INSTITUT OCHRANY OBYVATELSTVA

INSTITUT OCHRANY OBYVATELSTVA

INFORMAČNÍ ZPRAVODAJ

Ročník

16

Číslo

Lázně Bohdaneč

1 / 2005

2

3

SBORNÍK PŘEDNÁŠEK z XVI. celostátního semináře o separační che mii a analýze toxických látek Lázně Bohdaneč 20. – 22. 6. 2005

4

5

OBSAH ČAPOUN, T. – KRYKORKOVÁ, J.: Analýza plynů a par multikomponentním plynovým FTIR analyzátorem GASMET DX-4000

strana

7

FIŠERA, O. – ŠEBESTA, F.: Kompozitní filtry pro selektivní separaci a stanovení radionuklidů v životním prostředí

14

GRIČ, L. – SÜSSMILCH, J. – VINŠOVÁ, H. – KŘÍŽOVÁ, V.: Kinetika loužení vybraných toxických látek z produktů solidifikace kalů

18

HORNA, A.: Vybrané aplikace separačních, koncentračních a detekčních technik pro analýzu toxických látek

31

HOSKOVCOVÁ, M. – HALÁMEK, E. – KOBLIHA, Z.: Studium enzym-inhibitorových komplexů typu acetylcholinesteráza-organofosforová bojová látka

44

JEŽOVÁ, V. – EISNER, A. – CHALÁNKOVÁ, J. – VENTURA, K.: Úloha extrakčních a chromatografických technik v analýze explosiv a jejich reziduí

57

KUKLETA, P. – OSVALD, J.: Identifikace nebezpečné látky z havárie cisterny na dálnici D1 ze dne 2. září 2004

65

MALÍŘ, F. – ROUBAL, T. – SEVERA, J. – ŘIČAŘOVÁ, B. – ROLEČKOVÁ, E. – MAREŠOVÁ, H.: Některé toxikologicky významné mykotoxiny a možné zdravotní riziko

75

MATOUŠEK, J.: Biomedical sampling and analysis in verifying alleged use of chemical weapons

79

NAVRÁTIL, O. – KOBLIHA, Z. – HALÁMEK, E.: Zneschopňující látky

91

PATARIDU, R. – JEDINÁKOVÁ-KŘÍŽOVÁ, V.: Separace produktů konjugace v systému ligand-protein pomocí kapilární elektroforézy

97

PAVLOSEK, J.: Derivatizační postupy v chromatografických metodách – příklady aplikací v hygienických laboratořích

103

REKOVÁ, M. – JEDINÁKOVÁ-KŘÍŽOVÁ, V.: Metody pro charakterizaci konjugátů radionuklid – ligand – protilátka

107

SEVERA, J. – MALÍŘ, F. – ROUBAL, T.: Stanovení ochratoxinu A v moči metodou HPLC

116

6

SÝKORA, V. – HYLÁK, Č.: DSK ochranných filtrů typu MOF na vybrané průmyslové škodliviny

121

VACKOVÁ, M.: T-2 Mykotoxin a jeho možné zneužití

135

VEČERNÍK, P. – JEDINÁKOVÁ-KŘÍŽOVÁ, V.: Sledování difúze radionuklidů v aniontových formách ve zhutněném bentonitu

136

VINŠOVÁ, H. – VEČERNÍK, P. – JEDINÁKOVÁ-KŘÍŽOVÁ, V.: Hodnocení vlivu důležitých parametrů ovlivňujících sorpci 99TcO4- na bentonitu za anaerobních podmínek

143

Pozvánka na další seminář

153

7

ANALÝZA PLYNŮ A PAR MULTIKOMPONENTNÍM PLYNOVÝM FTIR ANALYZÁTOREM GASMET DX-4000 Tomáš Čapoun, Jana Krykorková Resumé Přednáška popisuje možnosti využití Multikomponentního plynového analyzátoru Gasmet DX-4000 při plnění úkolů chemickém průzkumu a monitorování nebezpečných chemických látek v ovzduší ve prospěch orgánů a zasahujících jednotek HZS. Kromě jeho hlavního určení jsou ukázány další široké aplikační možnosti. 1

URČENÍ PŘÍSTROJE

Multikomponentní plynový FTIR analyzátor Gasmet DX-4000 (obr. 1) je přenosný infračervený spektrometr s Fourierovou transformací, který je určen k identifikaci a stanovení plynů a par ve směsích. Jeho aplikační možnosti zahrnují především: • monitorování emisí v životním prostředí, • kontrolu koncentrace plynů a par • monitorování ovzduší v pracovním prostředí. Přístroj umožňuje jednoduchou kalibraci na jednotlivé látky a jejich analýzu pomocí počítačového zpracování spekter naměřených plynových směsí.

Obr. 1: Multikomponentní plynový FTIR analyzátor Gasmet DX-4000

8

2

POPIS PŘÍSTROJE

Analyzátor, stejně jako jiné IR spektrometry, sestává ze zdroje IR záření, interferometru, vyhřívané plynové kyvety, detektoru a zařízení ke zpracování výstupního signálu. Vzorek plynu je do plynové kyvety nasáván pomocí neoprenového membránového čerpadla o maximálním přetlaku 1 bar a maximálním průtoku 2,8 l/min. Pumpa umožňuje přepínat pomocí kohoutu vstup na přívod kalibračního plynu a plynného vzorku. Vedle pumpy je přípojka na proplachování plynové kyvety nosným plynem, zásuvky na připojení napájecí šňůry 230 V a šňůry na připojení k zapalovači vozidla (12 V) a hlavní vypínač, který spolu s kohoutem k otevírání a uzavírání pumpy tvoří jediné ovládací prvky. Analyzátor je dále vybaven 2 držáky k uchycení nosného popruhu. Činnost analyzátoru, jeho kontrola a vyhodnocování naměřených dat jsou plně řízeny a prováděny externím PC pomocí software CALCMET. Počítač je k analyzátoru připojen přes rozhraní RS 232. Software CALCMET dokáže ze změřeného spektra vzorku postupně odečítat spektra látek uložená v knihovně, a tak ve směsi plynů identifikovat a stanovit koncentraci až 30 různých látek najednou. Výsledkem je přehled látek přítomných ve vzduchu (včetně vodních par a oxidu uhličitého) a jejich koncentrace. • • • • • • • • • • • • •

Software dále umožňuje zobrazit: výsledky analýzy ve formě: hodnoty koncentrace, sloupcový diagram a maximum zbytku v AU po analýze; výsledky analýzy spolu se spektry vzorku a zbytku; průměrné hodnoty posledních výsledků analýzy; časový průběh koncentrace až pěti vybraných komponent při jejich monitorování; výsledek posledního prohlížení knihovny; spektrum vzorku; zbytek mezi naměřeným spektrem vzorku a modelem vypočítaného spektra (tzv reziduální spektrum); referenční spektrum; referenční spektrum spolu se zbytkem mezi naměřeným spektrem vzorku a modelem vypočítaného spektra; referenční spektrum spolu se spektrem vzorku; spektrum pozadí; přehled komponent zahrnutých do analýzy, pro každou komponentu počet referenčních spekter, počet interferujících látek a spektrální rozsahy; aktuální stav analyzátoru.

Při měření je možné volit měření pozadí (provádí se na dusík), kontinuální nebo jednoduché měření vzorků při parametrech měření, z nichž se volí a nastavují: • času měření a intervalů při kontinuálním měření vzorků; • parametry kalibrace nuly a ostatních kalibračních plynů; • adresáře a názvy souborů pro automatické ukládání spekter vzorků, zbytků a spekter pozadí; • formát výsledků dat analýzy; • stupnice pro zobrazování spekter a časových průběhů koncentrací na obrazovce; • aplikační knihovny pro analýzu;

9

3

TECHNICKÁ DATA Obecné parametry přístroje:

Typ měřených dat: Teplota okolí při měření: Skladovací teplota: Napájecí napětí: Interferometr: Rozlišení: Scanovací frekvence: Detektor: Zdroj IR: Materiál beamsplitteru: Materiál oken: Rozsah vlnočtů: Rychlost komunikačního portu: Nosný plyn pro kalibraci a měření pozadí: Rozměry: Hmotnost:

IR spektrum, název látky, koncentrace plynu 0 – 20 oC, optimální 15 – 25 oC – 20 – +60 oC 12 VDC nebo 100-240 VAC/50-60 Hz karuselový interferometr Temet© 8 cm-1 10 spekter/s MCT termoelektricky chlazený keramický, SiC, teplota 1550 K ZnSe ZnSe 700 – 4200 cm-1 57600 bps dusík čistoty minimálně 4.0 433 x 185 x 425 mm 16 kg

Plynová kyveta Optická délka: Materiál povrchu: Materiál oken: Objem: Teplota: Maximální tlak vzorku plynu: Průtok: Doba odezvy: Požadovaná filtrace vzorku:

9,8 m rhodium ZnSe 1,07 l 52 oC 2 bar 1 – 5 l/min < 60 s odstranění pevných částí > 2 µm

4

APLIKAČNÍ MOŽNOSTI

4.1

Odběry vzorků vzduchu

Multikomponentní plynový FTIR analyzátor Gasmet DX-4000 je v Institutu ochrany obyvatelstva hlavním plynovým analyzátorem mobilní laboratoře a vybaven interním čerpadlem, umožňujícím vlastní odběr. Kromě toho je pro další aplikace k dispozici odběrové čerpadlo na plyny PCXR4. K tomu byly úspěšně ověřeny následující 4 postupy odběru vzorků vzduchu: A. Odběr interním čerpadlem FTIR analyzátoru ve vozidle Odběrová hadice se jedním koncem našroubuje na kondenzační filtr, který je připojen na vstup, a druhý konec se zastrčí do prachového filtru, umístěného ve vstupním kohoutu vozidla. Výstupní hadice se odpojí v rychlosvorce a umístí se do digestoře. Spustí se odtah digestoře (v případě, že je vozidlo připojeno na elektrocentrálu nebo vnější síť 220 V) a zapne se větrání laboratoře (tj. vzduch dovnitř). Interní čerpadlo FTIR analyzátoru se zapne. Postup umožňuje odběr přímo ve vozidle při průjezdu oblakem plynu, při stání v místech úniku plynu nebo při monitorování v požadovaných prostorech.

10

B. Odběr interním čerpadlem FTIR analyzátoru mimo vozidlo Jeden konec odběrové hadice se našroubuje na kondenzační filtr, který je připojen na vstup analyzátoru, druhý konec odběrové hadice se vysunutím odpojí od prachového filtru a prostrčí se otvorem ven z vozidla. Mimo vozidlo se připojí odběrová teleskopická tyč. Výstupní hadice z analyzátoru se připojí rychlosvorkou k výstupnímu kohoutu, který se otevře. Interní čerpadlo FTIR analyzátoru se zapne. Postup umožňuje odběr vzorků vzduchu z požadovaných míst a prostorů mimo vozidlo, a to ze vzdálenosti až 8 m od vozidla. Odběr je ukázán na obrázku 2. C. Odběr odběrovým čerpadlem na plyny PCXR4 ve vozidle Výstup odběrového čerpadla se připojí na kondenzační filtr, který je připojen na vstup analyzátoru. Vstup odběrového čerpadla se připojí na prachový filtr, umístěný ve vstupním kohoutu vozidla. Výstupní hadice z analyzátoru se umístí do digestoře. Spustí se odtah digestoře (v případě, že je vozidlo připojeno na elektrocentrálu nebo vnější síť 220 V) a zapne se větrání laboratoře (tj. vzduch dovnitř). Odběrové čerpadlo PCXR4 se zapne a průtok se nastaví na 3 l/h. Postup umožňuje odběr přímo ve vozidle při průjezdu oblakem plynu, při stání v místech úniku plynu nebo při monitorování v požadovaných prostorech. D. Odběr odběrovým čerpadlem na plyny PCXR4 mimo vozidlo Výstup odběrového čerpadla se připojí na kondenzační filtr, který je připojen na vstup analyzátoru. Vstupní hadice čerpadla se prostrčí otvorem ven z vozidla. Mimo vozidlo se připojí odběrová teleskopická tyč. Výstupní hadice z analyzátoru se připojí rychlosvorkou k výstupnímu kohoutu, který se otevře. Odběrové čerpadlo PCXR4 se zapne a průtok se nastaví na 3 l/h. Postup umožňuje odběr vzorků vzduchu z požadovaných míst a prostorů mimo vozidlo, a to ze vzdálenosti až 8 m od vozidla. Odběr je ukázán na obrázku 2.

Obr. 2: Odběr vzorků vzduchu mimo vozidlo

11

4.2

Měření referenčních spekter výfukových plynů

Cílem této části ověřovacích zkoušek bylo změřit infračervená referenční spektra výfukových plynů vozidla a elektrocentrály Multikomponentním plynovým FTIR analyzátorem Gasmet DX-4000. Účelem práce bylo získání uvedených spekter a jejich zařazení do knihovny spekter k vyloučení jejich rušivého vlivu v případech odběru vzorků vzduchu za provozu vozidla či chodu elektrocentrály. Odběr obou výfukových plynů byl proveden odběrovým čerpadlem na plyny PCXR4 mimo vozidlo. Naměřená IR spektra byla uložena do knihovny IR spekter k využití. 4.3

Monitorování zplodin hoření

Cílem bylo ověřit možnost dlouhodobého monitorování chemických škodlivin v ovzduší. K tomu byl zapálen oheň, do kterého byly postupně vkládány různé materiály, jako umělé textilie, PVC podlahová krytina aj. K monitorování zplodin hoření byl zvolen Multikomponentní plynový FTIR analyzátor Gasmet DX-4000. Odběr zplodin byl prováděn interním čerpadlem FTIR analyzátoru mimo vozidlo, jak je ukázáno na obrázku 3. Jako nejvýznamnější zplodiny vedle vody a oxidu uhličitého byly identifikovány oxid uhelnatý, oxidy dusíku, chlorovodík aj. Při zpracování výsledků byly zjišťovány jejich průměrné a nejvyšší koncentrace a dále časové závislosti koncentrací. Výsledky uvádí obr. 4.

Obr. 3: Monitorování zplodin hoření – odběr zplodin mimo vozidlo

12

Obr. 4: Výsledky monitorování zplodin hoření

4.4

Analýza organického rozpouštědla

V rámci expertizní činnosti chemické laboratoře bylo úkolem zasahující jednotky HZS identifikovat dvě organická rozpouštědla v nalezených sudech. Byly odebrány vzorky kapalin, které byly dovezeny na Institut ochrany obyvatelstva. Vzorky byly nejdříve zplyněny v proudu dusíku při 150 oC pomocí dynamické kalibrační jednotky SYCOS K-DPG. Spektra plynů byla změřena Multikomponentním plynovým FTIR analyzátorem Gasmet DX-4000. Výsledné hodnoty koncentrace identifikovaných látek v plynné směsi byly přepočítány na koncentrace v kapalné fázi. Ve velmi dobré shodě byla identifikována rozpouštědla. Výsledky ukazuje tabulka 1. Tab. 1: Výsledky analýzy organických rozpouštědel Vzorek č. 1 2

Identifikované látky Toluen Ethylacetát Ethanol n-Butanol iso-Butanol Toluen

Konc. v plynné fázi CP, ppm 123 64 366 7,1 56 108

Odpovídající Odpovídající Druh objem kap. složení, rozpouštědla fáze, % obj. CP . M / ρ 13072 67,6 S 6031 6262 32,4 21363 55,3 S 6010 650 1,7 5175 13,4 11478 29,6

Složení, % obj. 68 32 57 15 28

13

4.5

Identifikace a stanovení těkavých organických látek ve vodě

K identifikaci a stanovení těkavých organických látek ve vodě pomocí Multikomponentního plynového FTIR analyzátoru Gasmet DX-4000 byl použit postup podobný metodě „head-space“ v plynové chromatografii. Do zábrusové Erlenmeyerovy baňky objemu 1000 ml bylo předloženo 500 ml vzorku vody a přidáno 10 g pevného chloridu sodného. Baňka byla uzavřena zábrusovým kohoutem a vložena na 15 minut do vroucí lázně. Po této době bylo ústí kohoutu připojeno přes vysoušecí trubici s chloridem vápenatým k čerpadlu přístroje (obr. 5). Kohout byl otevřen a provedeno nasátí par nad vodou. Pro různé látky byly sestrojeny kalibrační křivky. Byly zjištěny následující hodnoty mezí stanovitelnosti pro některé látky: • chloroform: 1 μg/l • toluen: 3 μg/l • cyklohexan: 5 μg/l • benzen: 10 μg/l • trichlorethylen: 10 μg/l • ethylacetát: 30 μg/l • aceton: 100 μg/l • ethanol: 300 μg/l • methanol: 500 μg/l

Obr. 5: Uspořádání při analýze těkavých organických látek ve vodě Kontaktní adresa: Tomáš Čapoun, Jana Krykorková, MV – GŘ HZS ČR, Institut ochrany obyvatelstva, Na Lužci, 533 41 Lázně Bohdaneč, [email protected].

14

KOMPOZITNÍ FILTRY PRO SELEKTIVNÍ SEPARACI A STANOVENÍ RADIONUKLIDŮ V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Ota Fišera, Ferdinand Šebesta 1

ÚVOD

• • • •

Filtry se zachycenou aktivní složkou umožňují: zpracovat velkoobjemové vzorky použít vyšší průtokovou rychlost ušetřit čas zjednodušit radiochemickou analýzu

• • •

Cíle práce ověření navrženého způsobu přípravy optimalizace způsobu přípravy ověření funkčnosti připravených filtrů

2

POSTUPY IMPREGNACE

• • • •

Impregnace kompozitními anorganickými měniči iontů kompozitní materiály: AMP-PAN, MnO-PAN, CaPMo1000-PAN, KNiFC-PAN impregnační roztok: rozpouštědlo PANu (HNO3, DMSO) + PAN + 1. složka iontoměniče koagulační/srážecí roztok: vodný roztok 2. složky iontoměniče filtry vysušené x filtry vlhké

• • •

Použité filtry: skleněné mikrovláknité filtry; GF/C (Whatman); BMA,BMB a BMD (Munktell) průměr 47 mm, plošná hmotnost 55 – 143 g/m2, minimální velikost zachytávaných částic 1 – 2,7 µm Sorpce: AMP-PAN MnO-PAN CaPMo1000-PAN KNiFC-PAN

~ vodovodní voda, 0,1M HNO3 + 137Cs ~ vodovodní voda (pH = 8) + 57Co ~ vodovodní i dest. voda, 0,1M HNO3 + 85Sr ~ vodovodní voda, 0,04M HNO3 + 137Cs

• •

Výsledky: ověřen zcela nový způsob přípravy impregnovaných filtrů u všech připravených filtrů docházelo k záchytu radionuklidů

• •

Nedostatky připravených filtrů: pokles průchodnosti (volná sraženina nebo kompozitní materiál) nerovnoměrnost rozložení akt. složky

• •

Optimalizace: koncentrace PANu v impreg. roztoku ● vícenásobné filtry statická x dynamická koagulace ● vlhké x vysušené filtry

15

Sorpce cesia na vlhkých filtrech GF/C KNiFCPAN a BMB KNiFC-PAN 80 průnik [%]

GF/C KNiFC-PAN; v = 3,6 ml/min

60 40

BMB KNiFC-PAN; v = 3,5 ml/min

20 0 0

200

400

600

800

1000

objem [ml]

Vliv vysušení filtrů na sorpci Sorpce kobaltu na filtrech GF/C MnO-PAN 50 v = 5,1 ml/min; vysušený

40

v = 1,6 ml/min; vysušený 30

v = 7,9 ml/min; vlhký v = 1,1 ml/min; vlhký

20 10 0 0

500

1000

1500

2000

2500

objem [ml]

Pokles průtokové rychlosti během experimentu Závislost okamžité průtokové rychlosti roztoku na zpracovaném objemu roztoku pro vlhké filtry GF/C MnO-PAN

10 v [m l/m in]

•

průnik [%]

•

Nerovnoměrné rozložení aktivní složky zachycené množství kompozitního materiálu na filtru: GF/C KNiFC-PAN = 5,2 mg BMB KNiFC-PAN = 13,2 mg nerovnoměrné rozložení aktivní složky (skvrny)

8 6 v = 7,9 ml/min v = 3,8 ml/min v = 1,1 ml/min

4 2 0 0

500

1000

1500

objem [ml]

2000

2500

16

● ●

Zvýšení kapacity filtru příprava trojitých filtrů (současná impregnace 3 filtrů) zachycené množství kompozitního materiálu na filtru: GF/C CaPMo1000-PAN = 40,9 mg 3 GF/C CaPMo1000-PAN = 62,7 mg

průnik [%]

Sorpce stroncia z destilované vody na filtrech GF/C CaPMo1000-PAN 100 80 60 40 20 0

trojitý, vlhký filtr; v = 0,6 ml/min vlhký filtr; v = 0,5 ml/min

0

● ●

200

400 objem [ml]

600

800

Rozpouštění AMP ve filtru během experimentu AMP = molybdátofosforečnan amonný (NH4)3P(Mo3O10)4.3H2O zachycené množství kompozitního materiálu = 107,3 mg Sorpce cesia na vlhkých filtrech GF/C AMP-PAN 70 v = 1,1 ml/min v = 10,1 ml/min

průnik [%]

60 50 40 30 20 10 0 0

3 • • • •

300

600

900 1200 objem [ml]

1500

1800

ZÁVĚR ověřen zcela nový způsob přípravy impreg. filtrů u všech filtrů docházelo k záchytu vybraných radionuklidů pokles průchodnosti ~ volná sraženina, uvolnění kompozit. materiálu vysušení filtrů ~ bez vlivu na rozpustnost AMP ~ pomalejší kinetika záchytu radionuklidu (GF/C MnO-PAN)

17

Tab. 1: Základní charakteristika filtrů impregnovaných kompozitním materiálem kompozitní materiál typ filtru AMP-PAN MnO2-PAN CaPMo1000-PAN

KNiFC-PAN

PAN

m0 [mg] mimp [mg] Δm [mg] cPAN [g/100 ml]

GF/C GF/C

96,9 97,1

204,2 111,2

107,3 14,1

GF/C

97,6

138,5

40,9

3 GF/C

292,8

355,5

62,7

GF/C

95,9

101,1

5,2

BMB

247,1

260,3

13,2

GF/C

98,1

102,8

4,7

BMB

249,0

263,5

14,5

4,4 2,8 4,4

2,8

2,8

m0 – hmotnost filtrů před impregnací; mimp – hmot. impregnovaného, vysušeného filtru; Δm = mimp - m0; cPAN – koncentrace PANu v impregnačním roztoku Kontaktní adresa: Ota Fišeraa,b, Ferdinand Šebestaa České vysoké učení technické v Praze, Centrum pro radiochemii a radiační chemii, Břehová 7, 115 19 Praha 1, e-mail: [email protected]. b České vysoké učení technické v Praze, Fakulta jaderná a fyzikálně inženýrská, Katedra jaderné chemie, Břehová 7, 115 19 Praha 1, e-mail: [email protected]. a

18

KINETIKA LOUŽENÍ VYBRANÝCH TOXICKÝCH LÁTEK Z PRODUKTŮ SOLIDIFIKACE KALŮ Lukáš Grič, Josef Süssmilch, HanaVinšová, Věra Křížová, 1

ÚVOD

Vývoj nové technologie solidifikace nebezpečných odpadů je komplexní záležitost, beroucí do úvahy fixované vlastnosti odpadů, hranice možností navrženého pojiva a proveditelnost procesu v reálných podmínkách s dostupnými technickými prostředky. Produkt solidifikace je unikum vzniklé ze specifického druhu odpadu aplikací k tomuto účelu vybraného a v laboratorních podmínkách ověřeného pojiva s použitím technologie jeho zpracování "šité na míru". Z chemie cementů je známo, že nečistoty ve vodě mohou být skutečným problémem a podstatně mohou ovlivnit chemizmus tuhnutí a cílové vlastnosti betonu a kvalita vody je jedním z hlavních faktorů sledovaných při aplikaci cementů v průmyslu. U kapalných odpadů nemáme možnost výběru, neboť "nečistoty" ve vodě jsou právě vtělenou vlastností odpadů. Proto musí být podrobně studována a objasněna interakce pojiva a ostatních látek tvořících fixační medium se složkami odpadů. Z hlediska havarijních scénářů úložišť či skládek nebezpečných odpadů musí být zároveň studovány procesy a mechanizmy separace jednotlivých toxických složek z produktů solidifikace v případě kontaktu těchto produktů s podzemní vodou.Tato znalost je nezbytná zejména pro věrohodnou předpověď dlouhodobého chování produktu solidifikace, pro vylepšení vlastností produktu solidifikace a pro optimalizaci a výběr vhodných složek směsí fixačního media. Potenciál využitelnosti nízkoteplotní technologie zpevňování kontaminovaných odpadů založené na využití aluminosilikátových matric spadá do oblasti, kde podle zákona o odpadech zákona č. 185/2001 Sb., o odpadech a zákona č. 18/1997 Sb. (atomový zákon) je nutné provádět solidifikaci odpadů před uložením na skládky NO a úložiště RAO. Proces solidifikace Vývoj technologie solidifikace musí zohledňovat jak specifika odpadu a tomu odpovídající návrh matrice a optimalizovaný postup solidifikace, tak i technologickou proveditelnost v daných podmínkách a respektovat kriteria přijatelnosti produktu na úložiště či skládku nebezpečného odpadu. Například výzkum a vývoj může zahrnovat účinky těžkých kovů a organických složek na stabilitu a kvalitu produktu, zatímco vlastní proces zpracování musí respektovat technologickou proveditelnost a ekonomicky přijatelné řešení. Výběr modelového odpadu z hlediska potřeb procesu solidifikace musí být proveden tak, aby byl možný návrh vhodného fixačního media pro danou skupinu odpadů, neboť jak je obecně známo, neexistuje univerzální solidifikační medium. Je třeba zohlednit, aby v odpadu byly přítomny složky, které ovlivňují chemizmus procesu stabilizace. Jinými slovy přiblížit se co nejvíce reálným odpadům. Proces solidifikace založený na využití aluminosilikátových matric aktivovaných silně alkalickými roztoky vykazuje určité přednosti před klasickými matricemi, zhotovenými z portlandského cementu. V literatuře je uváděna dlouhodobá stabilita aluminosilikátového

19

produktu uloženého v geologických podmínkách a zejména jeho schopnost vázat v určité míře do své struktury kationty některých elementů v místě negativního náboje na atomu hliníku, jak vyplývá z následujícího zjednodušeného sumárního schématu: | | | n(Si2O5,Al2O2) + 2nSiO2 + 4nH2O + NaOH nebo (KOH) → (Na+,K+)-(-Si-O-Al(-)-O-Si-O) + 4H2O (Si-Al surovina) | | | (polymerní aluminosilikátová mříž)

Nejedná se tudíž o pouhou enkapsulaci (zapouzdření) dané látky, ale o její částečné navázání do struktury polymerních řetězců [1]. Ve srovnání s klasickými cementovými matricemi poskytuje tato vlastnost možnost zpevňovat se zvýšenou účinností i soli rozpustné ve vodě. Cílem předkládané práce je porovnat retenční schopnosti alkalicky aktivované aluminosilikátové matrice pro vybrané toxické elementy, které jsou přítomny v produktu solidifikace v oxidické, méně rozpustné formě s produkty solidifikace obsahujícími rozpustné soli těchto elementů. U připravených produktů solidifikace byly stanoveny jejich některé fyzikální vlastnosti a následně byly vzorky vystaveny účinku vodného prostředí pro stanovení míry vyluhovatelnosti jednotlivých forem vybraných toxických elementů. Protože v reálných podmínkách se sledované toxické elementy nacházejí zpravidla jako doprovodná složka určitého typu odpadu (převážně kalů), byla jako makrosložka modelového odpadu použit železitý kal z úpravy technické vody a k tomuto kalu bylo přidáno určité množství sledované toxické látky (viz níže). Je tudíž třeba jednoznačně stanovit příčinnou souvislost vztahu mezi fyzikálněchemickými vlastnostmi kalu a vlastnostmi produktu solidifikace, zvláště jeho retenční schopnosti pro předmětné elementy. Pouze na základě dobré znalosti tohoto vztahu je možné produkovat spolehlivě solidifikované kaly s dostatečnou zárukou jejich dlouhodobé stability. • •

Zpracováním odpadů musí být dosaženo dvou hlavních cílů: Zabezpečení dlouhodobé stability produktu solidifikace Dlouhodobé udržení hodnot uvolňování nebezpečné látky na dostatečně nízké úrovni tak, aby nebylo ohroženo životní prostředí.

Únik sledovaných nebezpečných látek z produktu solidifikace je ve většině případů vázán na hydrolytickou odolnost produktů solidifikace, proto musí být provedeny testy, které stanoví mechanizmus úniku nebezpečné látky ve vodném prostředí. 2

EXPERIMENTÁLNÍ PROVEDENÍ Příprava modelových kalů

Pro přípravu modelových kalů byl použit v praxi se často vyskytující monotypický kal pocházející z úpravny technické vody z elektrárny Temelín, který obsahoval více jak 90 hmot.% vody a téměř 10 hmot.% pevného podílu, převážně hydratovaného oxidu železitého, kontaminovaného adsorbovanými nečistotami látek v relativně nízké koncentraci.

20

Tab.1: Složení kalu Fe Obsah sušiny(%) 9,84

RL (mg/l) 326

pH 7,1

SO42– (mg/l) 19,9

NEL (mg/l) 0,16

Fe (mg/l) 60,1

RL Rozpustné látky NEL Nerozpustné látky ve vodné fázi Fe Obsah železa ve vodné fázi Byly připraveny dva typy modelových kalů: A) S méně rozpustnou, oxidickou formou toxického elementu Modelový kal s obsahem 90% hmot. kalu Fe a 10% hmot. oxidu. (k 90 g kalu bylo přidáno 10 g příslušného oxidu). B) Modelový kal s obsahem rozpustné soli toxického elementu. Kal Fe byl smísen s rozpustnou solí těžkého kovu v takovém poměru, aby výsledný modelový kal obsahoval 2% hmot. příslušného kovu. Tab.2: Označení připravených vzorků v sérii „A“ a „B“ A–oxidická forma Označení vzorku Použitý oxid N–PbO PbO N–AsO As2O3 N–CrO Cr2O3 N–CdO CdO

B–rozpustná forma Označení vzorku Rozpustná sůl R–Pb Pb(NO3)2 R–Cr1 Cr(NO3)3·9H2O R–Cr2 K2CrO4 R–Cd Cd(NO3)2·4H2O

Příprava produktů solidifikace Na základě předchozích zkušeností, byla pro přípravu produktů solidifikace vybrána matrice na bázi komerčně dostupného metakaolinu STANDARD. Jako alkalický aktivátor byl použit metakřemičitan sodný Na2O⋅SiO2 ⋅ 5H2O. Odvážené množství modelového kalu bylo smíšeno za laboratorní teploty s křemičitanem sodným. Směs byla zahřívána na parní lázni na 75°C po dobu 10 min. Po této době došlo k rozpuštění metakřemičitanu, což mělo za následek výrazné ztekucení kalu. Vzniklá směs byla ochlazena na laboratorní teplotu. Ztekucený kal byl následně smíšen s odpovídajícím množstvím metakaolinu STANDARD viz tabulka č.3. Tab. 3: Procentické složení připravených vzorků: Modelový kal Fe Metakaolin STANDARD Rozpustný metakřemičitan sodný

33 hmot.% 36 hmot.% 31 hmot.%

Směs byla homogenizována v hnětači HOBART po dobu 10 min na první rychlosti (po 5 min čištění) za vzniku lepivé, avšak tekuté záměsi. Pro porovnání reologických

21

vlastností připravených záměsí byla stanovena roztékavost jednotlivých záměsí Suttardovým viskozimetrem viz tabulka č.4.

Stanovení roztékavosti pomocí Suttardova viskozimetru Od každého vzorku byly připraveny kostky pro stanovení nárůstu pevnosti v tlaku o rozměrech 40×40×40 mm a 20×20×20 mm pro stanovení hydrolytické odolnosti. Vytvrzení proběhlo ve vlhkém boxu při vlhkosti vzduchu 95 % a teplotě 24°C. Počátek tuhnutí se u všech vzorků pohyboval okolo 120 minut. Odformování bylo provedeno po 24 hod a vzorky byly umístěny zpět do vlhkého boxu do okamžiku měření. Fyzikální vlastnosti produktu Pevnost zatuhlého produktu solidifikace Pevnost produktů solidifikace je jednou z nejcharakterističtějších veličin. Produkty s vysokou pevností naznačují, že byla dodržena optimální technologie přípravy záměsi a její zhutnění. Vysoká pevnost produktu též naznačuje, že se pravděpodobně jedná o materiál s nízkou porozitou a tím i potenciálně vyšší chemickou odolností. Proto je snahou při přípravě produktů solidifikace dosáhnout i co nejvyšší pevnosti produktu. Stanovení pevnosti v tlaku bylo provedeno podle normy: ČSN EN 196 – 1 [2], v akreditované laboratoři firmy SQZ,s.r.o.

22

Stanovení kinetiky loužení (sumární, jednotlivé toxické elementy) Pro stanovení hydrolytické odolnosti produktů solidifikace je používána řada standardizovaných metod loužení. Z časového hlediska se jedná o náročné testy, které charakterizují vybranou vlastnost produktu solidifikace. V případu této práce se jednalo o vzájemné porovnání inkorporační schopnosti navržených matric s modelovými odpady. Nebylo tudíž žádoucí stanovit „absolutní“ hodnotu loužitelnosti jednotlivých produktů solidifikace některou ze standardizovaných, ale postačilo použití zjednodušených testů stanovení hydrolytické odolnosti. V práci byly stanoveny rychlosti vyluhování jednotlivých toxických látek uvedených v tabulce č.2 během prvního týdne loužení, kdy dochází k výraznému poklesu rychlosti vyluhování. Testované vzorky byly ponořeny do 100 ml redestilované vody o pH = 7 v PE nádobě. Po uplynutí stanovené doby byl vzorek z nádobky vyjmut a výluh byl použit k analýzám. Ihned po vyjmutí z loužící nádobky byl vzorek vložen do další nádoby a opět přelit 100 ml čerstvé redestilované vody a ponechán do následujícího odběru. U všech odebraných výluhů bylo změřeno pH, Eh a měrná vodivost. Celkové množství vyloužených látek pocházejících z matrice, železitého kalu a toxické složky bylo vypočteno z hmotnosti odparku. Stanovení obsahu vyloužených toxických elementů ve výluhu bylo provedeno metodou AAS. Stanovení obsahu Pb, Cr, Cd a As metodou AAS Stanovení obsahu olova, chrómu, kadmia a arsenu ve vodném výluhu bylo provedeno na atomovém absorpčním spektrometru Spectr AA880 pro plamenovou techniku firmy Varian s plamenem acetylen vzduch. Před vlastním stanovením studovaných prvků musela být nejdříve provedena prekondiciace nádobí. Nádobí používané při analýze bylo prekondiciováno loužením ve zředěné kyselině dusičné (1:3) po dobu 24 hodin a následným 24 hodinovým loužením v redestilované vodě. Pro ředění vzorků byl použit roztok 1%-ní kyseliny dusičné v redestilované vodě. Kalibrační řady pro jednotlivé prvky byly připraveny ředěním příslušných standardů (1000 mg/l, Analytika s.r.o.) roztokem 1%-ní kyseliny dusičné v redestilované vodě. Koncentrace studovaných prvků ve vodném výluhu byla vypočtena z rovnice kalibrační přímky dané specie. 3

VÝSLEDKY A DISKUSE V následující tabulce č.4 jsou uvedeny výsledky roztékavosti připravených vzorků. Tab. 4: Roztékavost stanovená s použitím Suttardova viskozimetru: Označení vzorku N–PbO N–CrO N–AsO N–CdO R–Pb R–Cr1 R–Cr2 R–Cd

Průměr ”koláče” [mm] 178 175 195 160 175 165 178 180

23

Stanovením roztékavosti se nepřímo stanovuje technologický parametr „čerpatelnost“, který souvisí s možností gravitačního vyprázdnění mísiče. Roztékavost 150 mm byla experimentálně stanovena jako postačující k vyprázdnění více jak 90% obsahu mísiče v daném uspořádání. Průměrné hodnoty naměřených veličin, které se pohybují v intervalu 160 – 195 mm vyhovují z technologického hlediska. Z uvedeného nelze učinit obecný závěr, že roztékavost je výrazně ovlivněna formou toxického elementu. Sedmidenní pevnost samotné matrice, to je produktu připraveného bez přídavku kalů pouze s přídavkem odpovídajícího množství vody, se pohybuje v intervalu 65 až 72 MPa [3]. Z hodnot naměřené pevnosti produktů solidifikace (matrice + kaly) je vidět, že pevnost produktů v tlaku je v porovnání s čistou matricí výrazně nižší. Dosažené pevnosti jsou však dostatečně vysoké pro zabezpečení integrity produktu. Sedmidenní pevnost byla stanovena zejména proto, že po 7 dnech vytvrzování vzorků byly zahájeny testy loužitelnosti. Experiment stanovení dlouhodobé pevnosti v tlaku nadále probíhá. Tab. 5: Pevnost v tlaku po 7 dnech Označení vzorku N–PbO N–CrO – N–AsO N–CdO

Pevnost v tlaku po 7 dnech [MPa] 26,6 30,4 – 23,4 28,5

Označení vzorku R–Pb R–Cr1 R–Cr2 – R–Cd

Pevnost v tlaku po 7 dnech [MPa] 22,8 24,9 20,9 – 24,9

Hydrolytická odolnost produktů solidifikace Orientační představu o stabilitě produktu solidifikace získáme z měření vodivosti, případně stanovení odparku. Vodivost roztoku daného systému spolu s odparkem poskytuje rychlou a snadno měřitelnou představu o množství látek a iontovém podílu nacházejících se v roztoku. Naměřené hodnoty zahrnují jak příspěvek matrice, tak i železitého kalu a toxického elementu. V následujících tabulkách je uvedena rychlost vyluhování stanovená měřením odparku (celková rychlost loužení) v porovnání s rychlostí loužení toxického elementu (stanovené analýzou výluhu). Oxidická forma Tab. 6: Srovnání rychlosti loužení celkové a selektivní pro N–PbO (PbO) Čas [dny] 1 2 3 4 5 6

Rychlost loužení [mg/cm2den] Celková* Pb 13,4 0,0058 4,4 0,0027 1,9 0,0017 1,6 0,0008 <0,5 0,0005 <0,5 0,0003

Tab. 7: Srovnání rychlosti loužení celkové a selektivní pro N–AsO (As2O3) Čas [dny] 1 2 3 4 5 6

Rychlost loužení [mg/cm2den] Celková* As 25,2 7,67 8,4 2,58 3,4 1,02 1,7 0,48 0,9 0,23 <0,5 0,13

24

Tab. 8: Srovnání rychlosti loužení celkové a selektivní pro N–CrO (Cr2O3)

Tab. 9: Srovnání rychlosti loužení celkové a selektivní pro N–CdO (CdO)

Rychlost loužení [mg/cm2den] Rychlost loužení [mg/cm2den] Čas Čas [dny] [dny] Celková* Cr Celková* Cd 1 9,9 0,0004 1 9,8 0,305 2 3,7 <0,0002 2 3,0 0,223 3 1,3 <0,0002 3 1,4 0,125 4 1,1 <0,0002 4 1,3 0,085 5 <0,5 <0,0002 5 <0,5 0,041 6 <0,5 0,012 6 <0,5 <0,0002 *Celková: Rychlost vyluhování stanovená z odparku výluhu Rozpustná forma Tab. 10: Srovnání rychlosti loužení celkové a selektivní pro R–Pb (Pb(NO3)2)

doba [dny] 1 2 3 4 5 6

Rychlost loužení [mg/cm2den] Celková* Pb 14,3 0,00130 4,5 0,00071 1,9 0,00038 1,1 0,00029 <0,5 0,00025 <0,5 <0,0002

Tab. 12: Srovnání rychlosti loužení celkové a selektivní pro R–Cr1 (Cr(NO3)3·9H2O)

Tab. 11: Srovnání rychlosti loužení celkové a selektivní pro R–Cd (Cd(NO3)2·4H2O) doba [dny] 1 2 3 4 5 6

Rychlost loužení [mg/cm2den] Celková* Cd 14,3 0,000190 4,4 0,000100 2,1 0,000058 1,4 0,000036 <0,5 0,000022 <0,5 <0,00002

Tab.13: Srovnání rychlosti loužení celkové a selektivní pro R–Cr2 (K2CrO4)

Čas Rychlost loužení [mg/cm2den] Čas Rychlost loužení [mg/cm2den] [dny] [dny] Celková* Cr Celková* Cr 1 22,9 0,00032 1 16,8 2,950 2 4,5 0,00032 2 5,0 0,520 3 1,7 0,00024 3 1,8 0,062 4 1,2 0,00028 4 1,1 0,013 5 <0,5 <0,0002 5 <0,5 0,004 6 <0,5 <0,0002 6 <0,5 <0,002 *Celková: Rychlost vyluhování stanovená z odparku výluhu Porovnání údajů celkové a selektivní rychlosti vyluhování jednotlivých elementů vidíme, že celková rychlost vyluhování stanovená z odparku výluhu a tím i celkové vyloužené množství látky je podstavně vyšší, než je tomu u jednotlivých elementů. To je

25

způsobeno jednak tím, že hmotnost analyzovaného vzorku je vyšší (téměř o dva řády) než je množství toxického elementu v nich obsažených a jednak tím, že v odparku z výluhu se nachází vedle analyzované složky především zbytky vyloužených nezreagovaných komponent matrice. Hodnota rychlosti vyluhování stanovená z odparku (v tabulce uvedená jako celková) se po jednom týdnu loužení pohybuje v hodnotách řádu 10-4 g/cm2d, což je hodnota velmi nízká, ve srovnání na příklad s produkty solidifikace na bázi portlandského cementu. Rychlost vyluhování jednotlivých toxických elementů z produktů solidifikace Přesnou představu o rychlosti vyluhování jednotlivých toxických elementů získáme analýzou výluhů. V následujících grafech je zobrazena změna rychlosti loužení sledovaných látek v závislosti na čase.

0,006

2

Rychlost loužení [mg/cm den]

0,007

0,005

0,004

0,003

0,002

0,001

0 0

1

2

3

4

5

6

Čas [dny]

Obr. 1: Změna rychlosti loužení Pb v čase pro vzorek N–PbO.

7

26

9

7

2

Rychlost loužení [mg/cm den]

8

6 5 4 3 2 1 0 0

1

2

3

4

5

6

7

Čas [dny]

Obr. 2: Změna rychlosti loužení As v čase pro vzorek N–AsO.

0,0005

0,0004

2

Rychlost loužení [mg/cm den]

0,0004

0,0003 0,0003 0,0002 0,0002 0,0001 0,0001 0,0000 0

1

2

3

4

5

6

Čas [dny]

Obr. 3: Změna rychlosti loužení Cr v čase pro vzorek N–CrO.

7

27

0,0012

2

Rychlost loužení [mg/cm den]

0,0014

0,0010

0,0008

0,0006

0,0004

0,0002

0,0000 0

1

2

3

4

5

6

7

Čas [dny]

Obr. 4: Změna rychlosti loužení Cd v čase pro vzorek N–CdO.

0,0012

2

Rychlost loužení [mg/cm den]

0,0014

0,0010

0,0008

0,0006

0,0004

0,0002

0,0000 0

1

2

3

4

5

Čas [dny]

Obr. 5: Změna rychlosti loužení Pb v čase pro vzorek R–Pb.

6

7

28

0,00030

2

Rychlost loužení [mg/cm den]

0,00035

0,00025

0,00020

0,00015

0,00010

0,00005

0,00000 0

1

2

3

4

5

6

7

Čas [dny]

Obr. 6: Změna rychlosti loužení R v čase pro vzorek R–Cr1 .

3,50

2

Rychlost loužení [mg/cm den]

3,00

2,50

2,00

1,50

1,00

0,50

0,00 0

1

2

3

4

5

6

Čas [dny]

Obr. 7: Změna rychlosti loužení chromu v čase pro vzorek R–Cr2 (K2CrO4).

7

29

0,00020

0,00016

2

Rychlost loužení [mg/cm den]

0,00018

0,00014 0,00012 0,00010 0,00008 0,00006 0,00004 0,00002 0,00000 0

1

2

3

4

5

6

7

Čas [dny]

Obr. 8: Změna rychlosti loužení Cd v čase pro vzorek R–Cd. Přestože obsah jednotlivých sledovaných toxických elementů byl v modelovém odpadu poměrně vysoký, to je výrazně vyšší než je obvyklé u reálných kalů (10% hm. oxidických složek a 2% kovového kationu u rozpustných solí), bylo naměřené vyloužené množství těchto látek z produktů solidifikace velmi nízké a pohybovalo se v jednotkách či zlomcích jednotek ppm. Obecně se rychlost vyluhování ve sledovaném intervalu snížila přibližně o jeden řád. Tato skutečnost svědčí o dobré záchytné schopnosti vybrané matrice pro vybrané elementy, což potvrzují i výsledky stanovení celkového vylouženého množství jednotlivých elementů uvedené v tabulce č 14. Tab.14: Množství vylouženého toxického elementu z produktu solidifikace po jednom týdnu loužení vyjádřené v procentech. Označení vzorku N–PbO N–AsO N–CrO N–CdO

Vyloužené množství [hmot.%] 0,063 84,808 0,007 0,013

Označení vzorku R–Pb R–Cr1 R–Cr2 R–Cd

Vyloužené množství [hmot.%] 0,07 0,05 98,47 0,01

30

U sledovaných sloučenin je jejich celkové vyloužené množství (až na arsen a chroman draselný) velmi nízké a pohybuje se v setinách procenta, což nasvědčuje o výborné retenční schopnosti dané matrice. Matrice není vhodná pro solidifikaci sloučenin arsenu a chromanu draselného, které se z matrice louží ve významném množství. Je překvapivé, že jiná rozpustná sůl chrómu - dusičnan chromitý je vázána v matrici uspokojivým způsobem. 4 •

•

•

•

ZÁVĚR Retenční schopnost matrice je významně selektivní a je tudíž třeba ji prověřit pro každý element přítomný v odpadu zvlášť. Kromě toho je třeba určit i jednotlivé formy výskytu sledovaného elementu, neboť jak je vidět na příkladu chrómu je záchytná schopnost závislá i na formě inkorporovaného elementu. Proces solidifikace s využitím aluminosilikátových matric probíhá v silně alkalickém prostředí, které vytváří podmínky pro chemické reakce, jež mohou změnit formu v odpadu přítomného elementu. Tak je tomu například v případě oxidu arsenitého, který v alkalickém prostředí přechází na rozpustné formy jako jsou AsO2(OH)2- a AsO33-. S výjimkou inkorporovaného arsenu a alkalického chromanu poskytuje vybraná aluminosilikátová matrice velmi kvalitní produkty s vysokou hydrolytickou odolností. Rychlost vyluhování je po jednom týdnu loužení (až na výše uvedené výjimky) nižší než 10-6 g/cm2d. Množství rozpuštěných solí stanovené z odparku výluhů vykazuje řádově vyšší hodnoty, než je tomu u sledovaných toxických elementů, jejichž obsah ve výluhu byl stanoven metodou AAS. Zatím co odparek stanovuje celkové množství solí přítomných ve výluhu, to znamená, že obsahuje i vyloužené nezreagované složky matrice, hodnoty získané analýzou výluhu podávají informaci o množství uvolněných toxických elementů. Z tohoto pohledu informace získaná stanovením vodivosti výluhu podává informace o podílu rozpustných iontových forem či jeho odparku charakterizující spíše „rozpustnost“ vlastní netoxické matrice než její retenční schopnost pro jednotlivé toxické elementy. Tu je nutné stanovit analýzou výluhu.

Tato práce byla vypracována za finanční podpory MPO, v rámci projektu FI-IM/113 „Nízkoteplotní technologie zpevňování kontaminovaných kalů založené na využití aluminosilikátových matric“ a projektu MSM 6046137307. LITERATURA: [1] Van Jaarseld 1997: Van Jaarseld J.G.S., Van Deventer J.S.J., Lorenzen L., Toxic Metals Immobilization, Part I: Theory and Applications. Minerals Engineering, 10, 659-669 (1997). [2] ČSN EN 196 – 1: Metody zkoušení cementu – Část 1: Stanovení pevnosti. [3] Závěrečná zpráva úkolu MPO: FI-IM/113 „Nízkoteplotní technologie zpevňování kontaminovaných kalů založené na využití aluminosilikátových matric“. Chemcomex Praha, a.s. 2004. Kontaktní adresa: Lukáš Grič, Josef Süssmilch, Chemcomex Praha, a.s. Pražská, 102 21 Praha 10, e- mail: [email protected]. HanaVinšová, Věra Křížová, Vysoká škola chemicko – technologická, Ústav analytické chemie, Technická 5, 166 28 Praha 6, e- mail: [email protected].

31

VYBRANÉ APLIKACE SEPARAČNÍCH, KONCENTRAČNÍCH A DETEKČNÍCH TECHNIK PRO ANALÝZU TOXICKÝCH LÁTEK Aleš Horna Porous Graphite Electrode

Flow from the column

Cutaway of the ESA CoulArray Cell Pack

a)

Counter and Reference Electrodes

Flow Channel

Channel 1

Channel 4

Channel 2

Lack Of Selectivity And Sensitivity With Dual Amperometric Electrodes

Channel 3

32

b) Dual Coulometric Electrodes Are Selective And Sensitive

Fat Soluble Vitamins Linearity and Lower Limit of Detection (LOD)

LOD a Linearity b Precision c 2 pg injected r % R.S.D. Retinol 3.8 0.999 0.60 Lutein 11.6 0.999 1.95 7.2 0.999 0.80 γ-Tocopherol 5.1 0.999 0.65 α-Tocopherol 11.7 0.999 1.28 Retinyl Palmitate 18.8 0.999 2.39 Lycopene 74.2 0.989 7.80 α - Carotene 9.8 0.968 0.69 β - Carotene 7.5 0.999 6.32 Coenzyme Q10 9.8 0.997 ND Vitamin K1 a Limit of detection, signal to noise ratio of 3:1. b Linearity studied using dilutions of commercial standards. Five concentration levels (n=2) were assayed over the range of 0 to 1µg/ml. Correlation coefficient (r2) from least squares regression analysis of peak height vs. concentration. c Intra- assay precision, % relative standard deviation (%R.S.D.) using 18 replicates of a pooled serum extracted and analyzed using the NIST high control as the external standard. Name

Corona™ CAD™ Superior Performance Corona CAD vs. Other Detection Methods

33

More Consistent Response Factors l l l l

Consistent inter-analyte response independent of chemical structure Can be used routinely for quantitation Superior technology for achieving more accuracy in relative mass measurements Example: Similar response for a wide diversity of chemical structures

34

Superior Reproducibility l l l l

Consistent, reproducible performance High precision (RSD typically less than 2%) Well suited to routine analyses in discovery, development and QC environments Example: Overlaid results of 10 identical injections of glucose, caffeine, propranolol and chlorpromazine

Corona CAD vs. RI l

Example: Corona CAD provided gradient performance not achievable with RI in the detection of: — Glucose — Caffeine — Propranolol — Chlorpromazine

35

Conventional supports are slow and have poor capacity for large biomolecules

Schematics showing the flow characteristics and design of: A. B. C. D. E. F.

CIM® - possible formats

Monolith is ...?

totally porous particles, perfusion particles, nonporous particles, Superficially porous particles membranes and monoliths

36

CIM Convective Interaction Media® Main Characteristics Characteristics of CIM® supports • Simple handling eliminating time-consuming column packing and repacking. Since air bubbles are not trapped in the monolithic structure, they are just washed out with the mobile phase, the target molecule can be eluted in a very concentrated elution buffer by pushing a small volume of the elution buffer with compressed air out of the monolithic unit. • Reduced biomolecule inactivation due to short contact times with the chromatographic matrix. • Optimised surface area for big molecules - high binding capacity for very large biomolecules (> 10 mg pDNA/ml and about 20 mg gDNA/ml). Methacrylate monolith O

+

O

O

O

O

O

GMA

EDMA

Glycidyl methacrylate

O O O

O O

O

O

O

O

O

O

O

O

O O

O O

O

O

O

O

O

O

O

O O O

O

O

O

O

O

O

O O

O

O

O O

O O

O O

O O

O

O O

O

O O

O

O O

O

O O

O

O O O

O O

O O

O

Ethylene glycol dimethacrylate

O O O

O

O

O O

O

O

O O

O

Poly(glycidylmethacrylate-co-ethyleneglycoldimethacrylate)

CIM® BIA Separations; Swift Isco Monolithic history

37

Commercially available disk monolithic columns

CIM® disk monolithic columns, BIA Separations Extremely fast gradient separation of proteins using a CIM® column

relativeabsorbance absorbanceatat280 280nm nm(mAU) (mAU) relative

200 200 180 180 160 160 140 140 120 120 100 100 80 80 60 60 40 40 20 20 00 00

22

44

66

88

10 10

12 12

time time(sec) (sec)

Gradient separation of 14 oligonucleotides in IEX on a CIM® monolithic column

150 150 55

100 100

88 66

33 11

77

44

16 16

80 80

10 10 12 12

100 100

99 14 14

60 60

15 15

40 40

50 50

20 20

00

00 00

0.5 0.5

11

1.5 1.5

22 time time(s) (s)

2.5 2.5

33

3.5 3.5

44

bufferAA %%buffer

relativeabsorbance absorbanceatat260 260nm nm(mAU) (mAU) relative

22

38

Chromatographic separation of phenols using Chromolith™ with a flow- and solvent gradient

time (min.) 1) 2,4,6-trichlorophenol, 2) pcp, 3) 2,4-dinitrophenol, 4) 4-chlorophenol, 5) 2-chlorophenol, 6) 2-methyl-4.6-dinitrophenol Dynamic binding capacity of pDNA on different supports

Column (lenght x diameter)

Capacity µg pDNA/ml 240

CCC Form % 94

gDNA ng/µg Plasmid n.d.

DEAE methacrylate particle based column (35x10mm ID) CIM® DEAE disk 7900 93 80 monolithic column (3x12 mm ID) DEAE sepharose 270 92 0.25 particle based column (50x10mm ID) DEAE silica 34 83 32 particle based column (30x10mm ID) Courtesy of R. Necina, Boehringer Ingelheim, Vienna, Austria Virus Concentration and Separation using CIM® supports Viruses, fields of application CIM monolithic supports for virus concentration and separation PLANT VIRUSES Cucumber mosaic virus Tomato mosaic virus HUMAN VIRUSES Measles virus Mumps virus

RNA ng/µg Plasmid 43

LAL EU/ml

28

0,3-3

44

0,3-3

217

<0,3

<0,3

39

Viruses Ø nucleic acid molecule + protein capsid (coat) + (lipid bilayer membrane with proteins) Ø submicroscopic pathogens that cause diseases Ø obligate parasites, requiring the presence of living cells for their replication and development They vary in: Ø Size Ø Shape Ø Type of nucleic acid Ø Isoelectric point Ø Host

Applicability of purification and concentration of viruses Ø Gene therapy High purity of the virus, virus should be infective Ø Vaccination Ø Immunisation High purity of the virus Ø Enables virus detection (ELISA, PCR) Higher concentration of the virus Techniques to purify and concentrate viruses Ø Precipitation Ø Ultrafiltration time-consuming, expensive and sometimes ineffective Ø Ultracentrifugation Ø Liquid chromatography Optimal conditions for concentration of viruses are unique for each virus! CIM for virus concentration and separation? Ø large channels allow viruses to permeate the matrix Ø convective flow, short columns → enhances the speed of the separation process (important for stability of the virus) Plant viruses Ø transmission of different plant viruses by water Ø highly diluted virus in irrigation water → still able to infect plants Monitoring of irrigation waters for the presence of viruses after the concentration step. Ø working with human viruses demands high safety measures Plant viruses as model. Cucumber mosaic virus (CMV) Virus Cucumber mosaic virus (CMV)

Size (nm) 30

Shape/ virion surface isometric

Genome

pI

A260/A280

ss RNA, Linearsegmented

pH=4,7

1,7

40

Propagation plant: Nicotiana tabacum cv. Samsun Purification protocol: Lot et al.

Concentration of CMV using CIM® DEAE disk

Fra ctio n 1

1180

Fra ction 2

F ra ction 3

100 90

980

80 70

780

60 50

580

40 380

30 20

180

10 -20

0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

T ime (min) 5 μl

20 μl

50 μl

100 μl

200 μl

g ra die nt

Buffer A: 20mM Tris-HCl, pH=8; Buffer B: Buffer A + 1,5M NaCl, pH=8 Step gradient: 100% A-100%B-100% A, flow rate: 6 ml/min Quantity of CMV before and after the concentration 100000

Number of CMV units / ml

10000

1000

100

10

1 5 ul

20 ul

50 ul

100 ul

200 ul

Volume (ul) of CMV clarificate / 0,5L of Tris-HCl buffer

Detection limit of the ELISA method ~ 6 CMV “units” / ml

41

Infectivity of CMV after the concentration Test plant: Chenopodium quinoa Ø Second fraction → no symptoms Ø All fractions together → no symptoms Ø CMV clarificate in buffer A → symptoms Ø CMV clarificate in buffer B → no symptoms Ø CMV clarificate in buffer A → through HPLC system without the disk → no symptoms Reason: CMV is relatively labile virus Tomato mosaic virus (ToMV) Virus

Size (nm)

Shape/ virion surface

Genome

pI

A260/A280

Tomato mosaic virus (ToMV)

300 x 18

Rod like non-enveloped

ss RNA, Linear Non-segmented

pH=4,6

1,17

Propagation plant: Nicotiana clavelandii Purification protocol: Van der Vlugt Virus clarificate: A260=1,9 → 0,6 mg ToMV/ml

30

carbonate b.

40

carbonate b.

50

carbonate b.

60

tris-HCl b.

Yield (%)

70

acetate b.

80

citrate phosphate b.

90

phosphate b.

100

phosphate b.

Selection of the CIM® disk and pH of the buffer system

20 10 0

4.5

5.5

6.5

7.5

8.5

9.5

10.5

11.5

pH of the buffer CIM DEAE

CIM QA

Highest yield at pH 5.5 and 7.5. In this pH range CIM® QA disk has higher yield.

42

Separation of ToMV using CIM® QA disk 100

Buffer system at pH 5.5 A: 20mM sodium acetate B: buffer A+1.5M NaCl

90 80

A280 (mAu)

70 60

Buffer system at pH 7.5 A: 20mM phosphate buffer B: buffer A+1.5M NaCl

50 40 30 20 10 0 0

1

2

3

4

Time (min)

pH 5.5

pH 7.5

Salt gradient (0-1.5M NaCl)

Concentration of ToMV using CIM® QA disk ToMV diluted in 0,5 L 20mM NaAc fract

fract

100

fraction 1 fraction 1

575 575

fraction 3 fraction 3

fr action 2 fr action 2

100 100

90

50

90 90 475 475

80

80 80

40

60 50

20

40

10

30

R el. a bs . (mA u) -28 0 nm R el. a bs . (mA u) -28 0 nm

30

Gra dient (%A )

R el. a bs . (mA u) -28 0 nm

70

70 70

375 375

60 60 275 275

50 50 40 40

175 175

30 30

0 20

20 20

75 75

-10

10

-20

0 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

10 10 -25 -25

0 0

0

0,2 0,2

Time ( min)

0.5 ul ToMV

1 ul ToMV

0,4 0,4

0,6 0,6

0,8 0,8

1

0

1

Time (min) Time (min)

2 ul ToMV

gradient (%A)

0.5 ul cToMV 0.5 ul cToMV

1 ul cToMV 1 ul cToMV

2 ul cToMV 2 ul cToMV

Buffer A: 20mM Na acetate, pH=5,5; Buffer B: Buffer A + 1,5M NaCl, pH=5,5 Step gradient: 100% A-100%B-100% A, flow rate: 6 ml/min Capacity of CIM® QA disk for ToMV

gr adient ( %A) gr adient ( %A)

Gra dient (%A ) Gra dient (%A )

frac

60

ToMV diluted in 0,5 L tap water

43

Conditions: ToMV (0.033mg ToMV/ml) in 20 mM phosphate citrate buffer pH 7.0, Flow rate 0.5ml/min. Disk size: 6 x 1.5 mm ID. Capacity is up to 24 mg ToMV/ml CIM® QA monolith at 10% breakthrough. Concentration of measles viruses using CIM® DEAE disk to improve detection of the RT-PCR method

1

0,8

75

0,6 50 0,4 25

Conc. NaCl (M)

Absorbance unit

100

0,2

0

0 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

Time (min) Signal

Conc. NaCl

Buffer A: 20 mM tris-HCl, pH 8.0; buffer B: 20 mM tris-HCl, 1 M NaCl pH 8.0. Linear gradient: 0 – 1 M NaCl / 1 min; Flow rate: 4 ml/min Courtesy of Dr. K. Branovic, Institut za Imunologiju, Zagreb, Croatia Conclusions and perspectives Ø Fast virus concentration procedure based on CIM® Ø Very high capacity for viruses Ø Viruses retain infectivity after the concentration procedure Ø High yields Ø CIM monolithic supports could shorten the procedures for virus purification from plant material Ø Production of large quantities of pure viruses for gene therapy and production of vaccines and antibodies

5th International Conference VITAMINS – Targeted Nutritional Therapy University of Pardubice, Czech Republic September 14 – 15, 2005

Kontaktní adresa: Aleš Horna, Radanal s.r.o. Pardubice , UTB Zlín

44

STUDIUM ENZYM-INHIBITOROVÝCH KOMPLEXŮ TYPU ACETYLCHOLINESTERÁZA-ORGANOFOSFOROVÁ BOJOVÁ LÁTKA Monika Hoskovcová, Emil Halámek, Zbyněk Kobliha Resumé Byla studována reaktivace monopyridiniovými oximy s využitím acetylcholinesterázy (AChE) imobilizované na celulózové textilii inhibované sarinem, somanem a cyklosarinem. Aktivita enzymu byla stanovovaná pomocí měření remisních změn povrchu textilie s AChE použitím Ellmanovy metody s acetylthiocholin jodidem jako substrátem a kyselinou 5,5´-dithiobis(2-nitrobenzoovou) jako chromogenním činidlem. Použitá metoda poskytuje jednoduché hodnocení reaktivační účinnosti oximů na enzym-inhibitorový komplex in vitro, pomocí něhož je možné rozlišit jednotlivé organofosfáty. 1

ÚVOD

Organofosforové bojové látky patří mezi ireverzibilní inhibitory acetylcholinesterázy (AChE). Tyto látky inhibují AChE ve třech krocích. V prvním se inhibitor váže na hydroxylovou skupinu serinu v aktivním centru enzymu. Vzniká nekovalentně vázaný enzyminhibitorový komplex, který je reverzibilní. V dalším kroku je serin pomocí vody kovalentně fosforylován. Z molekuly organofosforové látky odchází odstupující skupina, v případě sarinu F-, tabunu CN- atd. Tato vazba je stále reverzibilní. Ke znovuobnovení aktivity AChE dochází spontánně velmi pomalu, pomocí vody, která je součástí struktury enzymu nebo přebytkem acetylcholinu nebo rychleji, za pomoci nukleofilních činidel. Opačným procesem k obnově aktivity enzymu je tzv. stárnutí (ageing). Znamená to, že fosforylovaná cholinesteráza přechází na svojí dealkylovanou formu. Je to děj, při kterém dochází k odštěpení alkoxylových skupin navázaných na fosfor účinkem vody. Tento stav je již nezvratný. Zde již nedochází ke spontánní obnově aktivity enzymu ani k obnově pomocí nukleofilních činidel. Rychlost této dealkylace je závislá na době kontaktu enzymu s organofosfátem a na jeho struktuře. Proto dosahují jednotlivé inhibitory této dealkylované formy za různou dobu. U somanu řádově v minutách, u sarinu v desítkách minut a u látky VX ve stovkách minut. [1 - 8] Byla zmíněna nukleofilní činidla, která se používají pro obnovení funkce aktivního centra enzymu, tzv. reaktivátory AChE. Jsou to látky, které jsou díky své struktuře schopné vejít do aktivního centra a pomocí své reaktivní nukleofilní funkční skupiny uvolnit molekulu organofosfátu ještě před tím, než dojde k její dealkylaci. Jako účinné se ukázaly být sloučeniny, které ve své struktuře obsahují aldoximovou funkční skupinu (-CH=N-OH). Při této reakci vzniká fosforylovaný oxim, který se rozpadá na netoxické produkty. Nezměněná molekula AChE může znovu plnit svojí funkci. [9 - 11] Za posledních padesát let bylo vyzkoušeno velké množství těchto látek. Mezi nejvýznamnější a nejúčinnější patří monopyridiniové monooximy jako je např. pralidoxim a bispyridiniové mono- a dioximy, mezi které patří HI-6, methoxim. [12 – 14 ] Tyto látky byly také zavedené jako prostředky antidotní terapie v AČR a v jiných armádách. Jejich účinnost ale není stoprocentní. Žádný z reaktivátorů není schopen reaktivovat celé spektrum

45

bojových chemických látek a pro tyto jednotlivé sloučeniny mají různou účinnost. Na této farmakologicky nepříznivé okolnosti je možné založit metodu identifikace jednotlivých bojových chemických látek. 2

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁS T

Byl sestaven jednoduchý in vitro model, který je pomocí komponent k biosenzoru Detehitu [15] schopen studovat vliv jednotlivých reaktivátorů na obnovu aktivity AChE inhibované nervově paralytickými látkami. Jedná se o celulózovou textilii s imobilizovanou AChE a indikační papír, na kterém je nanesen acetylthiocholin jodid, jako substrát a kyselina 5,5´-dithiobis(2-nitrobenzoová), jako chromogenní činidlo. Princip je založen na změně intenzity zabarvení indikační textilie v závislosti na stupni aktivity AChE. Textilie s imobilizovanou AChE byla inhibována nervově paralytickými látkami sarinem, somanem a cyklosarinem po dobu 2 min. Poté byla propláchnuta destilovanou vodou a vložena do vodného roztoku reaktivátorů o koncentracích 0,5; 0,1; 0,05 a 0,01 mg.cm-3 na dobu 10, 15 a 20 min. Po uplynutí této doby byla textilie s imobilizovanou, reaktivovanou AChE propláchnuta destilovanou vodou a na 1 min byl přiložen indikační papír se substrátem a chromogenním činidlem. Následně byl měřen průběh změny zabarvení povrchu textilie v čase na přístroji ULTRA SCAN XE při 410 nm. Měření při každé koncentraci reaktivátoru bylo prováděno minimálně sedmkrát. 3

VÝSLEDK Y A JEJICH DISK USE

Změny zabarvení povrchu textilie jsou závislé na koncentraci inhibitoru a na době jeho působení. Závislost koncentrace inhibitoru na inhibiční účinnosti je znázorněna v grafu č. 1.

100

1 2

95 90 3

R % 85

4 80 75 70 20

30

40

50

60

70

80

90

100 110 120

t [s]

Graf. 1: Inhibiční účinnost inhibitoru GB na tkaninu s imobilizovanou AChE po dobu 2 min o koncentracích 4,5.10-4 mg.cm-3 (1), 1.10-4 mg.cm-3 (2), 1.10-5 mg.cm-3 (3), počáteční aktivita enzymu (4). Intenzita zabarvení textilie se stupněm inhibice snižuje ze žluté do bílé barvy.

46

Při reaktivaci dochází v závislosti na druhu inhibitoru a reaktivátoru a době expozice k obnově aktivity enzymu, což se projeví opětovným žlutým zabarvením textilie, jehož intenzita je závislá na stupni reaktivace. Tento stav znázorňuje graf č. 2.

1 2 3 4

100 95 90 R % 85

5

80 75 70 20

30

40

50

60

70

80

90

100 110 120

t [s]

Graf. 2: Účinnost reaktivace imobilizované AChE inhibované inhibitorem GB o koncentraci 4,5.10-4 mg.cm-3 (1), po dobu 2 min, reaktivátory 4-PAB (2), 2-PAB (3) a 2-PAM (4) o koncentraci 0,5 mg.cm-3 po dobu 10 min a počáteční aktivita enzymu (5). Účinnost reaktivace je závislá nejen na typu daného reaktivátoru, ale také na jeho koncentraci. Příklad je uveden v grafu č. 3.

100

1 2 3 4

95 90 R % 85

5

80 75 70 20

30

40

50

60

70

80

90

100 110 120

t [s]

Graf. 3: Účinnost reaktivace imobilizované AChE inhibované inhibitorem GB o koncentraci 4,5.10-4 mg.cm-3 (1) po dobu 2 min, reaktivátorem 2-PAM o koncentracích 0,01 mg.cm-3 (2), 0,1 mg.cm-3 (3), 0,5 mg.cm-3 (4), a po dobu 10 min a počáteční aktivita enzymu (5). Pro rozlišení látek sarinu (GB), somanu (GD) a cyklosarinu (GF) byla vybrána homologická řada monopyridiniových monooximů typu pralidoximu o třech členech, která obsahovala methylovou (PAM), ethylovou (PAE) nebo propylovou (PAB) skupinu na pyridiniovém dusíku a jejich izomery s oximovou funkční skupinou v polohách 2, 3 a 4 v pyridiniovém kruhu.

47

3.1

Reaktivace AChE inhibované sarinem

Výsledky reaktivace jsou zaznamenané v tabulce č. 1. a graficky znázorněná závislost procenta reaktivace na koncentraci reaktivátoru je znázorněná v grafech č. 4 a 5. Tab. 1: Účinnost reaktivace (%) AChE inhibované látkou GB po dobu 2 min studovanými reaktivátory o koncentracích 0,5; 0,1; 0,05 a 0,01 mg.cm-3, při dobách reaktivace 10, 15 a 20 min. doba reakt. [min] reaktivátor [mg.cm-3]

10

15

20

0,5

0,1

0,05

0,01

0,5

0,1

0,05

0,01

0,5

0,1

0,05

0,01

2-PAM 2-PAE 2-PAB

41,88 53,91 27,78

36,32 49,02 8,26

31,62 33,85 9,48

23,5 23,36 2,96

38,89 76,67 36,67

35,56 70 51,11

72,22 81,11 40

42,22 45,55 22,22

38,89 82,22 -

65,56 94,44 13,33

62,22 100 6,67

45,56 100 6,67

3-PAM 3-PAE 3-PAB

27,78 23,33 20

14,44 25,55 32,22

11,11 30 36,67

6,67 4,44

28,89 23,33 26,67

17,78 27,78 23,33

24,44 13,33 16,17

11,11 10

26,67 36,67 23,33

30 56,67 10

25,56 50 25,56

31,11 8,89 22,22

4-PAM 4-PAE 4-PAB

17,8 22,48 22,69

11,01 15,44 10,56

31,62 10,95 5,98

7,08 1,5

34,44 33,33 22,22

46,56 46,67 43,33

33,33 32,22 31,11

32,22 17,78

52,22 37,78 12,12

33,33 40 16,67

37,78 21,11 5,56

3,33 -

Homology s oximovou skupinou v poloze 2 Pro obnovu sarinem inhibované AChE byly nejúčinnější reaktivátory s oximovou skupinou v poloze 2 v pyridiniovém kruhu. Nejefektivnějším je 2-PAE. Jeho účinnost se zvyšuje s dobou reaktivace. Při koncentracích činidla 0,05 a 0,01 mg.cm-3 dosahuje po 20 min reaktivace procento obnovení aktivity enzymu hodnoty 100 %. Z této řady je nejméně účinný 2-PAB, u kterého ale byla zaznamenána nejlepší účinnost po 15 min působení reaktivátoru při všech koncentracích. Pro reaktivátor 2-PAM byla zaznamenána nejvyšší reaktivační schopnost po 15 min jeho působení v koncentraci 0,05 mg.cm-3. Homology s oximovou skupinou v poloze 3 Homologická řada reaktivátorů s oximovou skupinou v poloze 3 v pyridiniovém kruhu má ve všech koncentracích a dobách reaktivace nižší účinnost než 2-PAM a 2-PAE. U koncentrace 0,5 mg.cm-3 je reaktivace téměř shodná při všech použitých časech reaktivace, dosahuje hodnot mezi 20 až 30 %. Nejvýznamnější hodnoty obnovení aktivity enzymu homology s oximovou skupinou ve třetí pozici v pyridiniovém kruhu byly zaznamenány u 3-PAE, při koncentraci reaktivátoru 0,5 mg.cm-3 a 20 min reakce je hodnota reaktivace 36,67 %. Při koncentraci 0,1 mg.cm-3 je hodnota obnovení aktivity enzymu při tomto čase 56,67 % a při koncentraci 0,05 mg.cm-3 50 %. U koncentrací 0,1 a 0,01 mg.cm-3 se se zvyšující se dobou působení reaktivátorů účinnost reaktivace zvyšuje. Výjimku tvoří 3-PAB v koncentraci 0,1 mg.cm-3.

48

Homology s oximovou skupinou v poloze 4 Účinnější než homology 3-PAM je homologická řada odvozená od 4-PAM. Tato skupina reaktivátorů ale nedosahuje účinnosti homologické řady pralidoximu. Při koncentraci reaktivátoru 0,5 mg.cm-3 se hodnota obnovení aktivity AChE zvyšovala s dobou, po kterou působil oxim na inhibovaný enzym. Odchylka byla zjištěna pouze u 4-PAB po 15 a 20 min reaktivace. Celkově nejvyšší reaktivační účinnost byla zaznamenána u látky 4-PAM o koncentraci 0,5 mg.cm-3 a době reaktivace 20 min, a to 52,22 %. Poté následoval reaktivátor 4-PAE o koncentraci 0,1 mg.cm-3, kde bylo nejvyšší reaktivace dosaženo po 15 min působení činidla.

100 80 60 %R 40 20

0,5

0,1

0,05

c [mg.cm-3]

4-PAB

0,5 4-PAE

4-PAM

3-PAB

3-PAE

3-PAM

0,05 2-PAB

2-PAE

2-PAM

0

0,01

Graf 4: Reaktivace imobilizované AChE (%) inhibované po dobu 2 min vodným roztokem inhibitoru GB s následnou reaktivací po dobu 15 min vodným roztokem reaktivátorů (2-PAM, 2-PAE, 2-PAB, 3-PAM, 3-PAE, 3- PAB, 4-PAM, 4-PAE, 4-PAB) o koncentracích 0,5; 0,1; 0,05 a 0,01 mg.cm-3. 100 80 60 %R 40 20

0,5

0,1

0,05

c [mg.cm-3]

4-PAB

0,5 4-PAE

4-PAM

3-PAB

3-PAE

3-PAM

0,05 2-PAB

2-PAE

2-PAM

0

0,01

Graf 5: Reaktivace imobilizované AChE (%) inhibované po dobu 2 min vodným roztokem inhibitoru GB s následnou reaktivací po dobu 20 min vodným roztokem reaktivátorů (2-PAM, 2-PAE, 2-PAB, 3-PAM, 3-PAE, 3-PAB, 4-PAM, 4-PAE, 4-PAB) o koncentracích 0,5; 0,1; 0,05 a 0,01 mg.cm-3.

49

3.2

Reaktivace somanem inhibované AChE

Reaktivace AChE inhibované somanem vykazuje celkově nižší účinnost studovaných reaktivátorů ve srovnání s reaktivací enzymu inhibovaného sarinem. Výsledky reaktivace jsou zaznamenané v tabulce č. 2. a grafická závislost procenta reaktivace na koncentraci reaktivátoru je znázorněná v grafech č. 6 a 7. Tab. 2: Účinnost reaktivace (%) AChE inhibované látkou GD po dobu 2 min studovanými reaktivátory o koncentracích 0,5; 0,1; 0,05 a 0,01 mg.cm-3, při dobách reaktivace 10, 15 a 20 min. doba reakt. [min] reaktivátor [mg.cm-3]

10

15

20

0,5

0,1

0,05

0,01

0,5

0,1

0,05

0,01

0,5

0,1

0,05

0,01

2-PAM 2-PAE 2-PAB

4,17 18,38 11,77

5,84 10,29 -

1,47 -

-

18,27 4,4 14,28

15,05 -

17,16 -

6,37 -

11,83 12,08 6,59

19,35 -

21,51 -

9,68 -

3-PAM 3-PAE 3-PAB

12,9 11,83 2,15

5,37 12,9 6,45

12,9 20,43 6,45

10,75 2,15 9,14

15,05 16,13

9,68 16,13 15,05

17,2 11,83 11,83

8,07 18,27 8,61

19,35 9,64 13,98

11,83 6,4 15,05

13,98 20,43 11,83

3,22 10,75 10,75

4-PAM 4-PAE 4-PAB

1,68 23,53 8,09

6,62 -

-

-

17,2 7,69 5,2

3,22 -

20,43 -

4,3 -

12,9 5,49 3,29

11,83 -

9,68 -

5,37 -

Homology s oximovou skupinou v poloze 2 U homologické řady reaktivátorů s oximovou skupinou v poloze 2 byl nejúčinnější 2- PAM. To se projevilo zejména při koncentracích 0,1; 0,05 mg.cm- 3 a 0,01 mg.cm-3 u časů reaktivace 15 a 20 min. Nejvyšší obnovy aktivního centra AChE bylo dosaženo při koncentraci 0,05 mg.cm-3 po 20 min působení, a to z 21,51 %. Hodnoty reaktivace tímto reaktivátorem jsou při 10 min působení nevýznamné. Od koncentrace 0,05 mg.cm-3 nebyla jeho účinnost zaznamenána. U reaktivátoru 2-PAE byla po 10 min reaktivace zaznamenána nejvyšší reaktivační účinnost zjištěna u koncentrace 0,5 mg.cm-3, která se s nižšími koncentracemi snižovala. U koncentrace 0,01 mg.cm-3 již nebyla zaznamenána. Po 15 a 20 min působení nebyl účinný od koncentrace 0,1 mg.cm-3. 2-PAB je při všech dobách reaktivace od koncentrace 0,1 mg.cm-3 a nižších zcela neúčinný. Homology s oximovou skupinou v poloze 3 Homologická řada reaktivátorů s oximovou skupinou v poloze 3 byla ze studovaných sloučenin celkově nejúčinnější. U koncentrace 0,05 mg.cm-3 byl z těchto homologů nejlepší druhý člen řady, 3-PAE po 10 a 20 min reaktivace, kde byla zaznamenána stejná hodnota. Aktivní centrum bylo obnoveno z 20,43 %.

50

Totožné hodnoty reaktivace byly zaznamenány také u reaktivátoru 3-PAB o koncentraci 0,1 mg.cm-3 po 15 a 20 min. A také u reaktivátorů 3-PAE a 3-PAB u koncentrace 0,05 mg.cm-3 po 15 min působení a 0,01 mg.cm-3 po 20 min. U 3-PAB byla, na rozdíl od jeho izomerů, zaznamenána schopnost reaktivace při všech studovaných koncentracích. Homology s oximovou skupinou v poloze 4 Účinnost homologů 4-PAM se snižovala s prodlužujícím se alkylovým řetězcem na pyridiniovém dusíku. Nejvyšší účinnost reaktivace byla zaznamenána u druhého člena řady 4-PAE po 10 min působení. Funkce aktivního centra enzymu byla obnovena z 23,53 %. Tato účinnost se s prodlužující dobou působení snižovala. U koncentrace 0,1 mg.cm-3 byla zjištěna změna zabarvení pouze po 10 min reaktivace. V dalších zkouškách byl reaktivátor neúčinný. 4-PAM je nejúčinnější po 15 min působení reaktivátoru o koncentraci 0,05 mg.cm-3 . Z této homologické řady je jako jediný efektivní při koncentracích 0,05 a 0,01 mg.cm-3 po 15 a 20 min působení. 4-PAE reaktivuje inhibovaný enzym pouze v nejvyšší použité koncentraci při všech dobách reaktivace. Po 10 min kontaktu enzymu s reaktivátorem také při koncentraci 0,1 mg.cm-3. Ve všech nižších koncentracích je zcela neúčinný.

50 40 30 %R 20 10

0,5

0,1

0,05

c [mg.cm-3]

4-PAB

0,5 4-PAE

4-PAM

3-PAB

3-PAE

3-PAM

0,05 2-PAB

2-PAE

2-PAM

0

0,01

Graf 6: Reaktivace imobilizované AChE (%) inhibované po dobu 2 min vodným roztokem inhibitoru GD s následnou reaktivací po dobu 15 min vodným roztokem reaktivátorů (2-PAM, 2-PAE, 2-PAB, 3-PAM, 3-PAE, 3-PAB, 4-PAM, 4-PAE, 4-PAB) o koncentracích 0,5; 0,1; 0,05 a 0,01 mg.cm-3.

51

50 40 30 %R 20 10

0,5

0,1

c [mg.cm-3]

4-PAE

0,05

4-PAB

0,5

4-PAM

3-PAB

3-PAE

3-PAM

0,05 2-PAB

2-PAE

2-PAM

0

0,01

Graf 7: Reaktivace imobilizované AChE (%) inhibované po dobu 2 min vodným roztokem inhibitoru GD s následnou reaktivací po dobu 20 min vodným roztokem reaktivátorů (2-PAM, 2-PAE, 2-PAB, 3-PAM, 3-PAE, 3-PAB, 4-PAM, 4-PAE, 4-PAB) o koncentracích 0,5; 0,1; 0,05 a 0,01 mg.cm-3. 3.3

Reaktivace cyklosarinem inhibované AChE

Výsledky reaktivace jsou zaznamenané v tabulce č. 3 a grafická závislost procenta reaktivace na koncentraci reaktivátoru je znázorněná v grafu č. 8. Tab. 3: Účinnost reaktivace (%) AChE inhibované látkou GF po dobu 2 min studovanými reaktivátory o koncentracích 0,5; 0,1; 0,05 a 0,01 mg.cm-3, při dobách reaktivace 10, 15 a 20 min. doba reakt. [min] reaktivátor [mg.cm-3]

10

15

20

0,5

0,1

0,05

0,01

0,5

0,1

0,05

0,01

0,5

0,1

0,05

0,01

2-PAM 2-PAE 2-PAB

20 16,29 16,29

11,12 11,12 8,89

2,22 11,12 -

5,19 -

8,89 4,44 16,66

17,78 1,11 12,22

8,89 3,33 -

3,33 6,67 3,33

14,44 11,11 20

4,44 3,33 13,33

2,22 8,89 4,44

1,11 -

3-PAM 3-PAE 3-PAB

5,56 7,78 -

-

5,56 7,78 -

1,11 -

10 14,44 13,33

10 8,89

14,44 10 4,44

6,67 5,56 -

5,56 13,33 5,56

1,11 13,33 2,22

5,56 2,22 6,67

5,56 13,33

4-PAM 4-PAE 4-PAB

11,38 12,6 7,4

11,06 8,89 7,4

14,63 0,01 5,19

0,01 -

15,55 1,11 11,11

14,44 10 8,89

17,76 6,67 6,67

2,22 4,44 2,22

11,11 10,2 12,22

5,56 17,35 10

8,89 9,19 6,67

11,22 11,11

52

Homology s oximovou skupinou v poloze 2 Po 10 min reaktivace byl nejúčinnějším reaktivátorem pro AChE inhibovanou cyklosarinem 2-PAM. Při koncentraci 0,5 mg.cm-3 byla změřena stejná hodnota reaktivace enzymu pro látky 2-PAE a 2-PAB, a to 16,29 %. Při 0,1 mg.cm-3 byla totožná reaktivační účinnost pro 2-PAE a 2-PAB, 11,12 %. V koncentracích 0,05 a 0,01 mg.cm-3 je 2-PAB neúčinný, 2-PAM v koncentraci 0,01 mg.cm-3. Nejvyšší reaktivační účinnost byla zaznamenána pro 2-PAM v koncentraci 0,5 mg.cm-3, a to 20 %. Se zvýšením doby reaktivace na 15 min byla u 2-PAM zjištěna vyšší reaktivační účinnost inhibovaného enzymu od koncentrace 0,1 mg.cm-3 a nižších. U druhého člena řady 2-PAE byla obnova aktivního centra nižší s výjimkou koncentrace 0,01 mg.cm-3. 2-PAB měl při této době působení na inhibovaný enzym vyšší účinnost než po 10 min reaktivace. Pouze v koncentraci 0,05 mg.cm-3 byl bez účinku. Po 20 min reakce byl 2-PAM méně účinný. Ve srovnání s předchozí dobou působení tohoto reaktivátoru byla vyšší reaktivace zjištěna pouze u koncentrace 0,5 mg.cm-3. Pro 2-PAE byly změřeny vyšší hodnoty reaktivace než po 15 min, ale nižší ve srovnání s 10 min. U koncentrace 0,01 nebyla zaznamenána změna zabarvení textilie. U 2-PAB byla po 20 min a koncentraci 0,5 mg.cm-3 změřena stejná hodnota reaktivace jako u 2-PAM po 10 min o stejné koncentraci, a to 20 %. Homology s oximovou skupinou v poloze 3 U homologické řady reaktivátorů s oximovou skupinou v poloze 3 byla po 10 min reaktivace změřena změna pouze u prvních dvou členů homologické řady. U 3-PAM při koncentracích 0,5 mg.cm-3 a 0,05 mg.cm-3 a u 3-PAE při koncentracích 0,5; 0,05 a 0,01 mg.cm-3. Hodnoty reaktivace jsou ale velmi nízké a nepřesáhly 10 %. 3-PAB je za daných podmínek zcela neúčinný. Po 15 min působení reaktivátoru bylo zaznamenáno zvýšení účinnosti reaktivátorů. Hodnoty obnovení aktivity enzymu ale nepřesáhly 15 %. Na rozdíl od předchozí doby reaktivace byla zaznamenána zvýšená účinnost 3-PAB. U reaktivační doby 20 min byl zaznamenán pokles v porovnání s dobou reaktivace 15 min. Výjimku tvoří pouze 3-PAM a 3-PAE v koncentraci 0,1 mg.cm-3 a 3-PAB při koncentracích 0,05 mg.cm-3 a 0,01 mg.cm-3. Homology s oximovou skupinou v poloze 4 Z homologické řady reaktivátorů s oximovou skupinou ve 4 poloze je nejúčinnější 4-PAM. Pro 4-PAM jsou nejvyšší hodnoty obnovení aktivního centra zjištěny po 15 min působení při všech koncentracích. Nejvyšší hodnota reaktivace (17,76 %) byla zjištěna při koncentraci 0,05 mg.cm-3. 2-PAE je z této homologické řady nejméně účinným reaktivátorem. Pouze při 10 min reaktivace o koncentraci 0,5 mg.cm-3 a při 20 min o koncentraci 0,1 mg.cm-3 měl mírně vyšší nebo stejnou reaktivační účinnost jako první a třetí člen homologické řady. Účinnost reaktivátoru 4-PAB se postupně zvyšovala s dobou reaktivace. Rozdíly mezi jednotlivými hodnotami jsou ale velmi malé. Nejvyšší rozdíl byl zaznamenán u koncentrací 0,01 mg.cm-3.

53

50 40 30 %R 20 10

0,5

0,1

c [mg.cm-3]

0,5

0,05

4-PAB

4-PAE

4-PAM

3-PAB

3-PAE

3-PAM

0,05 2-PAB

2-PAE

2-PAM

0

0,01

Graf 8: Reaktivace imobilizované AChE (%) inhibované po dobu 2 min vodným roztokem inhibitoru GF s následnou reaktivací po dobu 10 min vodným roztokem reaktivátorů (2-PAM, 2-PAE, 2-PAB, 3-PAM, 3-PAE, 3-PAB, 4-PAM, 4-PAE, 4-PAB) o koncentracích 0,5; 0,1; 0,05 a 0,01 mg.cm-3. Porovnání izomerů Z pohledu účinnosti jednotlivých izomerních řad je pro enzym inhibovaný sarinem ze studovaných sloučenin nejúčinnější reaktivátor, který má oximovou skupinou v poloze 2. Zejména u 2-PAE byla zaznamenána vysoká reaktivační schopnost této látky při všech koncentracích a dobách reaktivace. U třetího člena homologické řady již není tato schopnost zaznamenána ve všech případech.

100 80 60 %R 40 20

10

15

t [min]

4-PAB

10 4-PAE

4-PAM

3-PAB

3-PAE

3-PAM

20 2-PAB

2-PAE

2-PAM

0

20

Graf 9: Znázornění reaktivační účinnosti studovaných izomerů. Reaktivace imobilizované AChE (%) inhibované po dobu 2 min vodným roztokem inhibitoru GB s následnou reaktivací po dobu 10, 15 a 20 min vodným roztokem reaktivátorů (2-PAM, 2-PAE, 2-PAB, 3-PAM, 3-PAE, 3-PAB, 4-PAM, 4-PAE, 4-PAB) o koncentraci 0,5 mg.cm-3.

54

Pro reaktivaci AChE inhibované somanem je nejúčinnější homologická řada s oximovou skupinou v poloze 3, zejména pro druhé a třetí členy řady. Látky s oximem ve 2 a 4 poloze byly neúčinné od koncentrace 0,1 mg.cm-3 s výjimkou 2-PAM, 2-PAE a 4-PAE po 10 min reaktivace. 50 40 30 %R 20 10

10

15

4-PAE

t [min]

4-PAB

10

4-PAM

3-PAB

3-PAE

3-PAM

20 2-PAB

2-PAE

2-PAM

0

20

Graf 10: Znázornění reaktivační účinnosti studovaných izomerů. Reaktivace imobilizované AChE (%) inhibované po dobu 2 min vodným roztokem inhibitoru GD s následnou reaktivací po dobu 10, 15 a 20 min vodným roztokem reaktivátorů (2-PAM, 2-PAE, 2-PAB, 3-PAM, 3-PAE, 3-PAB, 4-PAM, 4-PAE, 4-PAB) o koncentraci 0,1 mg.cm-3. Pro enzym inhibovaný cyklosarinem byly po 10 min reaktivace účinnější izomery s oximovou funkční skupinou v polohách 2 a 4 než izomery s oximem v poloze 3. Toto platí pro všechny studované koncentrace reaktivátoru. Po 15 a 20 min reaktivace již není tato závislost patrná. 50 40 30 %R 20 10 20 t [min] 10 4-PAB

15

4-PAE

3-PAB

10

4-PAM

3-PAE

3-PAM

2-PAB

2-PAE

2-PAM

0

20

Graf 11: Znázornění reaktivační účinnosti studovaných izomerů. Reaktivace imobilizované AChE (%) inhibované po dobu 2 min vodným roztokem inhibitoru GF s následnou reaktivací po dobu 10, 15 a 20 min vodným roztokem reaktivátorů (2-PAM, 2-PAE, 2-PAB, 3-PAM, 3-PAE, 3-PAB, 4-PAM, 4-PAE, 4-PAB) o koncentraci 0,1 mg.cm-3.

55

4

ZÁVĚR

Pro reaktivaci sarinem inhibovaného enzymu byl nejúčinnějším reaktivátorem v celém rozsahu koncentrací a všech dobách reaktivace 2-PAE, který je za daných podmínek účinnější než 2-PAM. Nejvýraznější je tento rozdíl po 20 min působení činidla. Pro reaktivaci imobilizované AChE inhibované somanem je nejúčinnější homologická řada s oximovou skupinou v poloze 3 v pyridiniovém kruhu. V literatuře je uváděna jako nejméně vhodná z důvodu umístění nukleofilní funkční skupiny pro aktivním centrum AChE. U látek s oximem ve 2 a 4 poloze byla od druhé nejvyšší použité koncentrace zaznamenána minimální nebo žádná reaktivační schopnost. U AChE inhibované cyklosarinem byly po 10 min reaktivace účinnější izomery s oximovou funkční skupinou v polohách 2 a 4 ve srovnání s izomery s oximem ve 3 poloze. Po 15 a 20 min reaktivace již nebyla tato závislost patrná. Cílem práce bylo pomocí vybrané homologické řady reaktivátorů a jejich izomerů zjistit reaktivační účinnost a na jejím základě od sebe odlišit vybrané nervově paralytické látky. Na základě rozdílné reaktivační účinnosti je možné odlišit tyto inhibitory pomocí reaktivátoru 2-PAE o koncentraci 0,05 nebo 0,01 mg.cm-3 po 20 min působení, kde dojde k výraznému obnovení AChE inhibované sarinem. Na somanem a cyklosarinem inhibovanou AChE nemá tento reaktivátor v této koncentraci vliv. Soman a cyklosarin je možné od sebe odlišit pomocí reaktivátoru 4-PAE nebo 4-PAB o koncentraci 0,01 mg.cm-3 po 20 min působení. LITERATURA: [1]

SOMANI, S. M., Chemical warfare Agents, UK: Academic Press, 1992. ISBN 0-12654620-7

[2]

LÜLLMANN, H., MOHR, K., WEHLING, M., Farmakologie a toxikologie., 1. české vydání, Praha: GRADA, Avicenum, 2002, 696 s. ISBN 80-7169-976-4

[3]

Bajgar, J. Patočka, J., Acetylcholinesteráza: struktura, funkce a vlastnosti. Informační zpravodaj VLIS 18, 4, 5-24,1977.

[4]

BAJGAR, J., The influence of inhibitors and other factors on cholinesterases. Sborník vědeckých prací Lékařské fakulty UK Hradec Králové 34, 1, 1991.

[5]

SUSSMANN, J. L., HAREL, M., SILMAN, I., Three-dimensional structure of acetylcholinesterase and its complexes with anticholinesterase drugs. Chem-biol. Interactions, 87, 187-197,1993.

[6]

ORDENTLICH, A., BARAK, D., KRONMAN, CH., ARIEL, N., SEGALL, Y., VELAN, B., SHAFFERMAN, A., The architectureof human acetylcholinesterase active center probed by interactions with selected organophosphate inhibitors. The Journal of Biological Chemistry 271, 20, 11953-11962, 1996.

[7]

Fleisher, J. H., Harris, L. W., Dealkylation as a mechanism for aging of cholinesterase after poisoning with pinacolyl methylphosphonofluoridate. Biochemical Pharmacology 14, 641-650, 1965. ISSN 0006-2952

[8]

BAJGAR, J., Present view on toxicodynamics of soman poisoning. Acta Medica 39, 101105, 1996.

56

[9]

PETROVA, I., BIELAVSKÝ, J., Přehled syntéz reaktivátorů cholinesterázy v letech 1980-1992. Vojenské zdravotnické listy 93, 20-37, 1999. ISSN 0372-7025

[10] POZIOMEK, E. J., HACKLEY B. E. jr., STEINBERG G. M., Pyridinium aldoximes. Journal of Organic Chemistry 23, 714-718, 1958. ISSN 0022-3263 [11] REINER, E., Organophosphorus compounds and esterases: current research topics concerning the toxicity of and protection against organophosphates. Arhiv za Higijenu Rada i Toksikologiju 52, 323-331, 2001. ISSN 0004-1254 [12] LOOMIS, T. A., SAFALSKY B., Antidotal action of pyridinium oximes in anticholinesterase poisoning; comparative effects of soman, sarin and neostigmine on neuromuscular function. Toxicology and Applied Pharmacology 5, 685-701, 1963. ISSN 0041-008X [13] FLEISHER, J. H., HARRIS L. W., MURTHA E. F., Reactivation by pyridinium aldoxime methochloride (PAM) of inhibited cholinesterase activity in dogs after poisoning with pinacolyl methylphosphonofluoridate (soman). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 156, 345-351, 1967. [14] Harris ,L. W., Anderson, D. R., Lennox, W. J., Woodard, C. L., Pastelak, A., Vanderpool B. A., Evaluation of several oximes as reactivators of unaged soman-inhibited whole blood acetylcholiesterase in rabbits. Biochemical Pharmacology 40, 12, 2677-2682, 1990. ISSN 0006-2952 [15] TUŠAROVÁ, I., HALÁMEK, E., Patent ČSFR 2701 Kontaktní adresa: Monika Hoskovcová, Emil Halámek, Zbyněk Kobliha, Ú OPZHN, UO Brno, Víta Nejedlého, 680 01 Vyškov na Moravě.

57

ÚLOHA EXTRAKČNÍCH A CHROMATOGRAFICKÝCH TECHNIK V ANALÝZE EXPLOSIV A JEJICH REZIDUÍ Věra Ježová, Aleš Eisner, Jana Chalánková, Karel Ventura ÚVOD Extrakční proces je nejdůležitějším krokem úpravy tuhých a kapalných vzorků1. Z hlediska fyzikální chemie je extrakce proces, kdy složky přechází fázovým rozhraním z kapalné či tuhé fáze do jiné fáze (např. kapalné – rozpouštědla). Slouží k zakoncentrování nebo přečištění vzorku, případně k izolaci některé složky (skupiny) ze složitější matrice. Volba extrakční techniky ovlivňuje nejen výtěžnost ale i kvalitu stanovení. Důležitým faktorem je i skupenství, ve kterém se analyzovaná látka nachází. Pro extrakční proces obecně platí Libigovo pravidlo „Podobné v podobném rozpouštěj“, s čímž souvisí i možnost použití velkého množství různých druhů rozpouštědel V minulosti standardním typem extrakce tuhých vzorků byla extrakce v Soxhletově extraktoru. Je to proměřená metoda s vysokými extrakčními výtěžky a reprodukovatelnými výsledky danými i mimo jiné relativně velkou navážkou. Nevýhodami jsou velká spotřeba rozpouštědla a časová náročnost analýzy (asi 3 až 20 hodin, někdy 72, podle okolností). V současné době se používá rozličná škála modernějších extrakčních technik nahrazujících extrakci v Soxhletově extraktoru, jedná se o mikrovlnnou extrakci (MAE), extrakce nadkritickou tekutinou (SFE) a vysokotlakou extrakci rozpouštědlem (PFE). Pro izolaci látek z kapalných vzorků byla nejvíce používána extrakce kapalinakapalina (LLE). Její velkou nevýhodou je práce s relativně velkými objemy rozpouštědel a s tím související nutnost zakoncentrování, přečišťování a riziko ztráty těkavých látek. Moderní alternativou k LLE jsou extrakce tuhou fází (SPE) a mikroextrakce tuhou fází (SPME). 1

MODERNÍ EXTRAKČNÍ TECHNIKY

1.1

Extrakce nadkritickou tekutinou

Extrakce nadkritickou tekutinou2 (Supercritical Fluid Extraction, SFE) je separační technika sloužící k izolaci látek z tuhých a kapalných vzorků. Extrakčním médiem při extrakci nadkritickou tekutinou je tekutina v nadkritickém stavu. Čistá látka se nachází v kritickém stavu pokud se její tlak a teplota nachází nad kritickými hodnotami tlaku a teploty. V kritickém bodě K mají obě fáze (kapalná i plynná) stejnou hustotu, mizí rozdíly ve vlastnostech kapalin a plynů a vzniká nová nadkritická fáze, která je ohraničena body pk a Tk (Obr. 1). Při teplotě vyšší než Tk a pk látka nemůže kondenzovat ani se odpařovat a její vlastnosti se mění s rostoucím tlakem od vlastností charakteristických pro plyny k vlastnostem charakteristickým pro kapaliny. Kombinují se preferenční vlastnosti plynů z hlediska přenosu hmoty se solvatačními vlastnostmi kapalin. U běžně používaných rozpouštědel je nadkritických podmínek dosaženo za mírných teplot (do 100°C) a tlaků (do 10 MPa). Při výběru vhodného extrakčního činidla je třeba

58

zvážit různé vlastností (korozivita, toxicita, cenová dostupnost). Mezi nejběžněji používané nadkritické tekutiny patří CO2 (Tk=31,3°C, pk=7,38 MPa). K dalším nadkritickým tekutinám patří např. N2O, NH3, MeOH, ethan, acethylen.Účinnost nadkritické tekutiny se dá podpořit přídavkem vhodného modifikátoru (alkoholy, aminy, aceton, acetonitril, kyselina mravenčí, hexan,....). P

Pk

Soxhlet PFE

SFE K

Tr Soxtec Obr. 1: Fázový diagram Rozlišujeme dvě základní uspořádání SFE extrakce: 1) statické - extrakční cela je naplněna fluidem a systém ponechán v klidu (ustanoví se rovnováha) a po určité době je extrakt vypuštěn do sběrné nádoby a celý postup je v případě potřeby opakován. 2) dynamické - fluidum je čerpáno přes extrakční celu se vzorkem. Výhodou je, že vzorek je v neustálém kontaktu s čerstvým fluidem. Proto je toto uspořádání častější. 1.2

Vysokotlaká extrakce rozpouštědlem

Vysokotlaká extrakce rozpouštědlem (Pressurised Fluid Extraction, PFE; dříve Accelerated Solvent Extracaitoin - ASE) pracující na principu extrakce tuhá látka - kapalina6, je prováděna za teploty nad bodem varu rozpouštědla (50-200 °C), vysokém tlaku a po krátký časový úsek (5-20 minut). PFE bývá charakterizována jako velmi rychlá extrakční technika s nízkou spotřebou rozpouštědla se zachováním extrakční výtěžnosti ve srovnání s klasikou Soxhletovou extrakcí. Důvodem vysoké účinnosti extrakce za vysoké teploty je vliv rozpustnosti, přenosu hmoty a narušení povrchové rovnováhy. Teplota a tlak jsou dva faktory, které mají vliv na extrakční výtěžnost. Použití vyšší teploty oproti teplotám používaných při klasických extrakcích (LLE) příznivě ovlivňuje rozpustnost, přenos hmoty a přechod přes fázové rozhraní. Za vyšších teplot se zvyšuje kapacita rozpouštědla. Zlepšuje se také rozpustnost vody v organických rozpouštědlech, což usnadňuje přístupnost vodou uzavřených pórů a tím i analytů v nich obsažených. Je snižována viskozita rozpouštědel, povrchové napětí analytu, rozpouštědla a matrice, díky čemuž je usnadněn přístup do pórů tuhé matrice a analyt může rychleji přecházet do rozpouštědla. Vlivem vyšších teplot dochází ke zvýšení rychlosti difuze. Při použití zvýšených pracovních teplot musí být použito přiměřeně zvýšených tlaků pro udržení rozpouštědla v kapalném stavu.

59

PFE extrakce může mít dvě uspořádání: 1) předehřívací(,,preheat“) – extrakční cela se ohřívá na pracovní teplotu ve vyhřívaném bloku až do ustanovení tepelné rovnováhy v cele. Statický ventil je otevřen. Rozpouštědlo se čerpá do cely do okamžiku než se ve sběrné nádobce nahromadí asi 1 ml extraktu. Uzavře se ventil a cela je natlakována na nastavený tlak. Po statické periodě se extrakt vypustí do sběrné nádobky a celý systém se propláchne čistým rozpouštědlem a následně inertním plynem. 2) předplnící (,,prefill“) – cela je naplněna rozpouštědlem po vložení do vyhřívací pece a těkavé sloučeniny jsou tak zachyceny v rozpouštědle. Zahříváním se rozpouštědlo v cele rozpíná a zvyšuje se tlak. Extrakt, který uniká během vyhřívání, je jímán ve sběrné nádobce. Po vyhřátí opět následuje statická perioda, propláchnutí čistým rozpouštědlem a inertním plynem. 1.3

Extrakce tuhou fází

Principem extrakce tuhou fází (Solid Phase Extraction, SPE) je schopnost aktivních center v povrchové struktuře tuhých látek interagovat s molekulami látek nacházejícími se v kapalné nebo plynné fázi, která je v kontaktu s tuhým sorbentem. Sorpční vlastnosti tuhých látek jsou závislé na řadě faktorů jako např. složení tuhé fáze a její povrchová struktura. Při výběru sorbentu je třeba zvážit řadu faktorů: chemickou inertnost a funkčnost povrchu, velikost pórů částic, velikost a tvar částic. V současnosti se používá velké množství různých typů sorbentů: polymerní sorbenty (styren-divinylbenzenové pro nepolární látky - Chromosorb 102), akrylátové polymery (použití pro polární látky), siloxanové sorbenty (C18, C8), iontoměniče a kombinované sorbenty (pro selektivní sorpci) a konečně uhlíkové sorbenty (aktivní uhlí, molekulová síta). Sorbent je umístěn v polypropylenové trubičce dvěma fritami a vzorek procházející SPE kolonkou je na tomto sorbentu zachycen (Obr. 2). SPE proces zahrnuje 4 základní kroky: - kondicionace kolonky - nadávkování vzorku - promytí kolonky - vymytí analytu 1) kondicionace kolonky – sorbentem je proléváno rozpouštědlo, čímž dojde k aktivaci sorbentu. Nejčastěji se jako rozpouštědla používají methanol, acetonitril a aceton. Poté se kolonka se promývá vodou, aby byl sorbent připraven i pro práci s vodnými vzorky. Sorbent mezi promýváním nesmí vyschnout.

Obr.2: Popis SPE kolonky

2) nadávkování vzorku – vzorek s analytem je nadávkován na kolonku. Sorbent zadržuje analyt po celou dobu dávkování a vzorek se zakoncentrovává. Někdy mohou být sorbentem zachyceny i některé složky matrice, ale většina z nich projde nezachycena.

3) promytí kolonky – kolonka se promývá vodou nebo vhodným rozpouštědlem k odstranění zachycených interferujících složek z matrice vzorku.

60

4) vymytí analytu – analyt se eluuje vhodným rozpouštědlem. Eluent musí být zvolen tak, aby došlo k porušení interakcí mezi analytem a sorbentem, ale zároveň musí dojít k co nejmenšímu vymytí ostatních složek zachycených sorbentem. 1.4

Mikroextrakce tuhou fází

Mikroextrakce tuhou fází (Solid Phase Microextraction, SPME) je bezrozpouštědlová technika přípravy vzorku vyvinutá v 90. letech 20. století Januszem Pawliszynem2. SPME je jednoduchá a účinná sorpčně - desorpční technika při které dochází k zakoncentrování analytu. Nejdůležitější součástí SPME extrakce je cca 1 cm dlouhé křemenné vlákno potažené vrstvou chemicky vázané stacionární fáze. Vlákno je spojeno s ocelovým pístem a umístěno v duté ocelové jehle, která jej chrání před mechanickým poškozením(Obr.3). píst stojan bezpečnostní šroub pístu z-štěrbina okno pro barevný kód vlákna

Analyty jsou sorbovány na SPME vlákně dokud není dosaženo rovnováhy. Metoda je použitelná ve spojení s plynovou (GC liner) i kapalinovou (speciální SPME/HPLC interface) chromatografií. Dává lineární výsledky v širokém koncentračním rozsahu. Základní kroky SPME extrakce:

nastavení jehly pružina septum jehla propichující septum trubice připevňující vlákno křemenné vlákno

Obr. 3: Detail SPME vlákna a jeho držák

1) sorpce - při sorpci je vlákno zataženo v ochranné jehle, která propíchne septum v zátce nádobky, ve které je umístěn vzorek. Posunutím pístu se vlákno vysune do kapalného vzorku popř. do prostoru nad jeho hladinou v případě headspace analýzy. Poté dochází k sorpci analytu do vrstvy pokrývající vlákno. K sorpci dochází tak dlouho, dokud není dosaženo sorpční rovnováhy. Po dosažení rovnováhy je vlákno zasunuto zpět do ochranné jehly a spolu s ní je vytaženo z nádobky.

2) desorpce – při desorpci je jehla zavedena do nástřikového prostoru plynového chromatografu, kde dochází k tepelné desorpci analytu, který je poté unášen na GC kolonu. V případě použití HPLC chromatografie je potřeba k desorpci SPME/HPLC adaptér, v němž je analyt eluován z vlákna rozpouštědlem a poté je mobilní fází unášen na kolonu. U HPLC desorpce rozlišujeme dva typy desorpce – dynamická a statická. 2

APLIKACE EXTRAKČNÍCH TECHNIK PRO ANALÝZU VÝBUŠNIN

2.1

Stanovení 2,4,6-trinitrotoluenu v půdě

Manipulace se střelivinami a jinou vojenskou municí mají za následek přítomnost různých organických látek v půdách a podzemních vodách1. Nejčastěji se jedná o deriváty nitro látek a aminů. Tyto látky pocházející z výbuchů či z uložené munice v zemi jsou toxické pro rostlinou i živočišnou vegetaci. Vzhledem ke své toxicitě, karcinogenitě a přítomnosti

61

v podzemních vodách představuje TNT mezinárodní ekologický problém. S tím souvisí i požadavky na stanovení těchto znečišťujících látek. TNT se vyskytuje ve formě bílých jehliček a je slabě rozpustný ve vodě (rozpustnost závisí na teplotě: 0,015g/25°C; 0,047g/50°C; 0,147g/100°C). Jeho biodegradační a fotolytické produkty představují vysoce reaktivní komponenty, často s vysokou polaritou a rozpustností ve vodě. Proto mohou být více škodlivé než samotný TNT. EPA (the US Environmental Protection Agency)3 udává, že TNT je toxický při koncentraci 2 µg.l-1. 2.1.1 Vysokotlaká extrakce rozpouštědlem Extrakty reálných vzorků půdy kontaminované 2,4,6-TNT byly připraveny za těchto podmínek: navážka 10g půdy, tlak 100 barů, teplota 80 °C, rozpouštědlo acetonitril, počet extrakčních kroků 2 po 10 minutách. Extrakty byly zakoncentrovány na 2 ml a analyzovány pomocí GC/MS-EI. Porovnáním retenčních časů standardů byly v kontaminované půdě identifikovány a kvantifikovány látky uvedené v tabulce I a znázorněné na obr. 4. 1750e3 1500e3 1250e3

2,6 DNT

1000e3 750e3 500e3

TNT 2,3 DNT 3,4 DNT

250e3 4

3

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Obr. 4: Ukázka chromatogramu kontaminované půdy Tab. I: Látky identifikované v kontaminované půdě

2.2

Retenční čas [min]

Identifikovaná látka

Koncentrace [μg/g]

7,2

2,6 - DNT

17,7

7,8

2,3 - DNT

13,8

8,4

3,4 - DNT

12,6

9,9

TNT

1790

Stanovení nitroesterů ve vodných vzorcích

Energeticky výkonnější výbušniny než nitrolátky jsou nitroestery, které jsou však nejméně chemicky a termicky stabilní. Mezi nejvíce používané nitroestery patří nitroglycerin a ethylenglykoldinitrát 4 .

62

Nitroglycerin (NG) je olejovitá kapalina, v čistém stavu bezbarvá a čirá. NG má slabě nasládlý pach, palčivou nasládlou chuť a je jedovatý. Ve vodě je NG špatně rozpustný a rozpustnost je závislá na teplotě (v 1 l vody se při teplotě 20 °C rozpustí 1,5 g NG). Nitroglycerin je hlavní složkou dynamitu patentovaného roku 1866 Alfredem Nobelem. Dnes hlavně používá v průmyslových trhavinách, v dynamitech, ale i jako přísada do vícesložkových pohonných hmot. Své uplatnění našel také v medicíně jako lék ke snížení krevního tlaku a rozšiřování cév. Ethylenglykoldinitrát (EGDN) je průhledná, bezbarvá, kapalná výbušnina. EGDN je chemicky stabilnější, méně citlivý k nárazu a ve vodě poněkud více rozpustný než nitroglycerin (v 1 l vody se při teplotě 20 °C rozpustí 5 g EGDN). Ethylenglykoldinitrát má podobné využití jako nitroglycerin, je běžná součást trhavin dynamitového typu (ve směsi s NG použití jako důlní, plastická trhavina) a detekční přísada pro plastické trhaviny. Jelikož se nitroestery v kontaminovaných vodách vyskytují často v nízkých koncentracích je nutné provést před samotným stanovením předseparační úpravu vzorku. Ideální extrakční metoda by měla být rychlá, levná a nenáročná na provedení. 2.2.1 Extrakce tuhou fází Extrakce tuhou fází probíhala na zařízení VISIPREP SPE Vacuum Manfold. SPE kolonky byla kondicionována nejprve 10 ml methanolu a poté 10 ml redestilované vody. Extrahováno bylo vždy 200 ml redestilované vody obsahující 10 µg/ml EGDN a 10 µg/ml NG. Eluce probíhala 10 ml acetonitrilu. Eluát se před nadávkováním do HPLC/UV zakoncetrován na 1 ml. Testovány byly SPE kolonky obsahující různé sorbenty: Waters Oasis HLB (divinylbenzen a N-vinylpyrolidon); Supelco Discovery DSC-18LT (monomerní oktadecyl); STRATA X (polymerní patentovaný sorbent); STRATA XC ( 33 µm cattion mixed polymer); Supelco DSC-C8 (oktyl monomerní). Nejlepší účinnost poskytovala kolonka Waters Oasis HLB (Obr. 5). Pro proměření detekčního limitu a vzorku reálné vody kontaminované nitroestery byla byla kolona Waters Oasis HLB. Při aplikaci vzorků byly dodrženy podmínky zvolené pro optimalizaci. Detekční limit je pro oba nitroestery 0,23 µg/ml. Na obr. 6 je ukázka chromatogramu reálné vody, ve které byly nalezeny tyto koncentrace esterů: 6,27 µg/ml EGDN a 4,60 µg/ml NG.

100

EGDN

Napětí [mV]

Výtěžnost [%]

800

NG

80 60 40 20

600

EGDN

400

NG

200 0 0

0 WO

HL

B SD

D

-1 SC

8L

T

a S tr

ta

X St

ra ta

XC S t ra

ta

C1

8E Su

pe

lc o

C DS

-C

8 Su

pe

lc o

C DS

-P

H

1

2

3

4

5

6

Čas [min]

SPE k olonk a

Obr. 5: Porovnání SPE kolonek Obr. 6: Chromatogram reálného vzorku vody

63

2.2.2 Mikroextrakce tuhou fází Pro mikroextrakci tuhou fází v kombinaci s kapalinou chromatografií byl použit SPME/HPLLC holder od firmy Supelco. Nejprve bylo vybráno SPME vlákno s nejvyšší extrakční výtěžností. Testovány byly tyto vlákna: raeboxen/polydimethylsiloxan (CAR/PDMS); polydimethylsiloxan/divinylbenzen (PDMS/DVB); carbowax/divinylbenzen (CW/DVB) a carbowax/pryskyřice (CW/TPR). Pro následující optimalizace bylo zvoleno PDMS/DVB vlákno(Obr. 7). Optimalizovány byly následující parametry: doba sorpce a desorpce, teplota sorpce, vliv míchání na sorpci a vliv přídavku NaCl do roztoku. Detekční limit byl proměřen při následujících podmínkách: PDMS/DVB vlákno; vodný roztok obohacený 10 % NaCl; přímá sorpce 20 min; statická desorpce 5 min; teplota sorpce 50 °C a v 8 ml vialkách; statické míchání. Separace byla prováděna kapalinovým chromatografem s UV detekcí. Detekční limit je pro oba nitroestery 0,07 µg/ml (Obr. 8). V reálných vzorcích byly zjištěny následující koncentrace nitroesterů: 6,52 µg/ml EGDN a 4,14 µg/ml NG.

EGDN

NG

NG

EGDN

6000

N a p ě t í [m V ]

Intenzita [mV]

8000

4000 2000 0 CW/TPR

CAR/PDMS PDMS/DVB

CW/DVB

Druh vlákna

Obr. 7: Porovnání SPM vláken

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

y = 622x + 269,61 R2 = 0,9938

y = 268,25x + 353,58 R2 = 0,9992 0

1

2

3

4

5

Koncentrace [µg/ml]

Obr. 8: Detekční limit

ZÁVĚR Cílem práce bylo nalezení vhodných analytických technik pro stanovení výbušnin a jejich reziduí ve vzorcích životního prostředí. Ve všech příkladech aplikací bylo dokázáno, že zvolené extrakční techniky jsou vhodné pro tato stanovení a detekční limity technik jsou dostačují vzhledem k toxickým limitům. Poděkování: Práce vznikla za finanční podpory grantových projektů MŠM 0021627502 a FRVŠ 1932/2005. LITERATURA: [1]

J. Yinon, S. Zitrin: Modern Methods and Applications in Analysis of Explosives, John Wiley & Sons, Chichester (1993).

[2]

J. Pawliszin: Solid Phase Microextraction: Theory and Practice. John Wile & Sons, New York, (1997).

[3]

Psillikakis E., Kalogerakis N.: J. of Chromatogr. A 938 113 (2001).

64

[4]

Ježová V., Skládal J., Eisner A., Ventura K.: Proceeding of the VIII. seminar: New trendes in research of energetic material. 797 (2005).

Kontaktní adresa: Věra Ježová, Aleš Eisner, Jana CHalánková, Karel Ventura, Univerzita Pardubice, Fakulta chemicko-technologická, Katedra analytické chemie, nám. Čs. legií 565, 532 10 Pardubice, E-mail: [email protected].

65

IDENTIFIKACE NEBEZPEČNÉ LÁTKY Z HAVÁRIE CISTERNY NA DÁLNICI D1 ZE DNE 2. ZÁŘÍ 2004 Josef Osvald, Pavel Kukleta Klíčová slova: Hasičský záchranný sbor (HZS), havárie s unikem nebezpečných látek, identifikace nebezpečných látek (NL), plynová chromatografie (GC), infračevená spektrometrie (IR). 1

ÚVOD

Hasičský záchranný sbor ČR plní úkoly vymezené zákony č. 238/2000 Sb. o Hasičském záchranném sboru, č. 133/1985 o požární ochraně ve znění pozdějších předpisů, č. 239/2000 o integrovaném záchranném systému, č. 240/2000 o krizovém řízení a změně některých zákonů (krizový zákon). Hlavním úkolem HZS je ochrana zdraví a života občanů , majetku a životního prostředí, při ohrožení požáry, živelními pohromami a jinými mimořádnými událostmi. Nedílnou součástí této činnosti je ochrana zdraví a života občanů , majetku a životního prostředí, při ohrožení, vznikajících při haváriích s unikem nebezpečných látek. 2

POPIS UDÁLOSTI ZE DNE 2. ZÁŘÍ 2004

Dne 2. září 2004 v 17:56 hodin byl na krajské operační a informační středisko HZS kraje Vysočina nahlášen požár kamionu na 121,5 km dálnice D1 ve směru na Prahu. Jednalo se o dopravní nehodu tahače typu Scania R124 s cisternovým návěsem, který převážel asi 33 000 litrů kapalné chemické látky. Cisterna se při předjíždění pravděpodobně dostala do kolize s kamionem, který jel před ní, dostala se do smyku a následně došlo k jejímu převrácení napříč celého dálničního tělesa. 7)

66

Obr. 1: Fotodokumentace zásahu – zdroj: média na internetu

67

Obr. 2: Mapa místa mimořádné události 3

PROVEDENÉ ANALÝZY

Vzorek kapalné chemické látky, odebraný zasahujícími příslušníky HZS, byl převezen do chemické laboratoře 2. září 2004 ve 23:20 hod. Úkolem bylo ověřit zda se jedná o 2,4,4trimethyl-1-penten (takto byla látka identifikována krajským operačním a informačním střediskem HZS kraje Vysočina podle UN kódu 3295) a zda chemická látka neobsahuje aromáty, které by mohly svoji karcinogenitou ohrozit zasahující příslušníky HZS. 3.1

Vyhledávání v databázích – UN 3295

Podle modulu Látky počítačového programu I.S. Havárie 2.03 UN kódu 3295 odpovídá 1-okten6) Podle kanadské databáze EMERGENCY RESPONSE GUIDEBOOK UN kódu 3295 odpovídají hydrocarbons liquid n.o.s. - tekuté uhlovodíky bez bližšího určení 5) 3.2

Destilační křivka

Bylo předestilováno 100 ml neznáme látky na jednoduché destilační aparatuře s Liebigovým chladičem. Výsledky jsou v tabulce 1 a destilační křivka na grafu1.

68

Tab. 1: Teploty při destilaci 0 74

Objem destilátu (%) Teplota

10 78

20 81

30 82

40 83

50 84

60 85

70 88

80 90

90 93

96 104

Teplota destilace [°C]

130 110 90 70 50 0

25

50

75

100

Objem destilátu [%]

Graf 1: Destilační křivka 3.3

Stanovení hustoty Hustota byla stanovena pyknometricky.

Zjištěná hustota: 3.4

0,7007 g/ml

Analýza na GC Podmínky analýzy:

Přístroj: Kolona:

GC 94 LABIO, detektor FID SPIRA KI 19 (25 m, ID 0,32 mm, film 2,5 m, fáze 14% cyanopropylphenyl-methylsiloxane) Nástřik: spolit,spliteles, nosný plyn: N2 Teplotní program: (t1=40°C/1 min., N1=10°C/min., t2=280°C/5min., p=20 kPa)

Chromatogram z nástřiku 0,2 l vzorku byl porovnán s retenčními časy hexanu, heptanu, benzenu , toluenu a s chromatogramem lékařského benzínu. Výsledky jsou shrnuty v tabulkách 2,3,4, a v grafech 2,3,4,5. Tab. 2: Retenční časy vzorku Poř. č. peaku 1 Retenční čas 6,1 Plocha peaku [%] 0,1 Retenční index 500

2 6,5 0,5 521

3 7,2 0,2 546

4 8,0 3,3 572

5 8,3 5,1 585

6 8,8 5,7 600

7 9,5 4,8 626

8 10,0 12,4 642

9 10,6 14,6 666

69

17 16,3 0,3 861

18 18,4 0,1 931

13,81 14

18,41 18

13,54 13

12,91 12

9,49 7

7,24 3

6,52 2

100

6,09 1

200

8,76 6

7,97 4 8,34 5

400 300

16 15,4 0,7 833

16,33 17

500

15 14,5 1,8 800

15,45 16

600

14 13,8 1,7 775

14,54 15

700

13 13,5 1,4 766

11,59 11

12 12,9 4,8 745

10,62 9 10,93 10

11 11,6 14,6 700

9,95 8

Voltage [mV]

Poř. č. peaku 10 Retenční čas 10,9 Plocha peaku [%] 28,0 Retenční index 676

0 7,5

10,0

12,5

15,0

17,5 Time [min.]

Graf 2: Chromatogram vzorku 3.5

Důkaz aromatických uhlovodíků

Důkaz byl proveden formaldehydem v prostředí koncentrované kyseliny sírové, kdy aromatické uhlovodíky poskytují intenzivně hnědě až červenohnědě zbarvené produkty, které jsou v kyselině sírové nerozpustné a vylučují se ve formě pryskyřičné hmoty.1) Výsledek zkoušky byl negativní. Tab. 3: Retenční časy lékařského benzínu Poř. č. peaku Retenční čas Plocha peaku [%] Retenční index

1 6,1 5,9 500

2 6,6 3,9 516

3 7,3 1,8 543

4 8,0 48,0 570

5 8,4 25,0 585

6 8,8 11,0 600

7 10,0 4,4 645

400

8,03 4

Voltage [mV]

70

8,43 5

300

10,03 7

8,83 6 7,30 3

100

6,57 2

6,13 1

200

0 5

6

7

8

9

10

11 Time [min.]

Graf 3: Chromatogram lékařského benzínu Tab. 4: Retenční časy hexanu, heptanu, benzenu a toluenu 1 hexan 8,7 600

2 heptan 11,6 700

3 benzen 12,3 723

4 toluen 15,5 833

12,27 - benzen

0,75

0,50

11,62 - heptan

0,25

15,45 - toluen

1,00

8,67 - hexan

Voltage [1E3 mV]

Poř. č. peaku Název láky Retenční čas Retenční index

0,00 8

10

12

14

16 Time [min.]

Graf 4: Chromatogram hexanu, heptanu, benzenu a toluenu

Voltage [mV]

71

700 600

Benzín lékařský

500

Vzorek hořlaviny

400 300 200 100 0 7,5

10,0

12,5

15,0

17,5 Time [min.]

Graf 5: Chromatogramy vzorku a lékařského benzínu 3.6

IR spektrometrie

Vzorek byl proměřen na tabletě KBr (0,04 g KBr) při vlnočtech 4000 -.400 cm-1 a při vlnočtech 3150 – 2750 cm-1, pro stanovení poměru CH3 a CH2 skupin. Absorpční pásy ve vzorku byly při vlnočtech 2966 cm-1, 2933 cm-1, 2880 cm-1, 1467cm-1, 1384 cm-1. Viz graf č. 7 Vypočtený poměr CH3 a CH2 skupin podle IR spektra zobrazeného na grafu č 7 je 0,78 – tento poměr odpovídá tabelované hodnotě pro benzíny3) 0,721 0,70

2933,2791 2966,4921

0,65 0,60 0,55 0,50

2879,9077

0,45 0,40 A 0,35 1384,0997

0,30 1467,0314

0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,000 3955,3

3600

3200

2800

2400

2000

1800

1600

1400

1200

1000

800

cm-1

Graf 6: IR spektrum vzorku při vlnočtech 4000 – 400 cm-1

600

408,4

72

1,09

1,0 2961,6869

0,9

0,8 2932,0388

0,7

0,6 A

2875,7109

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

-0,01 3149,1

3100

3000

2900

2800

2750,4

cm-1

Graf 7: IR spektrum vzorku při vlnočtech 3150 – 2750 cm-1.

2931,5913 2967,8040

n-heptan

2874,1231

1467,3999 1384,0042 724,3955

A 2966,4921

2933,2791

2879,9077

vzorek 1384,0997 1467,0314 415,9009

4000,0

3600

3200

2800

2400

2000

1800

1600

1400

1200

1000

800

600

400,0

cm-1

Graf 8: IR spektrum vzorku a n-heptanu 4

INTERPRETACE VÝSLEDKŮ ANALÝZ A DISKUSE

Úkolem chemické laboratoře HZS bylo identifikovat neznámou hořlavou látku, případně stanovit její nebezpečné vlastnosti. Hlavní důraz byl kladen na možné nebezpečí pro zasahující jednotky HZS, především zda se neznámá látka neobsahuje aromatické uhlovodíky jako potencionální karcinogeny.

73

Po zjištění, že se jedná o těkavou hořlavou látku a podle předaného UN kódu (3295) jsme přikročili ke zjištění destilačního rozpětí a stanovení hustoty kapaliny. Destilační rozpětí (74 – 104 °C ) a hustota 0,7007 g/ml odpovídají benzínům při atmosférické destilaci ropy. Atmosférickou destilací ropy vznikají kromě jiných frakcí i frakce tzv. lehkých benzínů s bodem varu 30 – 100 °C a frakce tzv. těžkých benzínů s bodem varu 100 200 °C.8) Tyto slouží k výrobě automobilových benzínů, ale i k výrobě uhlovodíkových rozpouštědel. Podle destilačního rozpětí rozlišujeme tyto základní typy uhlovodíkových rozpouštědel:1) a) Petrolejový ether. Je to nejtěkavější podíl benzínové frakce s destilačním rozmezím 30 – 70 °C a hustotou 0,645 – 0,665 g/ml b) Technické benzíny. Vyrábějí se v několika druzích s destilačním rozmezím: 60 – 80 °C, 80 – 110 °C, 90 – 150 °C, 80 – 120 °C, 50 – 110 °C, 50 – 160 °C. c) Lakové benzíny. Je to směs výše vroucích uhlovodíků s destilačním rozmezím 140 – 220 °C. d) Petrolej. Směs uhlovodíků s destilačním rozmezím 140 – 300 °C, s maximální hustotou 0,855 g/ml. e) Ostatní druhy. Např. 1) Benzín lékařský – s destilačním rozpětím 30 – 100 °C a hustotou 0,660 – 0,690 g/ml, zbavený aromatických uhlovodíků, vyhovující pro farmaceutické výrobky. 2) Čistící benzín s destilačním rozpětím 85 – 160 °C a maximální hustotou 0,765 g/ml V chromatogramu vzorku mají hlavní píky (které tvoří 95,3 % z plochy všech píků) retenční časy v rozmezí 8 – 13 minut - viz tabulka 2.a graf 2. To znamená, že většina píků se nachází v oblasti retenčních časů hexanu (8,67 min) a heptanu (11,62 min) - viz graf 4. Při porovnání retenčních časů vzorku a lékařského benzínu zjistíme shodné retenční časy lékařského benzínu a prvních osmi píku vzorku – viz tabulka 2,3 a graf 5. V chomatogramu vzorku se nevyskytoval pík s retenčním časem blízkým benzenu (12,3 min). Pík s retenčním časem shodným s retenčním časem toluenu (15,5 min) byl ve vzorku nalezen, tvořil však pouze 0,68 % z plochy všech píků. Podobnost píků potvrdily i stanovené retenční indexy. Že se může jednat pouze o stopy toluenu vyplývá i z porovnání teplot destilace vzorku (max. teplota 105°C) s bodem varu toluenu (110,8°C). Důkazová zkouška na aromatické uhlovodíky formaldehydem, v prostředí kyseliny sírové, byla negativní. Že ve vzorku nejsou obsaženy aromatické uhlovodíky nebo jsou obsaženy pouze ve stopách, nám rovněž potvrdil spektrogram v IR oblasti, kdy v spektru zcela chyběl absorpční pás při vlnočtu 3050 cm-1, který je charakteristický pro aromáty.10) Ve spektru vzorku byly pouze absorpční pásy charakteristické pro CH3 a CH2 skupiny, o čemž svědčí porovnání spektra vzorku se spektrem n-heptanu – viz graf 8. Na základě provedených analýz a porovnáním s referenčními materiály a údaji v literatuře, byl učiněn závěr, že neznámá látka z havarovaného kamionu je směs alifatických uhlovodíků jejichž bod varu a hustota odpovídá lehčím frakcím technického benzínu. 5

ZÁVĚR

Odborná činnost chemických laboratoří na místě zásahu je zaměřena zejména na zabezpečení speciálních úkolů v oblasti chemického a radiometrického průzkumu, dozimetrické, laboratorní chemické i radiologické kontroly, k zabezpečení ochrany zasahujících hasičů, složek IZS a obyvatelstva v případě mimořádných událostí s únikem nebezpečných látek, při teroristických útocích nebo při použití ZHN.4)

74

Analýza vzorku z havárie kamionu na dálnici D1 je jeden z příkladů činnosti chemických laboratoří HZS. Vzorek byl odebrán zasahujícími jednotkami HZS 2. září 2004 a ve 23:20 předán pracovníkům výjezdové skupiny chemické laboratoře HZS JmK v Tišnově. Výsledky analýz byly pro zasahující jednotky k dispozici ráno 3. září 2004 v 8:00 hod. O rozsahu havárie svědčí i následující údaje.9) -

Při havárii cisterny: uhořel její devatenáctiletý řidič 33 000 l technického benzínu uniklo na dálnici a do kanalizace požárem byli ohroženi obyvatele vesnice Kozlov benzín směřoval k obci pod polem se slámou a několikrát explodoval benzín vyhořel z 80 procent, zbytek se podařilo zastavit nornými stěnami a s použitými sorbenty odčerpat a odtěžit na místě havárie bylo odčerpáno a ekologicky zlikvidováno 30 m3 kontaminovaných vod bylo odtěženo asi 500 tun zasažené zeminy kanalizace a drenáže byly propláchnuty asi 20 m3 vody, kontaminovaná voda ekologicky zlikvidována kromě dálniční kanalizace a Kozlovského potoka nebyla zjištěna kontaminace povrchových a podzemních vod v okolí místa havárie

Na úspěšném zvládnutí havárie a snížení následných škod se podílely všechny zasahující složky IZS včetně chemické laboratoře HZS JmK v Tišnově. LITERATURA: [1]

Šedivec V., Flek J.: Příručka analýzy organických rozpouštědel, SNTL Praha 1968.

[2]

Horáková M., Lischke P., Grünwald: Chemické a fyzikální analýzy vod, SNTL Praha 1989.

[3]

Uchytil B.: Identifikace struktury sloučenin metodou infračervené spektrometrie, ICO ČR Lázně Bohdaneč 2000.

[4]

MV ČR GŘ HZS ČR: Koncepce chemické služby Hasičského záchranného sboru ČR, Praha 2005.

[5]

MINISTRY OF TRANSPORT: Emergency respose guidebook, Ottawa 2000.

[6]

Databáze I.S. HAVÁRIE 2.03 modul Látky ICO ČR Lázně Bohdaneč 2000.

[7]

Bílek L., Šetek J.: Dálnice zažila ohnivé peklo, časopis 112, 12/2004.

[8]

UNIVERSITA PARDUBICE: Přehled základních c-surovin a jejich zpracování, http://www.upce.cz/priloha/ktol-csuroviny.pdf, staženo 30.5.2005.

[9]

Enviweb: Ekologická havárie cisterny na dálnici je pod http://www.enviweb.cz/?secpart=_archiv_faaic_cz_&search=cisterna, 31.5.2005.

kontrolou, staženo

[10] Horák M., Papoušek D.: Infračervená spektra a struktura molekul, Academia Praha 1976. Kontaktní adresa: Josef Osvald, Pavel Kukleta, Chemická laboratoř HZS JmK, Cihlářská 1, 666 03 Tišnov, [email protected], [email protected].

75

NĚKTERÉ TOXIKOLOGICKY VÝZNAMNÉ MYKOTOXINY A MOŽNÉ ZDRAVOTNÍ RIZIKO František Malíř, Tomáš Roubal, Jan Severa, Blanka Řičařová, Eva Rolečková, Hana Marešová Motto: " Sanitas est bonum non cognitum nisi perditum. Zdraví je dobro, o němž nevíme, dokud ho neztratíme" (Walther 27 497) 1

ÚVOD

MYKOTOXINY patří mezi toxiny přírodního původu ("naturální" toxiny nebo tzv. "biotoxiny"). Jedná se o toxiny produkované mikroskopickými houbami. (U hub s makrostélkou, plodnicí, se hovoří o tzv. houbových jedech). MYKOTOXINY jsou produkovány vláknitými mikroskopickými houbami (tvořícími mikrostélku, tzv. mikromycety, Ascomycotina, vřeckovýtrusé), zařazenými do samostatné říše hub, mezi houby pravé, Eumycota. Nejznámější mykotoxiny jsou metabolickými produkty 5 rodů “vláknitých mikromycetů”, zejména Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Claviceps, Alternaria, avšak jsou produkovány ve všech taxonomických skupinách vláknitých mikromycetů. Název mykotoxiny pochází z řeckého „MYCOS“ , tj houba a latinského „TOXICUM“, tj. jed (otrava). Jedná se o toxické sekundární metabolity vláknitých mikromycetů a jedny z nejzávažnějších kontaminantů přírodního původu. Mykotoxiny jsou vysoce nebezpečné chemické látky známé svými toxickými účinky. Strukturně to jsou odlišné komplexní organické sloučeniny o nízké molekulové hmotnosti, které představují chemicky heterogenní skupinu (podle meziproduktů primárního metabolismu plísní, které jsou jejich společnými prekursory). Patří do ní polyketidy (acetylkoenzym A), terpenové deriváty (z mevalonové kyseliny), cyklické polypeptidy a jejich deriváty (výchozí látkou jsou aminokyseliny). V současnosti je známo více než 300 mykotoxinů. Odhad FAO/WHO uvádí, že cca 25 % potravin a surovin je kontaminováno mykotoxiny. Kontaminace potravin mykotoxiny se vyskytují přirozeně, jsou nepředvídatelné a nelze jim zamezit nebo je úplně odstranit, ani při dodržování doporučených správných zemědělských a technologických postupů, vedoucích ke snížení koncentrace mykotoxinů během vegetačního růstu plodin, sklizně a skladování. Tkáně zvířat obsahují nižší koncentrace mykotoxinů než rostlinné tkáně. Více ohroženy jsou proto děti a kojenci, vzhledem ke značně vysokému přívodu kontaminovaného mléka a mléčných produktů, svému specifickému metabolismu, nedostatečně vyvinutému imunitnímu systému, nízké hmotnosti a vysoké buněčné aktivitě. Proto musejí být mykotoxiny regulovány. Účelem regulace jejich obsahu v potravinách a krmivech je snížení ekonomických ztrát a zejména dopadu toxických účinků mykotoxinů na zdraví lidí a zvířat. Vyhl. MZ ČR č. 305/2004 Sb. stanovuje v souladu s právem ES přípustná množství a druhy kontaminujících látek, toxikologicky významných látek a látek vznikajících činností mikroorganismů, které smějí potraviny a suroviny obsahovat (z mykotoxinů: DON, zearalenon). Ve vyhlášce 305/ 2004 Sb. jsou dále uvedeny nařízení Komise ES, které jsou pro ČR z hlediska obsahu mykotoxinů v současné době zásadní, kterých je zatím 7. V ES jsou regulovány aflatoxiny (B1, B2, G1, G2 , M1), ochratoxin A a patulin. Navíc pro tyto a další MT existují v EU tzv. expoziční limity (ALARA - v co nejmenší rozumně dosažitelné míře, PTDI - provizorní tolerovatelný denní přívod, PMTDI provizorní maximální tolerovatelný denní přívod, PTWI - provizorní tolerovatelný týdenní přívod),

76

stanovené JECFA FAO/WHO (Společný výbor expertů pro additiva a kontaminanty) a EU SCF (Vědeckým výborem pro potraviny). V rozvojových zemích jsou mykotoxiny často neregulovány, protože dodržení legálního limitu by mělo za následek chybění potravin a obrovské navýšení jejich ceny.Primární kontaminace znamená, že k výrobě potravin se již používají suroviny kontaminované mykotoxiny. Sekundární kontaminace vychází z růstu toxinogenních mikromycetů na potravině, která je nevhodně uložená (např. ve vlhku) s následkem následné produkce mykotoxinů. V lidském okolí se ve významných množstvích vyskytuje asi 20 mykotoxinů, např.: aflatoxiny: B1, B2, G1, G2, M1, ochratoxin A (OTA), patulin, fumonisiny B1, B2, B3, citrinin, trichotheceny, jako deoxynivalenol (DON), případně T-2 toxin, aj., dále např. zearalenon. Mykotoxiny vykazují různé toxické účinky, např. genotoxické, mutagenní, karcinogenní (dle IARC, WHO, US EPA), teratogenní, estrogenové, imunotoxické, hemoragické, neurotoxické, cytotoxické, nefrotoxické, hepatotoxické. Lidská populace je exponována mykotoxinům majoritně, zejména prostřednictvím potravinového řetězce a dále minoritně, buď inhalačně nebo dermálně, kdy jsou exponovány pouze určité skupiny profesionálně exponovaných pracovníků, např. v zemědělství, textilním průmyslu, v laboratořích atd. Expozici obyvatelstva prostřednictvím dietárního přívodu dělíme na přímou, kdy dochází ke konzumaci kontaminovaných obilnin, olejnin, koření, čajů, atd. a právě vegetariáni mohou mít zvýšenou zátěž z přímé expozice. U expozice nepřímé se jedná o konzumaci kontaminovaného masa, mléka, sýrů, atd. Je však známo, že tkáně zvířat obsahují nižší koncentrace mykotoxinů než rostlinné tkáně, proto děti a kojenci s vysokou konzumací mléka a mléčných produktů jsou podstatně více ohroženi v porovnání s běžnou populací dospělých, a to z důvodu jejich specifického metabolismu, nedostatečně vyvinutého imunitního systému, nízké hmotnosti a vysoké buněčné aktivity. Způsoby hodnocení expozice a zdravotního rizika se provádějí buď odhadem denního přívodu mykotoxinů z potravin, kdy se musí zjistit koncentrace mykotoxinů a znát množství spotřeby potravin. Nebo na základě provádění tzv. biomarkerů mykotoxinů, což jsou vybrané analyty měřené ve tkáních, biologických tekutinách nebo exkretech, které poskytují informaci o kvantitativní úrovni expozice určitému mykotoxinu, např. aflatoxinům, OTA, fumonizinům a DON. MYKOTOXIKÓZA Je patologický stav způsobený mykotoxinem, který má škodlivý vliv na lidský organismus, vyvolává onemocnění, popřípadě smrt. Za účelem relevantního posouzení podílu mykotoxinu na vzniku mykotoxikózy u člověka je třeba zjistit přítomnost mykotoxinu v potravinách, potvrdit expozici člověka uvedenému mykotoxinu, stanovit korelaci mezi expozicí a incidencí onemocnění, zjistit a potvrdit reprodukovatelnost charakteristických symptomů onemocnění u laboratorních zvířat a konečně potvrdit, že způsob toxického účinku je podobný u člověka i u laboratorních zvířat. V současné době je přibližně asi 50 mykotoxinů dáváno do příčinné souvislosti s mykotoxikózami u lidí a zvířat. Např. bylo prokázáno, že aflatoxiny způsobují aflatoxikózu. Dále se uvažuje o možném podílu ochratoxinu A a citrininu u tzv. Balkánské endemické nefropatie (BEN) a nádorů ledvin, nebo podílu fumonisinů na vzniku karcinomu jícnu atd. Mezi nejvýznamnější mykotoxikózy patří např. AFLATOXIKÓZA. Aflatoxiny způsobují akutní aflatoxikózu a chronickou aflatoxikózu, jakou je např. primární jaterní karcinom. Uvažuje se také o možném podílu aflatoxinů na Reyově syndromu a Kwashiorkoru, i když v současnosti na to existují protichůdné názory. Aflatoxiny představují závažné riziko pro zdraví člověka a dalších živých organismů. Akutní aflatoxikóza u lidí obvykle rezultovala z vysokého přívodu aflatoxinů potravinami (např. manioku, kukuřice v rozsahu cca 1,1 - 15,6 mg. kg-1 po dobu 5 - 30 dní; příp.několik týdnů). Na základě aflatoxikózy v Indii (v r. 1974) byla spočítána

77

akutní letální dávka aflatoxinů pro dospělého ve výši 10 - 20 mg. Krátkodobá dietární expozice AFB1 1,7 mg.kg-1t. hm. údajně způsobuje závažné poškození jater. Akutní aflatoxikóza nebyla prokázána při konzumaci stravy o koncentraci AFB1 340 ug.kg-1t.hm. den-1 (na základě extrapolace dat na člověka z experimentů na primátech). Symptomy akutní aflatoxikózy se projevují jako akutní hepatitida. Dalšími příznaky jsou zvýšená teplota, anorexie, diarhea, bolestivost na dotek v oblasti jater a ascites. Při histopatologickém vyšetření byla prokázána steatoza jater, centrilobulární nekróza a tuková infiltrace, ve vzorcích jater byl vždy prokázán AFB1. Že případy akutní aflatoxikózy jsou stále aktuální, svědčí i informace ČTK z května 2004, kdy v Keni došlo u lidí ke dvěma případům akutní aflatoxikózy. V prvním případě došlo v důsledku požití kukuřice kontaminované aflatoxiny ke 26 případům úmrtí. Symptomy akutní aflatoxikózy byly vomitus, algický břišní syndrom, plicní edém, tonicko-klonické křeče, koma a úmrtí na edém mozku a otok jater, ledvin, srdce (pozn.: pravděpodobně se jednalo o intersticiální edémy). Ve druhém případě došlo po konzumaci obilí kontaminovaného aflatoxiny k 51 případům úmrtí. Symptomy aflatoxikózy byly následující: ikterické oči, vomitus, bolesti břicha a otok nohou, celková slabost, somnolence a netečnost, koma a úmrtí. Tj. akutní aflatoxikóza u lidí, po přívodu aflatoxinu kontaminovanou potravou, se často projevila jako akutní hepatitida a následoval exitus. Z tohoto pohledu byl v USA v r.1966 popsán kuriozní případ, kdy došlo k suicidálnímu pokusu u mladé ženy, která požila 5,5 mg čistého AFB1 během 2 dnů. Byla hospitalizována pro přechodné obtíže, a to nesvědivý skvrnitý raš, nauzeu, bolesti hlavy, pak byla propuštěna. O 6 měsíců později dotyčná žena požila 35 mg čistého AFB1 během 14 dnů a objevily se u ní pouze nauzea, následně byla propuštěna. Vždy jí byla vyšetřena krev a moč, dále jí bylo provedeno rtg. a sonografické vyšetření, počítačová axiální tomografie břicha, jater, sleziny a bioptické mikroskopické vyšetření jater se závěrem, že se jedná o normální nález. Žena žila dalších 14 let a při pitvě u ní nebyly zjištěny žádné příznaky onemocnění nebo poškození. Je třeba připomenout, že je prokázáno, že hepatotoxicita u dobře živených osob je nižší než u exprimentálních zvířat. Dále, že je důležitá doba expozice, individuální vnímavost, věk, zdravotní stav, pohlaví, genetická výbava, výživový stav a nemalou úlohu hraje také interakce s jinymi toxikanty. Zesílit aflatoxikózu může vitaminová deficience, podvýživa, alkoholismus a infekční onemocnění. AFB1 je prokázaný karcinogen pro člověka (IARC WHO), proto je základním cílem snížit expozici člověka a zvířat aflatoxinům (ALARA). Pouze "nulová" expozice aflatoxinům, podle současných mechanistických teorií, by zaručovala nulové riziko vzniku nádorů. Údajně i dietární expozice ve výši 1 ng. kg-1 t.hm.den-1 a nižší již může být již příčinou vzniku nádorů jater. Hepatokarcinogenita AFB1 je spojována s jeho biotransformací (mikrozomálními cytochrom P-450 dependentmími oxidázami) na vysoce reaktivní elektrofilní epoxid AFB1 - 8,9 epoxid, který tvoří addukty s DNA, RNA a proteiny. Je známo, že v případě DNA se váže preferenčně na pozici N7- guaninu a tvoří stabilní addukt, který je zodpovědný za mutagenitu a karcinogenitu AFB1. Navíc bylo prokázáno, že metabolizovaný AFB1 způsobuje bodovou mutaci na kodonu 249 (ser) (změna pořadí bází AGT na AGG) u tumor supresorového genu p53, což má za následek vznik primárního hepatocelulárního karcinomu. Specifická mutace byla detekována v DNA vzorcích získaných z buněk primárního hepatocelulárního karcinomu u pacientů v Tonganu (ČLR). Odhaduje se, že na světě každým rokem dochází k nárůstu primárního hepatocelulárního karcinomu v počtu 473 0000 nových připadů, 80 % případů se týká zejména rozvojových zemí. Proto byl proveden odhad karcinogenní schopnosti aflatoxinů (na základě experimentálních studií na laboratorních zvířatech a epidemiologických studií u člověka), ze kterého plynou následující statistické závěry, a to: v rozsahu od 0,01 (případů rakoviny/ rok u 100 000 obyvatel po přívodu aflatoxinu v ng AFB1.kg-1t.hm.den-1, s nejistotou od 0,002 do 0,03, u lidí, kteří neprodělali virovou B hepatitidu až do 0,3 (případů rakoviny/ rok u 100 000 obyvatel po

78

přívodu aflatoxinu v ng AFB1.kg-1t.hm.den-1, s nejistotou od 0,05 do 0,5, u populace s pozitivní hepatitidou B. Karcinogenní potenci aflatoxinů významně zvyšuje současný výskyt infekční hepatitidy B, případně C. V Koreji, kde existuje vysoký výskyt případů hepatitidy typu B a hepatocelulárního karcinomu, bylo, přes 3 roky, sledováno 370 000 mužů. U nich očkování proti hepatitidě snížilo počet případů hepatocelulárního karcinomu z 215 případů na 8 případů u 100 000 obyvatel. Další významnou mykotoxikózu způsobují např. makrocyklické trichotheceny (satratoxiny, verrukariny, roridiny), produkované Stychybotrys atra – chartarum, a to STACHYBOTRYOTOXIKOZU. Navíc jsou makrocyklické trichotheceny, po jejich inhalační expozici, dávány u lidí dlouhodobě žijících ve vlhkých budovách do příčinné souvislosti s idiopatickou plicní hemosiderózou (Cleveland, USA, 1999). Stachybotrys chartarum (2 chemotypy) produkuje toxické makrocyklické trichotheceny a anthrany. Bylo experimentálně prokázáno, že spóry Stachybotrys chartarum s vysokými koncentracemi makrocyklických trichothecenů (70-145 mg.kg -1) vykazují vysoce destruktivní účinek na plicní tkáň. Nemakrocyklické trichotheceny (HT-2 toxin, T-2 toxin, DAS, NIV) pak způsobují tzv. ATA (alimentární toxickou aleukii). 2

ZÁVĚR

Mykotoxiny se musejí neustále sledovat, protože ve vztahu k lidské populaci představují stále aktuální problém. Neustále jsou objevovány nové mykotoxiny (fuzáriové: YM-47524, YM -47525, visoltricin, roridin L a M, izo-chlamydosporol). Dosud neznáme mechanismy jejich toxických účinků. V podmínkách ČR je považováno za významné zejména riziko jejich pozdních toxických účinků (např. karcinogenita). Celkově jsou však stále nejasné souvislosti mezi chronickými intoxikacemi mykotoxiny a chorobami, zejména po dlouhodobém působení mykotoxinů na člověka. V důsledku globalizace potravinového trhu se může také v podmínkách ČR objevit zvýšené riziko akutního toxického účinku mykotoxinů. Z toho vyplývá, že mykotoxiny představují stálé riziko pro zdraví populace u dietární expozice, a to z důvodu přívodu mykotoxinů kontaminovanou stravou, dále u chorobných stavů s narušenými fyziologickými a detoxikačními schopnostmi a u dětí, z důvodu jejich specifického metabolismu a nedostatečně vyvinutého imunitního systému aj. Nelze nepřipomenout, že riziku jsou vystaveny také některé skupiny profesionálně exponovaných osob a možný bioterorismus s využitím toxinogenních plísní (vláknitých mikroskopických mikromycetů) a mykotoxinů. LITERATURA: Je k dispozici u autorů. Kontaktní adresa: František Malířa, Tomáš Roubala, Jan Severaa, Blanka Řičařováa, Eva Rolečkováa, Hana Marešováa, Zdravotní ústav, Centrum hygienických laboratoří, oddělení xenobiochemie, Národní referenční laboratoř pro biomarkery mykotoxinů a mykotoxiny v potravinách, Nezvalova 958, 501 01 Hradec Králové, e-mail: [email protected].

79

BIOMEDICAL SAMPLING AND ANALYSIS IN VERIFYING ALLEGED USE OF CHEMICAL WEAPONS Jiří Matoušek Summary Biomedical sampling and analysis as a tool for investigation of alleged use (IAU) in the terms of the Chemical Weapons Convention is briefly elucidated. Status and results of ongoing project started by the OPCW Scientific Advisory Board is presented oriented at the possibility of determining characteristic biomarkers in blood, urine and tissues following intoxications by the main types of chemical warfare agents. Recommendations for OPCW verification system are tabled. Key words: Chemical Weapons Convention, investigation of alleged use, environmental samples, biomedical samples, biomarkers, sulphur mustard, lewisite, nerve agents, phosgene, cyanide, BZ. 1

INTRODUCTION

The collection and analysis of biomedical samples is one of the methods referred to in the Chemical Weapons Convention (CWC) in the context of conducting investigations of alleged use (Verification Annex, Part XI, para 17) [1]. The primary objective of collecting and analysing “biomedical samples from human or animal sources (blood, urine, exreta, tissue etc.)“ is to provide facts that would help establish whether chemical weapons had in fact been used. The purpose of biomedical sample analysis in the context of the OPCW is forensic, and not related to the emergency response to an incident. If access to the alleged incident site is rapid, relevant information may be obtained by observation of clinical symptoms and by on-site analysis of environmental samples. Where access to an alleged incident site is delayed or not possible, analysis of biomedical samples from allegedly exposed humans or animals (blood, urine or tissue) may provide a unique source of information, or complement information obtained from the analysis of environmental samples. This paper reviews current status of biomedical sampling and analysis as shown by research results in some experienced States Parties (SPs) with regard to potential capabilities in verifying alleged use of chemical weapons (CW) (based at present only on environmental sampling and analysis), reflects status of ongoing activities in this field stimulated by the OPCW Scientific Advisory Board (SAB) as recommended in its report to the First CWC Review Conference [2]. Information presented in this paper stems mainly from the findings of the current work of the Temporary Working Group (TWG) of the OPCW- SAB. This TWG was constituted by the OPCW Director-General based on the recommendations of the SAB as contained in its report on its sixth session [3]. 2

PREVIOUS ACTIVITIES OF OPCW IN ADDRESSING THE PROBLEM

A previous report on the analysis of biomedical samples from 1999 [4] had pointed to the need for a system to be put in place by the OPCW for analysis of biomedical samples

80

similar to the system in place for environmental samples. On the basis of experience gained it is now clear that a much less regimented and more flexible system is required. In short, the OPCW operating procedures for the analysis of environmental samples are inappropriate for the analysis of biomedical samples. 3

CURRENT STATE-OF-ART IN BIOMEDICAL SAMPLING AND ANALYSIS

At this stage, the OPCW has not put in place a system of collecting, transporting, storing and analysing biomedical samples. The Central OPCW Laboratory is not equipped or otherwise prepared to receive, process or store biomedical samples. Furthermore, no laboratories have been designated by the OPCW Director-General for the analysis of such samples. On the other hand, a draft working instruction for the collection and transportation of biomedical samples by OPCW inspection teams has been prepared, was reviewed by the group, and found to be an acceptable basis for the continuation of the work in this area. It should now be tested. 4

SHORT OUTLINE OF THE PROJECT BY THE OPCW-SAB

What is needed for biomedical analysis are procedures that are practical, cost-effective and well validated, and that are fit for the purpose and provide accurate information on very infrequent incidents. The emphasis should be on achieving the lowest limit of detection possible rather than on large throughput of samples and rapid analysis. Quality control is of the utmost importance. At the same time, criteria are needed to properly interpret the analytical results. The implications of all this are considerable, in particular in view of the infrequent occurrence of such incidents. It is not expected that more than a few laboratories will wish to maintain all or some of the necessary expertise (including research-grade equipment, quality control systems, and engagement in methods development, staff training, standards, and custom synthesis capability). The modalities for the designation of laboratories for the analysis of biomedical samples need to differ from those adopted by the OPCW for laboratories analysing environmental samples, and need to be more flexible and based on the demonstrated capabilities of the laboratories in case. Task of the OPCW-SAB Temporary Working Group within the Project The temporary working group (TWG) on biomedical sampling and analysis consists of experts in those biomedical sampling and analysis techniques relevant to the activities of OPCW. The experts represent laboratories that are working actively in this area and have current knowledge of relevant technologies and scientific developments. The group is requested to report to the SAB on the following: (a) The specification of key biomarkers for the chemical warfare agents in the CWC´s Schedules; (b) Recommendations regarding the most-appropriate methods for analysing blood, urine, or other matrices for agents, agent markers, metabolites, and/or adducts, and other techniques that can provide evidence of chemical weapons exposure; (c) The identification of shortcomings in existing methodologies, and a proposed plan of action to establish a standard set of tests, which proposal should include: (i) required sensitivities and detection limits; (ii) analytical standards and reference compounds needed; (iii) standard operating procedures for validating methodologies; (iv) criteria for the interpretation of analytical results in the context of confirming the

81

alleged use of chemical weapons; (d) Administrative and organisational aspects of analysing biomedical samples that may be relevant, including: (i) suggestions regarding procedures to develop a suitable network of laboratories; (ii) recommendations regarding procedures for inter-laboratory comparison exercises and/or proficiency training; (iii) updates on the number of laboratories active in this field and that have an interest in extending their capabilities. Depending on the results achieved during its initial deliberations, the TWG’s followup activities could include: (a) Elaborating on scenarios in which biomedical analysis may become important, and, for each scenario, providing guidance on the urgency of analysis in relation to the stability of markers and on lag-times for bringing samples to the laboratory; (b) Standardising sample collection and handling, development of standard operating procedures (including as regards transport); (c) Assessing training needs and resources required for the extension of the OPCW’s capabilities in biomedical sampling and analysis; (d) Preparing the OPCW Laboratory to handle biomedical samples. 5

MAIN FINDINGS OF THE OPCW-SAB TWG TO-DATE

The group has developed a proposal for measures that would allow utilising the currently existing OPCW capabilities, together with capabilities of laboratories of Member States that are working in this field, to establish a start-up capability for the analysis of biomedical samples in investigations of alleged use. In reviewing available methodologies, the group gave most attention to nerve agents and mustards because most biomedical analyses, particularly of blood and urine, have been carried out on these agents and because the work done exemplifies the issues that needed discussion. In the annexed table, information is provided on key biomarkers that can be used for establishing past exposure to these and other agents (lewisites, BZ, cyanides, phosgene). The analytical methods that can be used, as well as comments on their advantages and disadvantages, are also included in the table. It was concluded that for cyanide and phosgene, the potential for high background levels resulting from sources unrelated to CW use (e.g., cigarette smoking for CN, incineration of material containing chlorine for phosgene) can complicate the situation. Any biomedical analysis is likely to provide inconclusive results unless unusually high concentrations of biomarkers for these agents were found. The group also briefly reviewed the possibility for analysis of a wide range of toxins in biomedical and other samples. It was felt that the whole topic of toxin analysis was so broad that it went beyond the scope of this TWG. The problem of analysis of toxins (in environmental as well as biomedical samples) should be taken up separately. There remains the possibility that an agent allegedly used may not be on the Schedules (including the alleged use of riot control agents as a method of warfare). Some of the techniques currently being used might be able to provide evidence of poisoning with such agents but research is needed to identify biomarkers for a broader range of chemicals relevant to investigations of alleged CW use (IAU). It was agreed that for collecting samples in an IAU, the emphasis should be on collecting blood and urine samples. Other samples (tissue, saliva, etc.) may also be useful but the current state of method development provides the highest level of confidence in the case of blood/urine samples. The following points raised during the discussions influenced the conclusions:

82

-

-

-

-

-

-

-

Since samples for analysis may be obtained at varying times after the alleged incident, and the levels of markers available for analysis are very time-dependent, only the most sensitive methods of analysis might be suitable; Unlike with environmental samples, where contamination levels are expected to be relatively high as assumed by the proficiency testing regime used by the OPCW, biomedical samples will require trace analysis techniques, bringing with it all the problems associated with the control for these techniques; High costs are associated with such techniques, including for equipment, reference standards and staff; staff have to be highly competent and maintain a thorough knowledge of the procedures and processes, which is only achievable after long training experiences; this is likely to be best maintained in what is essentially a research, rather than a routine, environment; The proficiency testing approach used by the OPCW for designation of laboratories for environmental analysis is therefore not an appropriate way to select laboratories for the analysis of biomedical samples. Instead, selection of laboratories should be based on knowledge about their capabilities (including QA/QC systems in place, compliance with standards such as GLP, methods validated at the laboratory, and proven ability to perform certain types of analysis) and designation made when the OPCW has adequate assurance that all the requirements are in fact met; Laboratories wishing to be selected should participate in inter-laboratory exercises to enhance confidence in their capabilities; Each and every sample needs to be supported by data (circumstances and observed effects of the incident and information on the sample source) so as to allow methods to be chosen that are most suitable for the suspected agent; The availability of standards is one of the greatest obstacles to the broader establishment of analytical capabilities for biomedical samples. This is particularly so for protein adducts. Although blood incubated with mass-labelled agent can be used as internal standard for protein adducts once a method has been established, a synthetic sample of the alkylated amino acid or peptide is required in the development or establishment of the method. A comparison of such synthetic methods for standards would be useful. If standards are acquired from other sources, it should be noted that their costs are high; Criteria for the interpretation of analytical results should be developed to avoid falsepositives and in order to help interpret the analytical results in context (see the chapter “Criteria for the interpretation of analytical results” for details). In addition to such criteria, a rigid quality control system is required for trace analysis. Recommended operating procedures (ROPs) should be adopted that include mandatory requirements for negative and positive controls. For example, a complete system blank is required immediately prior to a positive analysis.

It appeared desirable to the group that the present small number of laboratories capable of undertaking the types of analysis should further increase. It was emphasised during the discussions that the transfer of the details of the techniques used was best done by short visits of staff to or from laboratories that already work with those techniques, as well as good documentation of the main techniques. OPCW should compile and maintain a comprehensive description of various techniques for analysis of biomedical samples, and make this information available to States Parties. OPCW should also develop and distribute to States Parties guidelines on the collection, storage and transport of biomedical samples.

83

6

CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS

Analysis of biomedical samples is useful mainly in the context of IAU, as a forensic tool to be used together with other evidence. The CWC makes provision for the collection and analysis of such samples. At present, the OPCW does not have such a capability. The capabilities in Member States in this field are also still very limited. -

-

-

-

-

-

In order to establish such a capability, the OPCW should: Implement the measures proposed below as well as test and adopt its work instruction for the collection and transportation of biomedical samples, in order to establish a start-up capability at OPCW to analyse biomedical samples for investigations of alleged use; Build up and maintain an inventory of laboratories of Member States that are active in the field of biomedical analysis, and of their capabilities; Develop and adopt a separate mechanism for the designation of laboratories for the analysis of biomedical samples, based on their capability (including: quality systems in place; accreditation if applicable; methods, standards and experience at hand) and with the necessary flexibility; Develop, with the assistance of members of the TWG, and adopt criteria to be used to interpret the results from trace analysis to provide the highest confidence in the results and their interpretation in the context of the investigation Furthermore, the OPCW should Encourage methods development in the field of analysis of biomarkers for scheduled chemicals, as well as for non-scheduled chemicals that are relevant to investigations of alleged use; Review the issue of analysis of toxins (biomedical as well as environmental samples) for the purposes of implementing the Convention, including in respect to investigations of alleged use; Compile and maintain a comprehensive description of various techniques for analysis of biomedical samples, and make this information available to States Parties; Develop and distribute to States Parties guidelines on the collection, storage and transport of biomedical samples. Recommendations for utilization of current resources in the OPCW context

The group discussed the situation that would arise should an incident involving the need for biomedical sampling and analysis occur in the near future. Recognising that the Technical Secretariat is not currently staffed or equipped for the reception and handling of biomedical samples, the group recommended that: (a) The Technical Secretariat should test and validate its procedures for the collection and transport of biomedical samples, using as a basis the document that was provided to the TWG for review (Work Instruction for the Collection of Biomedical Samples during an Investigation of Alleged Use), edited according to the group’s proposals; (b) The Technical Secretariat should maintain a database of Member State laboratories active in the field of biomedical sampling and analysis, specifying the range of procedures and functions that each laboratory may be able to perform in the context of OPCW activities; (c) The Technical Secretariat should conclude agreements with willing laboratories that have been identified as capable of performing the following activities: (i) reception and handling of biomedical samples collected during OPCW activities; (ii) analysis of biomedical samples, utilizing the key methods identified in Annex; (iii) storage of biomedical samples.

84

(d) In the case of an incident, the Technical Secretariat should: (i) collect samples in accordance with the procedures referred to above, and if possible, in quantities to allow the assembly of four identical sample sets; (ii) dispatch one set of samples to a laboratory identified in (c) above for storage; (iii) dispatch one set of samples to each of two laboratories for analysis according to the recommended methods. These laboratories should be selected according to criteria which should be further developed; (iv) provide one set of samples to the inspected or requesting State Party. The group recognised that this was a departure from the procedures established by the OPCW for the processing of non-biomedical samples, but considered that this was the most practical way available to make use of current resources. Criteria for the interpretation of analytical results The criteria currently adopted by the OPCW for the identification of relevant compounds in environmental samples assume that the concentration will be sufficient to obtain full scan mass spectra or other unequivocal fingerprints such as NMR and IR data. A confirmatory analysis requires two such techniques to be used. In scenarios of allegations of CW use, and particularly in the case of biomedical samples, good quality full scan mass spectra are unlikely to be obtainable. Biological markers of poisoning, such as urinary metabolites and protein adducts, are most likely to be present in concentrations in the low or sub ppb range, except in cases of high level exposure and where samples are collected soon after the event. Identification is likely to require two analytical techniques such as GC-MS-(MS) or LC-MS-(MS) where pre-selected ions or fragmentations are monitored. With some biomarkers, detection may be possible by only a single technique, and monitoring only one ion or fragmentation. A different set of criteria will be required for a confirmatory analysis. An additional feature of biomedical samples is that a number of quite different biomarkers of exposure may be detectable, depending on the agent and matrix. The criteria for a confirmatory analysis therefore need to be much more flexible than for environmental samples. A flexible system for confirmatory analysis is suggested based on similar principles to those proposed by the EC for the identification of certain substances in animals and animal products [5]. This system requires a minimum number (3 or 4) of “identification points” for a confirmatory analysis. Identification points may be obtained using a combination of different analytical methods, different derivatives/analytes, or number of selected ions or fragmentations monitored. The system (which may need some modification for biomedical sample analysis) is shown in Table 1. Tab. 1: System for confirmatory analysis MS technique Low resolution (LR) MS, single ion Low resolution (LR) MS, two ions LR MS-MS, single transition LR MS-MS, two transitions High resolution (HR) MS, single ion HR MS-MS, single transition

Identification points 1 2 2.5 4.0 2 4.5

85

GC-MS (EI) and GC-MS (CI) are regarded as separate techniques. Where more than one ion is monitored, criteria for acceptable ratios are also proposed. Using this system, a confirmatory analysis for sulphur mustard poisoning could be obtained by GC-MS-MS and LC-MS-MS analysis of β-lyase metabolites, each monitoring a single transition. Alternatively, the detection of β-lyase metabolites by GC-MS-MS (single transition) could be combined with the detection of the albumin cystine adduct, monitoring a single transition by LC-MS-MS. Some aspects may need more detailed consideration, e.g. the acceptability of thiodiglycol/thiodiglycol oxide (TDG/TDGO) as biological markers, and the fact that detection of the N-terminal valine adduct of sulphur mustard, monitored using only a single ion by GC-MS, could earn only one identification point. REFERENCES: [1]

Convention on the Prohibition of the Development, Production, Stockpiling and Use of Chemical Weapons and on their Destruction. UN New York, 1993.

[2]

Note by the Director General: Report of the Scientific Advisory Board on Developments in Science and Technology. Conference of SPs, RC-1/DG.2. OPCW, The Hague 2003.

[3]

Report of the OPCW-SAB on its sixth session. SAB-6/1. OPCW, The Hague 2004.

[4]

Report of the Meeting on the Analysis of Samples of Biomedical Origin. OPCW, The Hague 1999.

[5]

European Commission Decision of August 12, 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results.

[6]

Noort D., Benschop H.P., Black R.M.: Biomonitoring of exposure to chemical warfare agents: A review. Toxicol. Appl. Pharmacol. 184, 116-126 (2002).

Kontaktní adresa: Jiří Matoušek, Masaryk University Brno, Faculty of Science, EU Research Centre of Excellence for Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Kamenice 126/3, CZ-625 00 Brno, Czech Republic; [email protected].

ANNEX Sampling and analysis of biomedical samples for the presence of chemical agents: Summary of key points agreed by the TWG (For the recent general literary review see e.g. [6].) SULPHUR MUSTARD Sample type Key biomarkers Urine TDG TDGO β-lyase metabolites

Protein adducts:

Chemical or enzymatic digestion, followed by:

N-terminal valine on Hb*

GC-MS or GC-MSMS

histidine residues on Hb.

Cysteine residue on albumin*

Standards

Advantages

(deuterated) Relatively easy TDG synthesis of analytical TDGO standards β-lyase metabolites LOD: 1 – 0.1 ng.ml

Disadvantages Short window for detection (max. 2 wks) TDG and TDGO present in unexposed persons.

Longer window for detection.

More demanding analytical methods.

PFP-thiohydantoin of valine adduct i.s.: d8-sulphur mustard-globin

Can be run on a benchtop GC-MS LOD: 100 nM human blood, in vitro

Laborious

LC-tandem MS

His-adducts I.s.: d8-sulphur mustard globin

His adduct also present in proteins of other tissues

Laborious

LC-tandem MS

Cys*-Pro-Phe i.s.: d8-sulphur

Easy work-up of sample

Alkylated tripeptide required as analytical

86

Blood

Recommended analytical methods GC-MS-MS LC-MS-MS

Asp. Acid/glutamic acid residues on blood proteins and keratin

mustard plasma

LOD: 1 nM human blood, in vitro

GC-MS

Thiodiglycol (derivatised); i.s.: d8thiodiglycol

Easy work-up of sample LOD: 25nM

standard

DNA adducts: Alkylation of deoxyguanosine (N7)

LC-MS-MS for N7HETE-guanine

N7-HETEguanine + d8 derivative as i.s.

Macromolecule present in all body tissues.

Shorter window for detection than protein adducts

Blood

Alkylation of deoxyguanosine (N7)*

ELISA assay for N7HETE-guanosine-5’phosphate

Sulphur mustard exposed DNA

Low cost LOD 50 nM human blood in vitro

Monoclonal antibody required Less specific than MSbased methods

*SOP available

87

Urine

NERVE AGENTS Sample type Key biomarkers Blood

Cholinesterase activity

Blood

Fluoride reactivation method: * Phosphylated BuChE (+ other proteins)

Standards

Advantages

Disadvantages

Rapid, available in the field

Does not identify the OP; False positive results; Only relatively high levels of activity depression are detectable

GC-MS GC-HR-MS With large volume injection;

Phosphonofluoridates i.s.: deuterated OP or plasma exposed to deuterated OP

Easily accessible internal standards and reference compounds; LOD 10 pg/ml (0.05-0.1% BuChE inhibition)

Not applicable to all OP’s

LC-MS-MS (after enzymatic digestion of modified cholinesterase.

Phosphylated nonapeptides; i.s. plasma exposed to CD3-OP

Covers all OP’s LOD: 1-5% BuChE inhibition

Expensive instrumentation and reference compounds

GC-MS-MS LC-MS-MS

(derivatised) alkyl methylphosphonic acids; i.s.: CD3 analogues

High levels shortly after exposure Easily accessible internal standards and reference compounds; LOD 0.2 – 1 ng/ml

Relatively short window of detection

88

Blood

Recommended analytical methods

Analysis of phosphylated peptides: Phosphylated BuChE

Urine / serum

Hydrolysis products: Alkyl methylphosphonic acids (does not include Tabun)

* SOP available

LEWISITE Sample type

Key biomarkers

Urine

CVAA

Blood

CVAA (globin bound and free)

Recommended analytical methods

Standards

Solid phase microextraction headspace sampling, followed by GC/MS with EI ionisation

Deuterated CVAA

GC-MS

As above

Advantages

LOD: 500 ppt

Disadvantages

Short window for detection.

Phenylarsine oxide Lack of validation in human samples. LOD: 1nM

As above

89

PHOSGENE Sample type

Blood

Key biomarkers

Recommended analytical methods

Standards

Advantages

Disadvantages

Protein adduct: Albumin peptide

LC-MS-MS

Specific and Whole blood treated with known phosgene sensitive concentrations LOD: 1uM

Standards not easily available

CYANIDE Sample type

Key biomarkers

Recommended analytical methods

Standards

Advantages

Disadvantages

Blood

CN itself

GC

HCN

LOD: 100ppb

Background levels (smokers, pollution etc)

Urine

Cystine adduct

HPLC

SCN

(SCN) LOD: 3ug/ml

As above

SCN

GC–LC

2-aminothiazoline, 4carboxylic acid

0.3 uM

90

BZ Sample type

Urine

Key biomarkers BZ, BA Q

Recommended analytical methods LC-MS-MS

Standards

BZ, BA, Q

Advantages

Disadvantages

Rapid and sensitive

Standards expensive and not easily obtainable

LOD: 1ppb

91

ZNESCHOPŇUJÍCÍ LÁTKY Oldřich Navrátil, Zbyněk Kobliha, Emil Halámek 1

ÚVOD

Zneschopňující látky vyvolávají dočasnou nezpůsobilost pro výkon normálních činností, ale nejsou určeny k usmrcení nebo trvalému poškození člověka. Přesněji jejich letální dávka je řádově vyšší, než dávka zneschopňující. V současnosti se některé z nich používají jako policejní plyny pro potlačování nepokojů, resp. protiteroristické prostředky a také jako výcvikové látky. Podle rychlosti nástupu účinků, resp. rozvoje syndromu zasažení je dělíme [1] na látky dráždivé - vyřazující okamžitě na krátkou dobu (minuty, desítky minut). Nejsou zařazeny do seznamu chemických látek v rámci Úmluvy o zákazu chemických zbraní, ale každý stát je povinen deklarovat ty z nich, které používá. Dělíme je dále na látky slzné dráždící horní cesty dýchací - tzv. sternity psychoaktivní látky a fyzicky vyřazující toxiny - působí dlouhodoběji (hodiny, desítky hodin) a jejich nástup není okamžitý - řádově po hodinách či desítkách minut. Ovlivňují mentální stav jednotlivce. Většinou jde o přírodní produkty. Některé z nich podléhají Úmluvě o zákazu chemických zbraní. Z jednotlivých skupin dále konkrétně uvádíme: Látky slzné: chloracetofenon - CN - bezbarvé krystaly zapáchající po jeřabinách. brombenzylkyanid - CA - pevná látka zapáchající po zkvašeném ovoci o-chlorbenzylidenmalononitril - CS - pevná látka zapáchající po anýzu a pepři dibenzo[b,f]-1,4-oxazepin - CR - pevná látka kapsaicin - pevná látka bez zápachu Dráždící horní cesty dýchací - sternity: difenylchlorarsan - DA - pevná látka bez zápachu difenylkyanarsan - DC - pevná látka zapáchající po hořkých mandlích adamsit - DM - pevná látka bez zápachu Psychoaktivní: halucinogeny LSD 25 (paličkovice nachová), mescalin (mexický kaktus), psilocybin (lysohlávka), tetrahydrokanabinol (konopí seté, indické, rumištní) chinuklidin-3-yl-difenyl(hydroxy)-acetát - BZ - pevná látka bez zápachu fenylcyklohexylpiperidin, sernyl - PCP - pevná látka bez zápachu fentanyl pevná látka bez zápachu, CAS 437-38-7 alfentanyl pevná látka bez zápachu, CAS 71195-58-9 Látky sufentanyl - pevná látka bez zápachu, CAS 560030-54-7 našeho remifentanyl pevná látka bez zápachu, CAS 132875-61-7 zájmu pethidin pevná látka bez zápachu, CAS 50-13-5 carfentanyl - pevná látka bez zápachu, CAS 59708-52-0 etorfin pevná látka bez zápachu, CAS 14521-96-1 Stafylokokový enterotoxin B - PG - protein produkovaný stafylokokem aureus.

92

Prakticky všechny výše uvedené látky se jako zneschopňující substance používají v aero- solech, jako nosná kapalná fáze slouží vhodné rozpouštědlo (spreje, rozprašovače atd.). To je vynuceno skutečností, že jsou samy o sobě za běžné teploty v pevném skupenství. Ochrana v případě použití aerosolů: ochranná maska. Dekontaminace: různá, např. u dráždících horní cesty dýchací vodně alkoholické roztoky sulfidu sodného, u enterotoxinu B formaldehyd. Chemické struktury (Ph = fenyl) chloracetofenon - CN :

Ph-CO-CH2Cl

brombenzylkyanid - CA :

Ph-CHBrCN

o-chlorbenzylidenmalononitril - CS :

Cl-Ph-CH=C(CN)2 N CH

dibenzo[b,f]-1,4-oxazepin - CR : O

difenylchlorarsan - DA :

Ph-AsCl-Ph

difenylkyanarsan - DC :

Ph-AsCN-Ph

difenylaminchlorarsan , adamsit - DM :

CH CH CH (CH2)4

C NH CH2

CH3

Ph=As(Cl)NH=Ph OH C C O O

chinuklidin-3-yl-difenyl(hydroxy)-acetát - BZ :

1-(1´-fenylcyklohexyl)piperidin - PCP : (sernyl)

OCH3

O

CH3

kapsaicin : (E)-N-[(4-hydroxy-3methoxyfenyl)]-8-methyl-6-nonenamid :

N

N

Doplněk: základní struktura:

fentanyl: O

[N-fenyl-N-[1-(2-fenylethyl)-4-piperidinyl]propanamid]

H 3C

N N

OH

93

O CH3

alfentanyl :

N O N H3 C

N

OCH3

N N

N

S

sufentanyl:

O

N

H 3C N OCH3

O

remifentanyl:

OCH3

N N

OCH3

H3 C O O

O

carfentanyl: H3C

N N

O CH3

O

CH3 N

pethidin: O

O

CH3

HO

etorfin: O N

O

HO

94

morfin: (pro srovnání)

HO

O N

HO

Charakteristika látek [1], [2] Název

t.tání, oC

CN CA CS CR kapsaicin DA DC DM BZ PCP fentanyl alfentanyl sufentanyl remifentanyl pethidin carfentanyl etorfin PG

54 25,4 94 71 65 40 35 ~195 168 242 83 141* 97

t.varu, oC 248 242 310 310 210 333 350 410 >400

rozkl. rozkl. rozkl.

rozkl. rozkl. vypoč.

vlastnosti v terénu

relat.stálý (dny), hydrolýza velmi pomalá, nerozp.v H2O relat.stálý (dny), hydrolýza velmi pomalá relat.stálý (dny), hydrolýza rychlá ve vodě relat.stálý, nehydrolyzuje, nepatrně rozp.v H2O stálý, hydrolýza pomalá, nerozp.v H2O stálý, hydrolýza pomalá méně stálý, hydrolýza velmi pomalá méně stálý, nehydrolyzuje stálý, pH 7 týdny, pH 13 minuty stálý , rozp.v H2O stálý

190* 214 stálý

* hydrochlorid Název CN CA CS CR kapsaicin DA DC DM BZ PG 1)

LCt50 1)

ICt50 2) -3

>50 mg.min.m-3

střední letální koncentrace

2)

Nejzávažnější symptomy -3

7-14 g.min.m 8-11 g.min.m-3 61 g.min.m-3 velmi vysoká 1-5 g.kg-1 15 g.min.m-3 10 g.min.m-3 15 g.min.m-3

:

80 mg.min.m 30 mg.min.m-3 1mg.min.m-3oči 5-20x > CS 1mg.min.m-3oči 12 mg.min.m-3 20 mg.min.m-3 22 mg.min.m-3 110 mg.min.m-3 0,5 mg.min.m-3

lakrymační úč., popálení, svědění, nevolnost lakrymační úč., pálení sliznic lakrymační úč., nevolnost, erytém dočasné oslepnutí, erytém lakrymační úč., pálení sliznic oči, sliznice, bolest na prsou, zvracení oči, sliznice, bolest na prsou, zvracení oči, sliznice, bolest na prsou, zvracení zvracení, dezorientace, halucinace zvracení, průjmy, dehydratace

střední zneschopňující koncentrace

95

Název

LD50

Nejzávažnější symptomy

PCP fentanyl

>100 mg 11,2 mg/kg ( i.v., myš)

alfentanyl sufentanyl remifentanyl pethidin carfentanyl etorfin

20 mg/kg (i.v., krysa) 19 mg/kg (i.v., myš)

anestetikum, halucinace, koma anestetikum (50-100x účinnější než morfin) Dubrovka, Moskva, X/2002 anestetikum (30x účinnější než morfin) anestetikum (2000x účinnější než morfin) anestetikum anestetikum anestetikum, anestetikum, toxický, jen velká zvířata

170 mg/kg (orálně, krysa) 3,4 mg/kg (i.v., krysa)

.

LD50 – střední letální dávka Studium vybraných bazí Náš původní záměr spočíval ve studiu rozdělení skupiny opiátů - fentanylu a jeho derivátů -metodou kapalinové extrakce (vodná fáze 0,1M HCl, organická fáze chloroform) s použitím aniontu bis[undekahydro-7,8-dikarbaundekaboráto- (2-)]kobaltnatého(1-), triviálně dikarbollylkobaltitanového, značeného 60Co: [60Co( 5-1,2-C2B9H11)2]- , zkratka X-. Tento záměr se nepodařilo realizovat pro nemožnost zakoupit včas vybrané opiáty. Ze zamýšlených sloučenin jsme dosud studovali jen látky CR, BZ, PCP, kapsaicin, a fentanyl, z příbuzných potom např. morfin, efedrin, prokain, kodein, brucin, kokain a LSD [3], [4]. Jejich základní charakteristiky, dané z extrakčních studií, jsou uvedeny v tab.I. Hodnota KDKas potom vyjadřuje rozdělovací charakteristiku daného iontového asociátu, vytvořeného z kationtu protonizované baze (jeho stabilitu vyjadřuje v tabulce uvedená konstanta KBH+) a aniontu X-, mezi chloroform a vodnou fázi 0,1M HCl. Tyto konstanty ale nejsou přímo úměrné fyziologickému působení daných sloučenin. Je pozoruhodné, že za uplynulých 12 měsíců bylo v oblasti zneschopňujících látek a fentanylu a jeho derivátů zvláště publikováno celkem ca 130 prací, abstrahovaných v CA AChS, ale všechny jsou původem z ústavů a vysokých škol lékařského zaměření. Z nich jen jedna [5], zpracovaná v ústavu pracovního lékařství v belgickém Leuven, se zabývá fyzikálně chemickými charakteristikami fentanylu, sufentanylu a alfentanylu a studuje jejich stanovení metodami GC-MS. Ostatní mají lékařský (klinický) charakter. Tab. I: Hodnoty log KDKas pro extrakci z 0,1M HCl do CHCl3 (*naše měření) baze logKDKas pKBH+ Lit. kapsaicin 2,4 4 morfin 3,7 8,21 3 efedrin 4,1 10,1 3 prokain 5,3 8,85 3 CR 5,6 3,0 3 kodein 5,9 8,21 3 BZ 7,5 8,74 3 PCP 7,9 7,98 3 brucin 7,9 8,16 3 LSD 8,1 7,68 3 kokain >8,1 8,41 3 fentanyl 8,7 5,9* 4

96

LITERATURA: [1]

Středa L., Halámek E., Kobliha Z.: Bojové chemické látky. Státní úřad pro jadernou Bezpečnost. Praha 2004.

[2]

The Merck Index, 12th ed. Merck, Whitehouse Station (NJ) 1996.

[3]

Navrátil O. Skaličan Z., Kobliha Z., Halámek E.: Czech.J.Phys. 1999, S1, 49, 731.

[4]

Navrátil O., Kobliha Z., Halámek E.: J.Radioanal.Nucl.Chem. 2004, 262, 429.

[5]

van Nimmen N.F.J., Veulemans H.A.F.: J.Chromatogr.A 2004, 1035, 249.

Kontaktní adresa: Oldřich Navrátil, Zbyněk Kobliha, Emil Halámek, Univerzita obrany, Ústav OPZHN, 682 03 Vyškov.

97

SEPARACE PRODUKTŮ KONJUGACE V SYSTÉMU LIGANDPROTEIN POMOCÍ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY R. Pataridu, V. Jedináková-Křížová Abstrakt V rámci studia konjugace bicyklického anhydridu kyseliny diethylentriaminopentaoctové (cDTPAA) s modelovým proteinem - hovězím sérovým albuminem (BSA), byla nalezena vhodná metoda kapilární elektroforézy pro separaci produktů konjugace, označovaná také jako micelární elektrokinetická chromatografie. Pro tuto metodu byly dále optimalizovány podmínky jejího použití, zahrnující pH a koncentraci separačního elektrolytu. Ve zvoleném pracovním elektrolytu pak byly testovány podmínky pro úspěšnou konjugaci cDTPAA a BSA. Sledován byl zejména vliv pH reakční směsi, koncentrace proteinu BSA a koncentrace ligandu cDTPAA. Maximální podíl cDTPAA vázaného na BSA v rámci testovaných podmínek, dosahuje v průměru 8 mol DTPA na 1 mol BSA. 1

ÚVOD

Makromolekulární látky reprezentované proteiny, peptidy a monoklonálními, případně polyklonálními protilátkami nalézají široké uplatnění ve výzkumu i praktické medicíně, jak pro diagnostické účely, tak pro imunoterapii1-6. Aplikace radioaktivně značených makromolekul proti nádorovým antigenům je v současné době také jedním z nejúčinnějších způsobů likvidace nádorových buněk. Výhodou použití těchto tzv. radioimunokonjugátů je zejména jejich specifita vůči nádorovým antigenům. Ta zajišťuje lokalizaci účinné složky přímo v nádorové tkáni a tím i ochranu zdravých tkání před nepříznivými účinky ionizujícího záření. Některé radionuklidy, jako např. 131I, 188Re, 99mTc lze jednoduše navázat přímo na danou makromolekulární látku nebo její fragment, ve většině případů se však dává přednost vícestupňové syntéze a značení přes vhodné chelatační činidlo1-4,7,8. Nejčastěji jde o bifunkční cheláty, jakými jsou například kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA), kyselina diethylentriaminopentaoctová (DTPA), kyselina 1,4,7,10 – tetraazacyklododekan – N, N´,N´´, N´´´- tetraoctová (DOTA), nebo jejich deriváty. V rámci této práce byla sledována interakce modelového proteinu BSA (hovězí sérový albumin) s bicyklickým anhydridem kyseliny diethylentriaminopentaoctové (cDTPAA), který podobně jako DTPA tvoří stabilní komplexy s řadou di- a trivalentních iontů kovů. Anhydridy karboxylových kyselin navíc ochotně tvoří vazby s aminoskupinami lysinových a hydroxylovými skupinami tyrosinových zbytků na proteinech. Použitím cDTPAA jako bifunkčního chelatačního činidla by se tedy mohla výrazně usnadnit například příprava imunokonjugátů značených radionuklidy lanthanidů. Pro stanovení a posouzení parametrů ovlivňujících konjugaci cDTPAA a BSA byla v této práci využita kapilární elektroforéza. Tato relativně nová metoda s velmi vysokou separační účinností je vhodná zejména pro separaci elektricky nabitých částic (iontů) na základě jejich rozdílné pohyblivosti v elektrickém poli. Ve farmacii je s výhodou využívána právě pro analýzy směsí makromolekulárních látek9-15. Mezi hlavní přednosti kapilární

98

elektroforézy lze zařadit vysokou citlivost, vynikající rozlišovací schopnost, rychlost analýzy (1 - 30 min.), dobrou přesnost stanovení, malý objem vzorku potřebný pro analýzu (pl – nl), nízkou spotřebu reagencií a v neposlední řadě i rozsáhlé možnosti automatizace analýz. Oproti HPLC, s níž byla donedávna srovnávána, má tedy kapilární elektroforéza několik výhod. Mezi ně patří zejména vyšší citlivost (lze stanovit i stopová množství nečistot), je robustnější a v řadě případů i levnější. 2

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Směs pro konjugaci byla připravena navážením pevného cDTPAA (98 %, SigmaAldrich) a BSA (>96 %Sigma-Aldrich) a jejich následným rozpuštěním v 15 mM borátovém pufru o pH = 8. Po rozpuštění byl vzorek inkubován po dobu 30 min za laboratorní teploty a poté analyzován pomocí kapilární elektroforézy. Koncentrace BSA v roztoku se pohybovala v rozmezí od 5 do 30 mg/ml, koncentrace cDTPAA byla nastavena tak, aby bylo dosaženo požadovaného molárního poměru BSA : cDTPAA 1:1 – 1:100 při konstantní koncentraci BSA. Před vlastní analýzou byly vzorky přefiltrovány přes 0,45 µm filtrační disk (Millipore, Millex HV). Experimenty kapilární elektroforézy byly provedeny na přístroji CAPEL 105 (Lumex Ltd., St. Petersburg, Rusko) s využitím kapiláry o délce 57 cm (50 cm k okénku detektoru) a vnitřním průměru 75 µm (Composite Metal Services, The Chase Hallow, Worcester, UK) bez úprav vnitřního povrchu. Kapilára byla mezi jednotlivými experimenty promyta postupně 0,1M NaOH, Milli-Q vodou a zvoleným pracovním elektrolytem. S ohledem na absorpční vlastnosti BSA a cDTPAA byla pro analýzy využita přímá UV detekce při 214 nm. Výtěžek konjugace byl stanoven porovnáním plochy píku anhydridu (resp. DTPA) ve vzorku po reakci s albuminem s kontrolním vzorkem samotného anhydridu . Chemikálie použité k přípravě elektrolytů pro kapilární elektroforézu - Na2HPO4 (Lachema), NaH2PO4 (Lachema), H3BO3 (Penta) a SDS (dodecylsulfát sodný, SigmaAldrich), byly p. a. čistoty. 3

VÝSLEDKY A DISKUSE

a) Nalezení vhodného separačního systému Tvorba konjugátů ligand-protein je obecně poměrně složitý děj vyvolávající řadu otázek o složení výsledného produktu. Albumin využívá ke konjugaci až tři vazebná místa s odlišnou afinitou k příslušnému ligandu, anhydrid DTPA je bicyklický a tedy i schopný vytvářet s molekulami proteinu dimery. Produktem reakce tedy může být i směs konjugátů s rozdílnou schopností vázat radionuklidy kovů, různou stabilitou a biologickými vlastnostmi. Prvotní experimenty proto byly zaměřeny na nalezení pracovního elektrolytu vhodného pro separaci produktů konjugace BSA s cyklickým anhydridem DTPA. Použité elektrolyty spolu s podmínkami analýzy jsou uvedeny v tab. I. Tab. I: Pracovní elektrolyty pro studium konjugace BSA-cDTPAA Elektrolyt pH 10 - 50 mmol/l Na3BO3 7,5 – 9,0 15 mmol/l Na3BO3 + 25 mmol/l SDS 8,5 *v závislosti na náboji analyzované látky

Analýza 214 nm, 10 kV, -10 kV* 214 nm, 15 kV

99

V borátovém pufru, který je již literaturou popsán jako elektrolyt vhodný pro stanovení BSA ve vodných roztocích16, byly optimalizovány podmínky separace zahrnující koncentraci pufru a pH. Oba tyto parametry mají vliv na tvar i mobilitu píku BSA. Na základě těchto experimentů byl jako vhodný elektrolyt vybrán 15 mmol/l Na3BO3 o pH = 8,5. Nicméně vzhledem k tomu, že BSA a cDTPAA nenesou stejný náboj, objevuje se v tomto elektrolytu při dané polaritě na elektroforegramu vždy pouze pík jedné látky a ztrácí se tak informace o druhé z reagujících složek. Z toho důvodu byl připraven borátový pufr doplněný o přídavek SDS v nadmicelární koncentraci. Přítomnost micel v separačním systému řeší zmíněný problém potlačením náboje separovaných složek a k separaci dochází pouze na základě rozdílné afinity k micelární fázi. Na elektroforegramu jsou pak patrné nejen píky reagujících látek, ale i produkty konjugace (viz obr. 1).

Obr. 1: CE analýza směsi po reakci BSA s cDTPAA 1 – BSA, 2 – DTPA, 3 – vysokomolekulární produkt konjugace Pracovní elektrolyt: 15 mmol/l borátový pufr + 25 mmol/l SDS, pH = 8,5 Vzorek: c(BSA) = 0,3 mmol/l, c(cDTPAA) = 1,5 mmol/l nástřik 15 mbar/10 s, UV detekce při 214 nm, 10 kV Kapilární elektorforéza využívající pro separaci micelární pseudofázi, označovaná také jako micelární elektrokinetická chromatografie, se jeví jako vhodná metoda pro analýzu systémů ligand-protein, a proto byla dále použita k hodnocení parametrů, které ovlivňují tvorbu konjugátů (pH, koncentrace proteinu, koncentrace ligandu). b) Vliv pH na tvorbu konjugátů Vliv pH reakční směsi na konjugaci BSA s bicyklickým anhydridem DTPA byla studována v rozmezí hodnot pH ∼ 5 až 9,5 při koncentraci proteinu 0,3 mmol/l a molárním poměru cDTPAA : BSA = 5:1. Při pH < 5 je separace zbytkové DTPA a produktu konjugace nedostatečná, při pH > 9,5 dochází k rozkladu BSA, doprovázené deformací jeho píku na elektroforegramu. Podíl zreagovaného cDTPAA ve směsi vzrůstá s rostoucím pH, maxima (nad 40 %) dosahuje v rozmezí hodnot 7,5 – 8,5. Další nárůst pH se projeví výrazným poklesem množství anhydridu cDTPAA, který se účastní konjugace, a to až na hodnoty nižší než 25 % (obr. 2).

100

podíl zreagovaného cDTPAA [%]

45 40 35 30 25 20 15 10 4

5

6

7

8

9

10

11

pH

Obr. 2: Vliv pH na konjugaci cDTPAA s BSA c(BSA) = 0,3 mmol/l, c(cDTPAA) = 1,5 mmol/l, inkubační doba 30 min c) Vliv koncentrace proteinu

podíl zreagovaného cDTPAA [%]

Při zvoleném optimálním pH = 8 a konstantním molárním poměru cDTPAA:BSA 5:1, byl dále hodnocen vliv koncentrace BSA na konjugaci. Z grafu uvedeného na obr. 3 je patrné, že pro úspěšnou tvorbu konjugátů je nezbytně nutné, aby koncentrace BSA v reakční směsi dosáhla minimálně 0,15 mmol/l. Při nižších koncentracích proteinu proběhne patrně ve vodném roztoku pufru přeměna anhydridu na kyselinu dříve, než vlastní konjugace a podíl anhydridu vázaného na BSA je pak zanedbatelný.

40

30

20

10

0 0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

c(BSA) [mmol/l]

Obr. 3: Vliv koncentrace BSA na konjugaci s cDTPAA c(cDTPAA) = 0,4 – 2,3 mmol/l, pH = 8, inkubační doba 30 min d) Vliv koncentrace ligandu Posledním z kritických parametrů, který byl při tvorbě konjugátů DTPA-BSA sledován je koncentrace cDTPAA. Anhydrid byl do reakční směsi o pH = 8, obsahující BSA

101

v koncentraci 0,3 mmol/l, přidáván tak, aby molární poměr cDTPAA : BSA dosáhl hodnot v rozmezí od 1:1 do 200:1. Podíl anhydridu vázaného na BSA za těchto podmínek stoupá s jeho rostoucí koncentrací ve směsi a maxima dosahuje při poměru cDTPAA : BSA 50:1 (obr. 4). Od poměru 10:1 se však na elektroforegramu objevují další dva píky vysokomolekulárních produktů (obr. 5) a je tedy otázkou, je-li výhodnější pracovat se směsí konjugátů, která obsahuje více molekul DTPA dostupných pro následné navázání příslušného radionuklidu, nebo s izolovanou frakcí. V případě, že se biologické vlastnosti vznikajících konjugátů budou při jejich aplikaci do organismu lišit, měla by být vždy upřednostněna frakce obsahující pouze jeden konjugát, jehož chemické a biologické vlastnosti lze snadněji popsat.

DTPA / BSA [mol/mol]

8

6

4

2

0 0

50

100

150

200

cDTPAA / BSA [mol/mol]

Obr. 4: Vliv koncentrace cDTPAA na konjugaci s BSA c(BSA) = 0,3 mmol/l, c(cDTPAA) = 0,3 – 60 mmol/l pH = 8, inkubační doba 30 min

Obr. 5: CE analýza směsi po reakci BSA s cDTPAA 1 – BSA, 2 – DTPA, 3, 4, 5 – vysokomolekulární produkt konjugace Pracovní elektrolyt: 15 mmol/l borátový pufr + 25 mmol/l SDS, pH = 8,5 Vzorek: c(BSA) = 0,3 mmol/l, c(cDTPAA) = 3 mmol/l nástřik 15 mbar/10 s, UV detekce při 214 nm, 10 kV

102

4

ZÁVĚR

S využitím kapilární elektroforézy se podařilo nalézt vhodný separační systém pro analýzu směsi cDTPAA, BSA a produktů jejich konjugace. Z testovaných elektrolytů se jako nejvhodnější jeví 15 mmol/l borátový pufr + 25 mmol/l SDS o pH = 8,5, který umožnil současné stanovení sledovaných látek, i přes jejich značně odlišnou protonovou afinitu a nalezení optimálních podmínek pro jejich konjugaci. K zajištění vysokých výtěžků konjugace je nezbytné udržet pH reakční směsi v mírně zásadité oblasti, maxima bylo dosaženo při pH = 8. Zároveň nesmí koncentrace proteinu poklesnout pod 0,15 mmol/l. Optimální hodnotu koncentrace ligandu nelze prozatím jednoduše stanovit. Největší podíl cDTPAA je sice vázán v případě, že molární poměr cDTPAA:BSA dosáhne hodnoty 50:1 nebo vyšší, za těchto podmínek však vzniká směs konjugátů. Pro zodpovězení otázky koncentrace cDTPAA v reakční směsi, bude tedy nutné nejdříve posoudit další chemické vlastnosti těchto konjugátů, zejména schopnost vázat požadovaný radionuklid při následné přípravě radioimunokonjugátů. Tato práce vznikla za finanční podpory MŠMT ČR v rámci projektu MSM 6046137307. LITERATURA: [1]

Woods M., Kovacs Z., Sherry D.: J. Supramol. Chem., 2002, 2, 1.

[2]

Parker D.: Chem. Soc. Rev., 1990, 19, 271.

[3]

Yunanfang L., Chuanchu W.: Pure & Appl. Chem., 1991, 63, 427.

[4]

Vranjes M., Archimandritis S. C., Potamianos S., Xanthopoulos S., Bouziotis P., Varvarigou A. D.: Appl. Radiat. Isot. 2002, 57, 665.

[5]

Funaro A., Horenstein A., Santoro P.: Biotechnology Advances, 2000, 18, 385.

[6]

Dadachova E., Mirzadeh S., Smith S. V., Knapp F. F., Hetherington E. L.: Appl. Radiat. Isot. 1997, 48, 477.

[7]

Westerberg D. A., Carney P. L., Rogers P. E., Kline S. J., Johnson D. K.: J. Med. Chem., 1989, 32, 236.

[8]

Alexander V.: Chem. Rev., 1995, 95, 273.

[9]

Altria K. D.: J. Chromatogr. A, 1999, 859, 443.

[10] Grossman P. D., Colburn j. C., Lauer H. H.: Anal Chem., 1989, 61, 1186. [11] Kraak J. C., Busch S., Poppe H.: J. Chromatogr., 1992, 608, 257. [12] Altria K. D., Elder D.: J. Chromatogr. A, 2004, 1023, 1. [13] Tanaka Y., Terabe S.: J. Chromatogr. B, 2002, 768, 81. [14] Kawaoka J., Gomez F. A.: J. Chromatogr. B, 1998, 715, 203. [15] Busch M. H. A., Carel L. B., Boelens H. F. M., Kraak J. C., Poppe H.: J. Chromatogr. A, 1997, 777, 311. [16] Pande P. G., Nellore R. V., Bhagat H. R.: Anal. Biochem., 1992, 204, 103. Kontaktní adresa: Pataridu, V. Jedináková-Křížová, Vysoká škola chemicko-technologická, Ústav analytické chemie, Technická 5, 166 28 Praha 6, e-mail: [email protected]

103

DERIVATIZAČNÍ POSTUPY V CHROMATOGRAFICKÝCH METODÁCH – PŘÍKLADY APLIKACÍ V HYGIENICKÝCH LABORATOŘÍCH Jiří Pavlosek Derivatizace v plynové chromatografii n umožnit analýzu látky vůbec n zlepšit separaci Důvody využívání derivatizace n snížení bodu varu – zvýšení těkavosti n zamezení nežádoucí sorpce n zlepšení selektivity a zvýšení citlivosti detekce 1 n n n

STANOVENÍ FENOXYALIFATICKÝCH HERBICIDŮ VE VODÁCH Do této skupiny herbicidů patří chlorované fenoxyalkankarbonové kyseliny, hydroxybenzonitrily a bentazon. Společným znakem této skupiny látek je jejich derivatizovatelnost esterifikací (metylací) diazometanem s možností následného stanovení GC-MS. Z hlediska kontroly kvality pitných vod významná skupina pesticidních přípravků – MCPA patří mezi nejvíce aplikované účinné látky v ČR MCPA Derivát kys.fenoxyoctové Přípravky:Aminex, Agritox

BROMOXYNIL Hydroxybenzonitril Přípravky: Bromotril, Buctril

BENTAZON Neklasifikovaný herbicid Přípravky: Basagran

104

Aparatura pro přípravu diazometanu

Chromatogram derivatizovaných fenoxyalifatických herbicidů ve spikované pitné vodě (100ng/l) Abundance Ion 159.00 (158.70 to 159.70): KAP12-5.D

12.57 10000 8000 6000 4000 2000 0

12.50 13.00 13.50 14.00 14.50 15.00 15.50 16.00 16.50 17.00 17.50

Time--> Abundance Ion 169.00 (168.70 to 169.70): KAP12-5.D

8000

13.12

6000 4000 2000 0

12.50 13.00 13.50 14.00 14.50 15.00 15.50 16.00 16.50 17.00 17.50

Time--> Abundance Ion 141.00 (140.70 to 141.70): KAP12-5.D

13.31 5000 4000 3000 2000 1000 0 Time-->

12.50 13.00 13.50 14.00 14.50 15.00 15.50 16.00 16.50 17.00 17.50

105

Chromatogram derivatizovaných fenoxyalifatických herbicidů ve spikované pitné vodě (100ng/l)-pokračování Abundance Ion 162.00 (161.70 to 162.70): KAP12-5.D 13.89 8000 6000 4000 2000 0

12.50 13.00 13.50 14.00 14.50 15.00 15.50 16.00 16.50 17.00 17.50

Time--> Abundance Ion 199.00 (198.70 to 199.70): KAP12-5.D

6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

14.14 14.61 15.00

12.50 13.00 13.50 14.00 14.50 15.00 15.50 16.00 16.50 17.00 17.50

Time--> Abundance

12000

Ion 212.00 (211.70 to 212.70): KAP12-5.D 16.94

10000 8000 6000 4000 2000 0 12.50 13.00 13.50 14.00 14.50 15.00 15.50 16.00 16.50 17.00 17.50 Time-->

2 n n n

STANOVENÍ METABOLITŮ PAU V MOČI METODOU GC - MS V problematice hygieny práce a pracovního lékařství tyto látky sledovány jako produkty biotransformace a současně biomarkery expozice PAU (1–hydroxypyren) V poslední době zájem o sledování těchto metabolitů v souvislosti s léčbou psoriázy dehtovými masťovými preparáty s rizikem expozice PAU přes kůži 1–hydroxypyren v HL stanovován obvykle HPLC-FLU, pro stanovení metabolitů je vhodnou alternativou metoda GC–MS s přednostmi kvalitní separace na kapilární koloně a větší identifikační jistoty

Popis stanovení hydroxyfenantrenů a hydroxypyrenu v moči n Enzymatická hydrolýza konjugátu stanovovaných analytů n Izolace analytů ze vzorku moče – v literatuře jsou popsány tyto možnosti: - extrakce SPE (C18) - extrakce kapalina-kapalina (etylacetát) - extrakce SPME (fast screening, derivatizace na vlákně – polyacrylát) n Derivatizace silylací (BSTFA, popř. BSTFA+TCMS) n Stanovení analytů metodou GC-MS v modu SIM (OH-PHE m/z=266, 251 OH-PY m/z=290, 275)

106

Chromatogram derivatizovaných OH-PHE ve vzorku uriny

Ion 251.00 (250.70 to 251.70): V1455-2.D Abundance

13.05

8000 7000 6000

12.86 13.58

5000 12.80

4000 3000

12.08

12.56 12.62

2000

13.95

13.12

12.51

13.70

12.36

1000 0 Time--> 12.00

12.20

12.40

12.60

12.80

13.00

13.20

13.40

13.60

13.88

13.80

Ion 266.00 (265.70 to 266.70): V1455-2.D Abundance

13.05

8000

12.86

7000 6000 5000

12.80 12.08

4000 3000 13.59

2000

0 Time--> 12.00

12.20

13.41

13.14

12.37

1000

12.40

12.60

12.80

13.00

13.20

13.40

13.95

13.60

13.80

Chromatogram derivatizovaného OH-PY ve vzorku uriny

Ion 275.00 (274.70 to 275.70): V1455-2.D Abundance 6000

4000 14.86 14.33 14.4414.64 14.94 15.17 14.61

2000

0 Time--> 14.00

14.50

15.00

16.29 16.18 15.50

16.00

16.50

Ion 290.00 (289.70 to 290.70): V1455-2.D Abundance 6000

14.86

4000

2000

14.18

0 Time--> 14.00

14.44 14.47 14.65 14.61

14.50

15.38 15.00

15.50

16.00

16.50

Kontaktní adresa: Jiří Pavlosek, Zdravotní ústav se sídlem v Pardubicích, Západní pobočka, pracoviště Pardubice.

107

METODY PRO CHARAKTERIZACI KONJUGÁTŮ RADIONUKLID – LIGAND - PROTILÁTKA Marie Reková, Věra Jedináková - Křížová Abstrakt V současnosti nabývá velký význam komplexů v cílené terapii nádorových onemocnění, kdy pomocí protilátek značených α nebo β zářiči je nuklid cíleně transportován do nádorů. Zabývali jsme se studiem konjugace protilátek lidského imunoglobulinu G (d8le IgG) a anti-CD20 s bicyklickým anhydridem kyseliny diethylentriaminopentaoctové (d8le cDTPAA) a značením připravených konjugátů radionuklidy 90 Y (beznosičový) a 177 Lu. Separaci konjugátu protilátka - DTPA od volné DTPA umožňuje HPLC – SEC metoda, ultrafiltrace a gelová filtrace. Charakterizaci způsobu navázání bifunkčního chelatonu na protilátku lze objasnit s využitím FTIR spektroskopie. 1

ÚVOD

Radiofarmaka jsou látky používané v radiodiagnostice a radioterapii různých nádorů. Jedním typem radiofarmaka jsou látky složené z radionuklidu, ligandu (tj. bifunkčního chelatonu) a protilátky. Radionuklid je vlastní účinnou složkou radiofarmaka. Bifunkční chelaton zprostředkovává navázání radionuklidu na danou protilátku a protilátka zajišťuje transport radiofarmaka na místo účinku. Z tohoto důvodu se zabýváme značením protilátek. Nejvýznamnější způsob značení protilátek radionuklidy kovového charakteru je použití tzv. bifunkčních chelatonů. Bifunkční proto, že chelaton je vybaven jednak typickým uskupením tvořícím silné chelátové vazby a dále reaktivní skupinou, která se váže s protilátkou. Jako chelatační činidla lze univerzálně použít chelatony typu EDTA – kyselina ethylendiaminotetraoctová, DTPA – kyselina diethylentriaminopentaoctová nebo cDTPAA – bicyklický anhydrid kyseliny diethylentriaminopentaoctové1,2,3 (Obr. 1) apod.

O

O

O

O N O

N O

N COOH

Obr. 1: Struktura bicyklického anhydridu kyseliny diethylentriaminopentaoctové (cDTPAA)

108

Značení protilátek je nutno provádět radionuklidy s hodnými fyzikálními, chemickými a jadernými vlastnostmi, které tvoří kationty (např. 111In, 90Y, 177Lu apod.) vstupující do silné chelátové vazby s tak vysokou konstantou stability, aby v podmínkách „in vivo“ nedocházelo k disociaci komplexů radonuklidu. Protilátky lze značit radionuklidy těmito způsoby: 1. Přímou reakcí radionuklidu s protilátkou 2. Elektrofilní substitucí 3. Chelatací po konjugaci s bifunkčním chelatonem Přímá reakce radionuklidu s protilátkou probíhá za tvorby sulfidových vazebných můstků. Tato možnost je málo využívána, neboť při aplikaci „in vivo“ jsou sulfidové můstky málo pevné a takto vázaný radionuklid ruší doménu protilátky tvořenou vnitřní disulfidickou vazbou. Tyto přímé reakce jsou popsány zejména u radionuklidů 99mTc, 188Re, 186Re. Elektrofilní substituce, která proběhne obvykle na aromatickém kruhu tyrosinu, je nejdéle známý způsob značení protilátek a je používán zejména pro značení radionuklidy nekovového charakteru 131I, 125I, 123I, 211At. Lze též konjugovat protilátku nebo peptid s bifunkčním chelatonem (dále BCH) a takto do jejich molekuly zavést chelatotvornou skupinu. BCH je vybaven jak typickým uskupením tvořícím chelátové vazby tak i reaktivní skupinu, která se váže s protilátkou resp. peptidem. Nejvhodnějším místem pro navázání BCH je aminoskupina zásaditých aminokyselin (lysinu, hydroxylysinu a argininu), která není vázána v peptidické vazbě, např. 6-aminoskupina lysinu. Jako chelatačních činidel lze universálně použít silné chelatony jako EDTA, DTPA, cDTPAA apod. V současnosti nabývá význam zobrazování buněčných antigenů pomocí značených monoklonálních protilátek (MoAb) a zobrazení specifických receptorů na buněčných membránách pomocí radionuklidy značených peptidů. Pro diagnostické účely tzv. imunoscintigrafii je využíváno zejména radionuklidů 99mTc, 111In4, případně 123I, které mají dostatečně vysokou energii, umožňující registraci vyzařovaných fotonů vně lidského organismu a vhodné fyzikální vlastnosti. Rovněž narůstá i užití terapeutických nuklidů jako 186Re, 188Re, 166Ho, 153Sm, 90Y4,5,6, které se používají ve formě anorganických koloidů či jednoduchých, ale stabilních komplexů. Velký význam nabývá cílená terapie nádorových onemocnění, kdy pomocí MoAb a peptidů značených α nebo β zářiči je nuklid transportován do neoperovatelných nádorů (např. nádor velkého rozsahu; nádor v těsné blízkosti životně důležitých struktur, orgánů; nádory prorůstající do okolních orgánů). V případě MoAb je vhodné navázat BCH na sacharidový zbytek monoklonální protilátky. Tato konjugace je založena na reakci aldehydické skupiny v sacharidovém zbytku aminoskupiny BCH. Nejznámější je konjugace pomocí desferalu nebo dvojicí avidin – biotin. V následující tabulce jsou uvedeny vybrané radionuklidy, které lze použít pro značení protilátek.

109

Tab. I: Radionuklidy kovového charakteru vhodné pro značení konjugovaných protilátek chelatací Radionuklid 47 Sc 67 Cu 90 Y 149 Tb 149

Pm Ho 177 Lu 199 Au 213 Bi

166

Poločas [hod] 82,1 61,9 64,1 4,1

Eγ [KeV] 159 93,185 -

Eβ [MeV] 0,5 0,2 0,9 -

Eα [MeV] 3,97

53,1 26,7 161,0 75,1 0,8

285 80 112,208 158,208 435,120

1,05 1,85 0,18 0,16

-

Způsob značení

1,39(98%) β 5,90(2%) α

Chelatace Chelatace Chelatace Chelatace, sulfidové můstky Chelatace Chelatace Chelatace Chelatace Chelatace

U lymfomů vycházejících z B lymfocytů se používá MoAb proti povrchové molekule CD20. Kombinace MoAb proti CD20 receptoru na B lymfocytech s navázaným izotopem yttria (Yttrium 90 ibritumomab tiuxetan – ZEVALIN6,7) je radioimunoterapeutikum, zavedené do praxe zcela nově pro léčbu některých typů maligních nehoodgkinských lymfomů, a to rezistentních vůči rituximabu. Připravené konjugáty lze charakterizovat také stanovením výtěžku značení (dále VZ) a stupně konjugace (dále SK). Výtěžek značení udává množství radionuklidu zachyceného na protilátce. Stupeň konjugace vypovídá o množství bifunkčního chelatonu navázaného na protilátce. Výtěžek značení (VZ) je definován následujícím vztahem: VZ =

AV 100[%] ( AV + AN )

(1),

kde AV je naměřená aktivita vysokomolekulární složky (tj. konjugát protilátka-DTPA) a AN je naměřená aktivita nízkomolekulární složky (tj. volná DTPA). Stupeň konjugace (SK) byl vypočítán dle následujícího vztahu: SK =

M *VZ MK

(2),

kde M je celkové látkové množství iontu příslušného kovu M3+ (M = M1 + M2, kde M1 je látkové množství Lu3+ z nosiče nebo Y3+ z eluátu [mol] a M2 je látkové množství přidaného nosiče [mol]), VZ je stanovený výtěžek značení [%] a MK je látkové množství konjugované protilátky [mol]. Předmětem této práce byla příprava konjugátů lidského imunoglobulinu G a antiCD20 s cDTPAA, označení těchto imunokonjugátů radionuklidy beznosičovým 90Y a 177Lu a také stanovení výtěžku značení a stupně konjugace.

110

2

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Radionuklid 177Lu byl připraven ozářením 2 mg LuCl3 (tj. 7,1.10-6 mol) tokem tepelných neutronů v reaktoru LVR-15 (kanál H5) 8.1013 s-1.cm-2 po dobu 24 hod. Doba „chladnutí“ radionuklidu 177Lu před značením konjugátu IgG-DTPA byla 72 hod. Celková radioaktivita 177Lu ke zpracování získaná ozářením LuCl3 v reaktoru byla 1,13 GBq a měrná aktivita 1,6.105 GBq/mol. Beznosičový radionuklid 90Y byl získán elucí z generátoru 90Sr – 90Y založeném na principu ionexové chromatografie (ionex AGX8W). Z generátoru byl získán roztok 90Y ve formě citranu o specifické aktivitě 0,9 MBq/ml. HPLC – SEC (Size Exclusion Chromatography) metoda s kolonou BioSep 3000 byla použita pro separaci reakční směsi. Tato kolona umožňuje skupinové dělení vysoko a nízkomolekulárních složek z reakční směsi. Mobilní fázi tvořil samotný fosfátový pufr o koncentraci 100 mmol/l (pH = 6,8). Vlastní analýza byla provedena při průtoku mobilní fáze 1 ml/min a detekci 280 nm (UV-VIS detektor). Nejprve byly eluovány vysokomolekulární složky (konjugovaný IgG) a poté nízkomolekulární (volná DTPA) (Obr. 2.). Pro oddělení konjugátu protilátka – bifunkční chelaton od volného chelatonu byla také použita ultrafiltrace (membrána SepPak) a gelová filtrace (Sephadex G25). K separaci připravených konjugátů byla přednostně využívána gelová filtrace (Sephadex G25), neboť je technicky nenáročná a vlastní separace konjugátu trvá pouze několik málo minut oproti ultrafiltraci. Naopak, předností ultrafiltrace je možnost zakoncentrování imunokonjugátu. Analytická kontrola imunoglobulinu G značeného beznosičovým radionuklidem 90Y byla provedena za stejných podmínek, s využitím stejné kolony jako při separaci reakční směsi. V tomto případě byl k měření aktivity použit scintilační detektor Packard Radiomatic. K mobilní fázi (100 mmol/l fosfátový pufr, pH = 6,8) byl přidáván scintilační koktejl (Packard Permafluor-E) v poměru 1:3 (v/v) (1 díl mobilní fáze : 3 díly scintilačního koktejlu). FTIR spektroskopie byla použita pro charakterizaci vázání bifunkčního chelatonu na protilátku. Roztoky lidského imunoglobulinu G o koncentracích 50 mg a 10 mg IgG v 1 ml fosfátovém pufru (pH = 7,3) byly měřeny na FTIR spektrometru Nicolet Nexus 670 s jednoodrazovým ATR nástavcem MIRacle se ZnSe krystalem. Na jedno měření bylo dávkováno na krystal 30 µl roztoku imunoglobulinu G. Pro jedno spektrum bylo akumulováno 128 skenů s rozlišením 2 cm-1 a pro každý vzorek byla akumulována 2 opakovaná spektra. Software Omnic 7.1 (Thermo Nicolet) byl použit ke zpracování naměřených spekter (Obr. 3.). Pro podrobnější charakterizaci připravených konjugátu byly také stanoveny výtěžek značení (VZ) a stupeň konjugace (SK). Výtěžek značení udává množství radionuklidu zachyceného na imunokonjugátu a stupeň konjugace vypovídá o množství bifunkčního chelatonu navázaného na dané protilátce. 3

VÝSLEDKY A DISKUSE

Chromatogram získaný po separaci vysokomolekulární (konjugovaný IgG) od nízkomolekulární složky (volná DTPA) HPLC - SEC metodou (kolona BioSep 3000) je zobrazen na Obr.2. Nejprve byl eluován konjugovaný imunoglobulin G (tR = 8 min.)

111

a poté volná, nenavázaná DTPA (tR = 10,8 min.). Jedou z vhodných separačních metod dělící vysokomolekulární látky od nízkomolekulárních se ukázala být HPLC – SEC metoda, což také dokládá tento chromatogram.

DTPA

IgG

Obr. 2: Chromatogram separace konjugovaného lidského IgG od volné DTPA metodou HPLC – SEC Podmínky separace: kolona – BioSep 3000 (SEC), mobilní fáze – 100 mmol/l fosfátový pufr (pH = 6,8), průtok – 1 ml/min., UV-VIS detekce při λ = 280 nm. Stupně konjugace stanovené pro zvolené molární poměry lidského imunoglobulinu G a bifunkčního chelatonu pro konjugát IgG - DTPA značený beznosičovým radionuklidem 90Y jsou uvedeny v tabulce II. Tab. II: Stanovené stupně konjugace IgG-DTPA značeného beznosičovým radionuklidem 90 Y Konjugační poměr IgG:cDPTAA

Stupeň konjugace (SK)

1:100

0,10 ± 0,01

1:500

0,12 ± 0,01

1:1000

0,20 ± 0,02

Zvolené poměry protilátka (IgG) : bifunkční chelaton (cDTPAA) 1:100, 1:500 a 1:1000 jsou vhodné pro přípravu studovaných imunokonjugátů. Například, stupeň konjugace 0,1 pro poměr 1:100 udává počet molekul ligandu navázaného na IgG, tj. na každé desáté koncové aminoskupině aminokyseliny je navázána 1 molekula DTPA. Pokud by byl molární poměr protilátka : bifunkční chelaton zvyšován, pravděpodobně by docházelo ke ztrátě imunoreaktivity dané protilátky. Toto tvrzení bude potvrzeno

112

nebo vyvráceno experimenty sledující vliv měněného molárního poměru protilátka : bifunkční chelaton na imunoreaktivitu protilátky. Tyto experimenty jsou předmětem další studie. V tabulce III. jsou uvedeny stanovené hodnoty výtěžků značení a stupňů konjugace pro konjugát IgG-DTPA označený radionuklidem 177Lu. Tab. III: Výtěžky značení a stupně konjugace stanovené pro konjugát IgG-DTPA značeného radionuklidem 177Lu 1. podíl (1 ml)

2. podíl (1 ml)

3. podíl (1 ml)

VZ [%]

75

6

4

SK

0,09 ± 0,02

0,06 ± 0,02

0,06 ± 0,02

Stanovené výtěžky značení po druhém a třetím přídavku radionuklidu 177Lu do směsi jsou nízké, pouze 4% a 6 %, což bylo způsobeno vysokým obsahem neaktivního nosiče příslušného radionuklidu ve směsi, který svou vazbou blokuje vazebná místa. Chceme-li získat vyšší výtěžek značení, musíme ke znační konjugátu protilátka DTPA použít beznosičový radionuklid 177Lu o vyšší specifické aktivitě. Pro imunokonjugát IgG - DTPA bylo dosaženo stupně konjugace 0,09 ± 0,02, 0,06 ± 0,02 a 0,06 ± 0,02. Stupeň konjugace vypovídá o tom, že na každé šesté popř. deváté přístupné aminoskupině aminokyseliny, která není vázána v peptidické vazbě, byla navázána 1 molekula DTPA. V případě konjugátu anti-CD20-DTPA označeného beznosičovým radionuklidem 90Y bylo dosaženo vyšších výtěžků značení 62 %, 40 % a 23 % (Tabuka IV.). Beznosičový radionuklid 90Y je vhodný pro značení studovaného imunokonjugátu z hlediska svých fyzikálních vlastností. Stanovené stupně konjugace anti-CD20-DTPA byly 0,29 ± 0,02, 0,31 ± 0,02 a 0,28 ± 0,02. Na každou třicátou přístupnou, koncovou aminoskupinu zásadité aminokyseliny dané protilátky se navázala 1 molekula bifunkčního chelatonu. Tab. IV: Stupně konjugace a výtěžky značení pro konjugát anti-CD20-DTPA označený beznosičovým radionuklidem 90Y 1. podíl (1 ml)

2. podíl (1 ml)

3. podíl (1 ml)

VZ [%]

62

40

23

SK

0,29 ± 0,02

0,31 ± 0,02

0,28 ± 0,02

Pro dosažení vyšších výtěžků značení imunokonjugátu daným radionuklidem je vhodné použít nuklidy získané z generátoru (tzv. generátorové radionuklidy). Beznosičový radionuklid 177Lu je možné připravit následujícími způsoby: redukcí ytterbia pomocí sodíkového amalgamu a nebo oddělením mikrosložky lutecia od makrosložky ytterbia založený na principu ionexové chromatografie. Stupeň konjugace imunokonjugátů je ovlivněn prostorovou orientací protilátky, sekvencí jednotlivých aminokyselin a přístupností jednotlivých koncových aminoskupin. Z porovnání hodnot stanovených stupňů konjugace

113

studovaných konjugártů, vyplívá, že na imunoglobulin G se navázalo více molekul DTPA než na protilátku anti-CD20. Analytická kontrola značení konjugátu IgG-DTPA beznosičovým radionuklidem 90Y byla provedena metodou HPLC s použitím scintilačního detektoru (Obr. 3.). Na chromatogramu je vidět intenzivní pík označeného imunokonjugátu IgG-DTPA-90Y, což dokazuje, že aktivita označeného konjugátu 90Y-IgG-DTPA je dostatečná pro aplikaci v radioterapii nebo radiodiagnostice.

90

Y-DTPA-IgG

IgG-DTPA 1 2

Obr. 3: Chromatogramy označeného konjugátu 90Y-IgG-DTPA a neoznačeného konjugátu IgG-DTPA Podmínky analýzy: kolona – BioSep 3000 (SEC), mobilní fáze – 100 mmol/l fosfátový pufr (pH = 6,8), průtok – 1 ml/min., scintilační koktejl (1:3, v/v), 1 - UV-VIS detekce při λ = 280 nm, 2 - scintilační detektor Packard Radiomatic [cpm]. Charakterizace způsobu navázání bifunkčního chelatonu na protilátku byla zkoumána pomocí FTIR spektroskopie. Na FTIR spektru (Obr. 4.) korigovaného na obsah vody jsou vidět dva intenzivní píky amidových skupin. V intervalu vlnočtů 1700 – 1600 cm-1 a 1600 – 1500 cm-1 se nacházejí amidové skupiny zásaditých aminokyselin. Rozdíl intenzit FTIR spekter 1 a 2 je dán rozdílnou koncentrací IgG ve fosfátovém pufru. Po navázání bifunkčního chelatonu na protilátku se očekává změna právě těchto pásů. Tato skutečnost bude doložena následujícími experimenty. FTIR spektroskopie je tedy jednou z vhodných metod pro charakterizaci způsobu navázání bifunkčního chelatonu na protilátku.

114

1650

1550

1

2

Wavenumber (cm-1)

Obr. 4: FTIR spektra lidského imunoglobulinu G 1 – 50 mg IgG v 1 ml fosfátového pufru (pH = 7,3), 2 – 10 mg IgG v 1 ml fosfátového pufru (pH = 7,3). 4

ZÁVĚR

Pro značení imunokonjugátů protilátka – bifunkční chelaton využívaných v radioterapii a radiodiagnostice různých nádorů je nezbytné použití beznosičových radionuklidů s vysokou specifickou aktivitou. Zvolené konjugační poměry protilátka : bifunkční chelaton 1:100 - 1:500 a 1:1000 se jeví jako optimální pro přípravu studovaného imunokonjugátu lidského imunoglobulinu G s cDTPAA. Metody HPLC – SEC metoda (kolona – BioSep 3000) a gelová filtrace (Sephadex G25) umožňují separaci vysokomolekulárních látek od nízkomolekulárních. Pro analytickou kontrolu značení imunokonjugátu protilátka - bifunkční chelaton radionuklidy lze využít HPLC metodu s radiometrickou detekcí a aplikací kapalinového scintilátoru. Spektroskopické metody, hlavně FTIR spektroskopie a FTRamanova spektroskopie jsou vhodnými metodami pro charakterizace způsobu navázání bifunkčního chelatonu na protilátku. Charakterizace značení a přípravy imunokonjugátů, popisu způsobů navázání bifunkčního chelatonu na protilátku je velice důležitá pro určení optimálních podmínek přípravy daného radiofarmaka a jeho aplikaci v radiodiagnostice a radioterapii různých nádorů. LITERATURA: [1]

Tang, H.; Sheng, Y.; Yang, R.: Inorg.Chem. Commun., 2003, 6, 1213 - 1216.

115

[2]

Abbas Rizvi, S. M.; Henniker, A. J.; Goozee, G.; Allen, B. J.: Leuk. Research, 2002, 26, 37 - 43.

[3]

Fani, M.; Vranjes, S.; Archimandritis, S. C.; Potamianos, S.; Xanthopoulos, S.; Bouziotis, P.; Varvarigou, A. D.: Appl. Radiation and Isotopes, 2002, 57, 665 – 674.

[4]

Breeman, W. A. P. de Jong, M.; Visser, T. J.; Erion, J. J.; Krenning, E. P.: Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 2003, 6, 917 – 920.

[5]

Pandez, U.; Mukherjee, A.; Sarma, H. D.; Das, T.; Pillai, M. R. A.; Venkatesh, M.: Appl. Radiation and Isotopes, 2002, 57, 313 – 318.

[6]

Lohri, A.; Herrmann, R.: Schweiz. Med. Forum, 2004, 4, 1145 – 1148.

[7]

Krasner, C.; Joyce, R. M.: Current Pharm. Biotech., 2001, 2, 341 – 349.

[8]

Semac, I. Polamba, C.; Knlangara, K.; Klages, H.; van Echten-Deckert, G.; Borisch, B.; Hoessli, D. C.: Cencer. Research, 2003, 63, 534 – 540.

Tato studie byla uskutečněna za podpory GA ČR číslo projektu: 104103/0400 a MSM číslo projektu: 6046137307. Kontaktní adresa: Marie Reková, Věra Jedináková – Křížová, Vysoká škola chemicko – technologická, Ústav analytické chemie, Technická 5, 166 28, Praha 6 – Dejvice, e-mail: [email protected], [email protected].

116

STANOVENÍ OCHRATOXINU A V MOČI METODOU HPLC J. Severa, F. Malíř, T. Roubal ÚVOD Ochratoxin A (OTA) je možný karcinogen. Náleží mezi silně toxické mykotoxiny (LD cca řádově jednotky mg . kg-1 tělesné hmotnosti). Hlavním zdrojem perorálního příjmu OTA jsou cereálie a produkty vyráběné na bázi obilí vůbec. Dalšími zdroji OTA přijímaných výživou jsou maso, masné výrobky, káva, čaj aj. Při chronické kontaminaci organismu OTA dochází k jeho kumulaci v krevním séru a ustavení rovnovážného stavu mezi přísunem a odsunem z organismu s poločasem přibližně 35 dnů. Jeho exkrece se uskutečňuje převážně močí. Nález OTA v moči je tedy významným biomarkerem kontaminace organismu tímto mykotoxinem a jeho přítomnost v nadlimitní koncentraci v moči může sloužit jako ukazatel úrovně příjmu OTA do organismu. To vytváří podklad k přijetí příslušných regulačních a hygienických opatření, případně léčebných opatření u kontaminované osoby. 1

Literární přehled metod

K průkopnické práci zabývající se metodou stanovení OTA v moči metodou HPLC patří sdělení M. Castegnara (1990), který pracovní postup rozdělil na předpřípravu, první stupeň předčištění a na izolaci OTA, přičemž předčištění a následný krok doporučuje opakovat ke zvýšení výtěžnosti OTA. Metoda je časově a materiálově neúnosně náročná. Pascale, M. a Visconti, A. (2000) použili k extrakci OTA 5% roztok hydrogenuhličitanu sodného k izolaci OTA z extraktu imunoafinitní kolonku (IAK) OCRATEST. Výtěžek OTA byl neuspokojivý. Petkova – Bochareva, T. aj. (2003) popsali extrakci OTA po okyselení moče chloroformem. Chloroform odpařili, odparek rozpustili v TRIS pufru. OTA izolovali na IAK, k eluci OTA použili methanol. Popsaný postup byl podle hodnocení autorů úspěšný. V roce 2004 publikovali Moliné, A. aj. práci zaměřenou na extrakci OTA z potravin tak, že po okyselení vzorku kys. sírovou extrahovali OTA acetonitrilem. Extrakt purifikovali a OTA reextrahovali do chloroformu. Další postup je obdobný tomu, co je uvedeno v předchozím sdělení, Postup je složitý, náročný na čas (sestává asi z 20 postupných kroků) a na chemikálie. Z výčtu několika uvedených citací vyplývá, že přes některé zásadní odlišnosti je k dosažení vysokého výtěžku OTA potřeba dodržet několik zásadních kroků. Především dodržet optimální pH při extrakci i izolaci OTA., extrakci opakovat a k oddělení rozdílných fází použít odstředění se značným urychlením. Vyhnout se zbytečným krokům, které vedou ke ztrátám analytu, např. sorpcí. Z těchto poznatků vzešel náš, dále popsaný, postup.

117

2

Experimentální část

2.1

Chemikálie

V námi upraveném pracovním postupu stanovení OTA v moči byly použity tyto chemikálie: - kyselina chlorovodíková p.a. Merck - chloroform pro analysis,. Riedel-de Haen - methanol gradient grade pro chromatografii, LICHROSOLV, Merck - TRIS pufr ( 12,11 g TRIS báze rozpuštěno v 570 ml vody, pH roztoku upraveno HCl na 7,5). 2.2

Přístroje

Metoda předpokládá vybavení následující přístrojové vybavení a pomůcky (v závorce jsou uvedeny ty, které jsme v experimentech použili): - pH metr pH 330/SET - 1 - vibrátor – třepačka Yellow line OS-5 - chlazená centrifuga JUAN Br 4i - prosávací zařízení (vakuová jednotka Baker spe 12 G systém) - IAK OCHRAPREP - odpařovací zařízení EVATERM - HPLC souprava (Spektra Systém: vakuový odplyňovač SCM 400, gradientová pumpa P 2000, automatický dávkovač Spektra- Physics 3000, Chrom – Jet integrátor SP 4400) s fluorescenčním detektorem Jasco, model 920 FP. 2.3

Pracovní postup

Dále uvedený postup byl nejprve několikráte odzkoušen s nativní močí bez přídavku OTA a po té jsme přistoupili ke stanovení OTA v moči s přídavkem roztoku standardu OTA ( koncentrace 4 µg . ml-1, přídavek 400 µl do 25 ml moče, výsledná koncentrace OTA v mobilní fázi je 0,4 ng . ml-1). Do 25 ml moče v Erlenmayerově baňce byl dán přídavek roztoku standardu OTA a vzorek byl okyselen HCl na pH 2,5. Do nádoby bylo přidáno 15 ml chloroformu. Následovala extrakce vibracemi po dobu 10 min s použitím zařízení OS-5 ( 700 kmitů za min). K rozdělení vodné a organické fáze (chloroformu) byla použita centrifugace po dobu 30 min při teplotě 10 oC a 4.200 otáček . min-1. Organická fáze byla pomocí pipety přenesena do vialky a odpařena pod proudem dusíku do sucha. Odparek byl rozpuštěn v 1 ml methanolu s podporou UZ vibrací. Roztok byl přenesen do kalibrované nádoby a postupnými výplachy vialky TRIS pufrem ( pH 7,5) doplněn na objem 50 ml. Následovala izolace OTA pomocí IAK OCHRAPREP, promytí kolonky 20 ml vodou a nakonec eluce analytu 5 ml směsí methanol/kys.octová (98:2). Eluát byl pod dusíkem odpařen do sucha a odparek rozpuštěn v 1 ml mobilní fáze, tj. v methanolu. 3

Výsledky a jejich diskuse Na obr. 1 a 2 jsou dokumentovány výsledky měření zpracované programem počítače,

118

který je integrální součástí soupravy HPLC. Z nich vyplývá, že bylo dosaženo vynikajícího výsledku, tj. nalezená koncentrace odpovídá koncentraci přídavku. Výsledky považujeme za předběžné a předpokládáme jejich vícenásobné opakování.

Obr.1: Slepý pokus.

119

Obr.2: Vzorek moče s přídavkem OTA. ZÁVĚR Získané první výsledky kvantitativního stanovení OTA v moči naznačují možnost dosáhnout vysoké výtěžnosti analytu a zřejmě také vysokou reprodukovatelnost výsledků měření. Potvrdil se náš předpoklad, že základem úspěchu při stanovení OTA v moči při nízkých koncentracích je nalezení optimálních koncentrací vodíkových iontů, volba vhodného extrakčního činidla a podmínek extrakce vůbec, jakož i prostředí a podmínek izolace OTA. Je nasnadě, že bez kvalitní soupravy pro HPLC, včetně detektoru, nelze o úspěchu vůbec uvažovat.

120

Kontaktní adresa: J. Severa, F. Malíř, T. Roubal, Zdravotní ústav se sídlem v Hradci Králové, Centrum hygienických laboratoří, Oddělení xenobiochemie a Národní referenční laboratoř pro biomarkery mykotoxinů a mykotoxiny v potravinách, Nezvalova 958, 500 02 Hradec Králové, e-mail: [email protected].

121

DSK OCHRANNÝCH FILTRŮ TYPU MOF NA VYBRANÉ PRŮMYSLOVÉ ŠKODLIVINY Vlastimil Sýkora, Čestmír Hylák 1

ÚVOD

Pro potřeby Civilní ochrany byly vyvinuty k ochraně proti vysoce toxickým otravným látkám, biologickým (bakteriologickým) prostředkům a RA prachu malé ochranné filtry pod označením MOF, a to MOF-1 (MOF), MOF-2, MOF-4 a MOF-5 a dále speciální kombinovaný filtr určený nejen k ochraně proti ZHN, ale též k ochraně proti vybraným průmyslovým škodlivinám - MOF-6-M. U těchto filtrů, vyjma kombinovaného MOF-6-M a MOF-1 (MOF), který již byl vyřazen, prošla nebo v nejbližších letech bude procházet poskytovaná záruka 20 let (nejstarší filtry MOF-2 jsou z roku 1975, tudíž 30 let staré a nejmladší MOF-5 z roku 1991 je starý 14 let). Jelikož těchto filtrů se stále v různých skladech a uložištích nachází řádově milióny kusů, naskýtá se otázka, co s nimi, neboť podle „Koncepce ochrany obyvatelstva do roku 2006 s výhledem do roku 2015" se předpokládá, že k válce nedojde nebo že o ní budeme vědět několik let dopředu. Co však ale aktuálně hrozí je např. havárie doprovázena únikem nebezpečných chemických látek, popř. teroristický útok či havárie v chemických továrnách nebo provozech (např. únik chlóru v Neratovicích či oxidů dusíku ze SYNTHESIE v Pardubicích v loňském roce). Přestože MOF filtry, jak již bylo řečeno, byly původně vyvinuty pro záchyt vysoce toxických vojenských látek a protože i po řadě let jejich sorpční schopnost není nezanebatelná, byla snaha využít je i jiným způsobem a pro jiné účely než jen k pouhé likvidaci po uplynutí záruční lhůty. Kromě toho v současné době filtry pro Civilní ochranu nejsou nakupovány, jejich stavy z výšeuvedených příčin klesají, a proto naším cílem bylo v systému zachovat alespoň to, co se tam nachází a zároveň posoudit, má-li smysl filtry i po záruční době dále uchovávat. Kvalita jednotlivých typů a ročníků byla testována na vybrané průmyslové škodliviny dle ČSN EN 141 – „Ochranné prostředky dýchacích orgánů – Protiplynové a kombinované filtry – Požadavky, zkoušení a značení(1), a to na cyklohexan (třída A), amoniak (třída K), oxid siřičitý (třída E), chlór a sirovodík (třída B). 2

POUŽITÉ METODY, POSTUP MĚŘENÍ, PŘÍSTROJE

1) DSK filtrů na látky s b.v. nad 65 °C Princip měření

122

Tlaková láhev s čistým vzduchem nebo generátor pro přípravu čistého vzduchu

Vlhčící zařízení s ohřevem Odparka průmyslové škodliviny

Směšovací trubice stanovení vstupní koncentrace IČspektrofotometr GENESIS nebo MIRAN FILTR indikace průniku

Aparatura pro měření RD látek s bodem varu nad 65 °C: Pro testování DSK filtrů typu MOF na látky s b.v. nad 65 °C byla použita aparatura skládající se z rotametru pro nastavení vstupního průtoku čistého, suchého vzduchu (získaného buď pomocí generátoru pro přípravu čistého, suchého vzduchu nebo vzduchu z tlakové lahve), vlhčícího ohřívacího tělesa pro přípravu vlhkého vzduchu o požadované relativní vlhkosti a teplotě, zásobníku kapalné testovací látky s ohřevem, rotametru pro nastavení průtoku vzduchu obohaceného testovanou látkou a upínacím zařízením pro upnutí testovaných filtrů.

Aparatura pro měření látek s bodem varu nad 65 °C

123

Generátor pro přípravu suchého a čistého vzduchu Měření byla prováděna dle „Metodiky testování MOF na kapalné látky(2)“ (interní předpis) v souladu s Českou technickou normou ČSN EN 141(1). Jako zdroj tlakového vzduchu byl použit kompresor s jmenovitým tlakem 0,4-0,8 MPa. Pro měření koncentrace cyklohexanu ve vzduchu a pro stanovení průrazu filtrů byl použit IČ spektrofotometr GENESIS série FTIR (model 9423-240080251 s výrobním číslem 950 138s) od firmy ATI MATTSON s plynovou kyvetou o objemu cca 113,6 .10-6 m3. Měření byla prováděna při laboratorní teplotě 18-22 °C a pro měření a vyhodnocení výsledků byl použit instalovaný program WINFIRST. Úprava vzduchu na požadovanou relativní vlhkost byla prováděna pomocí vlhčícího zařízení opatřeného ohřevem, rychlost proudícího vzduchu byla měřena rotametrem a požadovaná vlhkost psychrometrem.

IČ spektrofotometr GENESIS série FTIR Pracovní postup a vyhodnocení naměřených výsledků: Dle schématu(2) bylo provedeno zapojení jednotlivých částí měřícího zařízení, poté byla uvedena do provozu aparatura pro měření DSK (ohřev), zapnut kompresor a nastaveny požadované parametry na vstupu a výstupu z generátoru čistého vzduchu, nastavena relativní

124

vlhkost vzduchu na vlhčícím zařízení a zapnut IČ spektrofotometr. Poté, po dosažení požadovaných parametrů vzduchu (teplota, relativní vlhkost a průtok), byla nastavena požadovaná koncentrace, a to buď 0,1 ± 0,01 obj. % nebo 0,5 ± 0,05 obj. %, dále byl nastaven pracovní režim a na IČ spektrofotometru vybrána vhodná kalibrační křivka. Nakonec byl připojen předem zvážený odzátkovaný testovaný filtr a pomocí IČ spektroskopie byla sledována doba, za kterou došlo k proniknutí (průrazu) testované látky za filtrem. V pravidelných časových intervalech byla také pomocí IČ spektrofotometru sledována koncentrace plynné směsi. Dobou průniku pak byla doba, kdy došlo k naměření takové koncentrace pronikající látky, která odpovídala průnikové koncentraci dle ČSN EN 141. Pro měření byly použity nejméně 2 zkušební, nepoužité filtry. 2) DSK filtrů na plynné látky Princip měření Tlaková láhev s čistým suchým vzduchem nebo generátor pro přípravu čistého a suchého vzduchu

Mísící zařízení SYCOS-K-V/2M Vlhčící zařízení s ohřevem vzduchu Tlaková láhev s průmyslovou škodlivinou

FILTR indikace průniku IČ spektrofotometr, multidetektor plynů MX 21 Plus nebo QRae

Aparatura pro měření RD plynných látek Měření byla prováděna dle „Metodiky testování MOF na plynné látky“ (interní předpis)(3) v souladu s Českou technickou normou ČSN EN 141(1). Pro testování DSK filtrů typu MOF na toxické plynné látky byla použita aparatura skládající se ze zdroje tlakového vzduchu (kompresor s jmenovitým tlakem 0,4-0,8 MPa), generátoru pro přípravu suchého a čistého vzduchu, z mísícího zařízení SYCOS (umožňuje

125

přesné nastavení požadované koncentrace plynné látky ve vzduchu), z vlhčícího zařízení (slouží pro přípravu vlhkého vzduchu o požadované relativní vlhkosti, je opatřené ohřevem), z rotametru (pro nastavení požadovaného průtoku vzduchu), psychrometru (pro nastavení požadované relativní vlhkosti vzduchu) a upínacího zařízení pro upnutí testovaných filtrů. Mísící zařízení SYCOS KV/3M Mísení vzduchu a toxického plynu k získání požadované koncentrace bylo prováděno pomocí dynamického mísícího zařízení SYCOS KV/3M firmy ANSYCO osazeného 3 hmotnostními průtokoměry (model 5850E) a větví umožňující ohřev proudícího vzduchu od 5 do 65 °C. Zařízení vyžaduje vstupní tlak 2 bar. Průniková koncentrace plynných látek byla měřena buď multidetektorem plynů MX 21 PLUS či QRae, popř. IČ spektorfotometrem GENESIS série FTIR. Měření byla opět prováděna při laboratorní teplotě 18-22 °C, průtok vzduchu s toxickým plynem byl 30 l.min-1. K měření průnikové koncentrace amoniaku, oxidu siřičitého, chlóru a sirovodíku byly použity elektrochemické vyměnitelné senzory.

+ Multidetektor plynů MX 21 PLUS

Multidetektor plynů QRAE PLUS

Pracovní postup a vyhodnocení naměřených výsledků: Kalibrace použitého plynu v tomto případě nebyla prováděna, neboť mísící zařízení SYCOS dle nastavených požadavků si připravilo plynnou směs v požadované koncentraci samo. Dle schématu(3) bylo provedeno zapojení jednotlivých částí měřícího zařízení, poté bylo zapnuto mísící zařízení SYCOS, spuštěn kompresor a nastaveny požadované parametry na vstupu a výstupu z generátoru čistého vzduchu a nastavena relativní vlhkost vzduchu pomocí vlhčícího zařízení. Poté, po dosažení požadovaných parametrů na jednotlivých částech měřícího zařízení (tj. vstupních parametrů přiváděného vzduchu – teploty - 20 ± 1 °C, relativní vlhkosti - 70 ± 2 % a průtoku - 30 ± 3 % l.min-1), požadované koncentrace buď 0,1 ± 0,01 obj. % nebo 0,5 ± 0,05 obj. % a nastavení pracovního režimu byl připojen předem zvážený odzátkovaný filtr a byla sledována doba, za kterou došlo k proniknutí (průrazu filtru) toxického plynu za filtr. Průniková koncentrace byla měřena buď IČ spektrofotometrem nebo multidetektory plynů MX 21 PLUS či QRae. Dobou průniku pak byla doba, kdy došlo

126

k naměření takové koncentrace, která odpovídala průnikové koncentraci dané látky dle ČSN EN 141. Pro měření byly opět použity nejméně 2 zkušební, nepoužité filtry. Vyhodnocení a zpracování naměřených výsledků: Naměřené hodnoty byly v obou případech vyhodnoceny a zpracovány stejným způsobem. Na základě naměřených hodnot rezistenční doby (RD) byla vypočtena dynamická sorpční kapacita (DSK) dle nížeuvedené rovnice, jako výsledek byl vzat aritmetický průměr jednotlivých měření. DSKTF = MHTL . VPS . CTL . tP / 24470 kde:

DSKTF MHTL VPS CTL tP

dynamická sorpční kapacita testovaného filtru [mg] molekulová hmotnost testované látky [g.mol-1] průtok plynné směsi [l.min-1] koncentrace plynné směsi [ppm] doba průniku testované plynné směsi skrz filtr [min]

3

VÝSLEDKY A DISKUSE

V období let 2003-2005 bylo provedeno hodnocení malých ochranných filtrů (MOF), původně určených pro potřeby civilní ochrany, na vybrané průmyslové toxické látky dle ČSN EN 141. Výsledky těchto zkoušek jsou uvedeny v následujících tabulkách č.1 - cyklohexan, č.2 - amoniak, č.3 - oxid siřičitý, č.4 – chlór a č.5 - sirovodík. Pod každou hlavní tabulkou jsou uvedeny základní podmínky a požadavky na měření protiplynových filtrů testovaných na příslušnou průmyslovou škodlivinu dle ČSN EN 141(1). Dále jsou do této tabulky zařazeny i hodnoty DSK, které musí testovaný filtr dosáhnout, aby splnil požadavky této normy. Tyto hodnoty DSK byly spočteny na základě údajů nížeuvedených tabulek. 1) Dynamická sorpční kapacita filtrů typu MOF – cyklohexan Koncentrace 0,1 obj. % Jako první testovanou látkou dobře imitující organické sloučeniny a otravné látky organofosfátového typu jako jsou látky V a G, je cyklohexan. Výsledky hodnocení filtrů typu MOF-2, MOF-4 a MOF-5 na cyklohexan jsou uvedeny v tabulce č.1. Tyto filtry byly testovány pouze při koncentraci 0,1 obj. % ve vzduchu. V tabulce, vedle jednotlivých naměřených hodnot RD (každý filtr popsán rokem výroby, číslem šarže a označením) jsou uvedeny i hodnoty odpovídající vypočtené DSK. Požadavek normy ČSN EN 141 nám specifikuje pro danou toxickou látku a koncentraci za definovaných podmínek minimální hodnotu RD a průnikovou koncentraci (viz. tabulka č.1). Na základě této minimální hodnoty RD dle výpočtového vzorce uvedeného výše byla vypočtena minimální hodnota DSK, které by filtry, aby splnily požadavky příslušné normy, měly dosáhnout. V případě cyklohexanu pro koncentraci 0,1 obj. % a minimální RD 70 min by hodnota DSK pro třídu A1 měla dosahovat 7,21 g.

127

Tab. 1: DSK a RD filtrů typu MOF na cyklohexan Filtr - typ

Rok výroby - šarže

12.1975/D-50/018 3.1976/D-17/045 3.1977/D-24/155 MOF-2 2.1978/D-19/240 7.1979/D-08/387 4.1980/D-15/459 9.1980/D-17/024 10.1981/D-10/141 3.1982/D-24/179 9.1983/D-23/333 10.1983/D-35/348 6.1984/D-14/414 MOF-4 3.1985/D-40/478 4.1986/D-43/582 7.1987/D-48/690 8.1988/D-23/775 4.1989/D-02/835 5.1990/D-5/914 9.1991/D-05/005 MOF-5 c = 0,1 obj. %

Typ a třída A1 A2

Min. doba průniku za zkušebních podmínek (RD) (min) 70 35

DSK (g) 7,40 7,79 6,65 6,30 6,33 9,33 4,25 4,69 3,63 3,95 4,16 3,69 4,05 9,50 8,37 8,63 9,03 8,41 7,47

RD (min) 73,0 75,6 63,0 61,0 61,5 90,0 40,5 44,5 35,0 39,0 40,0 35,0 39,5 90,0 80,0 82,0 88,0 81,0 72,0

Czkušebního plynu ve vzduchu

DSK

Cprůniková

(mg.l-1) 3,5 17,5

(g) 7,21 18,0

(ml.m-3) 10 10

(obj. %) 0,1 0,5

V řadě případů však tento požadavek nebyl splněn. Zejména filtry typu MOF-4 (ročníky 1980-1985) dosahovaly poměrně nízkých hodnot RD, v průměru kolem 39 min, což odpovídalo cca 56% požadované hodnoty. Tyto filtry se od ostatních lišily nejenom použitým sorbentem (středně zrněný sorbent SZS 710-1000), ale i jeho obsahem(4) – z testovaných filtrů měl nejnižší. Přesto pokles hodnot RD byl vyšší než by odpovídalo nižší hmotnosti (teoreticky by se hodnoty RD měly pohybovat vzhledem k nižšímu obsahu sorbentu kolem 56 min) sorbentu. I když oba sorbenty použité v MOF filtrech, tj. CHS-5 a SZS 710-1000, byly a jsou především určeny pro záchyt vojenských toxických látek a ne pro záchyt průmyslových škodlivin, přesto filtry obsahující sorbent CHS-5 cyklohexan podstatně lépe zachytávají. Jak filtry typu MOF-4 (ročníky 1986-1990), tak i filtr MOF-5 cyklohexan zachytávají do té míry, že dokáží splnit požadavky příslušné normy kladené na třídu A1. U filtrů typu MOF-2 byly však nalezeny určité výkyvy v naměřených a vypočtených hodnotách RD a DSK jednotlivých ročníků. Zatímco starší filtry (ročníky 1975 a 1976) a nejmladší filtr MOF-2 z roku 1980 požadavky normy splňovaly, hodnoty RD a DSK ročníků 1977-1979 se pohybovaly cca 12% pod normou. Pravděpodobně u starších ročníků se ve větší míře projevilo stárnutí sorbentu poklesem sorpční účinnosti sorbentu, neboť tyto ročníky MOF-2 filtrů měly co do obsahu stejnou náplň jako ročníky 1986-1990 MOF-4 filtrů.

128

2) Dynamická sorpční kapacita filtrů typu MOF – amoniak V případě amoniaku byly filtry typu MOF měřeny jak při koncentraci 0,1 obj. % amoniaku ve vzduchu, tak i při koncentraci 0,5 obj. %. Vedle již hodnocených filtrů MOF-2, MOF-4 a MOF-5 byl při koncentraci 0,5 obj. % změřen dnes již vyřazený filtr MOF. Výsledky měření RD a DSK filtrů dle ČSN EN 141 pro jednotlivé koncentrace jsou uvedeny v tab. č. 2. Koncentrace 0,1 obj. % Z tabulky č.2 vyplývá, že požadované RD nebylo při této koncentraci dosaženo u žádného měřeného filtru a též ani minimální hodnoty DSK (ta pro minimální dobu průniku 50 min. činí asi 1,04 g; dle ústního sdělení je tento údaj v normě chybný a měl by být 40 min. Přesto ani v tomto případě, kdy by minimální hodnota DSK měla být asi 0,83 g, nebylo této hodnoty dosaženo u žádného testovaného filtru). Při hodnocení nebyly nalezeny významnější rozdíly mezi jednotlivými ročníky filtru typu MOF-2 (RD se pohybuje v rozmezí 19,5-36,7 min, DSK od 0,41 do 0,76 g) a MOF-4 se sorbentem SZS 710-1000 (tj. ročníky 1980-1985; RD se pohybovala od 19,1 do 31,5 min, DSK byla v rozmezí 0,40-0,66 g). Poněkud lepších výsledků bylo dosaženo u filtrů obsahující sorbent CHS-5, a to u filtrů MOF-4 z let 1986-1990 a MOF-5. Zejména tento poslední hodnocený filtr (MOF-5) a filtr MOF-4 z roku 1988 prakticky již požadavky normy na třídu K1 (bereme-li v úvahu opravený údaj RD 40 min) splňovaly. Z této skupiny se však poněkud vymyká filtr z roku 1989, kdy byla naměřena RD pouze 23 min a hodnota DSK byla přibližně 0,5 g. Tab. 2: DSK a RD filtrů typu MOF na amoniak Rok výroby - šarže

RD (min)

Filtr - typ MOF

MOF-2

MOF-4

MOF-5

C (obj.%) 6.1965/gts/65 12.1975/D-50/018 3.1976/D-17/045 3.1977/D-24/155 4.1978/D-30/265 2.1979/D-29/240 4.1980/D-15/459 9.1980/D-17/024 10.1981/D-10/141 3.1982/D-24/179 10.1983/D-35/348 6.1984/D-14/414 3.1985/D-40/478 4.1986/D-43/582 7.1987/D-48/690 8.1988/D-23/775 4.1989/D-02/835 5.1990/D-5/914 9.1991/D-05/005

0.1 24.56 36.65 25.00 21.55 22.90 19.50 19.07 19.70 31.53 23.75 23.50 19.40 29.20 30.80 38.75 23.30 31.60 39.00

0.5 11.72 12.50 8.75 9.35 7.66 7.25 7.18 6.26 6.62 8.55 7.93 8.71 9.42 11.35 9.44 10.44 9.19 12.36 11.30

DSK (g) 0.1 0.51 0.76 0.52 0.45 0.48 0.41 0.40 0.41 0.66 0.49 0.49 0.40 0.61 0.64 0.81 0.49 0.66 0.81

0.5 1.22 1.30 0.91 0.97 0.80 0.75 0.74 0.63 0.69 0.90 0.84 0.92 0.99 1.18 0.98 1.09 0.95 1.29 1.18

Min. doba průniku za Czkušebního plynu ve vzduchu DSK Typ a třída zkušebních podmínek (RD) (min) (obj. %) (mg.l-1) (g) 40 0,1 0,7 1,04 K1 40 0,5 3,5 5,21 K2

Cprůniková (ml.m-3) 25 25

129

Koncentrace 0,5 obj. % Obdobným způsobem jako pro koncentraci 0,1 obj. % amoniaku ve vzduchu byla vypočtena min. hodnota DSK (viz. tabulka č. 2) pro koncentraci 0,5 obj. %. Ta by při průniku 50 min měla dosahovat minimálně 5,21 g, budeme-li brát v úvahu nižší průnik (40 min), hodnota DSK bude kolem 4,17 g. Při porovnání dosažených výsledků (tabulka č. 2), ať již s původní nebo upravenou požadovanou minimální hodnotou RD, a tím i vypočtenou hodnotou DSK lze říci, že ani jeden filtr nesplnil požadavky normy ČSN EN 141 kladené na třídu K2. Nejvyšší dosažená hodnota DSK – 13,03 min. a RD – 1.36 g u filtru MOF-4, ročník 1990 byla 74%, resp. 67% pod požadovanými hranicemi. Pro porovnání sorpčních vlastností byl při této koncentraci proměřen již vyřazený filtr MOF (ročník 1965). Hodnoty RD i DSK se v porovnání s ostatními hodnocenými filtry pohybovaly na velmi slušné úrovni, lépe dopadly pouze filtry MOF-2 z roku 1975, MOF-4 z roku 1990 a MOF-5 z roku 1991. Opět, kromě ročníku 1975 filtru MOF-2, nebyly nalezeny významnější rozdíly mezi jednotlivými ročníky filtrů typu MOF-2 a MOF-4 se sorbentem SZS 710-100 (ročníky 19801985). Zatímco u filtrů MOF-2 se hodnoty RD pohybovaly od 7,18 do 9,35 min a hodnoty DSK od 0,73 do 1,00 g, u filtrů MOF-4 to bylo v případě RD od 6,26 do 9,42 min a v případě DSK od 0,57 do 1,09 g. Průměrný % rozdíl mezi těmito skupinami byl v případě DSK přibližně 1,8 %, v případě RD cca 1,5 %. Filtr MOF-2 z roku 1975 dosahoval porovnatelných hodnot RD i DSK s nejlepšími filtry v této tabulce. Také, jako v případě hodnocení při 0,1 obj. %, poněkud lépe dopadly filtry obsahující sorbent CHS-5, a to filtry MOF-4 z let 1986-1990 a MOF-5 z roku 1991. Zejména poslední dva typy vyráběných filtrů z roku 1990 (MOF-4 a MOF-5) dopadly lépe než ostatní, přesto ni oni nesplnily požadavky výšecitované normy. 3) Dynamická sorpční kapacita filtrů typu MOF – oxid siřičitý Koncentrace 0,1 obj. % Dalším hodnoceným toxickým plynem byl oxid siřičitý. Minimální RD dané touto normou, tj. 20 minut (viz tabulka č. 3), odpovídá min. požadovaná hodnota DSK 1,57 g. V následující tabulce č. 3 jsou uvedeny hodnoty RD a DSK testovaných filtrů při koncentraci 0,1 obj. %. Z výsledků vyplynuly následující závěry: 1) požadovanou minimální rezistenční dobu, tj. 20 minut, splnily a výrazně překročily všechny testované filtry, a to o cca 120 – 270 %, 2) obdobně i hodnoty DSK, získané z naměřených výsledků RD, v porovnání s minimální teoretickou hodnotou vypočtenou na základě požadavků kladených normou ČSN EN 141 na třídu E1, do značné míry překračovaly požadavky příslušné normy, a to o 100,0 – 285 %, 3) opět se ukázalo, že vyřazené filtry MOF dosahovaly jedny z nejlepších výsledků, lépe byly hodnoceny pouze filtry MOF-2 (1976), MOF-4 (1986 a 1989) a MOF-5, 4) naměřené hodnoty u filtrů MOF-2, tak jako v případě předchozích toxických látek, byly rozkolísané, hodnoty RD se pohybovaly v rozmezí 44-65 min a hodnoty DSK od 3,4 do 5,1 g,

130

5) tak jako při měření s cyklohexanem a amoniakem i zde nejnižších hodnot RD i DSK bylo dosaženo u filtrů typu MOF-4 obsahujících sorbent SZS 710-100 z let 1980-1985, přesto tyto filtry požadavky normy třídy E1 splnily; v porovnání se skupinou filtrů MOF-2 bylo opět dosaženo jak nižších hodnot RD (o cca 3%), tak i DSK (o cca 2,8 %), tyto rozdíly však již nebyly tak výrazné. 6) velmi vysokých hodnot RD i DSK bylo dosaženo i u druhé skupiny MOF-4 filtrů, vysoké hodnoty byly dosaženy také u filtru MOF-5 obsahující též sorbent CHS-5. Tab. 3: DSK a RD filtrů typu MOF na oxid siřičitý Filtr – typ MOF

MOF-2

MOF-4

MOF-5

Rok výroby – šarže C (obj.%) 6.1965/gts/65 12.1975/D-50/018 12.1975/D-07/018 3.1976/D-17/045 3.1977/D-24/155 4.1977/D-24/156 2.1978/D-29/240 5.1979/D-19/365 7.1979/D-20/390 9.1979/D-8/402 4.1980/D-15/459 9.1980/D-17/024 10.1981/D-10/141 3.1982/D-24/179 10.1983/D-35/348 6.1984/D-14/414 3.1985/D-40/478 4.1986/D-43/582 7.1987/D-48/690 8.1988/D-23/775 4.1989/D-02/835 5.1990/D-5/914 9.1991/D-05/005

RD 0,1 63.00 56.00 63.00 63.00 61.00 51.25 51.50 48.50 46.25 56.25 59.50 44.50 56.75 55.25 46.50 63.50 61.00 62.00 74.75 60.75 72.00

(min) 0,5 13.40 11.26 14.00 10.50 10.75 12.10

12.00 11.50 12.42 13.35 12.80 12.15 12.45 12.50 12.20 13.02 14.50 13.65 12.00 16.35

DSK 0,1 4.95 4.40 4.94 4.95 4.79 4.02 4.04 3.81 3.64 4.42 4.67 3.45 4.46 4.34 3.65 4.98 4.80 4.87 5.87 4.77 5.65

(g) 0,5 5.26 4.42 5.42 4.12 4.22 4.75

4.71 4.52 4.88 5.24 5.02 4.77 4.89 4.91 4.79 5.11 5.69 5.36 4.71 6.42

Czkušebního plynu ve vzduchu DSK Min. doba průniku za Typ a třída zkušebních podmínek (RD) (min) (obj. %) (mg.l-1) (g) 20 0,1 2,7 1,57 E1 20 0,5 13,3 7,85 E2

Cprůniková (ml.m-3) 5 5

Koncentrace 0,5 obj. % Jestliže tyto filtry vyhověly požadavkům třídy E1 v celém svém rozsahu, naopak požadavkům kladeným pro třídu E2 (tj. koncentraci 0,5 obj. % SO2 ve vzduchu, minimální době průniku 20 min. a minimální vypočtené hodnotě DSK 7,85 g) nevyhověly. V následující tabulce č. 6 jsou uvedeny naměřené hodnoty RD i DSK. Získané závěry jsou následující: 1) filtr MOF i při této koncentraci dosahoval po filtru MOF-4 (1988) a MOF-5 jeden z nejlepších výsledků,

131

2) rozkolísaná kvalita naměřených hodnot u filtrů MOF-2 byla nalezena i při této koncentraci, rozdíl se pohyboval v případě hodnot RD přibližně 3,7 min a u DSK cca. 1,46 g, 3) obdobně jako v případě koncentrace 0,1 obj. %, i zde bylo posouzeno porovnání MOF-2 filtrů s MOF-4 filtry obsahující sorbent SZS 710-100, tj. filtry z let 1980-1985; naopak při této koncentraci nižší hodnoty byly nalezeny u MOF-2 filtrů, a to v případě RD o cca 5,9 %, v případě DSK o cca 5,8 %, 4) pouze nepatrně vyšších hodnot bylo naměřeno u skupiny filtrů MOF-4 se sorbentem CHS-5 v porovnání se stejným typem obsahujícím ale sorbent SZS 710-1000, rozdíl skupin činil v případě hodnot RD pouze 1,2 min a u DSK 0,17 g, 5) filtr MOF-5 dosáhl nejvyšších hodnot ze všech testovaných filtrů, rozdíl proti normě přesto činil 3,65 min, resp. 1,43 g. 4) Dynamická sorpční kapacita filtrů typu MOF – chlór Koncentrace 0,5 obj. % Protože z dřívějších informací bylo známo, že filtry typu MOF splňují požadavky normy ČSN EN 141 pro třídu B1-chlór, bylo měření pouze prováděno při koncentraci 0,5 obj. % Cl2 ve vzduchu. Přesto bylo provedeno jedno kontrolní měření při koncentraci 0,1 obj. %. Jako zkušební vzorek byl vybrán filtr MOF-4. ročník 1990 – viz tabulka č. 4. V souladu s požadavky třídy B1 uvedenými v příslušné normě je zřejmé, že příslušný filtr nejenže splňuje požadavky normy na minimální dobu průniku, tj. RD, a též na vypočtenou hodnotu DSK, ale tyto hodnoty značně překračuje. Nárust v případě RD a DSK se pohyboval kolem 385 %. Porovnáním výsledků dosažených při koncentraci 0,1 obj. % a 0,5 obj. % lze vidět, že naměřená RD 97 min při 0,1 obj. % spíše odpovídá hodnotě RD 19 min než 14 min naměřené při koncentraci 0,5 obj. %. Tomuto závěru odpovídá i skutečnost, že DSK při 0,1 obj. % činí 8,43 g a při 0,5 obj. % u filtru s dosaženou RD 19 min 8,26 g. Na základě těchto faktů lze konstatovat, že 5-ti násobnému zvýšení koncentrace chlóru ve vzduchu odpovídá 5-ti násobný pokles RD (existuje zde přímá úměra mezi nárustem koncentrace a poklesem RD). Na základě této úvahy lze říci, že i ostatní nehodnocené MOF, MOF-2, MOF-4 a MOF-5 filtry splňují požadavky normy třídy B1, neboť filtr s nejnižší hodnotou RD (MOF-4, ročník 1982) 9,6 min po přepočtu dosahuje RD 48 min, a tudíž požadavek normy třídy B1 - 20 min – zdaleka překračuje. Na základě tohoto přepočtu je zřejmé, že MOF filtry zcela vyhovují třídě B1 příslušné normy. Jestliže výšeuvedené filtry splňovaly požadavky třídy B1, naopak pro zařazení do třídy B2 nebyl nalezen ani jeden filtr. Nejlepší dosažený výsledek byl u filtru MOF-4, ročník 1989, kde hodnoty RD a DSK dosahovaly 99 % požadovaných hodnot. U filtru MOF, který v porovnání s předchozím hodnocením, dopadl o něco hůře, dosažená RD byla pouze kolem 72%. Jednotlivé ročníky u filtrů MOF-2 vykázaly opět značný rozptyl ve výsledcích, tento rozdíl činil přibližně 4 min. Porovnáním průměrné hodnoty RD a DSK této skupiny filtrů se skupinou filtrů MOF-4 se sorbentem SZS 710-1000 bylo zjištěno, že jsou lepší o cca 3%, naopak pouze o asi 12% horší než skupina MOF-4 filtrů se sorbentem CHS-5. Posledně jmenovaná skupina se

132

pohybovala na úrovni 78% požadované hodnoty, obdobně i naměřené hodnoty u filtru MOF-5 dosahovaly cca 80% teorie. Tab. 4: DSK a RD filtrů typu MOF na chlór Filtr - typ MOF

MOF-2

MOF-4

MOF-5

Rok výroby - šarže

RD

DSK

C

(min)

(g)

(obj. %)

2.1974/D-10/2134

14,40

6,26

0,5

12.1975/D-50/018

12,85

5,58

0,5

3.1976/D-17/045

14,90

6,47

0,5

3.1977/D-24/155

11,65

5,06

0,5

2.1978/D-29/240

14,35

6,23

0,5

7.1979/D-20/390

15,55

6,76

0,5

4.1980/D-15/459

12,65

5,50

0,5

9.1980/D-17/024

11,75

5,10

0,5

10.1981/D-10/141

12,72

5,53

0,5

3.1982/D-24/179

10,75

4,67

0,5

10.1983/D-35/348

13,70

5,95

0,5

6.1984/D-4/414

14,55

6,32

0,5

3.1985/D-40/478

16,10

7,00

0,5

4.1986/D-43/582

12,60

5,47

0,5

7.1987/D-48/690

14,10

6,12

0,5

8.1988/D-23/775

15,45

6,71

0,5

4.1989/D-02/835

17,90

7,95

0,5

5.1990/D-5/914

16,50

7,17

0,5

5.1990/D-5/914

97,00

8,43

0,1

9.1991/D-05/005

16,00

7,00

0,5

Min. doba průniku za Czkušebního plynu ve vzduchu DSK Typ a třída zkušebních podmínek (RD) (min) (obj. %) (mg.l-1) (g) 20 0,1 3,0 1,74 B1 20 0,5 15,0 8,70 B2

Cprůniková (ml.m-3) 0,5 0,5

5) Dynamická sorpční kapacita filtrů typu MOF – sirovodík Koncentrace 0,5 obj. % Jedním z nejlépe sorbovaných plynů pomocí filtrů typu MOF byl sirovodík (sulfan). Měření však byla pouze prováděna při 0.5 obj. %, neboť záchyt tohoto plynu při nižší koncentraci by byl značně časově náročný (viz tabulka č. 5 – filtr MOF-4, ročník 1990). Jako u jediného z testovaných plynů byly splněny u všech typů a jednotlivých ročníků MOF filtrů požadavky třídy 2, tj. záchyt 0.5 obj. %, přesto v porovnání s předchozími výsledky zde bylo několik rozdílů.

133

Jestliže MOF filtry (myšleno typově) zachytávaly předchozí testované plyny na velmi dobré úrovni, v tomto případě, i když filtr splnil požadavky normy třídy B2, výsledná hodnota RD (DSK) se pohybovala pouze nepatrně nad požadovanou hranicí. I tak nevhodné filtry pro záchyt výšeuvedených látek, jako jsou MOF-4 filtry (ročníky 1980-1985), dosahovaly v tomto případě lepších výsledků. Nebyly nalezeny významné rozdíly mezi jednotlivými typy filtrů. Pouze ročníky 1988 a 1989 MOF-4 filtrů a ročník 1976 MOF-2 filtru dosahovaly vyšších hodnot DSK. Naopak poměrně nízké hodnoty DSK byly nalezeny u později vyráběných filtrů, a to u filtru MOF-4 (ročník 1990, kde hodnota DSK byla „pouze“ 10,22 gramů) a MOF-5 (ročník 1991, hodnota DSK dosahovala „pouze“ 13,03 gramu). Tab. 5: DSK a RD filtrů typu MOF na sirovodík Filtr – typ MOF

MOF-2

MOF-4

MOF-5

Rok výroby - šarže

RD

DSK

C

8.1965/gts/80

(min) 44,25

(g) 9,22

(obj. %) 0,5

12.1975/D-07/018 3.1976/D-17/045 5.1977/D-25/166 4.1978/D-30/256 7.1979/D-20/390 4.1980/D-15/459

55,25 70,35 53,75 66,75 43,25 55,75

11,53 14,56 11,21 13,92 9,02 11,62

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

9.1980/D-17/024 10.1981/D-10/141 1.1982/D-24/165 10.1983/D-35/351 6.1984/D-4/414

48,25 51,50 63,00 42,75 51,33

10,06 10,74 13,13 8,91 10,70

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

5.1985/D-40/496 4.1986/D-43/582 4.1986/D-43/582 7.1987/D-48/690 8.1988/D-23/775 4.1989/D-02/835 5.1990/D-5/914 5.1990/D-5/914 9.1991/D-05/005

46,75 49,5 24,0 51,00 80,00 70,25 49,00 411,0 62,50

9,75 10,32 10,00 10,63 16,68 14,44 10,22 17,13 13,03

0,5 0,5 1,0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,1 0,5

Významně se zde neprojevil (kromě ročníků 1988 a 1989) ani vliv různých sorbentů v MOF-4 filtrech. Na závěr bylo provedeno též hodnocení u náhodně vybraného filtru při koncentraci 1 obj. %. Požadavek normy však testovaný filtr nesplnil (MOF-4, ročník 1986). Při hodnocení filtrů, zejména při vyšších koncentracích, byl pozorován zvýšený nárust teploty uvnitř filtru, a to o 10-15 °C. Přesná příčina tohoto jevu sice není ještě známa, ale přepokládáme, že zde kromě fyzikální sorpce dochází i k chemisorpci, při které dochází k reakci mezi složkami sorbentu a zachytávaným sirovodíkem, a tato reakce má exotermní průběh.

134

Min. doba průniku za Czkušebního plynu ve vzduchu DSK Cprůniková Typ a třída zkušebních podmínek (RD) (min) (obj. %) (mg.l-1) (g) (ml.m-3) 40 0,1 1,4 1,67 10 B1 40 0,5 7,1 8,36 10 B2 60 1,0 14,2 25,01 10 B3

4

ZÁVĚR

Malé ochranné filtry MOF vyvinuté původně pro potřeby Civilní obrany lze v omezené míře použít jako únikových prostředků, zejména vyskytují-li se v ovzduší organické látky (imitované cyklohexanem), oxid siřičitý, chlór a sirovodík. Z 5 testovaných látek minimálním požadavkům na RD a DSK, tj. vyhovujícím alespoň požadavkům třídy 1 (0,1 obj. %) ČSN EN 141, nevyhověly jak u všech typů, tak i u jednotlivých ročníků zejména filtry testované na amoniak. Naopak filtry testované na sirovodík jako jediné v celém rozsahu vyhověly požadavkům třídy 2 (0,5 obj. %)příslušné normy. Z pohledu jednotlivých typů byly nejhorší výsledky dosaženy u filtrů MOF-4 obsahující středně zrněný sorbent SZS 710-1000 (ročníky 1980-1985). Filtry této skupiny splňovaly pouze požadavky třídy 1 v případě oxidu siřičitého a chlóru, hodnoty však ve většině případů byly nižší než u ostatních typů a ročníků. Sorbent SZS 710-1000, použitý u této skupiny MOF filtrů, ačkoli vyhovuje požadavkům technických podmínek pro záchyt vojenských toxických látek, je svým složením, úpravou, distribucí velikosti částic, distribucí a velikostí pórů a mikropórů prakticky nepoužitelný pro záchyt průmyslových škodlivin, byť i jen v omezené míře. Ostatní hodnocené filtry dosahovaly nepoměrně lepších výsledků, řada ročníků splnila nebo se blížila požadavkům třídy 1 pro cyklohexan. Také výsledky hodnocení na amoniak byly lepší, i když v tomto případě požadavky normy nebyly splněny. LITERATURA: [1]

ČSN EN 141 (83 2220) Ochranné prostředky dýchacích orgánů – Protiplynové a kombinované filtry – Požadavky, zkoušení a značení.

[2]

Sýkora, V. Metodika testování MOF na kapalné látky – interní přepis. Lázně Bohdaneč 2003.

[3]

Sýkora, V. Metodika testování MOF na plynné látky – interní přepis. Lázně Bohdaneč 2003.

[4]

Kroupa, M. Prostředky individuální ochrany. Příručka pro orgány státní správy, územní samosprávy, právnické osoby, podnikající fyzické osoby a obyvatelstvo. MV-generální ředitelství Hasičského záchranného sboru ČR, Praha 2003.

Kontaktní adresa: Vlastimil Sýkora, Čestmír Hylák, Institut ochrany obyvatelstva, Na Lužci 26, 533 41 Lázně Bohdaneč, e-mail: [email protected].

135

T-2 MYKOTOXIN A JEHO MOŽNÉ ZNEUŽITÍ Marie Vacková ÚVOD V běžném životě můžeme trichothecenový T-2 toxin nalézt v řadě cereálií jako produkt plísní rodu Fusarium. Trichothecenové mykotoxiny (T-2 toxin) se v organismu rychle vstřebávají trávicím traktem, jsou poměrně rychle metabolizovány a vylučují se stolicí a močí. Projevují se dráždivým účinkem gastrointestinálního traktu s hemorhagiemi, zvracením, ztrátou chutí k jídlu a úbytkem na váze. T-2 toxin vykazuje také cytotoxický efekt s následným poškozením lymfatické a hemopoetické tkáně, což může vést i k celkové imunosupresi. K chemické detekci jsou po izolaci, extrakci a purifikaci používány chromatografické metody. Známy jsou také některé biologické detekční testy. T-2 TOXIN A JEHO MOŽNÉ ZNEUŽITÍ Už méně je známý fakt, že s tímto mykotoxinem musíme také počítat v souvislosti s jeho možným zneužitím k vojenským či teroristickým účelům. Klinické projevy účinku T-2 toxinu se značně odlišují podle brány vstupu toxinu do organismu. Za mimořádných situací (zneužití) se jako nejvíce nebezpečné jeví použití T-2 toxinu ve formě aerosolu. U zasažených osob se objevuje popáleninová bolest, zarudnutí, puchýře a může dojít až ke vzniku nekrózy. Při poškození horních cest dýchacích dochází nejdříve k projevům pálení na sliznici dutiny nosní, dále se rozvíjí serózní rýma, epistaxe a v závěru nastupují vážné poruchy dýchání. Snad nejdříve po expozici T-2 ve formě aerosolu však dochází k postižení očí (minuty), které se projeví bolestivostí, slzením, zarudnutím, neostrým viděním. Systémová toxicita se může projevit ztrátou koordinace, ataxií, závratěmi, vyčerpáním. U fatálních případů se objevuje tachykardie, hypotermie a hypotenze. DIAGNOSTIKA Při vyslovení podezření na použití T-2 toxinu musí být brány v úvahu další zpuchýřující látky (například yperit). Rychlá specifická diagnostika T-2 toxinu není zatím možná v polních podmínkách. Proto se doporučuje zaslat na vyšetření moč a sérum do nejbližší laboratoře, která je schopna provést detekci toxinu a jeho metabolitů. Pro patologické vyšetření lze zasílat krev, moč, vzorek plicní nebo jaterní tkáně a střevní obsah. ZÁVĚR V současné době není k dispozici žádné antidotum či jiný léčebný postup po zasažení tímto toxinem. Účinky dermální toxicity lze snížit omytím čistou vodou a mýdlem. Jestliže došlo ke spolykání T-2 toxinu, tak můžeme podat aktivní uhlí (Carbo medicinalis). Výplach zasažených očí lze provádět fyziologickým roztokem nebo čistou vodou. Kontaktní adresa: Marie Vacková, Katedra epidemiologie, Fakulta vojenského zdravotnictví UO, Třebešská 1575, 500 01 Hradec Králové, [email protected].

136

SLEDOVÁNÍ DIFÚZE RADIONUKLIDŮ V ANIONTOVÝCH FORMÁCH VE ZHUTNĚNÉM BENTONITU Petr Večerník, Věra Jedináková-Křížová Abstrakt Studovány byly difúzní experimenty technecistanu (99TcO4-) a rhenistanu ve zhutněném bentonitu. Pro výpočet efektivních a zdánlivých difúzních koeficientů byla využita průniková metoda. Sledován byl vliv zrnitosti bentonitu použitého k vytvoření tablet zhutněného materiálu o hustotě 1,3 g/cm3. Vypočtené difúzní koeficienty ukazují, že difúzní procesy závisí na použitém zhutněném bentonitu. Hodnoty efektivních difúzních koeficientů pro 99TcO4- i modelový anion ReO4- jsou srovnatelné a pohybují se v rozmezí 3,0⋅10-12 až 3,3⋅10-12 m2/s a zdánlivých difúzních koeficientů v rozmezí 3,6⋅10-12 až 3,9⋅10-12 m2/s. 1

ÚVOD

Při provozu jaderných elektráren, ve výzkumu a dalších oblastech lidské činnosti vznikají radioaktivní odpady. Pro uložení vysoce aktivních odpadů a vyhořelého jaderného paliva bude vybudováno hlubinné úložiště. Předpokládána je výstavba v žulovém masivu v hloubce přibližně 500m a bude založeno na multibariérovém systému, který bude bránit možnému úniku uložených látek do životního prostředí1,2. Vysoce aktivní odpady budou zabudovány do skleněné matrice, vitrifikovány, a stejně jako vyhořelé jaderné palivo uzavřeny v kovových kontejnerech. Tyto kontejnery musí splňovat požadované parametry pro konečné dlouhodobé uložení. Pevná matrice odpadu a kontejner budou tvořit první dvě inženýrské bariéry. Další bariéry pak budou na bázi bentonitu. Ten bude spolu s různými příměsemi (písek, grafit, …) sloužit jako zásypový a výplňový materiál kolem kontejneru. Poslední bariérou bude samotná mateřská hornina, ve které bude hlubinné úložiště vybudováno3. Bentonit je jílový materiál, o němž je známo, že ve vodném prostředí bobtná. Z hlediska chemických charakteristik má velmi dobré pufrovací vlastnosti, výraznou kationtově výměnnou kapacitu, ale velmi malou schopnost vyměňovat anionty. Jednou ze složek vyhořelého jaderného paliva jejíž obsah je relativně vysoký (6 %) je radionuklid 99Tc emitující β záření. Tento izotop technecia má velmi dlouhý poločas rozpadu, 2,1⋅105 let, a může tedy ovlivňovat životní prostředí po velmi dlouhou dobu. Technecium lze zařadit mezi prvky, jejichž transport mimo jiné závisí i na okolních podmínkách, zejména na pH a Eh prostředí. V aerobních systémech se technecium vyskytuje ve formě aniontu TcO4-, za anaerobních podmínek převládá technecium ve formě oxidu ve valenčním stavu Tc(IV). Technecistanový anion je velmi dobře rozpustný a tudíž velmi mobilní, naopak oxid technecičitý je rozpustný velmi málo4. Často se využívá velmi podobných chemických vlastností a chování technecia a rhenia k provádění modelových experimentů, při kterých je radioaktivní technecium nahrazeno neaktivním rheniem. Tyto experimenty jsou méně nákladné a nedochází při nich k manipulaci s radioaktivními materiály5. Difúze je jev, při kterém dochází k přesunu hmoty na základě koncentračního gradientu. Veličina, jenž tento přenos popisuje se nazývá difúzní tok, nebo také hustota difúzního toku. Všechny popisy a vyhodnocení difúzních experimentů vycházejí z prvního a

137

druhého Fickova zákona a je možné je vyjádřit mnoha matematickými rovnicemi6,7,8. V těchto rovnicích se vyskytuje veličina zvaná difúzní koeficient (D), jehož stanovení je hlavním cílem difúzních experimentů. Difúzní koeficient sledované sloučeniny popisuje její prostup přes studovaný materiál a poskytuje informaci o rychlosti šíření této sloučeniny v materiálu a lze jej vyjádřit několika způsoby, například vztahem [1]: D = De = Da (ε + ρ c K d ) = εD p = εDvϕ = εDv

δD , [1] τ2

kde De je efektivní difúzní koeficient, Da – zdánlivý difúzní koeficient, Dp – difúzní koeficient pórové vodě, Dv – difúzní koeficient v čisté vodě, ε - efektivní porozita, ϕ - geometrický (klikatostní) faktor, δD – zúžitelnost, τ - tortuozita (klikatost). Nejčastěji jsou stanovovány efektivní a zdánlivé difúzní koeficienty. Důležitými faktory ovlivňujícími difúzi v porézních materiálech, jako je např. zhutněný bentonit, jsou tedy porozita, tortuozita, struktura a geometrie pórů a vlastního materiálu9,10. Zdánlivé difúzní koeficienty Da v jílových minerálech jsou pak nižší než odpovídající difúzní koeficienty v čisté vodě. Migrace radionuklidů v geologických materiálech bude zejména probíhat ve vodě, která bude zaplňovat spáry a praskliny. Zde může docházet nejen k difúzi, ale také ke migraci radionuklidů díky proudění podzemní vody11. Bobtnáním bentonitu dojde k zaplnění mezer a spár vzniklých při výstavbě bariéry, popřípadě k zacelení poruch a prasklin vzniklých působením okolního prostředí. Vzhledem k tomuto chování bentonitu se předpokládá, že jediným mediem sloužícím k difúzi tedy bude voda v pórech zhutněného bentonitu (označuje se jako pórová voda). Difúze pak bude ovlivněna různými chemickými a chemickofyzikálními procesy, jako např. srážení, sorpce a desorpce, iontová výměna atd.12,13. 2

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Pevná a kapalná fáze

Pevnou fázi bylo při těchto migračních experimentech tvoří zhutněný bentonit z lokality Rokle, nacházející se nedaleko Kadaně. Surový bentonit byl vysušen, rozsítován a sítové frakce o zrnitostech 0,150 - 0,200 a 0,315 – 0,800 mm byly použity k výrobě tablet zhutněného bentonitu. Bentonit byl pomocí lisu zhutněn na suchou měrnou hmotnost 1,3 g/cm3. Takto vytvořené tablety byly umístěny do difúzních cel, nasyceny kapalnou fází a použity k experimentům. Jako vodná fáze byl použit bentonitový výluh připravený čtrnáctidenním loužením bentonitu v redestilované vodě, při poměru voda:bentonit = 1:10. Tato připravená vodná fáze by měla simulovat možnou podzemní vodu vyskytující se v hlubinném úložišti poté co prošla bentonitovou bariérou. Difúzní experimenty Difúzní experimenty byly prováděny v uspořádání zachyceném na obr. 1. K difúzním celám z nerezové oceli o vnitřních rozměrech: průměr – 10 mm, délka – 10 mm byly pomocí silikonových hadiček připojeny rezervoáry s kapalnou fází. Do difúzní cely byla vložena tableta zhutněného bentonitu, která byla před započetím experimentů nasycena kapalnou fází. Vzájemný kontakt kapalné a pevné fáze byl zajištěn pomocí skleněných frit značení S3, které jsou zabudovány uvnitř difúzních cel. Cirkulaci vodné fáze z rezervoáru do difúzních cel obstarávají peristaltická čerpadla. Ve fázi sycení vzorků bylo v obou rezervoárech 50 ml

138

bentonitového výluhu a doba sycení byla stanovena na 14 dní. Během této doby se předpokládá úplné nasycení zhutněného bentonitu, tj. zaplnění všech pórů ve vzorku vodnou fází a ustanovení rovnováhy. Po nasycení byla kapalná fáze v rezervoárech vyměněna za čerstvou. Jedny z rezervoárů napojených na difúzní cely byly označeny jako cílové a obsahovaly pouze 50 ml bentonitového výluhu, druhé byly označeny jako zdrojové a obsahovaly 50 ml bentonitového výluhu značeného NH499TcO4 (Lacomed s.r.o., Řež, ČR) nebo KReO4 (Sigma-Aldrich, Praha, ČR). Ke značení pomocí 99-technecistanu bylo použito 350 µl roztoku o koncentraci c = 3,72⋅10-10 mol/l a specifické aktivitě 740 kBq/ml a ke značení pomocí rhenistanu bylo použito 700 µl roztoku o koncentraci c = 7⋅10-3 mol/l přidaných do zdrojových rezervoárů.

Obr.1: Schéma difúzního experimentu Sledována byla časová závislost průchodu studovaných složek difúzní celou. V průběhu experimentu byly odebírány vzorky kapalných fází a byl v nich stanovován obsah technecia a rhenia. Způsob detekceβ-aktivity Pro měření β-aktivity 99Tc bylo využito měření pomocí kapalného scintilátoru na přístroji Triathler (Hidex, Oy, Finsko). Tato metoda umožňuje měřit vzorky o nízké aktivitě a její další výhodou je také možnost měření vzorků o malých množstvích. Jako kapalný scintilátor byl použit scintilační koktejl AquaLight (Fischer Chemicals, Velká Británie). V plastové vialce bylo dokonale smícháno 0,2 ml odebraného vzorku kapalné fáze a 1 ml scintilačního koktejlu. U takto vzniklé směsi byla stanovena a zaznamenána její aktivita. Tato metoda byla podrobněji popsána14. Chemické analýzy Stanovení obsahu rhenia v kapalné fázi bylo prováděno pomocí kapilární elektroforézy CAPEL-105 (Lumex Ltd., St. Peterburg, Rusko) s využitím křemenné kapiláry o délce 39 cm (30 cm k detektoru) a vnitřním průměru 75 µm a UV detekcí. Jako základní elektrolyt byl použit Britton-Robinsonův pufr o pH = 4,5. Při analýze byl použit hydrodynamický nástřik (30 s/15mbar) a separace probíhala při obrácené polaritě –10 kV a přímé UV detekci na vlnové délce 214 nm. Koncentrace rhenistanu byla vypočtena z plochy píku, která byla dosazena do rovnice kalibrační přímky.

139

Vyhodnocení Difúzní experimenty lze provádět v různých uspořádáních a různými metodami, např. metodou penetračního profilu, metodou planárního zdroje, průnikovou metodou, kapilární metodou atd. Při těchto experimentech byla využita průniková metoda. Výhodou této metody je, že z naměřených dat lze vypočítat dva typy difúzních koeficientů, efektivní difúzní koeficient De a zdánlivý difúzní koeficient Da. Průniková metoda je popsána rovnicí [2]:  D (nπ ) 2 t  D t 1 2 ∞ (−1) n Q  , [2] = e2 − − ∑ 2 exp e 2 6 π n =1 n ALc0 L L   přičemž pro dlouhodobý časový interval je možno tuto rovnici zjednodušit na [3]: c L Q c 0 De t − 0 , [3] = A L 6 kde Q je množství prodifundované složky (radionuklidu) , A – průřez, L – délka, c0 – počáteční koncentrace složky (radionuklidu), t – čas, De – efektivní difúzní koeficient. V grafu závislosti množství prodifundované látky na čase je možno inflexním bodem křivky vést tečnu a její průsečík s časovou osou je označován jako te – doba zpoždění (lag time). Po dosazení zjištěné doby zpoždění te do rovnice [4]: L2 , [4] te = 6 Da je možno vypočítat zdánlivý difúzní koeficient Da. Vzájemný vztah efektivního a zdánlivého difúzního koeficientu vyjadřuje rovnice [5]: De D [5] Da = = e , ε + ρc K d α kde Da je zdánlivý difúzní koeficient, De – efektivní difúzní koeficient, ρc – celková hustota (dry bulk density), ε - porozita, Kd – distribuční koeficient, α - kapacitní faktor. Využitím distribučního koeficientu vyskytujícího se v rovnici [5] je možno ve výpočtech navázat na sorpční experimenty, ve kterých je Kd jedním z parametrů vypočtených z naměřených dat. 3

VÝSLEDKY A DISKUSE

Naměřené hodnoty aktivit 99Tc nebo koncentrací rhenia při jednotlivých experimentech byly vyneseny do grafů v závislosti na čase (viz obr. 2 a 3). Pro výpočet De byly použity počáteční hodnoty aktivit 99Tc a koncentrací rhenia a hodnoty těchto veličin dosažených po 90 dnech difúzních experimentů, kdy již bylo předpokládáno dosažení rovnováhy. Při výpočtu efektivních difúzních koeficientů technecistanu pomocí vztahu [3], můžeme koncentrace nahradit naměřenými hodnotami aktivit (s-1) a prodifundované množství Q vyjádřit jako součin aktivity odebraného vzorku (s-1) a velikosti odebraného objemu (m3) a po matematické úpravě vzorce je možno vypočítat De.

140

průběh difúze

99

-

TcO4 bentonitem

50000

0,200 - 0,150 mm

0,800 - 0,315 mm

45000 40000

aktivita (s-1)

35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

čas (dny)

Obr. 2: Závislost prodifundovaného množství 99TcO4- na čase v závislosti na zrnitosti bentonitu, v grafu jsou znázorněny tečny pro odečtení doby zdržení te Vyhodnoceny byly tyto hodnoty efektivních difúzních koeficientů: pro zhutněný bentonit o sítové frakci 0,200 – 0,150 mm De = 2,94⋅10-12 m2/s a pro zhutněnou sítovou frakci o zrnitosti 0,315 – 0,800 mm De = 3,06⋅10-12 m2/s. Z těchto hodnot i z časových závislostí je možno usoudit, že difúze technecistanu závisí na zrnitosti použitého bentonitu. U hrubší sítové frakce jsou póry ve zhutněném bentonitu větší a tudíž je možná rychlejší difúze. U experimentů studujících časovou závislost difúze rhenistanu přes zhutněný bentonit, byly do rovnice [3] dosazeny vypočtené koncentrace rhenistanu a prodifundované množství Q bylo vyjádřeno jako součin zjištěné koncentrace rhenistanu v cílovém rezervoáru a jeho objemu. -

průběh difúze ReO4 bentonitem 0,02

0,200 - 0,150 mm

0,800 - 0,315 mm

c (mmol/l)

0,016

0,012

0,008

0,004

0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

čas (dny)

Obr. 3: Závislost prodifundovaného množství rhenistanu na čase v závislosti na zrnitosti bentonitu, v grafu jsou znázorněny tečny pro odečtení doby zdržení te Získány byly tyto efektivní difúzní koeficienty: pro zhutněný bentonit o sítové frakci 0,200 – 0,150 mm De = 3,29⋅10-12 m2/s, pro zhutněnou sítovou frakci o zrnitosti 0,315 – 0,800 mm De = 3,34⋅10-12 m2/s. Lze pozorovat závislost difúzního koeficientu rhenistanu, a tedy i rychlosti difúze, na použité sítové frakci, i když rozdíl mezi dosaženými difúzními koeficienty není příliš výrazný, viz tabulka 1.

141

Tab. 1: Efektivní difúzní koeficienty technecistanu a rhenistanu zrnitost bentonitu (mm) 0,150 - 0,200

efektivní difúzní koeficient De (m 2/s) 2,94×10-12

TcO4-

0,315 - 0,800

3,06×10-12

ReO4-

0,150 - 0,200

3,29×10-12

-

0,315 - 0,800

3,34×10-12

sledovaná složka 99

TcO4-

99

ReO4

Pro výpočet Da byly ve všech sestrojených grafech vyznačeny tečny v inflexních bodech závislostí a poté odečteny doby zdržení. Z odečtených hodnot pak byly po dosazení do vztahu [4] vypočteny zdánlivé difúzní koeficienty. Získané hodnoty difúzních koeficientů jsou shrnuty v tabulce 2. Tab. 2: Zdánlivé difúzní koeficienty technecistaun a rhenistanu zrnitost bentonitu (mm) 0,150 - 0,200

sledovaná složka 99

TcO4-

99

doba zdržení zdánlivý difúzní koeficient te (dny) Da (m2/s) 53 3,64×10-12 50 3,86×10-12

TcO4ReO4-

0,315 - 0,800 0,150 - 0,200

54

3,57×10-12

ReO4-

0,315 - 0,800

53

3,64×10-12

I zde byla potvrzena očekávaná závislost difúzních koeficientů na použitých sítových frakcích bentonitu. Získané zdánlivé difúzní koeficienty vykazují stejné trendy jako vypočtené efektivní difúzní koeficienty, tj. pro jemnější sítovou frakci bylo pro technecistan i pro rhenistan dosaženo nižších difúzních koeficientů, než při použití bentonitu o zrnitosti 0,315 – 0,800 mm. difúze

99

TcO4- prázdnou celou

12000

cilový rezervoár

zdrojový rezervoár

10000

aktivita (s-1)

8000

6000

4000

2000

0 0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

čas (min)

Obr. 4: Časová závislost difúze technecistanu prázdnou celou Pro vyhodnocování difúzních experimentů bylo také potřeba zjistit, zda difúzi sledovaných složek ovlivňuje konstrukce difúzní cely, tj. jak je migrace ovlivněna porézními fritami zajišťujícími kontakt kapalné a pevné fáze. Proto byl proveden experiment studující časovou závislost difúze technecistanu přes prázdnou celu. Experimentální uspořádání bylo stejné jako na obrázku 1, do difúzní cely však nebyl vložen zhutněný bentonit. Bylo zjištěno,

142

že k vyrovnání koncentrací mezi zdrojovým a cílovým rezervoárem dojde již během 8 hodin (viz obr.4). Porézní frity tedy neovlivňují difúzi studovaných složek přes zhutněný bentonit, neboť časový rozdíl ve zdržení ve velmi výrazný. Toto zdržení pak lze při dalším vyhodnocování zanedbat. 4

ZÁVĚR

U vypočtených efektivních i zdánlivých difúzních koeficientů technecistanu a rhenistanu je možno pozorovat jejich závislost na použitých sítových frakcích bentonitu. Zdržení studovaných látek v porézním materiálu zajišťujícím kontakt kapalné a pevné fáze v difúzní cele je vzhledem k časovému průběhu experimentu zanedbatelné. Při vzájemném porovnání získaných difúzních koeficientů technecistanu a rhenistanu bylo zjištěno, že dosažené hodnoty koeficientů si jsou blízké a vykazují stejné závislosti, což vede k závěru, že v budoucích experimentech bude možno simulovat difúzi aktivního technecistanu neaktivním rhenistanem. Tato práce vznikla za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy, číslo projektu MSM 6046137307. LITERATURA: [1] I. C. Bourg, A. C. M. Bourg, G. Sposito: J. Contam. Hydrol. 61 (2003), 293-302. [2] M. Molera, T. Eriksem, M. Jansson: Appl. Clay Sci. 23 (2003), 69-76. [3] P. Toulhoat: C. R. Physique 3 (2002). [4] H. Vinšová, P. Večerník, V. Jedináková-Křížová: Radiochim. Acta, v tisku (2005). [5] H. Vinšová, R. Konířová, M. Koudelková, V. Jedináková-Křížová: J. Radioanal. Nucl. Chem. 261 (2004), 407-413. [6] J. Crank: Mathematics of Difusion, 2nd edn., Claredon Press, Oxford, 1975. [7] M. Ochs, B. Lothenbach, H. Wanner, H. Sato, M. Yui: J. Contam. Hydrol. 47 (2001), 283-296. [8] J. L. Cormenzana, M. García-Gutiérrez, T. Missana, Á. Junghanns: J. Contam. Hydrol. 61 (2003), 63-72. [9] S. Suzuki, H. Sato, T. Ishera, N. Fujii: J. Contam. Hydrol. 68 (2004), 23-37. [10] M. García-Gutiérrez, M. Mingarro, T. Missana, P. L. Martín, L. A. Sedano, J. L. Comenzana: Appl. Clay Sci. 26 (2004), 57-64. [11] M. Jansson, T.E. Eriksen: J. Contam. Hydrol. 68 (2004), 183-192. [12] Zs. Szántó, É. Svingor, M. Molnár, L. Palcsu, I. Futó, Z. Szücs: J. Radioanal. Nucl. Chem. 252 (2002), 133-138. [13] X. Wang, Z. Tao: J. Radioanal. Nucl. Chem. 260 (2004), 305-309. [14] H. Vinšová, P. Večerník, V. Jedináková-Křížová: LiquiScint 2004, plný text publikován ve sborníku na CD, 2004. Kontaktní adresa: Večerník Petr, Jedináková-Křížová Věra, Ústav analytické chemie, Vysoká škola chemickotechnologická v Praze, Technická 5, 166 28 Praha 6 – Dejvice, e-mail: [email protected].

143

HODNOCENÍ VLIVU DŮLEŽITÝCH PARAMETRŮ OVLIVŇUJÍCÍCH SORPCI 99TcO4- NA BENTONITU ZA ANAEROBNÍCH PODMÍNEK H. Vinšová, P. Večerník,V. Jedináková-Křížová Abstrakt Jedním ze štěpných produktů vyhořelého jaderného paliva je radionuklid 99Tc, který se může vyskytovat v různých oxidačních stavech od –1 až +7, jejichž výskyt závisí zejména na vnějších podmínkách složení vodného roztoku (pH a Eh). Cílem presentované práce bylo zhodnotit důležité parametry ovlivňující průběh sorpčního chování radionuklidu 99Tc na bentonitu za anaerobních podmínek. Anaerobní podmínky byly uskutečněny v rukavicovém boxu v inertní atmosféře dusíku, kde procentický obsah O2 byl nižší než 0,5 % obj. Při experimentech byly sledovány tyto parametry – složení vodného roztoku pro dosažení redukčních podmínek přítomných v hlubinném úložišti, kinetika sorpce, vliv poměru l:s fáze a teploty reakční směsi, ovlivňující průběh sorpčního chování radionuklidu 99Tc na bentonitu. Pro dosažení záchytu technecistanového aniontu na bentonitu, byly k bentonitu přidávány vhodná aditiva (Fe, FeS, aktivní uhlí ..). Identifikace jednotlivých specií technecia na testovaných bentonitových směsích se zvolenými aditivy byla provedena pomocí tenkovrstvé chromatografie s radiometrickou detekcí. Provedenými experimenty bylo zjištěno, že mezi důležité parametry ovlivňující průběh sorpčního chování radionuklidu 99Tc na bentonitu lze zařadit vliv složení vodného roztoku, přídavek vhodných aditiv k bentonitu, kde za přítomnosti redukčních aditiv dochází k redukci technecistanového aniontu do nižšího oxidačního stavu Tc(IV) za vzniku málo rozpustných oxo- a hydroxo- sloučenin technecia nebo kationtových forem Tc4+. 1

ÚVOD

Mezi štěpné produkty vyhořelého jaderného paliva lze zařadit radionuklid 99Tc (T1/2 = 2,1·105 let), jehož obsah ve vyhořelém palivu je 6%, a proto se sleduje jeho chování v souvislosti s problematikou zpracování vyhořelého paliva a jeho ukládáním. Technecium se ve vodných roztocích může vyskytovat v širokém rozmezí oxidačních stavů od –1 až do +7. Výskyt jednotlivých oxidačních stavů technecia závisí na vnějších podmínkách prostředí zejména na pH a redoxním potenciálu vodného roztoku. V geochemických systémech přicházejí v úvahu dva nestabilnější oxidační stavy technecia - Tc(VII) a Tc(IV)1-2. Nejstabilnější oxidační formou je Tc(VII) ve formě technecistanového aniontu, druhým stabilním oxidačním stupněm je Tc(IV). Za aerobních podmínek se technecium vyskytuje v oxidačním stavu Tc(VII) ve formě technecistanového aniontu, který má velkou pohyblivost a rozpustnost a tím pádem nedochází k imobilizaci na přírodních sorbentech. Redukcí nebo reakcí se S2- aniontem je možno docílit změnu chemického chování technecia3-5 za vzniku málo rozpustných oxo- a hydroxo- sloučenin technecia (TcO(OH)2, TcO2·H2O) nebo nerozpustné sraženiny Tc2S7. Za anaerobních podmínek tj. podmínek, které lze očekávat v hlubinném úložišti dochází k redukci technecistanového aniontu do oxidačního stupně Tc(IV) za vzniku málo rozpustných oxo- a hydroxo- sloučenin technecia nebo kationtových forem Tc4+.

144

Obr. 1: Eh-pH diagram jednotlivých specií technecia ve vodném roztoku2 Pro ukládání vysoce radioaktivních odpadů a vyhořelého paliva se v současnosti předpokládá vybudování hlubinného úložiště. Při budování hlubinného úložiště se počítá s vícebariérovým systémem, kde první bariéru bude představovat kontejner s radioaktivním materiálem, dále bude následovat inženýrská bariéra na bázi bentonitu, poslední bariéra bude tvořena hostitelskou horninou. Systém inženýrských bariér je navrhován tak, aby zajistil prakticky úplné oddělení uložených odpadů od okolní horniny po předem určenou dobu, řádově prvních několik set nebo tisíc let. Při posuzování migrace a retardace radionuklidů v geologických systémech, je zapotřebí vzít v úvahu řadu mechanismů, které mohou mít výrazný vliv na celkové chování radionuklidů v systému. Retardací se rozumí fyzikální a chemické procesy, které mají za následek zpomalení či potlačení migrace radionuklidů vzhledem k rychlosti proudění podzemní vody a redukci jejich koncentrace v roztoku. Při posuzování migrace je nutné zahrnout řadu následujících mechanismů a jevů ovlivňujících výsledné chování sledovaných kontaminantů: proudění neboli advekci, difúzi, sorpci, imobilizaci, korozi kontejneru, rozpouštění solidifikovaných odpadů, radioaktivní rozpad, radiační efekty, tvorbu plynů, tvorbu komplexů sledovaných radionuklidů a vznik koloidů. Z celé řady jmenovaných parametrů k nejdůležitějším mechanismům migrace radionuklidů v bariérovém systému patří difúze a sorpce. Difúzí se rozumí pohyb radionuklidů v kapalném prostředí vlivem koncentračního gradientu. Sorpce je reverzibilní interakce mezi mobilní (vodnou) a stacionární (tuhou) fází, zahrnuje iontovou výměnu, adsorpci iontů a filtraci. Vede k retardaci radionuklidů, která je relativní vzhledem k proudění vody. Z chemického hlediska je pohyblivost radionuklidů ovlivněna zejména následujícími faktory: chemickým složením roztoku (pH, Eh a koncentrace ligandů), rozpustností minerálů, dostupností a kapacitou sorbujících se fází a pohyblivostí částic způsobenou tvorbou koloidů. Díky variabilnímu složení bentonitové bariery se mohou v systému vyskytovat specifické ligandy např. ve velké koncentraci CO32- ionty, které tvoří rozpustné komplexy s kovy. Další skupinu představují ligandy s redukčními vlastnostmi, např. HS- aniont, které přispívají k poklesu rozpustnosti přechodných kovů za vzniku nerozpustných sloučenin. Interakce geologické horniny s podzemní vodou, postupná spotřeba vzdušného kyslíku mikroorganismy a oxidace Fe2+ a Mn2+ iontů obsažených v minerálech s redukčními vlastnostmi má za následek, že za normálních podmínek bude vodná fáze vykazovat redukční podmínky

145

Eh < -250 mV, hodnoty pH vodné fáze budou ležet v alkalické oblasti v intervalu hodnot pH = 7 - 96-7. Předmětem prezentované práce je studium sorpce technecistanového aniontu na bentonitu za anaerobních podmínek. Pro zamezení migrace technecistanového aniontu do okolního prostředí byly k bentonitu přidávány vhodná aditiva (Fe, FeS, aktivní uhlí, Fe3O4, FeSO4) umožňující retenci na bentonitové směsi. Protože se předpokládá, že po přídavku aditiv (zejména redukční aditiva) k bentonitu bude docházet ke změně oxidačních stavů technecia, pomocí tenkovrstvé chromatografie s radiometrickou detekcí byla provedena identifikace jednotlivých specií technecia, která umožnila detailnější pochopení mechanismu záchytu technecistanového aniontu na testovaných pevných fázích. Vzhledem k tomu, že teplota bentonitové bariéry v hlubinném úložišti bude po uložení kontejneru s radioaktivním materiálem vyšší než 20 °C, byl sledován vliv rozdílných teplot (rozmezí 20 - 60°C) reakční směsi na průběh sorpčního chování technecistanového aniontu. 2

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Pro sorpční experimenty byl jako geologický materiál použit surový bentonit z lokality Rokle, jež se nachází 5 km od Kadaně. Pro popis sorpčního chování radiotoxických kontaminantů na geologických materiálech je nezbytné znát přesnou charakterizaci materiálu, protože jednotlivé složky obsažené v bentonitu mohou mít významný vliv na změnu chování jednotlivých radionuklidů a změnu vlastností inženýrské bariery. V tabulce I je uvedeno složení bentonitu použitého při sorpčních experimentech. Tab. I: Charakterizace, chemické a mineralogické složení bentonitu využívaného při sorpčních experimentech Sítová frakce: Specifický povrch : Porosita : Mineralogické složení: (dominantní fáze) Chemické složení: (majoritní složky)

0,315 - 0,800 mm 72,9 m2/g 21,8 % montmorillonit (Na,Ca)0,3(Al,Mg)2Si4O10(OH)2·H2O, kalcit (CaCO3), křemen (SiO2) MgO (3,6%), Al2O3 (17,1%), SiO2 (48,7%), CaO (9,5%), TiO2 (4,9%), Fe2O3 (17,3%), K2O (1,1%)

Pro lepší charakterizaci dějů probíhajících v hlubinném úložišti byla jako kapalná fáze využita bentonitová voda, která byla připravena 14 denním loužením bentonitu v redestilované vodě o poměru l:s fáze 10:1 (V/m). Studium sorpce 99TcO4- na bentonitovém materiálu za anaerobních podmínek z důvodu těsnějšího přiblížení redukčních dějů probíhajících v hlubinném úložišti bylo prováděno v rukavicovém boxu v inertní atmosféře dusíku (čistota N2 99,999 % obj., LINDE TECHNOPLYN a.s.), kde hodnota vzdušného kyslíku v atmosféře boxu byla v průběhu měření kontrolována pomocí analyzátoru Testo 305–2 (Laboratorní potřeby a technika MANEKO, Praha) a po dobu prováděných experimentů byla udržována na hladině menší než 0,5 % (obj.).

146

Pro sorpční experimenty byla navržena dávková statická metoda, která byla volena s ohledem co nejtěsnějšího přiblížení dějů probíhajících v hlubinném úložišti. Navrhovaná metodika se vyznačuje jednoduchostí a transparentností. Umožňuje monitorovat vlastnosti sledovaného systému (jako např. složení pevné a vodné fáze, pH, Eh, vodivost, apod.), které přímo či nepřímo ovlivňují kvalitu sorpce radiotoxických kontaminantů na bentonitových materiálech. Sorpční experimenty byly prováděny v polyethylenových zkumavkách, do kterých bylo naváženo předepsané množství bentonitu, popř. směsi bentonit + modifikátor, poté byla přidána vodná fáze značená studovaným radionuklidem (99Tc, Lacomed s.r.o, Řež), ve všech případech byl zachován poměr l:s fáze 10:1. Pro dosažení dokonalého kontaktu pevné a kapalné fáze byly zkumavky horizontálně umístěny do třepačky a třepány po předepsanou dobu. Po stanovené době byla pevná fáze od kapalné oddělena odstředěním po dobu 20 minut při otáčkách 2000 ot/min, ve vodném výluhu byla stanovena měrná aktivita radionuklidu 99Tc, dále u vodného výluhu byly měřeny důležité parametry ovlivňující sorpci - pH, Eh, měrná vodivost. Paralelními experimenty bylo zapotřebí ověřit, zda při použitém složení vodné fáze nedochází k sorpci na stěny PE zkumavky. Vzhledem k tomu, že bez přítomnosti pevné fáze se na stěny polyethylenové zkumavky sorbuje méně než 10% radionuklidu 99Tc, stanovení aktivity radionuklidu 99Tc může být oprávněně určeno z měření vodného výluhu, v opačném případě by bylo nutné využít přímého měření pevného vzorku. β-aktivita radionuklidu 99Tc byla stanovena pomocí plastického scintilačního detektoru SPF 35, v případě nízkých hodnot β-aktivity radionuklidu 99Tc (<10 Bq/ml) bylo využito kapalinové scintilační spektrometrie8. Identifikace jednotlivých chemických forem technecia ve vodném výluhu byla provedena pomocí tenkovrstvé chromatografie s radiometrickou detekcí. Vzhledem k tomu, že radionuklid 99Tc používaný při sorpčních experimentech měl nízkou hodnotu specifické aktivity (A = 7,4 MBq/ml, T1/2 = 2,1.105 let), která není dostačující pro detekci pomocí tenkovrstvé chormatografie s radiometrickou detekcí, pro identifikaci jednotlivých chemických forem technecia byl zvolen krátkodobý radionuklid 99 mTc (A = 2,88 GBq/ml, T1/2 = 6 h) ve formě technecistanu sodného. Chromatografická separace jednotlivých chemických forem technecia (Tc(VII) a Tc(IV)), byla provedena v následujícím uspořádání - stacionární fáze: chromatografické desky Gelman ITLC-SG, mobilní fáze: aceton. V tomto systému technecistan postupuje s čelem mobilní fáze Rf(TcO4-) = 0,84, zatímco redukované formy technecia (TcO2) Rf(TcO2) = 0,04 zůstávají na startu chromatografické desky9. 400

Tc(IV)

350 300

-1

A (s )

250 200 150 100

Tc(VII) 50 0 0

20

40

60

80

100

l (mm)

Obr. 2: Chromatogram specií technecia v oxidačním stavu Tc(IV) a Tc(VII)

147

3

VÝSLEDKY A DISKUSE Kinetika sorpce 99TcO4- na bentonitu a bentonitových směsí za anaerobních podmínek

Cílem kinetických studií je nezbytné pro správné stanovení distribučního koeficientu stanovit optimální dobu, za kterou se studovaný systém dostane do rovnováhy tj. dobu, kdy jsou za daných podmínek dosaženy maximální hodnoty distribučních koeficientů KD a výtěžků sorpce. Předpokládá se, že v hlubinném úložišti vybudovaném v hloubce 500 m pod zemským povrchem budou dosaženy redukční podmínky6. Kinetika sorpce technecistanového aniontu na bentonitu z důvodu těsnějšího přiblížení dějů probíhajících v hlubinném úložišti byla sledována za anaerobních podmínek v rukavicovém boxu v inertní atmosféře dusíku, kde hodnota vzdušného kyslíku byla nižší než 0,5% (obj.). Za těchto podmínek byly změřeny kladné hodnoty redoxního potenciálu bentonitové vody Eh ~ 150mV dokazující přítomnost oxidačního prostředí. Redukční podmínky přítomné v hlubinném úložišti byly za laboratorních podmínek modelovány10 přídavkem FeSO4 (ρ=25 mg/l) do bentonitové vody, která vykazovala redukční prostředí Eh ~ -150mV. Za přítomnosti vzdušného kyslíku obsaženého v pórech bentonitu dochází po přídavku takto modifikované vody k téměř okamžité oxidaci Fe2+ iontů na Fe3+ ionty, v systému jsou přítomny oxidační podmínky9 Eh ~ 150mV. Odstranění tohoto minimálního množství O2 z pórů bentonitu se nepodařilo uskutečnit ani po 5 denním probublávání dusíkem v boxu. Proto za těchto podmínek nebylo možné redukovat technecistan do nižšího oxidačního stavu (Tc(IV)), výtěžky sorpce radionuklidu 99Tc byly nižší než 10%. Téměř zanedbatelná retence technecistanového aniontu na bentonitu je způsobena nízkými hodnotami aniontově výměnné kapacity bentonitu (AEC = 0,09 mol/kg). Pro dosažení záchytu technecistanového aniontu na bentonitu byla testována řada aditiv11 (aktivní uhlí, sloučeniny Fe v různých formách - Fe, FeS, Fe3O4) rozdílné povahy umožňující zamezení migrace technecistanového aniontu do geosféry odlišnými mechanismy. Aditiva byla volena na základě předpokládaného složení bentonitové bariéry, kde řada minerálů obsahuje jako minoritní složky redukující látky umožňující docílení redukčních podmínek, což je velice výhodné u skupiny radiotoxických kontaminantů, kde výskyt jednotlivých oxidačních stavu závisí na redoxních podmínkách prostředí. Z uvedených výsledků na obr. číslo 3 je patrné, že výrazné změny hodnot výtěžků sorpce byly pozorovány na bentonitových směsích s Fe, FeS a aktivním uhlím. Pomocí uvedených aditiv dochází již po 1 denním kontaktu obou fází k dosažení rovnováhy s výtěžky sorpce převyšujícími hranici 95%. Vzhledem k tomu, že se jedná o aditiva rozdílné povahy, záchyt technecistanového aniontu je na těchto směsích uskutečněn pomocí odlišných mechanismů - fyzikální sorpce12-13 je řídícím mechanismem na bentonitové směsi s aktivním uhlím, dominantní specií je technecistanový aniont. V případě Fe a FeS dochází k redukci14-16 technecistanového aniontu do oxidačního stavu Tc(IV) za vzniku málo rozpustných oxo- a hydroxo- sloučenin technecia nebo kationtových forem Tc4+, které se sorbují iontověvýměnným mechanismem na „layer sites“ bentonitu. K redukci technecistanového aniontu nedochází po přídavku magnetitu, kde se železo vyskytuje v oxidačním formách Fe(II) a Fe(III), z těchto důvodů hodnoty výtěžků sorpce radionuklidu 99Tc nepřevyšují hranici 10%. Srovnáním redukčních vlastností testovaných aditiv na bázi sloučenin Fe lze doložit, že redukční vlastnosti dostačující k redukci technecistanového aniontu do oxidačního stupně Tc(IV) vykazuje Fe a FeS. V případě magnetitu a FeSO4 není možné redukovat technecistanový aniont, což je s největší pravděpodobností zapříčiněno menší redukční schopností těchto aditiv, kdy Fe2+ ionty potřebné pro redukci technecistanového aniontu mohou být oxidovány vzdušným kyslíkem obsaženým v pórech bentonitu na Fe3+ ionty.

148

100

výtěžek sorpce (%)

80

bentonit+Fe bentonit+aktiv. uhlí bentonit+Fe3O4 bentonit+FeS bentonit

60

40

20

0 0

2

4

6

8

t (d)

Obr. 3: Kinetika sorpce 99TcO4- na bentontiových směsích z anaerobních podmínek Experimentální podmínky: pevná fáze – bentonit, bentonit + Fe, Fes, Fe3O4, aktivní uhlí; poměr bentonit:modifikátor 10:1 (m/m), kapalná fáze - bentonitová voda, c(99TcO4-) =7,93·10-5 mol/l. Rovnovážná izoterma Popis rovnovážného chování sorpce radionuklidu 99Tc na testovaných bentonitových materiálech za daných experimentálních podmínek byl empiricky popsán sorpční izotermou, vyjadřující rovnovážnou závislost mezi koncentrací stanovovaného prvku v pevné a kapalné fázi.

0,012

q (mmol/g)

0,010 0,008 0,006 0,004 99

c0 = 0,079 - 1,5 mM TcO4 A= 3,4; B = 270

0,002 0,000

0,00

0,05

cL

0,10 99

-

0,15

-

TcO4 (mmol/l)

Obr. 4: Popis rovnovážného sorpčního chování technecistanového aniontu pomocí Langmuirovy izotermy na bentonitové směsi s Fe Jak vyplývá z obr. číslo 4, závislost koncentrace technecistanového aniontu v pevné a kapalné fázi na testovaných bentonitových směsích se zvolenými aditivy je nelineární, nejlépe ji lze popsat Langmuirovou izotermou uvedenou v následující rovnici,

149

q=

K L ⋅ c ⋅ q max 1+ KL ⋅ c

(1)

kde q je koncentrace v pevné fázi (mol/kg), c je koncentrace v kapalné fázi (mol/l), qmax je maximálně dosažitelná kapacita sorbentu za daných podmínek (mol/kg) a KL je rovnovážná konstanta příslušné adiční reakce. Vliv poměru l:s fáze při sorpci radionuklidu 99Tc na bentonitových směsích Vzhledem k tomu, že v geologickém prostředí nacházíme hodnoty poměru l:s fáze V/m << 1ml/g, z těchto důvodů byl při sorpčních experimentech sledován vliv poměru fází na hodnotu distribučního koeficientu. Aby bylo možné měřit koncentraci radionuklidů ve vodné fázi při stanovení pomocí statické dávkové metody s dostatečnou přesností, je nutné, aby nejnižší poměr V/m fáze byl 2 ml/g. Pro získání závislosti distribučního poměru u nižších hodnot poměru l:s fáze, lze využít distribuční koeficienty stanovené při difúzních experimentech, kde lze sledovat poměry l:s fáze < 1 ml/g, poté je možno ze získané lineární závislosti extrapolovat naměřená data na podmínky odlišné od experimentu. Ačkoli by distribuční koeficient podle rozdělovacího zákona neměl být ovlivněn poměrem fází, v praxi se sorpční a desorpční koeficienty mohou s poměrem fází měnit. Ze stanovených hodnot distribučních koeficientů pro různé poměry l:s fáze, kde v případě bentonitových směsích se zvolenými aditivy byl zachován optimální poměr bentonit:modifikátor 10:1, je zřejmé, že hodnoty distribučního koeficientu za daných podmínek závisí lineárně na logaritmu poměru fází. A)

2,5

B)

550 2,0 500

KD (ml/g)

KD (ml/g)

1,5

1,0

450

400

350 0,5 300 0,0 1

10

poměr fází (ml/g)

100

1

10

100

poměr fází (ml/g)

Obr. 5: Vliv poměru fází na hodnotu KD pro 99Tc na bentonitových směsí A)bentonit, B) bentonitová směs s aktivním uhlí; poměr bentonit:aktivní uhlí 10:1 Ilustrativní závislosti pro sorpci radionuklidu 99Tc na bentonitu a bentonitové směsi s aktivním uhlí jsou uvedeny na obr. 5, obdobné závislosti byly získány i pro ostatní sledované bentonitové směsi. Pokles hodnot distribučních koeficientů s klesajícím poměrem fází je s největší pravděpodobností způsoben omezeným přístupem radionuklidu 99Tc k pevné fázi, na které dochází k záchytu radionuklidu. Vliv teploty reakční směsi při sorpci radionuklidu 99Tc na bentontiovém materiálu Na obr. 6 je znázorněn vliv teploty reakční směsi na průběh kinetiky sorpce technecistanového aniontu u jednotlivých testovaných bentonitových směsí. Vzhledem

150

k tomu, že v reálném prostředí hlubinného úložiště bude teplota inženýrské bariery vyšší než 20°C, byl sledován vliv různých hodnot teploty reakční směsi na průběh sorpčního chování technecistanového aniontu na testovaných bentonitových materiálech (viz. obr. 6). Provedenými experimenty bylo zjištěno, že rozdílné teploty reakční směsi (20 – 60°C) pohybující se v rozmezí předpokládaných teplot v inženýrské bariéře17, výrazně neovlivní průběh kinetiky sorpce a změnu oxidačního stavu jednotlivých specií technecia, což potvrzují i téměř shodné hodnoty distribučních koeficientů (tab. II), které se u jednotlivých bentonitových směsích od sebe výrazně neodlišují. Tab. II: Rovnovážné hodnoty distribučních koeficientů při sorpci technecistanového aniontu na bentonitových směsích při různých teplotách reakční směsi Experimentální podmínky – kapalná fáze: bentonitová voda (V = 7ml) značeno 99Tc; c = 0,079 mmol/l, pevná fáze: bentonit R (m = 0,7 g) + modifikátory: Fe, FeS, aktivní uhlí (m = 0,07 g), teplota reakční směsi: 20 ± 2 °C, 40 ± 0,5 °C a 60 ± 0,5 °C 20 ± 2 °C KD (ml/g) 0,9 ± 0,2 450 ± 20 4500 ± 50 1280 ± 40

Pevná fáze Bentonit Bentonit+ aktiv. uhlí Bentonit + Fe Bentonit + FeS 20

bentonit

18

b en ton it + ak tiv ní uh lí

100 90

o

40 C

14

o

výtěžek sorpce (%)

60 C

12 10 8 6 4

80 70 60 o

20 C

50

o

40 C

2 0

60 ± 0,5 °C KD (ml/g) 1,1 ± 0,4 320 ± 40 3370 ± 50 1300 ± 70

o

20 C

16

výtěžek sorpce (%)

40,0 ± 0,5 °C KD (ml/g) 1,2 ± 0,3 405 ± 35 4120 ± 45 1420 ± 60

o

60 C

40

0

2

4

6

8

0

2

4

t (d)

6

8

t (d)

be nt o n it + Fe S 100

100

bentonit + Fe

90 80

výtěžek sorpce (%)

výtěžek sorpce (%)

90 80 70 60 o

50

20 C

70 60 50 o

40

20 C o

o

40 C

40 30

30

o

60 C

20 0

2

4

t (d)

6

40 C

8

o

60 C 0

2

4

6

8

t (d)

Obr. 6: Vliv teploty reakční směsi při sorpci technecistanového aniontu na bentonitových směsích Experimentální podmínky – kapalná fáze: bentonitová voda (V = 7ml) značeno 99Tc; c = 0,079 mmol/l, pevná fáze: bentonit R (m = 0,7 g) + modifikátory: Fe, FeS, aktivní uhlí (m = 0,07 g), teplota reakční směsi: 20°C, 40°C a 60°C

151

ZÁVĚR Výsledky provedených experimentů zabývajících se studiem vlivu důležitých parametrů ovlivňujících průběh sorpčního chování radionuklidu 99Tc na bentonitu ukázaly, že složení vodného výluhu má výrazný vliv na průběh sorpčního chování radionuklidu 99Tc. Vzhledem k tomu, že experimenty byly prováděny za anaerobních podmínek (O2<0,5%), po přídavku modifikované bentonitové vody vykazující redukční podmínky Eh ~ -150 mV k bentonitu dochází vlivem přítomnosti oxidujících látek v bentonitové směsi (s největší pravděpodobností z důvodu vzdušného O2 obsaženého v pórech bentonitu) k téměř okamžité oxidaci Fe2+ iontů na Fe3+ ionty za přítomnosti oxidačních podmínek v systému Eh ~ 150 mV. Z těchto důvodů nebylo možné redukovat technecistanový aniont do nižšího oxidačního stavu Tc(IV) za vzniku málo rozpustných oxo- a hydroxo- sloučenin technecia. Vzhledem k nízkým hodnotám aniontově výměnné kapacity bentonitu je záchyt technecistanového aniontu minimální, což potvrzují hodnoty výtěžků sorpce radionuklidu 99 Tc nižší než 10 %, pro docílení záchytu technecistanového aniontu na bentonitovém materiálu lze využít vhodná aditiva. Výsledky provedených experimentů ukázaly, že mezi vhodná aditiva umožňující záchyt technecistanového aniontu s výtěžky sorpce převyšujícími hranici 95 % lze zařadit aktivní uhlí, Fe, FeS, z důvodu rozdílné povahy testovaných aditiv imobilizace technecistanového aniontu probíhá různými mechanismy. V případě aktivního uhlí je řídícím mechanismem fyzikální sorpce, chemická sorpce probíhá u aditiv vyskytujících se v rozdílných oxidačních stavech Fe (Fe, FeS), kde dochází k redukci technecistanového aniontu do oxidačního stavu Tc(IV). Mezi další parametry ovlivňující průběh sorpce radionuklidu 99Tc na bentonitu lze na základě provedených experimentů zařadit vliv poměru l:s fáze a teploty reakční směsi, tyto parametry nemají výrazný vliv na průběh sorpčního chování radionuklidu 99Tc na bentonitovém materiálu. Tato práce vznikla za finanční podpory MŠMT ČR č. projektu MSM 6046137307. LITERATURA [1]

Lieser K. H., Bauscher Ch.: Radiochim. Acta, 1987, 42, 205.

[2]

Chen F., Burns P. C., Eing R. C.: J. Nucl. Chem., 2000, 278, 225.

[3]

L. Liang, B. Gu, X. Yin: Sep. Tehnol., 1996, 6, 111.

[4]

Allen P. G., Siemerin G. S., Shuh D. K., Buher J. J., Edelstein N. M., Langton C. A., Clark S. B., Reich T., Denecke M. A.: Radiochim. Acta, 1997, 76, 77.

[5]

Kunze S., Neck V., Gompper K., Fanghänel Th.: Radiochim. Acta, 1996, 74, 159.

[6]

Toulhoat P.: C. R. Physique, 2002, 3, 975.

[7]

Wersin P.: J. Contam. Hydrolog., 2003, 61, 405.

[8]

Vinšová H., Večerník P., Jedináková-Křížová V.: Determination of low β-activity of 99technetium in bentonite leachate, LiquiScint 2004, Praha, Česká Republika, 17. - 19.5. 2004, plný text publikován ve sborníku na CD.

[9]

Vinšová H., Večerník P., Jedináková-Křížová V.: Sorption characteristics of 99Tc on bentonite material with different additives under anaerobic conditions, Radiochimica Acta, v tisku 2005.

152

[10] Wikberg P.: Radionuclide sorption Saf. Eval. Perspect., Proc. NEA, Workshop 217, 2002. [11] Vinšová H., Konířová R., Koudelková M., Jedináková-Křížová V.: J. Radioanal. Nucl. Chem., 2004, 261, 407. [12] Holm E., Gäfvert T., Lindahl P., Roos P.: Appl. Rad. Isotop., 2000, 53, 153. [13] Gu B., Dowlen K. E., Liamg L., Clausen J. L.: Sep. Technol., 1996, 6, 123. [14] Shen D., Fan X. H., Gu X. G., Zeng J. S., Dong Y.: J. Radioanal. Nucl. Chem., 2002, 254, 137. [15] Cui D., Eriksen T. E.: Environ. Sci. Technol., 1996, 30, 2259. [16] Wharton M. J., Atkins B., Charnock J. M., Livens F. R., Pattrick R. A. D., Collinson D.: Appl. Geochem., 2000, 15, 347. [17] Ageskog L., Jansson P.: Heat propagation in and around the deep repository. Thermal calculations applied to three hypothetical sites: Aberg, Beberg and Ceberg, SKB Technical Report, 1999, 99-02, 1-95. Kontaktní adresa: H. Vinšová, P. Večerník,V. Jedináková-Křížová, Vysoká škola chemicko-technologická, Ústav analytické chemie, Technická 5, 166 28 Praha 6, E-mail: [email protected].

153

Vážení přátelé, další, v pořadí již 17. celostátní seminář o separační chemii a analýze toxických látek se bude konat ve dnech

18. – 20. června 2007. Předpokládáme některé změny ve způsobu přihlašování, které si kladou za cíl zjednodušit celý systém. Především bude odbourána předběžná písemná přihláška, a bude stačit pouze přihláška závazná (její obsah a forma písemného zaslání se nemění). Termín závazné přihlášky bude opět do konce května 2007. Přivítáme však přihlášky v dřívějším datu zejména s ohledem na seznam přednášek. Místo předběžné přihlášky bude zaslána cca v listopadu 2006 elektronicky informace o konání semináře a závazná přihláška s výzvou o zaslání názvů přednášek. V případě potřeby bude zaslání přihlášky opakováno. Seznam přihlášených přednášek pak bude průběžně zveřejňován na webových stránkách institutu na známé adrese www.ioolb.cz. Účastníkům, u kterých neznáme e-mailovou adresu, bude přihláška i nadále zaslána v tištěné formě. Lázně Bohdaneč, 30. července 2005 RNDr. Bedřich Uchytil, CSc. za organizátory

154

Název

Informační zpravodaj č. 1/2005

Vydavatel Odpovědný redaktor Do tisku Stran Náklad Vydání Tisk

Institut ochrany obyvatelstva v Lázních Bohdaneč Jitka Výtvarová září 2005 154 30 první Institut ochrany obyvatelstva v Lázních Bohdaneč

Tato publikace neprošla jazykovou korekturou.

ISBN 80 – 86640 – 44 – 2