IDENTIFIKASI FLAVONOIDA PADA HERBA PEGAGAN EMBUN. (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) HASIL ISOLASI SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF (KLTP)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

IDENTIFIKASI FLAVONOIDA PADA HERBA PEGAGAN EMBUN (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) HASIL ISOLASI SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF (KLTP)

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh : Titien Christinawati NIM : 038114056

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007

i


ii


iii


Tak ada hal yang paling indah dalam hidup ini selain saat kita mendapatkan dukungan dari orang-orang yang sangat kita sayangi dan menyayangi kita di saat kita jatuh.

“Janganlah hendaknya kamu kuatir tentang apapun juga, tetapi nyatakanlah dalam segala hal keinginanmu kepada Allah dalam doa dan permohonan dengan ucapan syukur” (Filipi 4; 6)

Persembahanku untuk Tuhan Yesus dan Bunda Maria yang selalu menjadi perantara doa-doaku Bapak dan Ibuku yang tak pernah berhenti menyayangi dan mendoakanku Mbak Ari, Mas Eko dan Mbak Ina yang selalu menyemangatiku Mas Freddyku yang selalu menemani dan memberikan dukungannya Almamaterku

iv


v


INTISARI Herba pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) merupakan salah satu jenis tumbuhan yang belum banyak dikenal masyarakat. Herba pegagan embun telah diketahui mengandung minyak atsiri, kumarin, saponin, terpen dan hiperin. Herba pegagan embun berkhasiat untuk mengobati sakit kuning (hepatitis), infeksi saluran kencing, infeksi amandel, infeksi telinga tengah dan sariawan. Kemungkinan yang berperan adalah flavonoidanya. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi jenis flavonoida selain hiperin yang terkandung dalam herba pegagan embun dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT), reaksi warna dan spektrofotometri UV. Flavonoida didapat dengan mengekstraksi herba pegagan embun dengan menggunakan campuran metanol dan air secara maserasi yang selanjutnya dianalisis dengan KLT dengan fase diam selulosa dan fase gerak n-butanol : asam asetat : air (BAW; 4 : 1 : 5, fase atas). Kemudian dilakukan isolasi dengan kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP). Didapat 3 bercak yang sesuai ciri flavonoida. Bercak tersebut masingmasing dengan Rf 0,63; 0,76; 0,90. Bercak dengan Rf 0,76 dan 0,90 dikerok dan dilarutkan dalam metanol yang kemudian diperiksa kemurniannya dengan menggunakan KLT multi eluen dengan fase diam selulosa dan fase gerak BAW dan asam asetat 15%. Dari hasil KLT multi eluen diketahui bahwa senyawa belum murni sehingga dilakukan reisolasi dengan fase gerak asam asetat 15 %. Dari hasil reisolasi diperoleh bahwa semua senyawa adalah tunggal (murni) sehingga dapat digunakan untuk analisis selanjutnya. Dipilih isolat yang tidak sesuai dengan ciri hiperin. Isolat tersebut dianalisis dengan reaksi warna dan spektrofotometri UV untuk mengetahui golongan dan posisi OH pada struktur flavonoida. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa isolat flavonoida yang diidentifikasi termasuk dalam golongan isoflavon yaitu 7,8-dihidroksi isoflavon.

Kata kunci : flavonoida, herba pegagan embun, spektrofotometri ultraviolet, KLTP, 7,8-dihidroksi isoflavon.

vi


ABSTRACT Pegagan embun herb (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) is a kind of plants that has not been known by people. Pegagan embun herb contains essential oil, coumarin, saponin, terpenoid and hyperin. Pegagan embun herb is useful for healing hepatitis, urinary tract infection, tonsil infection, middle ear infection and sprue. Flavonoid might play its role in healing those diseases. This study has a purpose to identify the kind of flavonoid instead of hyperin that is contained in pegagan embun herb by using thin layer chromatography (TLC), color reaction and UV spectrofotometry. Flavonoid was obtained by extracting pegagan embun herb using mixture of methanol and water by maseration that furthermore analyzed with TLC with stationery phase of cellulose and mobile phase of n-butanol : acetic acid : water (BAW; 4 : 1 : 5, upper phase). And then, isolation was done with preparative thin layer chromatography (PTLC). It was obtained 3 spots that similar to the characteristics of flavonoid. That spot with each Rf 0,63; 0,76; 0,90. The spot with Rf 0,76 and 0,90 were taken and dissolved into methanol and then the purity was examined using multi eluen (TLC) with stationery phase of cellulose and mobile phase of BAW and 15 % acetic acid. From the result of multi eluen TLC was known that compound was not yet pure so reisolation was done with mobile phase of 15 % acetic acid. From the result of reisolation, it was obtained that all of the compounds were singular (pure), so it can be used for next analysis. An isolate was chosen, in which the characteristic is not similar to the characteristic of hyperin. The isolate was analyzed with color reaction and UV spectrofotometry to know the group and the OH position on the flavonoid structure. The result of this examination indicated that the identified flavonoid isolate was included in the isoflavone group that is 7,8-dihydroxy isoflavone.

Key words : flavonoid, pegagan embun herb, UV spectrofotometry, PTLC, 7,8dihydroxy isoflavone

vii


KATA PENGANTAR Puji syukur dan terima kasih penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus dan Bunda Maria atas berkat, kasih karunia dan penyertaan-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul Identifikasi Flavonoida pada Herba Pegagan Embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) Hasil Isolasi Secara Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP). Skripsi ini disusun guna memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama penelitian sampai penyusunan skripsi ini, penulis tidak lepas dari bantuan dari berbagai pihak berupa bimbingan, dorongan, pengarahan, saran, ataupun fasilitas. Untuk itu pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada : 1. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen pembimbing atas segala bimbingan, saran, pengarahan, dan kesempatan yang telah diberikan selama penelitian maupun dalam penyusunan skripsi ini. 3. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen penguji atas segala masukan berupa kritik dan saran demi kesempurnaan skripsi ini. 4. Ibu Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. selaku dosen penguji atas segala masukan berupa kritik dan saran demi kesempurnaan skripsi ini.

viii


5. Laboran Fakultas Farmasi, Mas Wagiran, Mas Sigit, Mas Andri, Mas Ottok, Mas Kunto dan Pak Mukmin yang telah membantu selama penelitian. 6. Sahabat-sahabatku tercinta, Ratna, Rosa, Komang, Devi, Maria dan Anin untuk persahabatan dan dukungannya selama ini dalam segala hal. 7. Teman-teman kelompok C untuk kebersamaan dan kenangannya selama 3 tahun dalam praktikum. 8. Hartono, Aan, Timur, Madya, Bhodonk, Mas Prasojo dan Mas Sugiyono atas bantuannya dalam penyusunan skripsi. 9. Teman-teman kos Benteng, Mbak Utik, Mbak Kenny, Veni, Neldy, Mbak Icha, Mbak Kristin, Ajoe dan Mbak Nanay atas keceriaannya dan kebersamaannya. 10. Teman-teman kelas B dan teman-teman seperjuanganku di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia. 11. Semua pihak yang telah membantu selama penyelesaian skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Penulis menyadari bahwa dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan. Namun penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi masyarakat dan perkembangan ilmu pengetahuan.

Yogyakarta, Juli 2007

Penulis

ix


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ……………………………………………………………i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ……………………………......ii HALAMAN PENGESAHAN …………………………………………………iii HALAMAN PERSEMBAHAN …………………………………………….....iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ………………………………………..v INTISARI ……………………………………………………………………...vi ABSTRACT ……………………………………………………………………vii KATA PENGANTAR ……………………………………………………….viii DAFTAR ISI ………………………………………………………………......x DAFTAR TABEL …………………………………………………………...xiv DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………...xvi DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………….xviii BAB I. PENGANTAR ………………………………………..……………….1 A. Latar Belakang ………………………………………………………………1 1. Permasalahan …...………………………………………………………..3 2. Keaslian penelitian …………………………………………………….....4 3. Manfaat penelitian ……………………………………………………….4 B. Tujuan Penelitian …………………………………………………………....4 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ………………………………………..5 A. Tumbuhan Pegagan Embun ………………………………………………...5 1. Keterangan botani ……………………………………………………….5

x


2. Nama lokal ………………………………………………………………5 3. Morfologi ………………………………………………………………...5 4. Kandungan …………………………………………………………….....5 5. Penggunaan ………………………………………………………………6 6. Penelitian ………………………………………………………………...6 B. Pengeringan Bahan ……………………………………………………….....7 C. Maserasi ……………………………………………………………………..7 D. Flavonoida …………………………………………………………………..8 1. Struktur flavonoida ……………………………………………………....8 2. Distribusi flavonoida ……………………………………………….........9 3. Penggolongan flavonoida ………………………………………………..9 4. Manfaat flavonoida ………………………………………………..........10 5. Kelarutan flavonoida……………………………………………………11 6. Isolasi senyawa flavonoida ……………………………………………..12 7. Identifikasi warna flavonoida …………………………………………..12 E. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) …………………………………………...16 F. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)……………………………….18 G. Spektrofotometri Ultraviolet ……………………………………………….19 1. Tinjauan umum …………………………………………………………19 2. Spektrum senyawa flavonoida ………………………………………….22 H. Keterangan Empiris ………………………………………………………..28 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ………………………………….29 A. Jenis Penelitian …………………………………………..………………...29

xi


B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional …………………………….29 1. Variabel penelitian ……………………………………………………..29 2. Definisi operasional ……………………………………………………29 C. Bahan dan Alat Penelitian ………………………………………………….30 1. Bahan penelitian ………………………………………………………..30 2. Alat penelitian ………………………………………………………….30 D. Tata Cara Penelitian ……………………………………………………….31 1. Determinasi tumbuhan pegagan embun ………………………………..31 2. Pengumpulan bahan ……………………………………………………31 3. Pembuatan serbuk simplisia ……………………………………………31 4. Penyarian flavonoida …………………………………………………...31 5. Pemeriksaan pendahuluan flavonoida dengan KLT ……………………32 6. Isolasi flavonoida dengan KLTP ……………….……………..………..32 7. Pemeriksaan kemurnian isolat ………………………………..………...33 8. Reaksi warna flavonoida ………………………………………...……...33 9. Identifikasi senyawa flavonoida dengan spektrofotometri ultraviolet ….33 E. Analisis Data ………………………………………………..……………...35 BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN …………………..37 A. Determinasi Tumbuhan ……………………………………………….…...37 B. Pengumpulan dan Pengeringan Bahan …………………………………….37 C. Penyarian Bahan …………………………………………………………...38 D. Pemeriksaan Pendahuluan Flavonoida Secara KLT ……………………….39 E. Isolasi Flavonoida dengan KLTP ………………………………...………...44

xii


F. Pemeriksaan Kemurnian Isolat ……………………………………………..46 G. Identifikasi Senyawa Flavonoida …………………………………………..48 1. Identifikasi dengan reaksi warna ……………………………………… 48 2. Identifikasi dengan spektrofotometri ultraviolet ……………………….52 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN …………………………………….63 A. Kesimpulan ………………………………………………………………..63 B. Saran ……………………………………………………………………….64 DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………………...65 LAMPIRAN ………………………………………………………………….68 BIOGRAFI PENULIS ………………………………………………………..82

xiii


DAFTAR TABEL Halaman Tabel

I. Penampakan warna bercak pada kromatogram yang dideteksi dengan uap amonia (Markham, 1988) ……………………………………15

Tabel

II.

Penampakan

warna

golongan

flavonoida

dengan

pereaksi

(Venkataraman, 1962) …..……………………………………..16 Tabel

III. Rentangan serapan spektrum UV pada flavonoida (Markham, 1988) …………………………………………………………………..22

Tabel

IV. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOH (Markham, 1988) ……………………………………….25

Tabel

V. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOAc (Markham, 1988) ………..…………………………….26

Tabel

VI. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOAc dan H3BO3 (Markham, 1988) ………………………....26

Tabel

VII. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan AlCl3 serta AlCl3 dan HCl (Markham, 1988) ………………....27

Tabel

VIII. Penampakan warna bercak sampel (ekstrak metanol herba pegagan embun) …………….…………………………………………....43

Tabel

IX. Analisis hasil KLT pendahuluan dan hasil spektra dibandingkan dengan pustaka acuan (Markham, 1988) ……………………….47

Tabel

X. Penampakan perubahan warna isolat setelah penambahan pereaksi …………………………………………………………………..50

xiv


Tabel

XI. Penafsiran spektrum flavonoida dengan penambahan pereaksi geser dari isolat metanol herba pegagan embun ……………………...54

xv


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Kerangka flavonoida ………………………………………..……….9 Gambar 2. Sistem penomoran flavonoida ……………………………………….9 Gambar 3. Kerangka struktur golongan-golongan flavonoida …....……………14 Gambar 4. Dua komponen penyerap (benzoil dan sinamoil) ………….……….23 Gambar 5. Kromatogram uji KLT pendahuluan ekstrak metanol herba pegagan embun …....………………….…………....………………….……42 Gambar 6. Reaksi yang terjadi setelah diberi uap amonia ……………..……….43 Gambar 7. Hasil reaksi warna …………………………….………………….…50 Gambar 8. Reaksi yang terjadi setelah pemberian NaOH ………………….…..51 Gambar 9. Reaksi yang terjadi setelah penambahan H2SO4 pekat ……………..51 Gambar 10. Reaksi yang terjadi setelah penambahan Mg dan HCl ……………52 Gambar 11. Spektrum spektrofotometri UV isolat flavonoida dalam metanol ...53 Gambar 12. Spektrum spektrofotometri UV isolat flavonoida dalam metanol dan diberi NaOH ………………………………….………………….55 Gambar 13. Spektrum spektrofotometri UV isolat flavonoida dalam metanol dan diberi NaOH setelah 5 menit …………………….………………56 Gambar 14. Spektrum spektrofotometri UV isolat flavonoida dalam metanol dan diberi AlCl3 …....…………………….………………….………....57 Gambar 15. Reaksi yang terjadi setelah pemberian AlCl3 ……………………..57 Gambar 16. Spektrum spektrofotometri UV isolat flavonoida dalam metanol dan diberi AlCl3/HCl …………………….………………….…………58

xvi


Gambar 17. Reaksi yang terjadi setelah pemberian HCl pada isolat C dengan AlCl3 ………………………….………………….………………59 Gambar 18. Spektrum spektrofotometri UV isolat flavonoida dalam metanol dan diberi NaOAc ……………………….………………….………….59 Gambar 19. Reaksi yang terjadi setelah penambahan NaOAc …....……………60 Gambar 20. Spektrum spektrofotometri UV isolat flavonoida dalam metanol dan diberi NaOAc/H3BO3………………………….…………………61 Gambar 21. Reaksi yang terjadi setelah pemberian NaOAc dan ditambah dengan H3BO3 …………………….………………….…………………....61 Gambar 22. Gambar 22. 7, 8-dihidroksi isoflavon dengan kemungkinan letak gula pada posisi 5 ………………….………………….…....…………..62 Gambar 23. Gambar 22. 7, 8-dihidroksi isoflavon dengan kemungkinan letak gula pada posisi 4’ ………………….………………….…....…………..62

xvii


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi ……………………………………68 Lampiran 2. Foto tumbuhan herba pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) ……………………………………...…………………….69 Lampiran 3. Foto kromatogram KLTP hasil reisolasi isolat I dengan fase diam selulosa, fase gerak asam asetat 15 % …………………………..70 Lampiran 4. Foto kromatogram KLTP hasil reisolasi isolat II dengan fase diam selulosa, fase gerak asam asetat 15 % ………………………….71 Lampiran 5. Foto kromatogram KLT multi eluen isolat A dengan fase diam selulosa, fase gerak asam asetat 15 % ………………….………72 Lampiran 6. Foto kromatogram KLT multi eluen isolat A dengan fase diam selulosa, fase gerak BAW ……………………………………...73 Lampiran 7. Foto kromatogram KLT multi eluen isolat B dengan fase diam selulosa, fase gerak asam asetat 15 % ………………………….74 Lampiran 8. Foto kromatogram KLT multi eluen amonia B dengan fase diam selulosa, fase gerak BAW ……………………………………...75 Lampiran 9. Foto kromatogram KLT multi eluen isolat C dengan fase diam selulosa, fase gerak asam asetat 15 % ………………………….76 Lampiran 10. Foto kromatogram KLT multi eluen amonia C dengan fase diam selulosa, fase gerak BAW …………………………………….77 Lampiran 11. Foto kromatogram KLT multi eluen isolat D dengan fase diam selulosa, fase gerak asam asetat 15 % ………………………….78

xviii


Lampiran 12. Foto kromatogram KLT multi eluen isolat D dengan fase diam selulosa, fase gerak BAW ………………………………….....79 Lampiran 13.1. Spektrum spektrofotometri UV isolat A dalam metanol …….80 13.2. Spektrum spektrofotometri UV isolat B dalam metanol ……..80 Lampiran 14.1. Spektrum spektrofotometri UV isolat D dalam metanol ……81 14.2. Spektrum spektrofotometri UV rutin dalam metanol ………...81

xix


BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Banyak jenis tumbuhan telah digunakan oleh masyarakat Indonesia sebagai bahan obat. Tanaman obat tersebut diramu menjadi sediaan obat, yang lebih dikenal sebagai obat tradisional. Obat tradisional ada yang berasal dari tumbuhan, hewan, maupun mineral yang digunakan untuk pemeliharaan, peningkatan kesehatan dan penyembuhan penyakit. Namun masih banyak tumbuhan liar yang belum diketahui zat berkhasiat dan kegunaannya. Dewasa ini minat masyarakat untuk memanfaatkan tumbuh-tumbuhan sebagai ramuan obat semakin berkembang. Banyaknya permintaan dunia akan obat-obatan yang berasal dari alam, menunjukkan bahwa masyarakat memiliki kecenderungan untuk menempuh gaya hidup kembali ke alam atau ”back to nature” dalam mencapai tujuan hidup yang lebih sehat dan aman terhadap berbagai macam gangguan kesehatan (Kuswara, 2000). Herba pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) merupakan salah satu jenis tumbuhan yang belum banyak dikenal masyarakat. Herba pegagan embun mengandung minyak atsiri, kumarin dan hiperin (Anonim, 2005). Beberapa penelitian sebelumnya menyebutkan bahwa herba pegagan embun juga mengandung saponin (Matsushita, Sasaki, Warashina, Miyase, Noguchi, Velde, 2004), terpen (Asakawa, Matsuda, Takemoto, 1982) dan quercetin 3-O-β- -(6″caffeoylgalactoside) (Shigematsu, Kouno, Kawano, 1981). Herba pegagan embun dapat digunakan untuk mengobati sakit kuning (hepatitis), pengecilan hati dengan

1


busung, batu empedu, batu dan infeksi saluran kencing, batuk dan sesak nafas, sariawan, radang tenggorokan, infeksi amandel dan infeksi telinga tengah (Anonim, 2005). Timbulnya khasiat penyembuhan pada suatu penyakit tentunya disebabkan oleh adanya senyawa dengan struktur tertentu yang terdapat di dalam tumbuhan. Oleh karena itu, dengan diketahuinya struktur dari suatu senyawa akan membuka peluang untuk pengembangan obat baru. Untuk mengetahui suatu senyawa yang terkandung dalam suatu tumbuhan dapat dilakukan dengan mengisolasi senyawa tersebut secara kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) dan dilanjutkan dengan penentuan golongan serta strukturnya. Digunakan metode KLTP karena KLTP memiliki beberapa kelebihan dari kromatografi kolom yaitu pemisahan yang lebih baik karena pemisahan yang dihasilkan berupa bercak yang tidak bergerak., mudah mengambil senyawasenyawa yang terpisah secara individu dengan jalan mengeroknya dan mengumpulkan tiap-tiap lapisan, dan peralatannya yang sederhana (Gasparic dan Churacek, 1978). KLTP merupakan salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai peralatan paling dasar (Hostettmann, Hostettmann, Marston, 1995). Tanaman yang mengandung flavonoida banyak digunakan dalam dunia pengobatan tradisional, karena dapat bekerja sebagai inhibitor pernafasan. Flavonoida juga dapat menghambat perdarahan dan menghambat reaksi oksidasi, baik secara enzimatik maupun non enzimatik, beberapa flavonoida dapat bekerja

2


sebagai antihipertensi, dan flavonoida juga mempunyai potensi sebagai antibakteri (Robinson, 1995). Adanya khasiat herba pegagan embun untuk mengobati sakit kuning (hepatitis), infeksi saluran kencing, infeksi amandel, infeksi telinga tengah dan sariawan kemungkinan yang berperan dalam pengobatan adalah flavonoidanya karena flavonoida sendiri menurut Robinson (1995) memiliki daya sebagai bakterisida, antiinflamasi dan antioksidan. Flavonoida tersebar luas dalam dunia tumbuh-tumbuhan dan ditemukan dalam bagian-bagian tertentu dari tumbuhan. Flavonoida dalam jaringan tumbuhan ditemukan sebagai senyawa campuran (Swain, 1976). Pada penelitian sebelumnya telah ditemukan senyawa flavonoida yang terkandung dalam herba pegagan embun yaitu hiperin. Senyawa flavonoida ditemukan dalam bentuk campuran sehingga kemungkinan masih ada senyawa flavonoida lainnya yang terkandung dalam herba pegagan embun yang belum ditemukan. Oleh karena itu penelitian kandungan kimia khususnya jenis-jenis flavonoida lainnya yang terkandung dalam herba pegagan embun perlu dilakukan untuk pengembangan dan pemanfaatan herba pegagan embun dalam pengobatan. 1. Permasalahan Permasalahan yang ada dalam penelitian ini adalah : Senyawa golongan flavonoida apakah yang terdapat dalam herba pegagan embun selain hiperin dengan isolasi secara KLTP dan bagaimana prakiraan struktur parsialnya dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT), reaksi warna dan spektrofotometri ultraviolet?

3


2. Keaslian penelitian Berdasarkan hasil penelusuran pustaka, penelitian yang berkaitan dengan flavonoida pada herba pegagan embun yang pernah dilakukan adalah penelitian yang menemukan adanya flavonoida quercetin 3-O-β- -(6″caffeoylgalactoside) (Shigematsu et al., 1981) atau hiperin (Anonim, 2005). Sehingga penelitian ini dilakukan untuk menemukan jenis flavonoida lainnya selain hiperin. 3. Manfaat penelitian Manfaat dari penelitian ini meliputi 2 hal : a. Manfaat teoritis yaitu memberikan informasi yang diharapkan dapat dijadikan acuan untuk penelitian berikutnya tentang kandungan dan kegunaan herba pegagan embun. b. Manfaat praktis yaitu penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang kandungan flavonoida selain hiperin pada herba pegagan embun untuk pengembangan dan pemanfaatan tanaman tersebut dalam pengobatan. c. Manfaat metodologis yaitu penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang penggunaan KLTP dalam isolasi senyawa flavonoida pada herba pegagan embun.

B. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa flavonoida dari herba pegagan embun selain hiperin dengan menggunakan metode isolasi secara KLTP dan identifikasi dengan KLT, reaksi warna dan spektrofotometri UV.

4


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Tumbuhan Pegagan Embun 1. Keterangan botani Herba pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) mempunyai sinonim

Hydrocotyle

rotundifolia

Roxb.

dan

Hydrocotyle

formosana

Masamune., termasuk dalam familia Umbelliferae (Apiaceae) (Anonim, 2005). 2. Nama lokal Sunda

: pegagan embun, antanan beurit, a. lembut

Jawa

: andem, katepa’n, rendeng, semanggi

Madura : salatun, take cena China

: tikim, patikim, tian hu sui (Anonim, 2005).

3. Morfologi Tumbuh merayap, ramping, subur di tempat lembab, terbuka maupun teduh di pinggir jalan, pinggir selokan, lapangan rumput dan tempat lain sampai setinggi kira-kira 2.500 m dari permukaan laut. Batang lunak, berongga, panjang 45 cm atau lebih, daun tunggal berseling, bertangkai panjang, bentuk bulat (Anonim, 2005). 4. Kandungan Herba pegagan embun mengandung minyak atsiri, kumarin dan hiperin (Anonim, 2005). Beberapa penelitian menyebutkan bahwa herba pegagan embun juga mengandung saponin (Matsushita et al., 2004), terpen (Asakawa et

5


al., 1982) dan quercetin 3-O-β- -(6″-caffeoylgalactoside) (Shigematsu et al., 1981). 5. Penggunaan Herba pegagan embun dapat digunakan untuk mengobati sakit kuning (hepatitis), pengecilan hati dengan busung, batu empedu, batu dan infeksi saluran kencing, batuk dan sesak nafas, sariawan, radang tenggorokan, infeksi amandel dan infeksi telinga tengah (Anonim, 2005). 6. Penelitian Terdapat beberapa penelitian yang pernah dilakukan terhadap herba pegagan embun, yaitu : a. Penelitian yang mengisolasi flavonoida quercetin 3-(6”-caffeoylgalactoside dari herba pegagan embun (Shigematsu et al., 1981). b. Penelitian yang menemukan adanya terpenoid dari herba pegagan embun dengan kandungan terpenoid utamanya yaitu trans- β-farnesene (Asakawa et al., 1982). c. Penelitian yang menemukan adanya kandungan minyak atsiri pada herba pegagan embun (Janardhanan, Thoppil, 2001). d. Penelitian yang mengisolasi tujuh saponin triterpenoid yang salah satunya dikenal sebagai udosaponin B dari herba pegagan embun (Matsushita et al., 2004).

6


B. Pengeringan Bahan Tujuan pengeringan ialah untuk mendapatkan simplisia yang tidak mudah rusak sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama. Pengurangan kadar air dengan adanya pengeringan akan menghentikan reaksi enzimatik sehingga penurunan mutu simplisia dapat dicegah. Pada dasarnya dikenal dua cara pengeringan yaitu: 1. Pengeringan alamiah a. Dengan sinar matahari langsung. Cara ini dilakukan untuk mengeringkan bagian tanaman yang relatif keras seperti kayu, kulit kayu, biji dan sebagainya, dan mengandung senyawa aktif yang relatif stabil. b. Dengan diangin-anginkan dan tidak dipanaskan dengan sinar matahari langsung. Cara ini terutama untuk mengeringkan bagian tanaman yang lunak seperti bunga, daun, dan sebagainya dan mengandung senyawa aktif mudah menguap. 2. Pengeringan buatan Prinsip pengeringan buatan adalah udara dipanaskan oleh suatu sumber seperti lampu, kompor, mesin disel, atau listrik, udara panas dialirkan dengan kipas ke dalam ruangan atau lemari yang berisi bahan yang akan dikeringkan yang telah disebarkan di atas rak-rak pengering (Anonim, 1985).

C. Maserasi Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari

7


akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak keluar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi kesetimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol atau pelarut lain. Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah dilakukan. Pada penyarian dengan cara maserasi, perlu dilakukan pengadukan. Pengadukan diperlukan untuk meratakan konsentrasi larutan di luar butir serbuk simplisia, sehingga dengan pengadukan tersebut tetap terjaga adanya derajat perbedaan konsentrasi yang sebesar-besarnya antara larutan di dalam sel dengan larutan di luar sel (Anonim, 1986).

D. Flavonoida 1. Struktur flavonoida Golongan flavonoida dapat digambarkan sebagai deretan senyawa C6C3-C6. Artinya, kerangka karbonnya terdiri atas dua gugus C6 (cincin benzena tersubstitusi) disambungkan oleh rantai alifatik tiga-karbon (Gambar 1). Kelaskelas yang berlainan dalam golongan ini dibedakan berdasarkan cincin heterosiklik-oksigen tambahan dan gugus hidroksil yang tersebar menurut pola yang berlainan. Flavonoida sering terdapat sebagai glikosida. Golongan terbesar flavonoida berciri mempunyai cincin piran yang menghubungkan

8


rantai tiga-karbon dengan salah satu dari cincin benzena. Sistem penomoran untuk turunan flavonoida diberikan pada gambar 2 (Robinson, 1995). O

7

3'

2'

1

8

2

1'

B

4'

A C

C

3

6

C

5

Gambar 1. Kerangka flavonoida

6'

5'

4

Gambar 2. Sistem penomoran flavonoida

Dua cincin karbon di ujung kiri dan kanan molekul dinyatakan berturutturut sebagai cincin A dan B. Gugus hidroksil hampir selalu terdapat di flavonoida, khususnya tertempel pada cincin B di posisi 3` dan 4` atau tertempel pada posisi 5 dan 7 cincin A, atau pada posisi 3 cincin tengah. Gugus hidroksil

ini

merupakan

tempat

menempelnya

berbagai

gula

yang

meningkatkan kelarutan flavonoida dalam air (Salisbury & Ross, 1995). Di dalam tumbuhan, flavonoida biasanya berikatan dengan gula sebagai glikosida. Molekul yang berikatan dengan gula disebut aglikon (Riyanto, 1990). 2. Distribusi flavonoida Flavonoida mencakup banyak pigmen yang paling umum dan terdapat pada seluruh dunia tumbuhan mulai dari fungus sampai Angiospermae. Dikenal hampir 500 aglikon, dan lebih dari 4000 flavonoida jika glikosida diperhatikan juga. Pada tumbuhan tinggi, flavonoida terdapat baik dalam bagian vegetatif maupun dalam bunga (Robinson, 1995). 3. Penggolongan flavonoida Penggolongan flavonoida umumnya berdasarkan substitusi cincin heterosiklik yang mengandung gugus OH. Perbedaan gugus OH di bagian C3 akan menentukan sifat, golongan, atau tipe flavonoida, yaitu flavonol, flavon,

9


flavanon, isoflavon, auron, dan khalkon dengan flavon dan flavonol sebagai golongan terbesar (Gambar 3) (Robinson, 1995). 4. Manfaat flavonoida Flavonoida berfungsi sebagai pengatur tumbuh, pengatur fotosintesis, pengatur kerja antimikroba, antivirus, dan serangga bagi tanaman yang mengandungnya. Fitoaleksin merupakan senyawa flavonoida yang dibentuk sebagai tanggapan terhadap infeksi atau luka yang menghambat fungus penyerangnya. Sebagai pigmen, flavonoida berperan dalam menarik serangga atau burung untuk membantu proses penyerbukan (Robinson, 1995). Tanaman yang mengandung flavonoida banyak digunakan dalam dunia pengobatan tradisional, karena dapat bekerja sebagai inhibitor pernafasan. Flavonoida juga dapat menghambat perdarahan dan menghambat reaksi oksidasi, baik secara enzimatik maupun non enzimatik, beberapa flavonoida dapat bekerja sebagai antihipertensi, dan flavonoida juga mempunyai potensi sebagai antibakteri (Robinson, 1995). Isoflavon memiliki aktivitas anti kanker, anti inflamasi, aktivitas pada pembuluh darah dan aktivitas estrogenik. Isoflavon berpengaruh pada sistem sirkulasi dan penyakit jantung koroner yaitu dengan menghambat agregasi platelet (keping-keping sel darah), dilatan koroner dan menghambat introphy otot jantung (cardio trophyc) sehingga dapat memperlancar sistem sirkulasi darah (Pawiroharsono, 1994). Isoflavon berpotensi sebagai anti-kontriksi pembuluh darah dan juga berpotensi menghambat pembentukan LDL (low

10


density lipoprotein) sehingga dapat mengurangi terjadinya arteriosclerosis pada pembuluh darah (Jha, 1985; Jha, 1997). Senyawa isoflavon juga mempunyai efek hormonal, khususnya efek estrogenik. Hormon estrogen berpengaruh pula terhadap metabolisme tulang, terutama proses kalsifikasi, maka adanya isoflavon dapat melindungi proses osteoporosis pada tulang sehingga tulang tetap padat dan masif. Isoflavon juga mempunyai efek terhadap penurunan kolesterol. Mekanisme penurunan kolesterol oleh isoflavon melalui pengaruh terhadap peningkatan katabolisme sel lemak untuk pembentukan energi, yang berakibat pada penurunan kandungan kolesterol (Pawiroharsono, 1998). 5. Kelarutan flavonoida Aglikon flavonoida adalah polifenol, oleh karena itu mempunyai sifat kimia fenol. Adanya gula yang terikat pada aglikon akan menaikkan sifat polaritas dari flavonoida yang bersangkutan (Mursyidi, 1990). Senyawa polar akan larut dalam pelarut polar. Oleh karena itu flavonoida larut dalam pelarut polar. Pelarut polar yang biasa digunakan untuk menyari glikosida flavonoida adalah air, metanol, etanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida dan dimetil formamid. Penyarian akan memberikan hasil yang baik bila digunakan campuran pelarut-pelarut di atas dengan air. Untuk aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, flavon, serta flavonol yang mempunyai gugus metoksi, akan lebih mudah larut dalam pelarut yang kurang polar misalnya eter dan kloroform (Mursyidi, 1990).

11


6. Isolasi senyawa flavonoida Isolasi flavonoida dilakukan dengan cara penyarian. Flavonoida mudah mengalami peruraian karena panas, kerja enzim, adanya air, dan pH. Oleh karena itu beberapa usaha dilakukan untuk menghindari perubahan molekul flavonoida pada proses isolasi (Mursyidi, 1990). Banyak senyawa dari golongan ini yang mudah larut dalam air, terutama bentuk glikosidanya, dan oleh karena itu senyawa ini berada dalam ekstrak air tumbuhan. Bahkan senyawa yang hanya larut sedikit dalam air kepolarannya memadai untuk diekstraksi dengan baik memakai metanol, etanol, atau aseton; dan metanol 80 % barangkali merupakan pelarut yang sering dipakai untuk ekstraksi flavonoida (Robinson, 1995). Flavonoida yang diperoleh dengan cara penyarian umumnya merupakan campuran. Isolasi masing-masing komponen biasanya dilakukan dengan teknik kromatografi (Mursyidi, 1990). 7. Identifikasi warna flavonoida Flavonoida dapat diidentifikasi dengan mengamati perubahan warna pada KLT sebelum dan sesudah diuapi amonia yang dilihat pada sinar UV 366 nm. Menurut Markham (1988) warna bercak dapat digunakan sebagai petunjuk adanya flavonoida tertentu (Tabel I). Dalam suasana basa, aglikon flavonoida yang mengandung gugus hidroksi (bersifat asam) larut dalam air dengan membentuk warna kuning dan jika diasamkan akan mengendap kembali. Pembentukan warna kuning dalam

12


suasana basa tersebut digunakan untuk deteksi pada kromatografi dan spektrofotometri (Mursyidi, 1990). Penelitian fitokimia juga dilakukan dengan uji kimia tertentu seperti menggunakan pereaksi NaOH, H2SO4 pekat, logam Mg dan HCl (Tabel II) (Venkataraman, 1962). Uji warna memberikan gambaran umum golongan flavonoida yang terkandung pada hidroksilasi dan macam substitusi pada senyawa tersebut sehingga pada beberapa turunan flavonoida tidak memberikan warna

pada

uji

tersebut.

Uji

warna

spektrofotometri ultraviolet (Markham, 1988).

13

selanjutnya

didukung

analisis


O

O

O

Khalkon

Flavon

O

O

OH

OH

O

O

Flavonol

Dihidroflavonol O C H

O

O

O

Flavanon

Auron

O

O

OH

OH

OH

Leukoantosianidin

Antosianidin

O

O

OH

OH

O

Katekin

Flavanonol

O

O O

Isoflavon

Dihidrokalkon

Gambar 3. Kerangka struktur golongan-golongan flavonoida (Robinson, 1995)

14


Tabel I. Penampakan warna bercak pada kromatogram yang dideteksi dengan uap amonia (Markham, 1988) Warna bercak dengan UV 366 nm Jenis flavonoida yang mungkin tanpa NH3 dengan NH3 Lembayung Kuning, hijau- a. Biasanya 5-OH flavon atau flavonol (tersulih gelap kuning atau hijau pada 3-O dan mempunyai 4’-OH) b. Kadang-kadang 5-OH flavanon dan 4’-OH khalkon tanpa OH pada cincin B Perubahan warna a. Biasanya flavon atau flavonol tersulih pada 3-O sedikit atau tanpa mempunyai 5-OH tetapi tanpa 4’-OH bebas perubahan warna b. Beberapa 6- atau 8-OH flavon dan flavonol tersulih pada 3-O serta mengandung 5-OH c. Isoflavon, dihidroflavon, biflavonil dan beberapa flavanon yang mengandung 5-OH d. Khalkon yang mengandung 2- atau 4-OH bebas Biru muda Beberapa 5-OH flavanon Merah atau jingga Khalkon yang mengandung 2- dan/atau 4-OH bebas Fluoresensi biru Fluoresensi hijau- a. Flavon dan Flavanon yang tidak mengandung 5muda kuning atau hijau- OH, misalnya 5-OH-glikosida biru b. Flavanol tanpa 5-OH bebas tetapi tersulih pada 3-OH Perubahan warna Isoflavon yang tidak mengandung 5-OH sedikit atau tanpa perubahan Fluoresensi murup Isoflavon yang tak mengandung 5-OH bebas biru muda Tak tampak Fluoresensi biru Isoflavon tanpa 5-OH bebas muda Kuning redup Perubahan warna Flavonol yang mengandung 3-OH bebas dan dan kuning, atau sedikit atau tanpa mempunyai atau tak mempunyai 5-OH bebas fluoresensi perubahan (kadang-kadang dari dihidroflavonol) jingga Fluoresensi Jingga atau merah Auron yang mengandung 4’-OH bebas dan kuning beberapa 2- atau 4-OH bebas Hijau-kuning, Perubahan warna a. Auron yang tak mengandung 4’-OH bebas dan hijau-biru, atau sedikit atau tanpa flavanon tanpa 5-OH bebas hijau perubahan b. Flavanol yang mengandung 3-OH bebas dan disertai atau tanpa 5-OH bebas Merah jingga Biru Antosianidin 3-glikosida redup atau merah senduduk Merah jambu Biru Sebagian besar antosianidin 3,5-diglikosida atau fluoresensi kuning

15


Tabel II. Penampakan warna golongan flavonoida dengan pereaksi (Venkataraman, 1962) Tipe flavonoida NaOH

Reaksi warna H2SO4 pekat

Logam Mg dan HCl Jingga, merah, atau Tidak berwarna magenta

Khalkon

Jingga, merah

Dihidrokhalkon

Agak kuning

Agak kuning

Tidak berwarna

Auron

Merah-ungu

Merah-magenta

Tidak berwarna

Flavanon

Jingga Kuning-jingga, jika dingin merah, dipanaskan ungu

Flavon

Kuning

Flavonol

Kuning-jingga Kuning-jingga, bila teroksidasi dengan fluoresensi coklat

Merah-magenta

Flavanonol

Kuning cepat Agak merah-kuning menjadi coklat

Merah-magenta

Leukoantosianin

Kuning

Merah tua

Merah muda

Antosianidin dan antosianin

Biru-violet

Kuning-jingga

Merah-merah muda

Katekin

Kuning berubah Merah merah/coklat

Isoflavon

Kuning

Kuning

Kuning

Isoflavanon

Kuning

Kuning

Tidak berwarna

Kuning-jingga, dengan berfluoresensi

Merah-magenta, violet, biru Kuning, merah

Tidak berwarna

E. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisikokimia. Dalam berbagai jenis teknik kromatografi, KLT adalah yang paling cocok untuk analisis obat di laboratorium farmasi karena metodenya sederhana, cepat dalam

16


pemisahan, sensitif, kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang dipisahkan dan memerlukan jumlah cuplikan yang sangat sedikit. KLT adalah suatu cara pemisahan yang berdasarkan atas pembagian campuran senyawa ke dalam dua fase yaitu fase diam (padat/cair) dan fase bergerak (cair/gas). Adsorben yang umum digunakan antara lain silika gel, alumina, dan selulosa. Untuk penggunaan khusus digunakan sephadex atau resin penukar ion. Silika gel bersifat asam dan berguna untuk kromatografi pembagian maupun penyerapan. Alumina bersifat basa terutama digunakan untuk kromatografi penyerapan (Harborne,1987). Fase gerak adalah medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Fase gerak bergerak dalam fase diam disebabkan karena adanya gaya kapiler. Pelarut yang digunakan dengan tingkat mutu analitik. Pemilihan pelarut yang digunakan sebagai fase gerak tergantung dari sifat kelarutan komponen yang akan dipisahkan (Stahl, 1985). Senyawa

yang

dideteksi

biasanya

sebagai

bercak

warna

atau

berfluoresensi pada UV setelah direaksikan dengan pereaksi semprot yang sesuai. Kromatogram yang dihasilkan diuraikan dari zona-zona dan dicirikan oleh nilainilai hRf. Bilangan Rf adalah jarak yang ditempuh senyawa pada kromatografi, nisbi terhadap garis depan. Bilangan Rf diperoleh dengan mengukur jarak antar bercak pada titik awal dan jarak rambat bercak yang dihasilkan senyawa, dan jarak ini kemudian dibagi dengan jarak antara titik awal dan garis depan yaitu jarak yang ditempuh cairan pengembang (Harborne, 1987).

17


Rf =

jarak (cm) titik pusat bercak jarak (cm) rambat fase gerak

(Stahl, 1985). Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapis tipis yang juga mempengaruhi harga Rf antara lain struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan, sifat dari penyerap dan derajat aktivitasnya, tebal dan kerataan dari lapisan penyerap, pelarut (dan derajat kemurniannya) fase gerak, derajat kejenuhan dari uap dalam bejana pengembangan yang digunakan, teknik percobaan, jumlah cuplikan yang digunakan, suhu dan kesetimbangan (Sastrohamidjojo, 2001).

F. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Kromatografi lapis tipis preparatif merupakan salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai peralatan paling dasar (Hostettmann et al., 1995). Ukuran pelat kromatografi biasanya 20 x 20 cm. Ketebalan lapisan dan ukuran pelat mempengaruhi jumlah bahan yang akan dipisahkan dengan KLTP (Stahl, 1969). Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada pelat KLTP. Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5-10 %. Cuplikan ditotolkan berupa pita yang harus sesempit mungkin karena pemisahan bergantung pada lebar pita. Penotolan dapat dilakukan dengan tangan (pipet) tetapi lebih baik dengan penotol otomatis (Stahl, 1967). Pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari pelat dengan spatula atau pengerok berbentuk tabung. Senyawa harus diekstraksi dari penjerap dengan

18


pelarut yang paling kurang polar yang mungkin (sekitar 5 ml pelarut untuk 1 g penjerap) (Hostettmann et al., 1995). KLT preparatif adalah cara yang ideal untuk pemisahan cuplikan kecil (50 mg sampai 1 g) dari senyawa yang kurang atsiri (Gritter, Bobbitt, Schwarting, 1991). Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan dalam jumlah gram, sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah miligram (Hostettmann et al., 1995). KLTP berguna untuk memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang lazimnya berjumlah kecil dan campurannya rumit, dan untuk memperoleh cuplikan yang murni untuk mengalibrasi KLT kuantitatif (Gritter et al., 1991). Beberapa keuntungan KLTP dari kromatografi kolom adalah pemisahan yang lebih baik karena pemisahan yang dihasilkan berupa bercak yang tidak bergerak, mudah mengambil senyawa-senyawa yang terpisah secara individu dengan jalan mengeroknya dan mengumpulkan tiap-tiap lapisan, dan peralatannya yang sederhana (Gasparic et al., 1978).

G. Spektrofotometri Ultraviolet 1. Tinjauan umum Spektrofotometri ultraviolet adalah interaksi molekul yang mempunyai gugus kromofor dengan radiasi elektromagnetik pada daerah ultraviolet yang menyebabkan transisi elektromagnetik dan diperoleh spektra absorbsi elektron, karena transisi elektronik yang terjadi tergantung dari strukturnya dan jumlah radiasi elektromagnetik yang diabsorbsi ada hubungan dengan jumlah molekul

19


pengabsorbsi, maka spektra absorbsi dapat digunakan untuk analisa kualitatif yaitu memberikan informasi mengenai pola oksigenasi atau penentuan kedudukan hidroksi fenol (Sastrohamidjojo, 2001). Spektrum ultraviolet adalah suatu gambar antara panjang gelombang atau frekuensi serapan lawan intensitas serapan (Absorbansi). Absorbans suatu senyawa pada suatu panjang gelombang tertentu bertambah dengan banyaknya molekul yang mengalami transisi. Oleh karena itu absorban bergantung pada struktur elektronik senyawanya dan juga pada kepekatan senyawa tersebut (Fessenden & Fessenden, 1999). Transisi elektronik ditentukan oleh konfigurasi elektron dari orbital molekul dan transisi vibrasi-rotasi ditentukan oleh gugusan-gugusan fungsional dari suatu molekul, jadi transisi ini ditentukan oleh struktur molekul sehingga terdapat hubungan antara struktur molekul dengan frekuensi atau panjang gelombang.

Hubungan

ini

merupakan

dasar

dari

analisa

kualitatif

(Sastrohamidjojo, 1985). Terdapat pertalian antara panjang gelombang, frekuensi, dan kecepatan cahaya yang dinyatakan oleh persamaan :

λν = c / n dimana c = kecepatan cahaya dalam hampa (2,9976 x 1010 cm/det) dan n adalah indeks

bias

(perbandingan

kecepatan

cahaya

dalam

hampa

dengan

kecepatannya dalam media) (Sastrohamidjojo, 2001). Untuk melukiskan bagaimana radiasi elektromagnetik berinteraksi dengan benda, adalah perlu memikirkan berkas sinar sebagai foton. Tenaga

20


setiap foton berbanding langsung dengan frekuensi radiasi dan hal ini dinyatakan dalam persamaan : E = hν = h c / n λ

dimana E = tenaga foton dalam erg, ν = frekuensi radiasi elektromagnetik dalam hertz, dan h = tetapan Planck, 6,624 x 10-34 J-det. Foton yang memiliki frekuensi yang tinggi (panjang gelombang pendek) mempunyai tenaga yang lebih tinggi daripada foton yang berfrekuensi rendah (panjang gelombang panjang) (Sastrohamidjojo, 2001). Kromofor merupakan gugus molekul suatu zat yang dapat menyerap sinar tampak dan UV. Molekul yang mengandung kromofor dinamakan kromogen. Auksokrom merupakan gugus yang bila berdiri sendiri tidak dapat menyerap sinar tampak dan UV, tetapi jika terikat pada sebuah kromofor akan merubah panjang gelombang dan intensitas resapan maksimum. Contoh auksokrom adalah gugus hidroksil, gugus amino, dan halogen. Serah terima antara elektron (n) dan elektron (π) pada kromofor membentuk (n- π konjugasi). Perubahan spektrum dapat diklasifikasikan sebagai berikut: a. Pergeseran batokromik Pergeseran resapan ke arah panjang gelombang lebih panjang (red shift). b. Pergeseran hipsokromik Pergeseran resapan ke arah panjang gelombang lebih pendek (blue shift). c. Efek hiperkromik Bertambahnya intensitas resapan gugus kromofor.

21


d. Efek hipokromik Berkurangnya intensitas resapan gugus kromofor. Intensitas resapan dinyatakan dalam absorbtivitas molar pada panjang gelombang maksimum, semakin besar nilai absorbtivitas molar makin besar intensitasnya (Christian, 2004). 2. Spektrum senyawa flavonoida Flavonoida mempunyai sistem aromatik terkonjugasi, karena itu mempunyai pita serapan di daerah ultraviolet/cahaya tampak. Spektra dari golongan flavonoida dalam metanol memperlihatkan dua puncak utama yaitu pita I dan pita II pada daerah 240 nm-400 nm (Tabel III). Pita I menunjukkan absorbsi yang sesuai dengan cincin B sinamoil, sedangkan pita II berhubungan dengan absorbsi cincin A benzoil (Gambar 4). Tabel III. Rentangan serapan spektrum UV pada flavonoida (Markham, 1988) Pita II (nm) 250-280 250-280 250-280 245-275 275-295 230-270 (kekuatan lemah) 230-270 (kekuatan kuat) 270-280

Pita I (nm) 310-350 330-360 350-385 310-330 320-329 300-330 340-390

Jenis Flavonoida Flavon Flavonol (3-OH tersubstitusi) Flavonol 3-OH bebas Isoflavon Isoflavon 5-deoksi-6,7 dioksigenasi Flavanon dan dihidroflavonol Khalkon

380-430

Auron

465-560

Antosianin, antosianidin

22


3' 2' 1

8 9

7 A 6 5

O

1'

2

4' B 5' 6'

C 3

10

4 O

Gambar 4. Dua komponen penyerap (benzoil dan sinamoil) (Untoro, 1990)

Ket : 1 = komponen penyerap benzoil sebelum garis lurus 2 = komponen penyerap sinamoil setelah garis putus-putus Senyawa fenolik dapat menunjukkan ciri karakteristik yaitu efek pergeseran batokromik dengan adanya basa natrium hidroksida yang merupakan basa kuat sehingga dapat mengionisasi sejumlah gugus hidroksi pada inti flavonoida (Tabel IV). Natrium asetat (NaOAc) merupakan basa lemah dan mengionisasi gugus yang mempunyai sifat keasaman tinggi yang dalam molekul flavonoida dapat ditemukan pada posisi 7. Ada beberapa perkecualian, penambahan NaOAc akan menunjukkan pergeseran batokromik sebesar 5-20 nm pada pita II untuk flavon dan flavonol yang mempunyai gugus 7-OH bebas (Tabel V). Penambahan NaOAc dan H3BO3 akan membentuk kompleks dengan gugus orto dihidroksi pada semua posisi kecuali pada atom C5 dan C6 (Tabel VI). Adanya AlCl3 dan AlCl3/HCl, dapat membentuk kompleks tahan asam antara gugus hidroksil dan keton yang bertentangan dan membentuk kompleks

23


tak tahan asam dengan gugus orto-dihidroksi, pereaksi ini dapat digunakan untuk mendeteksi kedua gugus tersebut. Jadi spektrum AlCl3 merupakan penjumlahan pengaruh semua kompleks terhadap spektrum, sedangkan spektrum AlCl3 dan HCl hanya merupakan pengaruh kompleks hidroksi-keto (Tabel VII).

24


Tabel IV. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOH (Markham, 1988) Jenis Pergeseran tampak Petunjuk Flavonoida penafsiran Pita I Pita II Flavon Kekuatannya 3’,4’OH, o-diOH Flavonol menurun terus pada cincin A dan pada cincin B: 3OH yang berdampingan Mantap ±45-65 nm 4’-OH kekuatan tidak menurun Mantap ±45-65 nm 3-OH, tidak ada kekuatan menurun 4’-OH bebas Pita baru (bandingkan dengan MeOH) 7-OH Isoflavon, Tidak ada Tidak ada OH flavanon, dan pergeseran pada cincin A dihidroflavon Kekuatan o-di OH pada ol menurun cincin A (penurunan) lambat; O-diOH pada cincin B) Bergeser dari Flavanon dan ±280 nm ke ±325 dihidroflavonol nm, kekuatan dengan 5,7-OH, 7meningkat ke OH tanpa 5-OH 330-340 nm bebas Auron + 80-95 nm 4’OH (auron) 6Khalkon (kekuatan OH tanpa meningkat) oksigenasi pada 4’ (auron) +60-70 (kekuatan naik) pergeseran 6-OH dengan kecil oksigenasi pada 4’ (auron) +60-100nm 4’OH (auron) (kekuatan naik)

Antosianidin Antosian

tanpa kenaikan kekuatan

2-OH atau 4’OH dan tanpa 4’OH

+40-50 nm

4’OH (2’OH atau 4’OH) Nihil

Semuanya terurai kecuali 3deoksiantosianin

25


Tabel V. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOAc (Markham, 1988) Jenis flavonoida Flavon

Pergeseran yang tampak Pita I Pita II +5-20 nm (berkurang bila Flavonol ada oksigenasi Isoflavon pada 6/8) Kekuatannya berkurang dengan bertambahnya waktu Flavanon +35 nm Dihidroflavonol +60 nm Kekuatannya berkurang dengan bertambahnya waktu Pergeseran batokromik atau bahu pada panjang gelombang yang lebih panjang

Petunjuk Flavonoida 7-OH

-OH di 6,7 atau 7,8 atau 3,4’ 7-OH (dengan 5-OH) 7-OH (tanpa 5-OH) -OH di 6,7 atau 7,8 4’-OH dan atau 4OH (khalkon) 4’-OH dan atau tanpa 6-OH (Auron)

Tabel VI. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOAc dan H3BO3 (Markham, 1988) Jenis flavonoida Flavonol, Auron, Khalkon

Pergeseran Tampak Pita I Pita II +12-36 nm (nisbi terhadap spektrum metanol), pergeseran lebih kecil

Petunjuk penafsiran o-di OH pada cincin B

o-di OH cincin A atau 7,8) +10-15 nm (nisbi o-di OH terhadap spektrum cincin A metanol) atau 7,8)

Isoflavon, Flavanon, Dihidroflavonol

26

pada (6,7 pada (6,7


Tabel VII. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan AlCl3 serta AlCl3 dan HCl (Markham, 1988) Jenis flavonoida Pergeseran yang tampak (Pereaksi) Pita I Pita II Flavanon dan +35 sampai 55 nm flavonon (AlCl3 +17 sampai 20 nm dan HCl) Tak berubah + 50 sampai 60 nm (AlCl3)

Pergeseran AlCl3/HCl tambah 30 sampai 40 nm Pergeseran AlCl3/HCl tambah 20 sampai 25 nm

Isoflavon, flavanon, dan dihidroflavonol (AlCl3 dan HCl) (AlCl3)

Auron, Khalkon (AlCl3 dan HCl)

(AlCl3)

Antosianidin, Antosianin (AlCl3)

+48 sampai 64 nm +40 nm +60 sampai 70 nm Pergeseran AlCl3/HCl tambah 40 sampai 70 nm Penambahan lebih kecil +25 sampai 35 nm (Pada pH 2-4) Pergeseran lebih besar

Petunjuk penafsiran 5- OH 5-OH dengan oksigenasi pada 6 Mungkin 5-OH dengan gugus prenil pada 6 Mungkin 3-OH (dengan atau tanpa 5OH) o-diOH pada cincin B

o-di OH pada cincin A (Tambahan pada pergeseran o-di OH pada cincin B) +10 sampai 14 5-OH (Isoflavon) nm (Flavanon, +20 sampai 26 5-OH dihidroflavonol) nm Pergeseran o-diOH pada cincin A AlCl3/HCl, (6,7 dan 7,8) tambah 11 sampai 30 nm Dihidroflavonol tanpa Pergeseran 5-OH (tambahan pada AlCl3/HCl tambah 30 sembarang pergeseran o-di OH) sampai 38 nm 2’-OH (Khalkon) 2’-OH (Khalkon dengan oksigenasi pada 3’ 4-OH (Auron) o-diOH pada cincin B Mungkin o-diOH pada cincin A o-diOH Banyak o-diOH atau odiOH (3-deoksi antosianidin)

27


H. Keterangan Empiris Penelitian ini bersifat eksploratif dengan tujuan untuk mengidentifikasi struktur parsial senyawa flavonoida dalam herba pegagan embun selain hiperin hasil isolasi secara KLTP yang dapat ditentukan dari warna bercak dan harga Rf pada KLT, hasil reaksi warna dan spektrofotometri UV berdasarkan pembentukan pita serapan yang karakteristik dengan penambahan pereaksi geser.

28


BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian non eksperimental yang dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian a. Variabel terkendali : sumber tumbuhan, pengumpulan tumbuhan, pengeringan, pembuatan serbuk, proses penyarian flavonoida dan bahanbahan pereaksi yang digunakan. b. Variabel tak terkendali : kondisi fisiologis tumbuhan dan kondisi tempat tumbuh. 2. Definisi operasional a. Isolasi flavonoida herba pegagan embun adalah proses pengambilan senyawa flavonoida dari herba pegagan embun dengan maserasi dan dilanjutkan dengan kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP). b. Identifikasi senyawa flavonoida adalah uji kualitatif untuk mengetahui prakiraan struktur parsial senyawa flavonoida dalam herba pegagan embun secara kromatografi lapis tipis (KLT), reaksi warna dan spektrofotometri ultraviolet.

29


c. Simplisia herba pegagan embun adalah seluruh bagian tumbuhan pegagan embun yang ada di atas permukaan tanah yang telah dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. d. Maserasi adalah cara penyarian sederhana yang dilakukan dengan merendam serbuk simplisia ke dalam cairan penyari yaitu campuran metanol : air (dengan perbandingan 9 : 1 dan 1 : 1) yang disimpan selama 6-12 jam dengan digojog pada shaker.

C. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian a. Bahan tumbuhan yang digunakan adalah herba pegagan embun. b. Semua bahan kimia yang digunakan berderajat p.a (pro analysis), produk Merck kecuali dinyatakan lain. Bahan yang diperlukan dalam penelitian : metanol, n-butanol, asam asetat, amonia pekat, aluminium klorida, magnesium, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, natrium hidroksida, natrium asetat anhidrat, asam borat. 2. Alat penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian : spektrofotometer UV/vis model Genesys 6 split beam, lampu UV 365 nm, oven, blender, ayakan, kertas saring, vakum rotaevaporator, penangas air, vakum, shaker, alat-alat gelas (corong pisah, pipet tetes, gelas ukur, Beaker glass, corong, pengaduk, plat tetes, Erlenmeyer, labu alas bulat, pipet kapiler, alat penyemprot bercak, sintered glass, gelas arloji, pipet ukur, flakon, cawan porselen).

30


D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tumbuhan pegagan embun Determinasi terhadap tumbuhan pegagan embun dilakukan dengan menggunakan kunci determinasi tanaman (Backer dan Bakhuizen Van den Brink Jr.; 1963, 1965). 2. Pengumpulan bahan Bahan berupa herba yang diperoleh dari lingkungan kampus Universitas Sanata Dharma, Paingan dikumpulkan pada bulan Januari tahun 2006. 3. Pembuatan serbuk simplisia Herba tumbuhan pegagan embun terlebih dahulu dibersihkan dari debu dan kotoran pada air mengalir. Kemudian herba dikeringkan dengan dianginanginkan. Herba dinyatakan kering apabila ketika diremas mudah hancur. Herba yang telah kering tersebut diserbuk dengan menggunakan blender kemudian diayak. Serbuk disimpan dalam plastik hitam yang diikat rapat. 4. Penyarian flavonoida Bahan yang telah diserbuk dan diayak, ditimbang sebanyak 20 gram. Penyarian dilakukan dengan cara maserasi. Proses maserasi dilakukan dengan merendam serbuk menggunakan campuran pelarut pertama yaitu metanol : air (9 : 1) sebanyak 150 ml. Campuran digojog dengan shaker selama 6-12 jam, di tempat yang terlindung cahaya pada suhu kamar. Untuk pemisahan serbuk dan cairan hasil penyarian, dilakukan penyaringan menggunakan kertas saring. Bagian serbuk disari lagi dengan pelarut metanol : air (1 : 1) sebanyak 150 ml,

31


dilakukan dengan cara yang sama seperti di atas. Kedua hasil penyarian dicampur, diuapkan dengan vakum rotaevaporator hingga tinggal sepertiga atau metanolnya hampir menguap semua. Pelarut yang masih tersisa diuapkan pada oven. 5. Pemeriksaan pendahuluan flavonoida dengan KLT Pemeriksaan flavonoida dilakukan terhadap ekstrak metanol secara KLT dengan menggunakan fase diam selulosa dan fase gerak BAW (n-butanol : asam asetat : air = 4 : 1 : 5, fase atas). Ekstrak metanol ditotolkan pada lempeng selulosa, kemudian dikembangkan dengan jarak pengembangan 10 cm dari totolan. Pemisahan bercak yang didapat pada kromatogram dideteksi dengan menggunakan lampu UV 365 nm, sebelum dan sesudah diuapi amonia (warna reversible). 6. Isolasi flavonoida dengan KLTP Isolasi dengan KLTP dilakukan dengan fase diam selulosa dan fase gerak BAW. Ekstrak metanol ditotolkan berupa garis yang selanjutnya dikembangkan dengan jarak pengembangan 10 cm dari totolan, dan didapatkan bercak pemisahan berupa pita. Pita yang diduga sebagai flavonoida dikerok, dimasukkan ke dalam Beaker glass dan dilarutkan dengan metanol. Selanjutnya dilakukan penyaringan dengan menggunakan sintered glass dan disedot dengan vakum. Filtrat yang didapat dikeringkan dan kemudian ditimbang. Dilakukan reisolasi dengan fase diam selulosa dan fase gerak asam asetat 15 %. Reisolasi dilakukan dengan cara yang sama seperti di atas. Isolat flavonoida yang

32


diperoleh digunakan untuk dianalisis dengan KLT multi eluen, reaksi warna dan spektrofotometri UV. Sisa serbuk disimpan. 7. Pemeriksaan kemurnian isolat Kemurnian isolat flavonoida dapat diketahui menggunakan KLT multi eluen. KLT ini menggunakan fase gerak pertama BAW dan fase gerak kedua asam asetat 15 % dengan fase diam selulosa. Jika hasil dari kedua fase gerak tersebut adalah bercak tunggal maka dapat disimpulkan bahwa isolat flavonoida tersebut sudah murni. 8. Reaksi warna flavonoida Isolat flavonoida hasil pemisahan dianalisis dengan uji reaksi warna : a. Tiga tetes larutan isolat pada plat tetes ditambah dengan 1 tetes larutan NaOH 1 % (Larutan NaOH 1 % dibuat dengan melarutkan 1 g NaOH dalam air bebas CO2 hingga 100 ml). Warna yang terjadi dicatat. b. Tiga tetes larutan isolat pada plat tetes ditambah dengan 1 tetes larutan H2SO4 pekat. Warna yang terjadi dicatat. c. Tiga tetes larutan isolat pada plat tetes ditambah sedikit serbuk Mg dan 2 tetes HCl pekat. Warna yang terjadi dicatat. 9. Identifikasi senyawa flavonoida dengan spektrofotometri ultraviolet (Mabry, Markham, Thomas, 1970) Identifikasi dan penentuan struktur parsial isolat flavonoida dilakukan dengan metode spektrofotometri UV dengan melarutkan isolat dalam metanol dan berturut-turut dilakukan pemberian pereaksi geser atau diagnosis yaitu NaOH, AlCl3 dan HCl, natrium asetat anhidrat dan H3BO3.

33


Cara pembuatan pereaksi geser : a. NaOH 2 M Larutan NaOH 2 M dibuat dengan melarutkan 80,00 gram NaOH dalam air bebas CO2 hingga 1000 ml. b. AlCl3 Larutan AlCl3 dibuat dengan melarutkan 5 gram AlCl3 dalam metanol hingga 100 ml. c. HCl Larutan HCl dibuat dengan menambahkan 50 ml HCl pekat ke dalam 100 ml aquadest. d. NaOAc Digunakan serbuk NaOAc anhidrat. e. H3BO3 Digunakan serbuk asam borat anhidrat. Tahap-tahap pengerjaan dengan spektrofotometri UV adalah sebagai berikut : a. Tahap I Larutan isolat flavonoida dalam metanol dimasukkan dalam kuvet sampel. Pada kuvet blanko dimasukkan metanol. Keduanya dibaca serapannya pada panjang gelombang 200-500 nm. b. Tahap II Larutan sampel dari tahap I ditambah 3 tetes pereaksi NaOH, dicampur dan dibaca serapannya pada panjang gelombang 200-500 nm. Setelah 5 menit

34


pembacaan serapan dilakukan kembali untuk mengetahui kemungkinan terjadinya dekomposisi flavonoida. c. Tahap III Larutan isolat flavonoida baru ditambah 6 tetes pereaksi AlCl3, dicampur dan dibaca serapannya pada panjang gelombang 200-500 nm. d. Tahap IV Larutan sampel dari tahap III ditambah 3 tetes pereaksi HCl, dicampur dan dibaca serapannya pada panjang gelombang 200-500 nm. e. Tahap V Larutan isolat flavonoida baru dalam kuvet sampel ditambah serbuk NaOAc anhidrat sampai kira-kira setinggi 2 mm dari dasar kuvet, dikocok dan dibaca serapannya pada panjang gelombang 200-500 nm. f. Tahap VI Larutan sampel dari tahap V ditambah serbuk H3BO3 dengan jumlah setengah dari jumlah NaOAc yang digunakan, dicampur dan dibaca serapannya pada panjang gelombang 200-500 nm.

E. Analisis Data Metode yang dipakai dalam penelitian ini adalah metode non eksperimental deskriptif komparatif dengan data hasil penelitian yang berupa harga Rf, warna bercak pada kromatogram, pembentukan warna pada reaksi warna, dan spektra hasil spektrofotometri UV senyawa flavonoida dengan pergeseran panjang gelombang yang terjadi pada penambahan pereaksi geser.

35


Data tersebut dianalisis dan dibandingkan dengan pustaka acuan menurut Venkataraman (1962) dan Markham (1988).

36


BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN A. Determinasi Tumbuhan Determinasi tumbuhan dilakukan untuk memastikan bahwa tanaman yang diteliti sesuai dengan yang dimaksud sehingga tidak terjadi kesalahan pada jenis tanaman yang digunakan. Berdasar hasil determinasi (lampiran 1), tumbuhan pegagan embun yang digunakan dalam penelitian ini memiliki nama ilmiah Hydrocotyle sibthorpioides Lmk. Bagian tumbuhan yang digunakan untuk determinasi yaitu batang, daun, bunga dan buah.

B. Pengumpulan dan Pengeringan Bahan Bahan berupa herba pegagan embun diperoleh dari lingkungan kampus Universitas Sanata Dharma, Paingan yang dikumpulkan pada bulan Januari tahun 2006. Herba sebelum dikeringkan terlebih dahulu dicuci dengan air mengalir. Pencucian herba dimaksudkan untuk menghilangkan kotoran-kotoran atau bahanbahan asing lain seperti tanah, kerikil, rumput, dan juga dengan pembersihan awal ini diharapkan dapat mengurangi jumlah mikroba. Untuk membuat simplisia agar tidak mudah rusak dan tahan lama, maka herba pegagan embun dikeringkan dengan diangin-anginkan. Pemilihan cara pengeringan ini karena simplisia yang digunakan berupa herba yang bersifat lunak dan tipis. Tujuan dari pengeringan ini adalah mengurangi kadar air agar menghentikan reaksi enzimatik yang dapat menguraikan senyawa aktif dari simplisia tersebut dan juga dengan tidak adanya air dapat mencegah pertumbuhan

37


mikroba pada simplisia. Herba dikatakan kering apabila ketika diremas mudah hancur. Herba yang telah kering kemudian diserbuk dengan menggunakan blender dan diayak dengan ayakan tepung berukuran 35. Simplisia dibuat serbuk dan diayak untuk mendapatkan ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan serbuk lebih banyak kontak dengan cairan penyari sehingga semakin besar dan cepat senyawa aktif tersari. Selanjutnya serbuk disimpan dalam plastik hitam yang diikat rapat dan diharapkan melindungi simplisia dari cahaya dan kelembaban untuk mencegah penguapan dan penguraian zat aktif, karena dengan adanya cahaya dapat menyebabkan terjadinya fotooksidasi yang akan menguraikan susunan-susunan kimia senyawa aktif simplisia.

C. Penyarian Bahan Penyarian dilakukan dengan cara maserasi, karena maserasi merupakan salah satu metode penyarian yang sederhana, mudah dikerjakan, dan untuk menghindari kemungkinan rusaknya senyawa lain selain flavonoida karena pemanasan tinggi yang akan mengganggu proses penyarian.. Pelarut yang digunakan dalam proses penyarian adalah campuran metanol-air dengan perbandingan 9 : 1 dan 1 : 1. Proses maserasi dilakukan dengan merendam serbuk selama 6-12 jam dengan digojog pada shaker. Proses maserasi dengan campuran pelarut pertama (perbandingan 9 : 1) sebanyak 150 ml dilakukan sebanyak satu kali, sedangkan proses maserasi dengan campuran pelarut kedua (perbandingan 1 : 1) sebanyak 150 ml dilakukan sebanyak lima kali. Jadi, kemungkinan besar semua flavonoidanya sudah tersari. Cairan penyari akan

38


menembus membran dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung flavonoida di dalam sel, dan zat aktif akan larut sehingga terjadi perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dan konsentrasi cairan penyari di luar sel. Konsentrasi di dalam sel lebih besar daripada cairan penyari di luar sel karena arah perpindahan terjadi dari konsentrasi tinggi ke rendah maka flavonoida dapat tersari oleh cairan penyari. Pada proses maserasi dilakukan penggojogan dengan shaker untuk meratakan konsentrasi larutan di luar sel sehingga tetap terjadi perbedaan konsentrasi yang berarti antara larutan di dalam sel dan di luar sel. Ekstrak yang didapat kemudian diuji dengan kromatografi lapis tipis (KLT).

D. Pemeriksaan Pendahuluan Flavonoida Secara KLT Pemeriksaan

pendahuluan

adanya

flavonoida

dilakukan

dengan

menotolkan ekstrak metanol herba pegagan embun dan rutin sebagai pembanding pada KLT dengan fase diam selulosa yang kemudian dielusi menggunakan fase gerak n-butanol : asam asetat : air (BAW = 4 : 1 : 5, fase atas). Pemilihan fase diam dan fase gerak didasarkan pada polaritas dan sifat flavonoida. Penggunaan selulosa sebagai fase diam karena selulosa bersifat non polar sehingga sesuai dengan senyawa flavonoida yang bersifat polar dan juga selulosa dapat memisahkan glikosida dari aglikon yang kurang polar. Apabila digunakan fase diam lain contohnya silika yang mengandung logam CaSO4 akan mengakibatkan terjadinya kompleks dengan flavonoida yang banyak mengandung gugus OH dan dengan adanya kompleks dapat menyebabkan terjadinya pemisahan yang tidak sempurna sehingga mengganggu dalam identifikasi bercak.

39


Fase gerak yang dipakai adalah BAW karena BAW bersifat polar sehingga sesuai dengan flavonoida yang juga bersifat polar. Dengan persamaan sifat polar ini maka BAW dapat mengelusi flavonoida dengan baik karena akan terjadi interaksi yang lebih kuat antara flavonoida dengan BAW daripada flavonoida dengan selulosa. Ketiga larutan tersebut akan membentuk dua lapisan, yaitu fase atas dan fase bawah. Pemisahan disebabkan adanya perbedaan sifat kepolaran yaitu asam asetat dan air lebih polar dibandingkan dengan n-butanol. Asam asetat dengan sifatnya yang polar dan volumenya yang sedikit dapat larut dalam air. Fase atas mengandung n-butanol namun karena volume di fase atas lebih banyak daripada volume pada n-butanol yang semula ditambahkan maka menandakan adanya air dan asam asetat yang terdispersi dalam n-butanol. Untuk deteksi bercak pemisahan digunakan cahaya tampak dan UV 365 nm sebelum dan sesudah diuapi amonia pekat. KLT menggunakan fase diam selulosa dengan fase gerak BAW menghasilkan kromatogram (Gambar 5) dimana terdapat 3 bercak, ketiganya diduga sebagai flavonoida. Ketiga bercak tersebut memiliki nilai Rf sebagai berikut 0,63; 0,76; dan 0,90. Diperoleh juga harga Rf rutin 0,73 (Tabel VIII). Rutin berfungsi sebagai senyawa baku pembanding. Digunakan rutin karena rutin memiliki aglikon yang sama dengan hiperin yaitu kuersetin. Sehingga dengan penggunaan rutin sebagai senyawa baku pembanding diharapkan dapat dipilih bercak yang bukan hiperin untuk dianalisis lebih lanjut. Bercak dengan Rf 0,63 dan 0,90 memiliki penampakan warna yang sama dengan rutin yaitu pada cahaya tampak bercak tidak tampak namun ketika dilihat pada UV 365 nm warna yang tampak adalah ungu. Sedangkan bercak dengan Rf

40


0,76 pada cahaya tampak bercak tidak tampak namun ketika dilihat pada UV 365 nm warna yang tampak adalah fluoresensi biru muda. Kemudian kromatogram diuapi dengan uap amonia pekat yang dengan cepat menimbulkan bercak berwarna kuning yang mudah hilang pula, namun pada UV 365 nm warna yang timbul tidak jauh berbeda dengan sebelum diuapi amonia pekat pada UV 365 nm (Gambar 6).

41


Gambar 5. Kromatogram uji KLT pendahuluan ekstrak metanol herba pegagan embun, fase gerak BAW (4 : 1 : 5, fase atas), fase diam selulosa, jarak pengembangan 10 cm, deteksi dengan lampu UV 365 nm sesudah diuapi amonia. Keterangan : A dan B : Ekstrak metanol herba pegagan embun (Rf a : 0,63; Rf b : 0,76; Rf c : 0,90) C : Rutin (Rf : 0,73)

42


Tabel VIII. Penampakan warna bercak sampel (ekstrak metanol herba pegagan embun) dan pembanding (rutin 0,05% dalam metanol) sebelum dan sesudah diberi pereaksi uap amonia pekat yang dideteksi dengan cahaya tampak dan UV 365 nm. Bercak Pembanding (C) Sampel (A dan B)

a b c

Tanpa pereaksi Cahaya UV 365 tampak nm Tidak Ungu tampak Tidak Ungu tampak Tidak Fluoresensi tampak biru muda Tidak Ungu tampak

Diuapi amonia Cahaya UV 365 tampak nm Kuning Ungu

0,73

Kuning

Ungu

0,63

Kuning

Fluoresensi biru muda Ungu

0,76

Kuning

0,90

OH

OH HO

Rf

O

O

+

O

NH3 -NH4 O

O OH O

O

O

Gambar 6. Reaksi yang terjadi setelah diberi uap amonia

Struktur flavonoida memiliki gugus auksokrom OH dengan atom O yang sifatnya senang untuk menarik elektron, dengan adanya basa amonia akan mudah melepaskan H yang kemudian diikat oleh amonia sehingga O memiliki 3 pasang elektron bebas. Dengan adanya tambahan elektron tersebut, energi yang diperlukan untuk mempromosikan elektronnya semakin kecil sehingga akan diserap pada panjang gelombang yang lebih besar. Warna kuning terjadi karena terbentuknya kuinoid. Kuinoid merupakan kromofor yang dapat menyebabkan

43


suatu senyawa menjadi berwarna. Warna dapat cepat kembali seperti semula karena di udara terdapat banyak uap air (H-OH) yang akan memberikan H pada O yang kelebihan elektron sehingga reaksi kembali seperti semula (reversible). Dengan melihat data perubahan warna pada ketiga bercak dan dibandingkan menurut acuan (Markham, 1988), dapat dinyatakan bahwa ketiga bercak tersebut merupakan senyawa flavonoida.

E. Isolasi Flavonoida dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Isolasi flavonoida secara KLTP dengan cara menotolkan ekstrak metanol herba pegagan embun berupa pita memanjang. Fase diam yang digunakan adalah selulosa dan fase geraknya adalah BAW. Pada KLTP ini dihasilkan 3 bercak pemisahan, 2 dari 3 bercak tersebut yang memiliki intensitas warna yang kuat dikerok dan dilarutkan dalam metanol yang kemudian disebut isolat I untuk bercak dengan Rf 0,76 dan isolat II untuk bercak dengan Rf 0,90. Kedua isolat tersebut selanjutnya diperiksa kemurniannya dengan kromatografi lapis tipis multi eluen (KLT multi eluen). KLT multi eluen merupakan KLT dengan menggunakan lebih dari satu fase gerak. Fase diam yang digunakan adalah selulosa dengan fase gerak BAW dan asam asetat 15 % yang dideteksi dengan sinar UV 365 nm. Dari KLT multi eluen isolat I dengan fase gerak BAW tampak 1 bercak dengan Rf 0,73, sedangkan dari KLT multi eluen dengan fase gerak asam asetat 15 % tampak 2 bercak dengan Rf 0,39 dan 0,86. Jadi, diketahui bahwa isolat I

44


belum murni. Dan selanjutnya dari KLT multi eluen isolat II diperoleh hasil yang sama dengan KLT multi eluen isolat I, yaitu dengan fase gerak BAW tampak 1 bercak dengan Rf 0,90 dan dengan fase gerak asam asetat 15 % tampak 2 bercak dengan Rf 0,55 dan 0,80. Jadi, diperoleh hasil bahwa kedua isolat belum murni sehingga perlu dilakukan reisolasi. Karena diketahui bahwa KLT multi eluen untuk kedua isolat dengan fase gerak asam asetat 15 % menghasilkan 2 bercak, sedangkan dengan fase gerak BAW hanya menghasilkan 1 bercak maka untuk reisolasi dengan KLTP digunakan fase gerak asam asetat 15 % dengan fase diam yang sama, yaitu selulosa. Dari KLTP isolat I diperoleh 3 pita pemisahan yaitu pita dengan Rf 0,36 (isolat a) berwarna ungu; Rf 0,77 (isolat b) dan 0,86 (isolat c) berwarna biru. Sedangkan dari KLTP isolat II diperoleh 3 pita pemisahan yaitu pita dengan Rf 0,50 (isolat d) berwarna ungu; Rf 0,73 (isolat e) dan 0,86 (isolat f) berwarna biru. Setiap pita pemisahan masing-masing isolat dikerok dan hasil kerokan dari pita dengan warna dan Rf yang hampir sama dicampur, yaitu isolat b dengan isolat e dan isolat c dengan isolat f. Sehingga, didapatkan 4 isolat yaitu isolat a (A), isolat campuran b dan e (B), isolat campuran c dan f (C), dan isolat d (D). Selanjutnya setiap isolat dilarutkan dalam metanol dan dianalisis lagi kemurniannya dengan KLT multi eluen. Isolat tersebut selanjutnya akan digunakan untuk pemeriksaan kemurnian dengan KLT multi eluen, untuk reaksi warna dan untuk pemeriksaan spektrofotometri UV.

45


F. Pemeriksaan Kemurnian Isolat Sebelum semua isolat dianalisis lebih lanjut, terlebih dahulu diperiksa kemurniannya agar tidak mengganggu proses analisis reaksi warna dan spektrofotometri UV. Pada pemeriksaan ini digunakan KLT multi eluen dengan fase gerak pertama adalah BAW dan fase gerak kedua adalah asam asetat 15 %. Dari KLT dengan fase gerak pertama, yaitu BAW tampak bahwa semua isolat hanya menghasilkan 1 bercak. Masing-masing isolat menghasilkan bercak dengan Rf 0,79 (isolat A); 0,77 (isolat B); 0,76 (isolat C) dan 0,76 (isolat D). Dan selanjutnya dari KLT dengan fase gerak kedua, yaitu asam asetat 15 % juga hanya 1 bercak saja yang muncul pada masing-masing isolat, yaitu dengan Rf 0,40 (isolat A); 0,80 (isolat B); 0,84 (isolat C) dan 0,51 (isolat D). Hal ini menunjukkan bahwa semua isolat adalah tunggal (murni) sehingga dapat digunakan untuk analisis selanjutnya. Sebelum dilakukan analisis dengan reaksi warna, terlebih dahulu dilakukan scanning terhadap semua isolat untuk mengetahui hasil spektranya. Dari hasil scanning diperoleh puncak-puncak spektra dengan panjang gelombang tertentu yang sesuai dengan golongan flavonoida tertentu. Hasil puncak-puncak spektra tersebut dianalisis dan dibandingkan dengan acuan. Dari hasil scanning dan hasil KLT pendahuluan maka dapat diketahui prakiraan golongan dari masing-masing isolat (Tabel IX). Isolat A dan D mengarah pada golongan flavon atau flavonol dengan 3-OH tersubstitusi. Isolat B mengarah pada golongan flavanon dan dihidroflavonol. Sedangkan isolat C mengarah pada golongan isoflavon.

46


Isolat

A

B

C

D

Warna bercak dengan UV 366 nm Tanpa NH3

Dengan NH3

Lembayung gelap

Perubahan warna sedikit atau tanpa perubahan

Fluoresensi biru muda


Fluoresensi biru muda

Fluoresensi murup biru muda Perubahan warna sedikit atau tanpa perubahan

Lembayung gelap

Jenis flavonoida yang mungkin (Markham, 1988) Flavon atau flavonol tersulih pada 3-O mempunyai 5-OH tetapi tanpa 4’-OH bebas Beberapa 6- atau 8-OH flavon dan flavonol tersulih pada 3-O serta mengandung 5-OH Isoflavon, dihidroflavon, biflavonil dan beberapa flavanon yang mengandung 5-OH Khalkon yang mengandung 2- atau 4-OH bebas Isoflavon yang tidak mengandung 5-OH

Puncak spektra

Pustaka (Markham, 1988) Pita I Pita II (nm) (nm) 310-350 250-280 330-360 250-280

Golongan

Pita I (nm) 343

Pita II (nm) 259

319

296

300-330

275-295

Flavanon dan dihidroflavonol

327

242

310-330

245-275

Isoflavon

348

263

310-350 330-360

250-280 250-280

Flavon Flavonol (3-OH tersubstitusi)

Flavon Flavonol (3-OH tersubstitusi)

Isoflavon yang tidak mengandung 5-OH Isoflavon yang tidak mengandung 5-OH

Fluoresensi murup biru muda

Isoflavon yang tidak mengandung 5-OH


Flavon atau flavonol tersulih pada 3-O mempunyai 5-OH tetapi tanpa 4’-OH bebas Beberapa 6- atau 8-OH flavon dan flavonol tersulih pada 3-O serta mengandung 5-OH Isoflavon, dihidroflavon, biflavonil dan beberapa flavanon yang mengandung 5-OH Khalkon yang mengandung 2- atau 4-OH bebas

47


G. Identifikasi Senyawa Flavonoida 1. Identifikasi dengan reaksi warna Sebelum dilakukan identifikasi dengan reaksi warna terlebih dahulu dipilih salah satu isolat dari keempat isolat untuk dianalisis lebih lanjut, yaitu isolat C. Pemilihan isolat C didasarkan pada ketidaksamaan penampakan bercak hasil KLT pendahuluan dan hasil scanning terhadap semua isolat dengan golongan flavonoida hiperin yang dibandingkan dengan pustaka acuan. Hiperin

(hyperoside;

quercetin-3-O-galactoside)

merupakan

flavonoida

golongan flavonol. Sedangkan dari KLT pendahuluan dan hasil spektra untuk isolat C menunjukkan flavonoida golongan isoflavon. Sehingga dipilih isolat C yang tidak segolongan dengan hiperin. Pemilihan isolat C juga didasarkan pada jumlah isolat yang diperoleh dan manfaatnya yang lebih banyak dibanding dengan isolat B yang mengarah pada golongan flavanon dan dihidroflavonol.. Dengan pemilihan isolat C yang merupakan flavonoida golongan isoflavon maka diharapkan herba pegagan embun dapat dikembangkan menjadi salah satu tumbuhan yang dapat digunakan untuk menyembuhkan beberapa penyakit terkait dengan aktivitas yang dimiliki isoflavon. Reaksi warna pada isolat C dilakukan untuk lebih memantapkan bahwa senyawa flavonoida mengarah pada golongan tertentu. Reaksi warna tersebut hanya memberikan gambaran umum golongan senyawa flavonoida pada hidroksilasi dan substitusi senyawa tersebut. Isolat C diteteskan pada plat tetes, kemudian diberi pereaksi-pereaksi larutan NaOH, H2SO4 pekat, logam Mg dan HCl (Venkataraman, 1962). Dari data hasil dan dibandingkan dengan

48


acuan maka menunjukkan bahwa isolat C mengarah pada golongan isoflavon (Gambar 7) (Tabel X). Berdasarkan hasil KLT pendahuluan dan KLT multi eluen, kemungkinan isolat C adalah glikosida karena isolat C memiliki Rf yang hampir sama dengan rutin yang adalah glikosida. Rf rutin pada KLT pendahuluan dengan fase gerak BAW adalah 0,73 dan Rf isolat C pada KLT multi eluen dengan fase gerak BAW adalah 0,76. Pada KLT multi eluen dengan fase gerak asam asetat 15 % juga menunjukkan bahwa isolat C adalah glikosida karena isolat C pada KLT multi eluen dengan fase gerak asam asetat 15 % memiliki Rf yang lebih besar daripada Rf isolat C pada KLT multi eluen dengan fase gerak BAW. Rf isolat C pada KLT multi eluen dengan fase gerak asam asetat 15 % adalah 0,84 dan Rf isolat C pada KLT multi eluen dengan fase gerak BAW adalah 0,76. Asam asetat 15 % lebih polar daripada BAW sehingga semakin polar flavonoida maka Rfnya akan lebih tinggi pada asam asetat 15 %. Kepolaran flavonoida dipengaruhi oleh banyaknya gugus hidroksil dan adanya gugus gula yang terikat pada struktur flavonoida.

49


Gambar 7. Hasil reaksi warna Keterangan : 1. Isolat C ditambah dengan NaOH 2. Isolat C ditambah dengan H2SO4 3. Isolat C ditambah dengan logam Mg dan HCl pekat

Tabel X. Penampakan perubahan warna isolat setelah penambahan pereaksi Reaksi warna Isolat C Pustaka (Isoflavon)

NaOH Kuning → orange tua Kuning

H2SO4 p Kuning

Mg - HCl p Kuning muda

Kuning

Kuning

Penambahan NaOH memberikan suasana basa. Dalam suasana tersebut, aglikon flavonoida yang mengandung gugus hidroksi (bersifat asam) larut dalam air membentuk warna kuning untuk isoflavon (Gambar 8). Terjadinya warna kuning karena terbentuknya kuinoid.

50


OH OH O HO

O

+

Na

OH

O

-Na -H2O

O O

O O

O

O

Gambar 8. Reaksi yang terjadi setelah pemberian NaOH

Penambahan H2SO4 memberikan suasana asam. Dalam suasana tersebut, pada flavonoida terbentuk warna kuning untuk isoflavon (Gambar 9). Dalam reaksi ini, H2SO4 bertindak sebagai oksidator. Terjadinya warna kuning karena terbentuknya kuinoid. H+

H2SO4

+

HSO4

OH

OH

HO

O

HO

+

O

[O]

H

O

OH OH

O

O

+

H

OH

Gambar 9. Reaksi yang terjadi setelah penambahan asam sulfat pekat

Dengan penambahan Mg pada suasana asam, memberikan warna kuning muda untuk isoflavon (Gambar 10). Warna kuning muda terjadi karena

51


terbentuknya kompleks Mg dengan isoflavon. Terbentuknya kompleks menyebabkan suatu senyawa menjadi berwarna. OH

OH

HO

O

HO

O

+ O

OH O

HO

O

O

OH

OH

MgCl2

2 HCl Mg2+

MgCl2

+

2 Cl-

OH O

Cl

O

OH

Mg +

H

Mg O

O

OH O

+

+ MgCl2 OH

2 Cl-

OH

Gambar 10. Reaksi yang terjadi setelah penambahan Mg dan HCl

2. Identifikasi dengan spektrofotometri ultraviolet Analisis kemudian dilanjutkan dengan menggunakan spektrofotometri UV yang digunakan untuk menentukan struktur flavonoida terutama keberadaan posisi OH pada senyawa flavonoida. Pada hasil spektra isolat C dalam metanol dihasilkan beberapa puncak serapan yang kemudian dilihat 2 puncak yang masuk dalam kisaran pita I dan pita II dengan absorbansi paling besar (Gambar 11). Puncak serapan yang didapat adalah 242 nm (pita II) dan 327 nm (pita I). Kisaran tersebut mengarah pada berbagai golongan, namun dengan adanya dukungan data penampakan

52


bercak dari KLT dan reaksi warna yang mengacu pada golongan isoflavon, maka dilihat ternyata kisaran 2 puncak serapan tersebut juga berada dalam kisaran flavonoida golongan isoflavon. Oleh karena itu, dapat dinyatakan bahwa senyawa flavonoida dalam herba pegagan embun termasuk golongan isoflavon. Timbulnya 2 puncak serapan karena pada struktur flavonoida terdapat 2 komponen penyerap (Gambar 4).

Gambar 11. Spektrum spektrofotometri UV isolat flavonoida dalam metanol

Pada komponen penyerap benzoil merupakan puncak serapan pada pita II yaitu dengan panjang gelombang 242 nm sedangkan pada komponen penyerap sinamoil merupakan puncak serapan pada pita I dengan panjang gelombang 327 nm. Pada pita I memiliki panjang gelombang yang lebih besar karena kromofornya berjumlah 5 lebih banyak daripada pita II yang berjumlah 4 sehingga dengan penambahan kromofor akan menyebabkan makin kecilnya energi yang diperlukan untuk transisi π → π* dan akan menyerap radiasi UV pada panjang gelombang yang lebih panjang.

53


Setelah itu isolat C ditambah pereaksi-pereaksi kimia dan terjadi perubahan serapan puncak yang kemudian dilihat pergeserannya dan dibandingkan dengan acuan (Markham, 1988) untuk mengetahui perkiraan posisi OH (tabel XI). Tabel XI. Penafsiran spektrum flavonoida dengan penambahan pereaksi geser dari isolat metanol herba pegagan embun menurut Markham, 1988

Isolat MeOH MeOH/NaOH

Λ (nm) 327 381

MeOH/NaOH 5’

380

MeOH/AlCl3

Pita I Pergeseran λ (nm) +54

A

Pita II Pergeseran λ (nm) +28

A

Penafsiran

0,489 0,459

Isoflavon Adanya gugus hidroksil di cincin A

0,610 0,741

Λ (nm) 242 270

+53 -1

0,721

270

+28 0

0,455

Tanpa 3’,4’dihidroksil

346

+19

0,546

265

+23

0,431

MeOH/AlCl3/HCl

332

+5 -14

0,615

237

-5 -28

0,513

MeOH/NaOAc

339

+12

0,490

254

+12

0,471

MeOH/NaOAc/H3BO3

350

+23

0,698

258

+16

0,504

Adanya gugus orto dihidroksil di cincin A pada posisi 6, 7 atau 7, 8 Tanpa posisi 5OH Posisi OH bebas di C nomor 7 Tanpa posisi 6, 7 orto dihidroksil di cincin A

Pada penambahan NaOH pada isolat C, basa dapat mengionisasi gugus OH dan kemudian karena adanya perubahan struktur tersebut dihasilkan spektrum dengan puncak serapan sebesar 270 nm (pita II) dan 381 nm (pita I)

54


(Gambar 12). Pita I maupun II mengalami pergeseran batokromik (dibandingkan dengan panjang gelombang isolat dalam metanol). λmax pita I bergeser sebesar +54 nm tanpa penurunan intensitas yang menunjukkan adanya gugus hidroksil di cincin A. Panjang gelombang semakin besar karena adanya perubahan struktur yaitu perpanjangan ikatan rangkap terkonjugasi pada senyawa dengan adanya basa (NaOH) yang menyebabkan O kelebihan elektron sehingga terdapat 2 pasang elektron bebas yang berlaku sebagai ikatan rangkap terkonjugasi semu. Karena perpanjangan ikatan rangkap terkonjugasi menyebabkan energi yang diperlukan lebih kecil untuk mempromosikan elektron sehingga akan menyerap energi UV dengan panjang gelombang yang lebih besar (Gambar 8).

Gambar 12. Spektrum spektrofotometri UV isolat flavonoida dalam metanol dan diberi NaOH Keterangan : ——— = isolat flavonoida (dalam metanol) ——— = isolat flavonoida setelah diberi pereaksi NaOH

55


Kemudian isolat yang ditambah dengan NaOH tadi dianalisis lagi setelah 5 menit dan didapat puncak serapan sebesar 270 nm (pita II) dan 380 nm (pita I) (Gambar 13). Dibandingkan dengan puncak serapan isolat NaOH sebelum 5 menit tidak ada pergeseran, hal ini menunjukkan bahwa senyawa tidak terdekomposisi atau isoflavon bersifat stabil atau tidak terpengaruh pada suasana basa. Jadi diketahui bahwa tidak ada posisi 3’, 4’-dihidroksil.

Gambar 13. Spektrum spektrofotometri UV isolat flavonoida dalam metanol dan diberi NaOH setelah 5 menit Keterangan : ——— = isolat flavonoida setelah diberi pereaksi NaOH ——— = isolat flavonoida setelah diberi pereaksi NaOH setelah 5 menit

Tahap ketiga adalah dengan penambahan AlCl3 pada isolat C dan didapat spektrum dengan puncak serapan 265 nm (pita II) dan 346 nm (pita I) (Gambar 14). Adanya pergeseran batokromik pada pita I maupun pita II menunjukkan adanya gugus orto dihidroksil pada atom C nomor 6, 7 atau 7, 8 di cincin A (Gambar 15).

56


Gambar 14. Spektrum spektrofotometri UV isolat flavonoida dalam metanol dan diberi AlCl3 Keterangan : ——— = isolat flavonoida (dalam metanol) ——— = isolat flavonoida setelah diberi pereaksi AlCl3

Pergeseran ke arah batokromik setelah penambahan AlCl3 karena adanya ikatan kompleks menyebabkan senyawa berwarna yang berarti menggeser absorbansi ke panjang gelombang dalam daerah tampak. Panjang gelombang setelah penambahan AlCl3 lebih besar daripada panjang gelombang dari senyawa semula yang tidak berwarna pada cahaya tampak. Cl OH HO

Cl

Al O

O

+ AlCl3

O

OH O

-H+

O

Gambar 15. Reaksi yang terjadi setelah pemberian AlCl3

57


Kemudian isolat tadi ditambah dengan HCl dan didapat spektrum memiliki puncak serapan 237 nm (pita II) dan 332 nm (pita I) (Gambar 16). Dibandingkan dengan serapan puncak pada isolat dalam metanol, didapat pergeseran hipsokromik pada pita II sebesar -5 nm yang menandakan tidak adanya gugus OH pada atom C nomor 5. AlCl3 dan AlCl3/HCl menyebabkan pembentukan kompleks tak tahan asam dengan gugus o-dihidroksil, pereaksi ini dapat digunakan untuk mendeteksi gugus tersebut. Spektrum AlCl3 menunjukkan adanya gugus orto dihidroksil di cincin A pada posisi 6, 7 atau 7, 8 sedangkan spektrum AlCl3/HCl menunjukkan ada tidaknya OH bebas pada atom C nomor 5 (Gambar 17).

Gambar 16. Spektrum spektrofotometri UV isolat flavonoida dalam metanol dan diberi AlCl3/HCl Keterangan : ——— = isolat flavonoida (dalam metanol) ——— = isolat flavonoida setelah diberi pereaksi AlCl3/HCl

58


Cl Cl

Al O

OH

OH HO

O

O

+ HCl

O

O

Gambar 17. Reaksi yang terjadi setelah pemberian HCl pada isolat C dengan AlCl3

Tahap berikutnya adalah penambahan natrium asetat pada isolat C dan dihasilkan spektrum dengan puncak serapan 254 nm (pita II) dan 339 nm (pita I) (Gambar 18). Pita II mengalami pergeseran batokromik sebesar +12 nm yang menunjukkan adanya gugus OH pada atom C nomor 7 (Gambar 19). Pita II mengalami pergeseran batokromik karena adanya perpanjangan ikatan rangkap terkonjugasi yaitu dengan adanya konjugasi semu.

Gambar 18. Spektrum spektrofotometri UV isolat flavonoida dalam metanol dan diberi

NaOAc Keterangan : ——— = isolat flavonoida (dalam metanol) ——— = isolat flavonoida setelah diberi pereaksi NaOAc

59


OH

OH HO

O

O

O

-Na+ +

CH3COONa -CH3COOH O

O OH O

O

O

Gambar 19. Reaksi yang terjadi setelah penambahan NaOAc

Kemudian dalam isolat yang sudah ditambah dengan NaOAc ditambahkan lagi pereaksi H3BO3 yang membentuk kompleks pada orto dihidroksil di cincin A dan dihasilkan puncak serapan sebesar 258 nm (pita II) dan 350 nm (pita I) (Gambar 20). Terjadi pergeseran batokromik pada pita II sebesar +16 nm dan pada pita I sebesar +23 nm yang menunjukkan tidak adanya gugus orto dihidroksil pada cincin A yang berada pada posisi 6, 7 (Gambar 21).

60


Gambar 20. Spektrum spektrofotometri UV isolat flavonoida dalam metanol dan diberi

NaOAc/H3BO3 Keterangan : ——— = isolat flavonoida (dalam metanol) ——— = isolat flavonoida setelah diberi pereaksi NaOAc/H3BO3 OH

OH

HO

O

O

O OH

+

-Na + CH3COONa

+ -CH3COOH

O

B HO

OH

O

OH HO

B

O

O

O

-H2O

O

Gambar 21. Reaksi yang terjadi setelah pemberian NaOAc dan ditambah dengan H3BO3

Dari hasil analisis warna dan didukung spektrofotometri UV terhadap isolat C diperkirakan struktur parsial senyawa flavonoida hasil isolasi adalah turunan 7,8-dihidroksi isoflavon dengan kemungkinan letak gulanya pada posisi 5 atau 4’(Gambar 22).

61


OH HO

O

O

O

R

Gambar 22. 7, 8-dihidroksi isoflavon dengan kemungkinan letak gula pada posisi 5 OH HO

O

O

R O

Gambar 23. 7, 8-dihidroksi isoflavon dengan kemungkinan letak gula pada posisi 4’

62


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Turunan flavonoida yang diperoleh dari herba pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) dalam penelitian ini memiliki struktur parsial 7,8-dihidroksi isoflavon dengan kemungkinan letak gulanya pada posisi 5 atau 4’. OH HO

O

O

O

R

7, 8-dihidroksi isoflavon dengan kemungkinan letak gula pada posisi 5

OH HO

O

O

R O

7, 8-dihidroksi isoflavon dengan kemungkinan letak gula pada posisi 4’

63


B. Saran Agar penelitian ini dapat bermanfaat dalam bidang fitofarmaka, maka : 1. Perlu dilakukan hidrolisis terhadap isolat untuk memastikan apakah senyawa tersebut benar-benar glikosida dan untuk mengetahui posisi gulanya. 2. Perlu

dilakukan

penentuan

struktur

lengkap

isolat

hasil

pemisahan

menggunakan metode spektrofotometri infra merah, resonansi magnetik inti dan spektrofotometri massa. 3. Perlu dilakukan identifikasi kandungan flavonoida terhadap isolat-isolat yang lain.

64


Daftar Pustaka Anonim, 1985, Cara Pembuatan Simplisia, 4-6, 10-16, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 4-11, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim,

2005, Tanaman Obat Indonesia : Semanggi Gunung, http://www.iptek.net.id/ind/pd_tanobat/view.php?id=57. Diakses pada 19 Juni 2007.

Asakawa, Y., Matsuda, R., dan Takemoto, T., 1982, Mono- and sesquiterpenoids from Hydrocotyle and Centella species, http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TH742M84J13B&_user=10&_coverDate=12%2F31%2F1982&_rdoc=1&_fmt=&_or ig=search&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVe rsion=0&_userid=10&md5=3572055564a7635846ef8a5219ec7afe. Diakses pada 7 Maret 2007. Backer, C.A. dan Bakhuizen Van den Brink Jr., R.C., 1963, Flora of Java, Vol. I, 3-9, 25-26, N.V.P., Noordhoff, Groningen, The Netherlands. Backer, C.A. dan Bakhuizen Van den Brink Jr., R.C., 1965, Flora of Java, Vol. II, 171-172, N.V.P., Noordhoff, Groningen, The Netherlands. Christian, G.D., 2004, Analytical Chemistry, 6th ed, John Wiley and Sons Inc, USA. Fessenden & Fessenden, 1999, Organic Chemistry, diterjemahkan oleh Aloysius Hadyana, jilid 2, cetakan keempat, 436-438, Penerbit Erlangga, Jakarta. Gritter, R. J., Bobbitt, J. M., Schwarting, A.E., 1991, Pengantar Kromatografi, Edisi Kedua, Penerbit ITB, Bandung. Harborne, J.B., 1987, Phytochemical Methods, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro, Edisi II, 2-28,34-37, 47-49, 69-103, Penerbit ITB, Bandung. Hostettmann, K., Hostettmann, M., Marston, A., 1995, Preparative Chromatography Techniques, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 9-11, Penerbit ITB, Bandung.

65


Janardhanan, M., dan Thoppil, J.E., 2001, Chemical composition of two species of Hydrocotyle, http://jagor.srce.hr/acphee/6702.html. Diakses pada 9 Maret 2007. Jha, H.C., 1985, Novel isoflavanoids and its derivates, new antioxidant derived from fermented soybean (tempe), Asian Symposium Non-salted Soybean Fermentation, Tsukuba, Japan. Jha, H.C., Kiriakidis, S., Hoppe, M. dan Egge, H., 1997, Tempe Constituents as Antioxydant, Paper Abstract for International Tempe Symposium, Bali. Institutes Physiological Chemistry, University of Bonn. Kuswara, 2000, Warta Tumbuhan Obat Indonesia, Pengembangan Obat dari Bahan Alam di PT. Kalbe Farma, No. 1, Vol. 6, Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Mabry, T. J., Markham, K. R., Thomas, M. B., 1970, The Systematical Identification of Flavonoid Compound, 11-55, Springer Verlag, New York-Heindelberg-Berlin. Markham, K.R., 1988, Techniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 15-27, 32-53, Penerbit ITB, Bandung. Matsushita A, Sasaki Y, Warashina T, Miyase T, Noguchi H, Velde D., V, 2004, Hydrocotylosides I-VII, new oleanane saponins from hydrocotylesibthorpioides, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pub med&dopt=Abstract&list_uids=15043415. Diakses pada 7 Maret 2007. Mursyidi, A., 1990, Analisis Metabolit Sekunder, Cetakan I, 150-151, Pusat Antar Universitas Bioteknologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Pawiroharsono, S., 1994, Metabolisma Isoflavon dan Faktor-ll Pada Proses Pembuatan Tempe, Prosiding Simposium Nasional Pengembangan Tempe Dalam Industri Pangan Modem, UGM, Yogyakarta. Pawiroharsono, S., 1998, Benarkah tempe sebagai antikanker. Jurnal Kedokteran dan Farmasi MEDIKA, No. 12, Tahun Ke-XXIV, Desember 1998, p: 815-817. Riyanto, S., 1990, Flavonoid, in Mursyidi, A. (ed.), Analisis Metabolit Sekunder, 171-191. Robinson, T., 1995, The Organic Constituents of Higher Plants, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, edisi VI, 191-192, Institut Tehnologi Bandung, Bandung.

66


Salisbury & Ross, 1995, Plant Physiology, diterjemahkan oleh Diah dan Sumaryono, 154, Penerbit ITB, Bandung. Sastrohamidjojo, 2001, Spektroskopi, edisi ke II, 11, penerbit Liberty, Yogyakarta. Shigematsu, N., Kouno, I., Kawano, N., 1981, Quercetin 3-(6″caffeoylgalactoside) from Hydrocotyle sibthorpioides, http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TH742M84FJ17M&_user=10&_coverDate=12%2F31%2F1982&_rdoc=1&_fmt=su mmary&_orig=browse&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_versi on=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=4f865a7e8b7b368b4db93909 e464ad7d. Diakses pada 7 Maret 2007. Stahl, E., 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy : a Practical Supplement to Pharmacopies, diterjemahkan oleh Kokasih Padmawinata dan Iwang Soediro, 3-17, Institut Tehnologi Bandung, Bandung. Untoro, P., 1990, Pemisahan Kandungan Flavonoid Eriobotrya javonica, 15, Lind L, Disertasi ITB, Bandung. Venkataraman, 1962, Method for Determining the Structure of Flavonoid Compound, in Geissman, T.A. (ed.), The Chemistry of Flavonoid Compound, 70.

67


Lampiran 1

68


Lampiran 2

Foto tumbuhan herba pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.)

69


Lampiran 3

Foto kromatogram KLTP hasil reisolasi isolat I dengan fase diam selulosa, fase gerak asam asetat 15 % setelah diuapi amonia pekat dilihat di lampu UV 365 nm

70


Lampiran 4

Foto kromatogram KLTP hasil reisolasi isolat II dengan fase diam selulosa, fase gerak asam asetat 15 % setelah diuapi amonia pekat dilihat di lampu UV 365 nm

71


Lampiran 5

Foto kromatogram KLT multi eluen isolat A dengan fase diam selulosa, fase gerak asam asetat 15 % sebelum diuapi amonia pekat dilihat di lampu UV 365 nm

72


Lampiran 6

Foto kromatogram KLT multi eluen isolat A dengan fase diam selulosa, fase gerak BAW setelah diuapi amonia pekat dilihat di lampu UV 365 nm

73


Lampiran 7

Foto kromatogram KLT multi eluen isolat B dengan fase diam selulosa, fase gerak asam asetat 15 % setelah diuapi amonia pekat dilihat di lampu UV 365 nm

74


Lampiran 8

Foto kromatogram KLT multi eluen amonia B dengan fase diam selulosa, fase gerak BAW setelah diuapi amonia pekat dilihat di lampu UV 365 nm

75


Lampiran 9

Foto kromatogram KLT multi eluen isolat C dengan fase diam selulosa, fase gerak asam asetat 15 % setelah diuapi amonia pekat dilihat di lampu UV 365 nm

76


Lampiran 10

Foto kromatogram KLT multi eluen amonia C dengan fase diam selulosa, fase gerak BAW setelah diuapi amonia pekat dilihat di lampu UV 365 nm

77


Lampiran 11

Foto kromatogram KLT multi eluen isolat D dengan fase diam selulosa, fase gerak asam asetat 15 % setelah diuapi amonia pekat dilihat di lampu UV 365 nm

78


Lampiran 12

Foto kromatogram KLT multi eluen isolat D dengan fase diam selulosa, fase gerak BAW setelah diuapi amonia pekat dilihat di lampu UV 365 nm

79


Lampiran 13

13.1. Spektrum spektrofotometri UV isolat A dalam metanol

13.2. Spektrum spektrofotometri UV isolat B dalam metanol

80


Lampiran 14

14.1. Spektrum spektrofotometri UV isolat D dalam metanol

14.2. Spektrum spektrofotometri UV rutin dalam metanol

81


BIOGRAFI PENULIS

Titien Christinawati, penulis skripsi yang berjudul Identifikasi Flavonoida pada Herba Pegagan Embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) Hasil Isolasi Secara Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP), dilahirkan di Klaten pada tanggal 26 April 1985 dari pasangan Bapak R. Y. Sudaryo dan Ibu R. Nanik Karsini. Penulis menyelesaikan pendidikan Taman Kanak-kanak di TK Pertiwi Manjung pada tahun 1989 hingga 1991 dan menyelesaikan pendidikan dasar di SDN Manjung I, pada tahun 1991 hingga tahun 1997. Pendidikan SLTP ditempuh pada tahun 1997 hingga 2000 di SLTPN I Klaten. Kemudian dilanjutkan dengan menempuh pendidikan SMU di SMUN 2 Klaten pada tahun 2000 hingga 2003. Penulis melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dan menyelesaikan pendidikan S1 pada tahun 2007.

82

IDENTIFIKASI FLAVONOIDA PADA HERBA PEGAGAN EMBUN. (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) HASIL ISOLASI SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF (KLTP)

Recommend Documents