Imunofenotypizace leukemií z kostní dřeně, periferní krve, výpotku a mozkomíšního moku průtokovou cytometrií
1) Použití validovaných kitů od výrobce – značka CE/IVD 2) Home‐made metoda s vlastní (laboratoří provedenou) validací 3) Metoda publikována v mezinárodním impaktovaném časopise, kde prošla recenzním řízením
Panely kombinující protilátky pro detekci povrchových a intra znaků definujících příslušnost k buněčné linii (B, T, myelo, erythro), stadiu diferenciace apod.
Interní kontrola kvality 1) Kontrola přístrojů 2) Verifikace metody – Reprodukovatelnost? Opakovatelnost? Nejistota měření? Externí kontrola kvality Česká … mezilaboratorní porovnání Mezinárodní … UK NEQAS iBFM EuroFlow
„Nezávislou verifikací musí laboratoř potvrdit, prostřednictvím získání objektivního důkazu (ve formě výkonnostních charakteristik), že požadavky na výkonnost u daného postupu laboratorního vyšetření byly splněny. Požadavky na výkonnost, které se potvrzují procesem verifikace, musí být takové, které odpovídají zamýšlenému použití výsledků laboratorního vyšetření.“
Celková analytická chyba, velikost odchylky (bias), … v cytometrii??? 1) Dlouhodobá přesnost měření v laboratoři, získávanou v procesu vnitřní kontroly kvality – hodnoceno v rámci verifikací (CV a SD u metod s dostupným referenčním materiálem, kdy hodnotíme jednotlivé antigeny zvlášť) 2) Dlouhodobá přesnost měření získávaná v procesu externí kontroly kvality 3) Stabilita přístroje – sledování CV pro jednotlivé kanály (Rainbow Beads)? 4) Specifičnost? 5) Požadavek na minimalizaci ztrát buněk v průběhu přípravy vzorku?
Metodické pokyny Sekce laboratorní imunologie ČSAKI: http://www.sli‐csaki.cz/metodicke‐pokyny/ ‐ Praktické provádění validace a verifikace metod ‐ Doporučení pro určení odhadů nejistot výsledků měření v laboratoři ‐ Doporučení k aplikaci “in‐house” metod v imunologických laboratořích
Pravidelná údržba cytometrů ‐ servis, promývání Denní kontrola správné činnosti cytometrů CST Beads … laser delay, linear range, optical background, … Rainbow Beads … standardizace MFI, definovat přijatelnou mez detekce, standardizace mezi různými cytometry
datum start měření konec měření 22.9.2014 08:00:00 dop. 04:30:00 odp.
Kontrola kompenzací
B‐530/30‐A B‐575/26‐A B‐610/20‐A B‐695/40‐A V‐450/50‐A CV CV CV CV CV 2,8 2,4 2,7 3,9 4,9
CD1a CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD10
CD24 CD33 CD34 CD38 CD45 CD56 CD58 CD64
CD11b CD13 CD14 CD15 CD16 CD19 CD20 CD22
CD66c CD81 CD117 HLA‐DR Kappa Lambda NG2 TCRab/gd
IVD kit? IVD protilátky?
intra TdT intra MPO intra CD3 intra CD79a, ……………
IMMUNO‐TROL cells IVD … CD2, 3, 4, 5, 8, 19, 45, 3‐56+ not IVD … CD7, 10, 13, 14, 22, 33, , , HLA‐DR CD‐Chex Plus
% pozitivity SD
Cílové hodnoty uvedené výrobcem: CD3+ CD4+ CD8+ CD19+ CD3-56+ 76 47 26 11,9 12,2 10 6 6 5 5
IVD … CD2, 3, 4, 5, 8, 19, 20, 45, 3‐16+56+, HLA‐DR not IVD … CD7, 10, 11b, 11c, 13, 15, 22, 23, 33, 38, , ... CD117, 25, 71 … CD34 Stabilizovaný vzorek leukemie UK NEQAS … B, T …
Rozsáhlé panely znaků (protilátek a fluorochromů) FITC 4/8/3/7/45 CD4 FITC DR GATE KOMBI HLA‐DR FITC 99/7/5/3/45 CD99 FITC KORSA/56/19/45 KORSA 3544 FITC 20/10/19/34/45/SYTO 41/38 CD20 FITC 15/117/34/33/45/7 CD15 FITC 34/iLYSOZYM/45/33/14/11c CD34 FITC iTDT/7/3/i3/45 iTDT FITC iMPO/i79a/i3/45/7/19 iMPO FITC 11b/45/7/19/i22
BD IM BD IM BD BD IM DAKO IM
PE CD8 PE CD14 PE CD7 PE CD56 PE CD10 PE CD117 PE iLYSOZYM PE CD7 PE iCD79a PE CD11b PE
IM EX IM BD DAKO IM ADG IM DAKO BD
PerCP CD3 PC5 CD45 PerCP CD45 PerCP CD45 PerCP CD45 PerCP CD45 PerCP CD11c PerCp CY5.5 CD45 PerCP CD45 PerCP CD45 PerCP
IM EX EX EX EX EX BD EX EX EX
ECD CD7 ECD CD4 ECD
IM IM
PC7
CD7 ECD
IM
mCD7 ECD IM CD7 ECD IM
CD3 PC7 CD5 PC7 CD19 PC7 CD19 PC7 CD34 PC7 CD33 PC7 CD3 PC7 CD19 PC7 CD19 PC7
IM IM IM IM IM IM IM IM IM
APC CD45 APC CD8 APC CD3 APC
BD EX IM
CD34 APC CD33 APC CD14 APC iCD3 APC iCD3 APC iCD22 APC
IM IM BD IM IM BD
A700
PB
CD38 A700
EX SYTO 41 INV
Vybrat protilátky, které reportujeme na výsledkovém listě. CD45 PerCP KORSA 3544 FITC CD20 FITC CD34 APC CD15 FITC CD117 PE
n=45
Měsíční testování na referenčním materiálu, zdravé PK, zdravé KD
PO
CD45 PO
EX
Reprodukovatelnost
Testovaný znak CD4 FITC CD8 PE HLA‐DR FITC CD14 PE CD7 PE CD5 PC7 šarže refer.materiálu
říjen 44,9 29,5 20,1 77,7 75,8 70,5
cílové hodnoty uvedené výrobcem 46±5 27±7 19±6 77±20 73±18 73±12
listopad 47,5 28,2 22,6 77,5 78,7 73,1
7587045
cílové hodnoty uvedené výrobcem 49±5 27±7 20±6 82±20 77±18 75±12 7587047
prosinec 47,5 28,2 21,9 77,5 78,7 73,6
cílové hodnoty uvedené výrobcem 49±5 27±7 20±6 82±20 77±18 75±12 7587047
+ šarže protilátek kontrola návaznosti různých šarží Testovaný znak Na čem? Lymfo Mono Granulo % pozitivní/negativní KORSA 3544 FITC krev G 88,8 pozitivní CD20 FITC krev L 5,4 pozitivní CD34 APC dřeň L 34,4 pozitivní CD15 FITC krev G 99,9 pozitivní CD117 PE dřeň L 3,8 pozitivní
Nejistotu měření nestanovujeme
MFI 2408 18697 3243 1.3e5 2102
% pozitivní/negativní MFI 90,9 pozitivní 2309 8,2 pozitivní 18370 32,1 pozitivní 3075 99,4 pozitivní 1.31e5 2,4 pozitivní 2234
% pozitivní/negativní MFI 91 pozitivní 2336 4,83 pozitivní 18370 36,8 pozitivní 3381 99,2 pozitivní 1.33e5 6,8 pozitivní 1969
UK NEQAS …. stabilizovaný vzorek leukemie (diagnoza + minimal residual disease) dg, vybrat antigeny pro detekci zbytkové nemoci, % leukemických blastů
Léčebná skupina iBFM … mezilaboratorní porovnání diagnostického vzorku UK NEQAS % pozitivity jednotlivých znaků vybraných podle iBFM SOP EuroFlow QA Quality assessment program for EuroFlow protocols: Summary results of four‐year (2010‐2013) quality assurance rounds. Kalina T, et al. (Cytometry A, 2015 Feb;87(2):145‐56) Monitoruje celý cytometrický proces : nastavení cytometru, příprava vzorku, nahrávání, analýza.
PRIMÁRNÍ VERIFIKACE REAGENCIÍ … nově v normě ISO 15189 Kontrola reagencií probíhá při prvním měření vzorku danou reagencií. Reagencie jsou monitorovány, včetně šarže, doby expirace, data otevření a data vypotřebování. SPRÁVNĚ TITROVAT zejména na vhodném materiálu DOBŘE A PRAVIDELNĚ KOMPENZOVAT CD19 PerCP x general (PE) SLEDOVAT DOBU EXPIRACE Jak zacházet s protilátkami, které mají po době expirace?
NIS LIS Databáze … nutná validace výrobcem … nově v normě ISO 15189 Analyzační software (Diva, FlowJo, …) Vzorek (referenční materiál) několikrát analyzován stejnou gejtovací strategií … porovnání dat. Softwary nebo tabulky pro automatické přepočty př. Stanovení absolutního počtu buněk ‐ z WBC ‐ podle referenčních kuliček versus kalkulačka 13:30 workshop Synchronizační software kontrola přenosu a celistvosti dat
http://en.wikipedia.org/wiki/Phrases_from_The_Hitchhiker%27s_Guide_to_the_Galaxy #Don.27t_Panic
Poděkování Hana Feixová zástupce manažera kvality CLIPu kolegové z CLIPu: Daniel Thürner Martina Šmídková Pavla Luknárová Pavel Semerák http://clip.lf2.cuni.cz
13:30 workshop workshop „Klinická cytometrie“ kontrola kvality, problémy v cytometrických vyšetřeních http://www.csac.cz/cs‐konference‐seminare‐konferenceCSAC.html
