Validatie. van. moleculaire identificatie- en detectiemethoden van. Aphelenchoides fragariae, A. ritzemabosi, A. subtenuis en A

Validatie van moleculaire identificatie- en detectiemethoden van Aphelenchoides fragariae, A. ritzemabosi, A. subtenuis en A. besseyi (als aanvulling of als alternatief voor morfologische identificatie en detectie)

Validatierapport FES (WP3)

©2011, Lisse, Wageningen Validatierapport samengesteld door:

Dr. Joop van Doorn, Ing. Khanh Pham, ir. Robert Dees: PPO, Sector Bloembollen, Boomkwekerijgewassen & Fruit, Email: [email protected]; Dr. Hans Helder, ing. Paul Mooijman, Wageningen Universiteit, Laboratorium voor Nematologie, Email: [email protected]; Dr. Renske Landeweert, ir. Peter Veenhuizen, BLGG AgroXpertus, Email: [email protected]

VALIDATIERAPPORT Identificatie en detectie van Aphelenchoides fragariae, A. ritzemabosi, A. subtenuis en A. besseyi.

Inhoud

pagina

1.

Onderwerp en doel ........................................................................................................................ 3

2.

Samenvatting ................................................................................................................................ 3

3.

Conclusies ..................................................................................................................................... 4

4.

Scope / Specificaties / Analysemonster ........................................................................................ 5

5.

Werkwijze ...................................................................................................................................... 5

6.

Materiaal, referentie en kwaliteit ................................................................................................... 5

7.

Bepaling prestatiekenmerken ........................................................................................................ 7

8.

Bijlage 1: Beschikbaar biologisch materiaal ................................................................................ 18

9.

Bijlage 2: Schema bepaling prestatiekenmerken ........................................................................ 19

10.

Bijlage 3: Informatie 18S primerontwerp ..................................................................................... 20

11.

Bijlage 4: Q-PCR protocollen ...................................................................................................... 22

12.

Bijlage 5. Q-PCR resultaten voor herhaalbaarheid&reproduceerbaarheid ................................. 23

2


1.

Onderwerp en doel

Hoewel het geslacht Aphelenchoides een aantal belangrijke plantenparasieten omvat, is het gros onschuldig; de meeste Aphelenchoides soorten zijn schimmeleters. Het lastige van dit geslacht is (1) dat er meer dan honderd beschreven soorten zijn, en (2) dat deze soorten onder de microscoop bijzonder moeilijk uit elkaar te houden zijn. Bladaaltjes komen wereldwijd voor en worden veelal aangetroffen in de bodem, in bladmateriaal en bladresten, en in (veelal door kevers) aangetast houtig materiaal. Veel van de soorten zijn niet adequaat omschreven, en het is de vraag of ze überhaupt bestaan. Er is echter wel een grote behoefte aan alternatieve identificatie-methodes, omdat op dit moment geen goed onderscheid gemaakt kan worden tussen veelal onschuldige schimmeletende Aphelenchoides soorten en schadelijke plantenparasitaire leden van dit geslacht. In de praktijk is de kans dus zeer reëel dat er partijen plantmateriaal worden afgekeurd of besmet verklaard op basis van de aanwezigheid van totaal onschadelijke Aphelenchoides-soorten. Dit is niet wenselijk, en in dit FES perceel (onderdeel van FES programma ‘Versterking infrastructuur plantgezondheid’) is gekeken of soorten op DNA niveau wel van elkaar te onderscheiden zijn. Door beoogde eindgebruikers zijn vier target species geïdentificeerd: A. fragariae, A. subtenuis, A. ritzemabosi en A. besseyi. In de bloembollensector ondervinden veel siergewassen schade van de bladaaltjes A. fragariae (Af, het aardbeienbladaaltje, meer dan 500 waardplanten waaronder lelie, Fritellaria, Eremus, Dahlia en Nerine), A. ritzemabosi (Ar, het chrysantenbladaaltje, in Anemone, aster, anjer, Delphinium, lelie, Phlox) en A. subtenuis (As, het krokusknolaaltje, Colchicum, Gloriosa, krokus, narcis, Allium, Camassia, Chionodoxa). In tegenstelling tot A. besseyi (een quarantaineaaltje in aardbei en rijst) worden zij regelmatig aangetroffen in o.a. bloembolgewassen. In samenwerking met de nVWA, divisie Plant, is gezocht naar de doelorganismen en ‘close nontargets’; Aphelenchoides-soorten die niet plantenparasitair zijn, maar wel in Nederland (NW Europa) voorkomen. Op deze manier willen we er zo zeker mogelijk van zijn dat de toekomstige detectiemethoden specifiek zijn, en geen vals-positieve signalen geven. Afgezien van de DNA barcoding resultaten maakt de huidige moleculaire karakterisering duidelijk dat het geslacht Aphelenchoides zeer aan revisie toe is. Het is een kunstmatige groep (= zowel para- als polyfyletisch), en de resultaten van dit onderzoek zullen ook bijdragen aan vernieuwde indeling van deze aparte groep van plantenparasitaire aaltjes. Onderliggend validatierapport geeft weer hoe de methodevalidatie is uitgevoerd ter validatie van bovengenoemde detectietesten. 2.

Samenvatting

Onderliggend validatie-rapport geeft de resultaten weer van de methodevalidatie van verschillende ITS en 18S gebaseerde primerparen die zijn ontwikkeld voor de identificatie en detectie van Aphelenchoides ritzemabosi, A. fragariae, A. subtenuis en A. besseyi. Omdat biologisch materiaal van A. subtenuis en A. besseyi zeer schaars was werden de experimenten ten behoeve van het bepalen van de prestatiekenmerken noodgedwongen uitgevoerd met enkel A. ritzemabosi en A. fragariae, De prestatiekenmerken ‘juistheid’ en ‘robuustheid’ zijn wel uitgevoerd met materiaal van alle vier soorten Aphelenchoides. Uit de resultaten blijkt dat ten aanzien van het kenmerk ‘juistheid’ het goed mogelijk om één individueel bladaaltje te detecteren en tevens te onderscheiden van de andere soorten aaltjes. Voor detectie bleek alleen bij de reactie van A. ritzemabosi-primers (ITS) met A.fragariae een aspecifieke reactie op te treden. Gezien de hoge Ct-waarden en de afwijkende smeltcurve is dit geen probleem voor dit kenmerk. Ten aanzien van prestatiekenmerk ‘meetbereik’ blijkt dat DNA van 1000 individuen van A.fragariae en A.ritzemabosi prima gedetecteerd kunnen worden met zowel methode A (ITS) als methode B (18S) (Ct waarden 22,72 en 26,21 resp. Ct waarden 22,63 en 21,33). Ook DNA van lage aantallen A.fragariae en A.ritzemabosi in water kan worden gedetecteerd (Ct waarden 31,99 en 37,73 voor methode A en Ct waarden 33,08 en 29,77 voor methode B). Deze conclusie wordt bevestigd bij de prestatiekenmerken ‘juistheid’ en ‘aantoonbaarheidsgrens’ waar zonder problemen één individueel bladaaltje in water wordt aangetoond. Daarnaast is het ook mogelijk om DNA van vijf aaltjes in een overmaat van DNA van een nauw verwante soort te detecteren.

3


De aantoonbaarheidsgrens, bepaald voor A. fragariae en A. ritzemabosi ligt rond de 3/1000 individu; uitgaande van gemiddeld 1000 lichaamscellen in een nematode is dit dus ongeveer 3 cellen. Hiermee is de grens van ten minste 1 nematode te kunnen aantonen ruimschoots gehaald. Om het prestatiekenmerk ‘specificiteit’ te toetsen is bepaald wat het signaal is van de niet-parasitaire Aphelenchoides-soort A. bicaudatus en D. dipsaci. De specifieke primersets van methode A en B toonden aan dat voor de verschillende bladaaltjessoorten geen D. dipsaci of andere bladaaltjes worden aangetoond; pas bij meer dan een miljoen aaltjes ligt het signaal even hoog als dat van één individu van A. fragariae of A. ritzemabosi. Selectiviteit: vijf A. fragariae of A. ritzemabosi aaltjes kunnen worden gedetecteerd in een achtergrond van ~ 1000 verwante andere Aphelenchoides-aaltjes. Het kenmerk ‘robuustheid’ laat zien of een variatie in PCR annealingtemperatuur (Ta) van plus of minus 1 ºC een effect heeft op de uitslag (Ctwaarde). Bij geen van de vier primermixen (ITS en 18S) is er uitval van Q-PCR signaal geconstateerd bij een Ta 1,0 ºC hoger of lager dan de normale Ta. Alle vier primermixen voldoen hiermee aan de eis beschreven in het validatie plan. Ten slotte bleek, dat de kenmerken ‘herhaalbaarheid’ en ‘reproduceerbaarheid’ voor zowel de A. fragariae als de A. ritzemabosi primers met methode A en B voor alle geteste monsters 100 % scoorden.

3.

Conclusies

Alle hier ontwikkelde SYBRGreen Q-PCR testen, gebaseerd op ITS rDNA (methode A) en 18S rDNA (methode B) van de vier Aphelenchoides-soorten A. fragariae, A. subtenuis, A. ritzemabosi en A. besseyi voldoen aan de eisen die voortvloeien uit de scope. De soorten A. fragariae, A. subtenuis, A. ritzemabosi en A. besseyi zijn met deze testen te identificeren en kwalitatief te detecteren in een waterige nematodensuspensie. Dit is ook het geval in aanwezigheid van andere nematodensoorten die bij de extractie van bol / knol en of bladmateriaal van planten kunnen vrijkomen. De detectiegrens van één nematode in een suspensie van 1000 andere non target nematoden wordt ruimschoots gehaald.

4


4.

Scope / Specificaties / Analysemonster

Met de te valideren methoden moet het mogelijk zijn om: De soorten Aphelenchoides ritzemabosi, A. fragariae, A. subtenuis en A. besseyi te identificeren en kwalitatief te detecteren in een waterige nematodensuspensie. Hierbij moeten niet alleen de bovenstaande soorten onderling onderscheiden kunnen worden, maar moeten deze targets ook contrasteren met andere nematodensoorten die bij de extractie van bol / knol en of bladmateriaal van planten vrijkomen. Detectiegrens is één nematode in een suspensie van 1000 andere non target nematoden. Het isoleren van nematoden uit knol / bol / plant materiaal en het extraheren van DNA uit de nematodensuspensie maakt geen deel uit van deze validatie. In alle gevallen werd gebruik gemaakt van de DNA extractiemethode zoals in FES programma ‘Versterking infrastructuur plantgezondheid’ WP3, perceel 2, is uitgewerkt en gevalideerd. 5.

Werkwijze

Dit validatierapport omschrijft de validatie van twee nieuwe identificatie en kwalitatieve detectie methodes. Beide methodes zijn gebaseerd op soortkenmerkende ‘DNA sequence signatures’ zoals die gevonden zijn in het rDNA cistron van de relevante Aphelenchoides soorten. Voor het benodigde contrast zijn in de ontwikkelingsfase Aphelenchoides sequenties gegenereerd op basis van materiaal verschaft door PPO Lisse en nVWA, divisie Plant (Dr. Gerrit Karssen), zie bijlage 1. Methode A is in staat om Aphelenchoides ritzemabosi (Ar), A. fragariae, (Af) A. subtenuis (As) en A. besseyi (Ab) te identificeren (geviste aaltjes) en te detecteren tegen een achtergrond van duizenden terrestrische nematodensoorten (in silico). Methode A maakt gebruikt van ITS (Internal Transcribed Spacer) regio’s van het ribosomaal DNA (rDNA). Bij benadering A zijn specifieke Q-PCR primers ontwikkeld met verschillende annealing temperaturen welke te gebruiken zijn bij één temperatuur. Methode A maakt gebruik van Q-PCR in combinatie met SYBR Green detectie. Methode B is in staat om Aphelenchoides ritzemabosi (Ar), A. fragariae (Af), A. subtenuis (As) en A. besseyi (Ab) te identificeren en te detecteren tegen een achtergrond van 1,900 terrestrische nematodensoorten. Methode B maakt gebruik van het small subunit ribosomaal DNA (SSU rDNA of 18S rDNA). Bij benadering B zijn specifieke Q-PCR primers zo ontworpen dat ze alle een gelijke annealing temperatuur hebben. Methode B maakt gebruik van Q-PCR in combinatie met SYBR Green detectie. Bij het opstellen van dit validatieplan is de ‘Nationale richtlijn voor validatie van detectie- en identificatiemethoden voor plantpathogenen en plaagorganismen’ (NRL richtlijn, versie 2, 3 maart 2010) als leidraad gebruikt. Bij de beoordeling van het al dan niet voldoen van de verschillende prestatiekenmerken zal gekeken worden naar ∆Ct tussen doel- en niet-doelorganisme. Afhankelijk van de scope van de te valideren methode (te gebruiken voor identificatie dan wel detectie) wordt vastgesteld hoe groot ∆Ct hier bij voorkeur dient te zijn. In geval van een identificatiemethode zou ∆Ct kleiner mogen zijn (bijv. streefwaarde ∆Ct > 10) dan bij een detectiemethode (bijv. streefwaarde ∆Ct > 20). 6.

Materiaal, referentie en kwaliteit

Er was slechts beperkt referentiemateriaal beschikbaar voor de validatie van bovengenoemde detectiemethoden, met name biologisch materiaal van A. besseyi en A. subtenuis bleek schaars. In 2010 is door de nVWA (Dr. Gerrit Karssen) uit Turkije een in vitro cultuur verkregen van A. besseyi op wortel schijfjes (Tulek et al. 2009). Dit bleek uitstekend te werken; de vermeerdering van A. besseyi in dit kunstmatige systeem was boven verwachting hoog. Het meeste biologisch materiaal dat werd gebruikt in dit validatietraject was afkomstig uit de praktijk (praktijkmonsters afkomstig van nVWA en PPO). Determinaties werden uitgevoerd door PPO (A. subtenuis, A. fragariae) (Allen, 1952) en nVWA (A.besseyi, A.ritzemabosi). Zie verder bijlage 1, tabel 15.

5


Voor detectie van Aphelenchoides ritzemabosi (Ar), A. fragariae (Af), A. subtenuis (As) en A. besseyi (Ab) werden de primers gebruikt zoals weergegeven in Tabel 1A. Alle 18S primers zijn van Oligold® kwaliteit en zijn afkomstig van Eurogentec (www.eurogentec.com). Alle ITS primers zijn afkomstig van Biolegio (Nijmegen, Nederland). Zie Tabel 1B.

Tabel 1A. Q-PCR primers voor identificatie en detectie van verschillende Aphelenchoides-soorten.

1 2 3 4 5 6 7 8

Aphelenchoides soort

Target gen

Primer codes

A. subtenuis A. fragariae A. ritzemabosi A. besseyi A. subtenuis A. fragariae A. ritzemabosi A. besseyi

ITS ITS ITS ITS SSU rDNA SSU rDNA SSU rDNA SSU rDNA

A. sub For / Rev A. fra For / Rev A. ritz For / Rev A. bes For / Rev 1580F / 1582R 1470F / 1472R 1644F / 1495R 1760F / 1768R

Annealings temp 71 / 71 °C 73 / 70 °C 64 / 58 °C 60 / 60 °C 61 °C 61 °C 61 °C 61 °C

Produktgrootte 317 bp 424 bp 535 bp 469 bp

▼ Tabel 1B. Q-PCR primer-sequenties. Primer ID

Primer sequentie

Smelt temperatuur product

ITS A.sub For ITS A.sub Rev ITS A.fra For ITS A.fra Rev ITS A.ritz For ITS A.ritz Rev ITS A.bes For ITS A.bes Rev

TGA GAC AAT TCA GTC ACA CGA GAA

AGA AAA TGG TTA TTC GTC TCG GAA

CCG GGT TAG TTT AGT GAC CTG TAC

TCG AGC AGT GCC CAC AAC GTC GCC

ACA CCG CGC TCT ACA GCG TCT ACC

ACA ATC TCT CTC CCC GAC TCA AAA

SSU A.sub For (1580F) SSU A.sub Rev (1582R) SSU A.fra For (1470F) SSU A.fra Rev (1472R) SSU A.ritz For (1644F) SSU A.ritz Rev (1495R) SSU A.bes For (1760F) SSU A.bes Rev (1768R)

GTG GCC AAA TCA GGA CGG GCC CAT

GAC ATA AGT AAG CGG TAT AAT CAC

CCA ATA TCG TAA TAT TCA ACA CGA

AAA ACA TAG TCC TTT GTC TGC CCC

TTC TCT TTG GCA GCG CTA GAA GAA

ATA CAG GAT TCC T AGA CAG GG

TCA C CAA ATT GGC TT CGA TAA AA CC AT GC

CG TTTCTA AAT CAC C

82,1 °C 79.6 °C 86.3 °C 84.8 °C

90.0 °C 84.5 °C 87 °C 85.5°C

6


Bepaling prestatiekenmerken

A.

Juistheid

Juistheid: Het vermogen van de methode om te doen wat deze ‘zegt’ te doen. Met andere woorden: het vermogen van de methode om het doelorganisme binnen de matrix aan te tonen afgemeten aan een tweede methode, bij voorkeur gebaseerd op een andere techniek. Onder juistheid verstaan we hier: het vermogen van de Methodes A en B om Aphelenchoides soorten juist te identificeren en detecteren in een waterige nematodensuspensie van knol- / bol- / plantmateriaal, vergeleken met de referentiemethode (microscopische analyse van dezelfde monsters). Werkwijze: Voor identificatie werd één individuele nematode van elke soort uit een suspensie gevist en geanalyseerd met behulp van de microscoop (PPO: As, Af en nVWA: Ab, Ar). Vervolgens werd uit de microscopisch geïdentificeerde nematode DNA geëxtraheerd (uitvoering door BLGG, extractiemethode BLGG). Het gezuiverde DNA extract werd vervolgens opgesplitst in twee gelijke delen en op elk deel werden vier Q-PCR reacties uitgevoerd (met ITS primers door PPO, met 18S primers door BLGG). Voor detectie werden 5 nematoden (Ar en Af) kwalitatief aangetoond tegen een achtergrond van een Aphelenchoides-vrije suspensie. Er werd gebruik gemaakt van praktijkmateriaal (20 nematodensuspensies afkomstig uit praktijkmonsters), waaraan 5 individuele doelnematoden werden toegevoegd. Uit de hele nematodensuspensie werd vervolgens DNA geëxtraheerd (uitvoering door BLGG, extractiemethode BLGG). Het gezuiverde DNA extract werd vervolgens opgesplitst in twee gelijke delen en op elk deel werden vier Q-PCR reacties uitgevoerd (met ITS primers door PPO, met 18S primers door BLGG). Negatieve controle: Ditylenchus dipsaci. Resultaten: Resultaten zijn weergegeven in tabel 2 en 3. Tabel 2: Q-PCR analyse op DNA van geviste aaltjes in water. Aangegeven in cijfers zijn de Ct-waarden; N/A = geen Ct-waarde (negatief). Juistheid (bladaaltjes in water) Aph spp. Methode # aaltjes Af Ar Ab As D.dipsaci Af Ar Ab As D.dipsaci

A (ITS) A (ITS) A (ITS) A (ITS) A (ITS) B (18S) B (18S) B (18S) B (18S) B (18S)

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Af For/Rev Ct 31,91 N/A N/A N/A N/A 36,75 N/A N/A N/A N/A

Ar For/Rev Ct N/A 29,72 N/A N/A N/A N/A 38,49 N/A N/A N/A

Ab For/Rev Ct N/A N/A 29,2 N/A N/A N/A N/A 26,68 N/A N/A

As For/Rev Ct N/A N/A N/A 33 N/A N/A N/A N/A 31,05 N/A

7


Tabel 3: Q-PCR analyse op gezuiverd DNA van geviste aaltjes in een bladaaltjes-vrije nematodensuspensie. Aangegeven in cijfers zijn de Ct-waarden; N/A = geen Ct-waarde (negatief). Juistheid (bladaaltjes in achtergrond) Aph spp. Monster nr. # aaltjes

Methode A (ITS) Af For/Rev Ar For/Rev Ct Ct Af 6 5 32,23 38,10* Af 7 5 31,14 36,15* Af 8 5 31,58 37,00* Af 9 5 31,30 37,85* Af 10 5 32,38 36,42* Af 35 5 31,76 38,70* Af 36 5 31,68 36,63* Af 37 5 32,66 38,15* Af 38A 5 31,42 36,87* Af 38B 5 31,08 37,81* Ar 11 5 31,69 29,78 Ar 12 5 N/A 29,55 Ar 13 5 34,69 29,36 Ar 14 5 35,04 30,08 Ar 15 5 N/A 28,66 Ar 16 5 N/A 27,91 Ar 17 5 N/A 29,30 Ar 18 5 N/A 28,20 Ar 19 5 N/A 28,47 Ar 20 5 N/A 28,45 * smeltpatroon analyse laat zien dat dit een aspecifiek product is

Methode B (18S) Af For/Rev Ar For/Rev Ct Ct 34,00 N/A 33,25 N/A 33,09 N/A 33,25 N/A 32,57 N/A 32,60 N/A 32,72 N/A 32,34 N/A 32,31 N/A 32,91 N/A 34,33 37,67 N/A 36,53 36,92 36,26 37,22 35,78 N/A 35,40 N/A 34,44 N/A 35,39 N/A 34,75 N/A 34,24 N/A 34,62

Conclusies: Tabel 2 geeft resultaten voor de identificatie van één individuele Af, Ar, As en Ab. Hier blijkt dat het goed mogelijk is om één individueel bladaaltje te identificeren. In overweging moet genomen worden dat één nematode uit +/-1000 cellen bestaat (Kimble, 1979). Uit Tabel 3 blijkt dat een vijftal Af of Ar goed te detecteren zijn in DNA van een bladaaltjes-vrije nematodensuspensie. Uit dezelfde tabel 3 volgt dat de Ar primers goed onderscheid maken tussen DNA van een vijftal Af-aaltjes en DNA van een vijftal Ar-aaltjes, beiden in achtergrond DNA afkomstig van een bladaaltjes-vrije nematodensuspensie. Dit is alleen uitgezocht voor Ar en Af in verband met het niet voor handen zijn van voldoende nematoden van Ab en As. Echter, zowel de ITS als 18S Af primers geven een positief signaal bij monster 11, 13 en 14, terwijl dit negatief had moeten zijn. De waarschijnlijke oorzaak is, dat het in deze validatie gebruikte Ar materiaal een besmetting bevatte met Af. De reactie van Ar primers (ITS) met Af is een aspecifieke reactie gezien de hoge Ct-waarden en de afwijkende smeltcurve (niet weergegeven).

B.

Meetbereik

Meetbereik: Grenzen (onder- en bovengrens) waarbinnen de analyse betrouwbaar kan worden toegepast.

8


De scope geeft aan dat de ondergrens van detectie ligt op één nematode, terwijl de bovengrens wordt bepaald door het aantal Aphelenchoides-individuen dat in de praktijk uit bol / knol en of bladmateriaal van planten vrijkomt (hier stellen we – gebaseerd op PPO praktijkervaring – de bovengrens op 1000 individuen). Werkwijze: Met individuen van twee Aphelenchoides-soorten (Ar en Af) werden vier monsters gemaakt in water: twee monsters met 3 individuen van één soort en twee monsters met 1000 individuen van de ene soort en 5 individuen van de andere soort (uitvoering door PPO). Hieruit werd vervolgens DNA geëxtraheerd (uitvoering door BLGG, extractiemethode BLGG). Het gezuiverde DNA extract werd vervolgens opgesplitst in twee gelijke delen en op elk deel werden twee typen Q-PCR reacties uitgevoerd (met ITS primers door PPO, met 18S primers door BLGG). Het meetbereik werd op één toetsmoment vastgesteld, zie bijlage 1 van dit validatie-rapport. Resultaten: Resultaten zijn weergegeven in Tabel 4. Tabel 4: Q-PCR analyse op DNA van geviste Af en Ar aaltjes in een achtergrond van resp. 1000 Ar en 1000 Af aaltjes. Aangegeven in cijfers zijn de Ct-waarden; N/A = geen Ct-waarde (negatief). Meetbereik Af For/Rev Ar For/Rev Aph spp. Methode # aaltjes Ct Ct Af A (ITS) 3 33,08 37,59* Af A (ITS) 1000 + 5 Ar 22,63 29,12 Ar A (ITS) 3 N/A 29,77 Ar A (ITS) 1000 + 5 Af 24,85 21,33 Af B (18S) 3 31,99 N/A Af B (18S) 1000 + 5 Ar 22,72 35,05 Ar B (18S) 3 N/A 37,73 Ar B (18S) 1000 + 5 Af 23,07 26,21 * smeltpatroon analyse laat zien dat dit een aspecifiek product is Conclusies: Uit Tabel 4 blijkt dat DNA van 1000 Af en Ar prima gedetecteerd kunnen worden met zowel ITS als 18S primers (Ct waarden 22,72 en 26,21 18S; Ct waarden 22,63 en 21,33 ITS). Ook DNA van lage aantallen Af en Ar in water kan worden gedetecteerd (Ct waarden 31,99 en 37,73 18S; Ct waarden 33,08 en 29,77 ITS). Deze conclusie wordt bevestigd bij het prestatiekenmerk ‘juistheid’ en ‘aantoonbaarheidsgrens’ waar één individueel bladaaltje in water wordt aangetoond. Tabel 4 laat daarnaast ook zien dat het mogelijk is om DNA van vijf aaltjes in DNA van een nauw verwante soort te detecteren (Ct waarden 35,05 en 23,07 18S; Ct waarden 29,12 en 24,85 ITS) zie ook ‘selectiviteit’. Er moet hierbij worden opgemerkt dat Ct waarden van 23,07 (18S) en 24,85 (ITS) voor DNA van vijf Af aaltjes aan de lage kant is, zie hiervoor ook conclusie bij het prestatiekenmerk ‘juistheid’.

C.

Aantoonbaarheidsgrens

Aantoonbaarheidsgrens: Laagste concentratie van het doelorganisme in een laboratoriummonster waarvan de aanwezigheid nog met een bepaalde betrouwbaarheid kan worden vast gesteld.

9


Onder aantoonbaarheidsgrens verstaan we de laagste concentratie DNA van één individueel doelorganisme die nog voldoende is om tot een eenduidig positief Q-PCR signaal te komen. Werkwijze: Hiertoe werden dezelfde monsters gebruikt als die voor de juistheid werden gemaakt (Tabel 2): één monster met één individuele Ar en één monster met één individuele Af, waaruit DNA werd geëxtraheerd (uitvoering door BLGG, extractiemethode BLGG). Het gezuiverde DNA extract werd vervolgens opgesplitst in twee gelijke delen. Op verdunningsreeksen (in duplo gemaakt) van elk deel werden QPCR reacties uitgevoerd (met ITS primers door PPO, met 18S primers door BLGG). De aantoonbaarheidsgrenzen werden op één toetsmoment vastgesteld, zie bijlage 1 van dit validatierapport. Resultaten: Resultaten zijn weergegeven in Tabel 5. Tabel 5: Q-PCR analyse op verdund DNA van bladaaltjes gevist in water voor de bepaling van de aantoonbaarheidsgrens. Aangegeven in cijfers zijn de Ct-waarden; N/A = geen Ct-waarde (negatief). Aantoonbaarheid Aph spp. verdunning

Methode A (ITS) Methode B (18S) Af For/Rev Ar For/Rev Af For/Rev Ar For/Rev Ct Ct Ct Ct Af 50 32,71 33,71 Af 50 33,04 34,36 Af 250 36,55 N/A Af 250 35,23 34,64 Af 1250 N/A N/A Af 1250 N/A 38,02 Af 6125 N/A N/A Af 6125 N/A N/A Ar 50 28,78 36,04 Ar 50 28,17 35,52 Ar 250 31,04 36,68 Ar 250 30,11 N/A Ar 1250 34,01! N/A Ar 1250 32,27! N/A Ar 6125 38,91* N/A Ar 6125 38,79* N/A * smeltpatroon analyse laat zien dat dit een aspecifiek product is ! meerdere pieken in smeltcurve Conclusies: In Tabel 5 staan Q-PCR resultaten op een verdunningreeks van Af DNA en Ar DNA. In groen is aangegeven wanneer er positieve Q-PCR signalen werden gemeten. In twee gevallen werden aspecifieke producten waargenomen en in twee gevallen werden meerdere pieken in de smeltcurve gezien, wat mogelijk duidt op aanwezigheid van ‘primer dimers’. Met behulp van deze resultaten kan de aantoonbaarheidsgrens worden bepaald in de onderstaande formule: Aantoonbaarheidsgrens = (gemiddelde nog aan te tonen hoeveelheid + 3 * standaarddeviatie).

10


De aantoonbaarheidsgrens voor de 18S Af test wordt: 3,1 E-03 deel van een aaltje. Gesteld dat een nematode uit 1000 cellen bestaat, dan zou dit overeenkomen met ong. 3 cellen. De aantoonbaarheidsgrens voor de 18S Ar test wordt: 2,8 E-03 deel van een aaltje. Voor de PPO is de aantoonbaarheids grens voor zowel de Af test als de Ar test 2,4 E-04 deel van een aaltje.

D.

Specificiteit

Specificiteit: Het vermogen van een detectiemethode om het doelorganisme te onderscheiden van andere (al dan niet verwante) organismen en de mate waarin de analyse (bekende) varianten van het organisme kan onderscheiden. Onder specificiteit wordt hier verstaan het vermogen van een test om de vier target soorten (Ar, Af, As en Ab) van elkaar te onderscheiden en van andere nematodensoorten die redelijkerwijs zouden kunnen voorkomen in een waterige nematodensuspensie van knol / bol / plant materiaal. Werkwijze: Om de specificiteit te toetsen werd het volgende gedaan: ITS primers voor detectie van Ar en Af: Primers voor Ar zullen worden getest op biologisch materiaal van Af en vise versa. ITS primers voor As en Ab: Wegens gebrek aan biologisch materiaal zal de specificiteit slechts in silico kunnen worden getoetst. Alle ITS primers zullen ook worden getoetst op kruisreactie met biologisch materiaal van het stengelaaltje (Ditylenchus dipsaci). 18S primers voor detectie van Ar, Af, As en Ab: Primers zullen worden getest op plasmide DNA van de andere drie Aphelenchoides soorten die hier onderwerp van studie zijn en daarnaast op relevante niet-doelorganismen die uit analyse in ARB naar voren komen. Alle 18S primers zullen ook worden getoetst op kruisreactie met biologisch materiaal van het stengelaaltje (Ditylenchus dipsaci). Resultaten: Zie Tabel 6 - 9 in bijlage 3 voor resultaten 18S specificiteitstoetsing. De validatieresultaten van het kenmerk Specificiteit van de ITS testen zijn vermeld in Hfd A, Juistheid (Tabel 2). Conclusies: Uit Tabel 6 – 9 blijkt, dat het verschil in Ct waarden tussen het Aphelenchoides Q-PCR signaal en het Q-PCR signaal van DNA van relevante niet-doelorganismen minimaal 20 is (18S). Uit Tabel 6 volgt dat ∆Ct waarde van Af versus A. bicaudatus = 20,12. Dit betekent dat ongeveer 2 (20,12) = 1,1 miljoen A. bicaudatus -aaltjes hetzelfde signaal afgeven als 1 Af aaltje. In de praktijk komen zulke hoge aantallen niet voor. Hetzelfde argument geldt ook voor de andere niet-doelorganismen (sommigen met nog hogere ∆Ct waarden, zie Tabel 7). De resultaten van specificiteit van de ITS Aphelenchoides-testen staan vermeld in Hfd A, Juistheid (Tabel 2). Hier is te zien dat met de specifieke primersets voor de verschillende bladaaltjes soorten geen D. dipsaci of andere bladaaltjes worden aangetoond.

E.

Selectiviteit / matrixeffecten

Selectiviteit: Het vermogen van een detectiemethode om het doelorganisme te onderscheiden van andere componenten van het monster. In dit validatietraject is geen of nauwelijks sprake van matrix effecten. Uitgangspunt zijn waterige nematodensuspensies van knol / bol / plant materiaal. Het leek ons niet relevant om te testen of verschil-

11


lende bollensoorten / knollen / bladmateriaal een specifiek en afwijkend effect zouden hebben op het nematodenlysaat. Naar verwachting zal daar geen enkel systematisch verschil worden aangetroffen. Wel is hier de selectiviteit van de primers getest: vijf individuen van Af werden aangetoond in 1000 individuen van Ar en vise versa. Hiertoe werden met individuen van deze twee Aphelenchoidessoorten monsters gemaakt in water: twee monsters met 1000 individuen van de ene soort en 5 individuen van de andere soort (uitvoering door PPO). Hieruit werd vervolgens DNA geëxtraheerd (uitvoering door BLGG, extractiemethode BLGG). Het gezuiverde DNA extract werd vervolgens opgesplitst in twee gelijke delen en op elk deel werden twee Q-PCR reacties uitgevoerd (met ITS primers door PPO, met 18S primers door BLGG). De selectiviteit werd op één toetsmoment vastgesteld, zie bijlage 1 van dit validatierapport. Resultaten: Resultaten zijn weergegeven in Tabel 10. Tabel 10: Q-PCR analyse voor bepaling van de selectiviteit. Aangegeven in cijfers zijn de Ct-waarden,; N/A = geen Ct-waarde (negatief). Selectiviteit Aph spp. Methode # aaltjes Af A (ITS) 1000 + 5 Ar Ar A (ITS) 1000 + 5 Af Af B (18S) 1000 + 5 Ar Ar B (18S) 1000 + 5 Af ! meerdere pieken in smeltcurve

Af For/Rev Ct 24,85! 22,63 23,07! 22,72

Ar For/Rev Ct 21,33 29,12 26,21 35,05

Conclusies: Uit Tabel 10 blijkt dat bij de gangbare 10x verdunning vijf Af of Ar aaltjes kunnen worden gedetecteerd in een achtergrond van ~ 1000 verwante andere Aphelenchoides-aaltjes. Hierbij moet worden opgemerkt dat Ct waarden van 23,07 (18S) en 24,85 (ITS) voor DNA van drie Af aan de lage kant is, zie hiervoor ook conclusie van Hfdst. A (Juistheid). In twee gevallen werden meerdere pieken in de smeltcurve gezien, wat mogelijk duidt op aanwezigheid van ‘primer dimers’.

F.

Robuustheid

Robuustheid: De mate van ongevoeligheid van het meetresultaat voor afwijkingen in uitvoering, omstandigheden en hoedanigheid van materialen, zoals deze in de praktijk voorkomen. Werkwijze: De robuustheid van de ontwikkelde primers hangt mede af van hun gevoeligheid voor mogelijke variaties in annealingstemperatuur (Ta). Fabrikanten van PCR apparatuur gaan meestal uit van een mogelijke temperatuurspreiding rond de ingestelde Ta van ± 0.5 ºC. Deze variatie in Ta kan het presteren van de primerparen mogelijk (negatief) beïnvloeden. Om de gevoeligheid van de verschillende primerparen te testen voor mogelijke (onbedoelde) variaties in Ta, zullen alle primers (in aanwezigheid van het juiste doel-DNA) worden blootgesteld aan een temperatuurgradiënt rond de optimale Ta (in elk geval 1 graad hoger en 1 graad lager dan Ta). Resultaten: Resultaten zijn weergegeven in Tabel 11 en 12.

12


Tabel 11. Robuustheidbepaling van 4 Aphelenchoides primermixen (Methode A: ITS). Resultaten zijn weergegeven als Ct waarden bij temperatuurgradiënt (Ta). Monster

Primermix

Af

Af

Ar

Ar

As

As

Ab

Ab

Ta (ºC)

Ct

59,00 60,00 61,00 59,00 60,00 61,00 59,00 60,00 61,00 59,00 60,00 61,00

32,83 31,91 32,55 30,46 29,72 30,16 33,00 33,00 33,58 28,64 29,20 28,58

13


Tabel 12. Robuustheidbepaling van 4 Aphelenchoides primermixen (Methode B: 18S). Resultaten zijn weergegeven als Ct waarden bij temperatuurgradiënt (Ta). Nr Monster + clone nr 1 2 3 4 Af 1966 5 6 7 8 9 10 11 12 Ar 1960 13 14 15 16 17 18 19 20 As 1856 21 22 23 24 25 26 27 28 Ab 2160 29 30 31 32

Primermix

Af

Ar

As

Ab

Ta (ºC)

Ct

65,00 64,80 64,20 63,30 62,00 61,10 60,50 60,00 65,00 64,80 64,20 63,30 62,00 61,10 60,50 60,00 65,00 64,80 64,20 63,30 62,00 61,10 60,50 60,00 65,00 64,80 64,20 63,30 62,00 61,10 60,50 60,00

24,20 21,14 17,38 15,14 14,54 15,09 15,19 15,85 58,26 47,36 35,12 24,57 19,55 18,72 18,71 18,98 32,12 24,62 18,88 14,05 12,65 12,46 12,78 12,94 14,13 13,72 12,74 12,13 11,87 12,02 12,15 12,42

Conclusies: Bij geen van de vier primermixen is er uitval van Q-PCR signaal geconstateerd bij een Ta 1,0 ºC hoger of lager dan de normale Ta van 61 ºC. Alle vier primermixen worden hiermee voldoende robuust bevonden. Bij een annealingtemperatuur van ong. 65 oC geeft de primermix van Ar geen betrouwbare Ct-waarde meer (groen aangegeven in Tabel 12), maar valt dus ruimschoots binnen de gestelde robuustheidseis.

14


G.

Statistische kenmerken: Herhaalbaarheid en Reproduceerbaarheid

Herhaalbaarheid: De mate van overeenstemming tussen de resultaten van opeenvolgende metingen van dezelfde meetgrootheid, die onder dezelfde meetomstandigheden zijn verricht. Voor het bepalen van de herhaalbaarheid moeten metingen aan een laboratoriummonster uitgevoerd worden door dezelfde uitvoerder, met dezelfde meetapparatuur en binnen een zo klein mogelijk tijdsinterval. Reproduceerbaarheid: De mate van overeenstemming tussen de resultaten van metingen van dezelfde meetgrootheid, die onder verschillende meetomstandigheden zijn verricht. Onder meetomstandigheden worden tijd, apparatuur (meetinstrument) en uitvoerder verstaan. Voor het bepalen van de reproduceerbaarheid worden analyses uitgevoerd op meerdere toetsmomenten en bij voorkeur op meerdere apparaten en door meerdere uitvoerders. Werkwijze voor toetsen van herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid: Vanwege de beperkte beschikbaarheid van biologisch materiaal zal gewerkt worden met twee Aphelenchoides-soorten. Deze toets is naar verwachting representatief voor de andere soorten, aangezien het in alle redelijkheid niet te verwachten is dat herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid per primerpaar of nematodensoort zullen verschillen. Werkwijze: Er zullen 8 natuurlijke suspensies worden geselecteerd, waarvan vier met een natuurlijke besmetting van het doelorganisme (bij voorkeur twee met een hoge concentratie - en twee met een lage concentratie van het doelorganisme). Deze suspensies worden met de microscoop bekeken (door PPO), alvorens bij BLGG geëxtraheerd te worden. BLGG zal vervolgens de helft van de gezuiverde extracten terugsturen naar PPO. Aanvullend zullen vier natuurlijke suspensies (vrij van Aphelenchoides spp.) worden toegevoegd met resp. 2, 4, 6 en 10 individuele aaltjes van het doelorganisme (door PPO). Deze vier monsters worden vervolgens door BLGG geëxtraheerd. BLGG zal vervolgens de helft van de gezuiverde extracten terugsturen naar PPO. PPO en BLGG zullen vervolgens de DNA extracten opsplitsen in drie gelijke porties en volgens het schema in bijlage 2, PCR testen uitvoeren (op verschillende dagen en door twee verschillende analisten). Resultaten: Voor Q-PCR resultaten (Ct waarden) zie bijlage 5, Tabel 16 en 17. Voor resultaten prestatiekenmerken zie Tabel 13 en 14.

15


Tabel 13. Prestatiekenmerken herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van Af.

Monster lab monster 1 lab monster 2 lab monster 3 lab monster 4 lab monster 5 lab monster 6 lab monster 7 lab monster 8

# Af 2 4 6 10 300 300 30 30

Methode A (ITS) voor Af Herh.1 Herh.2 Repro + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Methode B (18S) voor Af Herh.1 Herh.2 Repro + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Tabel 14. Prestatiekenmerken herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van Ar.

Monster lab monster 1 lab monster 2 lab monster 3 lab monster 4 lab monster 5 lab monster 6

# Af 2 4 6 10 185 30

Methode A (ITS) voor Ar Herh.1 Herh.2 Repro + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Methode B (18S) voor Ar Herh.1 Herh.2 Repro + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Conclusies: Voor zowel de 18S als ook voor de ITS testen geldt: De herhaalbaarheid van de A. fragariae test is 100%; 16 van de 16 monsters zijn positief. De herhaalbaarheid van de A. ritzemabosi test is 100%; 12 van de 12 monsters zijn positief De reproduceerbaarheid van de A. fragariae test is 100%; 24 van de 24 monsters zijn positief. De reproduceerbaarheid de A. ritzemabosi test is 100%; 18 van de 18 monsters zijn positief.

16


H.

Literatuur 1. NRL richtlijn: Nationale richtlijn voor validatie van detectie- en identificatiemethoden voor plantpathogenen en plaagorganismen’, versie 2 (3 maart 2010) 2. Chizhov V.N., Chumakova O.A., Subbotin S.A. & Baldwin J. G. 2006. Morphological and molecular characterization of foliar nematodes of the genus Aphelenchoides: A. fragariae and A. ritzemabosi (Nematoda: Aphelenchoididae) from the Main Botanical Garden of the Russian Academy of Sciences, Moscow. Russian Journal of Nematology 14: 179-184. 3. McCuiston JL, Hudson LC, Subbotin SA, Davis EL, Warfield CY. 2007. Conventional and PCR Detection of Aphelenchoides fragariae in Diverse Ornamental Host Plant Species. J Nematol. 39(4): 343-355. 4. Tulek, A., Kepenekci, I., Cobanoglu, S., Hekimhan, H., Devran, Z., Melik, B., Elekcioglu, H.I. 2009. A new culturing method for the rice white tip nematode, Aphelenchoides besseyi Christie, 1942, on carrot discs. Russian Journal of Nematology 17(2): 143 -144. 5. Vovlas, N. Minuto, A. Garibaldi, A. Troccoli, A. Lamberti, F.2006. Identification and histopathology of the foliar nematode Aphelenchoides ritzemabosi (Nematoda: Aphelenchoididae) on basil in Italy. Russian Journal of Nematology17(2) p:1436. Kimble J, Hirsh D (June 1979). "The postembryonic cell lineages of the hermaphrodite and male gonads in Caenorhabditis elegans". Dev. Biol. 70 (2): 396–417. 7. Allen, M.W. 1952. "Taxonomic status of the bud and leaf nematodes related to Aphelenchoides fragariae (Ritzema Bos, 1891)." Proc. Helminth. Society of Washashington. 19:108120.

17


7.

Bijlage 1: Beschikbaar biologisch materiaal

Er zijn verschillende isolaten gedurende 2009 en begin 2010 aangeleverd, behalve Ab (Tabel 15). Er zijn ook enkele isolaten van Af (uit pioenroos) en As (uit narcis) ontvangen via Diagnostiek Service van PPO. Tabel 15. Beschikbare isolaten van Aphelenchoides spp. Nr. (Date) Genus/Species/Origin Nr. (Date) (19-03-09) WU (26-11-09) Aphelenchoides 2091 2575 Aphelenchoides 2127 2579 Aphelenchoides 2131 2583 Aphelenchoides 2135 (06-01-10) Aphelenchoides 2138 2611 Aphelenchoides saprophilus 2141 2627 Aphelenchoides c.f bicaudatus 2638 2146 Aphelenchoides subtenuis C1 2643 Aphelenchoides fragariae C2 2709 D. dipsaci (neg. controle) (2009) A..subtenuis controle DNA C1 (27-01-09) A. subtenuis controle DNA C2 A. fragariae controle DNA C1. (24-06-09) A. fragariae controle DNA C2

Genus/Species WU A. ritzemabosi A. fragariae A. fragariae A. subtenuis A. cfr. breviutoralis A. composticola A. sp.1 A. sp.2

18


8.

Bijlage 2: Schema bepaling prestatiekenmerken

Invulling voor de gezamenlijke bepaling van verschillende prestatiekenmerken. laboratoriummonster

prestatiekenmerk

Toetsmoment 1 2 3 4

Natuurlijk besmet monster 1 herhaalbaarheid/ reproduceerbaarheid xx

5

6

7

8

x

Natuurlijk besmet monster 2

herhaalbaarheid/ reproduceerbaarheid x


herhaalbaarheid/ reproduceerbaarheid

xx

x



x

xx

Laboratoriummonster 5


xx

x



x

xx



xx

x



x

xx

Laboratoriummonster nabij Aantoonbaarheid aantoonbaarheidsgrens Referentiemateriaal Monster(s)/monster(s) afwijkende matrix

Juistheid met Selectiviteit

Monster(s)/monster(s) met Robuustheid afwijkende omstandigheden X XX

xx

x x x x

: enkelvoudige bepaling : duplobepaling in herhaalbaarheidsomstandigheden

19


9.

Bijlage 3: Informatie 18S primerontwerp

Tabel 6: Overzicht van Q-PCR analyse op plasmid DNA voor bepaling van specificiteit van 18S Af test. Resultaten zijn weergegeven als Ct waarden. Nematode soort + clone nr. AchoSp3_2126_Aphelenchoides_sp3_F1

Ct waarde 17,90

AchoFra1_2579_Aphelenchoides_fragariae_1_1964

18,66

AchoFra2_2583_Aphelenchoides_fragariae_2_1966

16,16

ChoFra3_2586_Aphelenchoides_fragariae_3_1968

18,59

AChoSp8_2709_Aphelenchoides_sp8_2054

N/A

AnopSp2_1093_Anoplostoma_sp2_R8

N/A

SympSp1_1279_Symplocostoma_sp1_1371 PratPen1_No_number_Pratylenchus_penetrans_1_(Pp3)_1459

45,02 N/A

AnomXen1_748_Anomyctus_xenurus_1_951

42,99

AChoSp1_46_Aphelenchoides_1_227

48,19

AChoSp5_2134_Aphelenchoides_sp5_F5

49,26

AChoSap1_2140_Aphelenchoides_saprophilus_1_F9

57,89

AChoBicZ 2145 Aphelenchoides cf bicaudatus 1 F11

38,78

Neopmag1_454_Neopsilenchus_magnidens1_640

43,37

Tabel 7: Overzicht van Q-PCR analyse op plasmid DNA voor bepaling van specificiteit van 18S Ar test. Resultaten zijn weergegeven als Ct waarden. Nematode soort + clone nr. AChoRit1_2575_Aphelenchoides_ritzemabosi_1 1960

Ct waarde 17,98

AChoRit2_2576_Aphelenchoides_ritzemabosi_2 1962

18,58


46,66


44,47

PTylStr2_291_Paratylenchus_straeleni_2_396

N/A

RotySp1_405_Rotylenchus_sp._JH-2004_528

N/A

LaimPen1_561_Laimaphelenchus_penardi1_825

N/A

AnomXen1_748_Anomyctus_xenurus_1_951 GeomVil1_776_Geomonhystera_villosa1_1007 Globsp4_884_Globodera_sp4_BLGG_60798_1064

42,94 N/A 44,29

OgmaMen1_1118_Ogma_menzeli_1_1232

N/A

SteiGla2_1420_Steinernema_glaseri_2_1435

N/A

AChoCom1_2638_Aphelenchoides_composticola_1_2016

N/A

SynoSp1_1038_Synonchiella_sp1_P90

43,49

Onchfamil1_1055_Oncholaimidae_sp1_P26

43,32

20


Tabel 8: Overzicht van Q-PCR analyse op plasmid DNA voor bepaling van specificiteit van 18S As test. Resultaten zijn weergegeven als Ct waarden. Nematode soort + clone nr.

Ct waarde

AchoSub1_2293_Aphelenchoides_subtenuis_1_1856

12,76

AChoSub9_2649_Aphelenchoides_subtenuis_9_2023

13,30

AChoSub8_2628_Aphelenchoides_subtenuis_8_2077

12,40

GranSp1_541_Granonchulus_sp1_818

N/A

AlaiPar1_480_Alaimus_parvus1_685

N/A

TyloTyp2_174_Tylolaimophorus_typicus_2_1911

N/A

PlChSp2_Plectonchus_sp1_842

N/A

AChoRit1_2575_Aphelenchoides_ritzemabosi_1_1961

N/A


N/A

DiPeSp1_1045_Diplopeltula_sp1_P101

N/A

HeDeGoe1_1126_Heterodera_goettingiana_1_1245

N/A

PratNeg1_1315_Pratylenchus_neglectus_1_H17

N/A

AChoRit2_2576_Aphelenchoides_ritzemabosi_2_1963

N/A

AnomXen1_748_Anomyctus_xenurus_1_952

N/A

Tabel 9: Overzicht van Q-PCR analyse op plasmid DNA voor bepaling van specificiteit van 18S Ab test. Resultaten zijn weergegeven als Ct waarden. Nematode soort + clone nr.

CT waarde

AchoBes2_2781_Aphelenchoides_besseyi_2_2160

13,48

AchoBes1_2780_Aphelenchoides_besseyi_1_ 2158

13,13

AscoElo2Z_1069_Ascolaimus_cf_elongatus_2_p38 ClavTro1_269_Clavicaudoides_trophurus_1_486

N/A N/A

PcyaInt3_2217_Paracyatholaimus_intermedius_3_ 2146

N/A

EthmPra1_569_Ethmolaimus_pratensis1_888

N/A

RotyUni1_650_Rotylenchus_uniformis_857

N/A

AcLoTho1Z_2681_Acrobeloides_cf_thornei_1_2036

N/A

DoGaMac2_2279_Domorganus_macronephritices_2_1845

N/A

PGBeSta1_2211_Panagrobelus_stammeri_1_1820

N/A

TripFil1Z_81_Tripyla_cf_filicaudata_1_150

N/A

AchoCom1_2638_Aphelenchoides_composticola_1_2016

56,56

DeDeDur1_2148_Deladenus_durus_1_1766

N/A

AchoRit2_2576_Aphelenchoides_ritzemabosi 1962

N/A

21


10.

Bijlage 4: Q-PCR protocollen

Onderstaande protocollen, apparatuur en reagentia werden gebruikt bij de validaties: 1. Protocol ITS Q-PCR primers: Apparatuur: Real time cycler MX3000P Stratagene PCR-reagentia: Briljant II SYBER Green Q-PCR MasterMix (cat. no EA 600828, Stratagene). Primermix: MQ Mastermix primer 1 primer 2 Template

9.5 µl 12.5 µl 1 µl (10µM) 1 µl (10µM) 1 µl

NB: template is 1 microliter van het lysaat (40 microliter) van 1 nematode, 10 x verdund PCR programma: 95 °C 10 min 95 °C 30 sec 60 °C 60 sec 72 °C 60 sec

-

40 cycli

2. Protocol 18S Q-PCR primers: Apparatuur: MyiQ iCycler Bio-Rad PCR reagentia: iQ-sybrgreen, Westburg Absolute SYBR Fluoroscein Mix No AB-1220/B Primermix: Alle 18S primer combinaties: MQ 7.5 ul iQ-sybrgreen 12.5 ul primer 1 1 µl (5µM stock = 200nM end conc.) primer 2 1 µl (5µM stock = 200nM end conc.) Template 3 µl (plasmid 10pg/µl) PCR programma: Alle 18S primer combinaties: 95°C 15 min 1* 95°C 30 sec 60* 61°C 60 sec 72°C 30 sec

22


11.

Bijlage 5. Q-PCR resultaten voor herhaalbaarheid&reproduceerbaarheid

Tabel 16. Resultaten van Q-PCR analyses (methode A en methode B) voor het bepalen van prestatiekenmerken herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van Af.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

lab monster 1 lab monster 1 lab monster 1 lab monster 2 lab monster 2 lab monster 2 lab monster 3 lab monster 3 lab monster 3 lab monster 4 lab monster 4 lab monster 4 lab monster 5 lab monster 5 lab monster 5 lab monster 6 lab monster 6 lab monster 6 lab monster 7 lab monster 7 lab monster 7 lab monster 8 lab monster 8 lab monster 8

# Af 2 2 2 4 4 4 6 6 6 10 10 10 300 300 300 300 300 300 30 30 30 30 30 30

Herh/Repro Herh Herh Repro Herh Herh Repro Herh Herh Repro Herh Herh Repro Herh Herh Repro Herh Herh Repro Herh Herh Repro Herh Herh Repro

ITS Ct 32,27 33,11 33,27 32,95 33,51 34,39 33,92 32,43 33,32 34,45 34,47 31,58 23,23 24,41 26,46 26,05 25,93 23,26 29,24 29,38 32,00 31,57 31,26 29,47

18S Ct 32,99 32,78 33,59 34,63 33,68 31,28 32,92 33,11 33,00 32,77 32,75 31,50 24,75 24,62 24,83 25,09 24,57 24,66 28,30 28,58 29,04 28,93 28,95 27,27

23


Tabel 17. Resultaten van Q-PCR analyses (methode A en methode B) voor het bepalen van prestatiekenmerken herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van Ar.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

lab monster 1 lab monster 1 lab monster 1 lab monster 2 lab monster 2 lab monster 2 lab monster 3 lab monster 3 lab monster 3 lab monster 4 lab monster 4 lab monster 4 lab monster 5 lab monster 5 lab monster 5 lab monster 6 lab monster 6 lab monster 6

# Ar 2 2 2 4 4 4 6 6 6 10 10 10 185 185 185 30 30 30

Herh/Repro Herh Herh Repro Herh Herh Repro Herh Herh Repro Herh Herh Repro Herh Herh Repro Herh Herh Repro

ITS Ct 30,71 30,21 26,82 29,09 28,29 30,35 28,08 27,62 24,93 25,49 26,27 28,23 23,94 24,42 21,93 22,74 23,22 25,73

18S Ct 32,99 32,78 33,55 34,55 34,29 34,45 31,60 31,25 31,72 36,24 35,27 31,57 26,40 26,31 26,47 28,58 28,30 29,15

24

Validatie. van. moleculaire identificatie- en detectiemethoden van. Aphelenchoides fragariae, A. ritzemabosi, A. subtenuis en A

Recommend Documents