III BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.1. ` Bahan dan Peralatan 3.1.1. Objek Penelitian Objek pada penelitian ini yaitu semen yang berasal dari domba yang ada di breeding station Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran. Domba jantan yang dijadikan sumber semen berumur 2 tahun dan memiliki bobot badan 38 kg. 3.1.2. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan yaitu : 1) Semen domba yang digunakan sebagai objek penelitian 2) Tris (hydroxymethyl) aminomethane sebagai bahan pengencer 3) NaCl Fisiologis sebagai larutan untuk melakukan pengamatan secara mikroskopsis. 4) Kuning telur sebagai anti coldshock 5) Glycerol sebagai agen krioprotektan 6) Sari Kurma (Merek : Ruthab, Produksi : An-Nakhl, Surabaya) sebagai sumber energi pada pengencer. 3.1.3. Peralatan Penelitian Peralatan yang digunakan yaitu : 1) Penampung semen a. Satu set vagina b. Termometer c. Tabung Penampung d. Batang pengaduk
14
2) Evaluasi semen domba secara mikroskopis a. Mikroskop b. Cover glass c. Haemacytometer d. Kamar hitung Neubauer e. Pembakar bunsen f. Gelas objek 3) Pengenceran semen domba a. Spuit b. Tabung reaksi c. Rak tabung d. Aluminium foil e. Beaker Glass f. Batang pengaduk g. Timbangan analitik 4) Pembekuan semen domba a. Refrigerator b. Styrofoam c. Kawat d. Selang e. Straw f. Kontainer 5) Thawing semen domba a. Beaker glass
15
3.2.
Metode Penelitian
3.2.1. Tahapan Penelitian 1) Perhitungan Larutan Pengencer a. Perhitungan larutan pengencer pada awalnya dihitung dosis yang akan digunakan menggunakan rumus : V x KT x M 2 x KSM b. Perhitungan volume pengencer dan semen yaitu : (Jumlah dosis x Volume inseminasi) c. Volume pengencer yang ditambahkan dihitung dengan rumus : (Volume pengencer – Volume semen) d. Perhitungan kadar Sari Kurma yang ditambahkan : Menurut Evans dan Maxwell (1987) pada 100 ml pengencer semen terdapat 0,5 % fruktosa atau 0,5 gram fruktosa. Apabila ingin disetarakan dengan Sari Kurma yaitu perhitungannya sebagai berikut : 0,5 gram /73,51 x 100 = 0,68 gram Sari Kurma. Pada penelitian ini akan digunakan perlakuan dengan kadar masing-masing yaitu 0,34 gram, 0,68 gram dan 1,02 gram Sari Kurma. 2) Penampungan Semen Domba Vagina buatan yang akan digunakan dipersiapkan terlebih dahulu dengan suhu yang sesuai yaitu sekitar 42 – 45o C (Mardiyah dkk., 2001). Domba betina yang digunakan sebagai pemancing diikat pada sebuah tiang lalu pejantan yang akan ditampung semennya didekatkan dengan pejantan.
Ketika pejantan mulai menaiki betina dilakukan
16
false mount agar semen yang keluar dapat lebih banyak keluar. Pada saat pejantan menaiki betina pemancing untuk kedua kalinya, penis domba pejantan yang akan masuk kedalam vagina domba pemancing dibelokan ke dalam vagina buatan sampai terjadi ejakulasi. Proses penampungan semen selesai dan semen yang ditampung dibawa ke laboratorium untuk dievaluasi. 3) Penilaian Kualitas Semen secara Makroskopsis Penilaian makroskopsis semen diantaranya yaitu volume, warna, konsistensi, pH serta bau. Menurut Toelihere (1993), penilaian semen secara makroskopsis dilakukan menggunakan pengamatan secara langsung. Volume semen merupakan penilaian yang dapat dilakukan secara langsung menggunakan satuan nilai yang ada pada tabung penampung.
Rataan volume semen domba yaitu 0,5 – 2,0 ml (Garner
dan Hafez, 2000). Selanjutnya semen domba memiliki warna krem dan juga bau khas domba. Warna semen domba berkolerasi dengan konsentrasi spermatozoa.
Semakin pekat semen yang didapatkan konsentrasi
spermatozoa pada semen tersebut semakin banyak. Selain itu, data makroskopsis yang dapat dilihat secara langsung yaitu pH. Alat yang digunakan biasanya pH meter. pH semen domba berkisar antara 6,2 – 7,0. pH semen akan menentukan hidup atau mati spermatozoa. Hal ini disebabkan oleh asam laktat yang berasal dari metabolisme akhir spermatozoa secara anaerob.
Semakin banyak asam laktat yang
tertimbun akan mengakibatkan spermatozoa mati (Toelihere, 1993).
17
4) Penilaiain Kualitas Semen secara Mikroskopsis Penilaian semen domba secara mikroskopsis diantaranya adalah motilitas, abnormalitas, konsentrasi total dan gerakan massa. Penilaian secara mikroskopsis menggunakan alat bantu mikroskop salah satunya yaitu perhitungan spermatozoa motil. Salah satu metode yang digunakan untuk menghitung spermatozoa motl yaitu menggunakan kamar hitung neubauer. Menurut (Garner dan Hafez, 2000), motilitas spermatozoa yang baik berkisar antara 60 – 70 %.
Motilitas
merupakan daya gerak spermatozoa dan digunakan sebagai salah satu penilaian kualitas semen karena akan berpengaruh pada kesanggupan untuk membuahi betina. Spermatozoa akan bergerak kedepan dengan sendirinya menggunakan energi yang diproduksi oleh spermatozoa tersebut. Selanjutnya abnormalitas spermatozoa merupakan kelainan dari struktur dan fungsi sel spermatozoa.
Menurut Toelihere (1993),
abnormalitas terbagi menjadi abnormalitas primer dan sekunder. Abnormalitas
primer
meliputi
kepala
yang
terlampau
besar
(macrocephlalic), kepala terlampau kecil (microcephalic), kepala pendek melebar, pipih memanjang dan ekor ganda.
Sedangkan
abnormalitas sekunder meliputi ekor yang putus, kepala tanpa ekor, bagian tengah yang melipat, adanya butiran - butiran protoplasma proksimal atau distal dan akrosom yang terlepas.
Abnormlitas
spermatozoa yang lebih dari 20 % akan mengakibatkan menurunnya angka kebuntingan karena setiap spermatozoa yang abnormal tidak dapat membuahi betina (Toelihere, 1993).
18
Selanjutnya
gerakan
massa
dari
spermatozoa
dapat
dilihat
menggunakan mikroskop. Gerakan massa mempunyai nilai N, (+), (++) dan (+++). Menurut Rizal dan Herdis (2008), gerakan massa yang paling baik yaitu berada pada nilai ++ / +++. Nilai pada gerakan massa ditentukan melalui pengamatan dengan kriteria sebagai berikut : a) (+++) sangat baik, terlihat gelombang-gelombang besar, banyak, gelap, tebal dan aktif bagaikan gumpalan awan hitam yang bergerak cepat berpindah-pindah tempat. b). (++) baik, terlihat gelombang-gelombang kecil, tipis, jarang, kurang jelas dan bergerak lamban. c). (+) cukup, terlihat gelombang melainkan hanya gerakangerakan individual aktif progresif. 5) Pengenceran Semen Pembuatan larutan pengencer diawali dengan mencampur seluruh bahan pengencer yang disajikan pada Tabel 1 dan dilarutkan ke dalam 100 ml aquabidest. Setelah itu siapkan empat tabung reaksi. Kemudian larutan tersebut dimasukan ke dalam tabung reaksi dan dicampur dengan bahan perlakuan yaitu Sari Kurma. Tabung reaksi P1 sebagai ditambahkan dengan fruktosa 0,5 %. Tabung reaksi P2 ditambahkan dengan Sari Kurma 0,25 %, tabung reaksi P3 ditambahkan dengan Sari Kurma 0,5 %, dan tabung reaksi P4 ditambahkan dengan Sari Kurma 0,75 %. Komposisi larutan pengencer yang digunakan pada penelitian ini disajikan pada Tabel 1. sebagai berikut :
19
Tabel 1. Komposisi Larutan Pengencer Bahan Aquabidest (ml) Tris (hidroxymethyl) aminomethane (g) Asam sitrat (g) Kuning telur (%) Gliserol (%) Streptomycin (µg/ml) Penicilin (µg/ml)
Jumlah 100 3,63 1,99 20 5 1000 1000
Sumber : (Evans dan Maxwell, 1987).
6) Gliserolisasi Setiap tabung perlakuan dibagi menjadi 2 bagian dan dipisahkan ke dalam 2 tabung reaksi, yaitu bagian A dan bagian B. Bagian A berisi larutan pengencer yang dicampur dengan semen, sedangkan bagian B berisi larutan pengencer yang dicampur dengan Gliserol 10 % dari total larutan pengencer dalam bagian B.
Setelah itu bagian B
ditambahkan ke dalam tabung bagian A sebanyak ¼ bagian setiap 15 menit sekali. 7) Filling Setelah proses gliserolisasi, Larutan pada setiap tabung reaksi dimasukan ke dalam straw dengan volume 0,25 ml menggunakan alat hisap otomatis. lalu setiap ujung bebas straw ditutup dengan tepung Polyvinyl Alcohol.
20
8) Equilibrasi Setelah proses filling, seluruh straw yang sudah siap untuk proses freezing sebelumnya dilakukan proses equilibrasi.
Seluruh straw
didiamkan pada suhu 50 C selama 4 jam. 9) Prafreezing dan Freezing Setelah proses equilibrasi, selanjutnya memasuki proses prafreezing. Pada awalnya siapkan styrofoam yang di dalamnya telah diberi kawat serta tempat nitrogen cair untuk proses freezing. Sebelum memasuki tahap freezing seluruh straw tersebut diuapkan diatas kawat hingga suhu turun menjadi -1500 C dengan menggunakan vakum dan di diamkan selama 2 menit. Setelah itu seluruh straw di rendam dalam nitrogen cair. 10) Thawing Semen yang sudah terendam selama 30 menit diambil, lalu Thawing menggunakan air hangat 38o C selama 10 - 15 detik. Gunting bagian ujung straw dan lakukan evaluasi. 2.2.2. Peubah yang Diamati 1) Recovery rate Perhitungan Recovery Rate dapat dilakukan dengan menggunakan rumus : R = (𝑎/𝑏) 𝑥 100% Keterangan R = Recovery Rate a = Motilitas semen pasca thawing b = Motilitas semen segar
21
2) Keutuhan membran plasma Persentase MPU sperma ditentukan dengan menghitung persentase sperma yang memiliki membran plasma yang utuh, dengan cara memasukkan sampel semen ke dalam larutan hipoosmotik 0,032 M NaCl (0,179 g NaCl dalam 100 ml akuabides), kemudian diinkubasi selama satu jam pada suhu 370 C. Spermatozoa dengan membran plasma utuh ditandai dengan ekor melingkar dan sperma yang rusak ditandai dengan ekor lurus karena tidak adanya reaksi osmotik.
2.2.3. Rancangan Percobaan dan Analisis Statistik 1) Rancangan Percobaan Pada penelitian ini akan menggunakan Rancangan Acak Lengkap yang terdiri dari empat perlakuan, masing-masing perlakuan diulang sebanyak lima kali sebagai berikut : P1 = larutan pengencer tris kuning telur 99,5 % + Fruktosa 0,5 % P2 = larutan pengencer tris kuning telur 99,75 % + Sari Kurma 0,25 % P3 = larutan pengencer tris kuning telur 99,5 % + Sari Kurma 0,5 % P4 = larutan pengencer tris kuning telur 99,25 % + Sari Kurma 0,75 % 2) Analistik Statistik Model matematik pada rancangan acak lengkap adalah sebagai berikut : 𝑌𝑖𝑗 = u + τ𝑖 + ε𝑖𝑗
22
Tabel. 2. Sidik Ragam Sumber Keragaman
dB
JK
KT
F Hit
Perlakuan
(t-1)
JKP
KTP
KTP/KTG
Galat
t(r-1)
JKG
KTG
Total
tr – 1
JKT
-
Hipotesis yang diuji : H0 : P1 = P2 = P3 = P4 (berarti tidak ada pengaruh perlakuan). H1 : P1 ≠ P2 ≠ P3 ≠ P4 (paling sedikit ada satu perlakuan yang mempengaruhi).
Kaidah keputusan : a. Jika Fhitung ≤ F
tabel 0,05
artinya tidak berbeda nyata (non significant),
terima H0 b. Jika Fhitung > Ftabel 0,05 artinya berbeda nyata (Significant). terima H1 c. Apabila dalam analisis sidik ragam memperlihatkan perbedaan nyata (Fhitung > Ftabel) maka dilanjutkan dengan Uji Duncan. Rumus uji Duncan adalah sebagai berikut : SY
= √(KTG/r)
LSRα = SSRα x SY Keterangan : SY
= Standar eror
LSRα = Least Significant Range SSRα = Significant Studentiezed Range KTG = Kuadrat Tengah Galat r
= Ulangan
23
Kaidah Keputusan : Jika selisih antara perlakuan d ≤ LSRα, berarti tidak berbeda nyata. Jika selisih antara perlakuan d > LSRα, berarti berbeda nyata
