Interakce buněk s materiály pro tkáňové inženýrství Lucie Bačáková Fyziologický ústav Akademie věd České republiky Vídeňská 1083 142 20 Praha 4-Krč E-mail:
[email protected]
Tkáňové inženýrství „Interdisciplinární obor, který využívá principy technických a biologických vědních oborů pro vývoj biologické náhrady, která obnoví, zachová nebo zlepší funkci tkáně či celého orgánu” (Langer and Vacanti: Science 260: 920-926, 1993)
Nově konstruovaná tkáňová náhrada se skládá z: – nosiče buněk – buněčné složky
Jako nosiče buněk lze využít:
– biologické molekuly (proteiny extracelulární matrix, např. kolagen, elastin, fibronektin, laminin, fibrin, kyselina hyaluronová) – umělý materiál (syntetické polymery, materiály na bázi uhlíku, kovy a jejich slitiny, keramika). Biomateriál= materiál vstupující do interakce s biologickým prostředím
Materiálová složka hybridních bioarteficiálních tkáňových náhrad Materiál musí být biokompatibilní (tj. tolerován buňkami, bez cytotoxického, mutagenního a imunogenního působení, s vhodnými mechanickými vlastnostmi atd.) • Bioinertní: nepodporující adhesi buněk (kloubní plochy, nitrooční čočky, současně užívané cévní protézy)
• Bioaktivní (biomimetické, biospecifické, bioanalogní): • Napodobují vlastnosti molekul
extracelulární matrix (ECM), růstové faktory, hormony, enzymy;
• Navozují specifické a
regulovatelné chování buněk
Umělý materiál je analogem ECM, který přivádí buňku na rozcestí:
Molekulární mechanismus buněčné adheze ke konvenčnímu umělému materiálu Buňka Adsorbované molekuly extracelulární matrix: Fibronektin, vitronektin, kolagen, laminin Ze séra kultivačního média či z tělních tekutin
Umělý materiál (syntetický polymer, sklo, kov, keramika, uhlíkový materiál, kompozit)
Syntetizovány i buňkami, přítomny na jejich membráně
Buňky se vážou ke specifickým místům adsorbovaných molekul ECM
Adhesní receptory:
Buňka
Integrinové neintegrinové
(tj. k určitým sekvencím aminokyselin či k cukerným ligandům) Bačáková L., Švorčík V.: Cell colonization control by physical and chemical modification of materials, In: Cell Growth Processes: New Research (Ed. Daiki Kimura), Nova Science Publishers, Inc., Hauppauge, New York, pp 556, 2008; přehledný článek
Sekvence typické pro určité proteiny: RGD….. vitronektin, fibronektin REDV….fibronektin DGEA….kolagen YIGSR, IKVAV…. laminin VAPG…….elastin
Adsorbované proteiny
Umělý materiál
Sekvence preferované určitým adhezním receptorem: RGD, KQAGDV…..integrin avb 3 REDV…. integrin a4b 1 DGEA….integrin a2b 1 YIGSR, IKVAV…. a6b 1, a7b 1 KRSR…neintegrinový adhezní receptor (heparan sulfát)
Sekvence preferované určitým buněčným typem:
KQAGDV; VAPG …. hladké svalové buňky REDV…. endotelové buňky YIGSR, IKVAV….neurony KRSR….osteoblasty
Stavba integrinového receptoru
Horton M.A.: Int. J. Biochem. Cell Biol. 29: 721-725, 1997
Po navázání ligandu: Adhezní receptory se shromažďují ve specifických nanoa mikrodoménách na buněčné membráně, jsou to fokální adhezní plaky (fokální adheze):
V placích receptory komunikují: Strukturální molekuly (paxillin, talin, vinculin) Signální molekuly (fokální adhezní kináza) Aktinový cytoskelet (spojený s enzymy, buněčnými organelami a jádrem):
Takto se signál z extracelulárního prostředí, představovaného umělým
materiálem, dostane k buněčnému genomu, a ovlivní expresi genů (která je manifestována proteosyntézou), a tím chování buňky
Regulace adsorpce proteinů a buněčné adheze Fyzikálně-chemické vlastnosti povrchu materiálu: Přítomnost určitých chemických funkčních skupin (-OH, -NH2) Povrchová energie, polarita, smáčivost Morfologie povrchu (drsnost, topografie; velikost, tvar a vzdálenost nerovností; význam nanodrsnosti) Mechanické vlastnosti povrchu materiálu (tuhost, flexibilita) Elektrické vlastnosti materiálu (náboj, vodivost)
Tyto vlastnosti ovlivňují typ, množství a geometrickou konformaci adsorbovaných molekul ECM, jejich flexibilitu a možnost reorganizace, a tím dosažitelnost ligandů v těchto molekulách adhezními receptory buněk
Vliv smáčivosti materiálu na adhezi buněk (I) Hydrofobní povrch
Kontaktní úhel vodní kapky
(nemodifikované syntetické polymery, některé uhlíkové materiály)
Hydrofilní povrch (mírně)
Polární skupiny na materiálu, např. kyslíkové
Bacakova L, Filova E, Parizek M, Ruml T, Svorcik V: Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants. A review. Biotechnology Advances, 29: 739767, 2011 IF=9,3
Proteiny: rigidní, denaturované, přednostní adsorpce albuminu (neadhesivní pro buňky)
Proteiny: flexibilní, fyziologická konformace, přednostní adsorpce proteinů zprostředkujících adhesi buněk (vitronektin, fibronektin)
Vliv smáčivosti materiálu na adhezi buněk (II) Polyetylén o vysoké hustotě (HDPE) Nemodifikovaný
ELISA (na mg proteinu)
Ar+ plasma, PEG
Paxillin, a-actinin
*
*
*
140
*
*
*
*
**
*
160 120 100 80 60
M. Parizek, N. Kasalkova, L. Bacakova, P. Slepicka, V. Lisa, M. Blazkova, V. Svorcik: Int. J. Mol. Sci. 10: 4352-4374, 2009
1E +1 5
3E +1 4 2
*
*
*
*
a-actin, SM1,2-myosins, calponin *
300
1E +1 4 +
30 keV O ions/cm
350
*
250 200 150 100 50
5
4
1E +1
30 keV O+ ions/cm2
3E +1
4 1E +1
3 3E +1
1E +1
3
0
Pr isti ne
Kontaktní úhel: 60°
3E +1 3
Pr isti ne
Absorbance (Pristine PE=100%)
Alfa-aktin
400
1E +1 3
40
Talin
Kontaktní úhel : 100°
180
*
Cévní hladké svalové buňky
Absorbance (Pristine PE=100%)
200
Průměr S.E.M. (4-6 pokusů), nepárový Studentův t-test, *: p<0.05 **: p<0.01
Vliv smáčivosti materiálu na adhezi buněk (III) Extrémně hydrofilní povrch
Mírně hydrofilní povrch Bacakova L, Filova E, Kubies D, Machova L, Proks V, Malinova V, Lisa V, Rypacek F: J Mater Sci Mater Med. 18:1317– 1323, 2007
Hladké svalové buňky aorty potkana, 3. den po nasazení
Imunofluorescence vinkulinu Kopolymer PDLLA-PEO s vysoce hydrofilním a mobilním povrchem (kontaktní úhel < 30°)
Čistý PDLLA bez PEO (kontaktní úhel ~70°)
Vliv smáčivosti materiálu na adhezi buněk (IV) Silně hydrofilní materiál
Přiměřeně hydrofilní materiál
(A 145 PBS/DLA/PEG)
(LB-AP 154 PET/DLA)
1. den
5. den
Materiály pokryty fibrinovou sítí s fibronektinem a kolagenem (ÚMCH AVČR)
Rigidita a deformabilita adhesního substrátu buněk Polyakrylamidový gel + kovalentně vázaný kolagen Tvrdý gel, E = 40 kPa
Měkký gel, E = 1 kPa Engler A., Bacakova L., Newman C., Hategan A., Griffin M., Discher D.: Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophys. J. 86: 617-28, 2004.
GFP-paxillin
Hladké svalové buňky aorty potkana, linie A7r5, transfektované konstruktem DNA kódujícím GFPpaxillin nebo GFPaktin
Drsnost a topografie povrchu materiálu „Makrodrsnost“: 100 μm a více
– Nerovnosti příliš velké pro detekci buňkami Průměr buněk v suspenzi cca 20 μm Buňka se rozprostírá přes desítky μm
– Mechanické ukotvení implantátu
„Mikrodrsnost“: 1-100 μm: duální účinek: – Menší adhezní plocha buňky, pomalejší proliferace – Obvykle vyšší úroveň diferenciace buněk
„Submikronová drsnost“: 100 nm – 1 μm: – Duální účinek s převahou pozitivního účinku na kolonizaci
„Nanodrsnost“: méně než 100 nm:
– Příznivá pro adhezi, růst a diferenciaci buněk
Vliv mikrodrsnosti na adhezi buněk Kompozity s uhlíkovou matricí vyztuženou uhlíkovými vlákny, kostní buňky linie MG 63
Nemodifikovaný CFRC (Ra = 6.5 1.8 m)
Adsorbovaný fluorescenčně značeným kolagenem IV
Leštěný a pokrytý pyrolytickým grafitem (Ra = 0.24 0.09 m)
Imunofluorescence vinkulinu v buňkách MG 63
Bačáková L., Starý V., Kofroňová O., Lisá V.: J. Biomed. Mater. Res. 54: 567-578, 2001
Vliv nanodrsnosti na adhezi buněk Synergistický účinek se smáčivostí materiálu Molekuly ECM zprostředkující adhezi buněk jsou adsorbovány ve výhodné geometrické konformaci (blízké fyziologické) Přednostní adsorpce vitronektinu (relativně malá a lineární molekula)
Prof. Thomas J. Webster
Vitronektin je rozpoznáván přednostně osteoblasty (KRSR v doméně vázající heparin vitronektinu je vázána molekulami heparan sulfátu na plasmatické membráně osteoblastů) Nanostrukturovaný materiál
Mírně hydrofilní materiál Bacakova L, Filova E, Parizek M, Ruml T, Svorcik V: Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants. A review. Biotechnology Advances, 29: 739-767, 2011 IF=9,6
Lidské kostní buňky MG 63 na kompozitech z terpolymeru PP/PTFE/PVDF a uhlíkových nanotrubiček Imunofluorescence b-aktinu nebo barvení propidium iodidem Kontaktní úhel vodní kapky: Terpolymer: 100 ± 3.9° SWCNT: 105.2 ± 2.1° MWCNT: 101.4 ± 1.4°
PP/PTFE/PVDF
PP/PTFE/PVDF
Mikrodrsnost (Ra): Terpolymer: 0.20 ± 0.04 m SWCNT: 1.03 ± 0.52 m MWCNT: 1.08 ± 0.30 m Nanodrsnost (Ra): Terpolymer: 30 ± 4.5 nm SWCNT: 150 ± 22.5 nm MWCNT: n.a.
4% SWCNT
4% MWCNT
Spolupráce s AGH Univ. of Science and Technology, Krakov, Polsko
Bačáková L, Grausová L, Vacík J, Fraczek A, Blazewicz S, Kromka A, Vaněček M, Švorčík V: Diamond Relat Mater 16: 2133-2140, 2007
Syntetický analog extracelulární matrix GRGDSG
PHSRN
PEO
PDLLA PLLA Materiál připraven ve spolupráci s Ústavem makromolekulární chemie AVČR, Praha
Ligandy pro adhesní receptory (např. oligopeptid GRGDSG s kooperující sekvencí PHSRN)
Polyethylen oxid (PEO): • vysoce hydrofilní • neumožňuje adsorpci proteinů a nekontrolovanou adhesi buněk • flexibilní řetězec zajišťuje dosažitelnost ligandů adhesními receptory Poly-DL-laktid (PDLLA): kopolymerizován s PEO Poly-L-laktid (PLLA): nosný materiál nově konstruované bioarteficiální cévní náhrady
Adhese cévních hladkých svalových buněk na polylaktidu a PEO Imunofluorescenční barvení vinkulinu, proteinu fokálních adhesních plaků; 3. den po nasazení, médium s 10% fetálního bovinního séra PDLLA
PDLLA-PEO
50 m ---------------
50 m ---------------
Buněčná adhese je podobná jako
na standardních kultivačních substrátech (polystyrén, sklo)
Je zprostředkována adsorpcí proteinů ze séra kultivačního média (vitronektin, fibronektin)
Vysoce hydrofilní a mobilní řetězce PEO nedovolují adsorpci sérových proteinů
Buňky nejsou schopny adherovat, rozprostřít se a vyvinout fokální adhesní plaky
Adhese a růst HSB na polymerech s GRGDSG 3. den po nasazení, médium s 10% séra
Imunofluorescence vinkulinu
Inkorporace BrdU
PDLLA-PEO-5% GRGDSG PDLLA-PEO-20% GRGDSG DT=17.5 h
LI=6.8 %
DT=11.7 h
50 m
LI=21.4 %
PDLLA-PEO-5% GRGDSG
Neadhesivní kopolymer PDLLA-PEO funkcionalizován Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly (GRGDSG), tj. ligandem pro integrinové adhesní receptory na buňkách Adhese a růst byly regulovatelné koncentrací ligandu Buňky byly životaschopné, syntetizovaly DNA a proliferovaly i v bezsérovém médiu ______________________________________________________________________________________ Bacakova L, Filova E, Kubies D, Machova L, Proks V, Malinova V, Lisa V, Rypacek F: J. Mater. Sci. Mater. Med. 18:1317–1323, 2007
Cévní endotelové buňky na vrstvách PGMA-PEO s různou koncentrací ligandů pro adhezní receptory (RGD, pmol/cm2) 340
200
340
200 52
0
50
Popelka Š, Houska M, Havlíková J et al.: PEO brushes prepared by "grafting to" method as a platform for the assessment of cell receptor-ligand binding. Accepted in European Polymer Journal
Shrnutí a další perspektivy moderního tkáňového inženýrství Degradabilní přirozené i syntetické polymery (polyestery, chitosan, rekombinantní proteiny) Materiál s trojrozměrnou strukturou (porézní a vláknité nosiče s hierarchicky uspořádanou makro-, mikro- a nanostrukturou) S ligandy pro adhesní receptory buněk o definovaných typech, vzdálenostech, prostorovém uspořádání
Regionálně selektivní adhese buněk, preferenční adhese určitých buněčných typů ke specifickým oligopeptidickým sekvencím, řízení buněčných funkcí velikostí a tvarem plochy adhese Užití kmenových buněk (kostní dřeň, krev, pupečník, tuková tkáň, kůže, satelitní buňky kosterního svalu)
Dynamická kultivace buněk, jejich vhodné mechanické namáhání Uvolňování faktorů řídících růst, diferenciaci a funkci buněk z umělého materiálu
Vaskularizace tkáňově inženýrských konstruktů
Děkuji Vám za Vaši pozornost!
Lidské kmenové buňky tukové tkáně na fibrinovém gelu
Odd. biomateriálů a tkáňového inženýrství FgÚ AV ČR Ivana Zajanová
Věra Lisá, prom. biol.
RNDr. Lubica GrausováDoc. MUDr. Lucie Staňková, PhD Bačáková, CSc
Mgr. Martin Pařízek, PhD Mgr. Ivana Kopová
Mgr. Elena Filová, PhD
MUDr. Jaroslav Chlupáč
Mgr. Jana Lišková, PhD
Mgr. Lucia Mgr. Marta Ing. Markéta Straňavová Vandrovcová, Bačáková PhD
Ing. Jana Havlíková
Bc. Markéta Krýslová
RNDr. Jana Musílková, CSc.
Mgr. Katarína Novotná
