Immunohistochemistry Staining CD4, Kolagen & P53
Arya DOSENDOKTOR
Prinsip Utama Imunohistokimia Diambil dari kata “immune” proses yg menggunakan antibody dan “histo” menunjukkan jaringan secara mikroskopis Untuk mengukur dan mengidentifikasi karakteristik seluler spt proses proliferasi sel, apoptosis sel, mengetahui distribusi dan lokasi biomarker atau protein terekspresi pada jaringan tubuh
- Tahu jenis protein yg akan dideteksi - Tahu lokasi protein tersebut - Kalau pabrik sudah membuat Ab primernya - Kalau lab.PA punya kemampuan pem.IHC Label ada 2 macam: - fluorescent enzym / peroksidase
Label fluorescent tak perlu dicat lagi Label enzim perlu cat chromogen : DAB , AEC Adanya antigen spesifik didapat antibodi(Ab) spesifik Ab primer dilabel atau sudah Pada sel terdapat berbagai macam struktur protein yg AG berlabel spesifik baik tingkat selular maupun tingkat molekuler. pengecatanAg bisa Contoh protein spesifik selular : LCA, Vimentin, CD 20, CD 3 diamati Contoh protein spesifik molekuler: RE, RP, Her 2,p53, Bcl 2 IHC
Metode imunohistokimia Terdapat beberapa metode yang digunakan diantaranya adalah Prinsip utama metodetertua. ini antibodi primer yang dikatkan dgn Merupakan metode Imunohistokimia Memanfaatkan antigen, antibodi sekunder diikatkan metode reaksi antara antibodi primer yang telah diberi pada antibodi primer dilanjutkan dengan larutan Keunggulan substrat kromogen. label enzim dengan antigen pada jaringan. Metode ini lebih serbaguna dibanding metode direct lebih metode ini cepat krn hanya menggunakan satu antibodin banyak dapat jenis antibodi primer dr spesiesyg sama yg dpt digunakan dan reaksi nonspesifik diminimalisir. Kelemahan bersamasatu dengan antibodi sekunder yg terkonjugasi, serta lbh krn hanya menggunakan label antibodi amplifikasi sensitif beberapa sekunder dpt bereaksi terhadap sinyal/pewarnaan kurangkrn memadai dan antibodi mulai kurang sensitif beberapa shg memperkuat hasil. untuk permintaan diagnosaepitop akhir2primer ini Direct
Two step indirect method
Three step indirect method
ABC, LAB/LSAB,
Avidin-Biotin-Complex (ABC) menggunakanmetode afinitassebelumnya, terhadap molekul avidinMetode ini melanjutkan antibodi tersier yg biotin oleh tiga enzim peroksidase. pengikatan bbrp biotin dlm Antibodi dikonjugasi enzimSitus ditempelkan pd antibodi sekunder. molekul avidin tetravalen untuk amplifikasi merespon sinyalKedua tersier bertujuan ini harus spesifik terhadap dan antibodi sekunder. yang disampaikan oleh antigen antibodi tsb target. juga harus dikonjugasikan pd enzim yg sama. Labelled avidin biotin (LAB), 4-8 kali lebih sensitif dr ABC. Avidin sekarang Penambahan lapisan ketiga ini memperkuat hasil krn lbh banyak tlh tergantikan oleh streptavidin shg menjadi metode baru pada yaitupewarnaan labelled pada antibodi yg terikat, jg sangat membantu streptavidin-biotinepitop (LSAB) dan modifikasi lain dr ABC seperti CSA. (epitop mjd lbh banyak)
ABC Protocol
Fixation • Fiksasi sangat penting dalam menentukan outcome reaksi antigen-antibodi • Manfaat fiksasi : – Menjaga keutuhan komponen sel (protein struktural dan soluble) – Mencegah autolisis dan perubahan penyusun sel (antigen dan enzim) – Stabilisasi material sel dari akibat prosedur tindakan – Fasilitasi pengecatan konvensional dan imunostaining
• Ada dua macam cara fiksasi
– Fiksasi cross linking (non koagulasi) – Coagulating fixatives
Cross-linking Fixation • Gold standard : formaldehid • Mekanisme dasar fiksasi : pembentukan addition product antara formalin dan grup amino reaktif yg tak bermuatan (-NH atau NH2) membentuk cross-link • Jika terdapat hidrogen reaktif kedua maka akan terbentuk methylene bridge
Antigen retrieval • AR bertujuan untuk optimalisasi imunoreaksi • Tahap fiksasi akan mengubah struktur tersier protein (antigen) sehingga sulit bereaksi dengan antibodi • Metode untuk memulihkan perubahan akibat fiksasi • AR terutama diperlukan pada jaringan yang difiksasi dengan cross-link fixative • Tanpa AR, Ab poliklonal lebih mudah deteksi Ag dibanding Ab monoklonal • Prosedur AR yang paling banyak dipakai – Metode enzimatik – Metode heat-based retrieval – Cara lain : inkubasi slide dalam larutan alkali kuat, urea, larutan asam, borohidrid, larutan sukrosa
A.R enzimatik • Huang et al mengenalkan metode protease-induced epitope retrieval (PIER) • Enzim yang dipakai : tripsin, proteinase K, pronase, ficin, pepsin • Efek dipengaruhi : konsentrasi dan tipe enzim, parameter inkubasi (waktu, suhu, pH), dan durasi fiksasi • Waktu digesti enzimatik berbanding terbalik dengan lama fiksasi • Kelemahan metode PIER – Rendahnya jumlah antigen – Perubahan morfologi jaringan – Destruksi epitop
A.R heat-based • Heat-induced epitope retrieval (HIER) dikenalkan oleh Shi et al • Konsep : reaksi kimia antara protein dan formalin dapat dipulihkan/dibalik dengan pemanasan atau hidrolisis dengan alkali kuat • Pemanasan dapat membuka epitop melalui hidrolisis cross-link metilen • Pemanasan suhu tinggi (100°C) dengan durasi singkat (10 menit) akan mendapat hasil yang lebih baik dibanding pemanasan suhu rendah dengan waktu yang lama
Imunohistokimia CD4 BACKGROUND: Setelah diketahui bahwa limfosit dapat dibagi menjadi sel B dan sel T, diketahui jg bhw sel T berfungsi sebagai helper, supresor dan sel sitotoksik. Molekul CD4 mrp glikoprotein nonpolimorfik anggota superfamili gen Ig yg berekspresi pada permukaan membran subpopulasi sel T. Molekul CD4 bertindak sebagai ko-reseptor dan berikatan dengan region nonpolimorfik molekul MHC kelas II. SOURCES/CLONES: Ancell (QS4120), Becton Dickinson (Leu3), Biodesign (13B8.2, BL4), Biogenesis (T138A), Biotest (T4, TT1), Coulter (T4), Cymbus Bioscience (MEM115), Dako (MT310), GenTrak, Immunotech (BL4,13B8.2), Oncogene (VIT4), Sanbio (BL-TH4), MEM115), Seralab, Serotec (B-A1, B-F5, B-B14, 13B8.2) and Pharmingen (RM-4-4, RM-4-5)
Imunohistokimia CD4 APPLICATION: Antibodi CD4 berguna utk identifikasi Thelper/sel inducer, memeriksa limfosit reaktif (karena terdapat pada 45% limfosit darah perifer), kelainan limfoproliferatif dan monosit. Juga terdapat pada 80% thymocyt. Walaupun juga diekspresikan pada monosit/makrofag, sel langerhans dan sel dendritik lainnya, Cd4 tidak diekspresikan oleh sel B.
ADDITIONAL INFORMATION: Positive Control: Tonsil, spleen, thymus Negative Control: Omit primary antibody, isotype control or absorption control Standard Method: ABC Method or LSAB Method. Chromogen Substrate: DAB (3,3'-DIAMINOBENZIDINE) Counterstain: Mayer's Hematoxylin
• Gambar A dan B negative control • Gambar C dan D positive control terwarnai coklat
Imunohistokimia Kolagen BACKGROUND: Lamina densa mrp lapisan setebal 40-60 nm salah satu pembentuk lamina basalis selain lapisan lamina lucida. Kolagen tipe IV terdapat dibagian lamina densa, bila menggunakan mikroskop elektron bisa teramati pada lamina densa dan lamina lucida.
SOURCES/CLONES: Accurate (COL-4), Axcel (CIV22), Biodesign (1o42, MC4HA), Biogenesis (2D8/29), Biogenex (CIV22), Biotec (XCD02), Dako (CIV22), ICN (polyclonal, 1042), Immunotech (CIV22), Milab, Sanbio (SB11), SeraLab (1042) and Serotec (CIV22, PHM-12)
Imunohistokimia Kolagen (tipe IV)
APPLICATION: Diagnosis IHC kolagen tipe IV kebanyakan terpusat pada tumor invasif pada lamina basalis, sebagian tumor epitelial. IHC kolagen tipe IV juga digunakan utk membedakan hiperplasia sel C dengan karsinoma medular pada tiroid.
ADDITIONAL INFORMATION: Positive Control: Skin, kidney Negative Control: Omit primary antibody, isotype control, absorption control Standard Method: ABC Method atau LSAB Method Chromogen Substrate: DAB Counterstain: Mayer's Hematoxylin
• Kolagen cancer mamae(+)
Kolagen pada ginjal (+)
Imunohistokimia P53 BACKGROUND: P53 berfungsi utk memprogram kematian sel, diferensiasi sel dan mengontrol mekanisme siklus sel. Terdapat pd nukleus (terikat dgn DNA), pd lengan pendek kromosom 17. P53 mewakili sebagai molekul yg paling sering berubah dlm perubahan genetis pada kanker.
SOURCES/CLONES:Biodesign (Pab1801, 53-12), BioSource, Bioprobe (BP53-12), Chemicon, Cymbus Bioscience, Medac (CM-1), Dako (DO-7), GibcoBRL, Immunotech, Novocastra, Oncogene (Pab1801, Pab421, Pab122), Oncor, Pharmingen (G59-12), Serotec (Pab1801, BP53-12) and Signet. Antibodies to mutant p53 Biogenesis, Chemicon and Oncogene (Pab240) Antibodies to Wild-Type p53 Biodesign (Pab246), Oncogene (Pab1620) and Serotec (Pab246)
Imunohistokimia P53 APPLICATION: Deteksi P53 berdasarkan peningkatan konsentrasi protein pada tingkatan yg dpt terdeteksi. Umumnya, frekuensi hasil pengecatan positif sejalan dgn tumor yg disertai mutasi pada pemeriksaan sekuensing DNA. Analisis P53 pada kondisi neoplastic atau preneoplastik merupakan alat yg kuat dlm menyediakan informasi molekuler pd proses onkogen serta kemampuannya utk mendeteksi bentuk abnormal pada protein jaringan. ADDITIONAL INFORMATION: Positive Control: Skin cancer, tumors Negative Control: Omit primary antibody, isotype control, absorption control Standard Method: ABC Method atau LSAB Method Chromogen Substrate: DAB Counterstain: Mayer's Hematoxylin
• c-erbB2 staining is positive in (A) and negative in (B). p53 staining is positive in (C) and negative in (D). Slides were counterstained with Mayer's hemalum solution. Magnification, ×100
Terima kasih
