15
Jurnal Bioteknologi Pertanian, Vol. 10, bronchitis No. 1, 2005, pp.lapang 15-23 Indonesia Hubungan kekerabatan virus infectious isolat
Hubungan kekerabatan virus infectious bronchitis isolat lapang Indonesia Genetic relationships of infectious bronchitis virus field isolates from Indonesia NLP.I. Dharmayanti1, W. Asmara2, W.T. Artama2, R. Indriani1, dan Darminto3 2
1 Balai Penelitian Veteriner, Jalan R.E. Martadinata Nomor 30, Kotak Pos 52, Bogor 16114, Indonesia Pusat Antar Universitas, Universitas Gadjah Mada, Jalan Teknika Utara, Barek 55281, Yogyakarta, Indonesia 3 Balai Pengkajian Teknologi Pertanian Jawa Timur, Jalan Raya Karangploso km 4, Kotak Pos 188, Malang 65101, Indonesia
ABSTRACT
PENDAHULUAN
Infectious bronchitis is a contangius and acute respiratory disease in chickens caused by infectious bronchitis virus (IBV). Antigenic differences in IBV are associated with changes in the sequence of the spike glycoprotein (S). The hypervariable region (HVR) of S1 of two isolates (I-14 and I-269) were identified and compared with reference isolates of Mass41 and Conn using RT-PCR and sequence analysis. The gene sequences were analyzed by GenMac V.8.0 and compared with IBV references from GeneBank to know genetic relationship among IBV. The result showed that about 310-630 bp segment located in the S1 gene portion of I-14 and I-269 was amplified. Phylogenetic analysis suggested that the isolates were different to other isolates included Mass41 and Conn. The isolate I-269 and I-14 were Indonesia local isolates.
Virus infectious bronchitis (IB) termasuk dalam famili Coronaviridae, berbentuk pleomorfik walaupun umumnya rounded. Virus ini mempunyai amplop berdiameter sekitar 120 nm dengan club-shaped surface projections (spikes) yang panjangnya sekitar 20 nm. Spike tidak dikemas seperti rodshapes dari paramyxovirus (Cavanagh dan Naqi 1997). Virus IB mengandung tiga protein virus utama yang spesifik yaitu spike glycoprotein (S), glikoprotein membran (M), dan protein nucleocapsid internal (N). Protein yang keempat adalah small membrane protein (sM) yang dihubungkan dengan amplop virion. Protein S terdiri atas dua atau tiga kopi yang masing-masing mempunyai dua glikopolipeptida S1 dan S2 (berturutturut sekitar 520-620 asam amino). Hemaglutinationinhibiting (HI) dan sebagian besar virus netralisasi (antibody virus-neutralizing) diinduksi oleh S1 (Koch et al. 1990; Cavanagh et al. 1992; Kant et al. 1992; Karaca et al. 1992; Parr dan Collison 1993). Perbedaan antigenik di antara serotipe virus IB berkaitan dengan adanya variasi struktural dari protein S, suatu struktur peplomerik pada permukaan amplop virus. Subunit S1 menunjukkan variasi urutan nukleotida yang lebih tinggi dibandingkan dengan subunit S2 (Binns et al. 1986), dan S1 dikenal sebagai daerah hipervariabel (HVR-1 dan HVR-2). Virus IB menginfeksi ayam pada segala umur dan menyebabkan kerugian pada industri peternakan di dunia. Virus ini menyebabkan penyakit pernapasan, menurunkan kualitas dan produksi telur, dan mengakibatkan kematian pada kasus yang nefritis (McMartin 1993). Virus IB dapat bermutasi secara cepat dan menjadi strain yang berbeda secara antigenik, begitu pula
[Keywords: Bronchitis, viruses, field isolates, genetic relationships, Indonesia]
ABSTRAK Infectious bronchitis adalah penyakit pernapasan yang kontangius dan akut pada ayam yang disebabkan oleh virus infectious bronchitis (IB). Perbedaan antigenik di antara serotipe virus IB berkaitan dengan variasi struktural dari spike glycoprotein (S). Daerah hipervariabel (hypervariable region) gen S1 dari dua isolat lapang (I-14 dan I-269) diidentifikasi dan dibandingkan dengan isolat referens Mass41 dan Conn dengan menggunakan reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) dan analisis urutan nukleotida. Sekuen nukleotida dianalisis dengan menggunakan GenMac V.8.0. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat I-14 dan I-269 dapat diamplifikasi dan menghasilkan amplikon sekitar 310630 bp. Analisis pilogeni menunjukkan bahwa isolat I-269 dan I-14 berbeda dengan isolat IB lainnya termasuk isolat referen Mass41 dan Conn, sehingga kemungkinan merupakan isolat lokal Indonesia. [Kata kunci: Bronchitis, virus, isolat lapang, hubungan kekerabatan, Indonesia]
16
NLP.I. Dharmayanti et al.
patogenisitasnya atau muncul kelainan pada jaringan (Cook 1984; King 1988; Lucio dan Fabricant 1990; Gelb et al. 1991). Sering kali dalam satu serotipe dapat diisolasi strain yang berbeda (Davelaar et al. 1984; Cook dan Huggins 1986; El Houadfi et al. 1986; Avellaneda et al. 1994). Beberapa serotipe virus IB telah diketahui dan mempunyai perbedaan secara praktis dalam pengendalian penyakit IB, karena imunitas yang mengikuti infeksi atau vaksinasi dengan satu serotipe biasanya tidak protektif terhadap infeksi serotipe yang berbeda kerabatnya. Hal ini mungkin yang menyebabkan vaksinasi IB di Indonesia kadang mengalami kegagalan. Serotipe yang digunakan sebagai vaksin umumnya termasuk dalam serotipe Mass41, seperti H120, yang kemungkinan berbeda dengan virus penyebab wabah IB di lapangan. Beberapa virus IB isolat lapang Indonesia adalah I-37 dan I-269 yang diisolasi oleh Darminto (1992) dan isolat I-14 yang diisolasi Indriani dan Darminto (2000). Dharmayanti et al. (2003) menyatakan bahwa isolat I-37 termasuk dalam serotipe Connecticut yang mengalami mutasi setelah virus berada di lapangan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan kekerabatan isolat lapang virus IB Indonesia dengan strain lainnya. Informasi yang diperoleh diharapkan bermanfaat bagi pelaku industri peternakan dalam penentuan dan penggunaan vaksin IB yang sesuai dengan kondisi di Indonesia.
BAHAN DAN METODE Isolat virus yang digunakan dalam penelitian ini adalah dua jenis virus IB isolat lapang yaitu I-14 dan I-269. Perbanyakan virus IB dilakukan pada telur ayam specific pathogen free (SPF) berembrio umur 9-11 hari (Burlesom et al. 1992) yang diperoleh dari PT Vaksindo Satwa Nusantara. Cairan alantois dari telur berembrio yang telah diinokulasi dengan virus IB, disentrifugasi dengan kecepatan 500 x g selama 15 menit. Supernatan kemudian dipindahkan ke dalam tabung ultrasentrifugasi. Pelet virion diperoleh dengan melakukan sentrifugasi 93.000 x g pada suhu 4oC selama 3 jam (Wang dan Khan 2000). Ekstraksi RNA dilakukan dengan metode yang telah diuraikan terdahulu (Dharmayanti et al. 2002; 2003). Ekstrak RNA diresuspensi dalam 20 µl DEPC-treated water. Konsentrasi RNA dihitung dengan spektrofotometer menggunakan rumus OD260 x 40 x faktor pengenceran (ng/µl) (Sambrook et al. 1989).
Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) dilakukan dengan menggunakan Ready to go RT-PCR kit (Amersham Pharmacia) dengan program yang telah dioptimasi pada penelitian terdahulu. Primer yang digunakan adalah CK4/CK2 (Cybergene AB). Primer CK4 (forward) memiliki total panjang 23 bp dengan urutan TCAAAGCTTCANGGNGGNGCNTA dan primer CK2 (reverse) total panjangnya 25 bp dengan urutan CTCGAATTCCNGTRTTRTAYTGRCA (Kingham et al. 2000). Program RT-PCR yang digunakan untuk isolat I-14 adalah reaksi reverse transcriptase (RT) pada suhu 42oC selama 30 menit, 95 oC selama 4 menit, sedangkan pada reaksi PCR, denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik, annealing pada suhu 50oC selama 1 menit dan ekstensi pada suhu 72oC selama 1 menit serta final ekstensi pada suhu 72oC selama 15 menit dengan siklus PCR 35 kali. Untuk isolat I-269 optimasinya sama dengan isolat I-14, hanya berbeda pada suhu annealing yaitu 48 o C (Dharmayanti et al. 2002). Hasil RT-PCR dipurifikasi dan pengurutan nukleotida dilakukan di Lembaga Molekuler Eijkman, Jakarta. Pengurutan nukleotida dilakukan dengan menggunakan mesin sequencer ABI PRISM model 377. Urutan DNA dianalisis dengan Genetic Mac (GenMac) V.8.0. HASIL DAN PEMBAHASAN RT-PCR dan pengurutan daerah hipervariabel Gen S1 Daerah hipervariabel pada subunit S1 diamplifikasi dengan menggunakan primer CK2/CK4. Amplifikasi isolat I-14 dan I-269 dengan menggunakan primer CK2/CK4 menghasilkan amplikon yang terletak pada 310-600 bp, sedangkan amplikon dari virus IB referens Mass41 dan Conn terletak pada sekitar 630 bp (Gambar 1). Hasil ini memperlihatkan bahwa amplikon yang dihasilkan isolat I-14 dan I-269 berbeda dengan yang dihasilkan virus IB referens Mass41 dan Conn. Hasil penelitian ini tidak sejalan dengan Darminto (1992) yang melaporkan bahwa I-269 secara serologi termasuk dalam serotipe Mass41. Namun, Indriani dan Darminto (2000) melaporkan bahwa isolat I-14 secara serologi berbeda dengan isolat Mass41, Conn maupun I-269. Berdasarkan hal ini, I-14 diduga kuat merupakan isolat lokal Indonesia. Namun pada penelitian ini untuk isolat I-269, setelah diketahui urutan nukleotidanya dan dilakukan perbandingan pada daerah hipervariabel gen S1 antara isolat IB Indonesia dan strain IB lain (Gambar 2), memperlihatkan hasil yang berbeda dengan uji serologi yang telah dilakukan.
17
Hubungan kekerabatan virus infectious bronchitis isolat lapang Indonesia
630 bp
s
310 bp
s
Gambar 1. Hasil RT-PCR daerah hipervariabel gen S1 virus IB dengan primer CK2/CK4; MW = bobot molekul, 1= IB I-14, 2 = IB 1-269, 3 = IB Mass41, 4 = IB Conn, 5 = kontrol negatif. Fig. 1. Agarose gel electrophoresis of RT-PCR product of hypervariable region S1 gene by CK2/CK4 primer; MW = molecular weight, 1 = IB I-14, 2 = IB I-269, 3 = IB Mass41, 4 = IB Conn, 5 = negative control.
dari Australia yaitu Q3/88 (AIU51), N1/88 (U29450), N2/75 (AIU29523), dan N9/74 (AIU29452); dari Eropa yaitu H120 (M21970) dan D274 (X15832), serta dari Cina D41 (AF036937). Persentase homologi antara urutan nukleotida virus IB S1 isolat I-14 dan I-269 dengan virus IB S1 GeneBank dapat dilihat pada Tabel 1. Analisis homologi dengan GenMac V.0.8 untuk isolat I-14 dan I-269 memperlihatkan bahwa isolat lokal tersebut hanya mempunyai homologi nukleotida sekitar 48%. Ini berarti bahwa kedua isolat tersebut tidak berhubungan dekat, sesuai dengan hasil uji netralisasi yang mempertegas bahwa I-14 dan I-269 merupakan serotipe yang berbeda (Indriani dan Darminto 2000). Kedua isolat juga menunjukkan homologi kurang dari 50% terhadap semua isolat yang dianalisis. Analisis homologi I-14 dan I-269 dengan sekuen virus IB dari GeneBank
Protein S virus IB dipisahkan pada saat pascatranslasi dan menjadi bagian N-terminal S1 dan Cterminal S2. Diduga protein S1 berperan lebih penting dalam menginduksi respons imun protektif dibanding protein virion lainnya (Cavanagh et al. 1986). Subunit S1 mengandung epitop yang dapat menginduksi antibodi virus-netralisasi dan antibodi serotipe spesifik (Jia et al. 1996). S1 juga bertanggung jawab dalam penempelan sel dan penentuan jenis jaringan (Cavanagh 1983). Bagian N-terminal protein S1 merupakan daerah hipervariabel, baik pada serotipe yang berbeda maupun pada strain yang berbeda dalam serotipe yang sama (Jia et al. 1996). Sebagian besar determinan antigen dan serotipe berada dalam separuh dari Nterminal S1 (Kant et al. 1992; Jia et al. 1995). Hasil perbandingan beberapa strain virus IB (Kusters et al. 1989) dan Coronavirus lainnya (Holmes 1994) menunjukkan bahwa variasi asam amino pada protein S yang terbesar adalah dalam daerah N-terminal. Daerah hipervariabel yang mengandung epitop netralisasi diperkirakan berlokasi pada 56-59 bp dan 117-133 bp (Jia et al. 1996). Perbandingan urutan fragmen S1 hasil amplifikasi I-14 dan I-269 Hasil analisis urutan nukleotida isolat I-14 dan I-269 berturut-turut sebesar 394 dan 405 bp. Hasil ini kemudian dibandingkan dengan urutan gen S1 virus IB dari GeneBank, yaitu yang berasal dari Amerika Utara Ark DPI (AF006624), Ark 99 (L10384), SE17 (M99484), JMK (L14070), Gray (L14069), Fla-18288 (AF027512), Holte (L18988), Conn (L18990), dan Mass41 (M21883);
Tingkat homologi urutan nukleotida fragmen I-14 dengan Mass41 sangat rendah (45,5%). Dengan virus IB Conn, tingkat homologinya hanya 47,6% dan dengan H120 sebesar 48,8%. Hal ini menunjukkan bahwa isolat I-14 tidak mempunyai kekerabatan yang dekat dengan virus IB Conn, Mass41 maupun H120. Isolat I-14 hanya mempunyai nilai homologi paling dekat dengan virus IB N9/74 dari Australia dengan
Tabel 1. Persentase homologi nukleotida gen S1 virus IB isolat lapang. Table 1. Percentage of nucleotide homology of S1 gene of IBV field isolates. Virus IB I-14 I-37 I-269 D41 D274 Fla-18288 Gray Conn Ark99 Mass41 SE17 N2/75 Q3/88 Ark DPI H120 JMK N 9/74 Holte N 1/88
Homologi/Homology (%) 1-14 100 48 48 48,9 47,6 48,8 43,4 47,6 47,5 45,5 50 45,5 46,7 45,4 48,8 46,4 48,3 47,8 47,8
I-269 48 48 100 46,4 48 42,5 45,5 42,5 45 42,9 47,8 45 46,6 45,1 46,2 45,5 45,4 44,9 44,4
10 20 30
40 50 60 70 80 90 100
130
140 150 160
170
180
190
200
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - . . . . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - . . . . . . - . AA . . . . . . . . . . . . C . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
T TGGAG TAAG AA T T T CAG TG . . G . . . . - CG . G . . . . . . . . A . . . . . T . . . AA - - - T . . . . . - . T C A . . . . . . . C TGAG . . A . . . . . . . . G . . T . . . . . C .
- - - - - - - - G T G T TG T TAA TG . . . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T C . T . - - - . . . . . . - . . C . . . . . . . . A . . . T . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . .
FLA-18288
D274
D41
- - - - AG TAAG AA C T T TAG TG . . . . . . . - . G . G . . G . . . . . T . . . . . A . T TAG - - - T . . . . . - . T C G . . . . . A . C T . A . . . A . . . A . . . . G . . T . . . . . C .
T TGGAG CAAG AA T T T TAG TG . . G . . . . - . G . . . . C . . . . T T . . . . . A . . TAG - - - T . . . . . - . T C G . . . . . . G T . CAG . . A . . . . . C . . G . . T . . . . . . .
GRAY
T CAAAG T T TA AA TG T TGG TG . C . . . G . - A . . T . . . . . . . . A . . . . . TG T TGG AAG C . . A . . - . T C . . . . . . . . CG . A . T C T . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
N1/88
SE17
T TGGAG CAAG AA T T T TA C TG . . . . . . . - . G . . . . . . . . . . A . . . . . . T T TGG - - - T . . . . . - . . A C . . . . . A . C T T CG . . A . . . . . . . . A . . C . . . . . . .
T TGGAG TAAG AA T T T TAG TG . . G . . . . - . G . . . . . . . . . . A . . . . . . . C TG . - - - C . . . . . - . T C . . . . . . . . C T . A TG CA . . C . . C . . A . . T . . . . . . .
N9/74
N2/75
- - - - - - - - AG AA C T T T T C TG . . . . . . . - . G . G T . . . . . . . A . . . . . A T T . . . - - - T . . . . . - . T C . . . . . . . G C T CA CA . A . . . . . C . . G . . T . . T . . . .
TG G TAG T T TA AA T T T TAG TG . . G . . G . - AG . T . . . . . . . . A . . . . . TG T . GG AG C . . . . . . - . A A . . . . . . . . C . . . G . . A . . C . . . . . . . . . . . . . . . .
Q3/88
AG CAA T C CAA AG CA T C CA T T . C . T C . . G . . C . . . G . . . G T T T T T T . T . C C T T G TA . A . A . . A . T C C . AAGG C . . . . A C . . A . AA CA . TAA . G CA C . AAA .
HOLTE
GA TGAA CGAG AA CA TAAA CAAG . T . . T - GG . . T . G . . A T T - - - - . . . T . TA T G C T . A . . . . - T T T A . C . . A . . A T . A . T TA . CA G . . T . G . T TG . TG . G .
I-14
I-269
- - - - - - - - G T G T TG T TAA TG . . . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T C . T . - - - . . . . . . - . . C . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . .
- - - - - - - - AG AA T C T CAG TG . G G . C . . - AG . . . . C . . . . . T . . . . . A . T . AG - - - T . . . . . - . T C A . . . . . . G C . . A C T C T . . . . . . . . A . . C . . . . . . .
H120
ARKDPI
T TGGAG CAAG AA T C T TAG TG . . G . . . . - . G . . . . C . . . . T T . . . . . A . . TAG - - - T . . . . . - . T C G . . . . . . G T . CAG . . A . . . . . C . . G . . T . . . . . . .
TG G TGG T CG T G T TG T TAA TG . . . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T C . T . - - - . . . . . . - . . C . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
JMK
MASS41
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C T T C T T C - TA T AG C TA TGA CGG CA C CG CA A C C - - - AG G TA T - GG G T TGG T C TAG CAGA CAG T T T TG T A C TG CA CA C TG T A
C TA CAG TAAG AA T T T CAG TG . G G . C . . - AG . . . . C . . . . . T . . . . . A . T . AG - - - T . . . . . - . T C A . . . . . . G C . T C . T C T . . . . . . . . A . . T . . . . . . .
CONN
ARK99
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
120
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
D41
110
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - T T T T TA CGG AA T C TAG TAA TG CA - - - GG CA - CGA C TGGG TG TA C TG T CGG TG C T - A T T T A
FLA-18288
D274
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - T T T C TGAGG AA T A TAA TAA TG CA C C T GG CA - A T T C TGG T TG TG TGG C TGG TG C C - A T T T T
SE17
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A G TAG T TAA T G TGA C TA CAG AA T T TAA TAA TG CAG G C AG CG CA CAG T C C - TG TA C TG C TGG TG C T - A T TG G
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - TG CA G T TGA T CG T G TG T T TAA TA TAA C TAA TAA TG CAA A C GG TG - - - - C TGG T TG CA C TG T TGG T T C T - C T TG G
N2/75
N1/88
GRAY
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - TG CA G T TGA TA CA G TG T T TAA TG AGA C TAA TAA TG CAG T G GA TA - - - - G CA CG TG CA C TG C TGG TG C C - A T TG T
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A G TAG T TAA T A C T T C TA TGG AA T A CAA TAA TG CAG G T T C TA - A CAG TGAA TG TA C TG C TGG TG C T - A TA C A
Q3/88
N9/74
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - T CG TG T T A TA T TG A CAA GGAA TGG TG CGA A CG TA CA TA AAG C
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
I-269
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - CAAG GGG CG GGG C TAGA AGA C T C T G A TGA T C C TG C TG C T TGGA CA T T GA T TG C T TG GG C A
ARKDPI
I-14
HOLTE
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - TA TG CG G TAG T TAA T A T T T C TAG CG AA T C TAA TAA TG CAG G C T C T T - CA C C TGGG TG TA T TG T TGG TA C T - A T T C A
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
H120
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - T T T C TGAGG AA T A TAA TAA TG CA C C T GG CA - A T T C TGG T TG TG TGG C TGG TG C C - A T T T T
MASS41
JMK
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
GG T TGG CA T T TA CA TGGA GG T G C T TA TG CA G TAG T TAA T G TG T C TAG TG AAA A TAA TAA TG CAG G T A C TG - C C C CAAG T TG CA C TG C TGG TG C T - A T TG G
CONN
ARK99
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
18 NLP.I. Dharmayanti et al.
210
220
230
240
250
260 270
280
290
300
320
330
340
350
360
370
380
390
400
- - - - - . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . GG - - - - - - G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A TG C . . . A . . . . . . . . .
A - . . C . . CA . . . . . . . . . . . - - - . G . A . CG T TA A TA G T C - - - G T C C T . A T . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . T C . . . G . C . . . A . . T . . . T TA . . . . . G . .
GRAY
. - . . . . . . . . . . . . .
. - . . T . . . A . . . . . . . . . . . - - - . . . A - - - - - - A TA G CA - - - G T T - - - - - - . G . . T . . . . . C . . . . . . . . . G C . . . G . C . . . A . . T . . . . GA . . . . . G . .
. - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . - - - - - - - - - - - - - - . - - - - . A . . . . . . T . . . . . . . . . . . . TC . . . . . . . GC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
FLA-18288
D274
D41
. . . . . . . . . . . . - - - - - - - - - - - - - - . - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. - . . T . . C . . . GG . . TG T . T - - - . . . A - - - - - - - - - - - - - - - A TG G TG T T T CAA . T C . . . . . A . T . . . T . . . A . T C . . C . G . A . . TAGA T . . . . . . . G . .
. - . . T . . CA . . G . . . . . . . . . G . . G C . . A T G TA A TA A CG - - - . T T C T T . TA . A . . T . . . . . . . . . . . . T . G T C . . . T . . . . . T . . T . . . . . A . . . . . G . .
SE17
N2/75
N1/88
. - . . T . . . A . . G . . . . . . . . C C . . C . A . CG G TA A TA GA C - - - . TG G TG A T . . A . . T . . . . . . . . . . . . . . . C C . . . G . C . . . A . . . A . C . AA . . . . G . . .
C - . . T . . . A . . . . . . . . . . . - - - . . . A A CG G TA T - - - A C - - - . TA G T - - - T . G . . T . . . . . . . . . . . . . . . G C . . . G . C . . . A . . T . . A . AG . . . . G . . .
N9/74
. - C . T . . . A . . . . . . . . T . T . . . . . GA AGA G TG T TG T TGGG C . T T C TG A C T . A . . T . . . . . . . . . . . . . C . C C . . CG . C . . . A . . T . . . C TA . . A . . . . .
. - . . T . . . A . . GG C . TG C . T - - - . . . A - - - - - - - - - - - - - - - A TA GAG T T T CGG A T C T . . . . A . T . . . . . . . A . T C . . C . G TA . . TA . A . . . . . . . G . . .
. TGA C T . . A . C CA . C . C . . C . . CGG . A C C T GA TAA T T TA T TA TA CGA T A AAA . A C T . . G C . . A . . C . G AA . . T C . A T . C C . . AA . - . T . G T . . A . G T T C T
I-269
Q3/88
- - - . C . . . A . CA TG . . . G G T T T TGG T . C C - - - - - T T AA TG T TA T TGG T T . . . G C C T . . GG . C . A T T . T T CA CAA . G . . G A . . AA . . . A . CG C . G . . CGAG
I-14
HOLTE
. - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . - - - - - - - - - - - - - - . - - - - . A . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . GC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. - . . T . . . A . . G . . . . . . . . . . . C . T . . AA G TG C TA TG C - - - . TG G T . A C T . A . . T . . . . . . . . . . . . . . . T C . . . G . C . . . A . . T . . . . AG . . . . G . . .
ARKDPI
. - T . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - . . . A - - - - - - - - - - - - - - - A TG G C . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
MASS41
H120
. - . . T . . . A . . G . . . . . . . . . . . C . T . . AA G T CG TA CG C - - - . TG G T . A C T . A . . T . . . . . C . . . . . . . . . T C . . . G . C . . . A . . T . . . . AG . . . . G . . .
A - . . C . . CA . . . . . . . . . . . - - - . G . A . CG T TA A TA G T C - - - G T C T T . A T . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . T C . . . G . C . . . A . . T . . . T TA . . . . . G . .
JMK
T - A TA CG TG T T T C TG C TA TGAA A AAAG G - - - - - - - - - - - - - - C - - - - C G G C T T T T C T A TAA T T TA A CA G T T AG TG TAAA TAAG T A C C C TA C T T T TAA A T C
ARK99
CONN
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
310
. . . . . . . . . . . - - - - - -
. T . . . A . T . . . - - - - - - - - - - - T - . . G T . . . A . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . A G . . G T CA TGG . T CA . . . . . . T . . . . A . . T C TG . . . . . . . . . A . . CA
D274
D41
. T . . . A . T C . . - - - - - - - - - - - T - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . GG TAG GAG C TGG . C T T . . . . . . T . . . . A . . T C . . C . . T T . . . AGG C CA
. . . . . . . . . . . - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . AT . . . . . . . . . . . . . . .
FLA-18288
SE17
GRAY
. . . . C . . T . . - - - - - - - - - - - - A T . . . . . . . . . . . . . C . . T . . . . . C . T . T C . A G . . T T T C TGG . . C T . . C . . A T . G . . . . . T A A T . . A GG C . . AGG . G .
. T . . . A . C T . . - - - - - - - - - - - - T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . GA G CG G T T C T C . . AA T . . . . . . T . G . . A . . T . T T . . . . A . T CAGG . . .
N1/88
. T . . . . . . A . C - - - - - - - - - - - A - . . G T . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . G T . . G GAAA A A C . T T T . . . . . . T . . . . A . . T . TA . . . . A . . . . GG . . A
. T . . . A . T . . . - - - - - - - - - - - C - . . G T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . G G TAG TGG . T T T . . . . . . T . . . . G . . T A AG . . . . . . . . AGG . . A
N9/74
N2/75
. T . . CA . T . . . - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . C . T . . . G . . CG - - - - - - . C . . C . . . . . C T . . . . A . . T . TA . . . GA . A . AGG . CA
. T . . C . . . . . . GG TA G TG C TA C A . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . C . T . . . . A G CG GG C C CA . . A C . . . C . . . T . G . . . . . T A A T . . CGG . . . AGG . . .
Q3/88
I-269
HOLTE
TG GA . A . . . T C - - - - - - - - - - - - - AA CA . . C . C . . . G . . G . A . - - AA . . . GGGG . . G A TAA A A . . TA T . A . . . A C C . G T . AA . A . T T . A T T C TG . AG C . -
C . AG C CA T . . . - - - - - - - - - - - - - A CG G . A G C . C CA GA . T . A . G . . . . . A C TGG TGG A TAA TA . . T T T . A . . A . C C C CA . A T T . T T C . A . . . AG CG C . . G
I-14
. . . . . . . . . . . - - - - - - - - - - - - . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . G - - - - - - T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A TG C . . . A . . . . . . . . .
. T . . . A . T T C . - - - - - - - - - - - - TA . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . GA G CG GA T C TA . . A . T . . . . . . T . G . . A . . T C T T . . . . . . AG CGG . . A
ARKDPI
. . . . . . . . . . . - - - - - - - - - - - - . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - - - - TA TG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A TG C . . . A . A . . A . . . T
MASS41
H120
. T . . . A . T T C . - - - - - - - - - - - T - A . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . GA G CG GA T C TA . . A . T . . . . . . T . G . . A . . T C T T . . . . . . AG CGG . . A
. T . . . A . T C . . - - - - - - - - - - - T - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . GG CAG GAG C TGG . C T T . . . . . . T . . . . A . . T C T . . . . . . . A . AGG C CA
JMK
A C T T T T CAGA T - - - - - - - - - - - - A T TA CAG TG T T TG T TA CA CA T TG T TA TAAA CA TA - - - - - - A T GGG TG T C C TA TAA C TGG C T C CA T T C CA CAG CA T T C
ARK99
CONN
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
Hubungan kekerabatan virus infectious bronchitis isolat lapang Indonesia
19
410
420
430
440
450
460 470
480
490
500
. C . C . . - A . . . . . . . . . . . . CA A . . G . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . T T T . A . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
. . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - -
GRAY
FLA-18288
530
540
550
560
- - - - . . . . . . . . .T. . . . . . . . . . . . . . . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
. . .A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .G- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
FLA-18288
D274
D41
Gambar 2. Perbandingan daerah hipervariabel pada gen S1 virus infectious bronchitis isolat lapang dengan virus IB pada GeneBank. Fig 2. Comparison of hypervariable region of the S1 gene of field infectious bronchitis virus with that of IBV in GeneBank.
. . .A. . . . . . . . . . .C. . . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
N1/88
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T T T TG G TAA
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
N2/75
GRAY
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
N9/74
SE17
. . .A. . . . . . . .G. . . . . . . . . . . . .G- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Q3/88
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
HOLTE
I-269
. . .A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .G- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
H120
. . . AAG . . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
MASS41
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
JMK
I-14
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
ARK99
ARKDPI
TA A TG C TGG T GGA C C TA TA A C T T A TAAA G T TA T GAGAG AAG T TAAA G C C C TGG C T TA - - - - - - - - -
CONN
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | .
520
. . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . .A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
D41
510
GC . . . . - . . . . . . . . . . . . . A . G
D274
. . . . T . . . . . CC . . . . . . . C . . . . . C . . . . T T . . T . . . . . C . . . . . T . A . . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
. . . A . . - C . . . . . . . . . . . . AA C . . . G . T . . G . . . C . T . . . . . . A . . . . . A . A . . . . . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
G C . A . . - A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . G . . C . . . . . . . . . . . C . . . . . . . T T . . A . . . . . C . . C . . T . T . . . . . . . . G TGG . . . . . . . . . . . . . . .
SE17
. C . . . . - A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . G . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . TT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
N2/75
N1/88
. C . A . . - C . . . . . . . . . . . CAA C . . . G . . . . G . . C C . . . . . . . CA . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
C C . G . . - A . . . . . . . . C . . G CA A . . . . . T . . . . . . C . . . . . . . . . . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
HOLTE
N9/74
G C . . . . - A . . . . . . . . . . . . CA . . . . . . T . . G . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T T . . T . . . . . C . . A . . T . A . . . . . . . . G TG . A . . . . . . . . . C . . . .
I-269
Q3/88
. A GAA . T . GA . . C . T TGG . . . G . TG C . T TA . G . . C C . T CG C A C CA T . . C . TG . . . A T . A C TA . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
CG . . . . T C . . C C CA . G C . . . CA - . TG . . . A AGA . G CAG G . . CA . C . GAG . C . . C . T . TG C . C C . G CG - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
I-14
. . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . .A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . .A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
MASS41
G C . A . . - A . . . . . . . . . . . . . A . . . T . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . T . . . A . . . . . C T . T . . TGA . . . . . . . G T . G . . . . . . . . . . C C . . . .
. C . C . . - A . . . . . . . . . . . . CA A . . G . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . T T T . A . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
JMK
ARKDPI
GC . A . . - A . . . . . . . . . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
ARK99
H120
A T T T CA - G TG TG T TA A TAA T T T T A CA T C CG TA T A T T TA AA T GG TGA T C T TG T T T A CA C C T C T AA T GAG A C CA CA GA TG T TA CA T C TG CA GG TG T T TA T T T
CONN
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
20 NLP.I. Dharmayanti et al.
21
Hubungan kekerabatan virus infectious bronchitis isolat lapang Indonesia
tingkat homologi hanya sekitar 48,3% (Gambar 3). Indriani dan Darminto (2000) melaporkan bahwa isolat I-14 secara uji serum netralisasi tidak menunjukkan kekerabatan dekat dengan virus IB referens maupun dengan isolat lapang yang telah ditemukan. Dari hasil yang diperoleh, diduga I-14 adalah isolat lokal Indonesia. Analisis urutan nukleotida isolat I-269 menunjukkan homologi yang rendah dengan virus IB Mass41, 0,0036
Conn, dan H120 berturut-turut sekitar 42,9%, 42,5%, dan 46,2%. Dengan uji netralisasi, isolat I-269 mempunyai kekerabatan dekat dengan Mass41 (Darminto 1992), tetapi pada penelitian ini tidak menunjukkan hal demikian karena I-269 hanya mempunyai homologi nukleotida 42,9% dengan Mass41. Beberapa isolat virus IB yang diketahui mempunyai kesamaan 97% dengan isolat Dutch D274 berdasarkan uji VN merupakan serotipe yang berbeda.
D41
0,0099 H120 0,0021
0,0032 Mass41 0,0142 0,0122
Fla-18228
0,0058 Conn 0,0224 0,0054 I-37 0,0251 0,0021
0,0836 0,0386
I-14
N9/74
0,0094
0,0288 I-269 0,0806
0,0375
0,0696 0,0043
D274
N2/75 0,0147
0,0532 0,0094 0,0413 0,0174
Gray JMK
0,0162 SE17 0,0546 0,0040
0,0146
Ark DPI Ark 99
0,0101
0,0130 Holte 0,0606 0,0565
0,0510 0,0441
N1/88
Q3/88 0,0541
Gambar 3. Phylogenetic tree virus infectious bronchitis dengan metode Neighbour-joining menggunakan GenMac versi 8.0. Fig. 3. Phylogenic tree of infectious bronchitis virus by Neighbour-joining method in GenMac version 8.0.
22 Temuan ini dan hasil pengurutan VN-antibody monoclonal-escape mutants memperkirakan hanya sedikit epitop S1 yang menginduksi sebagian besar antibodi virus netralisasi, dan sedikit mutasi pada epitop ini mungkin menghasilkan perubahan dan terbentuknya serotipe baru (Cavanagh dan Naqi 1997). Hal ini diduga yang menyebabkan I-269 secara serologi termasuk dalam Mass41 karena kemungkinan urutan nukleotida pada daerah hipervariabel 127-708 merupakan epitop dominan yang mempunyai kemiripan tinggi antara Mass41 dan I-269. Jadi I-269 kemungkinan adalah isolat lokal Indonesia. Cavanagh et al. (1992) menyebutkan bahwa sebagian besar epitop yang menginduksi antibodi virus netralisasi dibentuk oleh sedikit asam amino dan terjadi pada satu dan tiga perempat subunit S1. Selanjutnya dinyatakan bahwa penelitian IB berdasarkan serologi seharusnya diikuti dengan analisis urutan nukleotida atau antibodi monoklonal. Setelah dilakukan penelitian lanjutan terhadap isolat I-269, ternyata isolat ini merupakan isolat lokal, seperti halnya I-14. Hasil perbandingan urutan nukleotida menunjukkan bahwa isolat lapang I-14 dan I-269 mempunyai perbedaan yang nyata, yaitu terdapat mutasi dan penyisipan beberapa nukleotida jika dibandingkan dengan isolat Mass41, Conn, dan H120 ataupun dengan isolat IB lainnya (Gambar 2). Hasil analisis pilogeni (Gambar 3) memperlihatkan bahwa isolat I-14 dan I-269 berada dalam kelompok yang berbeda, baik dengan kelompok virus Mass, Conn maupun dengan virus IB lainnya. Isolat I-14 dan I-269 berada dalam kelompok tersendiri dan mempunyai kedekatan genetik dengan virus IB N9/74 dari Australia. Berdasarkan analisis pilogeni, isolat I-14 dan I-269 berbeda dengan isolat IB lainnya sehingga isolat I-14 dan I-269 kemungkinan merupakan isolat lokal. Analisis urutan nukleotida pada daerah hipervariabel gen S1 menunjukkan adanya homologi antara I-14 dan I-269 dengan virus IB referens dan virus IB H120 yang digunakan sebagai virus vaksin di Indonesia. Tingkat homologinya berturut-turut sebesar 48,8% dan 46,2%. Hasil ini membuktikan bahwa di lapangan terdapat virus IB isolat lokal Indonesia dan varian dari serotipe virus IB lainnya yang berbeda dengan virus IB yang terkandung dalam vaksin yang beredar di Indonesia. Oleh karena itu, mungkin diperlukan peninjauan ulang terhadap serotipe virus IB yang terkandung dalam vaksin yang beredar di Indonesia, karena tidak adanya proteksi silang di antara serotipe virus IB. Informasi hasil penelitian ini diharapkan dapat dimanfaatkan untuk memperbaiki virus vaksin IB sehingga kegagalan vaksinasi IB dapat ditekan.
NLP.I. Dharmayanti et al.
KESIMPULAN Hubungan kekerabatan virus IB isolat lapang I-14 dan I-269 yang berasal dari Indonesia berbeda dengan virus IB dari GeneBank termasuk Mass dan Conn. Kedua isolat tersebut juga berbeda dengan virus IB yang digunakan sebagai vaksin di sebagian besar peternakan di Indonesia. Isolat I-269 dan I-14 merupakan isolat lokal Indonesia. UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan terima kasih kepada Drh. C.A. Nidom (Tropical Disease Center, Universitas Airlangga), Ibu Nur Ika, Bapak Toni (PAU Universitas Gadjah Mada) dan Bapak Nana Suryana (Balai Penelitian Veteriner) atas bantuan yang sangat berharga dalam menyelesaikan penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA Avellaneda, G.E., P. Villages, M.W. Jackwood, and D.J. King. 1994. In vivo evaluation of pathogenicity of field isolates of infectious bronchitis virus. Avian Dis. 38: 698-597. Binns, M.M., E.G. Boursnell, F.M. Tomley, and T.D.K. Brown. 1986. Comparison of spike precursor sequences of coronavirus IBV strains M41 and 6/82 with that of Beaudette. J. Gen. Virol. 67: 2825-2831. Burlesom, F.G., T.M. Chambers, and D.L. Wiedbrauk. 1992. Virology: A laboratory manual. Academic Press Inc., California. p. 40-57. Cavanagh, D. 1983. Coronavirus IBV: Structural characterization of the spike protein. J. Gen. Virol. 64: 2577-2583. Cavanagh, D., P.J. Davis, D.J. Pappin, M. Binns, M.E. Boursnell, and T.D. Brown. 1986. Coronavirus IBV: Partial amino terminal sequencing of spike polypeptida S2 identifies the sequences Arg-Arg-Phe-Arg-Arg at the cleavage site of the spike precursor propolypeptide of IBV strains Beaudette and M41. Virus Res. 4: 133-143. Cavanagh, D., P.J. Davis, J.K. Cook, D. Li, A. Kant, and G. Koch. 1992. Location of the amino acid differences in the S1 spike glycoprotein subunit of closely related serotypes of infectious bronchitis virus. Avian Dis. 21: 33-43. Cavanagh, D. and S.A. Naqi. 1997. Infectious bronchitis. p. 511-526. In B.W. Calnek (Ed.). Diseases of Poultry, 10 th ed. Iowa State University, Ames, IA. Cook, J.K.A. 1984. The classifications of new serotypes of infectious bronchitis virus isolated from poultry flocks in Britain between 1981 and 1983. Avian Pathol. 13: 733-741. Cook, J.K.A. and M.B. Huggins. 1986. Newly isolated serotypes of infectious bronchitis virus: Their role in disease. Avian Pathol. 15: 129-138. Darminto. 1992. Serotyping of infectious bronchitis viral isolates. Penyakit Hewan 24(44): 76-81. Davelaar, F.G., B. Kouwenhoven, and G.A. Burger. 1984. Occurrence and significance of infectious bronchitis virus
Hubungan kekerabatan virus infectious bronchitis isolat lapang Indonesia variant in egg and broiler production in Netherland. Vet. Quart. 6: 114-120. Dharmayanti, NLP.I., W. Asmara, W.T. Artama, R. Indriani, dan Darminto. 2002. Kemampuan primer general CK4/ CK2 virus infectious bronchitis (IBV) untuk mengamplifikasi genom IBV isolat lapang Indonesia. Jurnal Biologi Indonesia 3(3): 227-235. Dharmayanti, NLP.I., W. Asmara, W.T. Artama, R. Indriani, dan Darminto. 2003. Perbandingan sekuen daerah hipervariabel (HVR) subunit gen S-1 virus infectious bronchitis isolat lapang I-37 dengan serotipe Connecticut 46. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner 8(2): 107-113. El-Houadfi, Md., R.C. Jones, J.K.A. Cook, and A.G. Ambali. 1986. The isolation and characterization of six avian infectious bronchitis viruses isolated in Morocco. Avian Pathol. 15: 93-105. Gelb, J., J.B. Wolf, and C.A. Moran. 1991. Variant serotypes of infectious bronchitis virus isolated from commercial layer and broiler chickens. Avian Dis. 35: 82-87. Holmes, K.V. 1994. Coronaviruses. p. 255-260. In R.C. Webster and A. Xranoff (Eds.). Encyclopedia of Virology, 1 st ed. Academic Press, San Diego, CA. Indriani, R. dan Darminto. 2000. Variasi serotipe isolat virus infectious bronchitis yang berasal dari beberapa daerah di Pulau Jawa. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner 5(4): 234-240. Jia, W., K. Karaca, C.R. Parrish, and S.A. Naqi. 1995. A novel variant of avian infectious bronchitis virus resulting from recombination among three different strains. Arch. Virol. 140: 259-271. Jia, W., X. Wang, C.R. Parrish, and S.A. Naqi. 1996. Analysis of the serotype-specific epitopes of avian infectious bronchitis virus strains Ark99 and Mass41. J. Virol. 70: 7255-7259. Kant, A., G. Koch, D.J. Van Roozelaar, J.G. Kusters, J.G. Poelwijk, and B.A.M. van der Zeijst. 1992. Location of antigenic sites defined by neutralizing monoclonal antibodies on the S1 avian infectious bronchitis virus glycopolypeptide. J. Gen. Virol. 7: 591-596.
23
Karaca, K., S. Naqi, and J. Gelb. 1992. Production and characterization of monoclonal antibodies to three infectious bronchitis virus serotipes. Avian Dis. 36: 903-915. King, D.J. 1988. Identification of recent infectious bronchitis virus isolated that are serologically different from current vaccine strains. Avian Dis. 32: 362-364. Kingham, B.F., C.L. Keeler, W.A. Nix, B.S. Ladman, and J. Gelb. 2000. Identification of avian infectious bronchitis virus by direct automated cycle sequencing of the S1-gen. Avian Dis. 44: 325-335. Koch. G., L. Hartog, A. Kant, and D.J. van Roozelaar. 1990. Antigenic domain on the peplomer protein of avian infectious bronchitis virus: correlation with biological functions. J. Gen. Virol. 71: 1929-1935. Kusters, J.G., H.G. Niesters, M.C. Horzinek, and B.A. van der Zeijst. 1989. Phylogeni of antigenic variants of avian coronavirus IBV. Virology 169: 217-221. Lucio, B. and J. Fabricant. 1990. Tissue tropism of three cloacal isolates and Massachusetts strain of infectious bronchitis virus. Avian Dis. 34: 865-870. McMartin, D.A. 1993. Infectious bronchitis. In J.B. MacFerran and M.S. MacNully (Eds). Incidence, Characterization and Prophylaxis of Nephropathogenic Avian Infectious Bronchitis Viruses. Vet. Rec. 120: 205-206. Parr, R.L. and E.W. Collison. 1993. Epitopes on the spike protein of a nephropathogenic strain of infectious bronchitis virus. Arch. Virol. 133: 369-383. Sambrook, J., E.T. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, NY. Wang, X. and M.I. Khan. 2000. Use of reverse transcriptionpolymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism to examine the interaction between infectious bronchitis virus strains Massacusetts 41 and JMK in ovo. Avian Pathol. 29: 441-448.
