FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2008 - 2009
Immunogene respons van gamma bestraalde matrices in hartklep tissue-engineering
Lieselot ROBYNS
Promotor: Prof. Dr. G. Van Nooten Co-promotor: Dr. P. Somers
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
ARTS
FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2008 - 2009
Immunogene respons van gamma bestraalde matrices in hartklep tissue-engineering
Lieselot ROBYNS
Promotor: Prof. Dr. G. Van Nooten Co-promotor: Dr. P. Somers
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
ARTS
“De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”
29/04/2009
Lieselot Robyns
Prof. Dr. G. Van Nooten
Voorwoord
Graag zou ik hier enkele eenvoudige woorden van dank willen uiten.
Mijn oprechte dank gaat uit naar Prof. Guido Van Nooten voor het bieden van deze unieke opportuniteit. De ervaring opgedaan tijdens deze boeiende experimentele studie was van onschatbare waarde. Mijn fascinatie voor dit onderwerp is er nog verder door mogen groeien. Dank ook voor de wetenschappelijke begeleiding, die ik steeds ten zeerste geapprecieerd heb. Mijn co-promotor, Pamela Somers wens ik hartelijk te danken voor de goede begeleiding tijdens haar ongetwijfeld drukke doctoraatsstudie. Dank voor al de steun. Het was zeer aangenaam op deze manier mee te mogen werken aan dit project. Mieke Olieslagers wens ik te bedanken voor het steeds warme onthaal in het laboratorium. Tot slot wil ik mijn ouders, vriend en familie oprecht bedanken voor de bemoedigende woorden en de onvoorwaardelijke steun doorheen het hele verloop van deze scriptie.
Inhoudstafel
ABSTRACT ............................................................................................................................................1
I INLEIDING........................................................................................................................................2
1.1
ANATOMIE EN FUNCTIE VAN HET HART .......................................................................................2
1.2
ANATOMIE EN FUNCTIE VAN DE AORTAKLEP ..............................................................................4
1.2.1
MACROSCOPISCH .........................................................................................................................4
1.2.2
MICROSCOPISCH ..........................................................................................................................5
1.2.2.1
Cellulair.....................................................................................................................................6
1.2.2.2
Extracellulaire matrix................................................................................................................6
1.3
HARTKLEPZIEKTEN .......................................................................................................................7
1.3.1
EPIDEMIOLOGIE ............................................................................................................................7
1.3.2
AORTAKLEPPATHOLOGIE .............................................................................................................7
1.3.2.1
Aortaklepstenose.......................................................................................................................7
1.3.2.1.1
Etiologie.................................................................................................................................7
1.3.2.1.2
Pathogenese............................................................................................................................8
1.3.2.1.3
Klinische symptomen en onderzoeken ..................................................................................8
1.3.2.1.4
Technische investigaties ........................................................................................................9
1.3.2.1.5
Medicamenteuze therapie ......................................................................................................9
1.3.2.2
Aortaklepinsuffinciëntie .........................................................................................................10
1.3.2.2.1
Etiologie...............................................................................................................................10
1.3.2.2.2
Pathogenese..........................................................................................................................10
1.3.2.2.3
Klinische symptomen en onderzoeken ................................................................................11
1.3.2.2.4
Technische investigaties ......................................................................................................11
1.3.2.2.5
Medicamenteuze therapie ....................................................................................................11
1.4
THERAPIE AORTAKLEPAANDOENINGEN ....................................................................................12
1.4.1
MECHANISCHE KLEPPEN ............................................................................................................13
1.4.2
BIOPROTHESEN ..........................................................................................................................14
1.4.3
HOMOGRAFTS ............................................................................................................................15
1.5
TISSUE-ENGINEERING .................................................................................................................15
1.5.1
ALGEMEEN .................................................................................................................................15
1.5.2
HARTKLEP TISSUE-ENGINEERING ..............................................................................................16
1.6
IMMUNOGENE RESPONS ..............................................................................................................18
1.6.1
CROSS-LINKING ..........................................................................................................................18
1.6.2
DECELLULARISATIE ...................................................................................................................19
1.6.3
GAMMASTRALING ......................................................................................................................21
1.7
DOELSTELLING EXPERIMENTEEL ONDERZOEK ........................................................................22
II
MATERIALEN EN METHODEN .............................................................................................23
II. A LITERATUURSTUDIE ....................................................................................................................23
II. B EXPERIMENTEEL ONDERZOEK ....................................................................................................23
2.1
DISSECTIE VAN DE AORTAKLEPPEN ...........................................................................................24
2.2
DECELLULARISATIEPROCEDURE ...............................................................................................25
2.3
HISTOLOGISCHE ANALYSE NA DECELLULARISATIE .................................................................26
2.3.1
MACROSCOPISCHE ANALYSE NA DECELLULARISATIE ...............................................................26
2.3.2
MICROSCOPISCHE ANALYSE NA DECELLULARISATIE ................................................................26
2.3.2.1
Lichtmicroscopie na decellularisatie.......................................................................................27
2.3.2.2
Elektronenmicroscopie na decellularisatie .............................................................................27
2.4
BESTRALING KLEPBLADEN .........................................................................................................27
2.5
MECHANISCHE STERKTEMETINGEN ..........................................................................................27
2.5.1
ARBEID TOT MAXIMALE BELASTING ..........................................................................................28
2.5.2
ELASTICITEIT .............................................................................................................................28
2.6
PROEFDIEREN ..............................................................................................................................28
2.6.1
SUBCUTANE RATMODEL ............................................................................................................29
2.6.2
IMPLANTATIE .............................................................................................................................29
2.6.3
EXPLANTATIE .............................................................................................................................30
2.7
EXPLANTAATANALYSE ................................................................................................................31
2.7.1
MACROSCOPISCHE EXPLANTAATANALYSE ...............................................................................31
2.7.2
HISTOLOGISCHE EXPLANTAATANALYSE ...................................................................................31
2.7.2.1
Lichtmicroscopie.....................................................................................................................31
2.7.2.2
Elektronenmicroscopie ...........................................................................................................32
2.7.3
ANTILICHAAMBEPALING ............................................................................................................32
2.8
STATISTISCHE ANALYSE ..............................................................................................................33
III
RESULTATEN............................................................................................................................34
3.1
STRUCTUUR NA DISSECTIE ..........................................................................................................34
3.2
HISTOLOGISCHE ANALYSE NA DECELLULARISATIE .................................................................34
3.2.1
MACROSCOPISCHE ANALYSE NA DECELLULARISATIE ...............................................................34
3.2.2
MICROSCOPISCH ANALYSE NA DECELLULARISATIE ..................................................................35
3.2.2.1
Lichtmicroscopie na decellularisatie.......................................................................................35
3.2.2.2
Elektronenmicroscopie na decellularisatie .............................................................................35
3.3
MECHANISCHE STERKTEMETINGEN ..........................................................................................36
3.3.1.1
Arbeid tot maximale belasting ................................................................................................36
3.3.1.2
Elasticiteit ...............................................................................................................................37
3.4
EXPLANTAATANALYSE ................................................................................................................37
3.4.1
MACROSCOPISCHE EXPLANTAATANALYSE ...............................................................................37
3.4.2
MICROSCOPISCHE EXPLANTAATANALYSE .................................................................................38
3.4.2.1
Lichtmicroscopie explantaat ...................................................................................................38
3.4.2.2
Elektronenmicroscopie explantaat ..........................................................................................40
3.5
ANTILICHAAMBEPALING.............................................................................................................41
IV
DISCUSSIE ..................................................................................................................................42
V
REFERENTIES ............................................................................................................................50
Abstract
Inleiding: Aortaklepvervanging is een frequent toegepaste heelkundige interventie. De huidige mechanische en biologische hartklepprothesen kennen echter elk specifieke beperkingen. Tissue-engineering is een technologie die mogelijks een oplossing kan bieden voor deze problematiek. Van belang hierbij is dat de gecreëerde matrixstructuur biologisch inert dient te zijn en dat deze zowel structureel als functioneel de natieve aortaklep kan mimeren. Voor de uitschakeling van de immunogene respons worden xenogene kleppen onderworpen aan een decellularisatieprocedure. Recent onderzoek heeft aangetoond dat deze methode niet volstaat voor een volledige eliminatie van de antigeniciteit. De xeno-antigenen aanwezig in de extracellulaire matrix, verantwoordelijk voor de residuele immunogene respons, kunnen mogelijks wel gemaskeerd worden door middel van fixatie of cross-linking. Vermits chemische cross-linking autologe recellularisatie van de matrix inhibeert, werd geopteerd voor het gebruik van gammaradiatie. In deze studie wordt het effect van verschillende dosissen gammaradiatie op de mechanische sterkte, de ultrastructurele integriteit, de biocompatibiliteit en immunogeniciteit van gedecellulariseerde porcine matrices geëvalueerd. Methodologie: Porciene matrices werden gedecellulariseerd aan de hand van een detergentenzymatisch proces. Naderhand werden de matrices bestraald met verschillende dosissen gammaradiatie (10, 50 en 100 Gy). De mechanische sterkte van de bekomen kleppen werd onderzocht aan de hand van sterktemetingen. De bestraalde en controle matrices werden vervolgens geïmplanteerd in het subcutane ratmodel. Na een tot vier weken werden de kleppen geëxplanteerd en geëvalueerd aan de hand van licht- en elektronenmicroscopie. De IgG immuunrespons van de ratten tegen de matrices werd geanalyseerd aan de hand van Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA). Resultaten: De porciene aortakleppen werden succesvol gedecellulariseerd. De mechanische sterkte van alle bestraalde klepbladen nam significant toe. Verder werd de elasticiteit van de 50 en 100 Gy bestraalde matrices sterk gereduceerd. In tegenstelling tot al de andere matrices toonden de 10 Gy bestraalde scaffolds een zeer milde inflammatoire lymfocytaire reactie. Fibroblast ingroei was hierbij prominent aanwezig. De ultrastructurele integriteit werd bewaard tot een stralingsdosis van 10 Gy. Hogere dosissen vernietigden het collageen en elastine van de ECM. De resultaten van de optische densiteit van de IgG-antilichamen gaven aan dat de antistoffen rechtevenredig toenamen met een stijgende dosis van gammaradiatie. Conclusie: De gastheer immuunrespons wordt niet volledig onderdrukt door gammaradiatie. Een dosis van 10 Gray gammaradiatie reduceert echter wel de inflammatoire reactie in porciene matrices met behoud van de ultrastructurele integriteit van de ECM. Toekomstig onderzoek zal trachten de ideale dosis gammaradiatie te vinden voor acellulaire porciene matrices om toepassing ervan mogelijk te maken in tissue-engineering van een aortaklep.
1
I
Inleiding
Tissue-engineering van een aortaklep vormt een grote uitdaging. Dit inleidend gedeelte poogt de aspecten betrokken bij dit proces te kaderen binnen de ruimere context. Hiertoe zal vooreerst een beschrijving gegeven worden van de normale anatomie en functie van het hart, met de aortaklep meer in het bijzonder. De verschillende facetten van hartklepziekten zullen worden toegelicht en hierop aansluitend zal eveneens een overzicht geboden worden van de huidige therapeutische ontwikkelingen. Vanuit deze achtergrond kan vervolgens het concept van hartklep tissue-engineering evenals de immunogene problematiek inherent aan dit gegeven besproken worden. Het geheel zal uiteindelijk aanleiding geven tot het formuleren van de doelstellingen van deze experimentele studie.
1.1 Anatomie
en
functie
van
het
hart
Het menselijk hart is een opmerkelijk efficiënte en duurzame musculaire orgaanstructuur, gelegen in de thoraxholte in nauwe anatomische relatie met de omgevende structuren. Morfologisch kan er een linker- en rechterharthelft onderkend worden. Hierbij valt het op dat het linkergedeelte meer dorsaal gelegen is dan het rechter en dat beide van elkaar gescheiden worden door het interatriaal en interventriculair septum. Elke harthelft is verder opgebouwd uit een atrium en een ventrikel. Tijdens de hartcyclus staan de dunwandige atria in voor de finale vulling van de dikwandige ventrikels. Deze laatste voorzien de verschillende vaatgebieden van bloed via een volledige en krachtige contractie. Om tijdens dit proces een unidirectionele bloedstroom te garanderen beschikt het hart over vier cardiale kleppen, die op gesynchroniseerde wijze openen en sluiten [1]. De twee valva atrioventricularis, namelijk rechts de valva tricuspidalis en links de valva bicuspidalis of mitralis, zijn gelegen op de overgang van het atrium naar het ventrikel. Op de outflowtractus van het linkerventrikel naar de aorta en van het rechterventrikel naar de arteria pulmonalis bevinden zich respectievelijk de aortaklep en de pulmonalisklep. Het hart vervult een essentiële functie binnen het humane stelsel door via een optimale hemodynamiek de continue oxygenatie van de vitale organen te garanderen. Zo is een hart dat klopt aan 70 slagen per minuut in staat op pulsatiele wijze om en bij de 5 à 6 liter bloed per minuut rond te pompen [2].
2
Gedurende de cardiale cyclus keert zuurstofarm bloed terug vanuit de lichaamsweefsels naar het rechteratrium van het hart via de vena cava inferior en superior. Na de vullingsfase contraheert het rechteratrium waarbij het bloed langsheen de tricuspiedklep naar het rechterventrikel vloeit. Eens in het rechterventrikel wordt het bloed via de pulmonalisklep in de arteria pulmonalis gestuwd, waar het bloed ter hoogte van de longen van zuurstof voorzien wordt en via de pulmonale venen terechtkomt in het linkeratrium. Van hieruit passeert het bloed de mitralisklep en komt vervolgens terecht in het linkerventrikel van waaruit het via de aortaklep geëjecteerd wordt naar de aorta en de rest van het lichaam (figuur 1). De drukontwikkeling in het linkerventrikel is ongeveer zesmaal hoger dan in het rechter en dit omwille van de outflow naar de systemische circulatie [3]. Figuur 1 Het hart met aanduiding van de cardiale structuren; rechteratrium (RA), tricuspidalisklep (T), rechterventrikel (RV), pulmonalisklep (P), arteria pulmonaris (PA), linkeratrium (LA), mitralisklep (M), linkerventrikel (LV), aortaklep (A). De pijlen geven de richting van de bloedstroom aan. (Thubrikar)
Er kunnen twee fasen onderscheiden worden in deze cyclus: enerzijds de diastole, dit is de fase waarbij het hart wordt gevuld met bloed tijdens de relaxatie van de hartspiercellen, anderzijds de systole, de fase die instaat voor de lediging van het hart naar de arteriën toe. De systole vindt plaats onder invloed van een volumevermindering teweeggebracht door een contractie van de myocardiale cellen. De bloedstroom wordt dus bepaald door de drukveranderingen, zoals uitgezet in een druk-volumerelatie, uitgelokt door het afwisselend contraheren en relaxeren van het myocard. De hartcontractie wordt op haar beurt gecoördineerd via de pacemakercellen en het geleidingsysteem. De bloedvoorziening van het hart zelf wordt verzorgd door de coronaire arteriën die ontspringen ter hoogte van de aorta.
3
1.2 Anatomie
en
functie
van
de
aortaklep
Binnen de cardiale werking vervult de aortaklep een unieke functie. De complexe structuurfunctie relatie van deze hartklep en de cellulaire en extracellulaire matrix biologie eigen aan de klep zullen besproken worden.
1.2.1 Macroscopisch
De normale hartklepwerking laat slechts een unidirectionele bloedstroom toe en vereist de structurele integriteit en het gecoördineerd verloop van multiple kritische componenten [4]. Het geheel stelt de aortaklep in staat dagelijks ongeveer 103.000 keer en bij benadering 3,7 miljard maal in een leven te openen en te sluiten [5]. De tricuspiede aortaklep, met een gemiddelde diameter van 22 mm [4] en een klepoppervlak van 4 cm2 [6], is geïntegreerd in de aortabasis en vormt de structurele en hemodynamische scheiding tussen het linkerventrikel en de aorta ascendens. Drie componenten kunnen onderscheiden worden: de annulus, de klepbladen en de commissuren [6] (figuur 2). De annulus fibrosus, een verdikte fibreuze ring rondom de klep, vormt de insertieplaats van de klepbladen. De aortaklep is opgebouwd uit drie U-vormige klepbladen: de valvula semilunaris posterior, dextra en sinistra. Elk klepblad, ook leaflet of cusp genaamd, beschikt over een vrije kleprand of lunula valvulae semilunaris en is in het midden voorzien van een nodulus van Arantius als versterkende structuur. De aanhechtingsplaats waar twee aanliggende klepbladen elkaar ontmoeten, wordt aangeduid als de commissuur. Figuur 2 Anatomie van de aortaklep met ontvouwde klepstructuur na insnijding van de aorta. (Bewerking van Anderson R.H. et al.)
Ter hoogte van de kleppen dilateert de aorta voor de vorming van de sinussen van valsalva waarin ter hoogte van de rechter en linker sinus respectievelijk de arteria coronaria dextra en sinistra uitmonden.
4
De functie van deze semilunaire klep hangt af van de integriteit en van de gecoördineerde bewegingen van de klepbladen en hun vasthechtingsstructuur. De morfologie zorgt voor specifieke hemodynamische flow karakteristieken die in relatie staan met de cardiale contractie. Zo opent de aortaklep zich gedurende de ventriculaire systole door een retractie van de klepbladen als gevolg van een uitwaartse beweging van de commissuren. Na de ejectiefase zorgt een minimale drukomkeer tijdens de diastole voor het snel en volledig afsluiten van het orificium [7]. Een optimale competentie gedurende de sluiting wordt gegarandeerd door middel van een substantiële overlapping of coaptatie van de klepbladranden [6]. De sluitingsfase van de aortaklep kan met behulp van een stethoscoop worden waargenomen als de tweede harttoon. Gedurende dit proces weerstaan de klepbladen routinematig aan grote cyclische deformaties en induceert de hoge druk over de gesloten klep een grote mechanische belasting [7]. Indien defecten in het valvulair apparaat optreden omwille van deze inwerkende krachten zijn de complexe dynamische structuren tot op zekere hoogte in staat tot herstel en remodellering.
1.2.2 Microscopisch
Elk biologisch weefsel is opgebouwd uit cellen ingebed in een proteïnematrix, de extracellulaire matrix (ECM) genaamd, hoofdzakelijk bestaande uit collageen, elastine en proteoglycanen. De ratio van de componenten, geproduceerd door de cellen, is verschillend voor elk weefseltype en afhankelijk van zijn functie. Collageenvezels, bestaande uit drie polypeptide alfaketens in helixvorm, zijn de meest abundante componenten [8]. Collageen functioneert als de drukdragende proteïne en de gevormde vezels geven mechanische sterkte aan het weefsel [9]. Elastine staat in voor de stretching van het weefsel en de elastische recoil en is dan ook belangrijk voor het goed functioneren van de omgevende collageenvezels [8]. De extracellulaire matrix bestaat verder uit proteoglycanen, die opgebouwd zijn uit glycosaminoglycanen geschikt rond een kernstructuur. Deze moleculen kunnen gels vormen door de binding met water en vormen zo een stevige grondsubstantie voor het weefsel [10]. De structurele en biomechanische eigenschappen van de kleppen hangen af van de hooggespecialiseerde, complexe architectuur van de extracellulaire matrix en van de cellulaire componenten.
5
1.2.2.1 Cellulair
Twee algemene celtypes kunnen teruggevonden worden in de valvulaire structuur: enerzijds het endotheel als bedekkende laag, anderzijds de interstitiële cellen, die de eigenschappen van zowel gladde spiercellen als fibroblasten combineren (figuur 3). Deze myofibroblasten zijn in staat de ECM-proteïnen te synthetiseren en induceren aldus de continue remodellering van het klepweefsel [6, 7, 11]. De cellen aanwezig in de hartklep hebben elk unieke karakteristieken en functies, die hen in staat stellen tot cel-celcommunicatie en tot interactie met de extracellulaire matrix [6,11]. Het fungeren als bron van biologische mediatoren en structurele proteïnen maakt adaptatie van de klep aan de micro-omgeving mogelijk [4,11]. 1.2.2.2 Extracellulaire
matrix
Elk van de cuspale lagen is opgebouwd uit specifieke extracellulaire matrixcomponenten met eigen fysische en mechanische eigenschappen. De ventricularis, gelegen nabij de ventriculaire ruimte, bestaat voornamelijk uit dens collageen met radiaal geschikte elastinevezels. De centraal gelokaliseerde spongiosa bevat losmazig geschikt collageen en abundante glycosaminoglycanen [10]. Nabij het aortische oppervlak is de fibrosa gelegen, een dikke fibreuze laag predominant opgebouwd uit dense, circumferentieel geschikte collageenvezels, grotendeels parallel verlopend aan de vrije klepbladrand [6,7] (figuur 3). De ECM in het algemeen en het collageen in het bijzonder spelen een cruciale rol in de biomechanische klepfunctie en de duurzaamheid ervan [12]. Het stelt de hartklep in staat te accomoderen in functie van de hemodynamische veranderingen [9]. Figuur 3 Histologie van de aortaklep die de trilaminaire structuur en de aanwezigheid van de valvulaire interstitiële cellen en endotheelcellen weergeeft. (Mendelson K. et al.)
6
1.3 Hartklepziekten
1.3.1 Epidemiologie
Aandoeningen van de hartklep vormen wereldwijd een significante oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. In de Verenigde Staten kent hartklepziekte een prevalentie van 2.5% [13]. Als gevolg van de malfunctie van een van de hartkleppen sterven er in de VS jaarlijks ongeveer 20 000 patiënten en vindt er momenteel per jaar bij 100 000 patiënten een vervanging plaats van de dysfunctionele klep [14]. Wereldwijd worden er op jaarbasis 275 000 klepvervangende operaties uitgevoerd [14]. De problematiek stijgt duidelijke met toenemende leeftijd; een op de acht personen ouder dan 75 jaar heeft namelijk een matige tot ernstige vorm van valvulaire ziekte [13]. De wereldwijd toenemende incidentie en prevalentie kunnen dan ook verklaard worden door de verhoging van de levensverwachting, die een veroudering van de bevolking met zich meebrengt. Van alle hartkleppen is de aortaklep het meest, tot in 70% van de gevallen, onderhevig aan pathologische veranderingen [15].
1.3.2 Aortakleppathologie
Aortaklepziekte is een ernstige klinische conditie resulterend uit de dysfunctie van de hartklep. Algemeen kunnen hierbij twee grote entiteiten onderscheiden worden: namelijk aortaklepstenose en aortaklepinsufficiëntie. De vernauwing van de klepopening, die optreedt bij aortaklepstenose, vermindert de ventriculaire bloeduitstroom en veroorzaakt een drukoverbelasting van het linkerventrikel. Aortaklepinsufficiëntie daarentegen treedt op bij het onvolledig sluiten van de klep, waardoor bloed terugstroomt van de aorta naar het linkerventrikel en geeft op deze wijze aanleiding tot een volumeoverbelasting. Beide aandoeningen kunnen zich ook gelijktijdig voordoen. Globaal genomen is aortaklepstenose frequenter dan aortaklepinsufficiëntie [6]. 1.3.2.1 Aortaklepstenose
1.3.2.1.1 Etiologie
Aortaklepstenose bij volwassenen kan congenitaal verworven zijn, kan optreden secundair aan reumatische inflammatie van de hartklep of kan het gevolg zijn van een degeneratieve calcificatie van de aortaklep [16,17]. Deze laatste vorm is de meest frequente vorm van aortaklepstenose in de geïndustrialiseerde wereld [13,15]. Dit dystrofisch proces van de 7
klepbladen vertoont gelijkenis met het actieve inflammatoire proces bij atherosclerose [5,16,18]. Dertig procent van de populatie ouder dan 60 jaar kent sclerose van de aortaklep; dit is een aortaklepverkalking met een minimale gradiënt [6,16]. Slechts een minderheid hiervan zal een significante aortaklepstenose ontwikkelen. Een andere oorzaak van aortaklepstenose is de reumatische endocarditis, die typisch door een progressieve fusie van de commissuren veroorzaakt wordt en die nagenoeg steeds gepaard gaat met de reumatische aantasting van de mitralisklep. Een bicuspiede aortaklep is de meest frequente vorm van congenitaal verworven aortakleplijden. De bicuspiede aortaklep, die slechts uit twee klepbladen bestaat, komt voor bij 1 à 2% van de bevolking [5,6]. De abnormale morfologie kan leiden tot een progressieve toename van de rigiditeit en verder tot een verdikking of calcificatie van de klepbladen [6]. 1.3.2.1.2 Pathogenese
De stenose die gepaard gaat met een geleidelijke afname van het klepoppervlak, geeft aanleiding tot een drukoverbelasting van het linkerventrikel. Het geheel resulteert in een compensatoire concentrische linkerventrikelhypertrofie. Dit adaptief mechanisme geeft aanleiding tot een normalisatie van de systolische druk en zorgt voor een behoud van de cardiac output, zoals voorspeld kan worden aan de hand van de wet van Laplace. Uiteindelijk zal er een evolutie plaatsvinden tot myocard dysfunctie met myocardischemie, angor, aritmieën en linkerhartfalen. Als gevolg van de toenemende sclerose kan de cardiac output immers onvoldoende toenemen tijdens inspanning en uiteindelijk zelfs onvoldoende worden in rusttoestand. Hieropvolgend zal er een proces plaatsvinden van linkerventrikeldilatatie en zal de einddiastolische druk een toename kennen tot op een punt van klinisch symptomatisch hartfalen. De aortaklepstenose wordt als kritisch beschouwd vanaf een klepoppervlak kleiner dan 1 cm2 of indien er sprake is van een gemiddelde systolische gradiënt van meer dan 50 mmHg tussen het linkerventrikel en de aorta [16]. 1.3.2.1.3 Klinische
symptomen
en
onderzoeken
Het proces van aortaklepstenose kan jarenlang asymptomatisch verlopen. Patiënten presenteren zich gewoonlijk tussen de leeftijd van 50 en 70 jaar met één of meer van de drie cardinale symptomen: namelijk het optreden van dyspneu, angor en inspanningsgeassocieerde syncopes. Van zodra één van deze symptomen zich voordoet, bedraagt de mediane overleving gemiddeld minder dan drie jaar indien er geen therapeutische interventie plaatsvindt [6,16].
8
Milde aortaklepstenose geeft geen aanleiding tot drukveranderingen; bij matige tot ernstige stenose daarentegen kan zowel een verlaagde bloeddruk als een verlaagde polsdruk genoteerd worden. Bij hartauscultatie kan een typisch ruw, crescendo-decrescendo, systolisch ejectiegeruis ter hoogte van de tweede intercostaalruimte rechts of links gehoord worden, vaak gepaard gaande met een uitstraling naar de carotiden en apex toe. In een ver gevorderd stadium van verminderde cardiac output kan dit geruis evenwel in intensiteit afnemen. In ernstige gevallen kan bij de palpatie van de carotiden een trage upstroke en mogelijks ook een systolische thrill waargenomen worden. 1.3.2.1.4 Technische
investigaties
Het
rust-ECG
toont
vaak
een
linkerventrikelhypertrofie,
al
dan
niet
met
overbelastingstekenen. Echocardiografie laat toe de klep morfologisch te evalueren en de calcificaties op te sporen. De drukgradiënt tussen het linkerventrikel en de aorta kan berekend worden aan de hand van een Doppler-onderzoek. Tevens kan op deze manier een inschatting gemaakt worden van het klepoppervlak. Hartcatheterisatie kan eveneens informatie geven over de drukverschillen aan de hand van een terugtrekcurve en kan daarnaast een berekening maken van het klepoppervlak. Een coronaire angiografie kan preoperatief plaatsvinden om het eventueel begeleidend coronair lijden te evalueren. 1.3.2.1.5 Medicamenteuze
therapie
De progressie van degeneratieve aortaklepstenose is een actief proces, dat veel gelijkenis vertoont met atherosclerose. Maatregelen ter preventie van atherosclerose hebben ook hier hun waarde. Hoewel verscheidene retrospectieve studies reeds een positief effect aantoonden van statines en ACE-inhibitoren, zijn de data nog conflictueus en de enige gerandomiseerde studie naar statinetherapie tot hiertoe verricht, bleek negatief [5,16,18]. Omwille van onvoldoende evidentie bestaan er geen therapeutische aanbevelingen. Symptomatische patiënten hebben vroegtijdig nood aan chirurgie, daar geen enkele medicamenteuze therapie in staat is een operatie uit te stellen. Patiënten die niet geschikt bevonden worden voor chirurgie, kunnen evenwel geholpen worden met digitalis, diuretica, ACE-inhibitoren of angiotensine-receptorblokkers en dit indien er sprake is van hartfalen, vochtretentie, aritmie of hypertensie [20]. Antibioticaprofylaxe ter preventie van infectieuze endocarditis is essentieel [17].
9
1.3.2.2 Aortaklepinsuffinciëntie
1.3.2.2.1 Etiologie
De etiologie van aortaklepinsufficiëntie is divers. Het treedt het meest op ten gevolge van kleplijden of ten gevolge van een aantasting van de basis van de aorta. Primair kleplijden wordt voornamelijk veroorzaakt door reumatische pathologie, infectieuze endocarditis en congenitale afwijkingen [17]. Bij reumatisch kleplijden gaat de appositie van de klepblaadjes verloren omwille van een fibreuze retractie. Infectieuze endocarditis kan mogelijks optreden bij een voordien reeds reumatisch aangetaste klep, bij een congenitale malformatie van de klep of in zeldzame gevallen eveneens bij een normale klep. Verdere klepbeschadiging geeft in deze gevallen aanleiding tot insufficiëntie. Congenitaal verworven afwijkingen, zoals een bicuspide aortaklep of prolaps van een van klepblad, kunnen eveneens een aanleidend gegeven zijn. Primaire aantasting van de aortabasis kan leiden tot dilatatie van de aorta en de annulus en uiteindelijk tot insufficiëntie. Ondermeer hypertensie, atherosclerose van de aorta en het syndroom van Marfan kunnen aan de grond liggen van dit pathologische proces. 1.3.2.2.2 Pathogenese
Bij aortaklepinsufficiëntie zorgt de terugstroming van bloed naar het ventrikel tijdens de diastole voor een volumeoverbelasting van het linkerventrikel. Acute klepinsufficiëntie kent gewoonlijk een fulminant klinisch verloop. Het linkerventrikel is niet in staat de acute volumeoverbelasting en de stijging van de einddiastolische druk te compenseren. Hierop volgt dat de mitralisklep vroegtijdig sluit met een onvoldoende voorwaartse vulling van het linkerventrikel, wat uiteindelijk leidt tot cardiovasculaire collaps en respiratoire insufficiëntie. Bij chronische aortaklepinsufficiëntie kennen de volumeoverbelasting en de stijging van de einddiastolische
ventriculaire
druk
een
meer
geleidelijk
verloop.
Compensatoire
mechanismen van linkerventrikelhypertrofie en -dilatatie zullen optreden om de cardiac output te behouden. In het geval van gevorderde chronische aortaklepinsufficiëntie zal deze compensatie echter niet volstaan en de aortische weerstand zal een val van de diastolische druk veroorzaken met een afname van de coronaire perfusie. Het grote linkerventrikel zal onvoldoende zuurstoftoevoer krijgen en er zal cardiale ischemie optreden. Dit resulteert uiteindelijk in de ontwikkeling van linkerhartfalen.
10
1.3.2.2.3 Klinische
symptomen
en
onderzoeken
Het is mogelijk dat patiënten met chronische aortaklepinsufficiëntie gedurende lange tijd asymptomatisch blijven en dit tot het optreden van linkercordecompensatie. In geval van hartfalen dilateert het linkerventrikel, wat aanleiding geeft tot een cardiothoracale index van meer dan 0.5. De typische tekenen die zich daarbij ontwikkelen, zijn een vermindering van het inspanningsvermogen en dyspneu d’effort. In een gevorderd stadium kunnen eveneens klachten optreden van vertigo en angina pectoris. Typisch aan insufficiëntie is het voorkomen van een groot systolisch-diasystolisch bloeddrukverschil. Dit geeft op zijn beurt aanleiding tot een grotere differentiale druk of polsdruk. In vergevorderde gevallen kan dit zichtbaar zijn onder de vorm van uitgesproken perifere pulsaties, ook Waterhammerpols genoemd. Ter hoogte van de arteria femoralis kan een geruis aanwezig zijn, ook wel aangeduid als het teken van Durosiez. Bij de hartauscultatie zal men ter hoogte van de vierde intercostaalruimte links, ter hoogte van de hartapex, een typisch vroegdiastolisch geruis kunnen detecteren. In ernstige gevallen zal dit geruis holodiasystolisch worden met een presystolische versterking, ook gekend als Austin-Flint geruis. 1.3.2.2.4 Technische
investigaties
De onderzoeken die bij insufficiëntie kunnen plaatsvinden, zijn identiek als deze bij stenose. Het elektrocardiogram kan een linkerventrikelhypertrofie aantonen met eventuele overbelastingstekenen. Echocardiografie laat toe de oorzaak en ernst van de pathologie in beeld te brengen. Doppler-echocardiografie kan de hoeveelheid regurgiterend volume kwantificeren. Door middel van cardiale catheterisatie kan de ernst geclassificeerd worden aan de hand van contrastinjectie boven de aortaklep [19]. Vullingsdrukken kunnen gemeten worden en eventuele coronaire aandoeningen kunnen in het licht gesteld worden. 1.3.2.2.5 Medicamenteuze
therapie
Nitroprusside en inotrope agentia kunnen worden aangewend in een preoperatieve setting in geval van slecht getolereerde acute aortaklepinsufficiëntie. Bij patiënten met ernstige chronische insufficiëntie en hartfalen vormen ACE-inhibitoren de eerste keuze wanneer chirurgie
gecontra-indiceerd
is
of
in
geval
van
persisterende
postoperatieve
linkerventrikeldysfunctie. Er dient ook voldoende aandacht besteed te worden aan endocarditis-preventie met antibiotica [20].
11
1.4 Therapie
aortaklepaandoeningen
Naast de medicamenteuze behandeling van patiënten met aortakleppathologie is men in de meerderheid van de gevallen genoodzaakt over te gaan tot een chirurgische ingreep. Deze kan enerzijds bestaan uit klepplastie en anderzijds uit de werkelijke vervanging van de aortaklep. Onder klepplastie verstaat men het herstel van de beschadigde klep door middel van technieken zoals de valvulotomie of het insnijden van de klep, de commissurotomie of de insnijding van de commissuur, de annuloplastie of het herstel van de klepring. Onder klepplastie valt eveneens de radicale reconstructie. Het voordeel van deze procedures is dat men in staat is het eigen klepweefsel te behouden en dat er bijgevolg geen nood is aan anticoagulatie. Er dient echter opgemerkt te worden dat enkel geringe vormen van destructie of slechts matig gecalcifieerde weefsels hiervoor in aanmerking komen. De meest frequent toegepaste heelkundige interventie in het geval van klepdysfunctie en eindstadium kleplijden is echter de aortaklepvervanging. Deze therapie heeft tot doel de natieve hartklep te vervangen door een structuur die morfologisch en functioneel de eigen klep zo goed mogelijk benadert en bijgevolg instaat voor een significante verbetering van de levensverwachting en kwaliteit [4]. Hierbij wordt gestreefd naar de implantatie van een artificiële klep of prothese met lange termijn duurzaamheid, goede hemodynamiek en biologische compatibiliteit. Tot op heden verloopt deze procedure via een openhartoperatie, die met de huidige chirurgische technieken een lage mortaliteit en morbiditeit kan garanderen [15]. Recente rapporten suggereren dat endovasculaire interventies in de toekomst hiervoor een alternatief zouden kunnen bieden. Het zou gaan om de percutane implantatie van een vouwbare hartklep. Deze klep zou dan gemonteerd worden op een expandeerbare stent, eveneens percutaan ingebracht via gestandaardiseerde cathetertechnieken [6]. Sinds het ontstaan van de cardiale chirurgie in de jaren ‘60 maakt men routinematig gebruik van een mechanische of een biologische kunstklep ter vervanging van de aangetaste klep. Tot deze laatste groep van implantaten behoren enerzijds de porciene xenograft of boviene pericard bioprothesen en anderzijds de homografts, vervaardigd uit humane donorkleppen [21].
12
1.4.1 Mechanische
kleppen
Mechanische kleppen zijn synthetische structuren ontworpen uit een inerte klepring of housing, vroeger vervaardigd uit metaal maar tegenwoordig opgebouwd uit titanium bedekt met koolstofpyroliet. Verder zijn ze aan de buitenzijde bekleed met een kunststoffen hechtingsring en dit ter bevordering van de implantatie in de natieve annulus. De binnenzijde van de klepring wordt afgesloten door een beweeglijke occluder, die cyclisch opent en sluit, en via een ophangingsysteem of pivot is bevestigd in de klepopening. In grote lijnen kan men drie soorten mechanische kleppen onderscheiden: de ball-in-cage (Starr-Edwards), de single tilting-disc (Medtronic-Hall) en de bileaflet klep (St. Jude) (figuur 4). Deze laatste vorm, het twee-klepbladen- of bileafletsysteem, wordt momenteel het meest toegepast.
Figuur 4 I. Ball-in cage klep Starr Edwards® II. Monoleaflet tilting disc klep Medtronic Hall® III. Bileaflet klep St. Jude®
Mechanische kleppen zijn duurzame structuren, die omwille van hun laag profiel vlot implanteerbaar zijn. Ze kennen een excellente hemodynamiek die vergelijkbaar is met deze van de natieve hartklep. Het zwakke punt van het mechanische systeem is echter de ophangingstructuur. Ter hoogte van deze zone ontstaan immers niet-laminaire stromen, die een stase van bloed voor gevolg kunnen hebben. Om het risico op trombo-embolische complicaties, te wijten aan het niet fysiologische oppervlak en de abnormale flowkarakteristieken, substantieel te reduceren is men dan ook genoodzaakt tot levenslange anticoagulatietherapie. Het nadeel van deze chronische antistollingsbehandeling is dat deze iatrogeen hemorragische complicaties kan induceren [10]. Het betreft hier voornamelijk een verhoogde incidentie van cerebrale, gastro-intestinale en retroperitoneale bloedingen. Er dient dan ook een strikte en regelmatige monitoring van de stolling plaats te vinden, die ondermeer afhankelijk is van de positie van de klep. Voor de aortaklep dient de INR-waarde, de international normalized ratio voor de protrombinetijd, gelegen te zijn tussen de 2 en 2,5. Mechanische kleppen zijn voornamelijk geïndiceerd bij patiënten onder de 65 jaar en in geval van chronische voorkamerfibrillatie. Bij 60% van de klepvervangingen wordt geopteerd voor
13
deze mechanische structuur [22]. Dit kleptype is echter niet compatibel met een zwangerschap omwille van de teratogeniciteit van anticoagulantia. Bovendien zijn de mechanische kleppen niet geluidsloos en dit kan als storend ervaren worden door de patiënt. Verder vormt infectieuze endocarditis een onfrequente maar potentieel ernstige complicatie. Structurele degeneratie van de klepstructuur is in vergelijking met de bioprothesen een eerder zeldzame oorzaak van falen en is in die gevallen te wijten aan fabricagefouten. De meeste mechanische kleppen gaan echter levenslang mee.
1.4.2 Bioprothesen
De bioprothesen of xenografts zijn hybride structuren bestaande enerzijds uit een biologisch materiaal en anderzijds uit een synthetisch ondersteuningsmateriaal (figuur 5). De meeste van deze kleppen worden ontwikkeld uitgaande van porcien klepweefsel of bovien pericard, dat chemisch gecrosslinkt wordt door middel van glutaaraldehyde [10,23]. Voor het behoud van de juiste vorm kan dit geheel ondersteund worden door een stent van metaal of plastiek. Meer recent werden ook stentloze kleptypes ontwikkeld, die geacht worden over een beter hemodynamisch profiel te beschikken [19] (figuur 5). De kunststofring waarmee de klep wordt ingehecht, is na drie maanden reeds voldoende ingegroeid en bedekt met endotheel. Omwille van de biocompatibiliteit van dit type klep vergt deze na een initiële drie maand lange behandeling met anticoagulantia, geen verderzetting van deze therapie ad vitam. Bij de vervaardiging worden deze kleppen onderworpen aan verschillende bewaringsprocedures, wat maakt dat ze substantieel verschillend zijn van de natuurlijke hartkleppen. Buiten het feit dat bioprothesen ruimte-innemende structuren zijn met slechts een matige hemodynamiek voor kleine diameters, ligt het voornaamste nadeel hem in de progressieve klepdegeneratie door calcificatie en niet-calciumgebonden mechanismen. Onder deze laatste wordt de nefaste inwerking van mechanische krachten of proteolytische processen op het gefixeerde weefsel bedoeld [10,21]. Degeneratieve calcificatie, op basis van een immuungemedieerde reactie [6] en op basis van glutaaraldehyde interacties [18], wordt echter geacht de voornaamste reden te zijn van falen van de bioprothesen [24]. Dit proces van primair klepfalen kent een versneld verloop bij jonge personen, waarschijnlijk omwille van hun reactieve immuunsysteem [25]. Deze niet-levende kleppen hebben dan ook slechts een beperkte levensduur. Tien jaar na implantatie wordt 20 tot 30% van deze bioprothesen dysfunctioneel en meer dan 50% zal falen omwille van degeneratie binnen de 12 tot 15 jaar postoperatief [26]. Net zoals bij de mechanische klep kan eveneens infectieuze endocarditis optreden. Bioprothesen vinden op dit
14
ogenblik hun toepassing voornamelijk bij patiënten boven de 65 jaar en in gevallen waar er een contra-indicatie bestaat voor anticoagulantia [10].
Figuur 5 I. Bioprothese met stent II. Stentloze bioprothese III.Homograft
1.4.3 Homografts
Homografts, ook wel allografts genoemd, zijn gecryopreserveerde humane donorkleppen [23] (figuur 5). Daar ze van menselijke oorsprong zijn, zijn het de vervangende structuren die qua morfologie en fysiologie het dichtst aanleunen bij de natuurlijke klep [27], het minst trombogeen zijn en bijgevolg geen anticoagulatie vereisen. Homografts vertonen een excellent hemodynamisch profiel en kennen slechts een lage graad van infectie in vergelijking met andere soorten van klepprothesen, wat hen tot eerste keuze maakt in geval van endocarditis [28]. Bij implantatie kennen deze homografts vaak technische moeilijkheden. De majeure beperking is echter het kritisch tekort aan beschikbaar donorweefsel [29]. De lange termijn resultaten van deze avitale structuur zijn gunstig tot 15 jaar na de implantatie. Daarna treedt een proces op dat vergelijkbaar is met dit van de bioprothesen, namelijk een snelle degeneratie en verkalking met uiteindelijk structureel klepfalen. Omwille van het beperkt aantal
donoren
worden
de
homografts
niet
gematched
op
basis
van
immunohistocompatibiliteit. Hoewel cryopreservatie de cellulariteit reduceert, vertonen de structuren daardoor een blijvende expressie van allo-antigenen. Deze antigenen kunnen het immuunsysteem van de gastheer triggeren en resulteren in een rejectie van de graft of aanleiding geven tot progressieve degeneratie [27].
1.5 Tissue‐engineering
1.5.1 Algemeen
Het World Technology Panel Report stelt als definitie voor tissue-engineering: ‘De toepassing van wetenschappelijke en technologische principes en methoden om fundamenteel inzicht te verwerven in de structuur-functierelatie van nieuwe en pathologische weefsels alsook de 15
ontwikkeling van biologische substituten ter vervanging, instandhouding of verbetering van de weefselfunctie’ [23]. Tissue-engineering is met andere woorden een beloftevolle techniek in het huidige biotechnologisch onderzoek waarbij men poogt, via een experimentele benadering, een levende substraat te creëren ter vervanging van de deficiënte natuurlijke structuur. Binnen deze nieuwe wetenschappelijke discipline wordt er op cardiovasculair gebied eveneens onderzoek verricht.
1.5.2 Hartklep
tissue‐engineering
Alle huidige, artificiële kleppen kennen hun specifieke beperkingen. Mechanische kleppen zijn trombogeen en vereisen een levenslange therapie met anticoagulantia, wat op zijn beurt nieuwe risico’s induceert. De xenografts en homografts zijn dan weer minder duurzaam omwille van een proces van primaire klepdegeneratie [27,29-31]. Algemeen kan gesteld worden dat ongeveer 60% van de patiënten, ongeacht het kleptype, een ernstige prothese gerelateerde complicatie ontwikkelen binnen de tien jaar postoperatief [32]. Daarenboven zijn zowel mechanische als biologische kleppen dus avitale, lichaamsvreemde structuren met gebrek aan enig fysiologisch adaptatiepotentieel [28]. De optimale nieuwe hartklep zou over een duurzame en vitale structuur moeten beschikken met een biocompatiebele samenstelling en een natuurlijke dynamiek zonder trombogeniciteit of risico op infectie [23,29]. Van belang hierbij is dat de klep in staat dient te zijn tot groei, herstel en remodellering [25]. Dit geldt a fortiori voor de pediatrische en jongvolwassen patiëntenpopulatie waar enig groeipotentieel van de klep vereist is om de noodzaak tot heroperatie te beperken [33,34] en waarbij daarenboven voor het herstel van congenitale deformaties vaak kleine klepmaten vereist zijn, die tot hiertoe niet commercieel beschikbaar zijn [21]. Een duurzame tissue-engineerde klep houdt dus de ontwikkeling in van een vitale en dynamische constructie die net als de natieve hartklep opgebouwd is uit gespecialiseerde cellen en extracellulaire matrixcomponenten. Deze valvulaire structuur dient de aortaklep te mimeren op structureel en functioneel vlak, om zo te kunnen beantwoorden aan het groeipotentieel en te kunnen remodelleren in antwoord op fysiologische veranderingen in de lokale mechanische krachten op dezelfde manier als de natuurlijke klep dit doet [23,24,29]. Verscheidene punten dienen hierbij in acht genomen te worden: de opbouw van de dragende extracellulaire structuur of scaffold, de celbron voor de repopulatie van deze matrix en de omgeving waarin de repopulatie van de matrix kan plaatsvinden [27]. 16
Reeds verschillende technieken werden in de literatuur beschreven. Twee methoden kunnen hier weerhouden worden: enerzijds de methode waarbij men matrices ontwerpt uit synthetische biodegradeerbare polymeren [25,35], anderzijds deze waarbij men uitgaat van gedecellulariseerde biologische klepmatrices [6]. Voor beide vormen is het mogelijk dat de matrices in vitro, vóór de implantatie, reeds bezaaid worden met biocompatiebele cellen door gebruik te maken van een bioreactor of dat de repopulatie van de matrices in vivo plaatsvindt na de implantatie [23,30] (figuur 6). Als celbron wordt er geopteerd voor autologe recipiëntcellen [36] die na verloop van tijd in staat zijn zelf de extracellulaire matrix componenten te vervangen.
Figuur 6
Beschrijving van de mogelijke strategieën ter generatie van een tissue engineerde aortaklep. Het is mogelijk uit te gaan van een polymere of extracellulaire matrix om deze vervolgens in vitro reeds te bezaaien met de geschikte cellen. Er kan eveneens getracht worden de matrix primair in te planten om vervolgens de endogene cellulaire repopulatie in vivo te laten plaatsvinden.
Hoewel verschillende synthetische polymeren beloftevol zijn, is er reden om te geloven dat natuurlijk afgeleide biologische materialen bijkomende voordelen kunnen bieden, die het de moeite maken hen verder te onderzoeken. In deze studie zal tissue-engineering van de aortaklep dan ook benaderd worden vanuit deze laatste methode, namelijk door gebruik te maken van de unieke microstructuur van een extracellulaire porciene hartklepmatrix. De natieve aortaklepmatrix beschikt namelijk reeds over de gewenste driedimensionele anatomische architectuur, die onmiddellijk kan instaan voor de nodige biomechanische functie [37-39]. Verder kan deze als intrinsieke template dienen voor autologe celaanhechting en -ingroei [36,37]. Men gaat ervan uit dat de humane gedifferentieerde of progenitorcellen in staat zijn in vitro of in vivo de extracellulaire matrix te repopuleren en vervolgens te revitaliseren, waardoor een duurzaam levend weefsel gecreëerd wordt.
17
Het lange termijn succes van een klep, ontwikkeld op basis van tissue-engineering, zal afhankelijk zijn van de mogelijkheid van de cellulaire en extracellulaire matrixcomponenten om de normale functie op te nemen en om door middel van groei, herstel en remodellering in te spelen op de structurele veranderingen [40]. In de ideale toestand is deze extracellulaire basisstructuur biologisch inert, wat maakt dat de matrix geen specifieke immunologische of aspecifieke inflammatoire reactie teweegbrengt. De procedure voor het bekomen van een adequate scaffold of matrix blijkt dan ook cruciaal.
1.6 Immunogene
respons
Het is van belang bij de constructie van een aortaklep, uitgaande van dierlijk weefsel, rekening te houden met de biologische respons van het humane lichaam op de geïmplanteerde structuur [27,31]. De introductie van biomateriaal in het lichaam zet een sequentie van kritische gebeurtenissen in gang. Ondanks uitgebreid onderzoek blijven echter vele van de betrokken mechanismen ongekend [31]. De mismatch in immunohistocompatibiliteit tussen humaan en porcien weefsel is uitgesproken [23]. Xeno-antigenen worden hierbij door de gastheer per definitie herkend als lichaamsvreemd [38]. Voor de implantatie van porciene klepstructuren in het humane lichaam dient de antigeniciteit van de donor-ent dan ook op een adequate manier uitgeschakeld te worden.
1.6.1 Cross‐linking
Voor het onderdrukken van de antigeniciteit worden de huidige xenogene bioprothesen gecrosslinkt. Cross-linking is het proces waarbij chemisch covalente verbindingen tot stand komen tussen ketens van cellulaire en extracellulaire matrixproteïnen. Deze fixatiemethode vermindert
de
weefselantigeniciteit.
Naast
het
feit
dat
deze
fixatiemethode
de
weefselantigeniciteit vermindert, beschermt het de matrices bovendien tegen enzymatische degradatie, verhoogt het de stabiliteit van het materiaal en geeft het een zekere vorm van steriliteit. Het laat eveneens toe verschillende klepmaten in voorraad te hebben voor chirurgisch gebruik [41]. Verschillende cross-linking reagentia, zoals glutaaraldehyde, carbodiimide, epoxy componenten, het natuurlijk voorkomende genipin en andere nietchemische agentia zoals foto-oxidatie en UV-straling, werden reeds gehanteerd voor de fixatie van weefsels [40-43]. Voor de meerderheid van deze crosslinkers bleef het gebruik echter beperkt omwille van cytotoxiciteit, instabiliteit na verloop van tijd of onvoldoende onderzoek hierrond. Glutaaraldehyde is het klinisch meest gebruikte en tevens meest bestudeerde fixatief voor bioprothesen. Deze crosslinker creëert covalente bindingen tussen 18
de primaire aminogroepen van collageneus weefsel en de reactieve functionele aldehydegroepen van glutaaraldehyde [44]. Dit resulteert in de vorming van inter- en intramoleculaire bindingen in collageenmoleculen [43], wat leidt tot een nauw gecrosslinkte matrix [10] . Deze chemische fixatie maakt het aanwezige cellulair materiaal echter avitaal en verhindert bovendien een mogelijke repopulatie van de extracellulaire matrix met gastheercellen omwille van de residuele cytotoxiciteit [43]. Verder werden na deze cross-linking alternaties van de mechanische eigenschappen beschreven [44] en kon calcificatie van het weefsel door binding van calciumionen aan aldehyde geobserveerd worden [40]. Buiten deze specifieke nadelen kon eveneens worden aangetoond dat zich in glutaaraldehyde gefixeerde xenografts nog steeds zowel humorale als celgemedieerde immuunresponsen voordoen [37,45]. Uit onderzoek, in ondermeer het ratmodel, bleek dat de cellulaire restanten, aanwezig in deze gefixeerde kleppen, verantwoordelijk waren voor de residuele chronische antilichaamvorming en immuunrejectie en de daaruit volgende vroege graftdegeneratie en -calcificatie [33,37,45]. De huidige cross-linking strategieën blijken dus de antigeniciteit slechts suboptimaal te kunnen maskeren wat de bioprothesen onderhevig maakt aan immuungemedieerde degeneratieve en calcificatieprocessen. Al deze eigenschappen maken de glutaaraldehyde-gefixeerde weefsels ongeschikt voor tissueengineering doeleinden.
1.6.2 Decellularisatie
Binnen
de
tissue-engineering
dacht
men
door
middel
van
decellularisatie,
de
immunogeniciteit van porciene hartkleppen te kunnen elimineren [39]. Uit onderzoek bleek namelijk dat varkenscellen het alfa-1.3-Gal epitoop tot expressie brengen [23]. Dit porciene majeure xeno-antigen, een dissacharide galactose, is ondermeer gelokaliseerd op porciene endotheelcellen en fibrocyten. De interactie van de alfa-Gal specifieke IgG immunoglobulines met de terminale disaccharide structuur galactose-1,3-galactose initieert de activatie van de klassieke complement pathway, wat resulteert in een rejectie met uiteindelijk graft falen [40,46]. Gebaseerd op de veronderstelling dat de antigenen, die de immuunrespons van de acceptor mediëren, daadwerkelijk celgeassocieerd zouden zijn, werden er vervolgens procedures ontwikkeld ter decellularisatie van vers klepweefsels [24,46]. Het decellularisatieproces heeft tot doel het op efficiënte wijze verwijderen van het aanwezige cellulair materiaal en het residuele debris [38] en dit met het intact laten van de essentiële 19
structurele componenten van de extracellulaire matrix [37]. Er wordt beweerd dat decellularisatiebehandeling de immunogeniciteit vermindert en daardoor de duurzaamheid van de scaffold verbetert [23]. In de literatuur werden reeds verschillende methoden beschreven voor het vervaardigen van acellulaire weefselmatrices [23,36]. Deze decellularisatietechnieken houden in dat men tracht de aanwezige cellen te verwijderen op basis van detergent, enzymatische en mechanische processen of een combinatie hiervan [37,38].
Onderzoek
heeft
ondertussen
echter
aangetoond
dat
de
verschillende
decellularisatieprocedures onderling sterk verschillen in de volledigheid waarmee ze cellulair materiaal verwijderen [27,46]. Na onvolledige decellularisatie kunnen er antigene celrestanten achterblijven die de nidus vormen voor calcificatie en degeneratie [27,37,47]. Anderzijds is het intact laten van de structuur van de matrix eveneens belangrijk omdat agressieve weefselbehandeling de mechanische en elastische eigenschappen kan beïnvloeden [27]. Een gouden standaard voor de decellularisatie van porciene valvulaire weefsels werd nog niet ontwikkeld. Wel kon worden aangetoond dat een aantal multistaps detergent-enzymatische extractieprocessen uiteindelijk resulteerden in een intacte doch compleet acellulaire matrix [48-50]. De bekomen acellulaire structuren leken dan ook gebruikt te kunnen worden als biologisch inerte matrixen veilig voor implantatiedoeleinden [38]. Theoretisch vertonen gedecellulariseerde kleppen een lage immunogeniciteit en een hoge resistentie tegen calcificatie. Verder maakt repopulatie door autologe gastheercellen regeneratie van de extracellulaire matrix mogelijk [40]. Deze acellulaire weefsels werden echter overschat met betrekking tot hun biologische inertheid. Decellularisatie van vasculair weefsel resulteert wel degelijk in een reductie van de humorale respons [51] en van monocyten- en lymfocytenrecrutering, maar de migratie van polymorfonucleairen, die betrokken zijn bij de vroege immuunrespons, wordt nauwelijks beïnvloed [33,34]. Ondanks de decellularisatie lokt de celvrije porciene matrix een belangrijke vreemdlichaam inflammatoire reactie uit met recrutering van trombocyten en secretie van pro-inflammatoire cytokines/chemokines die monocyten en neutrofielen aantrekken [7]. In een latere fase worden er door de aanwezige antigenen eveneens lymfocyten geactiveerd. De betrokken monocyten en macrofagen worden verantwoordelijk geacht voor weefselcalcificatie omdat ze over de capaciteit beschikken te differentiëren tot een osteoblastlike calcium vormend fenotype [33]. Op deze plaatsen van ossificatie kan eveneens een infiltatie met B- en T- lymfocyten geobserveerd worden [11].
20
Deze residuele immunostimulatoire activiteit in vitro van gedecellulariseerd porcien weefsel correleert met de bevindingen in vivo van de SynergraftTM, de eerste commercieel beschikbare gedecellulariseerde porciene hartklep [34,39,46]. Uit het rapport bleek het catastrofale falen van deze klep, na implantatie bij vier pediatrische patiënten, te wijten aan de forse
inflammatoire,
vreemdlichaam
immuunrespons
uitgelokt
door
de
xenogene
collageenmatrix en aan het uitblijven van autologe cellulaire repopulatie [7,34]. Hiernaast kon een studie aantonen dat contact van gedecellulariseerd porcien weefsel met humaan bloed in vitro leidt tot sequentiële IgG depositie en activatie van de klassieke complement pathway met daaropvolgend adhesie en activatie van polymorfonucleairen [39]. Hieruit kan besloten worden dat decellularisatie van een porciene hartklep de cellulaire componenten kan verwijderen maar dat deze niet adequaat alle antigenen van de extracellulaire matrix verwijdert. Een studie heeft de extracellulaire matrix eveneens recent beschreven als modulator van de immuunrespons [52]. Het doel is om de nog onbekende, residuele xenogene componenten van de gedecellulariseerde porciene extracellulaire matrix te kunnen identificeren en maskeren door middel van fixatie of cross-linking. Hierbij kon een studie reeds aantonen dat chemische fixatie van acellulaire matrices met glutaaraldehyde niet resulteert in een verdere reductie van de antigeniciteit [53]. Momenteel wordt dus onderzoek verricht naar de ontwikkeling van een nieuwe techniek.
1.6.3 Gammastraling
Gammaradiatie is tegenwoordig een algemeen aanvaarde methode voor de sterilisatie van medisch
instrumentarium
[54].
In
de
literatuur
werd
eveneens
een
nieuwe
decellularisatiemethode beschreven die gebruik maakt van polyethylene glycol en gammaradiatie en die tot complete decellularisatie van de matrix leidt. Deze techniek verwijdert op effectieve wijze het alfa-Gal-epitoop, dat geïdentificeerd is als het majeure xeno-antigeen verantwoordelijk voor de hyperacute rejectie bij porciene xenotransplantatie [40]. Gammabestraling veroorzaakt hierbij lyse van de porciene cellen door middel van directe en de indirecte mechanismen. Daarenboven wordt gammaradiatie in de literatuur beschreven als een alternatieve methode voor weefselfixatie. Een recente studie heeft namelijk aangetoond dat gammastralen de alfa-1 en alfa-2 subunits van collageen crosslinken [55].
21
1.7 Doelstelling
experimenteel
onderzoek
Dit experimenteel onderzoek beoogt het verminderen van de immunogeniciteit van porciene aortaklepmatrices voor hun toepassing binnen de tissue-engineering. Een eliminatie van de antigeniciteit is vereist ten einde implantatie van deze kleppen mogelijk te maken en klepdegeneratie tegen te gaan. Van belang hierbij is dat het proces ter voorkoming van de immunogene respons op zich geen toxische nevenwerkingen induceert, noch de mechanische eigenschappen van de klep negatief beïnvloedt. Uit onderzoek is reeds gebleken dat de decellularisatie op zichzelf onvoldoende effectief is in het reduceren van de immunogeniciteit. Niet alleen het cellulair materiaal van xenogene aortakleppen maar eveneens de extracellulaire matrixcomponenten bevatten antigenen, die verantwoordelijk gesteld worden voor de immuungemedieerde respons opgewekt na implantatie. Het doel bestaat erin deze xenoantigenen te maskeren door middel van chemische fixatie of cross-linking. Daar chemische fixatie echter interfereert met een latere repopulatie door autologe recipiëntcellen, is men op zoek naar een niet cytotoxische cross-linking methode. In de literatuur wordt gammaradiatie beschreven als een alternatieve methode voor weefselfixatie. In deze studie wordt het effect van verscheidene dosissen gammaradiatie op de mechanische sterkte, de ultrastructurele integriteit, de biocompatibiliteit en immunogeniciteit van gedecellulariseerde porciene matrices geëvalueerd aan de hand van het subcutane ratmodel. Het uiteindelijke doel is het creëren van een celvriendelijke matrix geschikt voor het gebruik in tissue-engineering.
22
II Materialen
en
methoden
II.
A
Literatuurstudie
Een eerste luik van deze scriptie omvatte een verkennende literatuurstudie. Hierbij werden verschillende domeinen geëxploreerd, gaande van de anatomie en functie van het hart met de aortaklep meer in het bijzonder, over de specifieke pathologie van klep met de mogelijke therapeutische opties, tot het domein van de tissue-engineering en de problematiek van de immunogeniciteit. Het onderzoek naar de nodige relevante literatuur betreffende deze onderwerpen gebeurde via aangepaste zoekprogramma’s op het internet en via opzoekingen in de biomedische bibliotheek. Via MeSH werden de meest toepasselijke zoektermen opgespoord. Vervolgens werden databanken zoals PubMed-Medline, ISI Web of Knowledge en Science Direct doorzocht. Raadpleging van deze elektronische databanken leverde vaak een groot aantal resultaten. Deze konden gereduceerd worden via het instellen van limieten, zoals onder meer de datum van publicatie. Via de laatst vermelde databank was het eveneens mogelijk de impactfactor van de betreffende tijdschriften na te gaan. Door tijdens de loop van het project de zoekvraag regelmatig te hernieuwen werden de meest recente researchrapporten en reviews, die handelden over de specifieke onderwerpen, weerhouden. Naast de artikels werden boeken geraadpleegd waarvan een aantal online via Access Medicine en MD Consult. Na dit voorbereidend literatuuronderzoek kon vervolgens met meer achtergrondkennis overgegaan worden tot de geplande experimentele benadering.
II.
B
Experimenteel
onderzoek
Bij de proefopstelling gaat men uit van biologische aortakleppen, gedisseceerd uit varkensharten. Om deze kleppen van porciene oorsprong te ontdoen van alle cellulair materiaal worden ze onderworpen aan een decellularisatieprocedure. Na afloop van dit proces worden de bekomen matrices histologisch onderzocht om de volledigheid van het proces van celextractie na te gaan. In een volgende stap worden de acellulaire klepbladen, bestaande uit de resterende extracellulaire matrixcomponenten, gecrosslinkt aan de hand van verschillende dosissen gammastralen. Na radiatie worden de mechanische eigenschappen van deze scaffolds getest. De acellulaire gamma gecrosslinkte klepbladen worden vervolgens geïmplanteerd in het subcutane ratmodel teneinde de immunogene respons in vivo te onderzoeken. Na specifieke overlevingstijden van de proefdieren worden de implantaten 23
geëxplanteerd, waarna een macroscopische en microscopische explantaatanalyse aan de hand van licht- en elektronenmicroscopie plaatsvindt, evenals een bepaling van de antilichaamtiter op de pre- en postimplantatie afgenomen bloedstalen. Het bekomen serum wordt daarbij onderzocht op de aanwezigheid van IgG-antilichamen tegen de respectievelijk ingeplante matrices. Deze experimenten werden uitgevoerd in het laboratorium ‘Experimentele Cardiale Heelkunde’ van de faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen in Gent en in het laboratorium van de faculteit Bio-ingenieurswetenschappen in Melle. De onderzoeken vonden plaats in samenwerking met de vakgroep Anatomie, Embryologie, Histologie en Medische Fysica en de vakgroep Toegepaste Analytische en Fysische Chemie van de faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen. Als student werd mij de opportuniteit geboden deel te nemen aan dit experimenteel onderzoek. Meer in het bijzonder mocht ik meewerken aan de dissectie en de decellularisatie van de hartkleppen. Verder kreeg ik eveneens de kans mee de in- en explantaties van de klepbladen bij de proefdieren uit te voeren. Bij de studie van de explantaten kon ik de elektronenmicroscopische analyse van nabij volgen. De overige analyses werden verricht in verschillende laboratoria. De hieruit bekomen resultaten worden in deze scriptie gerapporteerd en geïnterpreteerd.
2.1 Dissectie
van
de
aortakleppen
De voor dit onderzoek gebruikte porciene aortakleppen waren afkomstig van varkensharten uit een erkend slachthuis. Van hieruit werden tweemaal twintig harten op ijs getransporteerd naar het laboratorium van de onderzoekseenheid ‘Experimentele Heelkunde’ van het Universitair Ziekenhuis Gent. De porciene harten werden daar gespoeld met een fysiologische zoutoplossing en vervolgens werd van elk hart het deel van de aorta met de drie klepbladen op steriele wijze vrij gedissecteerd, via het insnijden van de ventrikels en het doorhalen van de coronairen. Hierbij werd gelet op het ter plaatse laten van een centimeter lange aortawand boven de klepbladen en een vijf millimeter kleine rand myocardium onder de klepbladen. Ter oriëntatie van de structuur werd ook een mitralisklepblad ter plaatse gelaten. De klepbladen werden pas na afloop van de decellularisatieprocedure uit de aortawand vrij geprepareerd, wat het hanteren van de kleppen tijdens de decellarisatie vergemakkelijkte en bijgevolg het aanbrengen van potentiële schade aan de matrices verminderde. De bekomen weefsels werden
24
gespoeld in een 0.9%-zoutoplossing die phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF, 1µM, Sigma, Bornem, België) en antibiotica bevatte, namelijk een combinatie van streptomycine (100 µl/l) en penicilline (100 µl/l) (Sigma, Bornem, België). Vervolgens werden ze in deze oplossing gepreserveerd in afwachting tot de decellularisatie.
2.2 Decellularisatieprocedure
De voor het onderzoek gebruikte porciene klepweefsels werden primair onderworpen aan een gepatenteerde detergent-enzymatische behandeling. Bij dit decellularisatieproces werd strict gewerkt volgens de richtlijnen van het protocol. Dit protocol was reeds eerder uitgewerkt door de onderzoeksgroep en is gebaseerd op een combinatie van procedures, vroeger reeds succesvol beschreven in de literatuur [48-50]. Dit vijf dagen durende behandelingsproces vond plaats in de laboratoria van de bioingenieurswetenschappen van de Gentse universiteit in Melle. Het kon van start gaan na het exact afwegen van de noodzakelijke chemische stoffen en het juist bereiden van de stockoplossingen. Het multistaps detergent-enzymatisch proces veroorzaakte primair een lyse van de celmembranen. Hiertoe werden de weefsels met behulp van steriel materiaal ondergedompeld in
een
mild
alkalische,
hypotone
trishydroxymethylaminomethaan
gebufferde
natriumchloride-oplossing (Tris of TBS, pH 8.0) en vervolgens in een hypertone Tris gebufferde natriumchloride-oplossing met Triton X-100 (pH 8.0) (Biorad, Eke, België). Het detergent, Triton X-100, werd toegevoegd voor de extractie van de cytoplasmatische elementen. Aan beide oplossingen werd tevens PMSF (1µM), penicilline-streptomycine (respectievelijk 100 µL/L elk) en gebutyleerd hydroxyanisole antioxidans (BHA, 50 µM) toegevoegd (Sigma, Bornem, België). Beide processen vonden plaats in gesteriliseerde kolven, die voorzien waren van een magneetroerder en die gedurende 24 uur op een magnetische roerplaat op 4°C in een koelkamer geplaatst werden. Tijdens deze procedure konden proteasen vrijkomen uit de gelyseerde porciene cellen en dit kon aanleiding geven tot autolyse van de extracellulaire matrixproteïnen. Inactivatie van deze proteasen werd bekomen via het toevoegen van PMSF, het bufferen van de oplossingen evenals door rekening te houden met de temperatuur en inwerkingstijd. Na een tweevoudige spoeling van 10 minuten in een gebalanceerde zoutoplossing (Hanks Balanced Salt Solution) die het effect van PMSF tenietdoet, werden de weefsels behandeld 25
met een digestieve procedure op basis van een enzymatische oplossing van DNase I, RNase A, trypsine en fosfolipasen A2, C en D (Sigma, Bornem, België). Daar men met dit proces een klieving en volledige digestie van de resterende nucleïnezuren, eiwitten en de cellulaire membraanlipiden beoogt, werd deze enzymatische behandeling tweemaal uitgevoerd, telkens gedurende 45 minuten met de kolf geplaatst in een warmwaterbad op 37°C. De laatste stap in dit proces is een 24 uur lange grondige spoeling van de matrixen in een calcium- en magnesium-vrije Hanks gebufferde chelatie-oplossing onder constant roeren bij 4°C. Deze spoeling is erop gericht alle potentieel cytotoxische of immuunreactieve stoffen te verwijderen. Bij dit langdurige behandelingsproces werd bacteriële contaminatie vermeden door steriel te werk te gaan en door het toevoegen van antibiotica aan de verschillende oplossingen. Het multistapsproces verwijdert de cellulaire membranen, de nucleïnezuren, de lipiden en de cytoplasmatische componenten terwijl het onoplosbare fibrillaire collageen en elastine van de extracellulaire matrix bewaard blijven. De weefselstructuren werden na afloop van het proces bewaard in een steriel recipiënt gevuld met HBSS, antibiotica (100 µl/l) en fungizone (100 mg/l) op 4°C tot de volgende stappen van het onderzoek konden plaatsvinden
2.3 Histologische
analyse
na
decellularisatie
2.3.1 Macroscopische
analyse
na
decellularisatie
Na het decellularisatieproces werden in het laboratorium experimentele heelkunde uit elke weefselstructuur de drie aortaklepbladen op steriele wijze gedissecteerd. Het macroscopisch aspect van de klepbladmatrices werd bestudeerd. Vervolgens werden de matrices bewaard op 4°C in steriele recipiënten gevuld met HBSS, antibiotica (100 µl/l) en fungizone (100 mg/l) en afgesloten met parafilm.
2.3.2 Microscopische
analyse
na
decellularisatie
Het morfologische aspect van de matrix en de ultrastructurele integriteit van de extracellulaire matrixcomponenten werden vervolgens gecontroleerd aan de hand van histologisch onderzoek. Dit om na te gaan of de decellularisatie geresulteerd had in acellulaire doch intacte matrices. Er zijn verschillende methoden beschikbaar om de efficiëntie van de decellularisatieprocedure na te gaan.
26
2.3.2.1 Lichtmicroscopie
na
decellularisatie
Een matrix werd na afloop van de decellularisatie gefixeerd in 4% fosfaat gebufferde formaldehyde (Merck, Darmstadt, Duitsland) en ingebed in paraffine. Vijf micron (µm) paraffinecoupes werden gemaakt aan de hand van een rotatiemicrotoom. Vervolgens werd een standaard histologische hematoxyline-eosine (H&E) kleuring uitgevoerd om aanwezigheid van enig residueel cytoplasmatisch of nucleair materiaal na te gaan. 2.3.2.2 Elektronenmicroscopie
na
decellularisatie
Om de volledigheid van het decellularisatieproces eveneens ultrastructureel na te gaan, werd de matrix gefixeerd met 2% glutaaraldehyde in natrium cacodylaat buffer. Het specimen werd vervolgens met behulp van 2% osmium tetroxide (OsO4) nogmaals gefixeerd en ingebed in epoxyhars. De morfologie van de ultradunne 60 nm secties werd onderzocht aan de hand van een transmissie-elektronenmicroscoop.
2.4 Bestraling
klepbladen
De bekomen acellulaire matrices werden voor het crosslinken van de extracellulaire matrixcomponenten onderworpen aan verschillende dosissen gammaradiatie. Gammastraling, bekomen via het radio-isotoop Cobalt 60, is onzichtbare elektromagnetische straling met een zeer kleine golflengte van 10-13 meter en een zeer hoge energetische waarde. De matrices werden bestraald in een 0.9% NaCl-oplossing bij een temperatuur van 20°C aan een constante dosisgraad van 2.16 Gray (Gy) per minuut. Dit is de laagste dosisgradiënt die per minuut kan ingesteld worden in een Theratron 780C Cobalt 60-teletherapietoestel (Theratronics, Ontario, Canada). Twintig van de acellulaire matrices werden gedurende 4.63 min. blootgesteld aan 2.16 Gray, vervolgens twintig andere klepbladen gedurende 23.16 min en als laatste twintig klepbladen gedurende 46.3 min. Dit resulteerde in telkens twintig klepbladen bestraald met een totale dosis van respectievelijk 10, 50 en 100 Gy gammastraling.
2.5 Mechanische
sterktemetingen
De functionele integriteit van de structurele extracellulaire matrixcomponenten van de bestraalde, acellulaire matrices werd geëvalueerd aan de hand van mechanische sterktemetingen. Per dosis gammastraling werden drie matrices onderworpen aan een meting van de treksterkte. Drie niet-bestraalde acellulaire matrices werden gebruikt als controle. De geteste
27
matrices werden niet geïmplanteerd, vermits de extracellulaire matrix door de metingen beschadigd werd. De bekomen resultaten kunnen als representatief beschouwd worden voor de klepbladen geïmplanteerd in het subcutane ratmodel. Alle metingen werden verricht bij kamertemperatuur en de weefsels werden vochtig gehouden met een isotone zoutoplossing.
2.5.1 Arbeid
tot
maximale
belasting
Een Loyd LF Plus universeel materiaal testapparaat (Analis NV, Suarleé, Belgium), voorzien van een 10 Newton (N) ladingscel, werd gebruikt voor de analyses in combinatie met een nieuw
geconstrueerd
software
‘Compress’
testprogramma
voor
de
elektronische
dataregistratie. Een volledig klepblad werd hierbij door middel van twee metalen plaatjes over een 6-mm-opening geplaatst. Vervolgens werd het klepblad door de opening benaderd met een balprobe van 4.43 mm aan een snelheid van 5 mm/min. Na de applicatie van een preload van 0.2 N werd de test gestart en de balprobe verder in het klepblad gedrukt tot een maximale belasting van 8.5 N werd bereikt. Het gebied onder de stress-spanningscurve van de drempelbelasting tot aan de maximumbelasting werd bepaald, wat toelaat de arbeid tot maximale belasting in kilojoule (kJ) te berekenen.
2.5.2 Elasticiteit
Bij de beschreven proefopstelling kon eveneens de elasticiteit, uitgedrukt in Newton per meter (N/m), berekend worden. De waarden voor de elasticiteit werden bekomen vanuit de helling van de stress-spanningscurve tussen 3 en 8 N.
2.6 Proefdieren
Voor deze experimentele benadering werd geopteerd voor twintig, zes weken oude Wistar ratten, rond de 250 gram elk, gekweekt in de Harlan Laboratoria (Horst, Nederland). De ratten werden naar willekeur ingedeeld in vier groepen van vier proefdieren, van groep A tot en met groep D. Alle proefdieren konden gedurende een week acclimatiseren in het universitair animalarium vooraleer gestart werd met de onderzoeken. De dieren kregen onbeperkt de mogelijkheid tot het drinken van water. De voeding werd stopgezet twaalf uur voor de ingreep. Verder werd bij de dierenverzorging ‘The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals’ [56] nageleefd.
28
Alle protocols met betrekking tot de proefdieren werden goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierenexperimenten van de Universiteit Gent, Project No. ECP 07/41.
2.6.1 Subcutane
ratmodel
Subcutane implantatie van biologische kleppen in het ratmodel wordt algemeen gebruikt om in vivo de inflammatoire reactie, de immunogene respons en het calcificatiepotentieel na te gaan [40,37]. Buiten het feit dat het een relatief eenvoudige proefopstelling betreft met lage kosten is dit subcutane model geschikt bevonden omwille van het feit dat de biologische en morfologische eigenschappen van de klepbladen een analoog maar versneld verloop kennen als deze binnen de klinische setting [28]. Verder werd gekozen voor jonge proefdieren daar hun immunologisch systeem net zoals bij pediatrische patiënten zeer reactief is.
2.6.2 Implantatie
Tijdens de implantatie werden de dieren onder anesthesie gebracht door middel van inhalatie van isoflurane, met een inductiedosis van 4% en een onderhoudsdosis van 1 à 2% isoflurane. De monitoring van de anesthesie tijdens de ingreep verliep via capnografie. Verder volgde er eveneens een continue controle van de ademhaling, de reflexen, de lichaamstemperatuur en het hartritme. Na inductie van de anesthesie werd preoperatief via de staartvene 1 ml bloed afgenomen voor serumcentrifuge. Voor het goede verloop van de operatieve ingreep werd elke rat gefixeerd in ruglig. Het operatievlak werd verwarmd om hypothermie van de rat te vermijden. De abdominale vacht werd geschoren, gereinigd en grondig ontsmet. Vervolgens werd ter hoogte van elk van de vier abdominale kwadranten een subcutane laterale incisie gemaakt van 1 cm. Door middel van deze incisies werden er per rat ventraal vier subcutane holten gecreëerd voor de implantatie van de klepbladen (figuur 7). De bestraalde klepbladen werden voorafgaand aan de implantatie zorgvuldig gespoeld in 0.9% NaCl en als volgt op steriele wijze ingeplant: het 10 Gray bestraalde klepblad in het rechter bovenste kwadrant van het proefdier, het 50 Gray bestraalde klepblad in het linker bovenste kwadrant, in de onderste kwadranten het 100 Gray bestraalde klepblad en het niet-bestraalde controle klepblad respectievelijk rechts en links. De wondranden werden gesloten door middel van een doorlopende resorbeerbare hechting met Polysorb 3/O en nadien ontsmet met Chlortetra spray. Als postoperatieve analgesie werd subcutaan Temgesic 0,02 mg/kg toegediend. Na de ingreep werd elke rat individueel in een verwarmde kooi geplaatst tot voldoende ontwaken. Na het uitwerken van de verdoving werden alle dieren ondergebracht in de kooien van het facultair animalarium en verder gevoed volgens een standaarddieet. Ter identificatie werd de 29
staart van elk proefdier gelabeld; dit maakte tweedagelijkse postoperatieve opvolging via evaluatieformulieren mogelijk. Alle implantaties, evenals de opvolging, verliepen zonder complicaties.
Craniaal
Ventraal 10 Gray
50 Gray
100 Gray
Controle
Caudaal
Figuur 7 Implantatie van de matrices in het ventraal in de rat. Het maken van een subcutane incisie voor de insertie van het 100 Gy klepblad in het rechter onderste kwadrant.
2.6.3 Explantatie
Tijdens de explantatie werden de dieren zoals bij de implantatie onder anesthesie gebracht door middel van inhalatie van isoflurane, met een inductiedosis van 4% en onderhoudsdosis van 1 à 2% isoflurane. Een continue monitoring werd eveneens gegarandeerd. Na inductie van de anesthesie werd via de staartvene een tweede maal bloed afgenomen, ditmaal postimplantatie. Voor het goede verloop van de operatieve ingreep werd elke rat ook hier in ruglig gefixeerd. De abdominale vacht werd geschoren en grondig ontsmet. Vervolgens werden de vier abdominale holtes geopend en de daarin aanwezige klepbladen werden geëxplanteerd. Na explantatie werden de wonden gesloten door middel van een doorlopende hechting met Polysorb 3/O. Na afloop van deze ingreep werd de rat gesacrifieerd door middel van de inhalatie van een overdosis isoflurane. De explantaties van de klepbladen en de sacrificatie van de vier proefdieren per groep vonden wekelijks plaats, groep A na één week, groep B na twee weken, groep C na drie weken en groep D na vier weken overleving postimplantatie. Per proefdier werd na explantatie zowel het 10 Gy, 50 Gy, 100 Gy als het controle klepblad verdeeld in drie segmenten door een snede te maken vanaf de vrije kleprand tot aan de basis. 30
Elk segment werd voor verdere analyse bewaard in een specifiek recipiënt. Op willekeurige basis werd een van de drie segmenten genomen, bevroren op -80°C en bewaard in een droge cryotube voor antilichaambepaling. Een ander segment werd gefixeerd in 4% formaldehyde (formol) voor histologische examinatie en een derde segment werd gefixeerd in 2% glutaaraldehyde in cacodylaatbuffer voor transmissie elektronenmicroscopie. Zowel pre- als postimplantatie werd via de staartvene van de rat een bloedstaal afgenomen. Van deze bloedstalen werd na 10 minuten centrifugatie op 4000 rpm het bekomen serum ingevroren in een eppendorf voor de antilichaambepaling.
2.7 Explantaatanalyse
Na afloop van de explantatie werden de geëxplanteerde klepbladen macroscopisch en histologisch onderzocht.
2.7.1 Macroscopische
explantaatanalyse
Na explantatie werden de klepbladen macroscopisch geëvaleerd. Elk klepblad werd gemeten en gefotografeerd.
2.7.2 Histologische
explantaatanalyse
2.7.2.1 Lichtmicroscopie
De stalen voor histologie werden bekomen van de 10 Gy, 50 Gy, 100 Gy en controle klepbladen via de explantatie na een, twee, drie en vier weken. Ze werden gefixeerd in 4% fosfaat gebufferde formaldehyde (Merck, Darmstadt, Duitsland) en ingebed in paraffine. Vijf micron (µm) paraffinecoupes werden gemaakt en gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E) en trichroom Masson. De coupes werden beoordeeld onder een Axiovert S 100 lichtmicroscoop (Zeiss, Zaventem, België). Hematoxyline en eosine kleuring is een van de meest toegepaste technieken voor dierlijke histologie, waarbij ondermeer zuur nucleair materiaal blauwpaars aankleurt en het basische cytoplasma samen met de proteïnestructuren een roodpaarse kleur vertonen. Met behulp van deze kleuring is het mogelijk een eventuele immunologische reactie na te gaan. Trichoom Masson kleuring wordt gebruikt voor het aantonen van bindweefsel, voornamelijk collageen, dat door deze procedure een blauwe kleur verkrijgt [8].
31
2.7.2.2 Elektronenmicroscopie
De stalen van de wekelijks bekomen 10 Gy, 50 Gy, 100 Gy en controle klepbladen werden gefixeerd met 2% glutaaraldehyde in natrium cacodylataat buffer. Het specimen werd vervolgens gepostgefixeerd met 2% osmium tetroxide (OsO4) en ingebed in epoxyhars. Ultradunne 60 nm secties werden gemaakt en onderzocht door middel van een Jeol 1200 EXII transmissie elektronenmicroscoop op 80 keV (Zaventem, België). Deze techniek wordt aangewend om de cellulaire reactie en het fibrillair collageen en elastine ultrastructureel te bekijken.
2.7.3 Antilichaambepaling
Een antilichaambepaling werd uitgevoerd op de pre- en postimplantatie afgenomen bloedstalen. Het bekomen serum werd onderzocht op de aanwezigheid van IgG-antilichamen tegen de respectievelijk ingeplante matrices. De optische densiteit van het serum werd bepaald op 405 nm na een verdunning van 1/10 000 in een oplossing van isotone PBS bufferoplossing en 0.05% polysorbaat 20, een stabilisator voor membraan-immunoassay . De bevroren stalen van de controle en bestraalde matrices werden gewogen en op mechanische wijze gehomogeniseerd in 2 ml PBS buffer op 700 toeren per minuut gedurende 10 minuten op ijs. De homogenaten werden vervolgens gecentrifugeerd op 10,000 g en 18°C gedurende 30 minuten. Van elk supernatans werd één honderdste van een microliter gebruikt voor de proteïnebepaling en dit gebruik makend van een biureet reactieproces (BCA, biuret copper reduction – bicinchoninic acid reaction, Sigma). Het overblijvende supernatans werd gebruikt voor de antilichaam IgG-bepaling door middel van een ELISA of Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay. De ELISA-procedure, zoals beschreven door Rooster et al., werd toegepast met minimale aanpassingen voor wat de coatingconcentraties betreft [57]. Het supernatans van de controle en bestraalde klepbladen werd hiertoe aangebracht op een plastic coatingplaatje. Vervolgens werd hierop het rattenserum, maar daarin mogelijks de antilichamen gericht tegen porcien weefsel, aangebracht. De gebonden antilichamen konden gedetecteerd worden door toevoeging van 100 µl van een aangepaste verdunning van konijn antirat-immunoglobuline antilichamen (SouthernBiotech, Birmingham, USA) chemisch geconjugeerd met het peroxidase enzyme en gebufferd met 1% varkensserum (DakoCytomation, Glostrup, Denmark). De immunoglobulinen konden aangetoond worden doordat het enzym aanwezig op de anti-immunoglobuline antilichamen een reactieproduct vormde. De absorptie hiervan 32
op 405 nm (OD405) werd spectrofotometrisch bepaald na een uur op 37°C en dit geldt als maat voor de hoeveelheid aanwezige antilichamen.
2.8 Statistische
analyse
Statistische analyses werden uitgevoerd op de data bekomen van de mechanische sterktemetingen enerzijds en van de antilichaambepaling anderzijds. ANOVA on Ranks (Kruskal-Wallis) werd gebruikt voor de niet-parametrische data-analyse van de arbeid tot maximumbelasting en de elasticiteit. De One Way Analysis of Variance (ANOVA) (Student’s t-Test) werd toegepast voor de parametrische analyse van de IgG-titers indien er homogeniciteit kon worden aangetoond door de Kolmogorov-Smirnov (K-S) en/of de Shapiro-Wilk (S-W) Test. Data werden weergegeven als gemiddelde ten opzichte van de standaarddeviatie. Een p-waarde kleiner dan 0.05 werd als significant beschouwd (SPSS 15.0, SPSS Inc, Chicago, IL, USA).
33
III Resultaten
3.1 Structuur
na
dissectie
De aortakleppen werden samen met het omgevend weefsel vrij geprepareerd uit de varkensharten via het insnijden van het ventriculaire myocard een 5-tal mm onder de klepbladen, door aan de rechter- en linkerzijde respectievelijk de coronaria dextra en sinistra door te halen en via het insnijden van de aortawand ongeveer een cm boven de klepbladen. Ter oriëntatie van de structuur werd eveneens het aanliggend mitralisklepblad ter plaatse gelaten. Onderstaande figuur 8 toont het aspect van de structuur bekomen na dissectie. Figuur 8 Structuur bekomen na dissectie. De aortawand met een deel van de coronair en een rand onderliggend ventriculair myocard kunnen worden waargenomen.
3.2 Histologische
analyse
na
decellularisatie
3.2.1 Macroscopische
analyse
na
decellularisatie
Na decellularisatie blijft het macroscopisch aspect van de aortaklep bewaard, zoals getoond op figuur 9. Wel kan worden opgemerkt dat de aortawand en het klepblad een bleker aspect vertonen, wat verklaard kan worden door het feit dat het endothelium, dat normalerwijs de vasculaire en valvulaire weefsels aflijnt, niet langer aanwezig is bij acellulaire structuren.
A
B
Figuur 9 (A) Gedecellulariseerde weefselstructuur.Het macroscopisch aspect blijft bewaard. (B) Structuur van het klepblad na decellularisatie.
34
3.2.2 Microscopisch
analyse
na
decellularisatie
3.2.2.1 Lichtmicroscopie
na
decellularisatie
De cellulariteit van een niet-gedecellulariseerde natieve porciene aortaklep, zoals aangetoond op hematoxyline en eosine kleuring is weergegeven in figuur 10A. Deze histologische coupes geven een beeld van de natuurlijke densiteit van de natieve cellen en de architectuur van de extracellulaire klepmatrix. Na de decellularisatieprocedure was de porciene matrix volledig acellulair zoals te zien op figuur 10B. Bij vergelijking van beide coupes kan worden opgemerkt dat de decellularisatie zorgt voor een volledige verwijdering van het endotheel en de interstitiële cellen die normaal aanwezig zijn in de valvulaire structuur. Bij histologische verificatie konden noch residuele cellen, noch celnuclei of cellulair debris worden aangetroffen. Verder toont de H&E-kleuring een intacte architectuur van de extracellulair matrix aan.
Figuur 10 Hematoxyline-eosine kleuring. (A) Een intact natief porcien aortaklepblad, de interstitiële cellen kleuren donker paars aan. (B) Een gedecellulariseerde varkensmatrix. Noteer de afwezigheid van enig cellulair materiaal. 10x vergroting.
3.2.2.2 Elektronenmicroscopie
na
decellularisatie
Door middel van transmissie-elektronenmicroscopie kon eveneens een acellulaire matrix worden aangetoond na afloop van de decellularisatieprocedure. Ondanks het detergentenzymatisch proces bleef de specifieke matrixarchitectuur met de ventricularis, spongiosa en fibrosa nauw bewaard. De collageenvezels behouden hun histologisch patroon zoals aangetoond op figuur 11.
35
Figuur 11 Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). (A) Toont dat de collageneuze scaffold van de gedecellulariseerde klepmatrices intact is. Schaal 200 µm. (B, detail) De acellulaire matrix toont een normaal bandpatroon, dat een kenmerk is van de eind-aan-eind en de laterale stapeling van de triple helixstructuur van de collageenvezels. Ondanks de decellularisatieprocedure is deze collageen dwarsstreping bewaard gebleven. Schaal 50 µm.
3.3 Mechanische
sterktemetingen
3.3.1.1 Arbeid
tot
maximale
belasting
Tijdens de proefopstelling werd de gemiddelde arbeid tot maximale belasting (kJ) ± de standaarddeviatie (SD) van de klepbladen berekend. Voor de controles (0 Gy) leverde dit de volgende waarde: 6.29 ± 0.62 kJ. De meting van de 10 Gy bestraalde klepbladen gaf een gemiddelde van 3.78 ± 0.09 kJ. 50 Gy bestraling aan, wat resulteerde in een gemiddelde van 3.65 ± 0.08 kJ. De gemiddelde arbeid tot maximumbelasting voor de 100 Gy bestraalde klepbladen bedroeg 3.77 ± 1.07 kJ. De mechanische treksterkte nam significant (p<0.001) toe in alle geïrradieerde matrices in vergelijking tot de controles (figuur 12). Er kon geen significant verschil worden aangetoond in treksterkte tussen de verschillende radiatiegroepen (p>0.05). Figuur 12 Box-and-Whiskerplot met op de y-as de arbeid tot maximale belasting uitgedrukt in kilojoule (kJ) ten opzichte van matrices bestraald met respectievelijk 0, 10, 50 en 100 Gray op de x-as.
36
3.3.1.2 Elasticiteit
De elasticiteit nam significant (p<0.001) af in vergelijking tot de controles eenmaal de klepbladen bestraald waren. Daarenboven werd de elasticiteit van de klepbladen significant gereduceerd vanaf een dosis van 50-100 Gy in vergelijking tot de 1 Gy en 10 Gy bestraalde klepbladen (p=0.001) (figuur 13). De gemiddelde elasticiteit (N/m), ± de standaarddeviatie (SD), was voor de controles 8861.16 ± 813.79 N/m. De meting van de 10 Gy bestraalde klepbladen gaf een gemiddelde van 14137.08 ± 729.51 N/m. De meting van de 50 Gy bestraalde klepbladen resulteerde in een gemiddelde van 17054.85 ± 1713.04 N/m. De gemiddelde elasticiteit van de 100 Gy bestraalde klepbladen bedroeg 17400.81 ± 3931.47 N/m. Figuur 13 Box-and-Whiskerplot met op de yas de elasticiteit uitgedrukt in Newton per meter (N/m) ten opzichte van matrices bestraald met respectievelijk 0, 10, 50 en 100 Gray op de x-as.
3.4 Explantaatanalyse
3.4.1 Macroscopische
explantaatanalyse
De explanatatie van de klepbladen bij de proefdieren wordt weergegeven in figuur 14. Figuur 14 Explantatie van het 10 Gy klepblad na 1 week. H: hoofd, S: Staart.
37
Na 1 week waren de 50-100 Gy bestraalde en controle klepbladen licht nodulair verdikt. De 10 Gy bestraalde klepbladen behielden hun normale afmetingen en vertoonden geen macroscopische afwijkingen (figuur 14). Na twee (figuur 15A) tot drie (figuur 15B) weken waren alle bestraalde en controle matrices prominent nodulair verdikt. De kleppen behielden hun normale afmetingen. Na vier weken (figuur 15C) was de normale klepstructuur niet meer herkenbaar, de kleppen waren hierbij sterk nodulair verdikt en verkleind.
Figuur 15 Macroscopische explantaatanalyse van de klepbladen: (A) na twee weken implantatie, (B) na drie weken implantatie, (C) na vier weken implantatie.
3.4.2 Microscopische
explantaatanalyse
3.4.2.1 Lichtmicroscopie
explantaat
De histologische analyse door middel van hematoxyline en eosine kleuring toonde de aanwezigheid van inflammatoire lymfocytaire infiltraten in alle geëxplanteerde klepbladen. Enkele neutrofielen en fibroblasten waren aanwezig. Figuur 16 toont representatieve histologische coupes van de 10, 50, 100 Gy bestraalde kleppen en de controle matrices na een week implantatie. In vergelijking tot de andere matrices toonden de 10 Gy bestraalde matrices slechts een minimale inflammatoire celinfiltratie (figuur 16A). Deze matrices werden gekenmerkt door een milde inflammatoire reactie met de aanwezigheid van een klein aantal lymfocyten. Fibroblast ingroei was duidelijk meer uitgesproken in de 10 Gy scaffolds (figuur 17). Daarnaast toonde de trichroom Masson kleuring van de 10 Gray bestraalde matrix aan dat de collageenstructuur van dit klepblad goed bewaard bleef (figuur 18). Alle 10 Gy matrices vertoonden hetzelfde aspect. Zelfs na 4 weken toonden de 10 Gy matrices slechts een milde inflammatoire lymfocytaire reactie. In de overige matrices was een groot aantal infiltrerende inflammatoire cellen aanwezig. Deze ernstige lymfocytaire respons leidde bij deze kleppen tot bindweefselvorming met hierin neovascularisatie.
38
Figuur 16 Hematoxyline Eosine kleuring van 10 Gy (A), 50 Gy (B), 100 Gy (C) en controle matrices (D) na 1 week implantatie. 10x vergroting. Schaal 50µm.
Figuur 17 Hematoxyline en Eosine kleuring van fibroblast ingroei in 10 Gy bestraalde matrix na 1 week implantatie . 100x vergroting. Schaal 10 µm.
Figuur 18 Masson trichroom kleuring van 10 Gy bestraalde matrix toonde een goed bewaarde collageenstructuur. Na 1 week implantatie. 10x vergroting. Schaal 50 µm
39
3.4.2.2 Elektronenmicroscopie
explantaat
Transmissie-elektronenmicroscopisch onderzoek heeft aangetoond dat de collageenmatrix goed bewaard gebleven is in de 10 Gy bestraalde kleppen (figuur 19A). De collageenfibrillen zijn intact. De dwarsstreping van de collageenvezels is vergelijkbaar met die van de controles (figuur 19D). Degeneratie van het collageen en elastine is aanwezig in de 50 en 100 Gy matrices (figuur 19B-C). De collageenvezels vertonen geen duidelijk gealigneerd patroon meer, maar zijn gedegradeerd en vormen losse gedesoriënteerde vezels. Condensatie van de collageenvezels is aantoonbaar. De beschadigde collageenvezels hebben hierdoor hun karakteristieke dwarsstreping verloren.
Figuur 19 Elektronenmicroscopische foto’s van de geëxplanteerde kleppen na 1 week. (A) Toont de intacte collageenmatrix van de 10 Gy bestraalde kleppen. (B-C) De 50 en 100 Gy matrices tonen collageen degeneratie en condensatie. (D) De controle matrix toont een goed bewaarde collageenstructuur. Schaal 500 nm.
40
3.5 Antilichaambepaling
De optische densiteit (OD) waarden van de IgG-antilichamen pre-implantatie tegen de controle matrices (0 Gy) na 1 week zijn: 0.091, na 2 weken: 0.094, na 3 weken: 0.098 en na 4 weken: 0.093. De OD-waarden postimplantatie gericht tegen de controle matrices (0 Gy) na 1 week zijn: 0.475, na 2 weken: 0.98, na 3 weken: 1.15 en na 4 weken: 1.07. De optische densiteit van IgG-antilichamen postimplantatie tegen de controle matrices en de verschillende gamma bestraalde matrices na 4 weken worden geïllustreerd in figuur 4. De IgG-antilichamen vertonen een significante stijging met toenemende bestralingsdosis zowel na 1 week (p=0.001), 2 weken (p=0.002) als na 4 weken (p=0.001). Na 4 weken zijn de antilichamen het hoogste tegen 100 Gy bestraalde matrices gevolgd door de controles. De 10 Gy bestraalde matrices wekken een lagere dosis antilichamen op (figuur 20).
Figuur 20 Box-and-Whiskerplot. Optische Densiteit (OD) van IgGantilichamen postimplantatie ten opzichte van controles (0 Gy) en gamma bestraalde matrices na 4 weken.
41
IV Discussie
De aortaklep is onontbeerlijk voor een efficiënte cardiale functie. Een goede klepwerking vereist de structurele integriteit en het gecoördineerd verloop van verscheidene kritische componenten. Het is de karakteristieke cellulaire en extracellulaire matrixbiologie die deze valvulaire structuur in staat stelt, zijn complexe functie te vervullen. Wanneer deze klep echter getroffen wordt door pathologie, zal dit aanleiding geven tot aortaklepdysfunctie. Dit proces kan lange tijd asymptomatisch verlopen maar zal uiteindelijk aanleiding geven tot klinische symptomen van aortaklepstenose of insufficiëntie. Het eindstadium kleplijden gaat in vele gevallen gepaard met een significante morbiditeit en mortaliteit. Daar medicamenteuze therapie niet in staat is deze toestand van valvulair malfunctie en linkerventrikelfalen substantieel te beïnvloeden en gezien de infauste prognose, dient men in vele gevallen over te gaan tot een heelkundige ingreep. De toenemende incidentie van deze problematiek maakt dat hartklepvervangingen wereldwijd frequent worden uitgevoerd. Bij de huidige procedure maakt men hierbij routinematig gebruik van een mechanische of een biologische klep. Sinds het begin van de cardiale chirurgie rond 1960 is de chirurgische techniek evenals het design van de gebruikte kunstkleppen sterk geëvolueerd. Dit heeft dan ook kunnen leiden tot een aanzienlijke terugdringing van het operatieve risico. Het is echter bekend dat de huidige artificiële hartkleppen elk nog specifieke beperkingen kennen. Mechanische kleppen vergen een therapie met anticoagulantia ad vitam en biologische kleppen zijn onderhevig aan een proces van progressieve degeneratie. Prothese gerelateerde complicaties treden dan ook niet onfrequent op. De verklaring hiervoor dient gezocht te worden in de complexiteit van de natieve aortaklep enerzijds en in de beperkingen inherent aan de prosthetische kleppen anderzijds. Daarenboven zijn deze commercieel beschikbare kunstkleppen avitale, lichaamsvreemde structuren, die niet over de mogelijkheid van groei, herstel of remodellering beschikken. Vooral bij kinderen en jongvolwassenen brengt dit specifieke problemen met zich mee. Een beloftevolle techniek voor de generatie van een levende aortaklep is deze van de tissueengineering. Een tissue-engineerde aortaklep, ontwikkeld uitgaande van een drie dimensionele synthetische of biologische matrix bezaaid met autologe cellen, bezit namelijk het potentieel om de beperkingen van de huidige beschikbare kunstkleppen te overkomen. 42
Binnen deze nieuwe discipline wordt heden veel onderzoek verricht naar het gebruik van porciene hartkleppen, omdat deze reeds vele van de structurele en functionele kenmerken van de natieve aortaklep in zich dragen. Bij implantatie van dit porcien weefsel in het humane lichaam is het van belang de immunogeniciteit van het xenogene implant uit te schakelen. De antigeniciteit van de huidige bioprothesen poogt men door middel van cross-linking met glutaaraldehyde te reduceren. Deze behandeling resulteert echter in een avitale structuur die niet geschikt is voor toepassing in tissue-engineering. Onderzoek toonde daarenboven aan dat de cellulaire restanten in glutaaraldehyde gefixeerde kleppen nog steeds verantwoordelijk blijven voor zowel een humorale als celgemedieerde immunologische respons [37,45]. Uit daaropvolgend onderzoek bleek dat porciene cellen het alfa-gal epitoop exprimeren, een majeur xeno-antigen bij varkens dat verantwoordelijk geacht wordt voor het opwekken van humane antilichamen [23]. Vanuit deze bevinding is men vervolgens verschillende decellularisatieprocedures gaan ontwikkelen die erop gericht zijn het cellulair materiaal van verse porciene kleppen te verwijderen [24,46]. Tot voor kort bleek echter geen enkele methode succesvol, daar via analyses na decellularisatie werd vastgesteld dat ofwel de cellen onvoldoende geklaard werden of dat het proces schade toegebracht had aan de extracellulaire componenten. Recent onderzoek toonde aan dat een multistaps detergent-enzymatisch proces wel in staat is te resulteren in een volledig celvrije doch structureel intacte matrix. Met deze acellulaire structuur leek men dan ook een biologisch inerte matrix ontworpen te hebben, klaar voor gebruik [48-50]. Korte termijn successen van de implantatie van deze gedecellulariseerde matrices werden in het diermodel beschreven. De weinige dierexperimentele studies op lange termijn konden echter aantonen dat deze protocols faalden. Bovendien is het desastreuze gevolg van een commerciële gedecellulariseerde hartklep, namelijk de Synergraft®, duidelijk moeten worden toen vier pediatrische patiënten stierven kort na de implantatie ervan. Hieruit kan besloten worden dat de verwijdering van cellulair materiaal geen adequate eliminatie van de xenoantigenen verzekert, daar zelfs celvrije matrices een immuunrejectie uitlokken op basis van een vreemd lichaam type inflammatoire reactie. De huidige studies richten zich dan ook voornamelijk op het ontwikkelen van methoden die de residuele immunostimulatoire activiteit van de extracellulaire matrix kunnen tenietdoen. 43
Bij de experimentele studie hier beschreven, heeft men getracht de immunogeniciteit van porciene matrices te elimineren door de extracellulaire xenoantigenen te maskeren via fixatie of cross-linking. Van belang hierbij was dat het proces ter voorkoming van de immunogene respons op zich geen toxische nevenwerkingen mocht induceren, noch de mechanische eigenschappen van de klep negatief beïnvloeden. Daar chemische fixatie revitalisatie met gastheercellen onmogelijk maakt, werd er bij deze experimentele studie geopteerd voor het gebruik van een behandeling met gammaradiatie. Uit onderzoek kwam gamma bestraling namelijk naar voor als een alternatieve cross-linking methode met potentieel tot het maskeren van de xeno-antigenen. Deze studie was er dan ook op gericht het effect te evalueren van verschillende dosissen gammaradiatie op de mechanische sterkte, de ultrastructurele integriteit, de biocompatibiliteit en immunogeniciteit van gedecellulariseerde porciene matrices. Daartoe werden de porciene kleppen vooreerst onderworpen aan een gepatenteerde detergentenzymatische decellularisatieprocedure. Na afloop van het proces werd de acellulariteit evenals de intactheid van de extracellulaire matrix door middel van een microscopische analyse bevestigd. Vervolgens werden de bekomen acellulaire matrices ter cross-linking onderworpen aan gammastraling. Onderzoek van Inoue et al. had reeds aangetoond dat een collageengel blootgesteld aan gammaradiatie een cross-linking gaf van de alfa-1 en alfa-2 ketens van het collageen [55]. Gammastraling wordt voornamelijk toegepast voor de sterilisatie van medisch materiaal; in droge of gevriesdroogde toestand wordt daarbij algemeen gebruik gemaakt van een dosis van 25 kiloGray. Het is eveneens mogelijk weefsels in hun oorspronkelijke gehydrateerde toestand te bestralen. Onderzoek toonde echter aan dat matrices opgebouwd uit gehydrateerde hyalurongels, bestraald met 1.5 kGy tot 13.5 kGy, degeneratie vertoonden, waarschijnlijk te wijten aan de generatie van vrije radicalen [58]. Daarom werd besloten in deze studie de klepbladen te bestralen in hun oorspronkelijke gehydrateerde toestand (0.9% NaCl) door gebruik te maken van lage dosissen gammastralen, namelijk 10 Gy, 50 Gy en 100 Gy. Daar ook eerdere experimenten binnen dit laboratorium toonden dat een dosis van 0.50 kGy leidde tot een destructie van de collageenstructuur en een omvorming van de klepbladen tot starre lederachtige structuren. Decellularisatie in combinatie met gammaradiatie kan potentieel veranderingen veroorzaken in de biomechanische eigenschappen van de matrix. Om het effect hiervan na te gaan werden 44
de klepbladen na de procedure mechanisch getest met behulp van geschikte apparatuur. De resultaten van de metingen gaven aan dat na behandeling de mechanische sterkte van de bestraalde matrices significant toenam en de elasticiteit significant afnam in vergelijking met de controle klepbladen. Hoewel er geen significant verschil in sterkte kon worden geobserveerd tussen de verschillende radiatiegroepen, was er daarentegen tussen de groepen wel een significant verschil meetbaar in elasticiteit. De elasticiteit van de kleppen bestraald met 50 en 100 Gy was sterk gereduceerd ten opzichte van de klepbladen blootgesteld aan 10 Gy. Het is duidelijk dat alternaties in de driedimensionele structuur van het collageen leiden tot een veranderde rigiditeit van het weefsel. Gouk et al. demonstreerden dat de treksterkte van AlloDerm, een humane acellulaire weefselmatrix, toenam door bestraling met een lage dosis gamma maar afnam wanneer de dosis werd opgedreven [59]. Daarnaast toonde het onderzoek dat de elasticiteit van de bestraalde Alloderm werd gereduceerd. Hafeez et al. rapporteerden daarenboven dat irradiatie met 25 kGy gammastralen een afname van de mechanische sterkte en de elasticiteit veroorzaakte van gevriesdroogd pericard [60]. De in deze studie bestudeerde matrices vertoonden daarentegen geen significante toename in mechanische sterkte met toenemende irradiatie. De elasticiteit werd echter wel significant gereduceerd vanaf een dosis van 50 Gy. Hierbij dient te worden opgemerkt dat in deze studie veel lagere dosissen gehanteerd werden in vergelijking met de literatuur en dat de matrices hier bestraald werden in een gehydrateerde toestand. De immunogeniciteit van de gamma bestraalde acellulaire matrices werd in vivo geëvalueerd aan de hand van het subcutane ratmodel. Na explantatie werden de klepbladen hierbij eerst histologisch
onderzocht.
De
lichtmicroscopische
analyses
toonden
lymfocytaire
inflammatoire infiltraten aan in alle controle matrices. Alle bestraalde matrices toonden eveneens een groot aantal inflammatoire cellen die in de klep infiltreerden met uitzondering van de 10 Gy klepbladen. Irradiatie resulteerde daar in een reductie van lymfocytaire inflammatie. In contrast daarmee bleek de graad van inflammatie van de hogere bestralingsdosissen (50, 100 Gy) niet te verschillen van deze van de controles. In vergelijking met alle andere matrices was fibroblastingroei het meest uitgesproken in de 10 Gy scaffolds. Verhoging van het bestralingsniveau heeft een duidelijk effect op de extracellulaire matrix. Aan de hand van elektronenmicroscopisch onderzoek kon worden aangetoond dat enkel de normale collageenstructuur van de 10 Gy bestraalde matrices bewaard bleef. 45
In deze klepbladen konden geen tekenen van degeneratie worden teruggevonden. De ultrastructurele integriteit van het collageen en elastine werd bij de hoge dosissen van gammairradiatie (50-100 Gy) daarentegen wel duidelijk gemodificeerd in vergelijking met de controle matrices. Het collageen van deze matrices was gedegenereerd en vormde gedesoriënteerde klompen van vezels. Verder werd er ook een inkrimping en condensatie van de collageenvezels vastgesteld. Het is reeds aangetoond dat intensieve gammabestraling (2-30 kGy), zoals gebruikt bij sterilisatieprocedures,
significante
structurele
wijzigingen
veroorzaakt
zoals
collageencondensatie en inscheuring van de collageenvezels [59]. In onze studie werd gebruik gemaakt van een matige expositieprocedure (dosisgraad van 2.16 Gy/min). Typisch voor sterilisatiedoeleinden ligt de dosisgradiënt ongeveer 100 maal hoger. Het is gekend dat een verlengde expositietijd een kritische factor vormt voor weefselbeschadiging, daar structurele modificaties van de matrices proportioneel zijn tot de duur van expositie. De studieresultaten duiden erop dat stralingsdosissen boven de 10 Gy de collageenvezels en het elastine beschadigden. Volgens deze studie moet er bijgevolg voor gepleit worden dat klepbladen in gehydrateerde toestand niet mogen bestraald worden met dosissen boven de 10 Gy om zo de intacte architectuur van de scaffold te behouden. In vochtige weefsels veroorzaakt radiatie via de radiolyse van watermoleculen een vrijstelling van vrije radicalen die cross-linkingsreacties induceren in de collageenmoleculen [61]. Het is gekend dat deze effecten dosisafhankelijk zijn en dat ze een dosisdependente afname van de mechanische eigenschappen veroorzaken [62]. Dit zou de destructie van de collageenmatrix kunnen verklaren bij dosissen boven de 10 Gy. Verder zou dit aanleiding kunnen geven tot calcificatie daar deze gewoonlijk begint op plaatsen van onderbrekingen in de collageenvezels. De immunogene respons werd eveneens nagegaan via de antilichaambepaling in het bloed van de proefdieren. De resultaten van de optische densiteit van de IgG-antilichamen duiden erop dat de antistoffen rechtevenredig toenemen met stijgende dosis van gammaradiatie. Na vier weken zijn de antilichamen significant hoger voor de 100 Gy bestraalde klepbladen terwijl de 10 Gray bestraalde matrices na vier weken slechts lage titers van IgG-antilichamen uitlokken.
46
Er wordt in deze studie verondersteld dat de minimale gastheerrespons tegen de 10 Gy bestraalde matrices het gevolg is van een dosisdependente cross-linking die inflammatoire infiltratie voorkomt. Recent werd eveneens aangetoond dat gammaradiatie significante wijzigingen induceert in de samenstelling van de vetzuren en peptiden [63]. Deze modificaties worden geacht de immunogeniciteit van de bestraalde scaffolds te verminderen. Een beperking van deze studie is dat per proefdier de vier porciene matrices subcutaan geïmplanteerd werden ter hoogte van de abdominale wand. Het subcutane ratmodel wordt algemeen gebruikt om de immunogeniciteit van de bestudeerde implantaten in vivo na te gaan. Hierbij is het tot op heden niet duidelijk of de aanwezigheid van multiple implantaten in eenzelfde proefdier de uitkomst al dan niet beïnvloedt. Verder dient benadrukt te worden dat de klepbladen in dit model niet blootgesteld werden aan mechanische krachten, die wel aanwezig zijn in vivo in het circulatoir systeem. Vermoedelijk zou de immuunreactie van de klepbladen meer uitgesproken zijn binnen een dynamische opstelling. De volgende stap zou de implantatie zijn van 10 Gy bestraalde aortaklepmatrices in de pulmonale positie van het schaapmodel gedurende zes maanden. Eveneens dient daarbij het effect van gammabestraling op andere belangrijke extracellulaire matixcomponenten zoals elastinevezels en glycosaminoglycanen onderzocht te worden. Uit het geheel van deze experimentele studie kan besloten worden dat de gastheer immuunrespons niet volledig onderdrukt kan worden door middel van gamma-irradiatie. Bovendien veroorzaken toenemende niveaus van bestraling een vernietiging van de extracellulaire matrix van de porciene klepbladen. Het is gebleken dat alle scaffolds aanleiding geven tot een forse immuunrespons behalve de matrices bestraald met 10 Gy. Deze laatste vertonen weinig inflammatoire activiteit en daarenboven kan er ingroei van fibroblasten in deze 10 Gy bestraalde klepbladen geobserveerd worden. Daar men geen sluitende conclusie in het voordeel van de behandeling met gammastralen kan trekken maar er daarnaast ook geen overtuigende nadelige indicaties zijn gevonden van een bestraling aan lage dosis, dient toekomstig onderzoek dan ook tweeledig te gebeuren. Enerzijds zal er moeten getracht worden om het interval van bestraling te verkleinen zodoende het ideale niveau van gammabestraling te vinden voor acellulaire porciene matrices. Anderzijds kunnen alternatieven methoden geëxploreerd worden voor de eliminatie van de matrix immunogeniciteit.
47
Algemene beschouwing Het doel van valvulaire tissue-engineering is de generatie van een functionele structuur die cellen bevat, welke in staat zijn tot continue remodellering van de extracellulaire matrix. Deze nieuwe klep zou zowel structureel als biomechanisch de natieve humane hartklep mimeren. Daar de conventionele therapie vaak geen voldoening biedt, bestaat er wel degelijk nood aan een tissue-engineerde klep. Er is reden om aan te nemen dat porciene kleppen, waarvan het antigene materiaal geëxtraheerd of gemaskeerd is, in het humane stelsel kunnen functioneren. Men gaat er vanuit dat deze matrices in staat zijn tot repopulatie voor of onmiddellijk na de implantatie bij de patiënt. Een volledige gerepopuleerde matrix zou op deze wijze als het ware onzichtbaar worden voor het immuunsysteem van de gastheer. Eigen endotheelcellen zouden hierbij de structuur aflijnen en de interstitiële cellen, die de klep kunnen invaderen, zouden in staat zijn de extracellulaire matrix te remodelleren. Bij deze remodellering zou een nieuwe matrix gevormd worden door de cellen van de gastheer, ter vervanging van de langzaam degenererende porciene matrix. Een matrix die in staat is eventuele structurele schade te herstellen, die zich kan aanpassen aan het hemodynamische milieu en die tevens groeipotentieel in zich draagt in geval van implantatie in een zich nog ontwikkelend stelsel. Op theoretische basis is tissue-engineering van een aortaklep dan ook veelbelovend. De evolutie in de wetenschap en de aanzienlijke vooruitgang, die men reeds geboekt heeft omtrent inzicht in fysiologische en pathologische processen in de aortaklep, hebben de ontwikkeling van een levende hartklep sterk gestimuleerd. Diverse benaderingswijzen werden reeds uitgetest en verschillende disciplines werden noodzakelijkerwijs bij dit proces betrokken. Ondanks onderzoek vanuit verschillende invalshoeken is men er echter tot op heden niet in geslaagd dit te verwezelijken. De processen die instaan voor het welslagen van tissue-engineering zijn vaak complexer dan op het eerste zicht gesteld. Er is dus nood aan doorgedreven onderzoek dat er in slaagt de onderliggende mechanismen te ontrafelen. Het lijkt hierbij van belang dat de huidige wetenschapelijke inspanningen gebundeld worden om van hieruit meer coöperatief de huidige geboekte resultaten te optimaliseren.
48
Na jaren van onderzoek zijn verschillende laboratoria onafhankelijk van elkaar het doel reeds dichter genaderd door de ontwikkeling van effectieve decellularisatieprocedures. In tegenstelling tot de verwachting is het probleem van de immunogene respons hiermee echter nog niet opgelost. Dit bleek ondermeer uit de klinische ervaring met gedecelulariseerde matrices daar deze voor enkele pediatrische patiënten desastreuze gevolgen kenden. Hieruit blijkt de nood aan een grondige identificatie van de processen die aan de basis liggen van de residuele immunogeniciteit om gericht nieuwe strategiën te ontwikkelen, waarbij de aanwezige middelen efficiënt kunnen worden ingezet. Verder lijkt het hierbij belangrijk de mogelijke technieken eerst in vitro zowel op korte als lange termijn te evalueren om vervolgens na voldoende overtuigende studies over te gaan tot de preklinische in vivo setting. Tissue-engineering heeft tot hiertoe meer beloofd dan wat het reeds kon realiseren. De ontwikkeling van een biocompatiebele aortaklep is dus nog niet voor morgen. Ondanks dit blijft het wel een beloftevolle techniek. Wereldwijd wordt dan ook blijvend innovatief onderzoek verricht in verschillende laboratoria dat uiteindelijk poogt te resulteren in de ontwikkeling van een levende klepvervangende structuur. Een tissue-engineerde aortaklep dient superieur te zijn aan de huidige beschikbare bioprothesen om hun plaats in te nemen bij de behandeling van hartklepziekten. De grootste uitdaging voor toekomstig onderzoek bestaat erin de weefselantigenen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de geobserveerde residuele immuunrespons en verder methoden te ontwikkelen gericht op de adequate maskering van de antigenen. Het doel is het creëren van een celvriendelijke matrix geschikt voor het gebruik in tissue-engineering, met uiteindelijk de mogelijkheid voor toepassing van een vitale klepvervangende structuur binnen de klinische praktijk.
49
V Referenties
Artikels en boeken 1. SCHOEN F.J. : Evolving Concepts of Cardiac Valve Dynamics. The Continuum of Development Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation., 2008, 118, 1864-1880. 2. COTRAN R.S., KUMAR V., COLLINS T. : Robbins Pathology Basis of Disease. Saunders, 1999. 3. GANONG W.F. : Review of Medical Physiology. Lange Medical Books, 2005. 4. SIEVERS H. : In vivo tissue engineering an autologous semilunar biovalve : Can we get what we want?. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 2007, 134, 20-22e1. 5. MOHLER E.R. : Mechanisms of Aortic Valve Calcification. The American Journal of Cardiology, 2004, 94, 1396-1402. 6. SCHOEN F.J. : Cardiac valves and valvular pathology. Update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovascular Pathology, 2005, 14, 189-194. 7. LICHTENBERG A., BREYMANN T., CEBOTARI S. et al. : Cell seeded tissue engineered cardiac valves based on allograft and xenograft scaffolds. Progress in Pedriatric Cardiology, 2006, 21, 211-217. 8. YOUNG B., HEATH J.W. : Wheater’s Functional Histology. Elsevier Science, 2002. 9. BADYLAK S. F., : The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials, 2007, 28, 35873593. 10. LOVEKAMP J. J., SIMIONESCU D.T., MERCURI J.J. et al. : Stability and function of glycosaminoglycans in porcine bioprosthetic heart valves. Biomaterials, 2006, 27, 1507-1518. 11. CHESTER A.C., TAYLOR P.M. : Molecular and functional characteristics of heart-valve interstitial cells. Philosophical Transactions of The Royal Society B, 2007, 1-7. 12. SUNG H., CHEN C., HUANG R. et al. : In vitro surface characterization of a biological patch fixed with a naturally occurring crosslinking agent. Biomaterials, 2000, 21, 1353-1362. 13. NKOMO V.T., GARDIN J.M., SKELTEN T.N., et al. : Burden of valvular heart diseases : a populationbased study. Lancet, 2006, 368, 1005-1011. 14. RABKIN E., SCHOEN F. : Cardiovascular tissue engineering. Cardiovascular Pathology. 2007, 11, 305-317. 15. LUNG B., BARON G., BUTCHART E.G., et al : A prospective survey of patients with valvular with heart disease in Europe : The Euro Heart Survey on Valvular Heart Disease. Eur. Heart Journal, 2003, 24, 12311243. 16. RAJAMANNAN N. M., GERSH B., O BONOW R. : Calcific Aortic Stenosis : from bench to the bedside – emergening clinical and cellular concepts. Heart Online 2003, 89, 801-805. 17. KUMAR P., CLARK M. : Clinical Medicine. Elsevier Saunders, 2005. 18. DAVID T.E., IVANOV J. : Is degenerative calcification of the native aortic valve similar to calcification of bioprosthetic heart valves? The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 2003, 126, 939-941. 19. HENRY M.M., THOMPSON J.N. : Clinical Surgery second edition. Elsevier Saunders, 2005. 20. VAHANIAN A., BAUMGARTNER H., BAX J., et al : Guidelines on the management of valvular heart disease. Eur. Heart Journal, 2007, 28, 230-268. 21. GUILAK F., BUTLER D.L., GOLDSTEIN S.A., et al. : Functional Tissue Engineering. Springer, 2004.
50
22. Travis B.R., Leo H.L., Shah P.A., et al. : An analysis of turbulent shear stresses in leakage flow through a bilfeaflet mechanical prostheses. J. Biomech. Eng., 2002, 124, 155-165. 23. VESELY I. : Heart Valve Tissue Engineering. Circulation Research, 2005, 97, 743-755. 24. VAN NOOTEN G., SOMERS P., CORNELISSEN M. et al. : Acellular porcine and kangaroo aortic valve scaffolds show more intense immune-mediated calcification than cross-linked Toronto SPV® valves in the sheep model. Interact. CardioVasc. Thorac. Surg., 2006, 5, 544-549. 25. SODIAN R., HOERSTRUP S.P., SPERLING J.S. et al. : Tissue Engineering of Heart Valves: In Vitro Experiences. The Society of Thoracic Surgeons, 2000, 70, 140-144. 26. EVERAERTS F., TORRIANNI M., VAN LUYN M., et al. : Reduced calcification of bioprotheses, crosslined via an improved carbodiimide based method. Biomaterials, 2004, 25, 5523-5530. 27. SIMON P., KASIMIR M.T., RIEDER E., et al. : Tissue Engineering of heart valves – Immunologic and inflammatory challenges of the allograft scaffold. Progress in Pediatric Cardiology, 2006, 21, 161-165. 28. CEBOTARI S., MERTSCHING H., KALLENBACH K. et al. : Construction of Autologous Human Heart Valves Based on An Acellular Allograft Matrix. Circulation, 2002, 106, I 63-68. 29. MERCURI J.J., LOVEKAMP J.J., SIMIONESCU D.T., et al. : Glycosaminoglycan-targeted Fixation for improved bioprosthetic heart valve stabilization. 2007, 28, 496-503. 30. BERTIPAGLIA B., ORTOLANI F., PETRELLI L. et al. : Cell Characterization of Porcine Aortic Valve and Decellularized Leaflets Repopulated With Aortic Valve Interstitial Cells : The VESALIO Project (Vitalitate Exornatum Succedaneum Aortticum Labore Ingenioso Obtenibitur). Ann Thorac Surg, 2003, 75,1274-1282. 31. ANDERSON J.M., RODRIGUEZ A., CHANG D.T. : Foreign body respons to biomaterials. Semin. Immunol., 2008, 20, 86-100. 32. HAMMERMEISTER K., SETHI G.K., HENDERSON W.G., et al: Outcomes 15 years after valve replacement with a mechanical versus a bioprosthetic valve: a final report of the Veterans Affairs randomized trial. J Am Coll Cardiol 2000, 36, 1152-1158. 33. RIEDER E., SEEBACHER G., KASIMIR M. : Decellularized Porcine Scaffold Differ Importantly in Residual Potential to Attract Monocytic Cells Tissue Engineering of Heart Valves. Circulation, 2005, 111, 2792-2797. 34. SIMON P., KASIMIR M.T., SEEBACHER G., et al. : Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFTTM in pediatric patients. European Journal of Cardio-thoracic Surgery, 2003, 23, 10021006. 35. HOERSTRUP S.P., SODIAN R., DAEBRITZ S. et al. : Functional Living Trileaflet Heart Valves Grown In Vitro. Circulation, 2000, 102, III 44-49. 36. GRAUSS R.W., HAZEKAMP M.G., OPPENHUIZEN F. et al. : Histological evaluation of decellularised porcine aortic valves : matrix changes due to different decellularisation methods. European Journal of Cardio-thoracic Surgery, 2005, 27, 566-571. 37. CHMIDT C.E., BAIER J.M.: Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering. Biomaterials, 2000, 21, 2215-2231. 38. GILBERT T.W., SELLARO T. L., BADYLAK S.F. : Decellularization of tissues and organs. Biomaterials, 2006, 27, 3675-3683.
51
39. BASTIAN F., STELZMULLER M., KRATOCHWILL K. et al : IgG deposition and activation of the classical complement pathway involment in the activation of human granulocytes by decellularized porcine heart valve tissue. Biomaterials, 2008, 29, 1824-1832. 40. OTA T., TAKETANI S., IWAI S. et al. : Novel Method of Decellularization of Porcine Valves Using Polyethylene Glycol and Gamma Irradiation. Ann Thorac Surg. 2007, 83, 1501-1507. 41. VAN NOOTEN G. : Artificiële hartkleppen : state of the art. Verhandelingen voor de Koninklijke Academie voor Geneeskunde van België, 2002, LXV, 3, 135-180. 42. CHANG Y., HSU C., WEI H., et al. : Cell-free xenogenic vascular grafts fixed with glutataldehyde or genipin : In vitro and in vivo studies. Journal of Biotechnology, 2005, 120, 207-219. 43. SUH H., PARK J. : Evaluation of calcification in porcine valves treated by ultraviolet ray and glutaraldehyde. Materials Science and Engineering, 2000, C13, 65-73. 44. CHANG Y., TSAI C., LIANG H., et al. : Reconstruction of the right ventricular outflow tract with a bovine jugular vein graft fixed with a naturally occurring crosslinking agent (genipin) in a canine model. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 2001, 122, 1208-1218. 45. HUMAN P., ZILLA P.: Characterization of the Immune Response to Valve Bioprotheses and Its Role in Primary Tissue Failure. Ann Thorac Surg, 2001, 71, S 385-388. 46. KASIMIR M.T., RIEDER E., SEEBACHER G. : Decellularization does not Eliminate Thrombogenicity and Inflammatory Stimulation in Tissue-Engineered Porcine Heart Valves. J Heart Valve, 2006, 15, 278-286. 47. VAN NOOTEN, G., SOMERS, P., CORNELISSEN, M. et al. : Acellular porcine and kangaroo aortic valve scaffolds show more intense immune-mediated calcification than cross-linked Toronto SPV® valves in the sheep model. Interact Cardiovasc Thorac Surg 2006, 5, 544-9. 48. WILSON, G.J., COURTMAN, D.W., KLEMENT, P. et al.: Acellular matrix: a biomaterials approach for coronary artery bypass and heart valve replacement. Ann. Thorac. Surg. 1995, 60, 353-358. 49. ZELTINGER J., LANDEEN L.K., ALEXANDER H.G. et al.: Development and characterization of tissueengineered aortic valves. Tissue Engineering 2001, 7, 9-22. 50. BOOTH C., KOROSSIS S.A., WILCOX H.E. et al.: Tissue engineering of cardiac valve protheses I: development and histological characterisation of an acellular porcine scaffold. J Heart Valve Dis., 2002, 11, 457-462. 51. COURTMAN D.W., ERRETT B.F., WILSON G.J. : The role of crosslinking in modification of the immune response elicted against xeongenic vascular acellular matrices. J. Biomed. Mater. Res., 2001, 55, 576-586. 52. MORWOOD S.R., NICHOLSON L.B. : Modulation of the immune response by extracellular matrix proteins. Arch. Immunol. Ther. Exp., 2006, 54, 1-8. 53. SCHMIDT C.E., BAIER J.M. : Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering. Biomaterials, 2000, 21, 2215-2231. 54. Sterilization of health care products-radiation sterilization substantiation of 25 kGy as a sterilization dose for small or infrequent production batches. TC198, ICS:11.080.01, ISO/TS13409:2002, International Organization
for
Standardization.
Opgehaald
op
februari
2008,
van
http://www.iso.org/iso/en/CatalogueDetailPage. 55. INOUE, N., BESSHO, M., FURUTA, M. et al. : novel collagen hydrogel cross-linked by gamma-ray irradiation in acidic pH conditions. J Biomater Sci Polym Ed 2006, 17(8), 837-858.
52
56. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Bethesda, National Institutes of Health, Publ 85: 23, modified 85. 57. DE ROOSTER, H., COX, E., VAN BREE, H. : Prevalence and relevance of antibodies to type-I and -II collagen in synovial fluid of dogs with cranial cruciate ligament damage. Am J Vet Res 2000, 61, 1456-1461. 58. SRINIVAS, A., RAMAMURTHI, A. : Effects of gamma-irradiation on physical and biologic properties of cross-linked hyaluronan tissue engineering scaffolds. Tissue Eng 2007, 13, 447-459. 59. GOUK, S.S., LIM, T.M., TEOH, S.H. et al. : Alterations of human acellular tissue matrix by gamma irradiation: Histology, biomechanical property, stability, in vitro cell repopulation, and remodeling. J Biomed Mater Res Appl Biomater 2008, 84, 205-217. 60. HAFEEZ, Y.M., ZUKI, A.B.Z., YUSOF, N. et al. : Effect of freeze-drying and gamma irradiation on biomechanical properties of bovine pericardium. Cell and Tissue Banking 2005, 6, 85-89. 61. ZABIELSKI, J., SHIEH, J.J., LAKRITZ, L. : Effect of dose on gamma irradiation induced formation of free radicals in freeze-dried natural actomyosin. J Food Sci 2006, 55, 1462-1463. 62. NQUYEN, H., MORGEN, D.A., FORWOOD, M.R. : Sterilization of allograft bone: effects of gamma irradiation on allograft biology and biomechanics. Cell Tissue Bank 2007, 8, 93-105. 63. DUSSAULT, D., CAILLET, S., LE TIEN, C. et al. : Effect of γ-irradiation on membrane fatty acids and peptidoglycan’s muropeptides of Pantoea agglomerans, a plant pathogen. J Appl Microbiol 2009, 106, 10331040.
Figuren 1. THUBRIKAR M.J. : The Aortic Valve. CRC Press, Inc., Boca Raton, 1990. 2. ANDERSON R.H., DEVINE W.A., HO S.Y., SMITH A., MCKAY R. : The myth of the aortic annulus : the anatomy of the sub aortic outflow tract. Ann Thorac Surg. 1991, 52, 640-646. 3. MENDELSON K., SCHOEN F.J. : Heart Valve Tissue Engineering: Concepts, Approaches, Progress, and Challenges. Ann. Thorac. Surg., 2006, 34, 799-819.
53
