17
III. METODE 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan selama delapan bulan yang dimulai pada bulan Mei sampai dengan bulan Desember 2010. Penelitian dilakukan di kandang Mitra Maju yang beralamat di Jalan Manunggal Baru No. 1, Desa Tegalwaru, Kecamatan Ciampea, Kabupaten Bogor. Analisis sampel darah dilakukan di Laboratorium Fisiologi, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi (AFF), Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
3.2. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain spuid, seperangkat alat ultrasonography (USG), tabung reaksi, gelas objek, hemositometer, selotip, marker, kertas label, tabung kapiler, alat penghitung, adam mikrohematokrit reader, penyumbat tabung kapiler, alat sentrifugasi, tambang, dan mikroskop cahaya. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini di antaranya 16 domba betina, hormon Prostaglandin (PGF2α), hormon Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) dan human Chorionic Gondadotropin (hCG), pengencer Hayem, alkohol 70%, antikoagulan Ethilen Diamine Tetraasetate (EDTA), kertas saring, sediaan ekstrak temulawak plus (ekstrak temulawak, vitamin A, vitamin B kompleks, dan vitamin D), dan selang penanda.
3.3. Tahap Persiapan 3.3.1. Hewan Percobaan Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini ialah 16 domba betina lokal yang telah dewasa kelamin. Domba-domba tersebut berasal dari Priangan Timur dan memiliki kisaran bobot badan antara 20-25 kg.
3.3.2. Aklimatisasi Domba Sebelum mendapat perlakuan, domba penelitian dipelihara selama dua minggu untuk diaklimatisasikan. Tujuan aklimatisasi ialah untuk memberikan kesempatan agar domba-domba tersebut menyesuaikan diri terhadap lingkungan.
18
Selama aklimatisasi, domba diberikan antibiotik, antelmintik, dan vitamin B kompleks. Pemberian antibiotik, antelmintik, dan vitamin bertujuan untuk mendapatkan kondisi domba yang sehat dan bebas dari penyakit.
3.3.3. Kandang, Pakan, dan Minum Kandang yang digunakan dalam penelitian ini ialah kandang kelompok dengan konstruksi kandang panggung dengan ketinggian 50 cm dari permukaan tanah. Pakan domba perlakuan yang diberikan terdiri atas hijauan dan singkong. Hijauan diberikan pada pagi dan sore hari, sedangkan pada siang hari diberikan singkong. Pemberian air minum dilakukan secara tidak terbatas atau ad libitum.
3.4. Tahap Pelaksanaan 3.4.1. Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini ialah rancangan acak lengkap (RAL) pola faktorial 2 x 2. Faktor pertama ialah superovulasi sedangkan faktor kedua ialah pemberian ekstrak temulawak plus. Selanjutnya, domba penelitian dibagi ke dalam empat kelompok perlakuan yang masing-masing kelompok terdiri atas empat ekor domba. Rancangan percobaan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1 Pembagian kelompok domba perlakuan Perlakuan
Tidak disuperovulasi
Disuperovulasi
Tidak diberi ekstrak
Kontrol (4 ulangan)
SO (4 ulangan)
Diberi ekstrak
TM (4 ulangan)
SO dan TM (4 ulangan)
3.4.2. Superovulasi Perlakuan superovulasi diawali dengan sinkronisasi estrus terlebih dahulu terhadap semua domba pada setiap kelompok perlakuan. Sinkronisasi estrus dilakukan
dengan
menyuntikkan
hormon
PGF2α
(LutalyseTM)
secara
intramuskular sebanyak dua kali. Dosis PGF2α yang diberikan berkisar 5-15
19
mg/kg bobot . Penyuntikan PGF2α kedua dilakukan dengan selang waktu 11 hari dari penyuntikan pertama. Kelompok domba superovulasi (SO) dan kelompok domba yang dicekok ekstrak temulawak plus sekaligus disuperovulasi (TM SO) mendapat perlakuan superovulasi dengan penyuntikan secara intramuskular menggunakan hormon PMSG dan hCG yang disuntikkan sesaat setelah penyuntikan PGF2α yang kedua. Dua hari setelah penyuntikan PGF2α yang kedua, domba berada dalam kondisi estrus, semua kelompok perlakuan domba dicampur dengan domba pejantan yang telah dipilih. Pencampuran domba jantan dengan domba betina dilakukan selama dua hari. Pencampuran dengan pejantan dilakukan dengan membagi 16 domba menjadi dua kelompok dengan masing-masing kelompok terdiri atas 8 betina dan 1 jantan. Tiga puluh hari setelah pencampuran dengan pejantan, dilakukan pemeriksaan kebuntingan menggunakan USG.
3.4.3. Pemberian Ekstrak Temulawak Plus Kelompok yang mendapat perlakuan pencekokan ekstrak temulawak plus ialah kelompok domba yang hanya diberi ekstrak temulawak plus (TM) dan domba yang dicekok ekstrak temulawak plus dan disuperovulasi (TM SO). Kelompok
tersebut
mulai
mendapatkan
perlakuan
pencekokan
setelah
kebuntingan berumur satu bulan. Pencekokan dilakukan sekali seminggu dengan dosis 1 mg per kg bobot badan.
3.4.4. Pengambilan Sampel Pengambilan sampel darah pertama dilakukan sebelum domba diberikan perlakuan. Setelah itu, sampel darah diambil kembali setiap bulan selama lima bulan. Pengambilan darah dilakukan melalui vena jugularis menggunakan spuid sebanyak kurang lebih 5 ml kemudian langsung dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah dilapis antikoagulan EDTA. Tabung tersebut kemudian langsung ditutup menggunakan sumbat dan diberi label sesuai kode perlakuan. Sampel darah tersebut kemudian dimasukkan ke dalam kotak pendingin dan dibawa ke laboratorium fisiologi untuk dilakukan pemeriksaan darah.
20
3.4.5. Penghitungan Eritrosit, Hematokrit, dan Hemoglobin Penghitungan
eritrosit
dilakukan
secara
manual
dengan
metode
hemositometer. Metode ini diawali dengan menghisap darah menggunakan pipet eritrosit sampai skala 0,5. Kemudian, pipet dibersihkan dari noda darah yang menempel menggunakan tisu. Setelah itu, ujung pipet dimasukkan ke dalam cairan pengencer hayem dan menghisap larutan tersebut sampai batas tera 101. Aspirator dilepas, pipet diangkat, ujungnya ditutup dengan jempol, dan pangkalnya ditutup dengan jari tengah. Pipet diposisikan mendatar dan dihomogenkan dengan membuat gerakan memutar angka 8. Setelah homogen, cairan tetesan pertama dan kedua dibuang. Selanjutnya, hasil pengenceran dituangkan ke dalam kamar hitung dengan menyentuhkan ujung pipet eritrosit pada tepi kaca penutup. Kemudian, kamar hitung didiamkan beberapa menit agar sel-sel darah merah mengendap pada dasar kamar hitung. Langkah berikutnya, melihat kamar hitung di bawah mikroskop dengan pembesaran objektif 40 kali. Jumlah sel yang dihitung adalah di lima kotak, yaitu pada pojok kanan atas dan bawah, pokok kiri atas dan bawah, serta satu kotak yang tepat berada di tengah. Jumlah sel darah merah ialah jumlah dari penghitungan lima kotak tadi dikalikan dengan 10.000 per mm3. Penghitungan nilai hematokrit atau Pack Cell Volume (PCV) dilakukan menggunakan Adam Mikrohematocrit Reader. Tabung mikro yang digunakan adalah tabung mikro dengan panjang 7 cm dan diameter 0,1 mm. Sampel darah diambil dengan menempelkan bagian ujung dari tabung mikro tersebut ke dalam darah. Posisi ujung tabung mikro hampir mendatar dan bagian ujung tabung yang lain dikosongkan kira-kira 1 cm. Bagian ujung tabung disumbat. Setelah itu, tabung mikro yang berisi sampel darah tersebut disentrifuse selama 4-5 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Hasil sentrifugasi dibaca menggunakan Adam Mikrohematocrit Reader. Pengukuran nilai hemoglobin dilakukan dengan menggunakan metode Sahli. Metode ini dilakukan dengan menambahkan HCl ke dalam tabung kemudian ditambahkan dengan sampel darah dan ditambahkan secara perlahan sejumlah aquades hingga warna yang terbentuk sama dengan kontrol. Kadar hemoglobin diperoleh dengan membaca skala yang tertera pada tabung Sahli.
21
3.5. Variabel yang Diamati Variabel yang diamati dalam penelitian ini terdiri atas jumlah sel darah merah, nilai hematokrit (PCV), dan kadar hemoglobin.
3.6. Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis menggunakan metode analisis General Linear Model (GLM) multivariate untuk melihat interaksi dari masing-masing faktor perlakuan yang diberikan.
