy chimerických vzorků s biologickou příčinou. Pokud ve vyšetřovaném rodokmenu existuje podezření na chimérismus, ptáme se na dvojče matky a žalovaného (i nenarozené). Ze záznamu výsledků zobrazovacích metod lze někdy vypozorovat, že dvojče v průběhu těhotenství vymizelo. Případné vyšetření více druhů tkání dítěte může tento typ mozaicismu odhalit. Při uvažování o dvojčeti myslíme i na jev heteropaternální superfekundace, kdy dvojvaječná dvojčata mají rozdílné otce. S příchodem technik in vitro fertilizace může k takové situaci dojít pouhým pipetovacím omylem laborantky, což může být manifestováno například jako černošské dítě bělošských rodičů, viz http://www.newscientist.com/article/dn2512-white-ivf-couple-haveblack-twins.html). Mozaicismus vzniká postzygotickou mutací buď v zárodečných buňkách (germinální mozaicizmus) anebo v somatických buňkách (somatický mozaicizmus). Analyzuje se jako mutace a je mu proto věnováno více místa v kapitole věnované mutacím. Zbývá jen připomenout, že inaktivace jednoho ze dvou X chromozomů ženy (lyonizace) je fenotypovým mozaicismem a přítomnost směsných profilů mitochondriální DNA (heteroplazmie) je příkladem somatického mozaicismu.
5.8 Jednovaječnost Přestože teoreticky existuje možnost rozlišení jednovaječných dvojčat na genetické úrovni, v praxi toho ještě nebylo dosaženo a genetické omezení při identifikaci jednoho z jednovaječných dvojčat se promítá i do omezení při určování příbuznosti. Pokud jsou dva muži jednovaječní (monozygotní) bratři a dvě ženy jednovaječné sestry a spárují se, jejich děti jsou geneticky nejen bratranci a sestřenice, ale také bratři a sestry, a nelze genetickým vyšetřením zjistit, komu které dítě patří. Pokud je žalovaný muž jednovaječným vícerčetem v paternitním nebo forenzním případu, není na současné úrovni znalostí geneticky zjistitelné, zda je biologickým otcem on nebo jeho vícerče. Pokud však genetickými metodami zúžíme množství podezřelých na jednovaječné sourozence, pořád nám zbývají tradiční vyšetřovatelské metody (zjištění motivu, časové snímky, techniky výslechu) k finální identifikaci.
5.9 Uniparentální disomie Při uniparentální disomii jsou dítěti předány obě alely jednoho rodiče a žádná alela druhého rodiče. Dochází k tomu mechanismem nondisjunkce u jednotlivých chromozomů. Na takto počatém dítěti může být zjevné postižení ve formě lékařsky definovaných syndromů (pokud se naruší imprinting) nebo může být dítě nepostiženo. Ve forenzní oblasti již vedla unimaternální disomie v jednom případu ke zdánlivému vyloučení biologického otce 54
(Bein, 1998); podezření na obdobný případ bychom měli získat při jednotlivé mutaci, neodpovídající žádnému z mutačních modelů.
5.10 Vzácná alela Pokud se alela neobjevuje v naší populační databázi, ale zjistili jsme ji při profilování v rámci našeho případu, vypořádávají se s tím laboratoře rozdílným způsobem(Hallenberg, 2002). Přestože nejpřesnější by bylo použít Bayesovskou aposteriorní metodu výpočtu frekvence vzácné alely (Curran, 2002) nebo odvodit frekvenci vzácné alely z frekvence singletonů – případů alel s jediným výskytem (Brenner, 2010), ISFG doporučuje z praktických důvodů použít obecný vzorec pro výpočet databázových frekvencí xi 1 , N 1 kde xi je počet alel i v databázi a N je celkový počet alel v databázi(Gjertson, 2007). Při xi = 0 nabývá frekvence vzácné alely hodnotu 1 15 . N 1
5.11 Nulová alela Další komplikací může být nulová (tichá) alela. Je to alela, která není detekovatelná užitou typizační metodou. Důvodem může být, že u lokusu je kromě délkového polymorfismu (daného počtem repetic) přítomen v místě vazby 3´ konce primeru polymorfismus bodový, což vede k odlučování 3´ konce primeru od matrice, v důsledku čehož polymeráza nemůže zahájit elongaci řetězce, a tedy se nenastartuje exponenciální nárůst amplikonu v PCR. Podezření na nulovou alelu máme u klasického paternitního tria tehdy, když žalovaný a dítě jsou rozdílní homozygoti (Obrázek 12)16. Pak u tria matka AB, dítě B, žalovaný C nabývá paternitní index se započtením možnosti mutace hodnoty pat o 2 pC Cpat B C , PI 2 pC 2o o pB kde o je frekvence nulové alely(Buckleton, 2005). Nulová alela může změnit vzorec pro výpočet LR ve více konstelacích DNA profilů (Tabulka 12).
15
Americký National Research Council doporučoval hodnotu
5 (Committee on DNA Forensic 2N
Science: An Update, 1996). 16 Vzhledem k nejistotě metod bychom DNA profil měli nazývat fenotypem a nikoli genotypem až do té doby, než je přítomnost druhé shodné alely na lokusu potvrzena rodinnou studií. Správný zápis je proto následující: žalovaný A, dítě B (a ne AA, BB).
55
Obrázek 12: Rodokmen s podezřením na nulovou alelu
56
Tabulka 12: Výpočet LR při započtení nulové alely (http://dna-view.com/patform.htm)
Matka AB A
Dítě B B
Žalovaný
Likelihood ratio
B
1 pB o
B
pB o p B p B 2o
A nebo AC
AB
B
B
B
B
AB
B
BC (nebo AB)
B
B
BC
AB
AB
B
AB
B
C
B
B
C
pB o p B p B 2o 1 o3 pB o p B o p B 3o 1 2 p B o 1 o2 2 p B o p B 2o pB o p B 2o p A p B o p B o pC 2o o p B o pC 2o op B pC 2o pB o
B
o o1 p B 2o 1 pB p B 2o
B
pB o 2 p B p B 2o
netestována netestována
B AB
netestována
B
BC
netestována
B
C
pB o 2 p B p B 2o o p B 2o pC 2o
57
Před samotným započtením nulové alely při hodnocení výsledků analýzy je ovšem nanejvýš vhodné pokusit se jev „nulová alela“ jako takový odstranit a vyhnout se tak numerickému řešení, a to užitím jiného primerového páru pro stejný marker. Odpovídá to obecnému pravidlu, že je lépe mít konkrétní data než početní odvozeniny, že je lépe se jednou setkat tváří v tvář než týdny tlachat na Facebooku.
5.12 Vazba S fenoménem vazby se při vyšetření příbuznosti setkáváme například při použití genotypizace HLA genů na šestém chromozomu nebo STR markerů na chromozomu X. Vazbu není třeba při sledování příbuznosti uvažovat, pokud se jedná jen o jednu meiózu, protože se ve srovnání s případem bez vazby nemění mendelovský segregační faktor pro matku a žalovaného. Ukážeme si to na příkladu: mějme lokusy A a B ve vazbě u klasického paternitního tria s genotypy matky A3A4B3B4, dítěte A1A3B1B3, žalovaného A1A2B1B2, rekombinační frakci u žen RF a u mužů RM. Neznáme fázi u matky (neznáme, které dvojice alel na dvou lokusech jsou přítomny u matky na kterém chromozomu). Odvoďme si mendelovský faktor pro matku. Pro přenos A3B3 z matky na dítě musí dojít k jedné ze dvou možností. 1) matka má fázi A3B3/ A4B4, nedošlo k rekombinaci, byl vybrán chromozom A3B3; nebo 2) matka má fázi A3B4/A4B3, došlo k rekombinaci, byl vybrán ten správný chromozom ze dvou 1 1 1 1 1 rekombinovaných. Jedná se o pravděpodobnost 1 RF RF , což je hodnota 2 2 2 2 4 stejná jako bychom s vazbou vůbec nepočítali. Vazbu nemusíme uvažovat ani u vyšetření dua dítě-žalovaný, kde jde také jen o jednu meiózu. Vazbu však musíme při výpočtu LR uvažovat, pokud je meióz více. Mějme rodokmen s matkou M1, dítětem žalovaného C1, matkou M2, sporným dítětem C2 a žalovaným AF (Obrázek 13). Hypotéza obžaloby Hp je, že AF je otcem C2; hypotéza obhajoby Hd, že neznámý nepříbuzný muž je otcem C2. Obrázek 13: Rodokmen s více meiózami stejného chromozomu (Buckleton, 2005)
Chromozom každé z matek prodělal jen jednu meiózu, takže mendelovský segregační faktor je shodný jako v případě bez vazby. Chromozom žalovaného, pokud je dvojitým otcem, prodělal v tomto rodokmenu více než jednu meiózu, proto efekt vazby musíme započíst. Nazvěme P1AF fázi A1B1 a P2AF fázi A1B2. PC1, C 2 M 1, M 2, AF , H p
P C1, C 2 M 1, M 2, AF , P1AF , H p P P1AF P C1, C 2 M 1, M 2, AF , P2AF , H p P P2AF
58
Pokud P1AF = P2AF =1/2, tak
PC1, C 2 M 1, M 2, AF , H p
P C1, C 2 M 1, M 2, AF , P1AF , H p P C1, C 2 M 1, M 2, AF , P2AF , H p
,
2
při započtení vazby
P C1, C 2 M 1, M 2, AF , H p 1 1 R M 1 1 R M 1 R M 1 R M 2 2 4 2 4 2 4 2 4 2 1 R M R M 2 32
Pokud RM=1/2 (lokusy nejsou ve vazbě), tak
.
1 0,015625 . 64 Pokud RM =0,016 (vzdálenost 25 centiMorganů, lokusy CSF1PO a D5S818), tak 2 2 2 1 RM RM2 1 0,016 0,016 P C1, C 2 M 1, M 2, AF , H p 0,021 , 32 32 což je nezanedbatelný efekt. V paternitní praxi se s vazbou počítá převážně při vyšetření STR markerů na chromozomu X. Můžeme si chromozom X rozdělit na čtyři nezávislé vazebné skupiny DXS10135–DXS8378, DXS7132–DXS10074, HPRTB-DXS10101, DXS10134–DXS7423, anebo vazbu započítat pomocí hodnot rekombinačních frakcí(Krawczak, 2007): P C1, C 2 M 1, M 2, AF , H p
Tabulka 13: Rekombinační frakce na chromozomu X
Rekombinační frakce17 s předchozím markerem (R) DXS10135 DXS8378 DXS7132 DXS10074 HPRTB DXS10101 DXS10134 DXS7423
0,0020 0,3358 0,0176 0,3681 0,0002 0,1357 0,0018
Existují situace, kdy nám autozomální markery bez vazby nepřinesou potřebnou informaci (Egeland, 2008; Pinto, 2011a). Typickým příkladem je rozlišení hypotézy dědeček-vnučka od polovičních sourozenců a strýce-neteře (Obrázek 14).
17
Rekombinační frakce 0,01; 1 rekombinace na 100 meióz (přibližně 1 centiMorgan, cM) odpovídá fyzické vzdálenosti 1Mb. 59
Obrázek 14: Tři rodokmeny, u kterých využijeme lokusy ve vazbě
Jak si však poradit, pokud chceme v komplikovaném rodokmenu využít vyšetření STR na chromozomu X, nechceme se ztratit při ručním odvozování vzorce pro LR a zároveň se nechceme prokousávat programem MLINK (http://linkage.rockefeller.edu/soft/linkage/sec3.3.html) nebo bayesovskými sítěmi (Hatsch, 2007)? Můžeme použít několik únikových postupů: počítáme s haplotypy na chromozomu X stejným způsobem jako s haplotypy na chromozomu Y (nevýhoda - frekvence haplotypů je neznámá, takže při jejím odvození se konzervativně zvýší jmenovatel věrohodnostního poměru a část síly důkazu pro první hypotézu se ztrácí) vybereme si z genů ve vazbě ten, kde se vyskytla v našem rodokmenu nejvzácnější alela a výpočet provedeme jen pro tento jediný marker (nevýhoda – ztrácí se informace nesená alelami nezapočítaných genů ve vazbě a tím část síly důkazu pro první hypotézu) vypočteme LR jako bez vazby a za každou vazbu započítáme korekční faktor (nevýhoda – pokud korekční faktor nevypočteme správným způsobem a korekci provedeme konzervativně, tak můžeme přijít o veškerou informaci z vazebných lokusů. Odpovídající způsob výpočtu korekce je stejně početně náročný, jako započtení rekombinační frakce, takže si nepomůžeme). Zbývá připomenout, že genetická vazba je asociace dvou nebo více lokusů, které jsou vedle sebe na chromozomu tak blízko, že je mezi nimi omezena rekombinace. Oproti tomu vazebná nebo gametická nerovnováha (LD podle linkage disequilibrium) je odchylka od náhodného párování alel dvou nebo více lokusů v gametách, ať už na jednom nebo na více chromozomech. LD měří rozdíl mezi frekvencí haplotypu a součinem frekvencí jednotlivých alel na lokusech a je ovlivněna nejen vazbou, ale také selekcí, frekvencí mutací, driftu, asortativního páření a struktury populace. Vazba a vazebná rovnováha se často plete, proto prof.Max Baur razí od šedesátých let minulého století pro vazebnou nerovnováhu název „alelická asociace“. Přestože alelická asociace mezi forenzními markery existuje (například mezi alelami na STR lokusech na chromozomu X)(Tillmar, 2008)a může být kladná (LR snižující) i záporná (LR zvyšující), ve výpočtech ji prozatím opomíjíme, protože její rozsah nebývá velký a není dostupný žádný uživatelsky přívětivý softwarový nástroj.
5.13 Vícedětnost V imigračních a testamentových případech se můžeme setkat s hypotézami: Žalovaný je otcem všech dětí Jiný neznámý muž je otcem všech dětí. Mějme případ se dvěma dětmi, matku CD, první dítě AC, druhé dítě AB, žalovaného AB. Paternitní index je pak roven 60
PI
1 (Buckleton, 2005). 2 p A 1 p A
Dalším relativně častým testamentovým případem je hypotéza polovičního sourozenectví versus nepříbuznosti při profilování dvou osob (Tabulka 14). Tabulka 14: LR v případě sporu o dědičství po zemřelém muži (Brenner, 1997)
První osoba
Druhá osoba
AA
AA
AA
AB
AA
BB
AA
BC
AB
AB
AB
AC
AB
CD
Likelihood ratio při H1: poloviční sourozenectví a H2: nepříbuznost 1 1 2 2 pA 1 1 2 4 pA 1 2 1 2 1 1 1 2 8 p A 8 pB 1 1 2 8 pA 1 2
Případy s více dětmi a závětí mohou být hodně zajímavé a hodně komplikované (Drabek, 2002a), ale bývají natolik specifické, že je jednodušší použít software než vyčíslovat hodnoty LR do tabulek pro veškeré situace, které mohou nastat. Samozřejmě je také možné si LR pro konkrétní případ odvodit s tužkou a papírem způsobem ukázaným výše (což je kratochvíle hodná dlouhých zimních večerů století páry).
5.14 Subpopulace Pokud nejsou splněny podmínky HWE tím, že je populace stratifikovaná (je rozdělena na subpopulace), může být pravděpodobnost výskytu otcovské alely u alternativního otce ve stejné subpopulaci ovlivněna genotypy matky a žalovaného a věrohodnostní poměr pro otcovství žalovaného je tím snížen. Subpopulační efekt proto vyžaduje v trestních paternitních případech korekci PI. Korekce se provádí vnesením koeficientu inbreedingu théta, θ (také psáno jako FST) do vzorce pro PI (Tabulka 15). Théta18 je parametr vyjadřující, s jakou pravděpodobností jsou dvě alely ve dvou osobách náležící do stejné subpopulace identické původem19. Popisuje navýšení příbuznosti v subpopulaci ve srovnání s celou populací. 18
Definic théta je několik. Zmiňme si ještě jednu: měřítko genetické vzdálenosti mezi subpopulacemi, které se odlišily driftem. 19 Identitu původem, Identity by Descent (IBD), kdy alelu lze přes několik málo generací dosledovat ke společnému předkovi (jedná se o kopii stejné ancestrální alely), rozlišujeme od identity stavem, Identity by State (IBS), kdy stejná alela nemusí pocházet ze stejného rodokmenu. Pokud dojde k mutaci, tak dvě alely identické původem nemusí být identické stavem.
61
Dosahuje hodnot 0,005 (europoidní anglická populace) až 0,03 (asijská indopakistánská populace)(Buckleton, 2005). V civilních případech většinou tato korekce není nutná, a to ze dvou důvodů: jednak s výjimkou extrémních případů (velký rodokmen bez dostupného žalovaného, izolovaná subpopulace opuštěného ostrova s vysokým koeficientem inbreedingu) případná korekce nesnižuje PI natolik, aby to mohlo mít vliv na konečný verdikt soudu, jednak málokdy bývá opodstatněné uvažovat o subpopulaci. Je nutné myslet na to, že subpopulace se týká jmenovatele věrohodnostního poměru – biologického otce, pokud to není náš žalovaný. U klasického tria matka-dítě-žalovaný bereme v potaz, že jak matka, dítěte tak žalovaný muž mohou lhát, aby bránili své zájmy. Proto o subpopulaci mužů - potenciálních otců máme tak málo informací, že konzervativním postupem je použít populační frekvence z celkové české populace nebo z populace, do které náleží matka dítěte. Pokud jde například o prostorově omezenou romskou komunitu, ze které nemáme populační vzorek pro zjištění frekvencí jednotlivých alel, má použití koeficientu théta smysl. Stejně tak pokud česká žena uvádí, že byla znásilněna mužem vietnamského vzezření a my nemáme k dispozici populační vzorek českých Vietnamců pro zjištění frekvencí alel, můžeme použít vietnamské populační frekvence z jejich vlasti (nebo dokonce i celočeské frekvence) a subpopulační korekci. Podívejme se, jak se změní LR u klasického paternitního tria Matka: BB, Dítě: AB, Žalovaný: AA, pA=0,03 při započtení θ=0,1, když trio patří do stejné subpopulace: 1 1 LR 33,3 p A 0,03 se mění na: 1 3 1 0,3 1,3 5,7 2 1 p A 0,2 0,9 0,03 0,227 Korekce parametrem théta je rovněž nutná u domácích zvířat (například plemen psů), protože šlechtění se projevuje zvýšeným výskytem homozygotů (a s ním související inbrední depresí). Požadavky na forenzní vyšetření příbuznosti u zvířat se začínají přibližovat striktním forenzním požadavkům na testování lidské DNA, což se odráží ve třinácti doporučeních ISFG (Linacre, 2011), které byly formulovány ve spolupráci s International Society for Animal Genetics (ISAG). LR
Tabulka 15: Výpočet LR při subpopulaci
Matka
Dítě Žalovaný LR, když matka, žalovaný a LR, když jen žalovaný a biologický otec patří do biologický otec patří do stejné stejné subpopulace subpopulace
AA
AA AA
AA
AA AB
AA
AB AB
AA
AB BC
AB
AA AA
1 3 4 1 p A 1 3 23 1 p A 1 3 2 1 p B 1 3 2 1 p B 1 3 3 1 p A
1 2 1 p A 1 2 1 p A 1 2 1 p B 1 2 1 p B 1 2 1 p A
62
1 2 1 p A 1 2 1 p A 1 2 1 p A p B 1 2 1 p A p B 1 2 1 p A p B 1 2 1 p A 1 2 1 p A 1 2 1 p A 1 2 1 p B 1 2 1 p A 1 2 1 p A 1 2 1 p A
1 3 23 1 p A 1 3 22 1 p A 1 3 4 1 p A p B 1 3 4 1 p A p B 1 3 23 1 p A p B 1 3 2 1 p A 1 3 2 1 p A 1 3 2 1 p A 1 3 2 1 p B 1 3 2 1 p A 1 2 3 1 p A 1 2 22 1 p A 1 2 22 1 p A
1 p BI 2 1 p A p BI 1 p B p AI
netestováno AB AB
1 2 2 1 p A pB 4 1 p A 1 pB
1 p AI p BI 2 1 p A p BI p AI 1 p B
netestováno AB AC
1 2 4 1 p A
1 p BI 2 1 p A p BI 1 p B p AI
AB
AA AB
AB
AA AC
AB
AB AA
AB
AB AB
AB
AB AC
BB
AB AA
BC
AB AA
BC
AB AB
BC
AB AC
BD
AB AC
netestováno AA AA netestováno AA AB netestováno AB AA
5.15 Příbuznost Na hluboce evoluční úrovni jsou si všichni lidé příbuzní (každý z nás má 6,98 miliard příbuzných, viz http://www.prb.org/), ale důsledky pro určování otcovství má až příbuznost bližší. V předchozím odstavci byly zmíněny subpopulace jako částečný časově-geografický příbuzenský izolát. Existují však ještě užší, rodinné úrovně pokrevní příbuznosti, kdy koeficient théta dosahuje vyšších hodnot (Tabulka 7).
63
Příbuznost může u určování otcovství nabývat tří podob: 1) Žalovaný je nedostupný pro DNA profilování, ale lze otypovat jeho blízkého příbuzného, nejčastěji bratra (viz 5.2 Nedostupnost žalovaného). 2) Alternativní otec k žalovanému je jeho blízký příbuzný, nejčastěji bratr. 3) Ke zplození dítěte došlo mezi příbuznými (incest, konsagvinita) Ad 1) viz kapitola nedostupný žalovaný Ad 2) Pokud není alternativní hypotézou neznámý nepříbuzný muž z populace, ale bratr žalovaného, hodnota LR pro otcovství žalovaného se výrazně sníží, protože bratři sdílejí průměrně polovinu alel identických původem a více než polovinu alel identických stavem20 (Tabulka 16): P E Hp LR 2 LR . LRbratřr PE H d LR 1 LR 1 2 Hp – žalovaný je biologickým otcem dítěte Hd – bratr žalovaného je biologickým otcem dítěte
20
Bratři sdílejí průměrně více než polovinu alel identických stavem, přestože to na první pohled působí překvapivě. Polovinu alel by sdíleli pouze tehdy, pokud by rodiče byli heterozygoté bez shodných alel – AB a CD. Nedůvěřiví si mohou vytvořit tabulku, obdobnou Mendelově tabulce možných kombinací v F2 generaci, doplnit podíly shodných alel v jednotlivých dvojicích (0; 0,5; 1) a vypočítat průměr přes všechny kombinace bratrských genotypů. Pokud frekvence A, B, C, D nejsou rovny 25 %, tak musí být tento průměr vážený.
64
Tabulka 16: Index paternity při srovnání hypotéz žalovaný versus příbuzný žalovaného. Θ je příbuzenský koeficient mezi žalovanými (Evett, 1998).
Matka Dítě Žalovaný PI AA AA AA 2 AA AA AB 2 AA AB AB 2 AA AB BC 2 AB AA AA 2 AB AA AB 2 AB AA AC 2 AB AB AA 2 AB AB AB 2 AB AB AC 2 BB AB AA 2 BC AB AA 2 BC AB AB 2 BC AB AC 2 BD AB AC 2
1 1 2 p A 1 21 2 p A 1 21 2 p B 1 21 2 p B 1 1 2 p A 1 21 2 p B 1 21 2 p B 1 1 2 p A p B 1 1 2 p A p B 1 21 2 p A p B 1 1 2 p A 1 1 2 p A 1 21 2 p A 1 21 2 p A 1 21 2 p A
65
Tabulka 17: Hodnoty PI pro kombinace DNA profilů matky, dítěte a žalovaného za alternativní hypotézy otcovství bratra žalovaného v subpopulaci. Matka, žalovaní bratři i biologický otec patří do stejné subpopulace. Θ se zde vztahuje k subpopulaci, ne k vztahu bratr-bratr.
Matka Dítě Žalovaný PI AA AA AA 21 3 1 7 1 p A AA AA AB 21 3 1 9 21 p A AA AB AB 21 3 1 5 21 p B AA AB BC 21 3 1 5 21 p B AB AA AA 21 3 1 6 1 p A AB AA AB 21 3 1 7 21 p A AB AA AC 21 3 1 7 21 p A AB AB AA 21 3 1 7 1 p A p B AB AB AB 21 3 1 7 1 p A p B AB AB AC 21 3 1 9 21 p A p B B AB AA 21 3 1 5 1 p A BC AB AA 21 3 1 5 1 p A BC AB AB 21 3 1 5 21 p B BC AB AC 21 3 1 5 21 p B BD AB AC 21 3 1 5 21 p A Ad 3) Za inbreeding považujme omezení výběru partnerů pro sňatek na okruh příbuzných. Konsagvinita je vysoký stupeň inbreedingu mezi partnery a incest je extrémní případ. Současný český Zákon o rodině stanoví, že manželství nemůže být uzavřeno mezi sourozenci, mezi otcem a dcerou, matkou a synem nebo dědem a vnučkou (babičkou a vnukem). To by
66
odpovídalo protizákonnosti stupně inbreedingu, přesahujícího 1/16. 21 Kromě geografické dostupnosti a náboženství (Amišové nebo američtí habáni - Huterité) je příčinou inbreedingu společensko-ekonomický projev kultury - udržování majetku rodiny a zabezpečení věna nevěsty. V současné době úroveň manželských svazků bratranec-sestřenice dosahuje 0,6 % v západní Evropě, 3,9 % v Japonsku a až 50 % v muslimských zemích severní Afriky a Jižní Asie(Buckleton, 2005). Nízká frekvence letálních recesívních alel maskovaných heterozygotním stavem naznačuje, že během lidské historie docházelo k častému inbreedingu. Ostatně křesťanství omezilo neincestní konsagvinní manželské svazky až Trentským koncilem v šestnáctém století, zatímco další velká náboženství (buddhismus, konfucianismus, islám, hinduismus, judaismus) taková omezení nemají.22 Preferovaným muslimským svazkem je svatba bratrance se sestřenicí ze strany otce, zatímco hinduisté v jižní Indii preferují Koránem zakazovaný svazek strýc-neteř anebo spojení bratranec-sestřenice ze strany matky. Imigranti do Evropy si většinou zachovávají tradiční kulturní normy i po přestěhování a inbreeding může být ještě zesílen omezenou velikostí jejich komunity, proto zde vždy musíme započítat koeficent théta, zmíněný v předchozí kapitole. Věrohodnostní poměr v paternitním triu, kde jednou z hypotéz je, že muž je dítěti otcem i dědečkem, je stejný jako u klasického tria matka-dítě-žalovaný, pokud lze určit mateřskou alelu u dítěte. Pokud jsou matka i dítě shodní heterozygoti, incestní věrohodnostní poměr se snižuje ve srovnání s klasickým triem a matka s dcerou mají 25% pravděpodobnost, že mají obě alely identické původem (Balding, 2005). Stejný efekt můžeme pozorovat u hypotézy rodičovství ze vztahu bratr-sestra. Ve výpočtu LR při srovnání s hypotézou otcovství neznámého nepříbuzného muže však nedochází ke změně, protože příbuznost mezi žalovaným a matkou nemá vliv na pravděpodobnost DNA profilů dítěte za platnosti první nebo druhé hypotézy (Evett, 1998). U výpočtu LR při incestních případech (stejně jako u každého jiného výpočtu LR) důkladně zvažujeme alternativní hypotézy (například otec matky dítěte vs. bratr matky dítěte) a hodnotu apriorní pravděpodobnosti otcovství. Nově je možno incest (popřípadě uniparentální disomii) odhalit i cytogenetickým vyšetřením dítěte bez vyšetření jeho rodičů metodou DNA mikromatic/čipů/microarrays pro bodové polymorfismy, SNP (Schaaf, 2011) s vysokou hustotou markerů (např. 621 000, medián mezimarkerové vzdálenosti 2000 až 7000 bází). Takové dítě je většinou indikováno k cytogenetickému vyšetření pro vývojové abnormality a podezření na chromozomovou aberaci. U dítěte počatého mezi příbuznými prvního stupně (koeficient inbreedingu θ=0,25) je čtvrtina genomu (716 Mb) identická původem; u příbuzných druhého stupně (θ=0,125) je to 358 Mb, což se na výstupu čipového vyšetření projeví jako dlouhé úseky chromozomu bez heterozygozity.
5.16 Imprinting Imprinting je epigenetický mechanismus, zajišťující expresi mateřské nebo otcovské kopie určité chromozomální oblasti, ale nikdy ne obou kopií. Nástrojem imprintingu je diferenciální methylace cytozinů. Pokud je tento mechanismus narušen u ubikvitinproteinligázy, může to vést k Prader-Williho a Angelmanově syndromu. Imprintovaných genů není v lidském genomu mnoho (například paternálně exprimované v bílých krvinkách jsou IGF2, SNRPN, ZAC1, maternálně exprimované jsou H19, MEG3, PHLDA2, CDKN1C), proto se pro vyšetření příbuznosti používají zřídka. V literatuře je popsáno jen paternitní vyšetření VNTR 21
Jinde jsou přísnější: legislativa 31 států USA, Číny, Jižní Koreje, Severní Koreje a Tchaj-wanu zakazuje i sňatky mezi bratranci a sestřenicemi. 22 Jako zajímavost uveďme, že Charles Darwin se oženil se svou neteří Emmou Wedgewood.
67
u genu H19(Naito, 2003) a STR v intronu 1a u genu KCNQ1(Xu, 2006). Vyšetření se provádí pomocí methylačně citlivých restriktáz nebo převedením nemethylovaných cytozinů na uracil bisulfitační reakcí a následnou PCR reakcí. Pokud jsou matka a dítě stejní heterozygoti a díky imprintingu se u vyšetření otcovství dozvíme, která alela pochází od matky, zjednoduší se tím věrohodnostní poměr (Tabulka 18). Tabulka 18: Hodnoty PI pro kombinace DNA profilů matky, dítěte a žalovaného, zjednodušené při imprintingu (mateřská alela u dítěte je tučně)
Matka Dítě Žalovaný PI AB AB BB 1 pB AB AB AB 1 2 pB AB AB BC 1 2 pB Imprinting může mít u jiných organismů jiný vzorec – například u stromových mravenců královny předávají svou část genomu maternálního původu svým dcerám a paternální část svého genomu svým synům (Keller, 2010).
5.17 Chromozom Y STR-Y se používají u neúplných rodokmenů při určování otcovství a u směsí, ale z logiky věci jen tehdy, pokud je dítě mužského pohlaví. Chromozom Y se dědí po meči, patrilineárně, a z 95 % své délky nerekombinuje (výjimkou jsou pseudoautozomální oblasti). Nepřítomnost rekombinace znamená, že lokusy jsou v úplné vazbě a místo pravidla o násobení dílčích lokusových frekvencí je nutno použít haplotypovou frekvenci dítěte f (online databáze haplotypových frekvencí je na adresách http://www.yhrd.org/, http://usystrdatabase.org/, http://www.ybase.org/, http://www.ysearch.org/, http://www.genebase.com/in/dnaMarkerDetail.php nebo pro českou populaci v článku Zástěry a spol.(Zastera, 2010)). Index otcovství u tria matka-syn-žalovaný i u dua synžalovaný nabývá formy PI=1/f a může být zkombinován s autozomálním indexem otcovství pomocí násobení jen tehdy, pokud alternativní hypotézou není, že otcem je paternální příbuzný žalovaného(Ayadi, 2007). Subpopulační efekty lze započíst pomocí vzorce 1 (Balding, 1994). PI 1 f Dědění chromozomu Y vytváří nepřerušený řetězec otců a synů, ve kterém postupně může docházet k mutacím. Pokud hypotéza otcovství vyžaduje mutaci, nabývá PI formy k , PI 2f kde f je dětský haplotyp, µ je frekvence mutací a k je počet generací neboli počet meióz mezi dětským chromozomem Y a chromozomem Y žalovaného (Rolf, 2001). Pro úplnost uvěďme, že pravděpodobnost vyloučení PE=1-f.
5.18 Chromozom X Z povahy gonozomální dědičnosti vyplývá, že využití X-STR k vyšetření příbuznosti je možné jen tehdy, pokud se v rodové linii nenachází dvojice otec-syn, která přeruší přenos chromozomu X. Analýza STR na chromozomu X může doplňovat analýzu autozomů a 68
analýzu chromozomu Y zvláště u komplikovaných vyšetřování příbuznosti. Jedná se například o případy vyšetření: žalovaný z otcovství není k vyšetření dostupný a máme k dispozici jen někoho z příbuzných žalovaného (například matku žalovaného) duo možný otec-dcera u paternity (i v případě chorionických klků, směsi buněk matky a fétu) duo možná matka-syn u maternity(Szibor, 2003) hypotézy strýc ze strany otce-neteř a jednokrevní polobratr-jednokrevní polosestra incest s otcem vs. incest s bratrem (matka-jednokrevní polosestra a dcera vs. matkateta a dcera) identifikace obětí hromadného neštěstí. U paternitního tria matka-dcera-žalovaný jsou X-STR účinnější než autozomální markery, mají vyšší průměrnou pravděpodobnost vyloučení (Desmarais, 1998). Zatímco u autozomálních markerů je průměrná pravděpodobnost vyloučení dána výrazem: 2 3 2 pi3 1 pi pi 1 pi pi p j pi p j 1 pi p j , u X-STR je dána výrazem: i
i j
i
p 1 p p 1 p p p p 3 i
i
2
i
i
i
i
i j
i
j
i
p j 1 pi p j , kde je u posledního členu
každé sečítané sumační položky snížen exponent, což u čísel mezi 0 a 1 vede k navýšení hodnoty. X-STR marker obzvláště převažuje nad autozomálním markerem se stejnou populační frekvencí, pokud je tato frekvence nízká. Biologickou příčinou je, že muži jsou hemizygotní - mají jediný X chromozom, který nerekombinuje a který předávají všem svým dcerám. Chromozom X je u žen přítomen ve dvou kopiích, z nichž jedna je v každé buňce inaktivovaná na úrovni exprese procesem lyonizace. Kvantifikaci přínosu vyšetření markerů bez vazby na chromozomu X pro časté rodokmeny lze nalézt v publikaci Pinto et al. (Pinto, 2011b). Rodičovské aberace chromozomu X obyčejně vedou k neplodnosti, takže se neprojeví při analýze příbuznosti. Zárodečné aberace chromozomu X se můžou projevit jako genotyp X0 (Turnerův syndrom), jako žena s genotypem XY (necitlivost na androgeny vedoucí k testikulární feminizaci) nebo jako částečné a úplné monozomie. Pokud k takové aberaci dojde, je vyšetření chromozomu X pro určení příbuznosti nepoužitelné, protože střen (probant, osoba pro kterou vyšetření provádíme) se při genetickém vyšetření nesmí dozvědět informaci o dědičných onemocněních, pokud o ni vysloveně nepožádá. Stejně tak je vyšetření chromozomu X málo přínosné v případě vyšetření vzorku z potratu ženského pohlaví po incestu mezi otcem a dcerou, protože otcova dcera i incestní plod po něm zdědily stejný chromozom X, který ve směsi mateřských a dětských buněk nelze odlišit. U vyšetření mateřství pomocí chromozomu X je věrohodnostní poměr LR =1/2Nf, kde f je multilokusová (haplotypová) genotypová frekvence a N je počet zvažovaných heterozygotních X chromozomů. Při započtení struktury populace ukazuje hodnoty indexu paternity Tabulka 19.
69
Tabulka 19: Výpočet LR u paternit s použitím X-STR při subpopulaci (Ayres, 2005)
Matka
Dítě
AA
AA
AA
AB
AB
AA
AB
AB
AB
AC
AA
AA
Žalovaný LR při započtení efektu subpopulace a jedné mutace (koeficient θ a frekvence mutace μ) A 1 2 3 1 p A B 1 2 1 p B A 1 2 2 1 p A A 1 2 3 1 p A p B C 1 2 1 pC B 1 2 B A
2 1 p A
AA
AB
Z≠B
AB
AA
Z≠A
AB
AB
Z≠A, B
AB
AC
Z≠C
netestována AA
A
netestována AB
A
netestována AA
Z≠A
netestována AB
Z≠A, B
1 2 Z B 1 p B 1 2 Z A 1 p A 1 2 Z A Z B 2 1 p A p B 1 2 Z C 1 pC 1 2 1 p A 1 2 1 p A
1 Z A 1 p A 1 Z A p B Z B p A 21 p A p B
Pokud hypotéza otcovství vyžaduje mutaci, nabývá PI formy k , PI 2f kde f je dětský haplotyp, µ je frekvence mutací a k je počet generací neboli počet meióz mezi chromozomem X holčičky a chromozomem X žalovaného (Buckleton, 2005). Pokud využijeme po jednom markeru X-STR lokusy ze čtyř vazebných skupin, můžeme dílčí LR násobit (více viz 5.12 Vazba). Pokud testováním chromozomu X vyšetřujeme mateřství dua matka AB, dítě Y na lokusu k, tak při započtení možnosti mutace je
70
kAY kBY LR 2
1 (Buckleton, 2005). f
Věrohodnostní poměry pro X-STR u dalších často testovaných příbuzenských párů osob lze vypočíst z tabulovaných údajů (Tabulka 20, Tabulka 21, Tabulka 22) tak, že do poměru dáme dílčí genotypové pravděpodobnosti (Toni, 2007). Se složitějšími rodokmeny a X-STR nám pomůže například software MENDEL s rozhraním GREGOR(Lange, 2001) nebo bayesovské sítě (Hatsch, 2007). Tabulované hodnoty pro inbrední páry jsou uvedeny v publikaci Pinto et al. (Pinto, 2011a).
71
Tabulka 20: Pravděpodobnosti X-STR genotypů jednotlivých párů muž-žena za předpokladu jejich příbuznosti (dle nakresleného rodokmenu) Kombinace genotypů ženy a muže AA, A
p A2
AA, B 0
AB, A
p A pB
AB, C 0
p A2 p A 1 2
p A2 pB 2
p A pB 2 p A 1 2
p A pB pC
p A2 p A 3 4
p A2 pB 4
p A pB 2 p A 3 4
p A pB pC 2
p A2 3 p A 1 4
3 p A2 pB 4
p A pB 6 p A 1 4
3 p A pB pC 2
p A 5 p A2 3 p A 5 p A2 pB 8 8
p A pB 10 p A 3 5 p A pB pC 8 4
p 3A
2 p A2 pB
p A2 pB
2 p A pB pC
72
Tabulka 21: Pravděpodobnosti X-STR genotypů jednotlivých párů muž-muž za předpokladu jejich příbuznosti (dle nakresleného rodokmenu) Kombinace genotypů dvou mužů A, A
A, B
p A p A 1 2
p A pB
p A 3 p A 1 4
3 p A pB 2
p A 5 p A 3 8
5 p A pB 4
p A2
2 p A pB
73
Tabulka 22: Pravděpodobnosti X-STR genotypů jednotlivých párů žen za předpokladu jejich příbuznosti (dle nakresleného rodokmenu)
Kombinace genotypů páru osob ženského pohlaví Příbuzenský vztah
AA, AA
AA, AB
AA, BB AB, AB
AA, BC
AB, AC
AB, CD
p A3
2 p A2 pB
0
p A pB p A p B
0
2 p A pB pC
0
p A2 p A 1 2
p A2 pB
0
p A p B p A p B 2 2
0
p A pB pC
0
p A3 p A 1 2
p A2 pB 2 p A 1
p A2 p B2
p A p B 4 p A p B p A p B 2
2 p A2 pB pC
p A pB pC 4 p A 1
4 p A pB pC pD
p A3 p A 3 4
p A2 p B 2 p A 3 2
p A2 p B2 2
p A p B 4 p A p B 3 p A 3 p B 4
p A2 p B p C
p A p B p C 4 p A 3 2
2 p A p B pC p D
p A3 3 p A 1 4
p A2 p B 6 p A 1 2
3 p A2 p B2 2
p A p B 12 p A p B p A p B 4
3 p A2 pB pC
p A p B p C 12 p A 1 2
6 p A p B pC p D
p A3 5 p A2 3 p A 8
p A p B 3 p A 10 p A2 4
5 p A2 p B2 4
p A p B 20 p A p B 3 p A 3 p B 8
5 p A2 p B p C 2
p A p B p C 20 p A 3 4
5 p A p B pC p D
p A4
4 p A3 p B
2 p A2 p B2
4 p A2 p B2
4 p A2 p B2 p C
8 p A2 p B p C
8 p A p B pC p D
74
5.19 Mitochondriální DNA Mitochondrie jsou přenášeny matrilineárně, po přeslici, proto jsou použitelné jen pro určení mateřství (babičkovství, prababičkovství). Stejně jako u Y-STR, PE=1-f a LR=1/f, kde f je tentokrát mateřský haplotyp. Při započtení možnosti mutace je m kX Y , LR f kde m je počet meióz mezi dítětem a předkem po přeslici, k je lokalizace nukleotidu X změněného na Y, μ je frekvence tohoto typu mutace a f je frekvence dětského (ne mateřského) haplotypu (Buckleton, 2005). Vzhledem k tomu, že mitochondrie nemají reparační mechanismy pro DNA, můžeme se při analýze mitochondriální DNA setkat s jevem heteroplazmie, což je existence více mitotypů (lišících se ovšem třeba jediným nukleotidem) ve tkáni či dokonce přímo v jedné buňce. Přestože se mtDNA pro vyšetření příbuznosti u lidí nepoužívá v nijak velké míře, u jiných organismů může mít zajímavé využití: U rostlin jako je réva vinná (Vitis vinifera) se kromě mitochondriální DNA matrilineárně přenáší i chloroplastová DNA23. Oboupohlavná réva se po staletí propaguje vegetativně, a proto lze vyšetření příbuznosti provést i u současných cca 5000 odrůd révy. Již před lety se překvapivě ukázalo, že rodičem kvalitních odrůd Aligoté, Aubin vert, Auxerrois, Bachet, Chardonnay, Frankovka, Gamay noir, Knipperlé, Melon, Romorantin, Roublot, Sacy je nejen Pinot modrý, ale také podřadná hunčská odrůda Heunisch (Bowers, 1999). Hunčské odrůdy byly do Evropy zavlečeny Hunem Attilou, bičem božím. Víno z Heunische je tak bídné, že byly snahy tuto odrůdu zakázat a vymýtit. Vyšetřením SNP v chloroplastové DNA se zjistilo, že Heunisch byl mateřskou rostlinou, a mohl proto svým potomkům přenést odolnost k chladu a rezistenci k houbovému toxinu tentoxinu (Hunt, 2010).
5.20 Obtížně rozlišitelné hypotézy V současné době se v Evropě pro určení příbuznosti používá 34 autozomálních STR lokusů (Tabulka 23), které jsou součástí komerčních kitů PowerPlex16 (Promega), Identifiler (Applied Biosystems), Humantype Chimera (Biotype AG). Nové kity sledují standardy European Standard Set (ESS), CODIS, DAD a ISSOL a rozšiřují nabídku.
23
U rostlin musíme být opatrní s ohledem na možné zvláštnosti: například u kiwi (Actinidia chinensis) se chloroplastová DNA přenáší patrilineárně.
75
Tabulka 23: Autozomální STR pro určení příbuznosti (Nothnagel, 2010)
Lokus CSF1PO CYP19 (CYAR04) D10S2325 D12S391 D13S317 D16S539 D18S51 D19S253 D19S433 D21S11b D21S2055 D2S1338 D2S1360 D3S1358 D3S1744 D4S2366 D5S2500 D5S818 D6S474 D7S1517 D7S820 D8S1132 D8S1179 F13A1 F13B FGA LPL Penta E Penta D PLA2A SE33 (ACTBP2) TH01 (TH) TPOX VWA
Chromozomová pozice 5q33–q35 15q21
Počet alel Heterozygozita s frekvencí ≥ 0,1 % 7 0,725 8 0,725
10p14 12p13 13q21 16q24 18q21 19p13 19q21 21q21 21q22 2q35-q36 2p24 3p21 3q24 4p16 5q12 5q23 6q22 7q31 7p12 8q23 8q24 6p23–p24 1q31-q32 4q28 8q22 15q26 21q22 12q24 6q15
11 15 7 8 13 9 10 14 21 11 14 8 9 7 10 9 6 13 9 12 10 10 6 17 6 16 12 7 35
0,870 0,882 0,776 0,779 0,877 0,803 0,740 0,835 0,877 0,879 0,837 0,792 0,814 0,787 0,807 0,702 0,780 0,870 0,809 0,862 0,812 0,748 0,715 0,855 0,694 0,884 0,829 0,718 0,948
11p15 2p25 12p13
7 5 9
0,787 0,632 0,778
Přestože tento počet je více než dostačující k tomu, aby se vyšetřením dvou osob prokázala příbuznost prvního řádu (θ=0,25, přímá dědičnost, dvojice rodič-potomek, sourozenecsourozenec) i příbuznost druhého řádu (θ=0,125), nemusíme u vyšších řádů příbuznosti dosáhnout věrohodnostního poměru, dostačující pro jednoznačný závěr. Například genetické vyšetření dvou osob nedokáže rozlišit hypotézu teta-neteř od hypotézy dvou polovičních sester (nevlastních sester v obecné mluvě), protože pravděpodobnosti žádné, jedné a dvou alel identických původem se mezi hypotézami neliší (Thompson, 1975). Nicméně existuje i dvojice hypotéz (Brenner, 2008), kdy se Cottermanův k-koeficent (Tabulka 7) mezi 76
hypotézami neliší, a přesto není genetické vyšetření úplně neinformativní: je tomu tak kupříkladu při rozlišení tety ze strany matky od jednokrevní polosestry v rodokmenu se dvěma sestrami (Obrázek 15). Obrázek 15: Genetické vyšetření může být informativní pro rozlišení dvou hypotéz, i když Cottermanovy koeficienty k jsou shodné
Je to proto, že u první hypotézy v jedné osmině případů zdědí každá sestra rozdílnou tetinu alelu, zatímco dvě alely poloviční sestry se u úplných sester identicky původem vyskytnout nemohou. Pokud na chromozomu X vyšetřujeme několik lokusů, bližších než 50 cM a nepoužijeme frekvenci haplotypu, musíme do věrohodnostního poměru započíst vazbu(Nothnagel, 2010), jinak by byl náš výpočet zavádějící (viz 5.12 Vazba).
6 Automatizace vyšetření Někoho by mohly vzorce v předchozích kapitolách vyděsit natolik, že podléhá malomyslnosti a chce rezignovat na logickou interpretaci výsledků určování otcovství a příbuznosti pomocí věrohodnostního poměru a raději vydávat výsledek jen jako vyloučení/nevyloučení. To bych ovšem věrohodnostnímu poměru a nebožtíku Bayesovi vykonal medvědí službu. Naštěstí můžeme s výhodou použít počítačové programy a vyhnout se tak někdy náročnému výpočtu. Přestože software pro výpočet úrovně příbuznosti je celá řada(Drabek, 2009a), pro náš účel je obzvláště vhodný freeware familias. Má všechny nezbytné funkce a navíc umí i generovat hypotézy, což je funkce vhodná pro identifikaci obětí hromadných neštěstí.24 Program familias 1.81 (Obrázek 16) byl zvalidován pro forenzní účely dle požadavků ISO17025 (Drabek, 2009b) a je zdarma poskytován již více než patnáct let z webové adresy http://www.math.chalmers.se/~mostad/familias/. Nedávno byl aktualizován na verzi familias 2.0 (http://familias.name/), která však vedla jen k doladění a vychytání drobných chyb. Kosmetické změny směřovaly spíše ke zhoršení přehlednosti v posledním rozhraní. Připravuje se však projekt OpenFamilias s otevřeným kódem, využívající programovací jazyk R: http://www.r-project.org/, ve kterém budou implementovány další užitečné funkce (např. modul pro lokusy ve vazbě, algebraické vyjádření LR).
24
Pokud někomu program familias nevyhovuje, může si po registraci vyzkoušet Bayesovské sítě v programu Bonaparte https://www.bonaparte-dvi.nl (Bruijning-van Dongen, 2009)anebo stáhnout si na svůj počítač okleštěnou verzi programů EasyDNA http://www.hku.hk/statistics/EasyDNA/ (Fung, 2003). Pro lokusy ve vazbě se hodí uživatelsky málo přívětivý počítačový balík LINKAGE http://linkage.rockefeller.edu s programem MLINK. Vyplatí se také pravidelně sledovat softwarové stránky ISFG (http://www.isfg.org/Software) a NIST (http://www.cstl.nist.gov/strbase/software.htm).
77
Obrázek 16: Ovládací lišta programu familias 1.81
Ovládání programu probíhá v několika krocích: 1. Vybereme lokusy, zadáme populační (tiché a mutační) frekvence 2. Zadáme DNA profily konkrétního případu 3. Stanovíme apriorní pravděpodobnost otcovství 4. Stanovíme hypotézy 5. Nastavíme hodnotu příbuznosti 6. Srovnáme pravděpodobnosti DNA profilů za předpokladu soutěžících hypotéz, zkombinujeme s apriorní pravděpodobností v Bayesově větě. Místo toho, abych na několika stranách popisoval konkrétní kroky práce s programem familias, odkazuji na adresu http://www.4N6gen.org, kde jsou online nahrány webové tutoriály.
78
7 Závěr Někdo by mohl na základě Internetové nabídky genetického vyšetření otcovství nabýt dojmu, že se jedná o problematiku natolik zavedenou, standardizovanou a zprofanovanou, že není zajímavá z genetického ani z interpretačního hlediska. Touto publikací jsem se snažil upozornit na fakt, že určování otcovství a příbuznosti není tak triviální a nezajímavé, že vyžaduje biologické a matematické znalosti, stejně jako syntetizující pohled, a že interpretace bývá prováděna nesprávně i v české právní praxi. Přál bych si, aby publikace posloužila jako propagace věrohodnostního poměru a Bayesovy věty pro kombinaci různých zdrojů informací (důkazů), pro rozhodování za nejistoty, speciálně zamířeno pro soudní účely. Potěšilo by mě také, kdyby knížku otevřeli znalci pro konzultaci při obtížném příbuzenském případu nebo vývojáři forenzně bioinformatického software.
79
80
8 Úlohy k výpočtu 8.1 Zadání Jakákoliv podobnost s konkrétním DNA profilem je čistě náhodná.
Úkol 1: bratranec a sestřenice Máme osobu X: AB a osobu Y BB, pA=0,12 a pB=0,37, populace v Hardy-Weinbergově rovnováze. Zajímají nás hypotézy H1: X a Y jsou bratranec a sestřenice a H2: X a Y nejsou příbuzní. Jaké je LR?
Úkol 2: sourozenci nebo matka a syn Jack Nicholson až do svých 37 let považoval svou matku za svou sestru a svou babičku za svou matku. Využijme to pro příklad k výpočtu. V populaci s frekvencemi pA1=0,03 a pA2=0,02, pA3=0,05 máme Jacka: A1A2 a June: A1A3. Zajímají nás hypotézy H1: Jack a June jsou matka a syn a H2: Jack a June jsou úplní sourozenci. Jaké je LR?
Úkol 3: vliv mutace v zárodečné linii matky na sílu důkazu otcovství U standardního paternitního sporu není žalovaný vyloučen v žádném z 15 testovaných lokusů. Nicméně na lokusu D19S433 má matka genotyp 12, 16, dítě genotyp 14, 15 a žalovaný 14, 14. Nechť populační frekvence jsou D19S433*12=0,069, 14=0,362, 15=0,172, 16=0,041, mutační frekvence D19S433 je 0,1%. Projeví se suspektní mutace v zárodečné linii matky na sílu důkazu pro otcovství žalovaného na tomto lokusu?
Úkol 4: úplní bratři, poloviční bratři, nepříbuzní Vyšetřujeme dva muže, zda mají shodného jednoho nebo dva rodiče. Výsledek je D1S1677 12, 13 a 13, 14. Nechť populační frekvence jsou: 0,084 (alela 12), 0,207 (alela 13), 0,362 (alela 14). Doplňte tabulku:
Úplní bratři Poloviční bratři Nepříbuzní
Apriorní LR vs. pravděpodobnost Úplní bratři 0,33 1 0,33
LR vs. Poloviční bratři
LR vs. Aposteriorní Nepříbuzní pravděpodobnost
1
0,33
1
Úkol 5: otcem dítěte je žalovaný nebo jeho otec Ve filmu Soukromé pasti a v realitě třeba v rodině fotografa Jana Saudka došlo k situaci, kdy nemusí být jisté, kdo z dvojice mužů je otcem dítěte, přičemž tito muži jsou vůči sobě navzájem ve vztahu otce a syna. Využijme to pro výpočetní příklad. Testováno je dítě a mladší partner matky. Výsledek je na lokusu D1S1677 pro oba testované 14, 15 a na chromozomu Y pro oba testované:
81
DYS393 DYS390 DYS19 DYS391 DYS425 DYS426 DYS434 DYS435 DYS436 DYS437I DYS438 DYS439 DYS388 DYS389I DYS389II DYS392
13 25 15 10 12 11 11 11 12 8 10 10 14 10 26 11
Frekvence alely 14 je 0,362, frekvence alely 15 je 0,276, frekvence Y haplotypu C je 0,08. Jaké je LR?
Úkol 6: otec a dva synové Saddám Husajn Abd al-Madžíd at-Tikrítí byl po zajetí v prosinci 2003 ztotožněn na základě srovnání s DNA profily jeho dvou synů (Kusaje a Udaje, již dříve zabitých v Mosulu). Předpokládejme, že Udaj a Kusaj jsou úplní bratři. Mějme tyto genotypy zjištěné z bukálních výtěrů neidentifikovaného muže, údů Kusaje a kusů Udaje: Kusaj Udaj Saddám Husajn? SE33 DYS393 DYS390 DYS19 DYS391 DYS425 DYS426 DYS434 DYS435 DYS436 DYS437I DYS438 DYS439 DYS388 DYS389I DYS389II DYS392
32.2, 33 13 25 15 10 12 11 11 11 12 8 10 10 14 10 26 11
14, 15
14, 32.2
13 25 15 10 12 11 11 11 12 8 10 10 14 10 26 11
13 25 15 10 12 11 11 11 12 8 10 10 14 10 26 11 82
Srovnáváme hypotézy: H1: muž je otcem Kusaje i Udaje, H2: muž je otcem Usaje nebo Kudaje, H3: muž není otcem Kusaje ani Udaje. Populační frekvence jsou SE33*14 (0,055), 15 (0,050), 32.2 (0,005), 33 (0,005), Y haplotyp C má frekvenci 0,08. Jaká je aposteriorní pravděpodobnost, že neidentifikovaný muž je Saddám Husajn, když apriorní pravděpodobnosti jsou H1: 0,1; H2: 0,05; H3: 0,85?
Úkol 7: úplní sourozenci nebo nepříbuzní Usáma bin Ládin byl identifikován na základě zpravodajských informacích vedoucích k jeho úkrytu v pákistánském Abbottábádu, na základě výšky postavy a srovnáním DNA profilu s DNA profilem jedné úplné sestry z jeho dvaceti devíti sester a polosester. Mějme genotyp muže SE33*23,23.2; mitochondriální pozice 16069: G a genotyp suspektní sestry tohoto muže SE33*23,28; mitochondriální pozice 16069: G. Apriorní pravděpodobnost, že se jedná o Usámu bin Ládina, je 0,25, populační frekvence jsou SE33*23 (0,005), 23.2 (0,035), 28 (0,005), mitochondriální pozice 16069: G nebyla zjištěna v populačním vzorku 500 osob.
Úkol 8: bratr žalovaného alternativním žalovaným Při určování otcovství máme matku, dítě a žalovaného (genotypy viz tabulka) a zajímají nás hypotézy H1: žalovaný je biologickým otcem dítěte a H2: bratr žalovaného je biologickým otcem dítěte. Jaké je LR(Fung, 2008)? Genotypy matky, dítěte a žalovaného Lokus Matka D3S1358 15,16 vWA 18, 19 FGA 20, 21 TH01 7, 8
Dítě 15, 17 18, 20 20, 21 7, 8
Žalovaný 17, 18 20, 20 19, 20 7, 8
Úkol 9: rodičovství nebo nepříbuznost Máme možnou matku, možného otce, dítě. Zajímají nás hypotézy H1: možní rodičové jsou biologickými rodiči dítěte a H2: neznámý nepříbuzný pár jsou rodiče dítěte. Jaké je LR (Fung, 2008)? Lokus D3S1358 vWA FGA TH01 TPOX D16S539
Matka 15, 15 18, 19 20, 21 7, 9 8, 8 10, 11
Dítě 15, 15 18, 18 21, 21 7, 8 8, 9 11, 12
Žalovaný 15, 15 18, 18 19, 21 7, 8 8, 9 9, 12
83
8.2 Řešení úkolů Řešení úkolu 1 Dle tabulky v kapitole 2.3 (Tabulka 5): k 6 pB 1 3 1 LR k 0 1 1,0878 pB 4 8 pB 8 pB Výsledek genetického vyšetření svědčí spíše pro bratrance a sestřenici než pro nepříbuznost. Stejně jako u některých následujících úloh se jedná o důkaz slabý, který lze případně navýšit vyšetřením dalších znaků. Pro procvičení postupu snad výpočet může dostačovat. Řešení úkolu 2 Pro výpočet tohoto úkolu využijeme obecný vzorec z tabulky (Tabulka 5), kde do stejného obecného vzorce v čitateli i jmenovateli dosadíme Cottermanovy koeficienty pro situaci rodič-dítě a úplní sourozenci E F LR PE, F H d P E, F H p
(k0=0,25; 2k1=0,5; k2=0,25) 4k0 p A2 pB pC 2k1 p A pB pC
(k0=0; 2k1=1; k2=0) AB
AC
4k0 p A2 pB pC 2k1 p A pB pC
2 1,88679 2 p A1 1
Výsledek genetického vyšetření svědčí spíše pro mateřství June než pro sesterství June. Řešení úkolu 3 Pokud by nedošlo v zárodečné linii matky k mutaci o jednotku repetice (dítě by mělo genotyp 16, 14), tak by věrohodnostní poměr pro tento lokus při započtení českých populačních frekvencí dosahoval 2,76. Při započtení mutace se však tento věrohodnostní poměr sníží, protože při výpočtu jmenovatele - pravděpodobnosti rodokmenu s neznámým nepříbuzným mužem z populace - nemůžeme pominout možnost, že biologický otec předal dítěti alelu 15 a v zárodečné linii matky došlo buď k mutaci 1614 nebo 1214. Záleží na mutačním modelu, o kolik je hodnota LR snížená. Při modelu familias „equal probability“ je LR=1,87; při „decreasing with range equal“ LR=2,62, „decreasing with range stable“ LR=2,67 a při „proportional to frequency“ LR=1,38, což jsou vše hodnoty převyšující jedna. Pokud započteme LR ze zbývajících čtrnácti lokusů, tak závěr o prakticky prokázaném otcovství žalovaného je robustní, nemění se v závislosti na použití mutačního modelu. Řešení úkolu 4 Apriorní LR vs. pravděpodobnost úplní bratři Úplní bratři 0,33 1 Poloviční bratři
0,33
4 p13 1 2 p13 1
Nepříbuzní
0,33
8 p13 2 p13 1
LR vs. poloviční bratři 2 p13 1 4 p13 1 1
8 p13 4 p13 1
LR vs. Aposteriorní nepříbuzní pravděpodobnost
2 p13 1 8 p13
0,289
4 p13 1 8 p13 1
0,373 0,338
84
Odvození aposteriorní pravděpodobnosti pomocí programu familias: Apriorní LR Aposteriorní Aposteriorní pravděpodobnost pravděpodobnost = pravděpodobnost po apriorní korekci na celkovou pravděpodobnost × pravděpodobnost 1 LR (celková pravděpodobnost přesahuje 1, proto je nutná korekce) Úplní bratři 0,33 1 0,33 0,289 Poloviční bratři 0,33 1,29 0,4257 0,373 Nepříbuzní 0,33 1,17 0,3861 0,338 Celková 1,1418 1,00 pravděpodobnost Vyšetření tohoto lokusu svědčí více pro polobratry než pro bratry nebo nepříbuzné. Řešení úkolu 5 Do tabulky (Tabulka 6) dosadíme hodnotu θ = 0,25, platící pro příbuzenský vztah otce a syna: Dítě Žalovaný LR obecně LR po dosazení θ 1 2 p14 2 p15 AB AB 2
41 2 p A p B p A pB
4 p15 p14 p15 p14
1,2297
. Vyšetření chromozomu Y nepřináší relevantní informaci pro rozlišované hypotézy. Vyšetření lokusu D1S1677 svědčí více pro hypotézu otcovství žalovaného než pro hypotézu otcovství otce žalovaného. Řešení úkolu 6 Autozomální a gonozomální znaky jsou nezávislé, protože můžeme násobit LR. H Apriorní H Apriorní LR LR Aposteriorní Aposteriorní P P P z SE33 z Y P po korekci na STR celkovou pravděpodobnost 1 Saddám Husejn, 0,1 Saddám 0,1 454,54 11,185 0,99823 0,3371 otec Kusaje a Husejn, Udaje otec Kusaje a Udaje Saddám Husejn 0,05 Saddám 0,025 100 1,775 0,81986 0,2769 otec jednoho Husejn, otec Kusaje Saddám 0,025 9,09 1,775 0,29264 0,0988 Husejn, otec Udaje 85
Neznámý muž, nepříbuzný Udaji a Kudaji
Neznámý 0,85 muž, nepříbuzný Udaji a Kudaji
0,85
1
1
Celková pravděpodobnost
0,85
0,2871
2,96
1
Výsledky genetického vyšetření mění výchozí pravděpodobnosti tak, že nyní je nejpravděpodobnější hypotéza H2, že se jedná o otce buď Udaje nebo Kusaje (27,69+9,88=37,6 %). Řešení úkolu 7 H Apriorní LR z SE33 P Usáma bin Ládin
0,25
2 p A23 1 25,25 8 p A23
LR z mtDNA: 16069 1 1 x 1 f N 1 N 1 501 1
Aposteriorní P
Aposteriorní P po korekci na 100 % 0,999762907 0,571
Neznámý 0,75 1 0,75 0,429 nepříbuzný muž Výsledky genetického vyšetření svědčí pro hypotézu, že se jedná o Usámu než pro hypotézu, že se jedná o neznáměné muže. Řešení úkolu 8 Koeficient příbuznosti (θ, kinship coefficient) pro bratry je roven 0,25. LR25 1,4
Lokus D3S1358
Obecný vzorec LR
Vzorec LR po dosazení θ
1 2 21 2 pi
1 0,5 p17
vWA
1 2 1 2 pi
1 0,51 p 20
1,97
FGA
1 2 21 2 pi p j
1 0,5 p 20 p 21
1,21
TH01
1 2 1 2 pi p j
1 0,51 p7 p8
1,59
Celkem
5,31
Vyšetření svědčí více pro hypotézu otcovství žalovaného než pro hypotézu otcovství bratra žalovaného.
25
Použité frekvence alel jsou z české populace (Simkova, 2009).
86
Řešení úkolu 9 Lokus D3S1358 vWA FGA TH01 TPOX D16S539 Celkem
Obecný vzorec LR 1/p2i 1/2p2i 1/4p2i 1/4pipj 1/2pipj 1/8pipj
Vzorec LR 1/p215 1/2p218 1/4p221 1/4p7p8 1/2p8p9 1/8p11p12
LR* 17,89 9,5 7,5 15,97 17,6 1,43 512328,9
Vyšetření svědčí více pro hypotézu rodičovství testovaných osob než pro hypotézu rodičovství neznámých osob.
87
9 Seznam použitých zdrojů 9.1 Reference 1. ALBRECHT, K. and SCHULTHEISS, D. Proof of paternity: historical reflections on an andrological-forensic challenge. Andrologia, 2004, vol. 36, no. 1, p. 31-37. 2. AYADI, I., MAHFOUDH-LAHIANI, N., MAKNI, H., et al. Combining autosomal and Y-chromosomal short tandem repeat data in paternity testing with male child: Methods and application. Journal of Forensic Sciences, 2007, vol. 52, no. 5, p. 1068-1072. 3. AYRES, K. L. and POWLEY, W. M. Calculating the exclusion probability and paternity index for X-chromosomal loci in the presence of substructure. Forensic Science International, 2005, vol. 149, no. 2-3, p. 201-203. 4. BALDING, D. J. Weight-of-evidence for Forensic DNA ProfilesChichester: John Wiley and Sons, 2005. 198 s. 5. BALDING, D. J. and DONNELLY, P. Evaluating DNA profile evidence when the suspect is identified through a database search. Journal of Forensic Sciences, 1996, vol. 41, no. 4, p. 603-607. 6. BALDING, D. J. and NICHOLS, R. A. DNA profile match probability calculation how to allow for population stratification, relatedness, database selection and single bands. Forensic Science International, 1994, vol. 64, no. 2-3, p. 125140. 7. BAUR, M. P., ELSTON, R. C., GURTLER, H., et al. No fallacies in the formulation of the paternity index. American Journal of Human Genetics, 1986, vol. 39, no. 4, p. 528-536. 8. BAYES, T. Essay towards solving a problem in the doctrine of chances. Philosophical Transactions of the Royal Society London, B Biological Sciences, 1763, vol. 53, p. 370-418. 9. BEIN, G., DRILLER, B., SCHURMANN, M., et al. Pseudo-exclusion from paternity due to maternal uniparental disomy 16. International Journal of Legal Medicine, 1998, vol. 111, no. 6, p. 328-330. 10. BIRUS, I., MARCIKIC, M., LAUC, D., et al. How high should paternity index be for reliable identification of war victims by DNA typing? Croatian Medical Journal, 2003, vol. 44, no. 3, p. 322-326. 11. BOWERS, J., BOURSIQUOT, J. M., THIS, P., et al. Historical genetics: the parentage of Chardonnay, Gamay, and other wine grapes of Northeastern France. Science, 1999, vol. 285, no. 5433, p. 1562-1565. 12. BRENNER, C. H. Symbolic kinship program [published erratum appears in Genetics 1997 Sep;147(1):following 398]. Genetics, 1997, vol. 145, no. 2, p. 535-542. 88
13. BRENNER, C. H. Counterexample to a kinship conjecture of Krawczak. Forensic Science International-Genetics, 2008, vol. 2, no. 1, p. 75-75. 14. BRENNER, C. H. Fundamental problem of forensic mathematics-The evidential value of a rare haplotype. Forensic Science International: Genetics, 2010, vol. 4, no. 5, p. 281-291. 15. BRUIJNING-VAN DONGEN, C. J., SLOOTEN, K., BURGERS, W., et al. Bayesian networks for victim identification on the basis of DNA profiles. Forensic Science International: Genetics Supplement Series, 2009, vol. 2, p. 466-468. 16. BUCKLETON, J., TRIGGS, J., and WALSH, S. J. Forensic DNA Evidence Interpretation Boca Raton, FL : CRC Press , 2005. 534 s. 17. CHAKRABORTY, R. and JIN, L. Determination of relatedness between individuals using DNA fingerprinting. Human Biology, 1993, vol. 65, no. 6, p. 875-895. 18. CHAKRAVARTI, A. and LI, C. C. Estimating the prior probability of paternity from the results of exclusion tests. Forensic Science International, 1984, vol. 24, no. 2, p. 143-147. 19. CIOFI, C., TZIKA, A. C., NATALI, C., et al. Development of a multiplex PCR assay for fine-scale population genetic analysis of the Komodo monitor Varanus komodoensis based on 18 polymorphic microsatellite loci. Molecular Ecology Resources, 2011, vol. 11, no. 3, p. 550-556. 20. CLAYTON, T. M., GUEST, J. L., URQUHART, A. J., et al. A genetic basis for anomalous band patterns encountered during DNA STR profiling. Journal of Forensic Sciences, 2004, vol. 49, no. 6, p. 1207-1214. 21. COMMITTEE ON DNA FORENSIC SCIENCE: AN UPDATE, National Research Council. The Evaluation of Forensic DNA Evidence1. Washington D.C.: The National Academies Press, 1996. 272 s. 22. CURRAN, J. M., BUCKLETON, J. S., TRIGGS, C. M., et al. Assessing uncertainty in DNA evidence caused by sampling effects. Science & Justice, 2002, vol. 42, no. 1, p. 29-37. 23. DAWID, A. P., MORTERA, J., and PASCALI, V. L. Non-fatherhood or mutation? A probabilistic approach to parental exclusion in paternity testing. Forensic Science International, 2001, vol. 124, no. 1, p. 55-61. 24. DESMARAIS, D., ZHONG, Y., CHAKRABORTY, R., et al. Development of a highly polymorphic STR marker for identity testing purposes at the human androgen receptor gene (HUMARA). Journal of Forensic Sciences, 1998, vol. 43, no. 5, p. 1046-1049. 25. DRABEK, J. Urceni otcovstvi bez vzorku z otcova tela. Profilovani DNA a Bayesova veta. [Paternity testing without sample from putative father. DNA profiling and Bayes theorem]. Vesmir, 2002a, vol. 81, p. 69-70.
89
26. DRABEK, J. Vyjadreni sily expertniho dukazu pri urcovani otcovstvi [Way to express an expert evidence in paternity testing]. Casopis Lekaru Ceskych, 2002b, vol. 141, no. 12, p. 371-375. 27. DRABEK, J. Use of freeware for calculating likelihood ratio for paternity and kinship in complicated human pedigrees. 23rd World Congress International Society for Forensic Genetics, 2009a, vol. Buenos Aires, Argentina, September 14 18, 2009, p. 0054-0054. 28. DRABEK, J. Validation of software for calculating the likelihood ratio for parentage and kinship. Forensic Science International: Genetics, 2009b, vol. 3, p. 112118. 29. EGELAND, T. and MOSTAD, P. F. Manual for familias. 2010, p. 1-52. 30. EGELAND, T. and SHEEHAN, N. On identification problems requiring linked autosomal markers. Forensic Science International-Genetics, 2008, vol. 2, no. 3, p. 219-225. 31. ELSTON, R. C., GEORGE, V. T., and SEVERTSON, F. The Elston-Stewart algorithm for continuous genotypes and environmental factors. Human Heredity, 1992, vol. 42, no. 1, p. 16-27. 32. ESSEN-MOLLER, E. Die Beweiskraft der Ahnlichkeit im Vaterschaftsnachweis Theoretische Grundlagen [The evidential value of similarity as proof of paternity, fundamental principles]. Mitteilungen der Anthropologischen Gesellschaft, 1938, vol. 68, p. 9-53. 33. EVETT, I. W. and WEIR, B. S. Interpreting DNA evidence: statistical genetics for forensic scientists1. Sunderland, Massachusetts: Sinauer Assoc., 1998. 278 s. 34. FRYSTAK, M. and KREJCI, Z. Postaveni znalce v trestnim rizeniBrno: Masarykova Univerzita v Brne, 2009. 168 s. 35. FUNG, W. K. User-friendly programs for easy calculations in paternity testing and kinship determinations. Forensic Science International, 2003, vol. 136, no. 13, p. 22-34. 36. FUNG, W. K. and HU, Y. Q. Statistical DNA forensics. Theory, methods, and computation. Chichester: John Wiley and Sons, LtD., 2008. 241 s. 37. GILDING, M. Rampant misattributed paternity: the creation of an urban myth. People and Place, 2005, vol. 13, no. 2, p. 1-11. 38. GJERTSON, D. W., BRENNER, C. H., BAUR, M. P., et al. ISFG: Recommendations on biostatistics in paternity testing. Forensic Science International: Genetics, 2007, vol. 1, no. 3-4, p. 223-231. 39. GONZALEZ-GALARZA, F. F., CHRISTMAS, S., MIDDLETON, D., et al. Allele frequency net: a database and online repository for immune gene frequencies in worldwide populations. Nucleic Acids Research, 2011, vol. 39, no. Database issue, p. D913-D919. 90
40. GOTTSCHALK, R. Grundriß der gerichtlichen Medizin (einschließl. Unfall- und Invalidenversicherung) für Ärzte und Juristen : mit bes. Berücks. d. einschl. Entscheidungen d. Reichsgerichts u. d. Reichsversicherungsamtes4. Leipzig: Georg Thieme, 1912. 471 s. 41. HALLENBERG, C. and MORLING, N. A report of the 2000 and 2001 Paternity Testing Workshops of the English Speaking Working Group of the International Society for Forensic Genetics. Forensic Science International, 2002, vol. 129, no. 1, p. 43-50. 42. HATSCH, D., KEYSER, C., HIENNE, R., et al. Resolving paternity relationships using X-chromosome STRs and Bayesian networks. Journal of Forensic Sciences, 2007, vol. 52, no. 4, p. 895-897. 43. HUMMEL, K., IHM, P., and SCHMIDT, V. [Evaluation of paternity probability determined according to the formula of Essen-Moller with regard to the given mother-child constellation. Description of the methods; tables and graphs]. Dtsch. Z. Gesamte. Gerichtl. Med., 1969, vol. 66, no. 3, p. 97-122. 44. HUNT, H. V., LAWES, M. C., BOWER, M. A., et al. A banned variety was the mother of several major wine grapes. Biol. Lett., 2010, vol. 6, no. 3, p. 367369. 45. IHM, P. Biomathematical Evidence of PaternityBerlin: Springer-Verlag, The problem of paternity in the light of decision theory, 46. IHM, P. and HUMMEL, K. [A method to calculate the plausibility of paternity using blood group results of any relatives (author's transl)]. Z. Immunitatsforsch. Exp. Klin. Immunol., 1975, vol. 149, no. 5, p. 405-416. 47. ILNYTSKYY, Y. and KOVALCHUK, O. Non-targeted radiation effects-An epigenetic connection. Mutation Research, 2011, vol. 714, no. 1-2, p. 113-125. 48. KAYE, D. H. Can jurors understand probabilistic evidence? Journal of the Royal Statistical Society, Series A, 1991, vol. 154, no. I, p. 75-81. 49. KELLER, L. Genetics: biased transmission of genomes according to parents of origin. Curr. Biol., 2010, vol. 20, no. 14, p. R601-R602. 50. KRAWCZAK, M. Kinship testing with X-chromosomal markers: mathematical and statistical issues. Forensic Science International: Genetics, 2007, vol. 1, no. 2, p. 111-114. 51. LANGE, K., CANTOR, R., HORVATH, S., et al. Mendel version 4.0: a complete package for the exact genetic analysis of discrete traits in pedigree and population data sets. American Journal of Human Genetics, 2001, vol. 69, no. 4, p. 504-504. 52. LENHART, K. Genetika pro ucely paternitnich expertiz1. Olomouc: Polygraficke stredisko VUP, 2001. 41 s.
91
53. LENHART, K., LUKS, A., BARTOVA, A., et al. Exclusion and inclusion of paternity: 1976-1985. Acta Universitatis Palackianae Olomucensis Facultatis Medicae, 1988, vol. 119, p. 251-260. 54. LENHARTOVA, E., LENHART, K., and BARTOVA, A. Quantitative indices in paternity cases. Acta Universitatis Palackianae Olomucensis Facultatis Medicae, 1992, vol. 134, p. 77-80. 55. LIAO, X. H., LAU, T. S., NGAN, K. F., et al. Deduction of paternity index from DNA mixture. Forensic Science International, 2002, vol. 128, no. 3, p. 105-107. 56. LINACRE, A., GUSMAO, L., HECHT, W., et al. ISFG: Recommendations regarding the use of non-human (animal) DNA in forensic genetic investigations. Forensic Science International: Genetics, 2011, vol. 5, no. 5, p. 501-505. 57. MARTINEZ-GONZALEZ, L. J., LORENTE, J. A., MARTINEZ-ESPIN, E., et al. Intentional mixed buccal cell reference sample in a paternity case. Journal of Forensic Sciences, 2007, vol. 52, no. 2, p. 397-399. 58. NAITO, E., DEWA, K., FUKUDA, M., et al. Novel paternity testing by distinguishing parental alleles at a VNTR locus in the differentially methylated region upstream of the human H19 gene. Journal of Forensic Sciences, 2003, vol. 48, no. 6, p. 1275-1279. 59. NOTHNAGEL, M., SCHMIDTKE, J., and KRAWCZAK, M. Potentials and limits of pairwise kinship analysis using autosomal short tandem repeat loci. International Journal of Legal Medicine, 2010, vol. 124, no. 3, p. 205-215. 60. PINTO, N., GUSMAO, L., and AMORIM, A. X-chromosome markers in kinship testing: a generalisation of the IBD approach identifying situations where their contribution is crucial. Forensic Science International: Genetics, 2011a, vol. 5, no. 1, p. 27-32. 61. PINTO, N., SILVA, P. V., and AMORIM, A. A general method to assess the utility of the X-chromosomal markers in kinship testing. Forensic Science International: Genetics, 2011b, 62. ROBERTSON, B. and VIGNAUX, G. A. Interpreting evidence1. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore: John Wiley & Sons, Ltd., 1995. 240 s. 63. ROLF, B., KEIL, W., BRINKMANN, B., et al. Paternity testing using Y-STR haplotypes: assigning a probability for paternity in cases of mutations. International Journal of Legal Medicine, 2001, vol. 115, no. 1, p. 12-15. 64. ROLF, B., WIEGAND, P., and BRINKMANN, B. Somatic mutations at STR loci - a reason for three-allele pattern and mosaicism. Forensic Science International, 2002, vol. 126, no. 3, p. 200-202. 65. SCHAAF, C., SCOTT, D., WISZNIEWSKA, J., et al. Identification of incestuous parental relationships by SNP-based DNA microarrays. Lancet, 2011, vol. 377, no. 9765, p. 555-556.
92
66. SCHULTE-MOENTIG, J. and WALTER, E. Statistische Interpretation von serologischen Befunden zur Beurteilung einer Vaterschaft. Bundesgesundheitsblatt - Gesundheitsforschung - Gesundheitsschutz, 1972, vol. 18, p. 257-259. 67. SIMKOVA, H., FALTUS, V., MARVAN, R., et al. Allele frequency data for 17 short tandem repeats in a Czech population sample . Forensic Science International: Genetics, 2009, vol. 4, no. 1, p. e15-e17. 68. SONG, Y. S., PATIL, A., MURPHY, E. E., et al. Average probability that a "cold hit" in a DNA database search results in an erroneous attribution. Journal of Forensic Sciences, 2009, vol. 54, no. 1, p. 22-27. 69. STOCKMARR, A. Likelihood ratios for evaluating DNA evidence when the suspect is found through a database search. Biometrics, 1999, vol. 55, no. 3, p. 671677. 70. SZIBOR, R., KRAWCZAK, M., HERING, S., et al. Use of X-linked markers for forensic purposes. International Journal of Legal Medicine, 2003, vol. 117, no. 2, p. 67-74. 71. THOMPSON, E. A. Estimation of Pairwise Relationships. Annals of Human Genetics, 1975, vol. 39, no. OCT, p. 173-188. 72. THOMPSON, W. C. and SCHUMANN, E. L. Interpretation of statistical evidence in criminal trials - the Prosecutors fallacy and the Defense attorneys fallacy. Law and Human Behavior, 1987, vol. 11, no. 3, p. 167-187. 73. TILLMAR, A. O., MOSTAD, P., EGELAND, T., et al. Analysis of linkage and linkage disequilibrium for eight X-STR markers. Forensic Science International-Genetics, 2008, vol. 3, no. 1, p. 37-41. 74. TONI, C., DOMENICI, R., and PRESCIUTTINI, S. Genotype probabilities of pairs of individuals for X-chromosome markers. Transfusion, 2007, vol. 47, no. 7, p. 1276-1280. 75. UK DEPARTMENTS OF HEALTH. Good Practice Guide on Paternity Testing Services. 2008, p. 1-35. 76. WATTS, P. C., BULEY, K. R., SANDERSON, S., et al. Parthenogenesis in Komodo dragons. Nature, 2006, vol. 444, no. 7122, p. 1021-1022. 77. WIENER, A. S. Estimation of nonpaternity. American Journal of Human Genetics, 1966, vol. 18, no. 3, p. 309-310. 78. XU, H. D., NAITO, E., DEWA, K., et al. Parentally imprinted allele typing at a short tandem repeat locus in intron 1a of imprinted gene KCNQ1. Leg. Med. (Tokyo), 2006, vol. 8, no. 3, p. 139-143. 79. YUNIS, E. J., ZUNIGA, J., ROMERO, V., et al. Chimerism and tetragametic chimerism in humans: implications in autoimmunity, allorecognition and tolerance. Immunologic Research, 2007, vol. 38, no. 1-3, p. 213-236. 93
80. ZASTERA, J., ROEWER, L., WILLUWEIT, S., et al. Assembly of a large Y-STR haplotype database for the Czech population and investigation of its substructure. Forensic Science International-Genetics, 2010, vol. 4, no. 3, p. E75-E78. 81. ZEMAN, K., REHAKOVA, B., POLASEK, V., and SOUKUPOVA, E. Mimomanzelska plodnost v Ceske republice po roce 1989: socialni a ekonomicke souvislostiPraha: Sociologicky ustav Akademie Ved Ceske Republiky, 2006.
9.2 Doporučená literatura BALDING, D.J., Weight-of-Evidence for Forensic DNA Profiles. John Wiley & Sons, Chichester (2005). BUCKLETON, J., TRIGGS, J., and WALSH, S. J. Forensic DNA Evidence Interpretation. Boca Raton, FL: CRC Press, 2005. 534 s. EVETT, I. W. and WEIR, B. S. Interpreting DNA evidence: statistical genetics for forensic scientists, 1st Edition, Sunderland, Massachusetts: Sinauer Assoc., 1998. 278 s. FUNG, W. K. and HU, Y. Q. Statistical DNA forensics. Theory, methods, and computation. Chichester: John Wiley and Sons, LtD., 2008. 241 s. ROBERTSON, B. and VIGNAUX, G. A. Interpreting evidence. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore: John Wiley & Sons, Ltd., 1995. 240 s. TARONI, F., AITKEN, C., GARBOLINO, P., BIEDERMANN, A. Bayesian networks and probabilistic inference in forensic science. John Wiley & Sons, Chichester (2006).
9.3 Použité webové odkazy http://cs.wikipedia.org/wiki/Abecedn%C3%AD_seznam_%C4%8Dlen%C5%AF_rodiny http://dna-view.com/ http://dna-view.com/exclusn.htm#definition http://dna-view.com/ideas/ChildBody.htm http://dna-view.com/patform.htm http://dna-view.com/placental.htm http://familias.name/ http://linkage.rockefeller.edu http://linkage.rockefeller.edu/soft/linkage/sec3.3.html http://obcanskyzakonik.justice.cz/cz/rodinne-pravo/co-upravuje-rodinne-pravozakoniku/urcovani-rodicovstvi.html http://pysih.com/2010/10/05/john-schneeberger/ http://usystrdatabase.org/ http://www.4N6gen.org http://www.cssfg.org http://www.cstl.nist.gov/strbase/kinship.htm http://www.cstl.nist.gov/strbase/mutation.htm http://www.cstl.nist.gov/strbase/software.htm http://www.genebase.com/in/dnaMarkerDetail.php http://www.hku.hk/statistics/EasyDNA/ http://www.hutka.cz/ 94
http://www.isfg.org/ http://www.isfg.org/Software http://www.math.chalmers.se/~mostad/familias/ http://www.newscientist.com/article/dn2512-white-ivf-couple-have-black-twins.html http://www.prb.org/ http://www.r-project.org/ http://www.ybase.org/ http://www.yhrd.org/ http://www.ysearch.org/ https://www.bonaparte-dvi.nl
95
