JURNAL AGROTEKNOS Nopember 2013 Vol. 3 No. 3. Hal 163-169 ISSN: 2087-7706
HUBUNGAN KEKERABATAN AKSESI PISANG KEPOK (Musa paradisiaca Formatypica) DI KABUPATEN MUNA BERDASARKAN KARAKTER MORFOLOGI DAN PENANDA RAPD Genetic Relationship of Kepok Banana (Musa paradisiaca Formatypica) Accessions in Muna Regency Based on Morphological Characters and RAPD Markers TEGUH WIJAYANTO*), DIRVAMENA BOER, LA ENTE
Jurusan Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Haluoleo, Kendari
ABSTRACT Twenty-four accessions that belong to four groups of kepok banana in Muna Regency have been analyzed for their genetic diversity based on morphological characters (qualitative and quantitative characters), and a few accessions based on RAPD markers. This study aimed to determine the genetic diversity and phylogenetic relationship of accessions of kepok bananas based on 52 qualitative and 12 quantitative morphological characteristics and DNA characteristics. Results of clustering analysis showed the euclidian values ranged between 0.50 to 1.00 for the qualitative data, 0.01 to 0.50 for quantitative data, and 0.83 to 0.88 for DNA profile data. Combined qualitative and quantitative data had similarity coefficient ranged from 0.00 to 2.50. Dendogram of each character produced 2 main groups. The main group 1 formed subgroups. Although the qualitative and quantitative characters resulted in different accession groupings, the combined data analysis of quantitative and qualitative data showed that kepok banana in Muna regency was classified into 4 sub groups namely banana Manuru, Bugisi, Jiwaka and Manuru Lakabu. Keywords: cluster analysis, kepok banana, qualitative and quantitative characters, morphology, RAPD markers. 1PENDAHULUAN
Indonesia merupakan salah satu pusat keragaman genetik tanaman dunia, termasuk tanaman pisang (Damayanti dan Samsurianto, 2010). Untuk mengetahui lebih jauh besarnya keragaman genetik tersebut maka perlu dilakukan identifikasi dan analisis keragaman genetik. Kegiatan identifikasi keragaman genetik juga penting untuk keperluan perbaikan sifat genetik tanaman dalam upaya menghasilkan varietas atau klon-klon baru masa depan yang lebih baik untuk dibudidayakan (Prihatman, 2000; Prahardini et al., 2010; Ocimati et al., 2014)). Kegiatan eksplorasi, inventarisasi dan pelestarian plasma nutfah pisang di Indonesia masih terbatas. Hal ini disebabkan karena koleksi tanaman pisang saat ini berada di *) Alamat Korespondensi: E-mail::
[email protected]
tempat yang terpencar-pencar. Keadaan ini menyebabkan pengelolaan tanaman koleksi menjadi tidak optimal, sehingga tampilan tanaman juga tidak optimal dan seringkali mengacaukan data karakteristik varietas atau klon (Sukartini, 2006). Keragaman pisang kepok secara umum dan secara khusus di Kabupaten Muna belum teridentifikasi dengan baik, baik secara morfologi maupun genetik. Identifikasi genetik suatu populasi plasma nutfah adalah suatu kegiatan untuk memeriksa keragaman aksesi berdasarkan sejumlah karakter penciri (Darmono, 1996; IPGRI, 1996; Lengkong, 2008). Identifikasi morfologi yang dilakukan dapat digunakan untuk melakukan analisis kekerabatan antara aksesi. Berkaitan dengan hal tersebut, banyak sedikitnya jumlah karakter morfologi yang mempunyai heritabilitas atau repeatabilitas tinggi akan
Vol. 3 No.3, 2013
Hubungan Kekerabatan Aksesi Pisang Kepok
menentukan keakuratan pengelompokan aksesi-aksesi (Sukartini, 2006).
Keragaman populasi tanaman pisang sangat diperlukan dalam penyusunan strategi pemuliaan guna mencapai perbaikan varietas pisang secara efesien di masa yang akan datang (Ekesa, 2012; Galal et al., 2014). Dengan dasar inilah maka dilakukan penelitian analisis keragaman genetik berbagai aksesi pisang kepok di Kabupaten Muna. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui keragaman genetik dan hubungan kekerabatan antar aksesi pisang kepok yang ada di Kabupaten Muna, berdasarkan karakter morfologi dan penanda RAPD. BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat. Bahan yang digunakan pada pengamatan karakter morfologi adalah anakan pisang kepok yang dikoleksi dari 10 Kecamatan di Kabupaten Muna. Alat yang digunakan berupa cangkul. Sabit, ember, timbangan, meteran, mistar, kamera digital dan alat tulis menulis. Bahan yang digunakan pada pengamatan penanda RAPD adalah Buffer CTAB, pasir kuarsa, larutan PCI, dH2O, etanol 70 %, aquades, RNAse, primer, master mix, TAE, Enzim taq polymerase, agaros, ethidium bromida, loadyng dye dan buffer TE. Alat yang digunakan berupa : mikropipet, tip, sentrifugator, spin, vorteks, sel elektroforesis, mesin PCR, waterbath, tabung eppendorff, inkubator, timbangan analitik, photoforesis, cetakan agaros, hotplate, spektrofotometer, alu dan mortal, spatula, kuvet dan kulkas/refrigerator. Pengamatan profil DNA dilakukan di Laboratorium Genetika Fakultas MIPA Universitas Halu Oleo Kendari. Analisis Karakter Morfologi. Eksplorasi aksesi pisang kepok dilakukan pada 10 kecamatan di Kabupaten Muna, diambil anakannya selanjutnya ditanam pada lokasi penelitian. Sebanyak 24 aksesi anakan pisang kepok diperoleh, dan dilakukan karakterisasi morfologi berdasarkan panduan deskripsi pisang INIBAB (2001), berupa 52 karakter kualitatif dan 12 karakter kuantitatif. Analisis Penanda RAPD. Isolasi DNA dilakukan dengan memodifikasi metode yang digunakan oleh Rabi’ah (2005). Bahan isolasi adalah 0,1 - 0,2 g daun muda pisang kepok,
164
digerus dengan menggunakan pasir kuarsa sampai membentuk serbuk halus, lalu dimasukan ke dalam tabung eppendorff dan ditambahkan sekitar 600 µl buffer ekastraksi. Kemudian diinkubasi dalam waterbath pada suhu 650C selama 30 menit.Campuran ini disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit. Suprenatant dipindahkan kedalam tabung steril baru dan ditambahkan 1 x volume PCI (Phenol-Chalorofom-Isoamil Alcohol). Pemisahan fraksi di dalam campuran dilakukan dengan mengambil fase cair dan memindahkannya ke dalam tabung eppendorff baru dan disetrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 40C. Supernatant hasil pemurnian dipindahkan ke dalam tabung baru ditambahkan 1 x volume etanol absolut, diinkubasi dalam suhu 40C selama 2 jam, selanjutnya disetrifugasi kembali pada 10.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4 menit. Gumpalan DNA yang terbentuk (pelet) dicuci dengan 0,5 µl etanol 70%, kemudian dikering anginkan dan diinkubasi selama 12 jam pada suhu 370C. Uji kualitas dan kuantitas DNA dilakukan melalui elektroforesis dan spektrofotometer. Uji kuantitats DNA melalui elektroforesis pada prinsipnya dilakukan dengan memigrasikan DNA hasil isolasi dalam gel agaros dan dirunning dalam bak elektroforesis pada tegangan 100 volt selama 30 menit. Pita hasil isolasi dapat dilihat dengan manggunakan alat photoforesis. Uji kuantitas melalui spektrofotometer pada prinsipnya adalah melihat densitas DNA secara optik (Optical Density) pada gelombang 260 nm dan disetarakan dengan 50 µg/mL setiap 1 nilai OD pada absorbansi UV gelombang tersebut. Kualitas DNA diketahui dengan membandingkan hasil OD pada absorbansi 260 nm terhadap 280 nm. Seleksi primer dilakukan untuk mendapatkan primer yang dapat menghasilkan produk amplifikasi dan mempunyai tingkat keragaman genetik yang tinggi. Beberapa primer yang akan diseleksi, yaitu: OPA-12, OPA-18, OPD-10, OPB-10 dan OPH-07. Seleksi primer menggunakan 5 sampel DNA pisang kepok yang memiliki perbedaan struktur secara morfologi, yaitu, K20-H2, K06-C1, K11-D4, K05-B2 dan K10-D3. Proses amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan mesin PCR. Metode dan prosedur PCR ini mengacu pada prosedur
165
Wijayanto et al.
J. Agroteknos
hasil modifikasi Rabi’ah (2005). Bahan campuran untuk satu tabung reaksi PCR terdiri atas dNTPs (gabungan dari dATP, dCTP, dGTPdan dTTP), satu macam primer RAPD, buffer PCR, DNA template hasil isolasi, enzim Taq DNA polymerase dan air bebas ion. Eletroforesis dan visualisasi hasil amplifikasi PCR menggunakan alat photophoresis, untuk melihat karakteristik pita DNA yang teramplifikasi. Data hasil pengamatan morfologi berupa data kualitatif disajikan dalam bentuk data biner dan dianalisis hubungan kekerabatannya dengan menggunakan jarak genetik Match Maching, selanjutnya data kuantitatif distandarisasi terlebih dahulu selanjunya dianalisis hubungan kekerabatannya dengan menggunakan jarak genetik euclidian. Selanjutnya data tersebut dianalisis gerombol dengan menggunakan program NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate). Data hasil RAPD juga disajikan dalam bentuk data biner berdasarkan ada tidaknya pita DNA. Analisis kemiripan antar aksesi dilakukan dengan menggunakan prosedur SIMQUAL (Similarity for Qualitative).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis Hubungan Kekerabatan Pisang Kepok Berdasarkan Data Kualitatif. Hasil pengamatan terhadap 52 karakter kualitatif menunjukkan adanya penampilan yang beragam pada beberapa aksesi, namun ada a 1
b
beberapa aksesi yang memiliki penampilan sama. Secara visual, keragaman karakter kualitatif yang diamati pada daun adalah bentuk pangkal daun, bentuk membuka pangkal daun, lilin bawah daun, simetris pangkal daun, warna belakang daun menggulung, warna permukaan atas daun, warna permukaan bawah daun, warna tepi daun, warna tulang daun atas dan warna tulang daun bawah. Variasi yang terdapat pada tangkai daun (petiola) adalah: bentuk tepian petiola, lilin petiola, warna petiola dan warna tepian petiola. Variasi pada batang muda yang diamati adalah keadaan bercak batang, warna pigmentasi batang bagian dalam, warna pigmentasi batang bagian luar, warna bercak batang, warna dasar batang bagian dalam, warna dasar batang bagian luar dan lilin pada batang. Variasi pada anakan adalah: warna daun anakan, warna tepian daun anakan, warna tulang daun atas, warna tulang daun bawah, keadaan lilin permukaan bawah daun, warna petiola daun anakan, warna tepian petiola anakan, warna tepi petiola,warna tunas anakan dan bercak batang anakan. Variasi yang nampak pada karakter buah adalah keadaan permukaan kulit buah, warna daging buah masak dan bentuk ujung buah. Hasil analisis gerombol terhadap seluruh data kualitatif pisang kepok menghasilkan dendogram dengan koefisien kemiripan sebesar 0,50 – 1,00 seperti tampak pada Gambar 1.
a1
a2
2
Gambar 1.
Dendogram hubungan kekerabatan 24 aksesi pisang kepok berdasarkan data 52 karakter kualitatif
Vol. 3 No.3, 2013
Hubungan Kekerabatan Aksesi Pisang Kepok
Berdasarkan dendogram pada Gambar 1 terlihat bahwa terdapat hubungan kekerabatan yang signifikan dengan nilai koefisien kemiripan antara 0,51– 1,00. Semakin kecil nilai koefisien kemiripan (mendekati nol), maka hubungan kekerabatannya semakin jauh dan sebaliknya
semakin besar nilai koefisien kemiripan (mendekai satu), maka hubungan kekerabatannya semakin dekat. Hasil pengelompokan aksesi berdasarkan dendogram data kualitatif disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Kelompok aksesi pisang kepok berdasarkan dendogram data kualitatif Kelompok utama
1
Sub Kelompok
a1 a2 B
2
C
Aksesi K01-A1, K04-B1, K06-C1, K08-D1, K12-E1, K14-F1, K16-G1, K19-H1, K21-I1, dan K23-J1 K03-A3, K10-D3 dan K18-G3 K02-A2, K05-B2, K07-C2, K09-D2, K13-E2, K15-F2, K17-G2, K20-H2, K22-I2, dan K24-J2 K11-D4
Analisis Hubungan Kekerabatan Pisang Kepok Berdasarkan Data Kuantitatif. Berdasarkan data karakter kuantitatif pisang
166
Nama Lokal Manuru Jiwaka Bugisi
Manuru Lakabu
kepok umur 10 bulan diperoleh nilai maksimal dan minimal serta rata-rata setiap karakter seperti pada Tabel 2.
Tabel 2. Nilai minimal, maksimal dan rata-rata karakter kuntitatif pisang kepok Karakter yang diamati
Lebar daun Panjang daun Rasio panjang dan lebar daun Jumlah daun Dalam kanal petiola Keliling petiola Lebar kanal petiola Lebar tepian petiola Panjang petiola Keliling batang Tinggi batang semu Jumlah anakan
Nilai
Minimal
Ukuran 55,23 cm 160,00 cm 2,40 6,33 lbr 1,73 cm 11,77 cm 1,10 cm 0,30 cm 32,70 cm 44,63 cm 215,33 cm 0 anakan
Aksesi K11-D4 K18-G3 K01-A1 K14-F1 K11-D4 K11-D4 K04-B1 K11-D4 K01-A1 K11-D4 K07-C2 K01A1, K04-B1, K12-E1, K16-G1
Berdasarkan analisis gerombol dihasilkan dendogram dengan koefisien kemiripan 1a
1b
Gambar 2.
Maksimal
Ukuran 85,93 cm 280,33 cm 3,63 9,67 lbr 2,60 cm 17,37 cm 2,20 cm 1,55 cm 46,50 cm 85,57 cm 291,67 cm 1,76 anakan
Akasesi
K08-D1 K04-B1 K04-B1 K11-D4 K08-D1 K06-C1 K18-G3 K17-G2 K21-I1 K14-E1 K19-H1 K06-C1
Rata-rata 70,74 218,56 3,08 7,97 2,14 13,86 1,73 0,79 40,90 60,87 256,00 0,80
(euclidian) berkisar antara 0,01 - 0,50 seperti tampak pada Gambar 2.
1
2
Dendogram hubungan kekerabatan 24 aksesi pisang kepok berdasarkan data 12 karakter kuanlitatif
167
Wijayanto et al.
J. Agroteknos
Pola hubungan kekerabatan dari 12 karakter kuantitatif yang diamati pada 24 aksesi menunjukan keragaman dengan pengelompokan tertentu. Pengelompokan aksesi secara kuantitatif dari 24 aksesi pisang kepok di Kabupaten Muna tidak terlalu tegas seperti pada pengelompokan aksesi secara kualitatif. Hal ini disebabkan karena karakter kuantitatif sangat rentang dengan pengaruh faktor lingkungan. Beberapa faktor
lingkungan yang dapat mempengaruhi perbedaan karakter morfologi tanaman pisang antara lain kondisi fisiologis individu tanaman, terutama kemampuan menyerap unsur hara tanaman dan serangan hama dan penyakit (Robi’ah, 2005). Pengelompokan aksesi pisang kepok berdasarkan dendogram data kuantitatif disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3. Kelompok aksesi pisang kapok berdasarkan dendogram data kuantitatif Kelompok utama 1 2
Sub Kelompok A B C
Aksesi
K01-A1, K19-H1, K20-H2, K24-J2, K21-I1, K09-D2, K14-F1, K02-A2, K08-D1, K05-B2, K12-E1, K13-E2, K22-I2, K15-F2, K23-J1 dan K10-D3. K03-A3, K18-G3, K16-G1 dan K11-D4 K04-B1, K06-C1, K07-C2 dan K17-G2.
Analisis Hubungan Kekerabatan Pisang Kepok Berdasarkan Data Gabungan Karakter Kualitatif dan Kuantitatif. Berdasarkan analisis gerombol terhadap seluruh data gabungan karakter kualitatif dan kuantitatif pisang kepok di Kabupaten Muna, dihasilkan dendogram dengan koefisien kemiripan (similariti) berkisar antara 0,00 2,50 seperti tampak pada Gambar 3.
a1 a2
a1 a2
Pengelompokan aksesi pisang kepok berdasarkan hasil dendogram tersebut menunjukkan hal yang sama seperti pada gambar dendogram data kualitatif. Semakin kecil jarak genetik antara dua aksesi yang dibandingkan, maka hubungan kekerabatannya semakin dekat dan semakin besar jarak genetik antara dua aksesi yang dibandingkan, maka hubungan kekerabatannya semakin jauh.
a
b
a
1
b 2
1
2
Gambar 3. Dendogram aksesi pisang kapok berdasarkan gabungan data kualitatif dan kuantitatif
Analisis Hubungan Kekerabatan Pisang Kepok Berdasarkan Penanda RAPD Sebanyak 5 aksesi pisang kepok yang diisolasi DNA nya, hanya 3 aksesi yang teramplifikasi
dengan PCR, yaitu aksesi K20-H2, K06-C1 dan K11-D4. Hasil amplifikasi DNA-PCR ditampilkan pada Gambar 4.
Vol. 3 No.3, 2013
Hubungan Kekerabatan Aksesi Pisang Kepok
1
Gambar 4.
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
168
M
Profil pita DNA pisang kepok hasil PCR. Primer OPA-18 untuk sumur 1,2 dan 3, primer OPH-07 untuk sumur 5, 6 dan 7, dan primer OPD-10 untuk sumur 9,10 dan 11. Sumur 4 dan 8 adalah DNA Phage Lamda PstI. Sumur 1, 5 dan 9 untuk aksesi K20-H2, sumur 2, 6 dan 10 untuk aksesi K06-C1 dan sumur 3, 7 dan 11 untuk aksesi K11-D4. M adalah ukuran (Ladder) Phage Lambda DNA PstI.
Berdasarkan analisis clustering penanda RAPD nampak bahwa secara genetik dari 3 aksesi yang teramplifikasi dalam PCR memiliki keragaman dengan nilai koefisien kemiripan antara 0,83 - 0,88. Aksesi K20-H2 dan K06-C1 memiliki kekerabatan yang sangat dekat
dengan koefisien kemiripan 0,88, sehingga tergabung dalam satu kelompok, sedangkan aksesi K11-D4 sedikit berbeda dengan aksesi K20-H2 dan K06-C1 dengan nilai koefisien kemiripan sebesar 0,83. Hal ini tampak seperti pada Gambar 5.
Gambar 5. Dendogram aksesi pisang kapok berdasarkan data RAPD
SIMPULAN DAN SARAN
Berdasarkan data hasil penelitian dan pembahasan, maka dapat ditarik beberapa kesimpulan sebagai berikut: 1. Aksesi pisang kepok di Kabupaten Muna berdasarkan karakteristik kualitatif memiliki hubungan kekerabatan dengan koefisien kemiripan antara 0,51 s.d 1,00, dan terkelompok dalam 4 (empat) grup, yaitu pisang Manuru, pisang Bugisi, pisang Jiwaka dan pisang Manuru Lakabu.
Berdasarkan karakter kuantitatif, aksesi pisang kepok tersebut tidak terkelompok secara tegas seperti pada karakteristik kualitatif. Secara kuantitatif mereka memiliki hubungan kekerabatan dengan koefisien kemiripan antara 0,01 sampai 0,50. 2. Aksesi pisang kepok di Kabupaten Muna berdasarkan karakteristik gabungan data kualitatif dan kuantitatif memiliki pengelompokan yang sama dengan pengelompokan secara kualitatif, dan
169
Wijayanto et al.
memiliki hubungan kekerabatan dengan koefisien kemiripan antara 0,00 sampai 2,50. 3. Dari 3 (tiga) aksesi pisang kepok yang berhasil diamplifikasi secara PCR-RAPD (aksesi K20-H2, K06-C1 dan K11-D4), maka diketahui bahwa mereka memiliki hubungan kekerabatan dengan koefisien kemiripan antara 0,83 sampai 0,88.
DAFTAR PUSTAKA
Damayanti, F. dan Samsurianto, 2010. Konservasi invitro Plasma Nutfah Pisang untu aplikasi di Bank Gen. Bioprospek, Vol. 7(2): 86-90. Darmono, T.W., 1996. Ulas balik analisis keragaman tanaman dengan teknik molekuler (Analysis of plant genetic variation with molecular technique). Hayati, 3(1): 7-11. Ekasa, B.N., 2012. Bioaccessibility of provit A in banana (Musa sp). Food Chemistry 133: 1471-1477. Galal, A.A., I.A. Ibrahiem, and J.M. Salem, 2014. Influence of triadimefon on the growth and development of banana cultivars. African J. of Biotech. Vol 13(16): 1694-1701. INIBAP, 2001. Banana diversity. International network for the improvement of Banana and plantain. IPGRI, 1996. Discriptors for banana (Musa spp ). International plant genetic, Resources Institute Rome Monllier, 55 pp. Lengkong, E., 2008. Keragaman genetic plasma nutfah pisang (Musa sp) di Kabupaten Minahasa Selatan dan Minahasa Tenggara. Jurnal Formas, hal. 302-310. Ocimati, W., G. Blomme, and C. Murekezi, 2014. Musa germplasm diversity status. J. Appl. Biosc. 73:5979-5990. Prahardini, PER., Yuniarti, dan A. Krismawati, 2010. Karaterisasi varietas unggul pisang Mas Kirana dan Agung Semeru di Kabupaten Lumajang. Buletin Plasma Nutfah, Vol 16(2): 126-133. Prihatman, K., 2000. Pisang (Musa spp). http://www. Ristek.go.id Robi’ah R.H., 2005. Analisis keanekaragaman genetik pisang introduksi (Musa spp) berdasarkan penanda fenotipik dengan penanda RAPD. Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor.
J. Agroteknos
Sukartini, 2006. Pengelompokan aksesi pisang menggunakan karakter morfologi. Balai Penelitian Tanaman Buah Tropik. J.Hort, 17(11): 26 -33.
