Identificatie en validatie van de domeinspecifieke interactiepartners van de mogelijke tumor-promotor LMCD1

Identificatie en validatie van de domeinspecifieke interactiepartners van de mogelijke tumor-promotor LMCD1

Bram VAN DEN EECKHOUT

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor:

Prof. Dr. Christophe AMPE

Begeleider: n.v.t. Vakgroep:

Biochemie (GE07)

Academiejaar 2014-2015




Promotor:



Biochemie (GE07)


“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Gent, 8 mei 2015

Bram Van Den Eeckhout

Prof. Dr. Christophe Ampe

Voorwoord Het uitvoeren van een masterproef is een werk van lange adem dat onmogelijk alleen kon worden volbracht. Mijn bijzondere dank gaat dan ook naar een aantal personen die hierbij hebben geholpen. Vooreerst bedank ik mijn promotor, Prof. Dr. Christophe Ampe, voor de kans om dit werkstuk in zijn laboratorium te kunnen uitvoeren en voor de goede begeleiding gedurende de voorbije twee jaar. Bedankt dat u steeds bereikbaar was voor vragen of een kritische blik. Verder bedank ik ook Prof. Dr. Marleen Van Troys en Stefano Sala voor alle hulp die zij tijdens dit project hebben geboden. Zonder hun inzichten, ideeën, suggesties en opmerkingen was deze thesis niet mogelijk geweest. Bedankt aan mijn geweldige medestudenten Febe en Hanne en aan Laura en Willem voor de leuke momenten samen in het laboratorium. Speciale dank gaat naar Astrid en Bram, mijn medestudenten sinds het eerste uur en hechte vrienden. Hiernaast bedank ik ook mijn andere vrienden uit de Biomedische Wetenschappen voor de geweldige tijd die we samen hebben gehad de voorbije vijf jaar. Maar in het bijzonder bedank ik mijn ouders voor de kans die ik kreeg om te kunnen studeren en voor alle aanmoedigingen die ik van hen heb ontvangen. Ik bedank mijn zus Liza en mijn vriendin Laura voor hun nooit aflatende steun en het geduld dat zij hebben getoond tijdens lastige momenten.

Gent, 8 mei 2015

Bram Van Den Eeckhout

Inhoudstafel

Samenvatting................................................................................................................................... 1 Summary ......................................................................................................................................... 2 1.

Inleiding ................................................................................................................................... 3

2.

Materialen en methoden......................................................................................................... 13 2.1. Overzichtstabel ............................................................................................................... 13 2.2. DNA manipulaties .......................................................................................................... 14 2.2.1. Cloneringen voor de aanmaak van de LMCD1 GFP constructen ........................... 14 2.2.2. Amplificatie en zuivering van plasmide DNA ........................................................ 14 2.3. Celcultuur ....................................................................................................................... 15 2.3.1. Gebruikte cellijnen en corresponderende mediaformulaties ................................... 15 2.3.2. Het aanleggen, onderhouden en beëindigen van een HeLa celcultuur .................... 15 2.3.3. SILAC labelling ....................................................................................................... 16 2.3.4. Calciumfosfaat transfectie ....................................................................................... 17 2.4. Eiwitmanipulaties ........................................................................................................... 17 2.4.1. Cellysemethoden ..................................................................................................... 17 2.4.2. Eiwitconcentratiebepaling ....................................................................................... 17 2.4.3. Eiwitcomplex-immuunprecipitatie (co-IP) .............................................................. 18 2.4.4. PPI-iMix Pro experimenten ..................................................................................... 18 2.4.5. SDS-PAGE en Western Blotting ............................................................................. 18 2.5. Immunostaining .............................................................................................................. 19 2.6. Functionele assays: celadhesie– en celspreidingexperimenten ...................................... 19 2.6.1. iCelligence®-technologie ........................................................................................ 19 2.6.2. Alternatieve spreidingassay volgens Hadzic et al. .................................................. 20 2.6.3. Statistische dataverwerking ..................................................................................... 21

2.7. Fylogenetische analyse ................................................................................................... 21 3.

Resultaten............................................................................................................................... 22 3.1. Het endogene expressieniveau van LMCD1 in verschillende cellijnen ......................... 22 3.2. Het exogene expressieniveau van de LMCD1 GFP domeinconstructen in HeLa cellen 23 3.3. De in vivo lokalisatie van de LMCD1 GFP domeinconstructen in HeLa cellen ............ 25 3.4. Fylogenetische analyse tussen de TES en de LMCD1 eiwitsequenties uit verschillende organismen ...................................................................................................................... 28 3.5. “Pull-down” experimenten ............................................................................................. 31 3.6. Het effect van LMCD1 FL GFP op celadhesie in iCelligence® experimenten ............. 32 3.7. De vergelijking tussen TES FL GFP, LMCD1 FL GFP en monomeer GFP in een alternatieve spreidingsassay............................................................................................ 40

4.

Bespreking ............................................................................................................................. 45

5.

Referenties ............................................................................................................................. 50

Samenvatting De actinefilamenten vormen een onderdeel van het cytoskelet dat een essentiële rol speelt gedurende celmigratie. Celmigratie op zich is belangrijk gedurende sterk uiteenlopende processen, gaande van de embryonale ontwikkeling tot wondheling. Echter, onvoldoende of foutief gecontroleerde beweging van cellen kan aanleiding geven tot de ontwikkeling van ziektes, ondermeer kanker. Aberrante celmigratie kan worden geïnduceerd door het voorkomen van genomische mutaties en epigenetische wijzigingen ter hoogte van genen die coderen voor eiwitten met een functie in dit proces, zoals TES. TES is een mogelijke tumor-suppressor die voorkomt ter hoogte van de focale adhesies en de actine “stress fibers” en die samen met zijn interactiepartners een belangrijke functie vervult in de assemblage van actinefilamenten, aanleiding gevend tot verhoogde celspreiding en verlaagde celmotiliteit. Het eiwit LMCD1 is zeer gelijkaardig aan TES wat betreft zijn opbouw in domeinen, maar doet een andere in vivo functie en subcellulaire lokalisatie vermoeden. Zo komt LMCD1 zowel voor in de nucleus als in het cytoplasma en treedt een gedeeltelijke co-lokalisatie op met de actine “stress fibers”. Gemuteerd LMCD1 lokaliseert echter naar de focale adhesies en de lamellipodia, verhoogt de assemblage van corticaal actine en geeft aanleiding tot versnelde celbeweging, waardoor aan LMCD1 een tumor-promotor functie wordt toegeschreven. Hier werd de schijnbare tegenstelling tussen TES en LMCD1 verder onderzocht. Fluorescentie opnames van LMCD1 en zijn domeinen werden uitgevoerd om inzicht te krijgen in de subcellulaire lokalisatie en de in vivo functionaliteit. Deze opnames suggereerden voor bepaalde constructen co-lokalisatie met structuren van het actine celskelet, voornamelijk met actine “stress fibers”. Verder werden op basis van de beschreven homologie en de hoge sequentie-identiteit tussen TES en LMCD1 een aantal gekende interactiepartners van TES met een rol in het actine celskelet getest voor LMCD1 en onder de experimentele omstandigheden werden VASP en Hic-5 waargenomen als potentiële partners. Bijkomend werd getracht de rol van LMCD1 in actinegestuurde celspreiding, met name de invloed op de snelheid van celadhesie, te beschrijven aan de hand het iCelligence® platform. Uit drie verschillende experimenten kon echter geen eenduidige uitspraak worden gedaan omtrent een significant effect van LMCD1 op de spreidingssnelheid omdat telkens werd gewerkt met een uitermate heterogene celpopulatie. In een geoptimaliseerde, alternatieve spreidingstest werd de gekende rol van TES op de de celspreiding beschreven, maar voor LMCD1 konden geen conclusies worden getrokken ten gevolge van een technische beperking. 1

Summary The actin cytoskeleton performs a pivotal role during cell migration, an important mechanism in processes as the embryonic development or wound healing. Impaired control of this essential process, due to genomic mutations and epigenetic changes, may give rise to the development of diseases, including cancer. The LIM domain protein LMCD1 is a putative tumour-promoter with a potential role in actin-driven processes. LMCD1 and TES, a known tumour-suppressor, are highly similar in their domain structure but have a seemingly different function in vivo. Here, we made fluorescence stainings of LMCD1 and its domains in order to gain insight in the subcellular localization and the in vivo functionality. Using “pull-down” and proteomics experiments we tried to identify known interaction partners of TES as partners of LMCD1 in order to account for the observed differences. Ultimately, we performed two types of functional assays to identify the effect of LMCD1 on actin-driven cell adhesion. Our findings suggest that there is evidence of putative co-localization of certain LMCD1 domain constructs with structures of the actin cytoskeleton, mainly actin stress fibers. LMCD1 interacts with VASP and Hic-5 under the experimental conditions. No conclusion could be drawn about a possible significant effect of LMCD1 on the speed of cell spreading, because the experiment was hampered by the use of a very heterogeneous cell population. In an alternative cell spreading assay the known role of TES on cell spreading could be described, but due to technical difficulties no conclusions could be drawn for LMCD1.

2

1.

Inleiding Kanker is een verzamelend begrip voor een groep van pathologieën, gekarakteriseerd door

de ongecontroleerde proliferatie en verspreiding van de causale cellen. Het meest recente rapport van de American Cancer Society benadrukt de relevantie van kanker voor de Westerse samenleving, daar voorspeld wordt dat in de Verenigde Staten (VS) gedurende 2015 1.658.370 nieuwe patiënten zullen worden gediagnosticeerd en 589.430 individuen zullen overlijden ten gevolge van kanker [1]. Op het cellulaire niveau wordt de transformatie van een normale, fysiologisch gezonde cel naar een entiteit met een kankerfenotype beschouwd als een meerstapsreactie, opgebouwd uit fases van mutaties (tumor initiatie) en selectie [2]. Tumor initiatie is het gevolg van een accumulatie van genetische veranderingen die aanleiding geven tot abnormale celgroei. Deze alteraties kunnen onderverdeeld worden als verworven (“acquired”, bijvoorbeeld door blootstelling aan carcinogene stoffen, zoals tabak) of overgedragen (“germline”) mutaties. Hieronder verstaat men, naast genomische mutaties in genen veelal coderend voor transcriptiefactoren, proto-oncogenen of tumor-promotorgenen, ook epigenetische wijzigingen zoals veranderingen in het DNA-methylatiepatroon of histon acetylaties [3]. Ten gevolge van deze wijzigingen kan de cel controle over de celcyclus verliezen, leidend tot versnelde celgroei en –deling en finaal de vorming van tumorweefsel. Vanaf dan start een selectieproces, waarin tumorcellen met een selectief voordeel, bijvoorbeeld significant snellere groei, dominant worden binnen de populatie. Aldus ontstaat een primaire, heterogene tumor die dankzij deze selectie steeds sneller kan groeien en toenemen in maligniteit [2, 4]. Vervolgens wordt de angiogenese, of bloedvatvorming, naar het tumorweefsel toe gestimuleerd en aan de hand van het gevormde vasculaire netwerk worden de tumorcellen voorzien in nutriënten en zuurstof. Door bijkomende morfologische veranderingen kunnen sommige kankercellen migreren (2D) naar of invaderen (3D) in andere weefsels, buiten de primaire haard van tumorigenese. Vanaf dan kan de metastase starten, een proces dat gedefinieerd wordt als de verspreiding van kanker vanuit een bepaald orgaan naar een deel van het lichaam dat niet direct in contact staat met dit orgaan. Hiervoor doorbreken kankercellen de wand van nabijgelegen bloed– en lymfevaten, waarlangs ze doorheen het lichaam worden getransporteerd. Ter hoogte van het capillaire bed van het orgaanweefsel adhereren kankercellen aan de vaatwand en vervolgens treedt extravasatie op in het parenchym van het orgaan. Daarna start in deze secundaire haard van tumorigenese opnieuw een proces van proliferatie, selectie en angiogenese [4, 5, 6]. Het proces 3

van metastase is cruciaal tijdens het verloop van kanker. Zo geldt voor Europa en de VS dat de metastasering van kankercellen vanuit het colon naar de lever de belangrijkste risicofactor is voor de ontwikkeling van een hepatocellulair carcinoom (HCC), de meest abundante vorm van leverkanker [7]. In deze abberante celmigratie vervult het cytoskelet een cruciale rol. Dit skelet wordt opgebouwd uit de intermediaire filamenten, de microtubuli en de actinefilamenten, die vorm en steun aan de cel verlenen. De actinefilamenten zijn essentieel gedurende de celbeweging. De bouwsteen van deze filamenten is actine (globulair actine, G-actine), een abundant intracellulair eiwit in eukaryote cellen met het opmerkelijke potentieel om op een dynamische en reversibele manier geassembleerd te worden tot een gepolariseerd filament (filamenteus actine, F-actine) met een diameter tussen 7 en 9 nanometer en functioneel verschillende uiteinden. F-actine wordt initieel aangelegd als een stabiel complex (nucleus) van ATP-gebonden G-actine monomeren. Deze nucleus ondergaat vervolgens een fase van elongatie door de snelle assemblage van ATPgebonden G-actine aan het positieve (+) uiteinde en de trage assemblage aan het negatieve (-) uiteinde van F-actine. Finaal wordt een “steady state” situatie (“treadmilling”) bereikt waarbij de lengte van F-actine constant blijft, ondanks de polymerisatie van ATP-gebonden G-actine aan het (+) uiteinde en de depolymerisatie van F-actine tot ADP-gebonden G-actine aan het (-) uiteinde. Dit dynamische proces wordt gecoördineerd door verschillende actine-bindende eiwitten, waaronder het Arp2/3-complex, cofiline en profiline. Actinefilamenten worden geassembleerd tot een grote verscheidenheid aan verschillende structuren, elk met individuele cellulaire functies [8]. Actine “stress fibers”, bijvoorbeeld, zijn stevige, kabelachtige structuren die worden opgebouwd door een bundeling van 10 tot 30 F-actine filamenten door middel van “cross-linking” eiwitten en dankzij hun associatie met type II myosine motoreiwitten beschikken deze structuren over de mogelijkheid om te contraheren. Door een reeks van eiwitten worden “stress fibers” verbonden met het intracellulaire gedeelte van de transmembranaire proteïnen α– en β-integrine, die deel uitmaken van sterk georganiseerde structuren in de plasmamembraan, de focale adhesies [8, 9]. Het integrine adhesoom, met meer dan 190 verschillende gekende eiwitten, engagerend in potentieel meer dan 740 eiwit-eiwitinteracties, is een multiproteïne complex dat een brugfunctie vervult tussen het cytoskelet enerzijds en de extracellulaire matrix (ECM) anderzijds [10]. Deze mechanosensorische koppeling tussen de cel en zijn omgeving gebeurt via, bijvoorbeeld, fibronectine of collageen. Op deze manier is een signaaltransductie uit de ECM naar het 4

cytoskelet mogelijk, waardoor morfogenese, celdifferentiatie en celmigratie kan worden aangestuurd. Een cel kan, door de eiwitniveaus in de focale adhesies te veranderen, transformeren van een non-motiele naar een motiele toestand. De belangrijke functie van deze complexen kan geïllustreerd worden door de diapedese-beweging van witte bloedcellen, die doorheen de endotheliale bloedvatwand naar een site van infectie kunnen migreren [8]. Wanneer de organisatie van deze complexen of de signalisatie overheen deze complexen gestoord verloopt kan dit aanleiding geven tot abberante celmigratie [6]. Celmigratie is een sterk gereguleerd biologisch fenomeen, essentieel in meerdere biologische processen en resulterend uit gecoördineerde bewegingen van verschillende onderdelen van de motiele cel. Gedurende de embryonale ontwikkeling, bijvoorbeeld, bewegen specifieke progenitorcellen via vooraf vastgelegde paden naar de plaats waar bepaalde weefsels of organen moeten worden gevormd. Ook in adulte organismen dienen epitheliale cellen te migreren om wondheling mogelijk te maken en is er continue, trage migratie van epitheliale darmcellen langs de villi in het gastro-intestinaal systeem. Celmigratie wordt geïnitieerd door de vorming van grote, brede membraanprotrusies aan het zogenaamde leidende uiteinde van de cel, die kunnen beschouwd worden als de cellulaire motor van de migratie en de plasmamembraan naar voor duwen. Deze protrusies worden gevormd door een snelle polymerisatie en opeenvolgende bundeling van actinefilamenten onder de plasmamembraan en kunnen op basis van hun morfologie ingedeeld worden als lamillipodia of filopodia. Lamellipodia zijn eerder bladvormige structuren die gevormd worden door vertakkingen van de actinefilamenten, waar filopodia stekel– of vingerachtige formaties zijn die potentieel over de grenzen van de lamellipodia heen kunnen reiken [8, 11]. Wanneer de membraan zich voldoende heeft kunnen uitstrekken volgt een stevige vasthechting aan de matrix waarop of waarin de cel aan het migreren of invaderen is. Deze koppeling, transiënt en gemedieerd door de focale adhesies, bestaat enerzijds om te garanderen dat de protrusie niet terugtrekt en anderzijds heeft de cel deze vasthechting nodig om zich verder te kunnen voorttrekken. In de laatste fase van de migratiecyclus worden de achterste cel-substraatadhesies verbroken. Vervolgens kan de vrije, loshangende achterzijde van de cel bijgetrokken worden door de contractie van actine “stress fibers”, gestuurd door type II myosine motoreiwitten. Naast de eiwitten die een belangrijke regulerende functie hebben in de dynamische actine (de)polymerisatie, spelen de kleine GTPbindende proteïnen Cdc42, Rac en Rho een cruciale rol tijdens de coördinatie van celmigratie. 5

Signalisatie via GTP-gebonden Cdc42 en GTP-gebonden Rac leidt tot de activatie van het Arp2/3 eiwitcomplex en de vorming van filopodia en lamellipodia, respectievelijk. De formatie en contractie van actine “stress fibers” kan gestimuleerd worden dankzij signalisatie via GTPgebonden Rho [8, 11]. Ondermeer door bovengenoemde regulatoren is de beweging van cellen een sterk gecontroleerd proces en gebeurt de celmigratie in vivo altijd gericht. Kankercellen verwerven echter een groot migratiepotentieel en lijken de controle over deze gerichte beweging verloren te hebben. Een mogelijke verklaring hiervoor zijn de eerder vernoemde mutaties en epigenetische wijzigingen ter hoogte van genen coderend voor eiwitten met een rol in de actinegestuurde celmigratie. Op deze manier kunnen eiwitten met een migratie-bevorderende eigenschap geactiveerd of overgeëxpresseerd worden en eiwitten met een migratie-beperkend potentieel geïnactiveerd of neergereguleerd worden. Deze eiwitten kunnen ondergedeeld worden als proto-oncoproteïnen en tumor-suppressorproteïnen, respectievelijk. Mutaties en epigenetische wijzigingen die aanleiding geven tot de activatie van proto-oncogenen of de silencing van tumorsuppressorgenen kunnen de ontwikkeling van kanker in de hand werken [5, 12]. Een mogelijke tumor-suppressor, sterk geassocieerd met het cytoskelet en celmigratie, is het eiwit testine (TES). Dit verband werd initieel gelegd ten gevolge van afwijkende karyogrammen uit humane borstkankercellen, die het bestaan deden vermoeden van een gen met een tumor-onderdrukkende functie, gelegen op de lange arm van chromosoom 7, locus 7q31.1. De silencing van het TES-gen kan mogelijk verklaard worden door een vrij algemeen epigenetisch mechanisme voor het neerreguleren van tumor-suppressorgenen in kanker, namelijk de hypermethylatie van een CpG-eiland in de promotorregio stroomopwaarts van het gen, waardoor de transcriptie naar mRNA afneemt (transcriptionele silencing door “loss of heterozygosity”). Tevens vindt men in patiëntenstalen verschillende sequentie-varianten van dit gen terug, waaronder meestal polymorfismen in intron-sequenties en “silent changes” in exonen [13]. TES wordt in elke humane cel geëxpresseerd en codeert voor een eiwit met een lengte van 421 aminozuren, typisch sterk lokaliserend naar de focale adhesies, de actine “stress fibers” en zones van cel-celcontact [14]. TES is opgebouwd uit een amino (N)-terminaal CR domein (“cysteine–rich”), een centraal gelegen PET domein (Prickle/ Espinas/Testin) en drie carboxy (C)-terminale LIM domeinen (Lin11/Isl11/Mec3) (zie figuur 1). Recente experimenten tonen aan dat het CR domein, waarmee onder andere G-actine wordt gebonden, de de novo elongatie van nucleï en de actine-polymerisatie bevordert en zo de vorming van actine “stress fibers” en F6

actine kan stimuleren. Aan het PET domein wordt een potentiële functie toegeschreven in het mediëren van eiwit-eiwitinteracties en de activiteit van het CR domein (Medves S, Van Troys M, Guerin C (2013), unpublished). De LIM domeinen zijn cysteïne (Cys)- en histidine (His)-rijke motieven die belangrijk zijn in het aangaan van eiwit-eiwitinteracties en beschouwd worden als moleculaire “docking” plaatsen. LIM domeinen kennen typische lengtes van 50-60 aminozuren en omvatten twee zink-vinger motieven met sterk geconserveerde residuen, veelal Cys en His. Aan de hand van deze twee zink-vingers kan het LIM domein twee zink-ionen (Zn2+) coördineren. LIM domein eiwitten worden geclassificeerd in vier groepen volgens de organisatie en de positie van de LIM domeinen. Zo wordt het eiwit TES, samen met onder andere zyxine en paxilline in groep drie ingedeeld, een groep die gekenmerkt wordt door de aanwezigheid van additionele eiwit-eiwit interactiemotieven naast minstens 1 C-terminaal LIM domein en de afwezigheid van een mono-oxygenase of een katalitisch motief. LIM domein eiwitten worden beschreven als regulatoren in verschillende cellulaire processen, zoals celgroei, celdifferentiatie en hermodellering van het cytoskelet en hebben de mogelijkheid om te “shuttelen” tussen het cytoplasma en de celkern [15, 16]. Er is wetenschappelijke evidentie dat TES dankzij intramoleculaire interacties voorkomt in een open en een gesloten conformatie, afhankelijk van zijn subcellulaire locatie (Medves S, Van Troys M, Guerin C (2013), unpublished) [17]. Voornamelijk in de nucleolus zou TES gesloten voorkomen door de binding tussen de N- en de C-terminale gedeelten. In het cytoplasma, en meer bepaald in de focale adhesies, komt TES waarschijnlijk voornamelijk voor in de open configuratie, zodanig dat de LIM domeinen beschikbaar zijn als “scaffold” voor eiwitbinding (Medves S, Van Troys M, Guerin C (2013), unpublished) [18]. Via “yeast-two-hybrid” (Y2H) screens werd vastgesteld dat TES bindt aan zyxine en talin, typische focale adhesie eiwitten, en aan Mena, een actine bindend eiwit [14]. De noodzakelijkheid van TES in de organisatie van actinestructuren wordt duidelijk na de inductie van een experimentele “knock-down” in HeLa cellen, waardoor de lokalisatie van TES naar de focale adhesies met 60% gereduceerd werd en daardoor de vorming van actine “stress fibers” en focale adhesies sterk verlaagd werd. Tevens vermindert de RhoA-activiteit na RNA-interferentie (RNAi) significant, wat een mechanisme doet vermoeden waarin geactiveerd TES zijn functionaliteit uitoefent dankzij signalisatie via RhoA. Vermoedelijk verzorgen TES en zijn interactiepartners de assemblage en de verankering van actinefilamenten, leidend tot verhoogde celspreiding, verminderde celmotiliteit en onderdrukking van de tumorogeniciteit, hetgeen de 7

waargenomen rol van TES als tumor-suppressor ondersteunt [19, 20]. Deze hypothese sluit aan bij de vaststelling dat over-expressie van Tes in rat-fibroblasten aanleiding geeft tot verhoogde celspreiding en verlaagde celmotiliteit [14]. Bijkomend oefent TES zijn in vitro gepostuleerde functie ook in vivo uit, daar in hetero- en homozygote Tes “knock-out” muizen een hogere incidentie werd waargenomen voor gastrische tumoren in vergelijking met wild type muizen wanneer deze behandeld werden met n-nitrosomethylbenzylamine [20]. Deze resultaten schrijven een belangrijke regulerende functie toe aan TES in de focale adhesies, de celadhesie en de celmigratie en vormen een argument voor een mogelijke functie als tumor-suppressor.

Figuur 1 – Schematische voorstelling van de “full length” (FL) domeinstructuur van de eiwitten TES en LMCD1. TES is opgebouwd uit een N-terminaal CR domein, een centraal gelegen PET domein en drie C-terminale LIM domeinen. LMCD1 heeft één LIM domein minder, maar kent een frappante gelijkaardigheid aan TES inzake opbouw in domeinen. Er zijn twee potentieel klinisch relevante LMCD1 mutanten gekend. De E135K mutatie bevindt zich in het PET domein en de K237R mutatie is gelokaliseerd net voor het eerste LIM domein.

Tussen LMCD1 (LIM and Cysteine-rich Domains 1, in de literatuur ook beschreven als dyxine) en Tes bestaat een hoge sequentie-similariteit, in overeenstemming met hun gelijkaardige opbouw in domeinen (zie figuur 1). LMCD1 is een paraloog van TES en gelokaliseerd in de telomerische regio van de korte arm van chromosoom 3, locus 3p26-241. Met deze chromosomale locus worden verschillende genetische defecten verbonden, waaronder een Marfan-achtige bindweefselaandoening en de pediatrische neurologische pathologie Moyamoya. Het eiwit LMCD1 heeft een lengte van 365 aminozuren en is opgebouwd uit een N-terminaal CR domein, een centraal gelegen PET domein en twee C-terminale LIM domeinen (zie figuur 1). Samen met ondermeer TES en PRICKLE behoort LMCD1 tot groep drie binnen de familie van LIM domein eiwitten [21]. Uit Northern Blot analyses is gebleken dat LMCD1 als een 1,7 kB lang transcript 1

http://omim.org/geneMap/3/5?start=-3&limit=10&highlight=5

8

vrij algemeen wordt overgeschreven en significant sterker wordt geëxpresseerd in hart– en skeletspierweefsel. Evidentie voor een mogelijke functie van Lmcd1 in het mediëren van hypertrofie van hartspierweefsel is experimenteel waargenomen in culturen van hartspiercellen in vitro en in transgene muizen in vivo, waar Lmcd1 specifiek in hartspierweefsel verhoogd wordt geëxpresseerd. Lmcd1 vervult deze functie potentieel door het promoten van de calcineurine/NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) pathway, leidend tot de expressie van genen met een rol in cardiale hypertrofie. Additioneel vervullen eiwitten die lokaliseren naar de Z-schijf een belangrijke signaliserende functie gedurende de ontwikkeling van deze hypertrofie. Lmcd1 lokaliseert, samen met andere LIM domein eiwitten, zoals zyxine, naar de Z-schijf in hartspiercellen en interageert daar direct met de actine celskelet eiwitten α-actinine 2 en 3. Bovenstaande bevindingen stellen Lmcd1 voor als een mogelijk doel voor inhibitie in het beschermen van het hart tegen overbelasting en leveren argumenten voor de signaliserende rol van LIM domein eiwitten ter hoogte van de Z-schijf [22]. Bijkomend is er een grote mate van overlap tussen het expressiepatroon van LMCD1 en GATA6, een lid van de GATA-familie van transcriptiefactoren die voornamelijk worden geëxpreseerd in hematopoëtische weefsels (GATA1/2/3) enerzijds en cardiovasculair, respiratoir en gastro-intestinaal (GATA4/5/6) weefsel anderzijds [23, 24]. Via Y2H screens werd een directe interactie aangetoond tussen LMCD1 en GATA6 en deze binding wordt gevormd tussen het CR domein en de LIM domeinen van LMCD1 en de sterk geconserveerde C-terminale zink-vinger van GATA6. Deze C-terminale zink-vinger is een sterk bewaard motief dat bijkomend de interactie verzorgt tussen LMCD1 en GATA1 enerzijds en LMCD1 en GATA4 anderzijds. LMCD1 heeft geen inherente repressieactiviteit, maar vervult zijn rol als als co-repressor in complex met GATA6 via een vrij uniek mechanisme, namelijk door de binding tussen GATA6 en het DNA te inhiberen. Op een potentieel gelijkaardige manier onderdrukt LMCD1 de signalisatie via GATA1 en GATA4. Deze experimentele data doen een belang vermoeden van de interactie tussen de verschillende GATAfactoren en LMCD1 in de regulatie van weefsel-specifieke genexpressie, daar deregulatie van GATA6, bijvoorbeeld, aanleiding geeft tot meerdere defecten in de longontwikkeling en de homeostase [24]. Naast een werkzaamheid in het moduleren van genexpressie worden LIM domein eiwitten geassocieerd met het actine celskelet (voor spier zie hoger), maar buiten bovenvermelde potentiële functies is voor LMCD1 nog geen eenduidige rol vastgesteld in het cytoskelet. In een 9

genoom-wijde studie, waarin gekeken werd naar het aantal wijzigingen in DNA kopij-aantal, werd enerzijds aangetoond dat LMCD1 tot overexpressie wordt gebracht in HCC cellijnen en anderzijds dat dit gen in diezelfde weefsels een “hotspot” is van somatische variabiliteit, met prevalent voorkomende G517A en A824G puntmutaties. Op eiwitniveau vertalen deze mutaties zich respectievelijk in een E135K mutatie, gelokaliseerd in het mogelijk regulerende PET domein en een K237R mutatie, gelegen net voor het eerste LIM domein (zie figuur 1). In SK-Hep1 cellen die stabiel het wild type LMCD1 tot expressie brengen observeren Chang CY et al. een vrij algemene verspreiding van het wild type eiwit in het cytoplasma en de nucleus en een gedeeltelijke co-lokalisatie met de actine “stress-fibers”. De mutanten LMCD E135K en LMCD K237R lokaliseren echter sterk naar de focale adhesies en de lamellipodia. Wanneer bovenvermelde cellen stabiel een LMCD1 mutant tot expressie brengen vermeerdert de corticale actine accumulatie en neemt het aantal lamellipodia ter hoogte van het leidende uiteinde significant toe in vergelijking met de expressie van het wild type LMCD1. In drie verschillende celmigratie testen (gericht, “random” en chemotaxis) is aangetoond dat HCC cellen die stabiel de LMCD1 mutanten tot expressie brengen een versnelde celbeweging hebben. Muizen, intraveneus geïnjecteerd in de staart met LMCD1 E135K-getransfecteerde HCC cellen, vertonen significant meer metastases in de longen in vergelijking met muizen geïnjecteerd met wild type LMCD1– en LMCD1 K237R-getransfecteerde HCC cellen. Deze toename in migratiecapaciteit en formatie van de lamellipodia valt mogelijk te verklaren doordat na overexpressie van de LMCD1 mutant de activiteit van Rac1, een eiwit dat celmigratie kan aansturen door zijn stimulerende invloed op de vorming van lamellipodia, toeneemt. Deze in vivo waarnemingen vormen een argument voor de mogelijkheid dat de LMCD1 E135K mutant systemische metastase bevordert en samen ondersteunt deze data de hypothese dat LMCD1 een potentieel proto-oncogen kan zijn in de pathologie van HCC [25]. Het is zonder meer merkwaardig dat TES en LMCD1, ondanks het feit dat ze sterk gelijkaardig zijn aan elkaar wat betreft hun opbouw in domeinen (zie figuur 1), een schijnbaar tegengestelde functionaliteit vertonen en lokaliseren naar een andere subcellulaire omgeving. Buiten bovenvermelde data zijn er voor het eiwit LMCD1 en zijn individuele domeinen weinig functies beschreven. Zo blijven onder meer de specifieke rol van het CR en het PET domein en de cellulaire functies van LMCD1, waaronder voornamelijk zijn gerichte effecten op actinegestuurde processen, ongekend. In deze scriptie willen wij de verschillen onderzoeken 10

tussen TES en LMCD1 wat betreft hun interactiepartners en hun effect op de actinegestuurde celadhesie met als doel verder inzicht te verwerven in hun schijnbare tegenstellingen. Volledig naar analogie met voorgaande TES-studies (Sala S et al., unpublished, Medves S, Van Troys M, Guerin C (2013), unpublished) werden via cloneringsexperimenten fusies uitgevoerd tussen de domeinen van LMCD1 en monomeer GFP (zie figuur 2).

Figuur 2 – Schematische voorstelling van de domeinconstructen van LMCD1, gefuseerd aan monomeer GFP (Groen Fluorescerend Proteïne) en aangemaakt naar analogie met voorgaande TES-constructen (Sala S et al., unpublished, Medves S, Van Troys M, Guerin C (2013), unpublished). Van het LMCD1 2-LIM C GFP contruct bestaat ook een variant waarbij de GFP-tag N-terminaal is vastgekoppeld (LMCD1 2-LIM N GFP, niet weergegeven). Van alle constructen bestaat ook een variant met een GST-tag (Glutathione-S-Transferase, niet getoond) in plaats van een koppeling aan monomeer GFP, die in de toekomst kunnen worden gebruikt voor onder meer partnervalidatie met affiniteitschromatografie na expressie in Escherichia coli.

Met fluorescentie stainings werd de in vivo lokalisatie van deze domeinconstructen nagegaan in HeLa cellen. Deze stainings suggereerden mogelijke co-lokalisatie van LMCD1 FL GFP en LMCD1 NT GFP met structuren van het actine celskelet. De sterke homologie tussen TES en LMCD1 werd geëvalueerd aan de hand van een fylogenetische analyse en een alignering van de eiwitsequenties. Uitgaande van deze homologie werden een aantal interactiepartners van TES met een gekende rol in actinegestuurde processen gevalideerd voor LMCD1 via “pulldown” experimenten. Onder de geteste condities werden VASP en Hic-5 als potentiële partners voor LMCD1 FL GFP teruggevonden. Aanvullend werd getracht het interactoom van LMCD1 te beschrijven met proteomics experimenten op het LMCD1 FL GFP construct volgens de methode beschreven in Van Impe et al. [26]. In een functioneel luik werd het effect van LMCD1 FL GFP op actinegestuurde celadhesie bestudeerd met twee verschillende methoden, namelijk het 11

iCelligence® platform en de methode in Hadzic et al. (Hadzic E, Catillon M, Halavatyi A, submitted). Geen eenduidige uitspraak kon worden gedaan over een statistisch significant effect van LMCD1 FL GFP op het proces van celadhesie in de iCelligence® experimenten, ten gevolge van een grote heterogeniteit in de bestudeerde celpopulatie. De alternatieve spreidingsassay is een veelbelovende procedure waarin het effect van TES FL GFP op de celspreiding kon worden geïllustreerd, maar ten gevolge van een technische beperking kon voor het LMCD1 FL GFP geen eenduidige uitspraak worden gedaan.

12

2.

Materialen en methoden

2.1. Overzichtstabel Onderstaande tabel geeft een overzicht van alle gebruikte producten. Met het nummer voor de productnaam zal verwezen worden in de tekst onder de vorm van een superscript. Product 1. pEGFP-N1 fluovector

Firma

Cataloognummer

Clontech, Westburg (bron: groep Prof. Dr. Jan Gettemans)

2. SOC medium

Invitrogen

15544-034

3. Bactotryptone

LabM

MC005

4. Bactoyeast extract

LabM

MC001

5. “Nucleobond® Xtra Maxi Plus EF” kit

Machery-Nagel

740424.10

6. DMEM + GlutaMAX

Gibco

31966

7. Foetaal kalfserum

Hyclone

SH30071.01

8. Penicilline streptomycine

Gibco

15140

9. DPBS

Gibo

14190

10. 0,05% trypsine-EDTA

Gibco

1115157

11. SILAC DMEM

Silantes

280001300

12. Gedialyseerd foetaal kalfserum

Gibco

928711

13. GlutaMAX

Gibco

35050-038

14. Biorad protein assay

Biorad

500-0006

15. GFP-Trap®_A beads

Chromotek

ABIN1082213

16. Kaleidoskoopmerker

Biorad

161-0375

17. Hybond-C

Amersham Biosciences

RPN303C

18. Odyssey blocking buffer

Li-cor

927-40000

19. Collageen type I rat tail

Becton Dickinson

354236

20. DPBS++

Gibco

14040133

21. Triton X-100

Sigma Aldrich

T8787

22. Alexa Fluor® phalloïdine

Life Technologies

A12381

23. DAPI

Sigma Aldrich

D8417

24. Dabco

Sigma Aldrich

D2522

25. Fibronectine

Sigma Aldrich

F2006

26. Konijn polyclonaal anti-LMCD1

Novus Biologicals

NBP1-85986

27. Muis monoclonaal anti-GAPDH

Abcam

Ab8245

28. Geit anti-konijn IRDye®680RD

Li-cor

92668070

29. Geit anti-muis IRDye®800CW

Li-cor

92632218

13

30. Muis monoclonaal anti-GFP

Santa Cruz Biotechnology

sc-9996

31. Konijn polyclonaal anti-GAPDH

Abcam

Ab9485

32. Konijn polyclonaal anti-total actine

Sigma Aldrich

A2668

33. Geit anti-konijn IRDye®800CW

Li-cor

92632210

34. Konijn polyclonaal anti-VASP 35. Konijn polyclonaal anti-Hic-5

Geen commercieel antilichaam Santa Cruz Biotechnology

sc-28748

Tabel 1 – Overzicht van de gebruikte producten in de sectie materialen en methoden met de naam van de leverende firma en het bijhorende cataloognummer.

2.2. DNA manipulaties 2.2.1. Cloneringen voor de aanmaak van de LMCD1 GFP constructen LMCD1 GFP domeinconstructen werden ontworpen analoog aan de bestaande TES GFP constructen (zie bijlage). Voor ieder construct werden primers (“forward” en “reverse”) ontworpen waarin geschikte restrictiesites werden ingebouwd (zie bijlage). mRNA werd geïsoleerd uit MDA-MB-231 en HCR-116 cellen en via een overlappende “reverse-transcriptase” PCR reactie omgevormd en geamplificeerd tot het gewenste cDNA. cDNA werd geligeerd in een TA “storage” vector met een ampicilline resistentiegen en de clonering werd gevalideerd via sequenering. Lysaten van getransformeerde kolonies van E. coli bacteriën werden geanalyseerd via agarose-gelelektroforese en geschikte plasmiden werden via gelextractie gezuiverd en behandeld in een restrictiedigest (zie bijlage). cDNA werd geligeerd in een pEGFP-N1 fluovector1 met een ampicilline en een neomycine resistentiegen. 2.2.2. Amplificatie en zuivering van plasmide DNA Zuiver plasmide DNA (1 µg) werd toegediend aan DH5α E. coli bacteriën in suspensie (bewaard bij -80°C). Na “heat shock” transformatie werden de bacteriën gegroeid in SOC medium2 (1 mL) gedurende 1 uur in een schudbad bij 37°C. De cellen werden 3 minuten afgecentrifugeerd aan 7.000 rpm in een eppendorf centrifuge, geresuspendeerd en uitgeplaat op een Lysogeny-Broth (LB) agar plaat met het antibioticum kanamycine (100 µg/mL). Incubatie gebeurde overnacht bij 37°C. Kolonies werden geënt, toegediend aan 300 mL LB medium (10 g bactotryptone3, 5 g bactoyeast extract4 en 5 g NaCl in 1 L MQ H2O) met 1,5 mL kanamycine en in cultuur gebracht gedurende 24 uur bij 37°C. De cellen werden gedurende 15 minuten 14

afgecentrifugeerd aan 1.600 x g bij 4°C (Sorvall centrifuge, Thermo Scientific). “Endo-free” zuivering van het plasmide DNA gebeurde gebruik makend van de “Nucleobond® Xtra Maxi Plus EF” kit5. De concentratie van het plasmide DNA en de 260/280– en de 260/230-waarde werden bepaald aan de hand van een Nanodrop ND-100 apparaat (ISOGEN, Life Science). Gezuiverd plasmide DNA werd bewaard bij -20°C. 2.3. Celcultuur 2.3.1. Gebruikte cellijnen en corresponderende mediaformulaties De gebruikte HeLa cellen, epitheliale cellen uit een cervix carcinoom, werden verkregen van de Universiteit van Luxemburg (ULux, onderzoeksgroep “Cytoskeleton and Cell Plasiticty”). Standaard HeLa celmedium bestaat uit 500 mL DMEM + GlutaMAX6, 50 mL hitte-geïnactiveerd foetaal kalfserum7 en 5 mL van de antibioticumcombinatie penicilline-streptomycine8 en werd na filtratie in een laminaire flow bewaard bij 4°C. De HCC cellijnen HepG2 (humane oorsprong), HePa en BWTG3 (muriene oorsprong) en de epitheliale borstkankercellijn MDA-MB-231 zijn afkomstig van het Universitair Ziekenhuis Gent en werden als celpellets ontvangen en bewaard bij -20°C. 2.3.2. Het aanleggen, onderhouden en beëindigen van een HeLa celcultuur Een HeLa celcultuur werd aangelegd door 1 mL celsuspensie (bewaard bij -196°C) aan te lengen met 5 mL HeLa celmedium. De cellen werden afgecentrifugeerd gedurende 5 minuten aan 1.500 rpm (Eppendorf 5810R centrifuge, A-4-62 rotor), geresuspendeerd in 5 mL HeLa celmedium en overgebracht naar een falcon met een oppervlakte van 25 cm². Deze werd geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2. Indien de cultuur confluent was (nagegaan via lichtmicroscopie, Carl Zeiss®) werd het medium afgezogen met behulp van een aangedreven pasteurpipet. De cellen werden gewassen met DPBS (“Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline”)9 en er werd een geschikt volume 0,05% trypsine-EDTA10 toegediend. De behandelde falcon werd 3 minuten in de incubator geplaatst en de HeLa cellen werden geresuspendeerd in een geschikt volume celmedium. Een gepast volume celsuspensie werd samen met HeLa celmedium toegevoegd in een falcon met een oppervlakte van 75 cm² en wanneer deze falcon volledig confluent was werden de cellen op bovengenoemde wijze gesplitst naar een falcon met een oppervlakte van 175 cm². Naargelang de vereisten van een bepaald experiment werden de HeLa 15

cellen uitgezaaid naar een falcon met een oppervlakte van 25, 75 of 175 cm². De gebruikte werkvolumes van de falcons worden samengevat in tabel 2. Om HeLa cellen uit cultuur te halen werd de bekomen celpellet heropgelost in 1 mL DPBS, waarna deze suspensie 3 minuten werd gecentrifugeerd aan 8.000 rpm in een eppendorf centrifuge. Het supernatans werd afgezogen en de celpellet werd bewaard bij -20°C of -80°C. In sommige experimenten diende gewerkt te worden met een bepaalde hoeveelheid cellen, die werd bepaald na telling met behulp van de Bürker telkamer (Marienfeld-superior®). 25 cm² falcon

75 cm² falcon

175 cm² falcon

Werkvolumes celcultuur (zie 2.3.2.) HeLa celmedium

5 mL

10 mL

20 mL

DPBS

5 mL

10 mL

20 mL

0,5 mL

1 mL

2 mL

0,05% Trypsine-EDTA

Werkvolumes calciumfosfaat transfecties (zie 2.3.4.) 30 µL

n.v.t.

75 µL

(2) Plasmide DNA

5-15 µg

n.v.t.

20-50 µg

(1) + (2) + MQ H2O (totaalvolume)

300 µL

n.v.t.

750 µL

2XHEBS pH 7,1

300 µL

n.v.t.

750 µL

(1) 2 M CaCl2

Tabel 2 – De standaard werkvolumes gebruikt voor celcultuur en calciumfosfaat-transfectie in falcons met verschillende oppervlaktes. Om de reproduceerbaarheid tussen verschillende experimenten te kunnen garanderen werden deze volumes steeds gehanteerd. De hoeveelheid gebruikt plasmide DNA gedurende de calciumfosfaat transfectie hangt af van het individuele construct. Zo werd 5 µg (25 cm²) of 20 µg (175 cm²) plasmide DNA gebruikt voor monomeer GFP, terwijl eerder 15 µg (25 cm²) of 50 µg (175 cm²) werd gebruikt voor de LMCD1 GFP domeinconstructen.

2.3.3. SILAC labelling Er werd 12C en 13C SILAC medium aangemaakt, compatibel met de gebruikte HeLa cellen, door 450 mL SILAC DMEM HeLa celmedium11, 50 mL gedialyseerd foetaal kalfserum12, 5 mL GlutaMAX13, 2,5 mL PenStrep, 1 mL 12C of 13C lysine en 100 µL 12C of 13C arginine samen te voegen. Het medium werd gefilterd in de laminaire flow en bewaard bij 4°C. Over een periode van 14 dagen werden HeLa cellen in cultuur gehouden in 12C of 13C SILAC medium zodanig dat negen (zes maal

12

C en drie maal

13

C) 175 cm² falcons bekomen werden waarbij de confluentie

van de HeLa cellen finaal 75% bedroeg. 16

2.3.4. Calciumfosfaat transfectie HeLa cellen werden onderworpen aan een calciumfosfaat transfectie wanneer de cultuur een confluentie bereikte tussen 70% en 80%. Voor iedere individuele transfectie werd een oplossing bereid bestaande uit plasmide DNA en een 2 M CaCl2 oplossing, aangelengd met MQ H2O. Deze oplossing werd druppelsgewijs toegevoegd aan een volume 2XHEBS oplossing (“Hepes Buffered Saline”, pH 7,1) terwijl deze rustig werd gevortext (zie tabel 2 voor volumes). Deze nieuwe oplossing werd 30-40 minuten geïncubeerd in de laminaire flow en ondertussen werd het HeLa celmedium ververst. Finaal werd deze oplossing druppelsgewijs aan het HeLa celmedium toegevoegd terwijl de falcon heen-en-weer werd geschud. Na de transfectie werd de falcon bewaard in de incubator. Afhankelijk van het experiment werd de transfectie-efficiëntie en het expressieniveau na 24 uur of na 48 uur geëvalueerd en eventueel gedocumenteerd via fotografische opnames, gebruik makend van de fluorescentiemicroscoop (Olympus XI71, FITC filter) en de Cell^B software. 2.4. Eiwitmanipulaties 2.4.1. Cellysemethoden Twee methodes van cellyse werden gehanteerd naargelang de toepassing die erop volgde. Van een totale, denaturerende 2D lysebuffer (7 M urea, 2 M thio-urea, 0,5% triton, 1 µL DTT en 1 µL van een protease-inhibitorcocktail stock, met 1 mg/mL leupeptine, 1 mg/mL aprotinine, 1 mg/mL antipaïne en 1,6 mg/mL benzamidine) werd afhankelijk van de dikte van de celpellet 80 tot 100 µL toegediend, waarna het geheel werd gevortext en 10 minuten op ijs werd geplaatst. Nadien werden de stalen 10 minuten afgecentrifugeerd aan 13.000 rpm bij 4°C in een eppendorf centrifuge. Van een niet-denaturerende lysebuffer (50 mM Tris.HCl (pH 7,5), 125 mM NaCl, 5% glycerol, 0,2% NP4O, 1,5 mM MgCl2, fosfatase– en protease-inhibitoren, aangelengd met MQ H2O tot 10 mL) werd 500 µL aan de pellet toegediend, waarna het staal werd behandeld zoals eerder beschreven. Alle lysaten werden steeds bewaard bij -20°C of -80°C. 2.4.2. Eiwitconcentratiebepaling Voor eiwitconcentratiebepaling werd een ijkcurve opgesteld op basis van vijf standaardoplossingen (20 µL) met een gekende concentratie BSA (“Bovine Serum Albumin”). 17

Deze werden opgelost in 1 mL van een “Biorad Protein Assay”14 oplossing (verhouding 1:10). De absorbanties van deze oplossingen worden gemeten met een spectrofotometer bij een golflengte van 595 nm. Buiten het feit dat 1 µL staal werd gebruikt, werden cellysaten op dezelfde manier behandeld. 2.4.3. Eiwitcomplex-immuunprecipitatie (co-IP) Per individuele co-IP werden 25 µL GFP-Trap®_A beads15 driemaal gewassen door 100 µL lysebuffer op de beads te brengen en 4 minuten te centrifugeren aan 2.500 rpm bij 4°C in een eppendorf centrifuge. Nadien werd 2 mg lysaat eiwitmateriaal op de beads gebracht en het geheel werd, snel roterend, geïncubeerd voor 2 uur in de koude kamer (4°C). Wanneer de co-IP werd gevolgd door SDS-PAGE (“Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis”) en Western Blotting (zie 2.4.5.) dan werden de beads opnieuw driemaal gewassen zoals eerder beschreven en vervolgens opgekookt (95°C) in 5x sample buffer (huisbereid, 65 mM Tris HCl pH 6,8, 20% glycerol, 5% SDS, 250 mM DTT, spatelpunt bromofenolblauw). 2.4.4. PPI-iMix Pro experimenten Voor de PPI-iMix Pro experimenten werd per individuele co-IP een Biorad kolom gewassen met 200 µL van een 50 mM ammoniumbicarbonaat buffer, waarna het staal werd toegediend. Finaal werd deze kolom additioneel gewassen met 10 mL van deze buffer en werden de eiwitten van de kolom geëlueerd door 600 µL 4% mierenzuur toe te dienen. Alle samples werden geanalyseerd in de proteomics afdeling onder leiding van Prof. Dr. Kris Gevaert. 2.4.5. SDS-PAGE en Western Blotting Eiwitmengsels werden gescheiden op basis van het moleculaire gewicht aan de hand van SDS-PAGE

op

10% 16

kaleidoscoopmerker

gels.

Als

ladder

voor

het

moleculaire

gewicht

werd

een

gebruikt en er werd 10 tot 20 µg eiwitmateriaal of 25 µL voor de co-IP

stalen op gel geladen. Western Blotting gebeurde op een nitrocellulosemembraan17 en nadien werden primaire en secundaire antilichamen (zie figuur legendes) in een geschikte concentratie toegediend. Voor het blokkeren van de membraan en het aanmaken van de antilichaamoplossing werd Odyssey Blocking buffer18 gebruikt. Het nitrocellulosemembraan werd ingescand met het

18

Odyssey Infrared beeldvormingstoestel van Li-cor en de scanningsintensiteit werd zodanig gekozen dat geen verzadiging van lichtsignaal optrad (zie bijlage voor uigebreid protocol). 2.5. Immunostaining Dekglaasjes werden ontvet in 100% aceton, gesteriliseerd in 70% ethanol en per drie georganiseerd in één well binnen een zes well plaat. Steriliteit werd gegarandeerd door de plaat 15 tot 20 minuten onder UV licht in de laminaire flow te laten staan. De dekglaasjes werden gecoat met collageen19 (10 µg/cm²) gedurende 1 uur in de incubator en gewassen met 2 mL DPBS++20, waarna 2 mL HeLa celmedium werd toegediend. Getransfecteerde HeLa cellen werden uit cultuur gehaald en geteld zodat aan iedere well 150.000 HeLa cellen konden worden toegediend, waarna de plaat overnacht in de incubator werd geplaatst. Een dubbele fixatie en een permeabilisatie werd uitgevoerd door eerst per well 2 mL 4% PFA (paraformaldehyde, Merck)DPBS met 0,1% triton X-10021 toe te dienen (5 minuten incubatie bij kamertemperatuur) en vervolgens 2 mL PFA-DPBS (10 minuten incubatie bij 37°C). Per dekglaasje werd 150 µL Alexa Fluor 594 phalloïdine22 oplossing toegevoegd voor 1 uur bij kamertemperatuur, waarna de dekglaasjes driemaal werden gewassen in DPBS. Per dekglaasje werden een aantal druppels DAPI (4’,6-diamidino-2-fenylindool)23 toegevoegd, waarna meteen werd gewassen in MQ H2O. Finaal werden de dekglaasjes via Dabco (tri-ethyleendiamine) oplossing24 op een draagglaasje vastgehecht en bewaard in afwezigheid van belichting bij 4°C, waarna beeldvorming gebeurde met een 60X objectieflens van de confocale microscoop (Olympus IX81) en de Fluoview FV1000 software. Via deze software werden beelden opgenomen via verschillende kanalen (DAPI, Alexa Fluor 488 (voor GFP) en Alexa Fluor 594) en er werd een overlappend beeld gemaakt. 2.6. Functionele assays: celadhesie– en celspreidingexperimenten 2.6.1. iCelligence®-technologie Het iCelligence® toestel werd voor de aanvang van het experiment overnacht in de incubator geplaatst. De wells van “E-plates L8” werden gedurende 1 uur bezet met 150 µL fibronectine25 oplossing (10 µg/mL) in de incubator, waarna ze gedurende 20 minuten werden geblokkeerd met 150 µL 0,5% BSA oplossing. De wells werden tweemaal gewassen met 150 µL DPBS++ en 150 µL HeLa celmedium werd toegevoegd. Na registratie van het 19

achtergrondsignaal werd aan iedere well 50 µL van een 1 mL celsuspensie van 400.000 HeLa cellen toegediend. Aan één plaat werden LMCD1 FL GFP getransfecteerde HeLa cellen toegediend en aan de andere plaat monomeer GFP getransfecteerde HeLa cellen, per experiment konden dus 16 stalen in parallel worden gemeten. Gedurende de eerste zes uur werd iedere minuut de mate van celadhesie en –spreiding gemeten en vervolgens werd gedurende 48 uur iedere 20 minuten verder de mate van celgroei geregistreerd. Het experiment kon in “real-time” worden gevolgd via de iCelligence® applicatie op een Apple iPad® en nadien kon de data overgedragen worden voor verdere statistische analyses. Om de omstandigheden van het experiment te kunnen controleren, werden fotografische opnames genomen van de getransfecteerde HeLa cellen voordat deze uit cultuur werden gehaald. Niet gebruikte cellen werden gecollecteerd en gebruikt voor Western Blotting om het eiwitexpressiniveau na te gaan. 2.6.2. Alternatieve spreidingassay volgens Hadzic et al. Dekglaasjes werden behandeld als beschreven in 2.6.1. en apart georganiseerd in een 12 well plaat. De dekglaasjes werden 1 uur gecoat met 500 µL fibronectine oplossing (20 µg/mL) in de incubator, 1 uur geblokkeerd met 500 µL 1% BSA oplossing in de incubator en tweemaal gewassen met 500 µL DPBS++, waarna de plaat werd bewaard bij 4°C. Voor de aanvang van het experiment werd 1 mL HeLa celmedium toegediend, waarna de plaat in de incubator werd geplaatst. De getransfecteerde HeLa cellen werden uit cultuur gehaald en 30 minuten in suspensie gehouden. Aangezien de drie bestudeerde condities (TES FL GFP, LMCD1 FL GFP en monomeer GFP) werden gevolgd voor 5 verschillende tijdspunten, werden 5 dekglaasjes per conditie voorzien. Aan ieder dekglaasje werden 30.000 HeLa cellen toegediend, waarna de plaat in de incubator werd gestockeerd. Na incubatie voor 30, 90, 120, 180 of 240 minuten werden de dekglaasjes tweemaal gewassen met 500 µL DPBS++, gedurende 20 minuten gefixeerd met 3% PFA en gekleurd met een Alexa Fluor 594 phalloïdine oplossing (verdunning 1:250) en DAPI, waarna de coverslips met behulp van een Dabco oplossing op een draagglaasje werden gemonteerd. Beeldvorming gebeurde met een 20X objectieflens van de confocale microscoop en de Fluoview FV1000 software. Er werd getracht per conditie en per tijdspunt ongeveer 50 cellen in beeld te brengen. In ImageJ werden de opnames geconverteerd naar 8-bit beelden waarop binarisering gebeurde aan de hand van een “triangle” segmentatie. Vervolgens werden de celoppervlakte (in pixels²) enerzijds en de celperimeter (in pixels) van de partikels gemeten. Voor 20

ieder tijdspunt van elk construct werd steeds het gegenereerde masker en de meting op het masker en het Alexa Fluor 488 (GFP-signaal) beeld opgeslaan. 2.6.3. Statistische dataverwerking Statistische analyses werden uitgevoerd in SigmaPlot. Om na te gaan of de behandelde data normaal is verdeeld werd een Shapiro-Wilk normalisatietest uitgevoerd. Twee condities werden paarsgewijs met elkaar vergeleken op het 95% significantieniveau via de niet-parametrische Mann-Whitney U Rank Sum test, waarbij voor iedere vergelijking een p-waarde werd gegenereerd. Meerdere condities werden met elkaar vergeleken op het 95% significantieniveau via de niet-parametrische Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance (ANOVA) on Ranks test volgens de Dunn’s methode, waarbij voor iedere vergelijking een p-waarde werd gegenereerd. 2.7. Fylogenetische analyse Eiwitsequenties werden opgehaald uit de eiwitdatabank van het NCBI (“National Center for Biotechnology Information”)2 (zie bijlage). Voor de fylogenetische analyse werd de MEGA 6 software gebruikt. Een fylogenetische boom werd opgebouwd volgens de statistische “neigbourjoining” methode. Ter hoogte van de interne knooppunten van de fylogenetische boom werd een waarde tussen 0 en 100 berekend volgens de Bootstrap methode met 500 herhalingen. Sequentie alignementen werden online uitgevoerd via het EMBOSS “stretcher” programma van EMBLEBI3. De similariteit tussen de sequenties van de volledige eiwitten en de domeinen werd online bepaald aan de hand van de PRSS tool, die één van beide sequenties minstens 100 keer op een volledig willekeurige manier “scrambled” en steeds opnieuw een alignement score berekende. Deze gerandomiseerde scores werden vervolgens uitgezet in een distributie en dan werd aan de hand van een statistische test bepaald of de originele score (zie tabel 4) significant beter was dan de score voor de “scrambled” eiwitsequenties4.

2

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ 4 http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi 3

21

3.

Resultaten

3.1. Het endogene expressieniveau van LMCD1 in verschillende cellijnen LMCD1 is een weinig bestudeerd eiwit. In eerste instantie gingen we expressie ervan na in verschillende cellijnen. Dit verkennende experiment is nuttig in functie van de optimalisatie van toekomstige transfecties met de LMCD1 GFP domeinconstructen. Tezelfdertijd testen we de kwaliteit van het anti-LMCD1 antilichaam. Hiervoor werd een Western Blot uitgevoerd waarop kwantificatie gebeurde van het signaal van endogeen LMCD1 en het huishoud-eiwit GAPDH. Aangezien LMCD1 wordt verbonden met HCC (zie inleiding) werden de HCC cellijnen HepG2, HePa en BWTG3 bestudeerd in aanvulling op de eerder klassieke modelsystemen HeLa en MDA-MB-231 (zie materialen en methoden voor oorsprong). Als positieve controle gebruikten we MDA-MB-231 cellen waarin LMCD1 FL GFP getransfecteerd werd.

1

2

3

4

5

6

Figuur 3 – De endogene expressie van LMCD1 in verschillende kankercellijnen. Primaire antilichamen: konijn polyclonaal anti-LMCD126 en muis monoclonaal anti-GAPDH27. Secundaire antilichamen: geit anti-konijn 68028 en geit anti-muis 80029. Links: overzicht met 1: HeLa, 2: MDA-MB-231, 3: HepG2, 4: HePa, 5: BWTG3, 6: MDA-MB231 (getransfecteerd met LMCD1 FL GFP), midden kwantificatie van het LMCD1 signaal, rechts kwantificatie van het GAPDH signaal (zie ook tabel 3).

Figuur 3 toont de Western Blot van een experiment dat eenmaal werd uitgevoerd. Hieruit kan worden afgeleid dat het anti-LMCD1 antilichaam werkt, want een band kan duidelijk worden waargenomen ter hoogte van het moleculaire gewicht van endogeen LMCD1 (41 kDa). In het lysaat van de getransfecteerde MDA-MB-231 cellen (positieve controle) stemt de hoogste band overeen met LMCD1 FL GFP, de laagste band met endogeen LMCD1 en de banden hiertussen zijn mogelijk afbraakproducten van het fusie-eiwit. Endogeen LMCD1 is in alle geteste cellijnen goed detecteerbaar, behalve in BWTG3 cellen. Figuur 3, midden toont echter een zwakke band 22

ter hoogte van 41 kDa, dus mogelijk is expressie van LMCD1 in BWTG3 cellen zeer zwak. Het anti-LMCD1 antilichaam herkent in cellen van humane oorsprong een extra band, vermoedelijk doordat kruisreactiviteit optreedt tegen een humaan eiwit (de Ensembl databank bevat geen evidentie voor langere transcripten die aanleiding zouden kunnen geven tot een groter eiwit)5. De kwantificatie in tabel 3 leert dat, met uitzondering van BWTG3 cellen, LMCD1 in vergelijkbare hoeveelheid tot expressie wordt gebracht in de verschillende cellijnen. In MDA-MB-231 cellen is de endogene LMCD1 expressie lager dan de exogene, wat perspectief biedt in functie van de toekomstige transfecties. Concreet leren deze experimenten dat, op zijn minst in MDA-MB-231 cellen, LMCD1 mogelijk goed tot overexpressie kan worden gebracht aan de hand van transfecties. Staal

LMCD1 signaal

GAPDH signaal

Ratio

HeLa

9,73

82,58

0,118

MDA-MB-231

11,68

59,07

0,198

HepG2

7,39

61,60

0,120

HePa

7,74

84,98

0,091

BWTG3 MDA-MB-231 (getransfecteerd)

91,93 10,17

84,02

0,121

Tabel 3 – Kwantificatie van de Western Blot signalen. De ratio is de verhouding van het LMCD1 signaal tot het GAPDH signaal en laat vergelijking over meerdere stalen heen toe. Voor het BWTG3 staal werd geen signaal gemeten.

3.2. Het exogene expressieniveau van de LMCD1 GFP domeinconstructen in HeLa cellen Om later subcellulaire lokalisatie (zie 3.5.) na te gaan en ook in functie van toekomstige identificatie van domeinspecifieke interactiepartners via proteomics experimenten (zie 3.3.) bepaalden we het expressieniveau van de exogene LMCD1 GFP domeinconstructen ten opzichte van monomeer GFP via Western Blot en kwantificatie van het signaal met GAPDH als referentie. In figuur 4 wordt een representatieve Western Blot weergegeven voor een experiment dat tweemaal werd herhaald (overige niet getoond). Uit de kwantificatie, samengevat in tabel 4, volgt dat LMCD1 2-LIM N GFP het sterkst tot expressie wordt gebracht, gevolgd door LMCD1 ΔPET GFP, LMCD1 2-LIM C GFP, LMCD1 NT GFP en LMCD1 FL GFP. Tevens is het 5

http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary?db=core;g=ENSG00000071282;r=3:8501707-8574673

23

expressieniveau van LMCD1 ΔPET GFP en LMCD1 2-LIM C GFP enerzijds en LMCD1 NT GFP en LMCD1 FL GFP anderzijds onderling het best met elkaar te vergelijken. Figuur 4 toont voor het LMCD1 NT GFP construct een extra groene band net onder het rode signaal voor GAPDH, wat mogelijk te wijten kan zijn aan degradatie vanaf de N-terminus omdat GFP Cterminaal is vastgekoppeld en er nog steeds signaal zichtbaar is. Figuur 4, midden toont tussen deze twee duidelijke signalen ook andere bandjes. Deze tendens werd ook waargenomen in andere Western Blot experimenten. Een andere observatie is de dubbele band voor het LMCD1 ΔPET construct, die mogelijk kan worden verklaard door eiwitafbraak of een modificatie van dit domeinconstruct. Concreet kan dit experiment worden gebruikt om het expressieniveau van de domeinconstructen in de toekomst correct te kunnen afstellen op het expressieniveau van monomeer GFP, een vereiste die wordt gesteld voor ondermeer de proteomics experimenten.

Figuur 4 – De exogene expressie van de verschillende LMCD1 GFP constructen in HeLa cellen. Primaire antilichamen: muis monoclonaal anti-GFP30 en konijn polyclonaal anti-GAPDH31. Secundaire antilichamen: geit anti-muis 800 en geit anti-konijn 680. Links: overzicht, midden: kwantificatie van het LMCD1 en het monomeer GFP signaal, rechts: kwantificatie van het GAPDH signaal (zie ook tabel 4). Staal

Construct signaal

GAPDH signaal

Ratio

LMCD1 FL GFP

7,05

18,29

0,39

LMCD1 NT GFP

7,19

16,53

0,43

LMCD1 2-LIM N GFP

24,27

10,25

2,37

LMCD1 2-LIM C GFP

17,33

14,25

1,22

LMCD1 ΔPET GFP

24,13

16,47

1,47

Monomeer GFP

66,36

20,23

3,28

Tabel 3 – Kwantificatie van de Western Blot signalen. De ratio is de verhouding van het LMCD1 signaal of het monomeer GFP signaal tot het GAPDH signaal en laat vergelijking over meerdere stalen heen toe.

24

3.3. De in vivo lokalisatie van de LMCD1 GFP domeinconstructen in HeLa cellen Om inzicht te krijgen in de subcellulaire lokalisatie en de in vivo rol en effecten van LMCD1 en zijn domeinen in HeLa cellen werden fluorescentie opnames gemaakt met de confocale microscoop. Voor ieder construct worden vier beelden getoond: het DAPI (blauw) kanaal toont de celkernen, het Alexa Fluor 594 (rood) kanaal toont het F-actine, het Alexa Fluor 488 (groen) kanaal toont het LMCD1 GFP domeinconstruct in kwestie en aanvullend wordt een overlappend beeld (merge) tussen de drie kanalen getoond. Voor ieder construct wordt naast de subcellulaire lokalisatie aandacht besteed aan aspecten zoals co-lokalisatie met bepaalde celstructuren, een afwijkende morfologie van de cel(organellen) en de aanwezigheid van afwijkende structuren en artefacten.

Figuur 5 – Fluorescentie opnames van het LMCD1 FL GFP construct in HeLa cellen, links 24 uur en rechts 48 uur na transfectie. Links boven: DAPI, rechts boven: Alexa Fluor 594, links onder: Alexa Fluor 488, rechts onder: overlappend beeld.

Figuur 5, links toont het LMCD1 FL GFP construct 24 uur na transfectie in HeLa cellen. Het construct is in een sterke mate aangerijkt in het cytoplasma van de getransfecteerde cel en in de nucleus is weinig signaal zichtbaar in het Alexa Fluor 488 kanaal. Wanneer getransfecteerde 25

cellen vergeleken worden met wild type HeLa cellen wordt er geen afwijkende celmorfologie waargenomen. Figuur 5, rechts toont het LMCD1 FL GFP construct 48 uur na transfectie in HeLa cellen. Op dit tijdspunt wordt een meer evenwichtige verdeling over de beide celcompartimenten waargenomen. De vergelijking van getransfecteerde cellen met wild type HeLa cellen toont geen afwijkende celmorfologie.

Figuur 6 – Fluorescentie opname van het LMCD1 NT GFP construct in HeLa cellen.

Figuur 6 toont dat het LMCD1 NT GFP domeinconstruct zich gelijkmatig verdeelt over het cytoplasma en de celkern van de getransfecteerde cel. Voor het LMCD1 NT GFP construct worden er frequent getransfecteerde HeLa cellen met een langwerpige vorm waargenomen wanneer de vergelijking wordt gemaakt met wild type HeLa cellen. Wanneer de overlappende beelden in figuur 5 en figuur 6 samen worden bekeken, dan suggereren deze opnames dat het LMCD1 FL GFP en het LMCD1 NT GFP domeinconstruct potentieel co-lokaliseren met F-actine structuren (zie rode pijlpunten). Deze mogelijke co-lokalisatie wordt voornamelijk waargenomen ter hoogte van de plasmamembraan, waar naast corticaal actine ook actine “stress fibers” aanwezig zijn. In figuur 6 kan rechts onderaan in beeld een getransfecteerde cel worden waargenomen die een fase van celspreiding of –migratie ondergaat en waarbij de vorming van een lamellipodium zichtbaar wordt (zie rode pijlpunten). De overlap tussen de verschillende kanalen toont mogelijke co-lokalisatie van LMCD1 NT GFP naar deze lamellipodia. Bijkomend kan een co-lokalisatie worden waargenomen in structuren die potentieel focale adhesies zouden kunnen zijn, maar om dit te bevestigen dient in het vervolg een geschikte merker, zoals vinculine, gebruikt te worden.

26

Aan de hand van figuur 7 kan er in het algemeen geen merkbaar verschil opgemerkt worden in de subcellulaire lokalisatie van het LMCD1 2-LIM N GFP en het LMCD1 2-LIM C GFP domeinconstruct wat erop duidt dat de positie van het GFP gedeelte geen aanleiding geeft tot een verschillend patroon. Wanneer deze staining wordt vergeleken met de eerder besproken immunostainings kan worden vastgesteld dat de constructen in kwestie veel sterker aangerijkt worden in de nucleus van de getransfecteerde HeLa cel. Voor de beide constructen worden groene spots waargenomen in het Alexa Fluor 488 kanaal (zie rode pijlpunten figuur 7). Mogelijk zijn dit artefacten die ontstaan zijn gedurende de fixering of de kleuring of zijn de constructen in bepaalde mate onderhevig aan precipitatie in de cellen. In vergelijking met wild type HeLa cellen worden bij getransfecteerde cellen veel frequenter afwijkingen waargenomen in de kernmorfologie, voornamelijk een ingedeukt en schijnbaar verfrommeld fenotype komt regelmatig voor (zie rode pijlpunt in figuur 7, links). Deze tendens wordt niet waargenomen bij het LMCD1 FL GFP en LMCD NT GFP domeinconstruct.

Figuur 7 – Links: fluorescentie opname van het LMCD1 2-LIM N GFP construct in HeLa cellen. Rechts: fluorescentie opname van het LMCD1 2-LIM C GFP construct in HeLa cellen.

Figuur 8 toont dat het LMCD1 ΔPET GFP construct voornamelijk wordt aangerijkt in de nucleus van de getransfecteerde HeLa cel, in vergelijking met het cytoplasma, en daarom

27

overlapt de in vivo lokalisatie van dit domeinconstruct in een zeker mate met hetgene wordt geobserveerd voor de LMCD1 2-LIM GFP constructen. Net zoals voor de LMCD1 2-LIM GFP constructen worden hier in het Alexa Fluor 488 kanaal frequent groene spots teruggevonden (zie rode pijlpunten figuur 8), die het gevolg kunnen zijn van de behandelingsprocedure of kunnen wijzen op precipitatie van het LMCD1 ΔPET GFP construct. Ook voor dit domeinconstruct wordt waargenomen dat de nucleï van de getransfecteerde cellen regelmatig een ingedeukt en verfrommeld fenotype kennen. Wanneer de overlappende beelden in figuur 7 en figuur 8 samen worden bekeken dan kan geen co-lokalisatie met structuren van het actine celskelet, zoals actine “stress fibers” en lamellipodia, worden opgemerkt voor de drie verschillende constructen.

Figuur 8 – Fluorescentie opname van het LMCD1 ΔPET GFP construct in HeLa cellen.

Samenvattend tonen de verschillende fluorescentie opnames aan dat de in vivo lokalisatie van LMCD1 FL GFP en LMCD1 NT GFP het best te vergelijken valt en dat voor deze constructen een mogelijk co-lokalisatie met actinestructuren optreedt. Onderling valt de subcellulaire lokalisatie van de LMCD1 2-LIM GFP constructen en het LMCD1 ΔPET construct het best te vergelijken, maar voor deze domeinconstructen wordt een mogelijke co-lokalisatie met structuren van het actine celskelet niet opgemerkt. 3.4. Fylogenetische analyse tussen de TES en de LMCD1 eiwitsequenties uit verschillende organismen Om een beter inzicht te krijgen in de evolutionaire oorsprong van TES en LMCD1 werd een fylogenetische analyse uitgevoerd op gekende en voorspelde eiwitsequenties uit verschillende organismen. Er werd geprobeerd om telkens twee sequenties van organismen te 28

gebruiken uit de klasse der vertebraten, aangevuld met geselecteerde invertebraat en urochordaat sequenties. Deze fylogenetische boom wordt weergegeven in figuur 9.

Figuur 9 – Fylogenetische boom van gekende en voorspelde TES en LMCD1 eiwitsequenties uit verschillende organismen, opgebouwd volgens de statistische “neigbour-joining” methode met als fylogenetische test de Bootstrap methode met 500 herhalingen. De horizontale dimensie werd geschaald en de schaal, links onderaan weergegeven, geeft de lengte van een tak die een genetische wijziging van 0,1 aminozuursubstituties per residu voorstelt.

Fylogenetische bomen omvatten informatie over de afgeleide evolutionaire verwantschap tussen, in dit geval, eiwitsequenties. De horizontale dimensie (takken) geeft de hoeveelheid genetische wijziging in de tijd, uitgedrukt als het aantal aminozuursubstituties per residu. De waarde tussen 0 en 100 ter hoogte van ieder intern knooppunt geven de mate van ondersteuning voor deze opsplitsing. De boom in figuur 9 toont de verwachte evolutieve opsplitsing tussen de TES sequenties uit invertebraten (Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans en Strongylocentrotus purpuratus) en urochordaten (Ciona intestinalis) en de TES en LMCD1 sequenties uit de vertebraten. Voor eerstgenoemde organismen staan geen LMCD1 sequenties als dusdanig beschreven, dus hier kan de TES sequentie een duale rol hebben, of, indien deze 29

bestaat, is een mogelijke LMCD1 sequentie nog niet beschreven voor deze species. Bij de vertebraten werd een opslitsing gemaakt tussen de TES en de LMCD1 sequenties. Binnen en tussen beide groepen is de mate van de genetische wijzigingen beperkter. Een uitschieter in deze boom is de LMCD1 sequentie van Xenopus silurana, die in de evolutie sterke genetische wijzigingen blijkt te hebben. Identiteit (%)

Similariteit (%)

Gaps (%)

Alignment score

TES FL vs. LMCD1 FL

43,4%

57,4%

17,6%

847

TES CR vs. LMCD1 CR

57,8%

61,3%

19,4%

89

TES PET vs. LMCD1 PET

59,3%

76,9%

0,0%

345

TES LIM 1 vs. LMCD1 LIM 1

53,0%

68,2%

3,0%

209

TES LIM 2 vs. LMCD1 LIM 2

37,7%

60,7%

3.3%

129

Tabel 4 – Vergelijking van de procentuele identiteit en de procentuele similariteit tussen de volledige eiwitsequenties enerzijds en de individuele domeinen anderzijds van humaan TES en humaan LMCD1. Aanvullend wordt ook het procentueel aantal gaps getoond en de score voor het alignement.

Bovenstaande fylogenetische boom suggereert dat TES en LMCD1 een gemeenschappelijk invertebraat voorouderlijk gen hebben. De identiteit en de similariteit tussen de volledige sequenties of de individuele domeinen werd verder geanalyseerd met het online PRSS programma6. Hiervoor werd het EMBOSS “stretcher” programma van EMBL-EBI gebruikt, een gemodificeerd Needleman-Wunch algoritme dat toelaat relatief lange eiwitsequenties op een globale manier te aligneren. Uit tabel 4 volgt dat de procentuele identiteit tussen de twee bestudeerde eiwitten het hoogst is voor het PET domein, gevolgd door het CR domein, de eerste LIM domeinen en finaal de tweede LIM domeinen. Voor de vergelijking tussen de tweede LIM domeinen werd een lage identiteit (maar een relatief hoge similariteit) waargenomen. Dit kan potentieel verklaard worden doordat TES en LMCD1 aan de hand van dit “docking” domein verschillende eiwitten binden. Ook voor de volledige eiwitten wordt een hoge procentuele identiteit waargenomen.

6

http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi

30

3.5. “Pull-down” experimenten De uitgevoerde analyses onder punt 3.5. bevestigen onder meer de homologie tussen de humane TES en LMCD1 eiwitsequenties. Daarom hypothetiseren wij dat sommige actine celskelet partners van TES (Sala S et al., unpublished) potentieel een interactie kunnen aangaan met LMCD1 [17]. Deze veronderstelling werd hieronder getest aan de hand van “pull-down”experimenten voor drie gevalideerde partners van TES: actine, VASP en Hic-5. Identificatie van deze eiwitten als partners van LMCD1 kan inzicht verlenen in de biologische functies van dit eiwit.

Actine, 43 kDa

Figuur 10 – Western Blot van de “pull-down” voor actine. Van links naar rechts: merker, LMCD1 FL GFP, TES FL GFP, monomeer GFP en een HeLa cellysaat (input). Primair antilichaam: konijn polyclonaal anti-total actine32. Secundair antilichaam: geit anti-konijn 80033.

Uit figuur 10 volgt dat in het input signaal het eiwit van interesse onduidelijk getoond wordt, ten gevolge van het hoge achtergrondsignaal. Onder de geteste omstandigheden bindt actine (43 kDa) TES FL GFP (positieve controle). Er wordt geen binding teruggevonden tussen actine en monomeer GFP (negatieve controle). Onder de geteste omstandigheden bindt actine ook niet op LMCD1 FL GFP. Figuur 11 toont dat VASP (40 kDa) in de input aanwezig is onder de vorm van een dikke band. In deze test wordt onder de experimentele omstandigheden een interactie teruggevonden tussen VASP en TES FL GFP en VASP en LMCD1 FL GFP. Ook tussen VASP en monomeer GFP wordt een interactie beschreven. Het primaire anti-VASP antilichaam blijft binden aan TES FL GFP en LMCD1 FL GFP, waarschijnlijk ten gevolge van een massa-effect omdat ten gevolge van de “pull-down” zeer sterk wordt aangereikt voor deze eiwitten.

31

VASP, 40 kDa

Figuur 11 – Western Blot van de “pull-down” voor VASP. Van links naar rechts: merker, LMCD1 FL GFP, TES FL GFP, monomeer GFP en een HeLa cellysaat (input). Primair antilichaam konijn polyclonaal anti-VASP34. Secundair antilichaam: geit anti-konijn 800.

Hic-5, 50 kDa

Figuur 12 – Western Blot van de “pull-down” voor Hic-5. Van links naar rechts: LMCD1 FL GFP, TES FL GFP, monomeer GFP en een HeLa cellysaat (input). Primair antilichaam konijn polyclonaal anti-Hic-535. Secundair antilichaam: geit anti-konijn 800.

Finaal toont de Western Blot in figuur 12 dat Hic-5 duidelijk in het input signaal aanwezig en dat onder de geteste omstandigheden Hic-5 wordt teruggevonden als een interactiepartner van TES FL GFP en LMCD1 FL GFP, maar niet voor monomeer GFP. Uit deze “pull-down” experimenten volgt dat onder de geteste condities VASP en Hic-5, gekende celskelet partners van TES, potentieel ook een interactie vormen met LMCD1 FL GFP. Voor actine werd geen binding waargenomen. 3.6. Het effect van LMCD1 FL GFP op celadhesie in iCelligence® experimenten Om na te gaan of LMCD1 net als TES betrokken is bij celadhesie en/of –spreiding werden iCelligence® en microscopie experimenten uitgevoerd. Hieronder worden de resultaten getoond van drie afzonderlijke iCelligence® experimenten waarbij telkens de mate van celadhesie, herrekend als de celindex (CI), van HeLa cellen getransfecteerd met LMCD1 FL GFP of monomeer GFP wordt vergeleken. Het doel is om na dataverwerking uitsluitsel te kunnen geven over eventuele statistisch significante verschillen tussen de twee condities (LMCD1 FL GFP en monomeer GFP) enerzijds en de reproduceerbaarheid van de iCelligence®-experimenten anderzijds. In figuur 13, 14 en 15 wordt binnen ieder experiment voor elke conditie de CI in functie van de tijd weergegeven. De CI die gedurende zes uur om de minuut werd geplot is het 32

gemiddelde van de verschillende technische replicaten van een conditie op een bepaald tijdspunt. Op dit gemiddelde wordt steeds de SEM als fout weergegeven. De lineariteit van het adhesieproces in tijdsintervallen gedurende de eerste drie uur werd berekend via een lineaire regressie analyse. Dit gebeurde door binnen elk experiment in vier gedefinieerde tijdsintervallen voor de verschillende condities de “goodness of fit” (R²) te berekenen. Deze tijdsintervallen worden afgebakend als het eerste half uur, het tweede half uur, het tweede uur en het derde uur van het gevolgde adhesieproces. De R² wordt samengevat in tabel 5.

Experiment 1 - LMCD1 FL GFP vs. GFP 3,5

Cell index (CI)

3 2,5 2 1,5

LMCD1 FL GFP

1

GFP

0,5

0

Tijd

Figuur 13 – Experiment 1: de CI voor HeLa cellen getransfecteerd met LMCD1 FL GFP of monomeer GFP in functie van de tijd (hr). Het aantal technische replicaten (n) is zeven voor LMCD1 FL GFP en acht voor monomeer GFP.

33

Experiment 2 - LMCD1 FL GFP vs. GFP 3,5

Cell index (CI)

3 2,5 2 1,5

LMCD1 FL GFP

1

GFP

0,5 0

Tijd

Figuur 14 – Experiment 2: de CI voor HeLa cellen getransfecteerd met LMCD1 FL GFP of monomeer GFP in functie van de tijd (hr). N is acht voor LMCD1 FL GFP en acht voor monomeer GFP.

Experiment 3 - LMCD1 FL GFP vs. GFP 3,5 3

Cell index (CI)

2,5 2 1,5

LMCD1 FL GFP GFP

1 0,5 0 -0,5 Tijd

Figuur 15 – Experiment 3: de CI voor HeLa cellen getransfecteerd met LMCD1 FL GFP of monomeer GFP in functie van de tijd (hr). N is acht voor LMCD1 FL GFP en zeven voor monomeer GFP.

34

Conditie

R² experiment 1

R² experiment 2

R² experiment 3

LMCD1 FL GFP tijdsinterval 1

0,994

0,997

0,997


0,996

0,996

0,997


0,998

0,993

0,996


1,000

0,989

0,996

Monomeer GFP tijdsinterval 1

0,996

0,997

0,999


0,996

0,995

0,997


0,998

0,993

0,996


0,999

0,985

0,994

Tabel 5 – Binnen elk experiment wordt voor iedere conditie de “goodness of fit” (R²) berekend in een gedefinieerd tijdsinterval als maat voor de lineariteit van het spreidingsproces.

Op basis van de R² kan worden gesteld dat in de verschillende tijdsintervallen het adhesieproces zich op een nagenoeg lineaire manier gedraagt omdat de R² steeds zeer dicht bij 1 ligt. Om na te gaan welke invloed de verschillende condities hebben op de celadhesie werd voor ieder replicaat de spreidingssnelheid onder de vorm van een “slope” berekend in de verschillende tijdsintervallen. Deze “slope” kan berekend worden ten gevolge van de lineariteit van het proces, zoals aangeduid met de R² waarden in tabel 5. Binnen elk experiment kon vervolgens de gemiddelde spreidingssnelheid in de verschillende tijdsintervallen voor iedere conditie berekend worden, met de SEM als fout. Deze gemiddelde spreidingssnelheid wordt voor iedere conditie

40 35 30 25 20 15 10 5 0

LMCD1 GFP

1

2 3 Tijdsinterval

4

Slope

Slope

voor de verschillende tijdsintervallen weergeven in de staafdiagrammen in figuur 16.

40 35 30 25 20 15 10 5 0

LMCD1 FL GFP GFP

1

2 3 Tijdsinterval

4

35

Slope

Figuur 16 – De gemiddelde spreidingssnelheid in de 40 35 30 25 20 15 10 5 0

verschillende tijdsintervallen per conditie. Links boven: experiment 1, rechts boven: experiment 2, links onder: LMCD1 FL GFP GFP

experiment 3. De getoonde foutenvlaggen zijn de SEM. De tijdsintervallen worden gedefinieerd als het eerste half uur (1), het tweede half uur (2), het tweede uur (3) en het derde uur (4) van het gevolgde spreidingsproces.

1

2 3 4 Tijdsinterval

Uit figuur 16 kan worden gesteld dat in de verschillende experimenten voor de beide condities de snelheid van het adhesieproces afneemt in de tijd, maar bovenstaande grafische voorstellingen zijn uiteraard niet voldoende om conclusies te kunnen trekken wat betreft een statistisch significant verschil tussen de adhesiesnelheid van de condities in de verschillende tijdsintervallen. Daarom werd een statistische analyse uitgevoerd (zie materialen en methoden). Er geldt dat de vergeleken condities statistisch significant van elkaar verschillen op het 95% significantieniveau in hun gemiddelde adhesiesnelheid voor een bepaald tijdinterval wanneer de p-waarde kleiner is dan 0,05. In tabel 6 worden alle berekende p-waarden samengevat en in cursief geplaatst wanneer deze kleiner zijn dan 0,05. Experiment 1

Experiment 2

Experiment 3

LMCD1 FL GFP vs. GFP interval 1

<0,001

0,195

0,072


<0,001

0,328

0,189


0,001

0,574

0,613


0,021

0,645

0,955

Tabel 6 – De p-waarden voor de vergeleken condities voor alle drie de experimenten. P-waarden in cursief (<0,05) duiden op een statistisch significant verschil op het 95% significantieniveau.

Een bijkomende eis die wordt gesteld is dat dit verschil moet worden teruggevonden in drie onafhankelijke experimenten en bovendien moet de waargenomen trend dezelfde richting hebben. Wanneer de resultaten van de drie experimenten samen worden bekeken, dan kan geen eenduidige uitspraak worden gedaan omtrent de paarsgewijze vergelijking van de gemiddelde spreidingssnelheden van de condities in de gedefinieerde tijdsintervallen. Op basis van de berekende p-waarden kunnen over de drie experimenten heen worden duidelijk verschillende 36

adhesiesnelheden worden waargenomen. Zo zijn binnen experiment 1 alle gemaakte vergelijkingen statistisch significant verschillend op het 95% significantieniveau en wordt in experiment 2 en 3 in geen enkele geval een statistisch significant verschil waargenomen. Twee mogelijke verklaringen voor deze observatie zijn verschillen in de transfectie-efficiëntie binnen en tussen de verschillende experimenten enerzijds en verschillen in het eiwitexpressieniveau van LMCD1 FL GFP en monomeer GFP binnen en tussen de verschillende experimenten anderzijds. Om dit te evalueren worden fluorescentiebeelden van de verschillende transfecties getoond met als doel de transfectie-efficiëntie na te gaan. Aanvullend wordt het eiwitexpressieniveau bepaald aan de hand van drie Western Blot experimenten. De fluorescentiebeelden worden weergegeven in figuur 17, de Western Blot in figuur 18. Wanneer de fluorescentiebeelden op een visuele manier geïnterpreteerd worden met als doel een uitspraak te maken over de transfectie-efficiëntie kan het volgende worden gesteld. In experiment 1 ligt voor beide constructen de transfectieefficiëntie het hoogst. Binnen dit experiment is de transfectie-efficiëntie voor monomeer GFP hoger, maar in principe blijven de condities met elkaar vergelijkbaar. In experiment 2 ligt de transfectie-efficiëntie voor beide condities het laagst. Binnen dit experiment is de transfectieefficiëntie voor beide constructen sterk vergelijkbaar, maar voor dit experiment zijn ten gevolge van de lage efficiëntie nog veel niet getransfecteerde cellen aanwezig. Tot slot is in experiment 3 de transfectie-efficiëntie voor beide constructen iets lager dan in experiment 1 maar vrij vergelijkbaar.

37

Figuur 17 – Evaluatie van de transfectie-efficiëntie van LMCD1 FL GFP en monomeer GFP in de drie onafhankelijke experimenten. Bovenaan: experiment 1, midden: experiment 2, onderaan: experiment 3. Links: monomeer GFP transfecties, rechts: LMCD1 FL GFP transfecties. De beelden werden opgenomen met vergelijkbare microscoop instellingen (0,1 ms voor bright field opnames en 500 ms voor opnames met de FITC filter).

De Western Blots worden getoond in figuur 18 en telkens wordt de ratio bepaald van de signaalintensiteit van LMCD1 FL GFP of monomeer GFP ten opzichte van GAPDH. Voor de drie Western Blots wordt dan een gemiddelde ratio berekend, waarop een fout wordt berekend onder de vorm van de SEM, aanvullend uitgedrukt als een procentuele fout. Dit wordt voorgesteld in tabel 7.

38

Figuur 18 – Western Blots van de drie onafhankelijke experimenten. Links: experiment 1, midden: experiment 2, rechts: experiment 3. Primaire antilichamen: muis monclonaal anti-GFP en konijn polyclonaal anti-GAPDH. Secundaire antilichamen: geit anti-muis 680 en geit anti-konijn 800. LMCD1 FL GFP

GFP

Western Blot 1 signaal/GAPDH

13,42515432

15,3546798


0,845923098

4,264054054


10,03383459

11,69891122

Gemiddelde SEM

8,101637335 3,757627984

10,43921503 3,262954732

Procentuele fout

46,38%

31,26%

Tabel 7 – Voor ieder afzonderlijk experiment wordt de ratio getoond tussen de signaalintensiteit van LMCD1 FL GFP of monomeer GFP ten opzichte van het huishoud-eiwit GAPDH. Over de experimenten heen wordt een gemiddelde genomen, waarop de SEM wordt genomen. De SEM wordt bijkomend uitgedrukt als een procentuele fout. Voor de verschillende blots werden dezelfde Odyssey-instellingen gehanteerd: scannings intensiteit 5,0 voor zowel het 600 als het 800 signaal.

Voor ieder construct geldt dat de expressieniveaus variëren over de drie afzonderlijke experimenten heen. Binnen experiment 1 en 3 zijn de expressieniveaus van de condities vergelijkbaar, maar dit is niet het geval voor experiment 2. De variaties in de transfectieefficiëntie enerzijds en deze variaties in het expressieniveau anderzijds maken het moeilijk om uitspraken te doen over potentieel aanwezige significante verschillen in de gemiddelde spreidingssnelheid van een conditie in een bepaald tijdsinterval.

39

3.7. De vergelijking tussen TES FL GFP, LMCD1 FL GFP en monomeer GFP in een alternatieve spreidingsassay Onder deze sectie worden de resultaten getoond van een alternatieve spreidingsassay, uitgevoerd als in Hadzic et al. volgens de methodologie beschreven onder 2.6.2.. Aan de hand van figuur 19 en figuur 20 wordt geïllustreerd op welke manier het beeldmateriaal wordt verzameld via confocale microscopie en vervolgens wordt verwerkt in ImageJ.

Figuur 19 – Een voorbeeld van het verzamelde beeldmateriaal en de hierop volgende beeldverwerking voor het TES FL GFP construct 3 uur na uitzaaien. Bovenaan worden opnames van de confocale microscoop getoond, genomen met een 20X objectieflens, links: Alexa Fluor 594 kanaal, midden: Alexa Fluor 488 kanaal, rechts: overlappend beeld. Onderaan wordt de beeldverwerking van het Alexa Fluor 488 beeld in ImageJ getoond, links: masker verkregen na “triangle” segmentatie, midden: identificatie van de partikels in dit masker met berekening van de oppervlakte en de perimeter, rechts: overlap met het Alexa Fluor 488 beeld.

40

Figuur 20 – Een voorbeeld van het verzamelde beeldmateriaal en de hierop volgende beeldverwerking voor het LMCD1 FL GFP construct 3 uur na uitzaaien. Bovenaan worden opnames van de confocale microscoop getoond, genomen met een 20X objectieflens, links: Alexa Fluor 594 kanaal, midden: Alexa Fluor 488 kanaal, rechts: overlappend beeld. Onderaan wordt de beeldverwerking van het Alexa Fluor 488 beeld in ImageJ getoond, links: masker verkregen na “triangle” segmentatie, midden: identificatie van de partikels in dit masker met berekening van de oppervlakte en de perimeter, rechts: overlap met het Alexa Fluor 488 beeld.

In figuur 21 wordt, onder de vorm van “box-and-whisker” plots, de verdeling van de celoppervlakten en celperimeters van de individuele HeLa cellen getoond per conditie 1 uur en 3 uur na uitzaaien. De uitgezette data wordt samengevat in tabel 8. Hierin wordt voor iedere conditie en voor elk bestudeerd tijdspunt de gemiddelde waarde voor de oppervlakte en de perimeter gegeven, samen met de bijhorende SEM en het aantal datapunten n. Conditie TES FL GFP

LMCD1 FL GFP

Tijdspunt

Gemiddeld celoppervlak

SEM

Gemiddelde perimeter

SEM

n

1h

1354.5 pixels²

116,0

183.5 pixels

10,0

65

3h

2097,5 pixels²

117,3

306,9 pixels

12,7

100

1h

1955,8 pixels²

125,2

253,5 pixels

13,1

51

3h

955,0 pixels²

64,6

161,4 pixels

10,0

61

41

Monomeer GFP

Wild type HeLa

1h

1326,8 pixels²

77,2

155,8 pixels

6,6

81

3h

1173,1 pixels²

83,8

185,6 pixels

11,5

64

1h

1387,8 pixels²

77,4

164,9 pixels

4,7

170

3h

1652,7 pixels²

54,5

213,5 pixels

13,4

79

Tabel 8 – Samenvatting van de gevisualiseerde data van de verschillende condities voor de twee geteste tijdspunten. Het gemiddelde celoppervlak (pixels²) en de gemiddelde perimeter (pixels) wordt gegeven samen met de berekende SEM. N staat voor het aantal (getransfecteerde) HeLa cellen voor iedere dataset.

42

Figuur 21 – “Box and whiskers” plot van de verdeling van de oppervlakte (pixels², bovenste plot) of de perimeter (pixels, onderste plot) van de individuele HeLa cellen voor de twee bestudeerde tijdspunten. In de box zitten alle datapunten die zich bevinden tussen het 25ste en het 75ste percentiel. De lijn in de box toont de mediaan en de whiskers zijn geplaatst op 1,5 maal de interkwartielafstand. Alle datapunten die zich buiten het bereik van de whiskers bevinden zijn uitschieters.

De p-waarden worden getoond in tabel 9 voor de oppervlakten en tabel 10 voor de perimeter en worden in cursief gezet wanneer deze kleiner zijn dan 0,05 en er een statistisch significant verschil op het 95% significantieniveau optreedt. P-waarden voor de gemeten celoppervlakte TES 1h

TES 3h

LMCD1 1h

LMCD1 3h

GFP 1h

GFP 3h

WT 1h

WT 3h

TES 1h TES 3h

<0,001

LMCD1 1h

<0,001

1,000

LMCD1 3h

0,232

<0,001

<0,001

GFP 1h

1,000

<0,001

0,003

0,016

GFP 3h

1,000

<0,001

<0,001

1,000

1,000

WT 1h

1,000

<0,001

0,005

<0,001

1,000

0,824

WT 3h

1,000

0,056

0,228

<0,001

1,000

0,223

1,000

Tabel 9 – De p-waarden voor alle condities onderling, weergegeven voor de gemeten celoppervlakte. P-waarden in cursief (< 0,05) duiden op een statistisch significant verschil op het 95% significantieniveau. P-waarden voor de gemeten perimeter TES 1h

TES 3h

LMCD1 1h

LMCD1 3h

GFP 1h

GFP 3h

WT 1h

WT 3h

TES 1h TES 3h

<0,001

LMCD1 1h

0,001

1,000

LMCD1 3h

1,000

<0,001

<0,001

GFP 1h

1,000

<0,001

<0,001

1,000

GFP 3h

1,000

<0,001

0,003

1,000

1,000

WT 1h

1,000

<0,001

<0,001

1,000

1,000

1,000

WT 3h

1,000

<0,001

0,037

0,100

0,060

1,000

0,282

Tabel 10 – De p-waarden voor alle condities onderling, weergegeven voor de gemeten perimeter. P-waarden in cursief (< 0,05) duiden op een statistisch significant verschil op het 95% significantieniveau.

43

De volgende uitspraken kunnen worden gedaan wanneer deze data op een kritische wijze worden geïnterpreteerd. Een vergelijking tussen HeLa cellen getransfecteerd met monomeer GFP en wild type HeLa cellen laat toe het effect van de calciumfosfaat transfectie op de celadhesie en de –spreiding na te gaan. Deze twee condities gedragen zich statistisch niet significant verschillend voor de beide bestudeerde tijdspunten, wat suggereert dat de transfectieprocedure op zich geen effect heeft op zowel de celoppervlakte als de –perimeter. Aanvullend geldt ook dat er geen statistisch significant verschil is in de oppervlakte en de perimeter tussen het 1 uur en het 3 uur tijdspunt voor deze beide controle condities. Dit impliceert dat na 2 uur de veranderingen in beide parameters nauwelijks toenemen. Een vergelijking tussen HeLa cellen getransfecteerd met TES FL GFP of LMCD1 FL GFP en HeLa cellen getransfecteerd met monomeer GFP laat toe het effect van het construct op de celadhesie en de –spreiding na te gaan. Voor het TES FL GFP construct wordt een statistisch significant verschil waargenomen met HeLa cellen getransfecteerd met monomeer GFP voor de oppervlakte en de perimeter op het 3 uur tijdspunt. Dit suggereert dat overexpressie van TES FL GFP in HeLa cellen aanleiding geeft tot snellere celspreiding. Voor het LMCD1 FL GFP construct wordt een statistisch significant verschil waargenomen met HeLa cellen getransfecteerd met monomeer GFP voor de oppervlakte en de perimeter op het 1 uur tijdspunt. Tevens is de celoppervlakte en de –perimeter van LMCD1 FL GFP getransfecteerde cellen statistisch significant groter na 1 uur dan na 3 uur. Dit is biologisch moeilijk te interpreteren omdat de bestudeerde cellen dan gedurende deze periode zouden krimpen. Dit maakt het bijgevolg niet mogelijk om een uitspraak te kunnen doen over het LMCD1 FL GFP construct in deze spreidingsassay.

44

4.

Bespreking De fluorescentie opnames die werden gemaakt van de domeinconstructen van LMCD1 in

HeLa cellen hadden als doel de subcellulaire lokalisatie van de verschillende constructen te evalueren en bijkomend inzicht te verwerven in de in vivo functionaliteit van LMCD1 en zijn domeinen. Voor het LMCD1 FL GFP en het LMCD1 NT GFP construct werd een gelijkaardige subcellulaire lokalisatie waargenomen, deze domeinconstructen verdelen zich namelijk evenwichtig over het cytoplasma en de celkern van de getransfecteerde cel. In het cytoplasma werd mogelijke co-lokalisatie waargenomen met structuren van het actine celskelet, voornamelijk ter hoogte van de plasmamembraan, waar naast F-actine ook corticaal actine aanwezig is. De fluorescentie opname van het LMCD1 NT GFP construct suggereert zelfs een mogelijke colokalisatie met lamellipodia in spreidende of migrerende HeLa cellen. Deze mogelijke colokalisatie kan verband houden met de waargenomen toename in gelamelleerde extensies in SKHep1 cellen getransfecteerd met LMCD1 E135K of K237R [25]. Bovengenoemde observaties kunnen wijzen op een effectieve aanwezigheid en een functionaliteit van LMCD1 en zijn domeinen in het actine celskelet, maar deze kleuringen moeten vooral kritisch benaderd worden aangezien niet zomaar co-lokalisatie mag worden geconcludeerd. Dit komt omdat naast een verhoging van de intensiteit in het Alexa Fluor 488 kanaal ook duidelijk een sterke intensiteitstoename in het Alexa Fluor 594 kanaal werd waargenomen ter hoogte van structuren van het actine celskelet. Dit valt uiteraard te verklaren door de aanrijking van F-actine in deze structuren, maar ten gevolge van deze sterke intensiteitsverhoging in het rode kanaal kan de colokalisatie mogelijk worden overschat op het overlappend beeld. Bijkomend werd mogelijke colokalisatie geobserveerd met structuren die focale adhesies zouden kunnen zijn, maar om hierover duidelijk uitspraken te kunnen doen is een staining met vinculine, een merker voor deze complexen, noodzakelijk. De LMCD1 2-LIM GFP constructen en het LMCD1 ΔPET GFP construct lokaliseren in een sterke mate naar de kern van de getransfecteerde HeLa cellen. Deze lokalisatie naar de nucleus, waargenomen voor alle LMCD1 domeinconstructen, stemt overeen met de beschreven rol van LMCD1 als co-repressor van GATA1, GATA2 en GATA6 [23]. Mogelijk is er een bepaalde mate van toxiciteit van de LMCD1 2-LIM GFP constructen en het LMCD1 ΔPET GFP construct in HeLa cellen, aangezien de domeinconstructen schijnbaar worden opgehoopt in de celkernen en getransfecteerde HeLa cellen frequent een afwijkende kernmorfologie vertonen. Voor deze constructen werden ook frequent groene spots in het Alexa 45

Fluor 488 kanaal waargenomen, maar deze spots zijn niet noodzakelijk afkomstig van mogelijke toxiciteit, daar deze ook een artefact kunnen zijn van de procedure. Figuur 25 toont analoge fluorescentie opnames voor de TES GFP domeinconstructen. De subcellulaire lokalisatie van LMCD1 FL GFP is sterk vergelijkbaar met hetgene wordt waargenomen voor TES FL GFP, maar het TES NT GFP construct lokaliseert in een veel sterkere mate naar de actine “stress fibers”, een effect dat mogelijk kan worden toegeschreven aan de functionaliteit van het CR domein. Dit is een opmerkelijk verschil, zeker wanneer deze waarneming wordt gekaderd binnen de hoge procentuele identiteit van het CR domein van TES en LMCD1. Identificatie van de domein-specifieke interactiepartners van het CR domein van beide eiwitten kan hier mogelijk een verklaring bieden. Bijkomend doen de fluorescentie opnames op het TES NT GFP, het TES 3LIM GFP en het TES ΔPET GFP vermoeden dat de informatie die het CR domein omvat noodzakelijk is om te lokaliseren naar de actine “stress fibers” en dat de informatie die aanwezig is in de LIM domeinen essentieel is om te lokaliseren naar de celkern en de focale adhesies. Concreet leert deze vergelijking dat de mogelijke connectie tussen LMCD1 en zijn domeinen met het actine celskelet moeilijker af te leiden is uit fluorescentie opnames dan voor de analoge TES constructen.

Figuur 25 – Fluorescentie opnames van de TES domeinconstructen in HeLa cellen. Linksboven: TES FL GFP, rechtsboven: TES NT GFP, linksonder: TES 3-LIM GFP, rechtsonder: TES ΔPET GFP. Het Alexa Fluor 488 kanaal wordt steeds getoond (Sala S et al., unpublished).

46

Er geldt dat de functies die een eiwit in vivo uitvoert mee worden bepaald door de interactie complexen die worden gevormd in de onmiddellijke omgeving. Daarom werd getracht op een binaire manier, aan de hand van “pull-down” experimenten, een aantal gekende bindingspartners van TES met een rol in het actine celskelet te valideren voor LMCD1 FL GFP. Onder de geteste condities werden de eiwitten VASP en Hic-5 geïdentificeerd als potentiële interactiepartners voor LMCD1 FL GFP. VASP (Vasodilator-stimulated phosphoprotein) is een actine-geassocieerd eiwit dat de elongatie van F-actine promoot en onder andere een rol speelt in de dynamiek van de lamellipodia en de filopodia en de celmigratie [27]. Hic-5 (Transforming growth factor β-1 induced transcript 1 protein) is een moleculair adaptoreiwit dat eiwit-eiwitinteracties ter hoogte van de focale adhesies en de celkern coördineert en een functie doet vermoeden in celgroei en – migratie [28]. De waargenomen binding van VASP en Hic-5 met LMCD1 FL GFP kan een argument zijn voor de aanwezigheid van LMCD1 in het actine celskelet en een functionaliteit in actinegestuurde processen. Het is echter noodzakelijk om de waargenomen interacties in bijkomende experimenten te valideren. Dit kan aan de hand van het omgekeerde experiment, door de vermoedelijke partner te immunoprecipiteren en vervolgens via Western Blotting met een anti-LMCD1 antilichaam na te gaan of LMCD1 op zijn beurt als een partner wordt geïdentificeerd. Een alternatieve methode is partnervalidatie via affiniteitschromatografie door gebruik te maken van het bestaande LMCD1 FL GST construct. Dit domeinconstruct kan gekoppeld worden aan glutathion-sepharose beads die vervolgens geïncubeerd worden met een HeLa cellysaat. Nadien kan met een geschikt antilichaam via Western Blot de binding met VASP of Hic-5 worden gevalideerd. Onder de geteste condities werd geen binding beschreven tussen actine en LMCD1 FL GFP. Er dient wel te worden opgemerkt dat de geteste vorm van actine in dit geval globulair actine is omdat filamenteus actine grotendeels werd geprecipiteerd gedurende de cellyse. De binding tussen LMCD1 FL GFP en F-actine dient met behulp van een aangepast protocol te worden onderzocht. Indien geen directe interactie wordt beschreven tussen LMCD1 FL GFP en F-actine dan kan LMCD1 nog steeds recruteren naar structuren van het actine celskelet aan de hand van interactiepartners die wel direct F-actine kunnen binden. Aanvullend werd getracht een gedeelte van het LMCD1 interactoom te bepalen aan de hand van proteomics experimenten op het LMCD1 FL GFP construct. Er werden echter geen peptiden door de massaspectrometer geïdentificeerd, waardoor op deze manier geen mogelijke interactiepartners werden gevonden. Dit kan enerzijds te wijten zijn aan een technische fout gedurende de 47

procedure, bijvoorbeeld een slechte elutie tijdens de uitgevoerde co-IP of een te sterke verdunning van de stalen voordat deze op de massaspectrometer werden geladen. Anderzijds kan dit ook een gevolg zijn van de biologie van het LMCD1 FL GFP construct. Het is essentieel dat na co-IP de concentratie van het construct in het staal voldoende hoog is en het LMCD1 FL GFP construct kon gedurende de cellyse bijvoorbeeld gedeeltelijk worden geprecipiteerd waardoor deze concentratie niet werd bereikt. In een volgende experiment dient te worden overwogen om meerdere pellets van LMCD1 FL GFP getransfecteerde HeLa cellen samen te voegen, om zodanig een voldoende hoge concentratie van het eiwit van interesse te verkrijgen na co-IP. Bijkomend werden ook proteomics experimenten gestart op het LMCD1 2-LIM GFP construct, enerzijds omdat de LIM domeinen mogelijk moleculaire “docking” plaatsen zijn voor interactiepartners, anderzijds naar aanleiding van de gestarte modellering experimenten welke echter nog in uitvoering waren bij het indienen van deze masterproef. Het doel van de iCelligence® experimenten was de snelheid van celadhesie te vergelijken tussen HeLa cellen getransfecteerd met LMCD1 FL GFP en HeLa cellen getransfecteerd met monomeer GFP. Deze vergelijking liet ook toe om de eventuele invloed van de transfectieprocedure op de celadhesie na te gaan. Concreet werd per experiment de gemiddelde adhesiesnelheid van iedere conditie berekend in vier gedefinieerde tijdsintervallen die de eerste drie uur van het adhesieproces overkoepelden. Er werden drie onafhankelijke iCelligence® experimenten uitgevoerd en er werd vooropgesteld dat een statistisch significant verschil tussen met LMCD1 FL GFP en met monomeer GFP getransfecteerde HeLa cellen slechts betrouwbaar is als en slechts als deze trend dezelfde is voor de drie experimenten. Aangezien de resultaten over de drie experimenten heen verschillend zijn kon geen eenduidige uitspraak worden gedaan over een mogelijk verschil in de gemiddelde snelheid van adhesie in de vier bestudeerde tijdsintervallen. De verschillende resultaten mogen niet worden verklaard door het principe van het iCelligence® platform, daar de registratie van de impedantie-verandering van een met elektroden bezette plaat een goede manier is om weer te geven hoe de grootte van een door cellen ingenomen oppervlakte toeneemt in de tijd. Fluorescentie opnames toonden aan dat tussen de experimenten enerzijds en binnen een experiment anderzijds de transfectie-efficiëntie varieerde. De transfectie-efficiëntie bedroeg nooit honderd procent en daarom droegen ook de niet getransfecteerde HeLa cellen bij tot de gemiddelde adhesiesnelheid, waardoor deze mogelijk niet representatief was voor de bestudeerde condities. Ten gevolge van de calciumfosfaat transfectie 48

bleven getransfecteerde HeLa cellen regelmatig vasthangen aan de bodem van de falcon, ondanks langdurige behandeling met 0,05% trypsine-EDTA. De getransfecteerde cellen dienden telkens te worden geschraapt, een behandeling die een invloed kan hebben op de daarop volgende celadhesie. De transfectie-efficiëntie kon worden verhoogd tot nagenoeg honderd procent door gebruik te maken van een lipofectamine transfectie. Dit is echter een zeer aggresieve transfectiemethode die een sterke invloed naliet op de getransfecteerde HeLa cellen, waardoor deze niet meer betrouwbaar konden worden gebruikt in een functioneel experiment. Bijkomend werd via drie onafhankelijke Western Blots aangetoond dat het eiwit expressniveau van de condities varieert binnen en tussen de experimenten. Ten gevolge van een enorm heterogene celpopulatie is het onmogelijk een uitspraak te doen over statistisch significante verschillen tussen de twee condities wat betreft de gemiddelde adhesiesnelheid in de vier verschillende tijdsintervallen. In de toekomst kunnen andere transfectiemethoden of celtypes overwogen worden of het gebruik van HeLa cellen die stabiel het LMCD1 FL GFP tot expressie brengen. De alternatieve spreidingsassay was een aanvullende functionele test met als doel het vergelijken van de gemiddelde celoppervlaktes en –perimeters van getransfecteerde HeLa cellen (met TES FL GFP, LMCD1 FL GFP of monomeer GFP) en niet getransfecteerde HeLa cellen op twee tijdspunten, namelijk 1 uur en 3 uur uitzaaien. De vergelijking tussen monomeer GFP en wild type HeLa cellen toonde dat de calciumfosfaat transfectie op zich geen invloed lijkt te hebben op celspreiding. De gemiddelde celoppervlakte en –perimeter van TES FL GFP getransfecteerde HeLa cellen lag na 3 uur statistisch significant hoger dan voor monomeer GFP getransfecteerde cellen, wat overeen stemt met de beschreven invloed van TES op het proces van celspreiding [14, 19, 20]. Voor HeLa cellen getransfecteerd met LMCD1 FL GFP kon geen eenduidige uitspraak worden gedaan omdat de cellen schijnbaar leken te krimpen gedurende de bestudeerde periode. Om mogelijke foutieve behandeling van dit staal na te gaan, zullen ook de 2 uur en 4 uur tijdspunten bijkomend worden bestudeerd, waarbij zal worden gelet op het fenotype van de gefixeerde cellen. Ook voor deze veelbelovende test kan het gebruik van stabiele cellijnen een belangrijke meerwaarde zijn. In de toekomst dient het experiment uitgebreid te worden met meerdere tijdspunten, eventueel meerdere replicaten per tijdspunt, en beeldvorming van een groter aantal cellen per tijdspunt.

49

5.

Referenties

[1] [2] [3]

American Cancer Society, Cancer Facts & Figures 2015. Hanahan D, Weinberg RA (2011). Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 144(5):646-674. Hei M, Rosen J, Mangiameli D (2007). Microarray technology and cancer gene profiling. Advances in Experimental Medicine and Biology 593:117-133. Kumar V, Abbas AK, Fausto N. Robbins and Cotran pathologic basis of disease, 7th edition. Philadelphia: Elsevier Saunders; 2005. Sahai E (2005). Mechansims of cancer cell invasion. Curr Opin Genet Dev 15(1):87-96. Talmadge JE, Fidler IJ (2010). AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective. Cancer Res. 70(14):5649-5669. El-Serag H, Rudolph K (2007). Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis. Gastroenterology 132:2557-2576. Lodish H, Kaiser C, Bretcher A (2012). Molecular Cell Biology, 7th ed. Freeman. Tojkander S, Gateva G, Lappalainen P (2012). Actin stress fibers: assembly, dynamics and biological roles. J Cell Sci 125(8):1855-1864. Zaidel-Bar R, Geiger B (2010). The switchable integrin adhesome. Journal of Cell Science 123(9):1385-1388. Insall R, Machesky L (2009). Actin dynamics at the leading edge: from simple machinery to complex networks. Cell 17:310-322. Hall A (2009). The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev 28:5-14. Tobias ES, Hurlstone AFL, Mackenzie E (2001). The TES gene at 7q31.1 is methylated in tumours and encodes a novel growth-suppressing LIM domain protein. Oncogene 20:2844-2853. Coutts AS, MacKenzie E, Griffith E (2002). TES is a noval focal adhesion protein with a role in cell spreading. Journal of Cell Science 116:897-906. Zheng Q, Zhao Y (2007). The diverse functions of LIM domain proteins: determined by subcellular localization and protein-protein interaction. Biol. Cell. 99:489-502. Kadrmas JL, Beckerle MC (2004). The LIM domein: from the cytoskeleton to the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 5:920-931. Garvalov BK, Higgins TE, Sutherland JD (2003). The conformational state of Tes regulates its zyxindependent recruitment to focal adhesions. J Cell Biol. 161(1)33-39. Zhong Y, Zhu J, Wang Y (2009). LIM domain protein TES changes its conformational states in different cellular compartments. Mol Cell Biochem 320:85-92. Griffith E, Coutts AS, Black DM (2005). RNAi knockdown of the focal adhesion protein TES reveals its role in actin stress fibre organisation. Cell Motility and the Cytoskeleton 60:140-152. Drusco A, Zanesi N, Roldo C (2005). Knockout mice reveal a tumor suppression function for Testin. PNAS 102(31):10947-10951. Bespalova IN, Burmeister M (2000). Identification of a novel LIM domain gene, LMCD1, and chromosomal localization in human and mouse. Genomics 63:69-74. Bian ZY, Huang H, Jiang H (2010). LIM and Cysteine-rich Domains 1 regulates cardiac hypertrophy by targeting calcineurin/nuclear factor of activated T cells signaling. Hypertension 55:257-263. Molkentin JD (2000). The zinc-finger containing transcription factors GATA-4, -5 and -6. Ubiquitously expressed regulators of tissue-specific gene expression. J. Biol. Chem. 275:38949-38952. Rath N, Wang Z, Lu MM (2005). LMCD1/Dyxin is a novel transcriptional cofactor that restricts GATA6 function by inhibiting DNA binding. Mol. Cell. Biol. 25(20):8864-8873. Chang CY, Lin SC, Su WH (2012). Somatic LMCD1 mutations promoted cell migration and tumor metastasis in hepatocellular carcinoma. Oncogene 31:2640-2652. Van Impe K, Bethuyne J, Cool S (2013). A nanobody targeting the F-actin capping protein CapG restrains breast cancer metastasis. Breast Cancer Research 15:R116. Barzik M, Kotova TI, Higgs HN (2005). Ena/VASP proteins enhance actin polymerization in the presence of barbed end capping proteins. J. Bio. Chem. 280:28653-28662. Heitzer MD, DeFranco DB (2006). Mechanism of action of Hic-5/androgen receptor activator 55, a LIM domain-containing nuclear receptor co-activator. Mol. Endocrinol. 20:56-64.

[4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28]

50




Promotor:



Biochemie (GE07)


Bijlagen

1.

Bijlage 1 – De grenzen van LMCD1 en zijn domeinen als basis voor de aanmaak van de LMCD1 GFP domeinconstructen naar analogie met TES GFP domeinconstructen

Alignement tussen humaan TES en humaan LMCD1 HumanTes HumanLmcd1 HumanTes HumanLmcd1 HumanTes HumanLmcd1 HumanTes HumanLmcd1 HumanTes HumanLmcd1 HumanTes HumanLmcd1 HumanTes HumanLmcd1 HumanTes HumanLmcd1

MDLEN KVKKMGLGHE QGF-GAPCLK CKEKCEGFEL HFWRKICRNC KCGQEEHDVL MAKVAKDLNP GVKKMSLGQL QSARGVACLG CKGTCSGFEP HSWRKICKSC KCSQEDHCLT 61 120 LSNEEDRKVG KLFEDTKYTT LIAKLKS-DG IPMYKRNVMI LTNPVAAKKN VSINTVTYEW SDLEDDRKIG RLLMDSKYST LTARVKGGDG IRIYKRNRMI MTNPIATGKD PTFDTITYEW 121 180 APPVQNQALA RQYMQMLPKE KQPVAGSEGA QYRKKQLAKQ LPAHDQDPSK CHELSPREVK APPGVTQKLG LQYMELIPKE KQPVTGTEGA FYRRRQLMHQ LPIYDQDPSR CRGLLENELK 181 240 EMEQFVKKYK SEALGVGDVK LPCE--MDAQ GPKQMNIPGG DRSTPAAVGA MEDKSAEHKR LMEEFVKQYK SEALGVGEVA LPGQGGLPKE EGKQQEKPEG AETTAATTNG --SLSDPSKE 241 300 TQYSCYCCKL SMKEGDPAIY AERAGYDKLW HPACFVCSTC HELLVDMIYF WKNEKLYCGR VEYVCELCKG AAPPDSPVVY SDRAGYNKQW HPTCFVCAKC SEPLVDLIYF WKDGAPWCGR 301 360 HYCDSEKPRC AGCDELIFSN EYTQAENQNW HLKHFCCFDC DSILAGEIYV MVNDKPVCKP HYCESLRPRC SGCDEIIFAE DYQRVEDLAW HRKHFVCEGC EQLLSGRAYI VTKGQLLCPT 361 420 CYVKNHAVVC QGCHNAIDPE VQRVTYNNFS WHASTECFLC SCCSKCLIGQ KFMPVEGMVF CSKSKRS 421 430 CSVECKKRMS

CR domein, PET domein, LIM domeinen

1

2.

Bijlage 2 – De gebruikte primerparen en combinaties van restrictie enzymen voor de aanmaak van de LMCD1 GFP domeinconstructen LMCD1 construct

Primerpaar Forward: 5’-CCGCTCGAGATGGCAAAGGTGGCTAAGG-3‘

LMCD1 FL GFP

Reverse: 5’-CGACCGGTACGGAGCGTTTGGA CTTGCTG-3’ Forward: 5’-CGCTCGAGAACCATGGCAAAGGTGGCTAAGG-3’

LMCD1 NT GFP

Reverse: 5’-GGACCGGTACTTCCACTTCTTTGGACGGGTC-3’ Forward: 5’-CGCTCGAGAACATGTACGTCTGCGAGCTCTG-3’

LMCD1 2-LIM N GFP

Reverse: 5’-CGACCGGTACGGAGCGTTTGGACTTGCTG-3’ Forward: 5’-CCTCGAGGATCCAACATGTACGTCTGCGAGCTCTGCAAG-3’

LMCD1 2-LIM C GFP

Reverse: 5’-CGGGAATTCTCAGGAGCGTTTGGACTTGC Forward 1: 5’-CGCTCGAGAACCATGGCAAAGGTGGCTAAGG-3’

LMCD1 ΔPET GFP

Reverse 1: 5’-CTCCTCCTT GGA ACC CCGGTTCCTCTTGTAAATCC-3’ Forward 2: 5’-CAAGAGGAACCGGGGTTCCAAGGAGGAGGGGAAGCAGC-3’ Reverse part 2: 5’-CGACCGGTACGGAGCGTTTGGA CTTGCTG-3’

Tabel 1 – De gebruikte “forward” en “reverse” primers voor de aanmaak van de LMCD1 GFP domeinconstructen. LMCD1 construct

Restrictie enzymen 5’ einde: XhoI

LMCD1 FL GFP

3’ einde: AgeI 5’ einde: XhoI

LMCD1 NT GFP


LMCD1 2-LIM N GFP


LMCD1 2-LIM C GFP LMCD1 ΔPET GFP

3’ einde: EcoRI 5’ einde: XhoI 3’ einde: AgeI

Tabel 2 – De gebruikte restrictie enzymen voor de aanmaak van de LMCD1 GFP domeinconstructen.

2

3.

Bijlage 3 – De gehanteerde eiwitsequenties en het bijhorende NCBI Reference Sequence nummer voor het uitvoeren van de fylogenetische analyse

Naam sequentie

NCBI Reference Sequence

Homo sapiens TES

NP_056456.1

Mus musculus TES

NP_997059.1

Gallus gallus TES

NP_989954.1

Anolis TES

XP_003221259.1

Taeniopygia guttatta TES

XP_002193627.2

Xenopus silurana TES

NP_001004961.1

Latimera chalumnae TES

XP_005996750.1

Danio rerio TES

NP_991283.2

Homo sapiens LMCD1

NP_055398.1

Mus musculus LMCD1

NP_659048.1

Gallus gallus LMCD1

XP_414443.2

Taeniopygia guttatta LMCD1

XP_002187314.2

Anolis LMCD1

XP_003226820.1

Xenopus silurana LMCD1

NP_001096323.1

Latimera chalumnae LMCD1

XP_005987999.1

Danio rerio LMCD1

NP_957364.2

Caenorhabditis elegans TES1

NP_501190.1

Drosophila melanogaster TES

NP_611215.1

Strongylocentrotus purpuratus TES isoform 3

XP_798924.3

Ciona intestinalis TES

XP_002123524.1

Tabel 3 – De gebruikte eiwitsequenties voor het uitvoeren van de fylogenetische analyse. Voor iedere sequentie wordt de naam gegeven en de NCBI Reference Sequence nummer.

3

4.

Bijlage 4 – Protocol voor SDS-PAGE en Western Blotting

Concentratie BSA-standaarden voor eiwitconcentratiebepaling Standaard

Volume BSA-stockopl.

Volume H2O

[BSA]Finaal

S0

9,32 µL

190,68 µL

0,066172 mg/mL

S1

15,64 µL

184,36 µL

0,111044 mg/mL

S2

23,5 µL

176,5 µL

0,16685 mg/mL

S3

39,16 µL

160,84 µL

0,278036 mg/mL

S4

65,2 µL

134,8 µL

0,46292 mg/mL

Samenstelling 10% seperation gel (40 mL, 4 gels)      

15,8 mL MQ H20 13,4 mL 30% acrylamide mix 10 mL 1,5 M Tris pH 8,8 0,4 mL 10% SDS (Sodium-Dodecyl Sulfate) 0,4 mL 10% ammoniumpersulfaat 0,016 mL TEMED (tetramethylethyleendiamine)

Samenstelling 5% stacking gel (6 mL, 3 gels)      

4,08 mL MQ H2O 1,02 mL 30% acrylamide mix 0,78 mL 1 M Tris pH 6,8 0,06 mL 10% SDS 0,06 mL 10% ammoniumpersulfaat 0,006 mL TEMED

Protocol       

Bereken het volume cellysaat dat overeenstemt met de gewenste hoeveelheid eiwitmateriaal Voeg een 5x sample buffer toe Giet de Western-Blot houder gedeeltelijk vol met loopbuffer Laad de verschillende samples op de gel Giet de Western-Blot houder volledig vol met loopbuffer Sluit de gel vervolgens aan op een stroom van 25mA Maak een Western-Blot ‘sandwich’ in een vat met blotbuffer. Stapel van ‘onder’ naar boven’: 4

           

het witte deksel van de ‘sandwich’-houder een sponsje 2x een Whatman-papier een nitrocellulosemembraan de Western-Blot gel 2x een Whatman-papier een sponsje het zwarte deksel van de ‘sandwich’ houder Plaats de ‘sandwich’ in de Western-Blot houder Giet de Western-Blot houder volledig vol met blotbuffer Plaats de sandwich onder een spanning van 50V (1h30) Steek de nitrocellulosemembraan in een plastic zakje en vul dit met 3 mL blocking buffer Leg dit zakje op een schuddende plaat voor 1h Voeg primair antilichaam toe in de gewenste concentratie (opgelost in blocking buffer) Incubeer overnacht bij 4°C Was de membraan 3x in PBS-Tween voor 5 minuten Voeg secundair antlilichaam toe in de gewenste concentratie (opgelost in blocking buffer) Incubeer voor 45 minuten (donker) Was de membraan 3x in PBS-Tween en 1x in MQ H2O voor 5 minuten Droog de membraan en scan in

5

5.

Bijlage 5 – Datafolders op de CD-rom

Folder 1 – iCelligence_experiments -

-

-

-

iCelligence_exp1  iCelligence_exp1_data  iCelligence_exp1_statistiek iCelligence_exp2  iCelligence_exp2_data  iCelligence_exp2_statistiek iCelligence_exp3  iCelligence_exp3_data  iCelligence_exp3_statistiek iCelligence_lineaire regressie

Folder 2 – Alternatieve_spreidingsassay -

-

Data_file Boxplots_and_statistics TES_frames  1 h 10 cells (2).jpg.frames  1 h 10 cells.jpg.frames  1 h 13 cells.jpg.frames  1 h 15 cells.jpg.frames  3 h 8 cells.jpg.frames  3 h 9 cells.jpg.frames  3 h 11 cells (2).jpg.frames  3 h 11 cells.jpg.frames  3 h 14 cells (2).jpg.frames  3 h 14 cells.jpg.frames LMCD1_frames  1 h 3 cells.jpg.frames  1 h 5 cells.jpg.frames  1 h 8 cells (2).jpg.frames  1 h 8 cells.jpg.frames  1 h 10 cells.jpg.frames  3 h 3 cells.jpg.frames  3 h 5 cells.jpg.frames  3 h 6 cells.jpg.frames  3 h 7 cells (2).jpg.frames 6

-

 3 h 7 cells (3).jpg.frames  3 h 7 cells.jpg.frames  3 h 9 cells.jpg.frames Monomeric_GFP_frames  1 h 6 cells.jpg.frames  1 h 7 cells (2).jpg.frames  1 h 7 cells.jpg.frames  1 h 8 cells.jpg.frames  1 h 10 cells (2).jpg.frames  1 h 10 cells.jpg.frames  1 h 11 cells.jpg.frames  1 h 16 cells.jpg.frames  4 h 5 cells (2).jpg.frames  4 h 5 cells.jpg.frames  4 h 6 cells.jpg.frames  4 h 7 cells (2).jpg.frames  4 h 7 cells.jpg.frames  4 h 10 cells (2).jpg.frames  4 h 10 cells (3).jpg.frames  4 h 10 cells.jpg.frames

Folder 3 – Fluorescence stainings -

-

-

-

LMCD1_FL_GFP_stains  24h_stain  48h_stain  low_concentration_stain LMCD1_NT_GFP_stains  24h_stain  48h_stain LMCD1_2LIM_GFP_stains  N_terminal_GFP  C_terminal_GFP LMCD1_dPET_GFP_stains

7

Identificatie en validatie van de domeinspecifieke interactiepartners van de mogelijke tumor-promotor LMCD1

Recommend Documents