IDENTIFIKASI DAN POTENSI ANTIOKSIDAN FLAVONOID KULIT KAYU MAHONI ( Swietenia macrophylla KING)
OLGA MARDISADORA
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
ABSTRAK OLGA MARDISADORA. Identifikasi dan Potensi Antioksidan Flavonoid Kulit Kayu Mahoni (Swietenia macrophylla King). Dibimbing oleh DJAROT S HAMISENO dan SYAMSUL FALAH. Kulit kayu mahoni sebagai limbah industri pengolahan kayu belum banyak dimanfaatkan dibandingkan bagian lain dari tanaman mahoni. Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi kandungan flavonoid dari kulit kayu mahoni dan perannya sebagai antioksidan. Aktivitas antioksidan dari ekstrak kulit kayu mahoni diukur dengan menggunakan dua metode yaitu metode 1,1-diphenil-2picrylhydrazyl (DPPH) dan metode tiobarbituric acid (TBA). Identifikasi flavonoid (kuersetin) dilakukan menggunakan HPLC dan KLT sedangkan uji antioksidan flavonoid (kuersetin) dilakukan dengan metode DPPH. Daya hambat ekstrak kulit kayu mahoni pada metode DPPH untuk ekstrak metanol, n-heksana, dietil eter, etil asetat, vitamin E, (kontrol positif) dan air pada konsentrasi 50 ppm adalah masing-masing sebesar 81.33%, 12.74%, 23.40%, 65.54%,30.42%, dan 68.04%. Daya hambat ekstrak kulit kayu mahoni pada metode TBA untuk fraksi metanol 200, 100, 50 ppm adalah 59.81%, 59.02%, 58.96%. Ekstrak air 200, 100, 50 ppm adalah 54.65%, 49.01%, 43.09%. Vitamin E 200, 100, 50 ppm adalah 40.91%, 36.48%, 27.15%. Kadar kuersetin yang terdapat dalam sampel adalah 16 mg/100g sampel. Daya hambat dari kuersetin sebagai antioksidan pada 50, 100, dan 200 ppm sebesar 87.2%, 89.1%, 92.8%.
ABSTRACT OLGA MARDISADORA. Identification and antioxidant potential of flavonoids Mahogany Bark (Swietenia macrophylla King). Under the direction of DJAROT S HAMISENO and SYAMSUL FALAH. Mahogany bark as wood processing industrial waste has not widely used compared to other parts of mahogany. This research was conducted to identify the flavonoids from mahogany bark and its role as an antioxidant. Antioxidant activity of mahogany bark’s extract was measured by using two methods namely diphenil-1.1-2-picrylhydrazyl (DPPH) method and tiobarbituric acid (TBA) method. Identification of flavonoids (quersetin) was performed by using HPLC and TLC. Antioxidant activity of flavonoids (quersetin) was measured by using DPPH method.Inhibition activity of mahogany bark’s extract on DPPH method for the extraction of methanol, n-hexane, diethyl ether, ethyl acetate, vitamin E (positive control) and water at concentrations of 50 ppm are respectively for 81.33%, 12.74%, 23:40%, 65.54 %, 30.42%, and 68.04%. The inhibition activity of mahogany bark’s extract on TBA methods for methanol fraction 200, 100, 50 ppm was 59.81%, 59.02%, 58.96%. Extraction of water 200, 100, 50 ppm was 54.65%, 49.01%, 43.09%. Vitamin E 200, 100, 50 ppm was 40.91%, 36.48%, 27.15%. Kuersetin content in the sample is 16 mg/100g sample. Inhibition activity of antioxidants on kuersetin as 50, 100, and 200 ppm for 87.2%, 89.1%, 92.8%.
IDENTIFIKASI DAN POTENSI ANTIOKSIDAN FLAVONOID KULIT KAYU MAHONI ( Swietenia macrophylla King)
OLGA MARDISADORA
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
Judul Skripsi : Identifikasi dan Potensi Antioksidan Flavonoid Kulit Kayu Mahoni (Swietenia macrophylla King) Nama : Olga Mardisadora NIM : G84051256
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Djarot S Hamiseno, M.Sc. Ketua
Dr. Syamsul F, S.Hut., M.Si. Anggota
Diketahui
Dr.Ir.I Made Artika, M.App Sc. Ketua Departemen Biokimia
Tanggal lulus :
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas izin-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul Identifikasi dan Potensi Antioksidan Flavonoid Kulit Kayu Mahoni (Swietenia macrophylla King). Penelitian ini didanai oleh program unggulan IPB dibawah payung penelitian Dr. Syamsul F, S.Hut., M.Si dan kawan-kawan. Penelitian ini telah dilaksanakan dari April hingga Oktober 2009 di Laboratorium Biokimia Institut Pertanian Bogor, Balai Besar Penelitian Pasca Panen dan Pusat Studi Biofarmaka. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Djarot S Hamiseno, M.Sc dan Dr. Syamsul F, S.Hut., M.Si. selaku pembimbing yang tiada hentinya memberi perhatian lebih kepada penulis. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada drh.Sulistiyani, M.Sc.,Ph.D., para staf dan laboran Biokimia atas semua bantuannya baik secara langsung maupun tidak langsung. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada mama, papa, serta seluruh keluaraga. atas doa dan kasih sayangnya, kepada kelompok penelitian mahoni (Fitria, Mei, Bakuh, Vijonk dan Ratna), teman-teman biokimia (Vita, Risa, Isti, Arya, Tanti, Mela, Dini, Saipul), teman-teman kosan (Hervi, Cici, Neni, Seri Dina, Elin, Amel, Ela, Eci). Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Februari 2010
Olga Mardisadora
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Palembang pada tanggal 17 November 1987 dari ayah Drs. Edward dan ibu Mastura. Penulis merupakan putri pertama dari tiga bersaudara. Pada tahun 2005 penulis lulus SMU Negeri 1 Baturaja dan pada tahun yang sama berhasil lulus seleksi masuk IPB melalui Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih mayor Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melakukan praktik kerja lapangan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Transformasi, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor dari bulan Juli sampai Agustus 2008.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... vi DAFTAR LAMPIRAN........................................................................................ vi PENDAHULUAN ...............................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA Swietenia macrophylla ............................................................................... Flavonoid.................................................................................................... Radikal Bebas............................................................................................. Metode Analisis Aktivitas Antioksidan ..................................................... α-tokoferol .................................................................................................. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ............................................... Identifikasi Senyawa Flavonoid ................................................................. Kromatografi Lapis Tipis ...........................................................................
2 2 3 4 5 6 6 7
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ........................................................................................... Metode Percobaan ......................................................................................
7 7
HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan Kadar Air .................................................................................. Ekstraksi dan Fraksinasi ............................................................................ Daya Ekstrak Terhadap Radikal DPPH ..................................................... Sistem Oksidasi Asam Linoleat ................................................................. Konsentrasi Malondialdehida .................................................................... Analisis Flavonoid ..................................................................................... Isolasi Flavonoid dan Uji Aktivitas Antioksidan Kuersetin ......................
9 9 10 11 12 14 14
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan .................................................................................................... 15 Saran .......................................................................................................... 15 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 15 LAMPIRAN......................................................................................................... 18
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Sweitenia macrophllya......................................................................................
1
2 Struktur umum flavonoid..................................................................................
2
3 Struktur kuersetin..............................................................................................
2
4 Mekanisme pembentukan radikal bebas ..........................................................
3
5 Mekanisme pembentukan radikal bebas dalam peroksidasi lipid.....................
4
6 1,1-Difenil-2-picrilhidrazil dan 1,1-Difenil-2-picrilhidrazin ...........................
5
7 Daya hambat ekstrak terhadap radikal DPPH .................................................. 11 8 Penentuan waktu inkubasi maksimum ............................................................. 12 9 Daya hambat ekstrak terhadap pembentukan MDA ........................................ 11 10 Hasil analisis sampel dengan HPLC .............................................................. 14 11 Hasil dari KLT .............................................................................................. 14 12 Hasil visualisasi UV-VIS dari KLT .............................................................. 14 13 Daya hambat kuersetin terhadap radikal DPPH ............................................ 15
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Bagan alur penelitian ....................................................................................... 19 2 Ekstraksi dan fraksinasi kulit kayu mahoni ...................................................... 20 3 Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH............................................... 21 4 Metode pengujian aktivitas antioksidan MDA-TBA........................................ 22 5 Analisis kadar air kulit kayu mahoni ................................................................ 23 6 Hasil ekstraksi kulit kayu mahoni .................................................................... 24 7 Kurva standar TMP .......................................................................................... 25 8 Hasil pengujian aktivitas antioksidasi dengan metode MDA-TBA ................. 26 9 Hasil analisis statistik ....................................................................................... 27 10 Hasil HPLC kulit kayu mahoni fraksi metanol............................................... 28 11 Hasil pengujian aktivitas antioksidan kuersetin.............................................. 29
PENDAHULUAN Pengobatan tradisional menggunakan tumbuh-tumbuhan telah lama dikenal oleh masyarakat Indonesia, jauh sebelum obatobatan modern dikenal. Berkembangnya prinsip back to nature meningkatkan kecenderungan manusia untuk memanfaatkan bahan alam yang berasal dari tumbuh-tumbuhan sebagai obat bagi kesehatannya. Selain itu, krisis ekonomi yang melanda Indonesia beberapa tahun belakangan ini menyebabkan harga obatobatan modern tidak terjangkau oleh masyarakat menengah ke bawah. Swietenia macrophylla atau yang dikenal dengan mahoni ditanam secara luas di daerah tropis dalam program reboisasi dan penghijauan. Tanaman mahoni banyak digunakan sebagai tanaman naungan. Banyaknya penggunaan mahoni sebagai pohon peneduh di jalan membuat tanaman mahoni banyak terdapat di sekitar kita sehingga pemanfaatan tanaman ini tidak hanya sebagai tanaman peneduh saja tetapi menjadi tanaman yang dapat digunakan sebagai salah satu tanaman obat. Selain itu, tanaman mahoni juga telah lama dimanfaatkan dan dikenal dalam pengobatan secara tradisonal. Bagian dari tanaman mahoni yang paling sering digunakan sebagai tanaman obat adalah buah dan daun mahoni. Penemuan buah mahoni sebagai vitamin dan obat-obatan pertama kali oleh Doktor Larry Brookes pada tahun 1990. Kandungan flavonoid pada buah mahoni berguna untuk melancarkan peredaran darah, mencegah tersumbatnya saluran darah, mengurangi tingkat kolesterol, mengurangi penimbunan lemak pada dinding saluran darah, membantu mengurangi rasa sakit, mengurangi pendarahan dan lebam, bertindak sebagai antioksidan dan berfungsi menyingkirkan radikal bebas. Sedangkan saponin yang berasal dari buah mahoni berguna mencegah penyakit sampar, mengurangi lemak badan, meningkatkan sistem kekebalan, mencegah pembekuan darah dan tingkat gula dalam darah, serta menguatkan fungsi hati (Brookes 1990). Kulit kayu mahoni adalah bagian dari tanaman mahoni yang belum termanfaatkan. Selain itu, kulit kayu mahoni sebagai limbah industri pengolahan kayu memiliki potensi yang sangat besar. Namun, pemanfaatannya sebagai obat alami belum dilakukan. Oleh karena itu penelitian ini dilakukan dengan
tujuan menentukan aktivitas antioksidan ekstrak kulit kayu mahoni dan mengidentifikasi adanya kandungan flavonoid kulit kayu mahoni serta menentukan aktivitas antioksidannya Penelitian ini dilakukan secara in vitro. Aktivitas antioksidan dari kulit kayu mahoni diukur dengan menggunakan dua metode yaitu metode 1,1-diphenil-2-picrylhydrazyl (DPPH) dan metode thiobarbituric acid (TBA). Identifikasi flavonoid (kuersetin) dilakukan menggunakan high performance liquid chromatography (HPLC) dan kromatografi lapis tipis (KLT) sedangkan uji antioksidan flavonoid (kuersetin) dilakukan dengan metode DPPH. Penelitian ini diharapkan akan meningkatkan inovasi ilmu pengetahuan dan teknologi dalam penerapan ilmu biokimia. Selain itu, penelitian ini juga diharapkan dapat meningkatkan nilai guna kulit kayu mahoni yang merupakan limbah dari industri sehingga lebih bermanfaat secara ekonomi dan lingkungan.
TINJAUAN PUSTAKA Mahoni (Swietenia macrophylla) Mahoni yang diklasifikasikan sebagai famili Meliaceae mempunyai berbagai spesies, dua spesies yang terkenal adalah Swietenia macrophylla (mahoni daun lebar) (Gambar 1) dan Swietenia mahagoni (mahoni daun sempit). Swietenia macrophylla memiliki Kingdom: Plantae Subkingdom: Tracheobionta, Super Divisi: Spermatophyta, Divisi: Magnoliophyta, Kelas: Magnoliopsida, Sub Kelas: Rosidae, Ordo: Sapindales, Famili: Meliaceae, Genus: Swietenia, Spesies: Swietenia macrophylla (L.) (Cottle 1959).
Gambar 1 Sweitenia macrophllya.
Mahoni berasal dari Amerika Tengah dan Amerika Selatan. Mahoni tumbuh pada tipe iklim A sampai D, yaitu daerah bermusim kering atau basah. Ketinggian tempat yang sesuai untuk tanaman ini berkisar antara 0 – 1.000 m dpl. Tinggi tanaman ini mencapai 40 m dengan diameter batang mencapai lebih dari 100 cm . Pohon akan berbuah setelah tanaman berumur 12 tahun atau lebih, pada bulan Juli-Agustus. Buah yang masak berwarna cokelat hingga cokelat tua (Nataniella 1997). Penelitian mengenai kulit kayu mahoni telah dilakukan oleh Falah et al. (2008) yang ditekankan pada isolasi senyawa flavonoid dari ekstrak aseton dan aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini menunjukkan kulit kayu mahoni mengandung senyawa katekin, epikatekin, dan krofilanin. Flavonoid Flavonoida dan isoflavonoida adalah salah satu golongan senyawa metabolit sekunder yang banyak terdapat pada tumbuh-tumbuhan. Kandungan senyawa flavonoida sendiri dalam tanaman sangat rendah, yaitu sekitar 0.25%. Senyawasenyawa tersebut pada umumnya dalam keadaan terikat/konjugasi dengan senyawa gula (Snyder & Kwon 1987). Senyawa flavonoid terdistribusi secara luas pada bagian-bagian tanaman, baik pada akar, batang, daun, maupun buah. Senyawa flavonoida untuk obat mula-mula diperkenalkan oleh seorang Amerika bernama Gyorgy (1936) yang sekaligus sebagai pionir (pembuka) penggunaan senyawa tersebut di bidang terapeutik. Gyorgy menemukan senyawa yang disebut sebagai senyawa "bioflavonoids" atau vitamin P yang dinyatakan sebagai antihemorrhage (pendarahan). Senyawa flavonoida adalah kelompok senyawa fenol terbesar yang ditemukan di alam. Senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu, biru dan kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan. Golongan flavonoid memiliki kerangka karbon yang terdiri atas dua cincin benzena tersubtitusi yang disambungkan oleh rantai alifatik tiga karbon (Gambar 2).
Gambar 2 Struktur umum flavonoid (Robinson 1995).
Sejumlah tanaman obat yang mengandung flavonoid telah dilaporkan memiliki aktivitas antioksidan, antibakteri, antivirus, antiradang, antialergi dan antikanker (Miller 1996). Efek antioksidan senyawa ini disebabkan oleh penangkapan radikal bebas melalui donor atom hidrogen dari gugus fungsi hidroksil flavonoid. Beberapa penyakit seperti asteroklorosis, kanker, diabetes, parkinson, alzheimer, dan penurunan kekebalan tubuh telah diketahui dipengaruhi oleh radikal bebas dalam tubuh manusia (Amic et al. 2000). Pengelompokan flavonoid berdasarkan pada cincin heterosiklik-oksigen tambahan dan gugus hidroksil tersebar menurut pola yang berlainan (Robinson 1995). Golongan terbesar flavonoid memiliki cincin piran yang menghubungkan rantai tiga-karbon dengan salah satu cincin benzena. Pada umumnya, flavonoid terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon flavonoid, dapat pula berada dalam satu tumbuhan dalam beberapa bentuk kombinasi glikosida (Harbone 1987). Jenis utama flavonoid adalah antosianidin, flavonol, flavon, flavonons, dan iso flavon ( Spencer et al. 2003). Dibandingkan dengan jenis flavonid lain, jenis flavonol dan flavons merupakan dua dari jenis flavonoid yang paling banyak terdapat dalam tanaman sayur-sayuran. Flavonol terdiri atas kuersetin yang umumnya merupakan komponen terbanyak dalam tanaman sedangkan flavon yang terdiri atas lutelin dan apigenin, hanya ditemukan pada bagian pangan tertentu (Lee 2000). Flavonoid memiliki efek biologis dalam sistem sel mamalia yang berperan dalam kesehatan manusia. Beberapa flavonoid, terutama kuersetin meningkatkan kemungkinan untuk mengurangi resiko kanker, penyakit jantung, dan stroke pada manusia. Senyawa kuersetin (Gambar 3) merupakan golongan flavonol yang paling banyak terdapat dalam tanaman dan merupakan senyawa yang paling aktif dibandingkan golongan flavonol ( Aviram & Furkham 2003).
Gambar 3 Struktur Kuersetin (Robinson 1995).
Banyak tanaman obat menunjukkan khasiatnya yang seiring dengan tingginya kandungan kuersetin. Kuersetin juga telah terbukti memiliki aktivitas sebagai anti peradangan, karena langsung menghambat penyebab utama dari peradangan tersebut. Kuersetin juga memiliki kemampuan sebagai antitumor. Selain itu, kuersetin juga memiliki pengaruh yang positif dalam membantu mencegah kanker, gangguan jantung, katarak, dan gangguan pernafasan, seperti bronkitis dan asma. Kuersetin mampu menghambat oksidasi LDL dengan cara mengkelat ion tembaga, yang dapat menginduksi LDL ( Aviran & Furkham 2003). Radikal Bebas, Lipid Peroksida, dan Antioksidan Radikal bebas merupakan suatu atom atau molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbital terluarnya (Mimić-Oka et al 1999). Adanya elektron bebas yang tidak berpasangan mengakibatkan radikal bebas bersifat sangat reaktif dan tidak stabil. Untuk menstabilkan diri, radikal bebas cenderung bereaksi dengan senyawa lain untuk mendapatkan pasangan elektron. Beberapa radikal bebas yang terdapat di dalam tubuh antara lain radikal hidroksil (OH*), radikal peroksil lipid (LOO*), radikal oksida nitrit (NO*), dan radikal supeoksida (O2*) (Langseth 1995). Radikal bebas dapat dihasilkan dari hasil metabolisme tubuh (endogenous) misalnya, sekitar 5 persen dari oksigen pernafasan akan diubah menjadi radikal bebas. Selain itu faktor eksternal (eksogenous) juga dapat menghasilkan radikal bebas, seperti asap rokok, hasil penyinaran ultra violet, zat kimiawi dalam makanan maupun dari senyawa-senyawa polutan lain. Adanya atom atau molekul radikal bebas terjadi melalui sederetan mekanisme reaksi (Gambar 4). Reaksi tahap pertama adalah pembentukan radikal bebas awal (inisiasi). Tahap kedua adalah penambatan atau terbentuknya radikal baru (propagasi). Reaksi ini terjadi secara terus menerus karena menghasilkan radikal bebas lain yang menyebabkan terjadinya proses oksidasi lebih lanjut. Tahap terakhir adalah terminasi, yaitu penghilangan atau pengubahan radikal bebas menjadi molekul stabil dan tak reaktif. Terminasi terjadi bila ada reaksi antara radikal bebas itu sendiri (Hart 1983).
Gambar 4 Mekanisme pembentukan radikal bebas (Hart 2003). Beberapa kerusakan yang dapat timbul akibat serangan radikal bebas antara lain kerusakan protein, DNA, peroksidasi lipid, kerusakan membran sel, terutama penyusun membran sel berupa asam lemak tidak jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid serta protein, menimbulkan autoimun, dan menyebabkan penyakit degeneratif. Penyakit yang disebabkan oleh radikal bebas umumnya bersifat kronis, yaitu dibutuhkan waktu bertahun-tahun untuk penyakit tersebut menjadi nyata (terjadi akumulasi dalam tubuh). Contoh penyakit yang sering dihubungkan dengan radikal bebas adalah penyakit jantung koroner dan kanker. Akan tetapi, keberadaan radikal bebas tidak selamanya berbahaya bagi tubuh. Misalnya, radikal bebas berperan dalam pencegahan penyakit yang disebabkan mikroba melalui sel-sel darah khusus (Tuminah 2000). Salah satu molekul yang sensitif terhadap serangan radikal bebas adalah lipid. Reaksi antara lipid dan radikal bebas akan menghasilkan lipid peroksida. Peroksidasi lipid terjadi akibat serangan radikal bebas terhadap asam lemak tak jenuh majemuk (PUFA) yang sedikitnya mengandung tiga ikatan rangkap (Halliwel dan Gutteridge 1985, diacu dalam Wiseman et al 2005). Reaksi radikal bebas terhadap PUFA akan menghasilkan peroksil lipid (ROO*) yang dapat menghasilkan lipid peroksida (Gambar 5). Jika radikal peroksil lipid bereaksi dengan PUFA yang lain dapat membentuk lipid peroksida (ROOH) dan lipid bebas (R*) yang baru. Lipid peroksida terbentuk akibat hilangnya sebuah atom hidrogen yang diakibatkan serangan radikal peroksil lipid. Reaksi ini berlangsung secara berantai dan terus menerus, sebab reaksi ini menghasilkan radikal lipid bebas (R*) yang lain (Murray 2003). Jumlah lipid peroksida dalam tubuh tidak boleh melebihi kadar normalnya yaitu 4 mmol/mL (Yagi 1994). Seiring bertambahnya usia, kadar peroksida lipid dalam tubuh akan semakin meningkat.
Gambar 5 Mekanisme pembentukan radikal bebas dalam peroksidasi lipid (Murray 2003). Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menetralisir atau menstabilkan radikal bebas dengan cara melengkapi kekurangan elektron pada radikal bebas tersebut. Substansi ini mampu mencegah terjadinya reaksi berantai dari pembentukan radikal bebas yang dapat menimbulkan stres oksidatif (ketidakseimbangan antara prooksidan dan antioksidan) (Kikuzaki & Nakatani 1993). Terdapat tiga macam, mekanisme kerja antioksidan pada radikal bebas, yaitu (1) antioksidan primer yang mampu mengurangi pembentukan radikal bebas baru dengan cara memutus reaksi berantai dan mengubahnya menjadi produk yang lebih stabil. Contohnya adalah superoskida dismutase (SOD), glutation peroksidase, dan katalase yang dapat mengubah radikal superoksida menjadi molekul air, (2) Antioksidan sekunder berperan mengikat radikal bebas dan mencegah amplifikasi senyawa radikal. Beberapa contohnya adalah vitamin C, vitamin B, vitamin E, betakaroten dan senyawa fitokimia, (3) Antioksidan tersier berperan dalam mekanisme biomolekuler, seperti memperbaiki kerusakan sel dan jaringan yang disebabkan radikal bebas (Kartikawati 1999). Menurut Winarno (1997), antioksidan diklasifikasikan menjadi dua jenis yaitu sintetik dan alami. Antioksidan sintetik merupakan antioksidan hasil sintesis reaksi kimia. Beberapa antioksidan sintetik yang sering digunakan butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), propilgalat (PG), nordihidroguaricetic Acid (NDGA). Antioksidan sintetik tersebut adalah senyawa-senyawa fenol yang biasanya beracun, sedangkan antioksidan alami diperoleh dari hasil ekstraksi bahan
alami. Contohnya antara lain tokoferol, sesamol, gosipol, dan asam askorbat. Berdasarkan sumbernya, antioksidan terbagi menjadi antioksidan endogen dan antioksidan eksogen. Antioksidan endogen merupakan antioksidan yang dapat diproduksi oleh tubuh sendiri atau secara alami terdapat di dalam tubuh. Beberapa enzim dalam tubuh yang merupakan antioksidan endogen adalah superoksida dismutase, glutation peroksidase, biliverdin reduktase, katalase, dan tioredoksin reduktase. Contoh antioksidan endogen lain yang bukan enzim adalah glutation dan koenzim-Q. Antioksidan eksogen adalah antioksidan yang diperoleh dari luar tubuh atau dari asupan makanan, misalnya vitamin C, vitamin E, dan senyawa fitokimia pada tanaman, yaitu flavonoid, senyawa fenol, terpenoid, alkaloid, saponin, dan tanin (Atmosukarto 2003). Metode Analisis Aktivitas Antioksidasi Aktivitas antioksidasi dapat diuji secara langsung maupun tidak langsung. Pengujian secara langsung didasarkan pada pengukuran produk-produk utama dari oksidasi lipid, yang umumnya adalah hidroperoksida dan produk sekunder seperti aldehid. Pengujian aktivitas antioksidan secara langsung dapat dilakukan dengan beberapa metode diantaranya adalah metode oksigen aktif (active oxygen methods (AOM)), metode feritiosianat (FTC), metode tiobarbituric acid (TBA), uji Schall, uji masa simpan, dan uji rancimat (Adawiyah et al 2001). Pengujian secara tidak langsung didasarkan pada pengukuran selain produk utama atau sekunder dari oksidasi lipid, misalnya jumlah oksigen yang diperlukan untuk oksidasi. Beberapa pengujian aktivitas antioksidasi secara tidak langsung, yaitu uji wadah oksigen (Oxygen Bomb Test), sistem emulsi β-karoten-linoleat, penyemprotan larutan β-karoten, dan metode penimbangan (Adawiyah et al 2001). Selain metode tersebut, ada pula beberapa metode lainnya seperti bilangan ansindin, uji bilangan peroksida, uji kreis, dan diena terkonjugasi (Adawiyah et al 2001). Metode yang digunakan untuk menentukan aktivitas oksidasi pada penelitian ini adalah metode TBA dan DPPH. Menurut Kikuzaki dan Nakatani (1993), prinsip dari metode TBA ini adalah proses autooksidasi dari asam linoleat yang akan menghasilkan malondialdehida (MDA)
yang dengan adanya asam 2-tiobarbiturat akan membentuk kompleks MDA-TBA yang berwarna merah muda yang dapat diukur serapannya pada λ 532 nm. Secara spektrofotometri, uji TBA digunakan untuk mengukur jumlah MDA dalam bentuk tiobarbituric acid reactive substsances (TBARS). Reaksi TBA diketahui sangat sensitif terhadap peroksida lipid. Meski demikian produk oksidasi lipid lainnya seperti 2-alkenals, 2,4-alkenadials, dan 2,4hidroksialkenals serta senyawa-senyawa non lipid lainnya seperti gula, asam amino, urea, biliverdin, glioksal, dan furfural aldehid dapat bereaksi dengan TBA membentuk kompleks berwarna yang dapat terukur pada panjang gelombang yang sama (Schultz 1963; Wong 1995) Sebelum uji potensi antioksidasi dengan metode TBA, dilakukan pengukuran hidroperoksida yang merupakan produk primer oksidasi asam linoleat dengan metode diena terkonjugasi. Pengukuran hidroperoksida bertujuan untuk menentukan waktu inkubasi maksimum. Penentuan waktu inkubasi maksimum asam linoleat bertujuan untuk mengetahui lama yang diperlukan dalam menentukan daya antioksidasi sampel. Tahapan awalnya (inisiasi) asam linoleat akan dioksidasi menjadi diena terkonjugasi. Kemudian pada tahap berikutnya (propagasi), kadar diena terkonjugasinya terus meningkat dan akan mencapai kadar yang maksimum. Diena terkonjugasi tersebut dapat ditentukan intensitas penyerapannya pada λ 234 nm (Rossel 1983, diacu dalam Tensiska 2001). Selanjutnya diena terkonjugasi akan membentuk hidroperoksida dan akan mengalami dekomposisi menjadi MDA. Metoda diena terkonjugasi digunakan karena metode ini lebih cepat, lebih sederhana, dan membutuhkan sampel dalam jumlah yang cukup kecil dibandingkan dengan beberapa metode yang lain. Metode ke dua yang digunakan adalah metode aktivitas antiradikal bebas DPPH yang merupakan metode untuk menapis aktivitas antioksidan bahan alam (Santosa et al. 1998). Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode peredaman radikal bebas DPPH yang mendasarkan prinsip kerjanya pada sampel (mengandung senyawa bersifat antioksidan) yang dapat meredam radikal bebas (DPPH). (Hatano 1988) Senyawa antioksidan akan bereaksi dengan radikal DPPH melalui pendonoran
atom hidrogen (Gambar 6) yang menyebabkan terjadinya peluruhan warna dari warna ungu menjadi kuning yang diukur pada panjang gelombang 517 nm (Blois 1958). Selain itu metode ini lebih cepat, lebih sederhana, dan membutuhkan sampel dalam jumlah yang cukup kecil dibandingkan dengan beberapa metode yang lain. Perbedaan antara metode DPPH dan MDA-TBA terletak pada sensitivitas terhadap kerja antioksidan. Pelarut yang digunakan pada metode DPPH adalah metanol sehingga sampel yang larut metanol sangat sensitif dengan metode ini ( Huang et al. 2008). Sedangkan menurut Yagi (1994) pereaksi TBA mempunyai sensitivitas yang tinggi terhadap peroksida lipid yang dijadikan parameter terjadinya oksidasi dalam tubuh. H N-N(C 6 H 5 ) 2 O 2N
N-N(C 6 H 5 ) 2
NO 2
O 2N +
NO 2
Gambar 6
NO 2
AH
+
NO 2
1,1-Difenil-2-picrilhidrazil dan 1,1-Difenil-2-picrilhidrazin.
α-tokoferol Vitamin E merupakan antioksidan yang tergolong senyawa fenolik yang larut lemak serta terletak di membran eritosit dan plasma lipoprotein. Sebagai antioksidan dalam tubuh, vitamin E bertindak sebagai scavenger (penangkap) radikal-radikal bebas yang masuk ke dalam tubuh atau terbentuk di dalam tubuh dari proses metabolisme normal. Vitamin E bertindak sebagai donor ion hidrogen dan dapat mengubah radikal peroksil (hasil peroksidasi lipid) menjadi radikal tokoferol yang kurang reaktif dan relatif stabil sehingga tidak mampu merusak rantai asam lemak (Widjaja 1997). Vitamin E terdiri atas beberapa macam diantaranya adalah α-tokoferol, β-tokoferol, δ-tokoferol, dan γ-tokoferol. Komponen vitamin E yang paling banyak ditemukan adalah α-tokoferol yang memiliki cincin aromatik tersubtitusi dan rantai panjang isoprenoid sebagai rantai samping (Lehninger 1982). Peranan vitamin E dalam sel adalah dengan cara mengikat radikal bebas. Dalam jaringan, vitamin E menekan terjadinya asam lemak tidak jenuh yang terdapat pada membran, dengan demikian
A
mampu menjaga atau mempertahankan fungsi membran (Turkoglu et al. 2006). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Analisis kimia dengan metode kromatografi didasarkan pada pemisahan komponen yang terpartisi di antara dua fase dalam suatu kesetimbangan dinamis dan mengalir. Proses ini dilakukan dengan menggerakan suatu fase secara mekanis (fase gerak) relative terhadap fase lainnya. Menurut Gritter et al. (1991) secara teori pemisahan kromatografi yang paling baik akan diperoleh jika fase diam mempunyai luas permukaan sebesar-besarnya, sehingga memastikan kesetimbangan yang baik antara fase. Persyaratan kedua agar pemisahan baik adalah fase gerak harus bergerak dengan cepat secara difusi sekecilkecilnya. Untuk memperoleh permukaan fase diam yang luas, pada sebagian besar sistem kromatografi digunakan penjerap atau penyangga berupa serbuk halus. Untuk memaksa fase gerak bergerak lebih cepat melalui fase diam yang terbagi pada serbuk halus harus digunakan tekanan tinggi. Dengan dipenuhinya kedua persyaratan tersebut, diperoleh teknik kromatografi cair yang paling efektif yakni kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) atau high performance liquid chromatography (HPLC). Jadi pada HPLC fase gerak dialirkan dengan cepat dan hasilnya di deteksi dengan instrumen. Komponen utama dari sistem HPLC adalah pompa (tekanan tetap dan volume tetap), penginjeksi, kolom (eksternal dan internal), detektor, dan rekorder atau sistem data yang terintegrasi ( Rounds & Gregor 2003). Berbagai parameter yang akan mempengaruhi sistem kerja pada HPLC anatara lain diameter dari kolom HPLC, ukuran partikel, ukuran lubang pada fase diam, dan tekanan pompa. Terdapat lima tipe HPLC yaitu normal ion-exchange chromatography, sizeexclusion chromatography, affinity chromatography, phase chromatography, dan reversed phase chromatography. (Rounds & Gregor 2003). Pada penelitian ini, tipe HPLC yang digunakan adalah reversed phase chromatography (RPHPLC). Fase diam dari HPLC jenis ini adalah senyawa nonpolar, sedangkan fase geraknya polar. Oleh karena hal tersebutlah maka komponen yang akan keluar lebih dulu adalah komponen yang polar dibandingkan yang nonpolar.
Lebih dari 70% teknik pemisahan dengan metode HPLC menggunakan tipe reversed phase. Beberapa contoh teknik pemisahan yang menggunakan metode RPHPLC adalah analisis protein dari tanaman, protein dari biji-bijian, analisis vitamin larut air dan larut lemak, pemisahan karbohidrat, dan penentuan unsur-unsur pokok dari minuman ringan. Reversed phase HPLC dengan metode deteksi yang sangat bervariasi, digunakan untuk menganalis lemak (Rounds & Gregor 2003). Antioksidan, seperti butylated hydroxylanisole (BHA) dan butylated hydroxytoluene (BHT), dapat diekstrak dari bahan pangan kering dan dianalisis dengan menggunakkan detektor ultra violet (UV) dan flouresens secara bersamaan. Bahan pangan basah, pigmen (seperti klorofil, karotenoid, dan antosianin), dan komponen fenolik seperti vanili), dapat pula dianalisis dengan menggunakan metode RP-HPLC (Rounds & Gregor 2003) Kolom reversed phase chromatography lebih sulit untuk rusak dibandingkan dengan kolom silika normal. Hal ini dikarenakan kolom RP-HPLC terdiri atas alkil turunan silika dan tidak pernah digunakan dengan larutan basa (karena larutan basa akan menghancurkan ikatan silika). Kolom RPHPLC dapat digunakan dengan larutan asam tetapi tidak boleh kontak terlalu lama karena asam dapat menimbulkan korosi pada logam yang ada dalam peralatan HPLC. Kandungan logam pada kolom HPLC harus dijaga agar tetap rendah supaya dapat memberikan hasil terbaik pada pemisahan komponen. Salah satu cara untuk mengetahui kandungan logam di dalam kolom HPLC adalah menginjeksikan campuran dari 2,2’- dan 4,4’-bipiridin. Bila terdapat ion logam di permukaan silika, maka senyawa 2,2’-bipiridin akan mengkelat logam tersebut dan peak dari senyawa yang akan diidentifikasi menjadi tidak teratur sehingga dapat memberikan hasil yang tidak sesuai. Identifikasi Senyawa Flavonoid Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mendeteksi komponen fenolik dalam bahan pangan dengan metode HPLC. Komponen fenolik merupakan senyawa aromatik, oleh karena itu senyawa tesebut akan memberikan penyerapan yang baik pada panjang gelombang sinar UV. Flavonoid yang merupakan bagian dari senyawa fenolik, memiliki serapan pada
panjang gelombang 240 dan 270 nm, dan antara 320 dan 380 nm. Untuk mendeteksi komponen fenolik, detektor yang digunakan pada komponen HPLC adalah detektor UV atau UV-Vis ( Lee 2000). Analisis flavonoid pada sayuran seperti yang dikemukan Hertog et al. (1992) banyak diadopsi oleh para peneliti lain (Lee 2000). Identifikasi flavonoid pada sayuran dilakukan dengan menggunakan fase gerak 25% asetonitril dan buffer fosfat 0.025M, laju aliran adalah 0.9 ml/menit. Sampel yang akan diidentifikasi akan melewati kolom Nova_pak C18, yang akan memiliki dimensi (150 x 3,9-mm ID). Detektor yang digunakan yaitu Linear Model 204 UV-Vis detektor (Hertog et al. 1992). Menurut Macrae (1998) keuntungan utama dari HPLC adalah kemampuannya untuk menangkap komponen dengan stabilitas panas yang terbatas ataupun yang bersifat volatile. HPLC adalah metode yang sangat selektif, dan memiliki tingkat otomatisasi yang tinggi, sehingga lebih sederhana dalam pengoperasian. Di samping itu, HPLC banyak digunakan untuk analisis karena kemudahan injeksi, deteksi dan pengolahan data serta dapat digunakan untuk berbagai macam sampel seperti sampel cairan, padatan yang dilarutkan, maupun sampel yang labil terhadap pemanasan. Modern HPLC telah banyak diaplikasikan seperti pemisahan, identifikasi, pemurnian, dan penghitungan komponen yang bervariasi. Menurut Adamoson et al. (1999) HPLC merupakan metode yang efektif untuk mendeteksi dan menghitung komponen fenol dan metode ini telah digunakan secara luas. HPLC telah digunakan dalam menghitung prosianidin dalam kakao dan coklat. Dalam penelitian lain Mark et al. (2005) mengungkapkan bahwa HPLC merupakan metode yang telah banyak digunakan untuk analisis kuantitatif senyawa polifenol seperti flavonol dan proantosianidin. Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi lapis tipis (KLT) pertama kali diperkenalkan oleh Stahl pada tahun 1956 dengan cara menambahkan 2-5% perekat CaSO4 ke dalam silika gel kemudian merekatkan silika gel tersebut pada suatu plat gelas (Pomeranz & Meloan 1994). Pomeranz dan Meloan (1994) menyatakan beberapa keuntungan KLT antara lain mudah digunakan, sederhana, tidak
memerlukan keahlian khusus dan banyak parameter percobaan yang mudah divariasikan untuk mendapatkan efek-efek pemisahan. Prinsip utama KLT adalah adsorben, pengembangan dan deteksi (Heftman 1976). Sedangkan menurut Ault (1976) teknikteknik KLT yang penting meliputi persiapan plat, pengembangan dan visualisasi. Christie (1982) menyatakan bahwa silika gel adalah adsorben yang paling umum digunakan untuk berbagai tujuan dan biasanya mengandung kalsium sulfat yang berfungsi sebagai pengikat untuk meningkatkan daya adhesi lapisan pada plat. Pengembangan dilakukan dalam suatu bejana yang telah dijenuhkan dengan pelarut dan kejenuhan dipertahankan selama pengembangan. Larutan pengembangan dapat berupa satu atau lebih campuran pelarut yang ditentukan lewat percobaan (Ault 1976). Tahap selanjutnya setelah pengembangan adalah deteksi atau visualisasi. Menurut Ault (1976) jika senyawa yang terdapat dalam sampel sudah berwarna maka dapat diamati secara langsung, tetapi jika tidak berwarna maka pengamatan dapat dilakukan menggunakan sinar UV, uap iodium atau penyemprotan dengan pereaksi khusus yang akan bereaksi dengan komponen dalam sampel.
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah kulit kayu mahoni. Bahan untuk ekstraksi: aseton, n-heksana, dietil eter, etil asetat, kertas saring, aquades. Pengujian aktivitas antioksidan: buffer fosfat, asam linoleat, etanol 99.8%, TBA, vitamin-E (α-tokoferol), trichloroacetic (TCA), asam asetat, 1,1,3,3tetrametoksipropana (TMP), 2-(Nmorpholino) ethanesulfonic acid (MES), DPPH. Identifikasi flavonoid: kuersetin, asetonitril, KH2PO4, HCL, Na2CO3, dan etanol 95%, metanol. Alat yang digunakan adalah alat gelas, neraca analitik, corong, waterbath, corong pisah, rotaevapor, sentrifus, dan spektrofotometri UV-VIS, HPLC dan klinomat. Alat lain yang digunakan adalah botol gelap, vortex, kuvet, pipet Mohr, pipet mikro, dan cawan porselin, pipet tetes. Metode Tahap penelitian ini meliputi analisis kadar air, ekstraksi, pengkuran antioksidan,
identifikasi senyawa flavonoid (kuersetin) menggunakan HPLC, isolasi senyawa menggunakan KLT dan uji antioksidan senyawa hasil pemurnian (Lampiran 1). Analisis Kadar Air (Harjadi 1993 ) Cawan porselin dipanaskan pada oven dengan suhu 100°C selama 30 menit, kemudian ditimbang. Hal ini dilakukan sampai berat cawan porselin konstan. Selanjutnya 2 gram sampel dimasukan ke dalam cawan porselin dan dipanaskan pada oven dengan suhu 100°C. Hal ini juga dilakukan sampai berat sampel menjadi konstan. Besarnya kadar air dihitung dalam persen dengan cara: ((Berat sampel awal- berat sampel akhir)) : berat sampel awal ) x 100% Ekstraksi dan Fraksinasi dengan Pelarut Aseton, Metanol, n-heksana, Dietil Eter, Etil Asetat) Serbuk kayu mahoni (40-80 mesh, 3000 g berat kering) diekstraksi tiga kali dengan aseton ( masing-masing sebanyak 3 liter), pada suhu ruang selama 48 jam untuk setiap ekstraksi. Hasil ekstraksi dirotaevapor dan rendemennya dilarutkan kembali dengan metanol. Ekstrak aseton hasil rotaevaporasi diekstrak kembali dengan 200 ml aseton dan larutan disuspensikan oleh penambahan 50 ml air dan difraksinasi dengan n-heksana 150 ml, dipisahkan dengan corong pisah fraksi yang mengandung n-heksana dirotavapor. Fraksi sisanya difraksinasi kembali dengan dietil eter 150 ml, dipisahkan dengan corong pisah dan fraksi yang mengadung dietil eter dirotavapor. Fraksi sisanya difraksinasi kembali dengan etilasetat 150 ml, dipisahkan dengan corong pisah dan fraksi yang mengandung etil asetat dirotavapor (Falah et al 2008) (Lampiran 2). Ekstraksi dengan Pelarut Air Serbuk kulit kayu ditimbang dan ditambah dengan air (perbandingan 1 g : 10 ml air). Kemudian dipanaskan pada suhu 100°C selama kurang lebih 4 jam. Ekstrak yang diperoleh disaring dan filtratnya diuapkan dengan rotaevapor pada suhu 60°C (Harjadi 1993). Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH (Blois 1958) Aktivitas antioksidan dari fraksi diuji dengan metode DPPH (Blois 1958) yang dimodifikasi. Sampel dilarutkan ke dalam
metanol sehingga konsentrasi larutan menjadi 50 ppm. Larutan dari sampel yang akan diuji (0, 30, 60, 90, 120, 150 µL) ditambahkan ke dalam campuran 0.4 mM larutan DPPH, 20% larutan MeOH dan larutan buffer 0.2 M MES (1mL:1mL:1mL). Campuran dihomogenasikan dengan vortex selama 20 menit dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 517 nm (Lampiran 3). Pengujian ini juga dilakukan terhadap blanko (larutan DPPH yang tidak mengandung bahan uji) serta kontrol positif α-tokoferol. Aktivitas penangkap radikal DPPH (%) dihitung dengan rumus: (A blanko-A sampel) : Ablanko x 100 %. Penentuan Waktu Inkubasi Maksimum (Esterbauer et al.1989, diacu dalam Taher 2003) Penentuan waktu inkubasi maksimum dilakukan dengan menggunakan 2 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7, 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8% dan 1 mL air bebas ion diletakkan ke dalam botol gelap yang berulir, kemudian campuran diinkubasi pada suhu 40°C. Lama inkubasi ditentukan setelah tercapainya absorban maksimum. Campuran sampel tersebut diambil 50µL ke dalam 6 mL etanol 75%, kemudian absorbansi diena terkonjugasi sampel diukur langsung menggunakan spektofotometri sinar UV pada panjang gelombang 234 nm. Sampel diukur setiap hari sampai tercapai absorbansi maksimum. Analisis Konsentrasi Malondialdehida (MDA) dengan Metode TBA (Kikuzaki 1993) Campuran sampel yang dibuat terdiri atas 2 mL buffer fosfat 0.1M pH 7, 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8% dan 1 mL larutan uji. Campuran kontrol tanpa perlakuan dibuat sama seperti campuran sampel tetapi 1 mL larutan uji diganti dengan 1 mL air bebas ion. Campuran pembanding yang dibuat terdiri atas 2 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7,2 mL asam linoleat 50mM dalam etanol 99.8% yang mengandung α-tokoferol (vitamin E 200 ppm), dan 1 mL air bebas ion. Semua campuran tersebut diinkubasi dalam penangas air yang bersuhu 40°C dengan lama inkubasi 2 hari setelah waktu inkubasi maksimum. Masing-masing campuran reaksi diambil 1 mL lalu ditambahkan 2 mL TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% (b/v) dalam asam asetat
50%. Kemudian campuran reaksi tersebut ditempatkan pada penangas air yang bersuhu 100°C selama 10 menit. Setelah itu didinginkan dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit, selanjutnya diukur absorbansinya dengan spektrofotometeri pada panjang gelombang 532 nm. Sebagai kurva standar, larutan stok pereaksi 1, 1, 3, 3, - tetrametoksipropana (TMP) konsentrasi 6 M diencerkan menjadi 60 µM kemudian diencerkan kembali menjadi 3, 6, 9, 12 dan15µM. masingmasing konsentrasi dipipet sebanyak 1 mL lalu ditambahkan 2 mL TCA 20% dan 2 mL TBA 1% (b/v) dalam asam asetat 50% (v/v). kemudian semua tabung diinkubasi pada suhu 100°C selama 10 menit dan didinginkan pada suhu kamar. Setelah dingin dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit selanjutnya diukur absorbansinya dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 532 nm (Lampiran 4). Analisis Flavonoid dengan HPLC (Hertog et al 1992) Identifikasi flavonoid pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan fase gerak 25% acetonitril dan buffer fosfat 0.025M. Laju alirnya sebesar 0.9 ml/menit. Sampel yang akan diidentifikasi akan melewati kolom Nova_pak C18, yang memiliki dimensi (150 x 3,9-mm ID). Detektor yang digunakan yaitu linear model 204 UV-Vis detektor (Hertog et al 1992). Standar kuersetin yang telah disaring dengan syringe filter 0.45 µm, diinjeksikan ke dalam kolom HPLC. Selanjutnya ekstrak sampel (fraksi yang memiliki daya antioksidan tertinggi) juga disaring dengan syringe filter 0.45 µm dan diinjeksikan ke dalam kolom. Kemudian hasil dari kromatogram sampel dibandingkan dengan kromatogram standar ( kuersetin). Penentuan komponen yang terdapat pada sampel dilihat berdasarkan waktu retensi masing-masing standar. Isolasi Senyawa Flavonoid (kuersetin) (Osawa dan Namiki 1981) Isolasi senyawa flavonoid ekstrak kulit kayu mahoni dilakukan dengan kromatografi lapis tipis silika F254 menggunakan pelarut metanol. Standar kuersetin dan sampel diinjeksikan di lempengan silka dengan menggunakan klinomat. Lempengan silka dimasukkan ke
dalam bejana KLT yang berisi metanol jenuh. Selanjutnya sampel akan terpisah menjadi beberapa fraksi. Fraksi yang diperoleh divisualisasi dibawah sinar lampu UV (panjang gelombang 254-366). Komponen-komponen yang terpisah pada lapis tipis khususnya yang Rf-nya sama dengan standar dikerok dan dilarutkan dalam 2 mL etanol, diendapkan dan dipisahkan untuk pemurnian dari komponen penyusun plat KLT.
HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan Kadar Air Kandungan air dalam sampel kulit kayu mahoni sebesar 7.5%. Hasil perhitungan kadar air dapat dilihat pada Lampiran 5. Penentuan kadar air berguna untuk menyatakan kandungan zat dalam tumbuhan sebagai persen bahan kering dan sebagai faktor koreksi suatu sampel jika penelitian dilakukan pada sampel yang memiliki lingkungan agrobiofisik yang berbeda. Selain itu, juga untuk mengetahui ketahanan suatu bahan dalam penyimpanan (Harjadi 1993). Sampel yang baik disimpan dalam jangka panjang adalah sampel yang memiliki kadar air kurang dari 10%. Oleh karena itu kulit kayu mahoni ini dapat disimpan dalam jangka waktu panjang. Selain itu penentuan kadar air juga berfungsi untuk memperkirakan jumlah bahan yang dibutuhkan jika ingin mengekstraksi bahan langsung dalam keadaan basah dan sebagai koreksi rendemen. Ekstraksi dan Fraksinasi Ekstraksi yang digunakan pada penelitian ini adalah metode rebusan dan maserasi. Metode rebusan dilakukan dengan merebus serbuk kulit kayu mahoni dan air selama 4 jam. Hal ini mengikuti metode yang digunakan oleh Harjadi (1993). Pemilihan metode rebusan didasarkan pada kebiasaan masyarakat yang sering mengkonsumsi bahan herbal dengan cara menyeduh dan melarutkannya dalam air selain itu metode rebusan merupakan metode yang murah dan praktis sehingga dapat dilakukan oleh masyarakat umum. Metode kedua adalah maserasi dengan cara merendam sampel dalam pelarut tertentu. Maserasi merupakan metode yang sederhana karena tidak menggunakan pemanasan sehingga dapat mencegah rusaknya senyawa metabolit sekunder yang tidak tahan
terhadap suhu yang tinggi. Proses maserasi dengan menggunakan aseton, metanol, nheksana, dietil eter, etil asetat mengacu pada penelitian yang telah dilakukan Falah et al (2008). Rendemen yang diperoleh dari ekstraksi ditunjukkan pada Tabel 1. Sedangkan pada penelitian Falah et al (2008) rendemen yang dihasilkan dari ekstraksi dengan aseton, ekstaksi dengan metanol, fraksinasi nheksana, fraksinasi dietil eter, dan fraksinasi etil asetat adalah masing-masing sebesar 19.93% dan 6.96%. 0.28%, 1.16%, 3.10%. Pada penelitian ini jumlah ekstrak yang dihasilkan lebih kecil daripada yang dilakukan Falah et al (2008) dikarenakan pada penelitian ini kulit kayu mahoni yang digunakan berasal dari tanaman mahoni yang umurnya lebih muda (15 tahun) jika dibandingkan yang digunakan Falah et al (2008) ( 30 tahun). Selain itu lingkungan agrobiofisik tanaman yang digunakan juga berbeda sehingga mempengaruhi kadar senyawa metabolit sekunder tanaman. Menurut Nurcholis (2008) produksi metabolit sekunder pada suatu tanaman dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya umur tanaman dan interaksi lingkungan. Hal ini juga sesuai dengan Hanan (1999) yang menyatakan bahwa kandungan senyawa dalam suatu tanaman yang sama bisa berbeda karena adanya pengaruh iklim, keadaan tanah, sinar matahari, dan cara pengolahannya. Pemilihan pelarut pada penelitian ini berdasarkan pada polaritas komponen antioksidan yang akan diekstrak (Markham 1975). Alkohol yang merupakan senyawa serba guna karena dapat merusak membran sel dalam jumlah yang lebih besar (Ghisalberti 1993). Menurut Harbone (1987) eter, kloroform, dan petroleum digunakan untuk melarutkan lipid dan triterpenoid. Etanol, aseton, dan etil asetat digunakan sebagai pelarut senyawa yang lebih polar misalnya senyawa fenolik atau polifenolik. Tabel 1 Hasil ekstraksi kulit kayu mahoni Pelarut Berat ekstrak % ekstrak aseton 237.00 g 8.84% metanol 184.43 g 6.65% n-hexana 3.02 g 0.11% dietil eter 11.69 g 0.42% etil asetat 30.71 g 2.17% air 29.83 g 6.44%
Daya Hambat Ekstrak Terhadap Radikal DPPH Pada penelitian ini daya hambat terbesar untuk 50 ppm ekstrak metanol , fraksi nheksana, fraksi dietil eter, fraksi etil asetat, ekstrak air dan vitamin E adalah masingmasing sebesar 81.33%, 12.74%, 23.40%, 65.54%, 68.04%,dan 30.42% (Gambar 7). Kontrol positif yang digunakan pada penelitian ini adalah vitamin E yang merupakan antioksidan yang tergolong senyawa fenolik yang larut lemak serta terletak di membran eritosit dan plasma lipoprotein. Sebagai antioksidan dalam tubuh, vitamin E bertindak sebagai scavenger (penangkap) radikal-radikal bebas yang masuk ke dalam tubuh atau terbentuk di dalam tubuh dari proses metabolisme normal. Vitamin E bertindak sebagai donor ion hidrogen dan dapat mengubah radikal peroksil (hasil peroksidasi lipid) menjadi radikal tokoferol yang kurang reaktif dan relatif stabil sehingga tidak mampu merusak rantai asam lemak (Widjaja 1997). Pada penelitian ini digunakan metode Blois yang dimodifikasi dengan buffer MES, buffer ini berfungsi untuk menjaga keseimbangan pH pada proses reaksi sampel dengan radikal DPPH. Oleh karena itu faktor perusakan radikal karena pH tidak mempengaruhi penelitian ini. Hasil penelitian ini berbeda dengan penelitian Rohman & Riyanto (2005). Pada penelitian Rohman dan Riyanto besar daya hambat terbesar vitamin E adalah 87.17% tetapi pada penelitian Rohman dan Riyanto tidak menggunakan buffer MES sehingga pengaruh ketidakseimbangan pH dapat mempengaruhi kerusakan radikal DPPH. Selain itu Menurut Francis (1985) asam askorbat, karatenoid, dan tokoferol relatif tidak tahan terhadap udara dan oksigen sedangkan senyawa flavonoid dan tanin relatif tahan. Oleh karena itu vitamin E mudah terdegradasi oleh radikal bebas yang berasal dari lingkungan sebelum didegradasi oleh radikal yang berasal dari DPPH. Sedangkan sampel lebih sulit untuk terdegradasi oleh radikal bebas di lingkungan ataupun rusak oleh oksigen. Karena sampel mengandung flavonoid dan tanin sehingga besar daya hambat pada
sampel terhadap radikal DPPH lebih besar
Gambar 7
dibanding vitamin E.
Daya hambat ekstrak kulit kayu mahoni terhadap radikal DPPH. etil asetat, metanol, air, vitamin E, dietil eter, n-heksana.
Hasil ekstraksi yang mempunyai daya hambat terbesar pada penelitian ini adalah ekstraksi dari ekstrak metanol, Hal ini dikarenakan metanol merupakan senyawa serba guna karena dapat merusak membran sel dalam jumlah yang lebih besar (Ghisalberti 1993). Metanol juga merupakan senyawa polar yang sangat baik dalam mengekstrak senyawa fenolik yang terkandung dalam suatu bahan. Sampel kedua yang memiliki daya hambat terbesar adalah ekstrak air, sama seperti metanol, air juga merupakan senyawa polar, sehingga komponen fenolik yang bersifat polar juga banyak terekstrak oleh pelarut ini. Pelarut yang menghasilkan daya hambat terbesar ketiga adalah etil asetat. Menurut Harbone (1987) etil asetat digunakan sebagai pelarut senyawa yang lebih polar misalnya senyawa fenolik atau polifenolik. Menurut Hernani dan Rahardjo (2005), salah satu fungsi dari senyawa polifenolik adalah menangkap radikal bebas atau sebagai antioksidan. Sedangkan dietil eter dan n-heksana adalah pelarut yang bersifat non-polar sehingga ekstraksi kedua pelarut ini terhadap senyawa fenolik dan flavonoid yang bersifat polar lebih kecil dan menyebabkan daya tangkap terhadap radikal bebas kecil. Selain itu n-
heksana juga merupakan pelarut yang berfungsi mengikat lemak yang umumnya sering dirusak oleh radikal bebas sehingga dalam jumlah yang sedikit menambah jumlah senyawa yang teroksidasi. Pada penelitian pengukuran nilai inhibition concentration 50 (IC 50) tidak dilakukan karena pada penelitian ini nilai daya hambat maksimum terdapat pada konsentrasi 50 ppm sedangkan untuk konsentrasi diatasnya daya hambat sampel menjadi tidak stabil. Selain itu, penelitian ini menitikberatkan pada pemilihan sampel yang memiliki nilai daya hambat tertinggi dibanding sampel lain. Sampel dengan daya hambat tertinggi akan dianalisis ke tahap identifikasi dan potensi antioksidan flavonoid yang dikandungnya. Sistem Oksidasi Asam linoleat Penentuan waktu inkubasi asam linoleat bertujuan mengetahui lama inkubasi yang perlu dilakukan dalam menentukan daya antioksidasi sampel. Hasil penelitian menunjukkan bahwa absorbansi terbesar terjadi pada hari ke-4. Berdasarkan hasil penelitian ini, pengukuran MDA total sistem asam linoleat dan sampel dilakukan dua hari setelah kadar hidroperoksida maksimum
dengan asumsi semua hidroperoksida yang telah terbentuk terdekomposisi menjadi MDA (Kikuzaki & Nobuji 1993). Gambar 8 menunjukkan keadaan hidroperoksida selama inkubasi. Konsentrasi hidroperoksida sebanding dengan nilai absorbansi sampel. Pada penelitian ini nilai absorbansi sampel tidak naik dan turun secara konstan namun pada hari ke-4 yang merupakan waktu inkubasi maksimum nilai absorbansi sampel meningkat dan menurun secara tajam. Hasil dari penentuan waktu inkubasi maksimum pada penelitian ini berbeda dengan yang diperoleh Syaefudin (2008). Pada penelitian Syaefudin absorbansi sampel cenderung naik dan kemudian turun secara konstan. Perbedaan peningkatan dan penurunan nilai absorbansi pada penelitian ini dengan nilai absorbansi sampel yang dilakukan oleh Syaefudin (2008) dapat disebabkan oleh pola pengambilan sampel. Pada penelitian ini sampel diambil pada botol yang sama setiap harinya sehingga udara dapat masuk ke dalam botol dan mempengaruhi oksidasi asam linoleat yang ada dalam botol karena menurut Halliwel dan Gutteridge (1985), diacu dalam Wiseman et al. (2005) lipid adalah senyawa yang sangat sensitif terhadap radikal bebas dari udara.
Gambar 8
Penetuan waktu inkubasi maksimum asam linoleat. hasil pengukuran.
Konsentrasi Malondialdehida dan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Ekstrak yang dianalisis potensi antioksidannya dengan menggunakan metode TBA untuk mengukur MDA adalah ekstraki metanol dan ekstrak air (karena kedua ekstrak inilah yang larut di dalam air). Sebagai pembanding pada penelitian ini digunakan juga vitamin E seperti pada metode DPPH. Kisaran konsentrasi yang digunakan pada penelitian ini adalah 50,100, dan 200 ppm. Karena antioksidan seperti vitamin E memiliki aktivitas antioksidan in vitro maksimum pada 200 ppm (Coppen 1983). Selain itu nilai konsentrasi ini merupakan batas maksimum kandungan antioksidan yang diperbolehkan pada makanan (Hernani & Rahardjo M 2005). Analisis antioksidasi ini dilakukan pada hari ke-6 inkubasi. Diharapkan semua hidroperoksida yang terbentuk sebagai hasil oksidasi asam telah mengalami dekomposisi menjadi MDA. Prinsip metode MDA adalah mengukur produk oksidasi asam linoleat, yaitu MDA yang bereaksi dengan asam tiobarbiturat menghasilkan produk berwarna merah yang diukur pada panjang gelombang λ 532 nm (Kikuzaki & Nakatani 1993). Untuk pembuatan kurva standar digunakan larutan standar TMP, TMP merupakan prekusor MDA karena dari hasil hidrolisis TMP dengan air menghasilkan MDA. Oleh karena itu, larutan stok TMP dapat digunakan sebagai standar MDA. Persamaan garis linier yang diperoleh dari kurva standar digunakan untuk menentukan konsentrasi MDA adalah y = 0.097x + 0.141 dengan nilai R2 = 0.994 (Lampiran 7). Proses autooksidasi asam linoleat dapat dihambat oleh senyawa antioksidan, sehingga MDA yang terbentuk akan lebih sedikit daripada tanpa penambahan senyawa antioksidan. Nilai serapan yang diperoleh sebanding dengan konsentrasi MDA dan berbanding terbalik dengan aktivitas antioksidasinya. Nilai serapan yang keterbacaannya rendah menunjukkan adanya aktivitas antioksidasi yang tinggi. Nilai serapan dan daya hambat yang diperoleh pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 2 dan Gambar 9. Ekstrak metanol adalah ekstrak yang memiliki daya antioksidasi terbesar.
Tabel 2 Konsentrasi MDA dan % daya hambat ekstrak kulit kayu mahoni sampel
Konsentrasi MDA 50 ppm
Vit E Ekstrak Air Fraksi Metanol
100 ppm
Daya hambat (%) 200 ppm
50 ppm
100 ppm
200 ppm
0.02369
0.02066
0.01922
27.15
36.48
40.91
0.01851
0.01658
0.01475
43.09
49.01
54.6
0.01335
0.01333
0.01307
58.96
59.02
59.81
Gambar 9 Daya hambat ekstrak kulit kayu mahoni terhadap pembentukan MDA. vit E, metanol, air.
Ekstrak metanol memiliki daya hambat terbesar dikarenakan metanol yang adalah senyawa serba guna karena dapat merusak membran sel dan mengekstrak endoseluler dalam jumlah yang lebih besar (Ghisalberti 1993) dan metanol juga merupakan senyawa polar yang sangat baik mengekstrak senyawa fenolik yang terkandung dalam suatu bahan. Tetapi pada penelitian ini aktivitas ekstrak metanol lebih kecil jika dibandingkan dengan yang dihasilkan metode DPPH. Hal ini dikarenakan pada penelitian ini pelarut yang digunakan adalah air sehingga aktivitas kelarutan metanol menjadi sedikit berkurang jika dibandingkan dengan metode DPPH yang menggunakan metanol sebagai pelarut. Pada penelitian ini nilai daya hambat vitamin E lebih kecil jika
dibandingkan dengan literatur Alfarabi (2008) sebesar 54.51% tetapi jika dibandingkan dengan Ayuningtyas (2006) sebesar 22.06% nilai aktivitas antioksidasi vitamin E pada penelitian ini lebih besar. Perbedaan nilai aktivitas antioksidasi vitamin E pada berbagai penelitian disebabkan oleh sifat vitamin E yang sukar larut dengan air sehingga ketika menggunakan metode MDA yang pelarutnya air kelarutan vitamin E pada setiap percobaan berbeda. Selain itu Menurut Francis (1985) asam askorbat, karatenoid, dan tokoferol relatif tidak tahan terhadap udara dan oksigen sedangkan senyawa flavonoid dan tanin relatif tahan. Oleh karena itu vitamin E lebih mudah rusak sehingga aktivitas penghambatan
pembentukan MDA oleh vitamin E dapat menjadi lebih kecil. Sedangkan sampel lebih sulit untuk rusak karena sampel mengandung flavonoid dan tanin sehingga besar aktivitas daya hambat pada sampel terhadap pembentukan MDA lebih besar dibanding vitamin E. Analisis Flavonoid ( Kuersetin) dengan HPLC Kadar kuersetin yang terdapat dalam sampel adalah 16 mg/100g sampel. Kadar kuersetin pada penelitian ini tidak berbeda jauh jika dibandingkan kadar kuersetin dari apel segar (salah satu buah dengan kadar kuersetin yang tinggi) sebesar 17 mg/100g sampel serta lebih besar jika dibandingkan jus apel sebesar 2.5mg/l dan teh hitam 1013mg/l (Hertog et al 1992). Pendeteksian kuersetin pada penelitian ini dilakukan menggunakan HPLC, detektor yang digunakan adalah detektor UV-Vis (Lee 2000). Flavonoid yang merupakan bagian dari senyawa fenolik, memiliki serapan pada panjang gelombang 250 nm. Hasil dari analisis HPLC Gambar 10 menunjukkan adanya peak (puncak) yang hampir sama antara hasil kromatogram sampel (ekstrak metanol karena sampel dari ekstrak metanol memiliki daya antioksidan tertinggi pada 2 uji antioksidan) dan kromatogram standar (kuersetin) (Gambar 10).
Isolasi Flavonoid (Kuersetin) dengan KLT dan Uji Aktivitas Antioksidan Flavonoid (Kuersetin) Hasil proses pemisahan dengan KLT tidak memperlihatkan warna di lempengan KLT (Gambar 11) sehingga harus dilakukan visualisasi dengan menggunakan sinar UV. Hasil visualisasi menggunakan sinar UV menunjukkan bahwa dari 3 kali pengulangan sampel, sampel terpisah oleh pengembang dan memiliki faktor retensi (Rf) yang sama dengan standar kuersetin yaitu 0.8625 (Gambar 12). Pada proses KLT sampel yang digunakan sama dengan sampel yang digunakan pada proses HPLC yaitu ekstrak metanol. Pada penelitian ini KLT dilakukan dengan menggunakan silika berfluoresens F254 dan pengembangan dilakukan dengan menggunakan pelarut metanol. Christie (1982) menyatakan bahwa silika gel adalah adsorben yang paling umum digunakan untuk berbagai tujuan pada proses pemisahan dengan metode kromatografi. Metanol digunakan sebagai pengembang karena metanol merupakan senyawa yang bersifat polar sehingga dapat mengembangkan senyawa kuersetin yang bersifat polar.
Gambar 11 Hasil dari KLT ekstrak metanol kulit kayu mahoni (a) Standar kuersetin.
Gambar 12
Gambar 10 Hasil HPLC standar kuersetin (a), sampel ekstrak metanol (b).
Hasil visualisasi menggunakan UV-VIS dari KLT ekstrak metanol kulit kayu mahoni standar kuersetin (a), fraksi metanol I (b), fraksi metanol II (c), fraksi metanol III (d).
Selanjutnya setelah proses KLT, dilakukan isolasi kuersetin dari hasil KLT dengan proses pengerokan dan pelarutan ke dalam metanol. Namun karena kuersetin yang ada pada lempengan silika sangat sedikit maka proses isolasi kuersetin dari sampel tidak dilakukan. Oleh karena itu, uji aktivitas antioksidan kuersetin pada percobaan ini dilakukan dengan menggunakan standar kuersetin. Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode DPPH karena sampel yang digunaka adalah fraksi metanol yang larut dengan pelarut metanol yang digunakan pada metode DPPH. Konsentrasi yang digunakan 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm dan daya hambat yang dihasilkan sebesar 87.2%, 89.1%, 92.8% (Gambar 13). Daya hambat kuersetin ini cukup tinggi dan terus naik secara linear, namun tidak terlalu terpengaruh oleh konsentrasi karena % daya hambat yang didapatkan dari ketiga konsentrasi tersebut tidak berbeda nyata.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Kulit kayu mahoni menunjukkan aktivitas antioksidan pada metode DPPH dan metode MDA-TBA. Ekstrak yang memiliki potensi antioksidan tertinggi adalah ekstrak metanol. Pengidentifikasian esktrak metanol dari kulit kayu mahoni menggunakan HPLC dan KLT menunjukkan adanya flavonoid (kuersetin) dalam kulit kayu mahoni. Flavonoid (kuersetin) yang terkandung dalam kulit kayu mahoni sebesar 16mg/100g sampel. Flavonoid (kuersetin) memiliki potensi antioksidan yang sangat tinggi dan terus naik secara linear. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai identifikasi dan uji aktivitas antioksidan flavonoid jenis lain. Serta perlu juga dicari metode isolasi senyawa yang lebih baik misalnya menggunakan kromatografi kolom, KLT preparative dan HPLC preparatif.
DAFTAR PUSTAKA Adawiyah DR, Sarastani D, Fardiaz D. 2001. Kajian aktivitas antioksidan buah atung (Parinarium glaberimum Hassk.). [laporan penelitian]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Alfarabi M. 2008. Aktivitas antioksidan ekstrak daun sirih merah ( Piper crocatum) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Amic D, Dusanka DA, Beslo D, Trinasjtic. 2003. Structure-radikal scavenging activity relationship of flavonoids. Crotia Chem Acta 76:55-61. Atmosukarto K, Mitri R. 2003. Mencegah penyakit degeneratif dengan makanan. Cermin Dunia Kedokteran. 140:41-49. Ault A. 1976. Techniques and Experiments for Organic Chemistry. Boston: Holbrook Pr. Gambar 13 Daya hambat kuersetin sebagai antioksidan.
Ayuningtyas I. 2007. Potensi antioksidasi ekstrak daun keji beling (Strobilanthes crispus Blume.) [skripsi]. Bogor:
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Hernani, Rahardjo M. 2005. Tanaman Berkhasiat Antioksidan. Jakarta: Penebar Swadaya.
Brooke L. 1990. Other metabolites from Swietenia macrophylla King. Agr Fiji 29: 19-20.
Hertog et al. 1992. Optimatization of a quantitative HPLC determination of potentially anticarcinogenic flavonoid in vegetables and fruits. Agr Food 40: 1591-1598.
Blois MS. 1958. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 181:1199-1200. Falah S, Suzuki T, Katayama T. 2008. Chemical constituent from Swietenia macrophylla bark and their antioksidan activity. Pak J Biol Sci 11:2007-2012. Falakh S. 2008. Aktivitas antioksidan ekstrak jamur kuping hitam (Auricularia polytricha) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Francis FJ. 1985. Pigments and other colorants. Di dalam: Food Chemistry. Ennema OR, editor. New York: Marcel Dekker. Ghisalberti EL. 1993. Detection and isolation of bioactive natural products. Di dalam:. Bioactive Natural Products: Detection, Isolation and Determinations. Colegate SM, Molyneux RJ, editor. Florida: CRC Pr.
Hertog et al. 1992. Content of potentially anticarcinogenic flavonoids of 28 vegetables and 9 fruits commmnly consumed in The Netherlands. Agr Food 40: 2379-2383. Kartikawati D. 1999. Studi efek protektif vitamin C dan vitamin E terhadap respon imun dan enzim antioksidan pada mencit yang dipapar paraquat. [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Kikuzaki H, Nobuji N. 1993. Antioxidant effect of some ginger constituents. Food Sci 58:1407-1410. Langseth L. 1995. Oxidant, antioxidant, and disease prevention. Di dalam: ILSI Europe Concise Monograph Series 124. Brussel: Belgium. Lee HS. 2000. HPLC Analysis of phenolic compounds. Di dalam: Food Analysis by HPLC. Nollet LML, editor. New York: Marcel Dekker Inc.
Gritter RJ, Bobbitt JM, Schwarting AE. 1991. Pengantar Kromatografi. Ed Ke2. Padmawinata K, penerjemah; Bandung: ITB. Terjemahan dari: Elements of Chromatography
Lehninger AL. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Thenawidjaja M, penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry.
Harbone JB.1987.Phytochemical Methods. London : Chapman and Hall Ltd
Markham KR. 1982. Techniques of Flavonoids identification. London: Academic Pr.
Harjadi W. 1993. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: Gramedia Pustaka Hart H. 1983. Kimia Organik Suatu Kuliah Singkat. Ed-11. Achmadi S, penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Organic Chemistry.
Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper. Ed-25. Hartono A, Bani AP, Sikumbang TMN, penerjemah; Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Harper’s Biochemistry.
Hefman E. 1976. Chromatography of Steroids. New York: Elsevier Scientific Publ.
Miller AL.1996. Antioksidant flavonoids: structure, function, dan clinical usage. Alt Med Rev 1: 103-111.
Mimić-Oka J, Simic DV, Simic TP. 1999. Free radicals in cardiovascular disease. Sci J Fac Univ 6:11-12. Pomeranz Y, CE Meloan. 1994. Food Analysis, Theory and Practise. New York: Chapman and Hall. Rounds MA, JF Gregor. 2003. High Performance Liquid Chromatography. Di dalam: Food Analysis. Nielsen SS, editor . New York: Plenum Publ. Schultz HW. 1962. Symposium on Food: Lipid and their Oxidation. Connecticut: The Avi Publ. Spencer et al. 2003. Metabolism in the small intestine and gasrtoinstestinal tract. Di Dalam: Flavonoids in Health and Disease. Rice Evans CA dan Packers L, editor. New York: Marcel Dekker. Sofianti D. 2006. Potensi antioksidan daun mahkota dewa ( Phaleria macrocarpa Boerl.) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Syaefudin. 2008. Aktivitas antioksidasi formula ekstrak jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamnk.), jambu biji ( Psidium Guajava Linn.), dan salam ( Eugenia polyantha Wight.) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Taher A. 2003. Peran fitoesterogen sebagai antioksidan penanggulangan aterosklerosis Bogor: Sekolah Pascasarjana, Pertanian Bogor.
kedelai dalam [tesis]. Institut
Tensiska. 2001. Aktivitas antioksidan ekstrak buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC) dalam beberapa sistem pangan dan kestabilan aktivitasnya terhadap suhu dan pH. [tesis]. Bogor. Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor Tombilangi AK . 2004. Khasiat ekstrak daun jati belanda ( Guazuma ulmifolia Lamnk.) terhadap kadar lipid peroksida darah kelinci yang hiperlipidemia [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Turkoglu A et al. 2006. Antioxidant and antimicrobial activities of Morchella conica. Afric J Biotechnol 5:1146-1150. Tuminah S. 2000. Pencegahan kanker dengan antioksidan. Cermin Dunia Kedokteran 122:21-23. Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. Wiseman et al. 2005. Biomolecular Free Radical Toxicity: Cause and Prevention. New York: John Wiley & Sons. Yagi K. 1994. Lipid peroxides in hepatic, gastrointestinal, and pancreatic diseases, Di dalam: Free Radicals in Diagnostic Medicine. Amstrong D, editor. New York: Plenum Pr.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Alur Penelitian Ekstraksi/ fraksinasi
Uji antioksidan
Metode MDA-TBA
Metode DPPH
Analisis Flavonoid (HPLC) (
Isolasi flavonoid dengan KLT
Uji antioksidan flavonoid
Lampiran 2 Ekstraksi dan fraksinasi kulit kayu mahoni
Serbuk kayu mahoni
Ekstraksi dengan air
Ekstraksi 3 kali dengan aseton
Ekstrak aseton
Residu serbuk
Ekstrak kembali dengan aseton dan suspensikan dengan air
Ekstraksi dengan metanol
Ekstrak metanol Dipisahkan dengan nheksana
Dipisahkan dengan dietl eter
Dipisahkan dengan etil asetat etil
Fraksi etil asetat
Fraksi heksana
Fraksi dietil eter
Lampiran 3 Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
Sampel ditambah dalam campuran 0.4mM DPPH, 20% larutanMeOH, MES buffer (1mL:1mL:1mL)
divortex selama 20 menit
Absorbansinya diukur pada λ 517 nm
Lampiran 4 Metode pengujian potensi antioksidasi metode MDA-TBA
Campuran kontrol tanpa perlakuan
Campuran pembanding
Campuran sampel
Inkubasi pada 40°C dengan lama berdasar hasil analisis hidroperoksida
Diambil 1 mL masing-masing larutan tiap larutan ditambah 2 mL TCA 20% dan 2 mL TBA 1% (b/v) dalam asam asetat 50% (v/v) Inkubasi pada suhu 100°C, selama 10 menit
Didinginkan pada suhu kamar Sentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit Supernatant diukur pada λ 532 nm
Lampiran 5 Analisis kadar air kulit kayu mahoni Keterangan Bobot pinggan Bobot sampel awal Bobot pinggan + sampel telah di oven Bobot sampel akhir % kadar air Rata-rata % kadar air Perhitungan % kadar air:
I 28.49 g 2g 30.34 g 1.85 g 7.5%
Ulangan II 34.30 g 2g 36.15 g 1.85 g 7.5% 7.5%
(a-b) x 100% a
: (2-1.85) x 100% 2 = 7.5% Rata-rata % kadar air = kadar air I + kadar air II + kadar air III 3
= 7.5% +7.5% + 7.5% 3 = 7.5% Ket a : bobot sampel b : bobot sampel setelah pemanasan
II 36.23g 2g 38.08 g 1.85 g 7.5%
Lampiran 6 Hasil fraksinasi ekstrak aseton kulit kayu mahoni dengan berbagai pelarut Hasil maserasi ekstrak aseton kulit kayu mahoni dengan pelarut aseton, methanol, n-hexana, dietil eter, dan etil asetat (Lampiran 2) Sampel ekstrak aseton Pelarut aseton n-hexana dietil eter etil asetat
Berat ekstrak 237 g 3.02 g 11.69 g 30.71 g
Pembanding ekstrak air dan ekstrak methanol Pelarut Berat ekstrak air 29.83 g metanol 184.43 g
% ekstrak
% ekstrak 8.84% 0.11% 0.42% 2.17%
% ekstrak 6.64% 6.65%
= berat ekstrak (kulit kayu mahoni- kadar air )
x 100%
Lampiran 7 Kurva standar TMP Data Konsentrasi TMP (µM)
1
3 6 9 12 15
0.251 0.322 0.427 0.533 0.638
Serapan 2 0.257 0.323 0.432 0.520 0.638
3
Rerata
0.251 0.322 0.427 0.533 0.638
0.253 0.322 0.429 0.529 0.638
Keterangan : Persamaan garis linier yang dihasilkan digunakan untuk menentukan konsentrasi MDA Grafik
Lampiran 8 Hasil pengujian aktivitas antioksidasi dengan metode TBA Ekstrak kontrol (-)
Vit E (50 )
Vit E (100)
Vit E (200)
metanol (50)
metanol (100)
metanol (200)
air (50)
air (100)
air (200)
Ulangan Absorban 1 1.541 2 0.932 3 1.125 1 1.071 2 0.750 3 0.915 1 1.041 2 0.724 3 0.765 1 0.878 2 0.710 3 0.711 1 0.763 2 0.500 3 0.592
Rataan % daya [MDA] [MDA] Std dev hambat 0.0430 0.03252 0.43063 0.00% 0.0243 0.0302 0.0286 0.02369 0.16052 27.15% 0.0187 0.0238 0.0277 0.02066 0.17241 36.48% 0.0164 0.0179 0.0226 0.01922 0.00297 40.91% 0.0175 0.0175 0.0180 0.01335 0.00432 58.96% 0.0095 0.0125
1 2 3
0.728 0.451 0.547
0.0180 0.0095 0.0125
0.01333
0.00429
59.02%
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
0.726 0.430 0.543 0.809 0.675 0.746 0.710 0.630 0.702 0.705 0.529 0.629
0.0180 0.0089 0.0124 0.0205 0.0164 0.0186 0.0175 0.0150 0.0172 0.0173 0.0119 0.0150
0.01307
0.00459
59.81%
0.01851
0.00206
43.09%
0.01658
0.00135
49.01%
0.01475
0.00271
54.65%
Ket: [ MDA] = konsentrasi MDA Std dev = standar deviasi.
Lampiran 9 Hasil analisis statististik konsentrasi MDA dengan metodeTBA The SAS System Analysis of Variance Procedure Class Level Information Class
Levels
Values
PELARUT
3
abc
KONSENTRASI
3
123
Number of observations in data set = 27 The SAS System Analysis of Variance Procedure Duncan's Multiple Range Test for NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 18 MSE= 0.000017 Number of Means 2 3 Critical Range .004025 .004223 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping
Mean
N PELARUT
A
0.021989
9
a
B B B
0.017856
9
c
0.014089
9
b
The SAS System Analysis of Variance Procedure Duncan's Multiple Range Test for NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 18 MSE= 0.000017 Number of Means 2 3 Critical Range .004025 .004223 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping A A A A A
Mean
N
KONSENTRASI
0.018956
9
1
0.017822
9
2
0.017156
9
3
Lampiran 10 Hasil HPLC kulit kayu mahoni fraksi metanol
Standar kuersetin
Sampel
Lampiran 11 Hasil pengujian aktivitas antioksidan kuersetin metode DPPH
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Rata-rata
Daya hambat
blanko
0.683
0.690
0.685
0.686
-----
50 ppm
0.090
0.089
0.084
0.088
87.20%
100 ppm
0.073
0.077
0.075
0.075
89.10%
200 ppm
0.048
0.052
0.049
0.050
92.80%
Kuersetin
