Imobilizace pokus o přehled v oblasti enzymů a buněk

Imobilizace – pokus o přehled v oblasti enzymů a buněk Zita Purkrtová květen 2012

1

Imobilizace kvasinek do alginátového gelu

suspenze alginát + kvasinky

roztok CaCl2

imobilizované kvasinky v alginátu

4

5

6

7

4

3

8

3

2

9

2

1

11

5

6

7 8 9

1

10

2

Osnova semináře

Úvod

Imobilizace enzymů (proteinů)

Definice pojmu Základní otázky Přehled metod Příklady aplikací

Imobilizace buněk

Přehled metod Příklady aplikací

3

Co je to imobilizace ? Imobilizace (v biotechnologiích) – definice dle IUPAC Techniky používané pro fyzikální nebo chemickou fixaci buněk, organel, enzymů nebo jiných proteinů (např. monoklonálních protilátek) na pevný povrch nebo zadržených membránou za účelem zvýšení jejich stability a umožnění jejich opakovaného nebo kontinuálního používání. Tento princip je také používán pro afinitní chromatografii. 1992, 64, 157

Imobilizované enzymy (Jose M. Guisan) Enzymy, které jsou fyzikálně omezeny nebo lokalizovány v určité definované oblasti prostoru za současného zachování jejich katalytické aktivity a které mohou být používány opakovaně nebo kontinuálně.

4

Základní otázky imobilizace

Co ?

Důvod ?

opakované či kontinuální použití vylepšení/optimalizace katalytických vlastností nízká stabilita (multimerní enzymy) inhibice vysokou koncentrací substrátu nebo produktu nízká aktivita a selektivita vzhledem k nepřirozeným substrátům a pod nekonvenčními podmínkami Pozor ! ne vždy vede k cíli jednoduchá cesta a ne vždy je cíl stejný (např. zachování konformační flexibility x potlačení konformační flexibility)

Možné problémy

využití v biotechnologických procesech katalyzátor – průmysl (potravinářský, analytický, organická syntéza, biotechnologie) biosensor – diagnostika (imobilizace na magnetické částice; imobilizace na skleněné elektrody) bioafinitní chromatografie – průmysl, laboratorní techniky podávání léčiv – terapuetické účely (farmacie)

Proč ?

buňky (organely) enzymy (proteiny) ostatní biomakromolekuly (protilátky, DNA próby)

chemická modifikace, fyzikální modifikace, stérické zábrany

Jak ? 5

Obecný princip imobilizace I Imobilizace Nosič (povrchové skupiny)

Aktivace (modifikace nosiče/vytvoření vhodné povrchové skupiny)

Reakce s imobilizovaným proteinem/enzymem

Enzym je vázán na povrch

Enkapsulace/zachycení

Nosič

Aktivace neprobíhá

Reakce s proteinem/enzymem

Enzym je vázán uvnitř uzavřeného prostoru

enzym (rozpustný x nerozpustný protein) enzymová reakce probíhá ve vodném prostředí (kapalině) ⇒ vybrat nosič a metodu Imobilizace enzymů 6

Obecný princip imobilizace II carrier; support; matrix

nosič

cross-linking agent; bifunctional agent; carrier activator

raménko spojující protein s matricí → otázka jeho délky

modifikační činidlo

aktivovaný nosič raménko nutno zjistit empiricky; řada přístupů 7

Guisan,J.M.:Immobilization of enzymes and cells, Humana Press,2006.

Cíl: imobilizovat protein/buňky/organely bez ztráty aktivity

Nosiče

Vlastnosti ideálního nosiče:

stabilita (chemická i fyzikální)

velký (aktivní) povrch biokompatibilita (toxikologická nezávadnost) odolnost vůči mikrobiální kontaminaci finanční dostupnost

Fyzikální vlastnosti/charakterizace:

⇒ matrice nesmí působit jako denaturační činidlo

obecné:

průměr částice (mean particle diameter) schopnost absorbovat vodu (swelling behavior) mechanická odolnost

pórovitý materiál:

fyzikální odolnost vůči tlaku hydrofilní charakter x nerozpustnost ve vodě inertnost vůči enzymu (žádné nespecifické interakce s enzymem) tepelná odolnost

velikost pórů velikost částic

Poznámka: propojenost s výběrem reaktoru (reaktor s mícháním, průtokový či vsádkový reaktor)

Imobilizace enzymů 8

Klasifikace nosičů I

nosič, matrice (solid-phase support, carrier, matrix) porézní nosiče x nepórézní nosiče pórézní materiály mají větší plochu ⇒ větší kapacita vazby enzymu a větší ochrana enzymu před prostředím kontrolovaná velikost a distribuce pórů → optimalizace kapacity a průtokových vlastností systému organické nosiče x anorganické nosiče anorganické nosiče - vysoká stabilita vůči fyzikálním, chemickým a mikrobiálním vlivům

9

Klasifikace nosičů II

organické x anorganické

Anorganické nosiče přírodní minerály: bentonit; SiO2 syntetické materiály: sklo (neporézní a kontrolovaně porézní); kovy; oxidy kovů s kontrolovanou velikostí pórů Organické nosiče přírodní polymery

polysacharidy: celulóza; dextran; agar; agaróza; chitin; alginát proteiny: kolagen; albumin aktivní uhlí

syntetické polymery

polystyren polypropylen ostatní polymery: polyakrylát; polymetylakryláty; polyakrylamid; polyamidy; vinyl a allyl-polymery


Nosiče I - polysacharidy

Agaróza (1→ 4)-3,6-anhydro-α-L-galactopyranosyl-(1→ 3)-β-D-galactopyranan )

široké použití; nevýhodou je cena; komerční názvy (Sepharose) vysoká porozita ⇒ vysoká kapacita pro proteiny hydrofilní charakter usnadnění derivatizace absence nabitých skupin (tedy prevence nespecifické adsorpce substrátu a produktů)


Nosiče II - polysacharidy

dextran α-1,4-glukóza a α-1,6-glukóza

celulóza β – 1,4 –D-glukóza

alginát 1,4 – α-L-guluronic acid + 1, 4 – β –D- mannuronic acid


Nosiče III – syntetické polymery

polypropylen polystyren

vinyl allyl


Metody imobilizace I

dělení dle způsobu provedení: nahodilé x orientované

vratné x nevratné

nevratné imobilizace = po navázání nemůže být protein/buňka uvolněn/a aniž by byla zničena jeho biologická funkce nebo nosič vratné imobilizace = reverzibilně vázané enzymy/buňky mohou být uvolněny z matrice za mírných podmínek beze ztráty aktivity či zničení matrice

využití různých druhů interakcí mezi proteinem a nosičem:

nekovalentní:

pokud enzym ztratí aktivitu, nosič může být znovu použit

hydrofobní iontové vodíkové můstky

kovalentní

dva protichůdné faktory:

stabilita vratnost


Metody imobilizace – přehled I Nevratné metody kovalentní vazba

covalent binding = covalent coupling

entrapment

zachycení

enkapsulace

prokřížení

encapsulation

cross linking

15


Metody imobilizace – přehled II

Vratné metody Guisan,J.M.:Immobilization of enzymes and cells, Humana Press,2006.

adsorpce iontová vazba

afinitní vazba

vazba pomocí kovu

vazba pomocí disulfidového můstku


loschmidt.chemi.muni.cz/peg/lecture/biocat_lecture10.pdf

Metody imobilizace enzymů – alternativní dělení

17

Imobilizace enzymů

Enzymy – přirozené biokatalyzátory

výhody pro biotechnologický proces: specifita (schopnost „výběru substrátu“ ve směsi); mírné podmínky reakce; rychlost nevýhody pro biotechnologický proces: rozpustnost; nestabilita; možnost inhibice substrátem nebo produktem; fyziologické (tj. většinou mírné) podmínky reakce; přísná substrátová specifita (přirozený x nepřirozený substrát) ⇒ modifikace enzymů před jejich použitím v procesu:

úprava/změna vlastností enzymů pomocí technik molekulární biologie úprava/změna vlastností enzymů skrze imobilizace a post-imobilizační techniky

Cíl: získání enzymového preparátu s dostatečnou aktivitou a selektivitou a stabilitou pro daný proces

v průmyslu hraje samozřejmě velkou roli ekonomické hledisko – kolik bude stát imobilizace x za kolik bude možno prodat výsledný produkt nutno brát ohled na podmínky reakce (přítomnost kofaktoru, odebírání produktů atd.) → volba reaktoru a navržení technologického procesu 18

Technologické vlastnosti imobilizovaných enzymových systémů Výhody

Nevýhody

Opakované použití

Možné snížení aktivity

Snadnější provoz reaktoru

Limity způsobené difůzí

Snadnější separace produktu

Dodatečné náklady (proces imobilizace)

Rozšíření možnosti ve výběru reaktoru


Historická období vývoje imobilizace (enzymů)

1. období od roku 1815 – empirické použití imobilizovaných buněk v biotechnologických procesech (např. výroba kyseliny octové; čištění odpadních vod) 2. období 60. léta 20. století - imobilizace enzymů (produkce L-aminokyselin; izomerace glukózy) první imobilizovaný enzym použitý v průmyslu: aminoacylasa z Aspergillus oryzae pro rozlišení racemické směsi D- a Laminokyselin 3. období od roku 1985 – imobilizace enzymových komplexů včetně regenerace kofaktoru a imobilizace celých buněk (např. produkce Laminokyselin z keto-kyselin v membránových reaktorech) Imobilizace enzymů 20

Hlavní produkty získávané pomocí imobilizovaných enzymů Enzym

Produkt

Glukosaisomerasa

Kukuřičný sirup s vysokým obsahem fruktosy

Amidasa N-acylaminokyseliny

Aminokyseliny

Penicilin amidohydrolasa

Peniciliny

Nitril hydrolyasa

Akrylamid

β-galaktosidasa

Hydrolyzovaná syrovátka (laktosa)

■ největší skupiny látek produkované pomocí imobilizovaných enzymů: cukry, aminokyseliny, léčiva


Zlepšení vlastností imobilizovaných enzymů skrze imobilizační techniky I

Stabilizace enzymů „nahodilou“ imobilizací

Stabilizace enzymů kovalentní (orientovanou) imobilizací

kovalentní imobilizace nebo silná fyzikální adsorpce enzymů na vnitřní povrch pórovitého nosiče nemožnost intramolekulárních procesů (např. autolýza, proteolýza, agregace) interakce enzymu s pórovitým povrchem zabraňuje nežádoucím interakcím s velkými hydrofobními povrchy (např. vzduch/kyslíkové bubliny, nemísitelná org. rozpouštědla) rozhodující je počet částí (skupin) enzymů kovalentně vázaných na nosič ⇒ imobilizace „one-point“ a „multipoint“ kovalentní imobilizace enzymů na aktivovaný nosič pomocí velmi krátkých ramének (spacer arms) a skrze řadu zbytků na enzymovém povrchu může vést k dramatické stabilizaci 3D struktury enzymu mnohonásobná imobilizace vede k zabránění konformačních změn v důsledku změny pH, tepla, organických rozpouštědel atd.

Stabilizace multimerních enzymových jednotek pomocí „multisubunit“ imobilizace

prevence disociace podjednotek – zachování kvartérní struktury


Zlepšení vlastností imobilizovaných enzymů skrze imobilizační techniky II

Vznik velmi hydrofilního mikroprostředí obklopujícího každou molekulu imobilizovaného enzymu

Modulace enantio-selektivity (lipas) Redukce inhibice Hyper-aktivace (lipas)

ko-imobilizace enzymů a vysokomolekulárních hydrofilních polymerů o vysoké koncentraci toto mikroprostředí může vést k rozdělovacímu efektu na základě hydrofobicity (polarity) látek (ko-rozpouštědel, substrátů, produktů) mezi mikroprostředí a okolní kapalinu

dochází k ní pomocí selektivní adsorpce na hydrofobní povrchy ze velmi nízké iontové síly – dochází k stabilizaci „otevřené struktury“ lipas (aktivace směrem k malým a hydrofobním substrátům)

Chemické a fyzikální modifikace imobilizovaných enzymů

snadná modifikace pomocí chem. reakce (ukončení reakce oddělením imobilizovaného enzymu či reaktantů – např. zablokování skupin, takže nedochází k intermolekulovým chemickým modifikacím ⇒ ani agregace) příklady možných modifikací: připojení hydrofobních skupin; fyzikální adheze hyperhydrofilních polymerů; chemické prokřížení zbytků na povrchu


Metody imobilizace - přehled Nevratné metody kovalentní vazba

covalent binding = covalent coupling


zachycení

enkapsulace

prokřížení

24

Kovalentní vazba I

Metody kovalentního propojení enzymu a nosiče

výhoda: enzym není po reakci uvolněn do roztoku široká škála reakcí závislá od funkční skupiny přístupné na matrici nutná aktivace nosiče dvě skupiny „coupling methods“: A) aktivace matrice pomocí adice reakční skupiny k matrici B) aktivace matrice v důsledku modifikace její funkční skupiny, modifikace vede ke vzniku aktivované skupiny přímo v řetězci polymeru aktivace většinou vede k vytvoření elektrofilní skupiny na polymeru, která následně reaguje se silným nukleofilem v imobilizovaném proteinu pro následnou reakci aktivované skupiny matrice s enzymem se nejčastěji využívá těchto skupin v proteinech: lysin (ε−amino skupina); cystein (thiolová skupina); asparágová a glutamová kyselina (karboxylová skupina) reaktivita skupiny v postranním řetězci proteinu je určena stavem protonizace (⇒ vliv pH) a sleduje následující zákonitost:

S- > SH > O- > NH2 > COO- > OH > NH3


Garrett, Grisham: Biochemistry, SAunders College Publishing, 1995.

Vliv pH na vznik kovalentní vazby nosičprotein

26

Kovalentní vazba II A) aktivace matrice pomocí adice reakční skupiny k polymeru Aktivační metoda (činidlo)

Skupina (z imobilizovaného proteinu) , která reaguje s aktivovanou matricí

CNBr

amin

Glutaraldehyd

amin

Karbodiimid

amin

Bisoxirany (Epoxidy)

thiol, amin

Epichlorohydrin

thiol, amin

Glycidol-glyoxyl

amin

Tresylchlorid; Sulfonylchlorid

thiol, aminy

N-hydroxy-succinimidyl

amin


Kovalentní vazba III B) aktivace matrice v důsledku modifikace polymeru (jeho funkční skupiny) Polymer

Reagující skupina polymeru

Činidlo

Vznikající aktivovaná skupina polymeru

Skupina (z imobilizovaného proteinu),která reaguje s aktivovanou skupinou

Celulóza; Agaróza

diol

IO4−/IO65−

aldehyd

amin

Polyakrylamid

amid

hydrazin

hydrazid

amin

Polyakrylamid

amid

kyselé pH karboxylová kyselina

amin

Polyester

ester

kyselé pH karboxylová kyselina + alkohol

amin

Polyethylen; Polystyrene

CH2

HNO3

karboxylová kyselina; aromatický kruh substituovaný dusíkem

amin; histidin, tyrosin

Nylon

amid

hydrazin

hydrazid

amin


Kovalentní vazba IV ■ aktivace matrice pomocí CNBr


Kovalentní vazba V ■ aktivace matrice pomocí karbodiimidu


Kovalentní vazba VI ■ aktivace skla pomocí 3-aminopropyltriethoxysilan


Kovalentní vazba – použití glutaraldehydu

jedna z nejpoužívanějších metod 2 cesty: glutaraldehyd je použit pro aktivaci nosiče

nosič je aktivován amino skupinami, které jsou použity pro vazbu enzymu; již imobilizovaný enzym je ošetřen glutaraldehydem → prokřížení enzymu a nosiče



Kovalentní vazba – aktivace epoxy skupinou-I

epoxy skupina může reagovat s různými nukleofilními skupinami na povrchu proteinu za vzniku velmi pevných vazeb (sekundární amino, ether nebo thioeter skupina) děj imobilizace probíhá ve dvou krocích: hydrofobní adsorpce enzymu na povrch nosiče za vysoké iontové síly – rychlý proces „intermolekulová“ kovalentní reakce mezi absorbovaným proteinem a epoxy skupinou povrchu – pomalý proces Guisan,J.M.:Immobilization of enzymes and cells, Humana Press,2006.

minimální chemické modifikace proteinu (hodnota pKa vzniklé skupiny sekundárního aminu je velmi podobná původní amino skupině) ⇒ vznikají krátká raménka


Kovalentní vazba – aktivace epoxy skupinou-II

další možné kroky: inkubace při alkalickém pH, což vede ke zvýšení počtu kovalentních vazeb ⇒ stabilizace enzymu reakce nezreagovaných skupin nosiče s činidlem ⇒ změna povrchu nosiče ⇒ zamezení nežádoucích hydrofobních interakcí enzym-nosič „multipoint covalent attachment“ ⇒ stabilizace Guisan,J.M.:Immobilization of enzymes and cells, Humana Press,2006.


Kovalentní vazba – aktivace epoxy skupinou-III inovované nosiče s epoxy skupinou multifunkční matrice ⇒ na povrchu nosiče je několik typů skupin, které umožňují fyzikální adsorpci (iontové interakce, adsorpce pomocí kovu) Guisan,J.M.:Immobilization of enzymes and cells, Humana Press,2006.


Metody imobilizace II Nevratné metody kovalentní vazba

entrapment

zachycení

enkapsulace

encapsulation

prokřížení

36


Zachycení (entrapment) a enkapsulace - I

zachycení enzymu do polymerní struktury, která dovolí substrátu a produktům volně procházet, ale enzym zůstane zachycen enzym není vázán k matrici (membráně) ⇒ „volnost“ způsoby zachycení:

gel polymery vlákna mikro-enkapsulace

omezení metody: omezení přenosu hmoty skrze membránu nebo gely zvýšení aktivity (reakce v prostředích, která by jinak inhibovala enzym)

org. rozpouštědla; iontové kapaliny; superkritický CO2


Zachycení (entrapment) a enkapsulace - II

Sol-gel technika enzym je zachycen do matrice SiO2 nosič vzniká kyselou či bazickou hydrolýzou tetraalkoxysilanů ([Si(OR)4]; [RSi(OCH3)3]; [Si(OCH3)4]) dvojnásobná imobilizace –gel je vázán do porézních materiálů (silikáty)

⇒ zvýšení mechanické stability a

enzymové aktivity



Zachycení (entrapment) a enkapsulace - III

Enkapsulace do lipidových částic

lipid-based carriers:

liposomy (jádro je hydrofilní vodný roztok)

lipid microphores/lipospheres (hydrofobní jádro)

vakuola ohraničená mono- či dvojvrstvou fosfolipidů možnost směřování způsob doručení léčivé látky řešení pro:

špatně rozpustné látky látky, jež musí být přesně směrovány

http://www.equidblog.com/uploads/image/Lip osome(1).jpg

⇒

možno enkapsulovat hydrofobní či hydrofilní látku (záleží na vnitřním prostředí)


Metody imobilizace II Nevratné metody kovalentní vazba


zachycení

enkapsulace

prokřížení

cross linking

40

Prokřižování I

molekulová hmotnost nosiče oproti molekulové hmotnosti enzymu je zanedbatelná vyžaduje bisfunkční cross-linking (prokřižovací) činidlo – nejčastěji glutaraldehyd CLEA technologie (cross-linked enzyme aggregates) agregace enzymů pomocí vhodných činidel, která nezpůsobí jejich denaturaci či ztrátu enzymové aktivity (např. soli; organická rozpouštědla; ne-ionogenní polymery) možno propojit s prokřižováním pomocí glutaraldehydu Guisan,J.M.:Immobilization of enzymes and cells, Humana Press,2006.

Lipasa C. rugosa

Lipasa z C. antarctica



Prokřižování II

42

Prokřižování III

možno použít ke stabilizaci multimerních enzymů stabilizace kvartérní struktury použití multifunkčních polymerů (např. polyaldehyd dextran) druhá možnost stabilizace multimerních enzymů: imobilizace jednotlivých podjednotek za zachování prostorové struktury


43

Metody imobilizace III


Adsorpce Iontová vazba

Afinitní vazba

Vazba pomocí kovu Vazba pomocí disulfidového můstku


Adsorpce (nekovalentní interakce) - I

Nespecifická adsorpce

Iontová vazba

enzym k matrici vázán přes solný můstek teoreticky snadné, ale problém najít podmínky při nichž enzym zůstává jak silně vázán, tak plně aktivní možný problém: nabité skupiny matrice x nabité skupiny reaktantů či produktu

Hydrofobní adsorpce

enzym k matrici vázán vodíkovými můstky; van der Waalsovy síly nebo hydrofobní interakce ⇒ proces vazby enzymu na matrici může být vratný a lze jej zvrátit změnou podmínek (např. pH, iontová síla, teplota, polarita rozpouštědla)

entropicky řízený děj možno modulovat hydrofobocitu matrice druhem a počtem substituentů

Afinitní vazba

použití komplementárních biomolekul velmi specifické, ale většinou i velmi drahé (vazba specifického ligandu na nosič)


Hydrofobní adsorpce Hydrofobní adsorpce entropicky řízený děj možno modulovat hydrofobocitu matrice druhem a počtem substituentů nosiče: octadecyl-Sepabeads; butyl-, phenyl- a octyl-Sepharose; octyl-agarose Guisan,J.M.:Immobilization of enzymes and cells, Humana Press,2006.


Adsorpce pomocí iontové vazby - I Iontová vazba enzym k matrici vázán přes solný můstek teoreticky snadné, ale problém najít podmínky při nichž enzym zůstává jak silně vázán, tak plně aktivní možný problém: nabité skupiny matrice x nabité skupiny reaktantů či produktu

Imobilizace pomocí glutaraldehydu



Adsorpce pomocí iontové vazby - II Imobilizace pomocí nabitých polymerů několik možností:

na nosič aktivovaný různými skupinami (např. glyoxyl, amino, epoxy) kovalentně navázán polymer (bez náboje - polyethylenimin; polyalylamin; aldehydaspartátový dextran), který zcela pokrývá povrch polymer možno napojit i na porézní materiál nosič s nábojem (např. karboxymethyl; sulfono; amino) mohou být iontově potaženy polymery s opačným nábojem (např. amino nosič s síran-dextran)

vhodné použít i pro imobilizaci multimerních enzymů Guisan,J.M.:Immobilization of enzymes and cells, Humana Press,2006.


Adsorpce pomocí afinitní vazby - I ■ Afinitní vazba použití komplementárních biomolekul velmi specifické, ale většinou i velmi drahé (vazba specifického ligandu na nosič) dva přístupy:

matrice je aktivovaná vazbou s afinitním ligandem (enzym, který má být imobilizován je přidáván) enzym je konjugovaný k jiné molekule, která má afinitu k matrici (např. fúzní protein; biokonjugát vzniklý prokřížením) Guisan,J.M.:Immobilization of enzymes and cells, Humana Press,2006.



Adsorpce pomocí afinitní vazby - II

50




Afinitní vazba

Vazba pomocí kovu

Vazba pomocí disulfidového můstku


Vazba přes kov (chelatace)

ionty přechodných kovů (titan, zirkonium ) jsou vázány na povrch organické matrice koordinační vazbou s nukleofilní skupinou této matrice matrice není schopna vykrýt všechny koordinační místa kovu ⇒ některá místa zůstanou volná pro vazbu skupin z enzymu eluce kompeticí s rozpustnými ligandy nebo poklesem pH regenerace nosiče promytím roztokem chelatačního činidla (EDTA, EGTA) IMA = Immobilized Metal-Ion Affinity





Afinitní vazba

Vazba pomocí kovu

Vazba pomocí disulfidového můstku


Vazba pomocí disulfidových můstků

matrice a enzym vázány kovalentní vazbou (disulfidový můstek), která ale může být rozbita reakcí s vhodným činidlem (DTT či β-merkaptoethanol) za mírných podmínek reaktivitu thiolové skupiny je možno modelovat změnou pH podmínka: enzym musí obsahovat volnou thiolovou skupinu, která není nutná pro zachování struktury nosič musí také obsahovat volnou thiolovou skupinu (reaktivní disulfid či oxidy disulfidu - thiosulfinátové, thiosulfonátové skupiny) tyto skupiny mohou být vneseny na širokou škálu nosičů s rozdílným stupněm porozity a různými vlastnostmi Guisan,J.M.:Immobilization of enzymes and cells, Humana Press,2006.


Faktory ovlivňující imobilizaci enzymů I

Nosič

povaha nosiče – organický/anorganický nosič hydrofobní/hydrofilní velikost povrchu povrchové napětí a povrchový náboj chemická a mechanická stabilita porozita velikost částic

Faktory spojené s reakčním systémem/reaktorem

reakční prostředí difuze inhibice enzymu precipitace produktu viskozita směsi termodynamika reakce nespecifické interakce rozpouštědlo-nosič


Faktory ovlivňující imobilizaci enzymů II

Enzym

velikost konformační flexibilita vyžadovaná mechanismem isoelektrický bod povrchové funkční skupiny/hustota náboje glykosylace stabilita za podmínek imobilizace přítomnost hydrofobních oblastí přítomnost hydrofilních oblastí aditiva nutná při přípravě enzymu

změna vlastností imobilizovaného enzymu vzhledem k enzymu ve volném roztoku 3 důvody: změna vnitřní aktivity imobilizovaného enzymu vznik mikroprostředí po imobilizaci a následná změna vlastností změna 3D struktury enzymu po vazbě empirické určení


Martinek et al. Biochim Biophys Acta. 1977 Nov 23;485(1):1-12.

Faktory ovlivňující imobilizaci enzymů III

(a) (b) (c) (d)

aktivita volného chymotrypsinu aktivita chymotrypsinu po reakci s akryoyl chloridem (akryoyl chymotrypsin) aktivita akryoyl chymotrypsinu polymerizovaného s polymethylakrylátovým gelem aktivita chymotrypsinu nekovalentně zachyceného v polymethylakrylátovém gelu Všechny reakce prováděny za stejných podmínek. Zvýšení aktivity je v důsledku stabilizace a zabránění autokatalýzy enzymu.


Faktory ovlivňující imobilizaci enzymů IVa

http://www1.lsbu.ac.uk/biology/enztech/imkinetics.html

orientace během imobilizace

58


Faktory ovlivňující imobilizaci enzymů IVb

reakce je katalyzována ko-imobilizovanými enzymy reakce je katalyzována volnými enzymy 59

molekuly enzymu

Faktory ovlivňující imobilizaci enzymů V a) mikroprostředí – roztok v nejbližším okolí imobilizovaného enzymu


makroprostředí (okolní roztok) b) [SR] koncentrace substrátu na povrchu částice (vnější vrtsvě) [Sr] koncentrace substrátu uvnitř částice R, r poloměr (vzdálenost uvnitř) částice S substrát P produkt



Faktory ovlivňující imobilizaci enzymů VIa

Koncentrační gradient je důsledek reakce katalyzované enzymem a difuze iontů

B = pufr



Faktory ovlivňující imobilizaci enzymů VIb Koncentrační gradienty substrátu ([S] a produktu [P]) v okolí částice imobilizovaného enzymu v důsledku: a) reakce a vnitřní difuze v částici b) reakce a vnitřní difuze v částici a rozdělení/segmentace substrátu a produktu v mikroprostředí c) reakce a vnitřní difuze v částici a vnější difuze k povrchu částice d) kombinovaného efektu difuze a rozdělení/segmentace látek v mikroprostředí; vrstva, ve které probíhá difuze je běžně mnohonásobně silnějš než vrtsva, ve které probíhá rozdělení


Faktory ovlivňující imobilizaci enzymů VII

(= pH okolního prostředí)

volný enzym enzym kovalentně vázaný ke kladně nabitému nosiči enzym je vázaný na negativně vázaný nosič


Faktory ovlivňující imobilizaci enzymů VIII

(= pH okolního prostředí)

volný enzym enzym imobilizovaný na hydrofóbní nosič (pokles dielektrické konstanty mikroprostředí sníží disociaci nabitých skupin a zároveň zvýší pKa karboxylových skupin a sníží pKa některých bazických skupin)


Porovnání metod imobilizace enzymů Adsorpce

Kovalentní vazba

Zachycení

Enkapsulace

Příprava

jednoduchá

složitá

složitá

jednoduchá

Náklady

nízké

vysoké

střední

vysoké

Vazebná síla

liší se

silná

slabá

silná

Uvolnění enzymu

ano

ne

ano

ne

Uplatnitelnost

široká

selektivní

široká

velmi široká

Vliv matrice

ano

ano

ano

ne

Zábrany pro difúzi

ne

ne

Ochrana před MO

ne

ne

ano ano

ano ano


Microarrays – aplikace imobilizace

na pevný nosič (sklo; SiO2; plast) imobilizován protein či oligonukleotid inkubace se vzorkem – interakce pouze mezi partnery, kteří jsou schopni vytvořit vazbu na základě komplementarity (DNA) či specifity (protein) ⇒ velmi selektivní a citlivá metoda umožňující rychlý screening velkého počtu vzorků použití: medicína; molekulární biologie; proteomika

http://www.bioscience.org/2002/v7/c/stoll/figures.htm

66

Imobilizace buněk

používá se v průmyslu a medicíně

řada výhod:

fermentační procesy, katalýzy biotechnologie s ekologickým aspektem (degradace) podávání léčivých látek vysoká koncentrace buněk opakované použití buněk bez obnovy (ekonomické hledisko) vyřešení problému vymývání buněk v průtokových reaktorech možno použít vysokou rychlost přítoku a vysokou koncentraci buněk ⇒ vysoká produktivita vytvoření příznivého mikro-prostředí pro buňky (tj. pH gradient, gradient živinproduktů; mezibuněčný kontakt) ⇒ lepší biokatalýza (vyšší výtěžky, rychlost růstu a vznik produktů) zvýšení genetické stability ochrana proti střižnému poškození

problémy a možné komplikace:

otázka difuze (živiny, produkty) růst a uvolňování plynů může narušit imobilizační matrici oproti imobilizovaným enzymům je udržení systému imobilizovaných buněk mnohem náročnější (přísun živin; aerace atd.)

Imobilizace buněk 67

Historie vývoje metod imobilizace buněk

v biotechnologiích imobilizované buňky používané od nepaměti

kvasné procesy, čištění odpadní vody od roku 1960 obnovení zájmu v 70.-tých letech nové technologické procesy

1973 – L-asparágová kyselina produkovaná E. coli 1982 – L-alanin produkovaný Pseudomonas dacunhae

v biomedicíně je situace rozdílná:

1933 – Bisceglie – úspěšná enkapsulace nádorových buněk do polymerové membrány 1963 – Chang – artificial cell – enkapsulace jako imunoprotekce transplantovaných buněk v současné době testy na zvířecích modelech a první klinické testy


Nosiče

Ideální nosič: stabilita fyzikální odolnost vůči tlaku odolnost vůči mikrobiální degradaci finanční dostupnost Fyzikální vlastnosti/charakterizace: obecné: průměr částice schopnost absorbovat vodu mechanická odolnost odolnost vůči tlaku pórovitý materiál: velikost pórů velikost částic

polyvinylalkohol v gelatizované formě

alginát 1,4 – α-L-guluronic acid + 1, 4 – β –D- mannuronic acid

Poznámka: propojenost s výběrem reaktoru (reaktor s mícháním, průtokový či vsádkový reaktor)


Imobilizace buněk – metody I

Aktivní imobilizace zachycení v pórovitém materiálu nejběžnější metoda vhodné nosiče

organické polymery - agar, alginát, karagenan, polyakrylamid, chitosan, želatina, kolagen anorganické polymery - polyuretan, polystyren, silikátový gel

enkapsulace buňka je uzavřena do tzv. mikrokapsule (sférická částice s mono- či bilaterální vrstvou membrány) v porovnání s metodou zachycení do pórovitého materiálu je možno dosáhnout vyšší koncentrace buněk na jednotku objemu horší přenos hmoty (membrána či polo-membrána na povrchu kapsule) uvnitř kapsule není vzduchoprázdno ale roztok pro tvorbu kapsulí může být použita řada polymerů (např. nylon; polystyren; polyesterové membrány)


Imobilizace buněk – metody II

Aktivní imobilizace vazba na povrch nosiče (adsorpce) vazba pomocí fyzikálních nebo chemických sil na porézní materiál adsorpce i kovalentní vazba na nosič podpůrný materiál

piliny dřeva porézní silika; sklo; keramika aktivované uhlí želatina ionexové nosiče

hlavní výhodou je přímý kontakt mezi živinami a podpůrným materiálem důležitá je velikost pórů – malé: limitace v difuzi živin x velké – velký povrch ⇒ optimální velikost pórů při níž je maximální rychlost biokonverze Pasivní imobilizace biofilmy


Porovnání metod imobilizace buněk a proteinů Nevratné metody enkapsulace entrapment encapsulation

prokřížení


cross linking

zachycení

Vratné metody

vazba pomocí kovu

adsorpce

72

loschmidt.chemi.muni.cz/peg/lecture/biocat_lecture10.pdf

Imobilizace buněk – alternativní dělení

73

Imobilizace buněk – enkapsulace do alginátového gelu alginát je semipermeabilní – prochází jen některé látky (glukóza, kyslík, IgG), neprochází T buňky, B buňky, IgM

Islet = Langerhansovy ostrůvky

http://www.microislet.com/images/S_encap_islet_diagram.gif


Imobilizace buněk – aplikace v medicíně Hoffman et al, 1993

Řada možných aplikací

poruchy CNS endokrinní a metabolické poruchy „oprava“ či „rekonstrukce“ tkání

Frim et al, 1993

Tresco et al, 1992

Tessler, 1993

Roberts, 1996

Cai et al, 1989 Sagen, 1996

Chang et al, 1993


Imobilizace buněk – metoda LentiKats

polyvinylalkohol (PVA) nemůže sloužit jako zdroj živin ⇒ nejsou problémy s kontaminací tvorba gelu jen v důsledku vypařování vody – není nutná žádná chemikálie

laboratoř

průmysl

Nedovic, Willaert: Fundamentals of Cell Immobilisation Biotechnology, Kluwer Academic Publisher, Netherlands, 2004.


Orive et al., TRENDS in Biotechnology 2004, 22(2), 87-92.

Imobilizace buněk - enkapsulace


Imobilizace buněk zachycením v pórovitém materiálu Buňky

Nosič

Katalyzovaná reakce

S. cerevisiae

karagenan/polyakrylamid

Glukóza na ethanol

E. coli

karagenan

Fumarová kyselina na asparágovou

Trichoderma reesei

karagenan

Produkce celulózy

Acetobacter sp.

Ca-alginát

Glukóza na glukonovou kyselinu

Candida tropicalis

Ca-alginát

Degradace fenolu

E. coli

polyurethan

Penicilin G na G-APA


Imobilizace buněk adsorpcí Buňky

Nosič

Katalyzovaná reakce

Lactobacillus sp.

Želatina (adsorpce)

glukóza na mléčnou kys.

Clostridium acetobutylicum

Ionexové nosiče

glukóza na aceton či butanol

Streptomyces

Sephadex (adsorpce)

streptomycin

Živočišné buňky

DEAE-sephadex/cytodex (adsorpce)

hormony

E. coli

Ti4+ oxid (kovalentní vazba)

B. cubtilis

Agaróza-karbodiimid (kovalentní vazba)

Solanum aviculare

Polyfenyl oxid-glutaraldehyd (kovalentní vazba)

příprava steroidních glykoalkaloidů


Imobilizace buněk pomocí přechodných kovů (transition metal)

využívá se faktu, že oxidy přechodných kovů jsou pro mikrobiální buňky netoxické imobilizace na celou škálu anorganických a organických nosičů (např. DAE-celulosa; celite) možno použít celou řadu iontů: Fe3+; V3+; Sn4+; Zirkonium4+;Ti4+ možno použít oxidů kovů v gelovém stavu adsorpce je následována agregací ⇒ snadná manipulace


Pasivní imobilizace buněk biofilm

= mikro-kolonie mikrobiálních buněk zachycených na povrchu a zapouzdřených v adhezivních polysacharidech sekretovaných buňkami

růst buněk v několika vrstvách na povrchu pevného nosiče zachycení živin pro růst buněk a podpora pro růst buněk ⇒ prevence vyplavování buněk v proudících systémech v negativním smyslu – často v biotechnologických procesech jak kontaminace 3 kroky procesu tvorby biofilmu:

zachycení kolonizace rozvoj


http://chemeng.mcmaster.ca/courses/che3bk3/Lecture%2016.pdf


Typy reaktorů

a) b) c) d) e) f)

Stirred tank batch reactor (STR) – vsádkový s mícháním Batch membrane reactor (MR) – enzym je umístěn mezi membrány Packed bed reactor (PBR)/plug-flow reactor (PFR) – obsahuje usazenou vrstvu imobilizovaných buněk Continuous flow stirred tank reactor (CSTR) – kontinuální reaktor s mícháním – obdoba a) Continuous flow membrane reactor (CMR) – kontinuální obdoba b) Fluidised bed reactor (FBR) – tok plynu a/nebo substrátu udržuje imobilizované částice ve fluidním stavu 82

Děkuji Vám za pozornost !

83

Imobilizace pokus o přehled v oblasti enzymů a buněk

Recommend Documents