Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB INSTRUKSI KERJA LABORATORIUM BIOLOGI TANAH

Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB

INSTRUKSI KERJA LABORATORIUM BIOLOGI TANAH

UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2011

1


Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah Fakultas Pertanian Universitas Brawijaya Kode Dokumen

:

0040207300

Revisi

:

2

Tanggal

:

08 Juni 2011

Diajukan oleh

:

Tim Unit Jaminan Mutu Ketua, ttd Dr. Ir. Sugeng Prijono, SU

Dikendalikan oleh

:

Sekretaris Jurusan ttd Dr. Ir. Sugeng Prijono, SU

Disetujui oleh

:

Ketua Jurusan ttd Prof. Dr. Ir. Zaenal Kusuma, SU

2


DAFTAR ISI

Halaman Daftar Isi

iii

Daftar Gambar

iii

1. Analisa Lignin …………………………………………………………………………………

1

2. Analisa Polyphenolic ………………………………………………………………………….……. 3. Fraksionasi Bahan Organik berdasarkan ukuran partikel dengan metode POM ……………………………………………………………………….………. 4. Pengamatan Makrofauna Tanah : Cacing Tanah dan Rayap……………………………………………………………………… 5. Pengamatan Mikroorganisme tanah metode Slide Contact …………………………………………………………………………………… 6. Isolasi Mikrobia dari Lingkungan ……………………………………………………………………

3 6

8 12

15

DAFTAR GAMBAR Halaman 1.

Skema prosedur fraksionasi bahan organic berdasarkan ukuran partikel (Particulate Organic Matter = POM)……………………………………………………………

7

2. Posisi Pengambilan Sampel Cacing Tanah dan Rayap di Lapangan………………

9

3


ANALISIS LIGNIN (Kode : 0040207301) 1. RUANG LINGKUP Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan mengukur kualitas bahan organik menggunakan parameter konsentrasi Lignin. 2. ALAT dan BAHAN A. Bahan pereaksi 1. Acid detergent solution 8 g CTAB ( cetylmethyl-ammonium bromide) dilarutkan dalam 400 ml H2SO4, 0.5 ( larutkan 28 ml H2SO4 pekat p.a ke dalam aquadest sampai mencapai volume 1000 ml), 2. Antifoam solution 2.5 ml silicon antifoam 30% dilarutkan dalam 100 ml aquadest. Silicon antifoam : 30 ml silicon antifoam dilarutkan dalam 100 ml aquadest, dan 3. H2SO4 72% Larutkan 720 ml H2SO4 pekat p.a ke dalam aquadest sampai mencapai volume 1000 ml. 3. REFERENSI Prosedur Layanan Analisa Laboratorium dan Panduan Analisa Biologi Tanah. 4. DEFINISI 5. URAIAN PROSEDUR 1. Timbang 0.5 g contoh tanaman (WI) dan tambahkan 25 ml acid detergent solution dan 1 ml antifoam ke dalam 250 ml botol volumetric, 2. Panaskan sampai T = 150oC selama 1 jam, setelah mendidih (turunkan suhu pada awal terjadinya pembuihan dan dikocok sambil digoyang untuk beberapa waktu), 3. Kemudian disaring dalam filter glass crucible ( W2) dan cuci dengan aceton ( 1 kali saja) dan disusul dengan air panas sampai tidak berwarna, 4


4. Crucible dan isinya di oven pada T = 105oC selama 24 jam dan didinginkan dalam desikator dan timbang ( W3), 5. Crucible dan isinya ditempatkan dalam beaker glass dan tambahkan H2SO4 72% secukupnya sampai setengah dari volume crucible dan didiamkan selama 3-4 jam, 6. Gunakan vacum pump untuk membilas / menyedot dan setelah bersih dibilas dengan air panas sampai tidak asam ( tidak berwarna dan tidak berbuih), 7. Crucible dan isi dioven pada T = 105oC selama 24 jam, dinginkan dan timbang ( W4), sedangkan isinya diabukan pada T = 500oC untuk waktu 4-5 jam, dinginkan dan timbang ( W5 ). PERHITUNGAN : ADF ( % ) = ( W3 – W2) X 100 W1 ADL (%) = (W4 – W5) X 100 W1 Keterangan : ADF : Acid Detergent Fiber ADL : Acid Detergent Lignin W : Weight (g)

5


ANALISIS POLYPHENOLIC (Kode : 0040207302) 1. RUANG LINGKUP Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan mengukur kualitas bahan organik menggunakan parameter konsentrasi polyphenolic. 2. ALAT dan BAHAN a. Bahan Pereaksi 1. Methanol 50 % Larutkan 101.01 ml methanol 99% dalam 200 ml aquadest. 2. Sodium Carbonat ( Na2CO3 17%) 25.5 g Na2CO3 dalam 124.5 ml aquadest dilarutkan dalam beaker glass. 3. Sodium tungstate ( Na2WO4) 4. Asam orthophosphoric. 5. Asam phosphomolybdic. 6. Asam tannic. 7. Reagent Folin-Denis 25g sodium tungstate + 5 g asam phosphomolybdic dan 12.5 asam orthophosphoric dimasukkan ke dalam 250 ml botol volumetrik yang berisi 187.5 ml aquadest. Kemudian di reflux selama 2 jam dan diencerkan untuk 250 ml dengan menggunakan aquadest. 3. REFERENSI Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa Biologi Tanah. 4. DEFINISI 5. URAIAN PROSEDUR Membuat Standart 1. Siapkan 0,1 mg/ml asam tannic. 2. Larutkan 0.01 g asam tannic dalam 100 ml botol volumetrik dengan aquadest. 3. Pipet 0,1,2,3,4,5 dan 6 ml dari 0.1 mg/ml asam tannic dimasukkan dalam 50 ml cuvet yang berisi 20 ml aquadest.

6


4. Tambahkan 2.5 ml reagent Folin- Denis dan 10 ml Na2CO3 17% dan kemudian dibaca dengan spectrophotometer, absorbance 760 nm. Cara Kerja : 1. Timbang 0.75 g contoh tanaman dan diekstrak dengan 20 ml methanol 50% dalam beaker glass 100 ml kemudian tutup dengan para film atau aluminium foil. 2. Didihkan dalam water bath pada T = 70-80oC selama 1 jam dan hasil ekstraksi disaring dengan kertas saring (Whatman No. 42) dan dibilas dengan menggunakan methanol 50 % kemudian diencerkan sampai 50 ml dalam botol volumetrik ( konsentrasi = 15 mg/ ml ). 3. Pipet 1 ml hasil ekstraksi ke dalam cuvet 50 ml dan tambahkan 20 ml aquadest, 2.5 ml reagent Folin Dennis dan 10 ml Na2CO3 ( sodium carbonat 17%), kemudian encerkan sampai 50 ml dengan menggunakan aquadest dan diamkan selama 20 menit. 4. Baca dengan menggunakan Spectrophotometer, absorbance 760 nm. Perhitungan : 1. Carilah persamaan regresi dari larutan standart. 2. Tentukan TAE sampel dan TAE blanko (X) berdasarkan persamaan regresi diatas.

Keterangan : TEP : Total Extractable polyphenols (mg) TAE : Tannic Acid Equivalent (mg) W : weight of sample (g)

7


Tabel Pengamatan : A. Tabel Pengamatan X Y 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 ∑=

X2

XY

Y2

Catatan : X = konsentrasi larutan standart (mg/ml), Y = absorbance Sampel 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Y bacaan

8

TAE sampel


FRAKSIONASI BAHAN ORGANIK TANAH METODE POM (Kode : 0040207303)

1. RUANG LINGKUP Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan mempelajari dinamika karbon dalam tanah, melalui pemisahan partikel bahan organik tanah berdasarkan distribusi ukuran partikel dengan menggunakan Metode POM (Particulate Organic Matter) 2. ALAT dan BAHAN 1. Satu set ayakan basah : ukuran kasa 2 mm, 250 μm, μm dan 50 μm. 2. Tanah segar. 3. Na hexametaphosphate (hanya untuk tanah liat).

150

3. REFERENSI Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa Biologi Tanah. 4. DEFINISI Fraksi BOT berukuran pasir (5.0 mm – 2.0 mm) biasanya lebih labil daripada BOT berukuran liat dan debu (Tiesen dan Steward, 1983). Bahan organic tanah yang mempunyai ukuran pasir selanjutnya oleh Cambardella dan Elliot (1992) disebut dengan bahan organic berukuran partikel (particulate organic matter = POM). Prinsip penetapan fraksi BOT berdasarkan ukuran partikel adalah menentukan jumlah absolute dan proporsi relative C dan N dari partikel organic dalam tanah. Metode penetapan fraksi POM dari TSBF (Okalebo, 1993) adalah metode yang relative cepat, murah dan tidak menimbulkan pencemaran lingkungan karena hanya menggunakan air. Klasifikasi ukuran partikelnya sedikit berbeda dengan POM dari Cambardella dan Elliot (1992); pada teknik dari TSBF POM adalah fraksi BOT berukuran 50-250 nm. POM adalah fraksi bahan organic yang mudah didekomposisi, oleh karena itu dalam mempelajari dinamika C fraksi ini sangat penting untuk ditetapkan. 9


Mengingat pentingnya fraksi BOT dalam mempelajari dinamika C di daerah tropis, maka pemilihan teknik penetapan fraksi BOT yang murah dan cepat dengan hasil yang baik sangat dibutuhkan. 5. URAIAN PROSEDUR 1. Ambil 25 g subsample tanah segar kemudian tentukan kandungan air tanahnya. Bila tanah yang dimiliki adalah tanah kering udara, maka tanah harus dibasahi terlebih dahulu pada kapasitas lapang selama 1-2 minggu, kemudian tetapkan kadar air tanahnya. 2. Atur ayakan diatas mesin kocok dengan urutan ayakan 2 mm diatas 250 μm, 150 μm, 50 μm, yang terbawah adalah penampung. 3. Timbang 500 g contoh tanah basah (segar) dan letakkan pada ayakan ukuran kasa 2mm, pengayakan basah dapat dimulai. 4. Setelah 20 menit ambil semua partikel yang terdapat pada ayakan 2 mm, 250 μm, 150 μm, dan 50 μm secara terpisah. 5. Keringkan masing-masing fraksi tersebut dalam oven pada suhu 650C selama 24 jam, timbang berat keringnya dan tetapkan kandungan C dan N nya. 6. Tetapkan juga total C dan N dari total tanah.

Gambar 1. Skema prosedur fraksionasi bahan organic berdasarkan ukuran partikel (Particulate Organic Matter = POM)

10


PENGAMATAN DAN INDENTIFIKASI MAKROFAUNA TANAH : CACING TANAH DAN RAYAP (Kode : 0040207304) 1. RUANG LINGKUP Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan melakukan pengamatan biodiversitas makrofauna (cacing tanah dan rayap) masing-masing menggunakan metode monolit yang dimodifikasi oleh BGBD (2005) dan metode transek. 2. ALAT dan BAHAN Alat yang diperlukan meliputi : 1. Cetok, 2. nampan (4 buah), 3. pinset serangga, 4. kuas lukis, 5. bingkai kuadrat dari besi ukuran 25 x 25 x 10 cm, 6. Frame 50 cm x 50 cm 7. pensil 2B, 8. kertas HVS yang telah dipotongi untuk label, dan 9. Botol film. Bahan: 1. Formalin 4% 2. Ethanol 70% 3. Air bersih 3. REFERENSI Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa Biologi Tanah. 4. DEFINISI Fauna tanah berperanan penting dalam mempertahankan: ketersediaan hara (misalnya mikoriza dan rhizobium), porositas dan infiltrasi air tanah (misalnya cacing tanah). Dengan demikian, laju limpasan permukaan dan erosi bisa dikurangi sehingga produktivitas tanah dan tanaman dapat dipertahankan. Untuk itu pemahaman akan pentingnya peran fauna tanah dalam proses-proses biologi tanah sangat diperlukan. Metode monolit untuk pengambilan sampel cacing tanah diadopsi dari prosedur ASB ( Swift and Bignell, 2001) yang 11


dimodifikasi (BGBD, 2005). Fungsinya adalah mengkoleksi cacing tanah dan makroarthropoda.

untuk

Metode standar untuk pengambilan contoh rayap di lapangan adalah metode transek semi kuantitatif 100 m X 2 m yang bisa disederhanakan menjadi 20 x 2 m. Data yang dihasilkan dari pengukuran dengan metode semi kuantitatif transek merupakan data kualitatif bukan merupakan nilai mutlak. Namun data ini memiliki tingkat keakuratan tinggi. Metode transek dideskripsikan pertama kali oleh Jones dan Eggleton (2000). 5. URAIAN PROSEDUR Skema pengambilan contoh makrofauna tanah (cacing tanah dan rayap) dapat dilihat pada Gambar 2 di bawah ini:

1. Monolith cacing tanah (0.5x0.5 m2) 2. Transek semi kuantitatif untuk pengambilan contoh rayap Gambar 2. Posisi Pengambilan Sampel Cacing Tanah dan Rayap di Lapangan.

12


A. Cara Kerja Pengambilan Sampel Cacing Tanah dengan Metode Sampling Monolit Pada setiap sistem penggunaan lahan ditentukan 4-6 titik monolit. Pada hutan ditentukan 4 monolit cacing tanah yakni 1 monolit berukuran 25 cm x 25 cm x 10 cm dan 3 monolit lainnya berukuran 50 cm x 50 cm x 10 cm, sedangkan pada lahan pertanian misalnya perkebunan sawit diambil 6 monolit masing-masing dengan ukuran 50 cm x 50 cm x 10 cm. Pengambilan contoh monolit dilakukan pada lapisan (1) seresah, di atas tanah mineral (2) tanah kedalaman 0-10 cm, (3) tanah kedalaman 10-20 cm, dan (3) tanah kedalaman 20-30 cm. B. Cara Kerja Pemilahan Sampel Cacing Tanah dengan Metode Hand Sortir 1. Lapisan tanah yang diperoleh dari tiap monolit per lapisan kedalaman dimasukkan ke dalam nampan. 2. Setiap cacing yang ditemukan diambil secara manual (hand sortir). 3. Cacing tanah tidak langsung dimasukkan ke dalam ethanol 70% tetapi terlebih dahulu dimasukkan ke dalam nampan yang sudah diisi air. Tujuan perlakukan ini pertama, untuk menghilang tanah yang menempel pada tubuhnya. Kedua, cacing dimasukkan dalam nampan kedua yang berisi etanol 70 % untuk relaksasi. Ketiga, cacing dimasukkan dalam formalin 4% selama beberapa detik hingga tubuhnya kaku. Keempat, cacing tanah siap dimasukkan dalam botol film yang berisi ethanol 70 % dan sudah diberi label. C. Cara Pengambilan Sampel Rayap 1. Tali sepanjang 20 m ditarik dan dipasang di permukaan tanah sebagai garis tengah transek (midline of transect). Jaraknya dari sub-plot pengambilan monolit adalah 8 meter. Pemilihan lokasi untuk transek dilakukan dengan mempertimbangkan jarak terhadap monolit, dan kemiringan lahan. Transek diletakkan sejajar kontur. 2. Transek dibagi dalam 4 seksi berukuran 5 x 2 m (selanjutnya disebut seksi 1, seksi 2, seksi 3, seksi 4). Tiap seksi dibagi oleh garis tengah transek menjadi 8 sub seksi 13


yaitu S1 kiri dan kanan, S2 kiri dan kanan, S3 kiri dan kanan, S4 kiri dan kanan. Satu orang kolektor bekerja di satu seksi. 3. Dalam setiap sub seksi digali 6 monolit kecil berukuran 12 x 12 x 10 cm. Pada lima menit pertama, kolektor menggali monolit 1, tanah dimasukkan ke dalam nampan. Pengambilan contoh rayap dilakukan secara in situ dengan hand sortir. 4. Contoh rayap yang diperoleh, baik dari kasta pekerja maupun prajurit, dimasukkan ke tabung film berisi etanol 70 % dan diberi label. Kolektor diberi waktu 5 menit untuk menggali, memilah, memilih dan mengkoleksi contoh ke dalam tabung film sekaligus memberikan label. Setelah lima menit pertama berlalu, kolektor segera pindah ke monolit berikutnya. Sehingga total waktu yang dibutuhkan untuk menyelesaikan pengambilan contoh pada 6 monolit kecil adalah 30 menit. 5. Selama lima belas menit berikutnya, dilakukan pengambilan contoh pada lokasi alam kecil (micro sites) yang diperkirakan representatif untuk mendapatkan rayap untuk tiap sub seksi, misalnya: a. Pada tanah yang terdapat remukan dan sisa-sisa lapukan kayu b. Posisi samping kayu-kayu mati, tunggul c. Pada tanah dengan akumulasi humus yang tebal di bawah pohon, dan diantara perakaran. d. Disamping sarang rayap, gundukan, dan sarang karton, jalan rayap pada pepohonan dan sarang-sarang di atas pohon hingga ketinggian 2 m di atas permukaan tanah.

14


PENGAMATAN MIKROORGANISME TANAH METODE SLIDE CONTACT (Kode : 0040207305)

1. RUANG LINGKUP Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan melakukan pengamatan mikroorganisme dalam tanah menggunakan metode slide kontak. 2. ALAT dan BAHAN 1. Tabung reaksi 25 ml untuk pengenceran, 2. Gelas slide yang disterilkan dengan api sebelum digunakan. 3. Larutan Bengal Rose Fenol: larutan 1.0 g Bengal Rose dan 0.01g CaCl2.2H2O dalam 100 ml akua-fenol 5% . 3. REFERENSI Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Iswandi Anas.1989. Petunjuk Laboratorium, Biologi Tanah dalam Praktek, Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Bioteknologi Institut Pertanian Bogor. 4. DEFINISI Cara slide kontak adalah pengamatan mikroorganisme tanah yang menempel pada gelas slide yang dibenamkan ke dalam tanah selama beberapa waktu. Tujuan dari cara slide kontak ini adalah untuk mengamati populasi mikroorganisme tanah dalam keadaan alami. Pemindahan mikroorganisme ke dalam gelas slide memungkinkan pengamatan yang baik karena menghilangkan kesalahan yang disebabkan oleh adanya partikel tanah. Pembenaman gelas slide dilakukan secara hati-hati ke dalam tanah, untuk mendapatkan sampel mikroorganisme tanah dilakukan dengan cara menggosokkan bongkah tanah pada permukaan slide tersebut. Bila gelas slide dibenamkan untuk beberapa waktu di dalam tanah, kelompok organisme yang dapat menempel pada permukaan slide dapat diamati. Bila dikerjakan dengan hati-hati seandainya ada pembentukan spora maka spora tersebut dapat diusahakan agar tetap utuh. 15


Demikian pula pengamatan terhadap sifat – sifat koloni, bahan yang digunakan mikroorganisme sebagai sumber energi dan responnya terhadap faktor lingkungan dan sebagainya dapat dilakukan. Cara ini mempunyai arti yang sangat penting dalam mengamati hubungan penyusunan dan morfologi mikroorganisme dalam tanah. Pembuatan foto akan sangat berguna dalam penyampaian apa yang diperoleh. Dengan memanfaatkan gelas slide yang berbeda baik dari segi waktu dan lama inkubasinya, maka urutan proses ekologi dari mikroorganisme dapat diamati dan dipelajari. Metode ini adalah metode kualitatif dan dengan cara ini isolasi sukar dilakukan. Koloni berkembang sesuai pada tempatnya pada gelas slide. Bila isolasi dan identifikasi lebih lanjut dikehendaki, hal ini dapat dilakukan akan tetapi tidak semua organisme dapat tumbuh pada media buatan. Pemasukan gelas slide ke dalam tanah akan mengubah keadaan alami dengan terbentuknya permukaan yang baru untuk kolonisasi, akan tetapi pengaruhnya sukar dievaluasi. 5. URAIAN PROSEDUR 1. Buatlah celah di dalam tanah dengan mengusahakan sedikit mungkin gangguan pada tanah. Untuk ini dapat digunakan pisau. 2. Masukkan dengan hati-hati gelas slide dengan arah vertikal, sampai tersisa kira-kira 1.5 cm dari permukaan tanah. Tekan kembali tanah ke arah gelas slide. 3. Gelas slide diinkubasi sesuai dengan waktu yang dikehendaki, biasanya sekitar 1-3 minggu. 4. Bersihkan permukaan gelas slide sebelah atas dari tanah, kemudian tarik gelas slide dari belahan yang tidak terganggu dengan mengangkat gelas slide tersebut secara hati-hati. Setelah agregat tanah yang menempel pada gelas slide dilepaskan, kering udarakan gelas slide tersebut. Dengan bantuan aliran air, partikel tanah yang menempel pada permukaan tanah yang tidak terganggu dilepaskan dengan hati-hati sampai hanya ada lapisan tipis yang tertinggal. Bersihkan permukaan gelas slide pada

16


belahan yang terganggu dengan kain basah yang steril. Lengketkan mikroorganisme tanah pada gelas slide dengan membiarkan gelas slide tersebut kering udara dan panaskan di atas nyala api. 5. Tempatkan gelas slide di atas bejana air yang mendidih dan basahi selama 6 sampai 10 menit dengan Bengal Rose Fenol. Bila perlu tambahkan Bengal Rose Fenol agar gelas slide tersebut tidak kering. Buang kelebihan pewarna dengan mencuci gelas slide dengan air sampai tidak ada pewarna yang tercuci bersama air cucian. 6. Keringkan gelas slide tersebut dan amati gelas slide dengan menggunakan mikroskop.

17


ISOLASI MIKROBIA DARI LINGKUNGAN (Kode : 0040207306) 1. RUANG LINGKUP Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan melakukan isolasi mikrobia dari lingkungan. 2. ALAT dan BAHAN Alat dan bahan yang diperlukan dalam kegiatan pembuatan media dan sterilisasi secara aseptik yakni Erlenmeyer, cawan petri, kertas payung, plastik wrapping, kapas, benang kasur, autoklaf, Media TPC sebagai media isolat total mikrobia, Nutrien Agar (NA) sebagai media isolat bakteri, Potato Dextrose Agar (PDA) sebagai media isolat fungi. Berikut ini alat dan bahan yang diperlukan untuk sterilisasi dengan pembakaran Jarum oose, bunsen, korek api, media padat dalam cawan petri (berisi Na/PDA). Sedangkan alat dan bahan berikut ini digunakan dalam sterilisasi dengan Panas basah Bertekanan Tinggi (autoklaf): Media PDA dan NA dalam tabung reaksi, cawan petri steril, kertas payung, kapas, benang kasur dan inkubator. Alat dan bahan yang diperlukan dalam isolasi mikrobia dari lingkungan : 1. Sampel air rendaman bahan kompos. 2. Aquades steril dalam erlenmeyer (45 ml) 3. Aquades steril dalam tabung reaksi (9 ml) 4. Media Nutrien agar (NA) 5. Media Potato Dextrose Agar (PDA) 6. Oose 3. REFERENSI Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa Biologi Tanah. 4. DEFINISI Mikrobia yang berasal dari lingkungan, berada dalam populasi campuran. Mikrobia di alam sangat jarang berada dalam spesies tunggal. Dalam bidang bioteknologi, ketersediaan biakan murni sangatlah penting. Selain itu pemeliharaan kemurnian isolat 18


selama penyimpanan juga sangat perlu mendapatkan perhatian, karena berkaitan dengan didapatkannya produk atau metabolit tertentu dari suatu spesies tunggal yang hanya dapat dipelajari apabila spesies tunggal mikroba terpisah dari populasi campuran. Untuk itu perlu dilakukan isolasi/pemisahan untuk mendapatkan mikroba biakan murni. Untuk melakukan isolasi mikroba alat-alat yang digunakan dalam kegiatan di laboratorium harus disterilisasi. Sterilisasi adalah suatu usaha atau tindakan untuk membebaskan alat atau media dari mikroba. Hal ini diperlukan agar mikroba yang ingin ditumbuhkan, diamati dan diisolasi terbebas dari mikroba lain. Suatu alat atau bahan dikatakan steril bila alat atau bahan terbebas dari mikroba, baik dalam bentuk sel vegetatif maupun spora. Dengan kata lain dalam bahan dan alat yang akan digunakan tidak didapatkan mikroba yang tidak diharapkan kehadirannya, baik yang menggangu atau merusak media. Sterilisasi terdiri dari beberapa cara. Pemilihan cara sterilisasi ditentukan berdasarkan sifat alat atau bahan yang akan disterilisasi dan tujuan sterilisasi. Bekerja dengan mikroorganisme membutuhkan teknis aseptis untuk mencegah ataupun mengurangi kontaminasi yang tidak diinginkan, karena setiap benda yang digunakan maupun pekerja dilaboratorium dapat menjadi kontaminasi. 5. URAIAN PROSEDUR 1. Prosedur umum yang harus diperhatikan dalam teknik aseptis yakni : a. Disinfektan area kerja. Meja yang akan digunakan terlebih dahulu diberi disinfektan untuk membunuh mikroorganisme yang ada. b. Jarum oose. Pemindahan mikroorganisme dari kultur cair maupun padat ke medium lain membutuhkan jarum oose. Sterilisasi dari jarum oose ini dengan cara membakar jarum tersebut dengan api bunsen hingga berwarna merah. Sterilisasi ini dilakukan sebelum maupun setelah jarum digunakan. c. Mulut tabung. Sterilisasi pada mulut tabung reaksi atau erlenmeyer dapat dilakukan dengan membakar mulut tabung setelah tutup kapas dibuka dan sesaat sebelum menutup kembali.

19


d. Cawan petri. Sebelum cawan petri dibuka untuk melakukan inokukasi maupun setelah ditutup, tepi cawan petri didekat di api bunsen. Selama inokulasi, bagian cawan petri yang terbuka, didekatkan ke api bunsen untuk mencegah kontaminasi mikroba yang berasal dari udara. 2. Prosedur Sterilisasi A. Pembuatan Media dengan sterilisasi secara Aseptik Cara kerja: a) Media TPC, Nutrien Agar dan Potato Dextrose Agar ditimbang masing-masing 2 gram. b) Masing-masing media dilarutkan dalam aquades 100 ml. c) Dilarutkan sampai mendidih. d) Masukkan dalam erlenmeyer dan ditutup dengan kapas. e) Semua bahan dan alat dimasukkan dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan 1 atmosfir, dan dengan suhu 1210C. B. Sterilisasi dengan pembakaran Cara kerja: a) Nyalakan lampu bunsen, atur nyala api secara maksimal. b) Ambil jarum oose, bakar mulai dari bagian pangkal kawat oose secara perlahan menuju ujung kawat jarum oose. Pembakaran jarum oose ini dilakukan sampai kawatnya merah membara. c) Goreskan masing-masing jarum oose tersebut pada permukaan media padat dalam cawan petri. d) Inkubasi media tersebut pada 300C selam 48 jam. e) Amati mikroba yang tumbuh. C. Sterilisasi dengan Panas Basah Bertekanan Tinggi (autoklaf) Cara Kerja: 1. Tutup tabung reaksi yang berisi media dengan kapas, beberapa tabung diikat jadi satu dan bagian tutupnya dibungkus dengan kertas payung. Sisakan satu tabung untuk tidak disterilkan. 2. Isi autoklaf dengan aquades sampai permukaan air dibawah ansang autoklaf. 3. Masukkan semua alat dan bahan kedalam autoklaf.

20


4.

Tutup autoklaf dan kencangkan setiap mur pada penutupnya sampai kencang. 5. buka klep pada pengatur tekanan uap air, dan biarkan sampai mendidih. 6. Tutup klep tersebut setelah air mendidih dan media disterilkan selama 15 menit pada suhu 1210C dan tekanan 1 atmosfir. 7. Setelah selesai sterilisasi maka matikan autoklaf dan tunggu sampai dingin. 8. Buka autoklaf dan tunggu sampai media agak dingin (450C). 9. Tuangkan media (PDA dan NA) pada cawan petri steril. 10. Inkubasi media tersebut selama 48 jam dengan suhu 380C. 11. Amati pertumbuhan mikroba. 3. Isolasi Mikrobia dari Lingkungan Teknik isolasi/pemisahan dilakukan dengan berbagai cara, antara lain: melakukan pengenceran berseri dilanjutkan dengan mebiakkan pada media yang sesuai yaitu dengan metode cawan tung (pour plate) dan cawan gores (streak plate) Cara Kerja : 1. Pembuatan Seri Pengenceran Bahan yang akan dijadikan sebagai bahan pembuatan isolat merupakan air rendaman yang berasal dari bahan kompos kampus yang telah diinkubasi kemudian direndam selama 7 hari, diambil sebanyak 5 ml kemudian secara aseptis masukkan ke dalam 45 ml aquades steril. Kemudian dilakukan homogenitas dengan memvortek sampel. Sampel yang telah homogen ini disebut dengan pengenceran 10 -1. Dari sampel ini diambil 0,1 ml dan dimasukkan kedalam cawan Petri steril dan ditambahkan dengan media yang sesuai. Dari pengenceran 10-1 diambil 1 ml dan secara aseptis dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi 9 ml aquades steril dan dihomogenasi dengan vortek. Pengenceran ini disebut dengan pengenceran 10 -2. Dari pengenceran ini diambil 1 ml sampel untuk dimasukkan pada tabung reaksi berisi aquades berikutnya. Dan 0,1ml dimasukkan kedalam cawan petri steril. Dengan

21


cara yang sama akan didapatkan pengenceran 10-3 dan seterusnya sampai pada pengenceran 10-6. 2. Metode Cawan Tuang (pour plate) Masing –masing pengenceran berseri tersebut, diambil 0,1 ml sampel dan dimasukkan dalam cawan petri steril. Untuk mengisolasi bakteri maka ditambahkan dengan media Nutrien Agar, sedangkan untuk mengisolasi jamur ditambahkan media Potato Dextrose Agar. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar, untuk bakteri selama 24 jam sedangkan untuk jamur dilakukan inkubasi selama 3 x 24 jam. 3. Metode Cawan Gores (steak plate) Media Nutrien Agar dan Potato Dextrose agar dituangkan secara aseptis kedalam cawan petri steril. Biarkan memadat. Setelah media memadat, sampel dari pengenceran berseri diambil dengan menggunakan oose dan dilakukan teknik penggoresan. Sampel yang digores cukup satu oose. Sebelum berpindah dari satu kuadran ke kuadran berikutnya oose disterilkan terlebih dahulu, selanjutnya penggoresan dilanjutkan kembali . Dua metode ini dilakukan secara bergantian agar dapat diketahui metode mana yang dapat menghasikan banyak bakteri. 4. Penyimpanan Biakan Murni Biakan murni (isolat) yang diperoleh dari tiga tahap, selanjutnya dapat disimpan pada jangka waktu yang lama, dengan cara memindahkan kedalam media agar miring (slant agar) yang mengandung media yang sesuai (Nutrien agar atau Potato Dextrose agar).

22

Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB INSTRUKSI KERJA LABORATORIUM BIOLOGI TANAH

Recommend Documents