200
SAMENVATTING Dikkedarmkanker is één van de voornaamste oorzaken van kanker-gerelateerde sterfte in geïndustrialiseerde landen. Als de darmtumor in een vroeg stadium wordt ontdekt, is genezing meestal nog mogelijk door middel van chirurgische verwijdering. Bij veel patiënten zijn echter vaak op afstand al uitzaaiïngen (metastasen) aanwezig of deze ontwikkelen zich in de loop van de tijd. Wanneer metastasen worden gevonden, is chirurgische verwijdering veelal geen optie meer. Patiënten met metastasen worden daarom palliatief behandeld met traditionele chemotherapeutica zoals 5-fluorouracil (en –afgeleiden), irinotecan en oxaliplatin; voorbeelden van nieuwe middelen zijn het VEGF antilichaam bevacizumab en de EGFR remmer cetuximab. Sinds de introductie van irinotecan en oxaliplatin is de mediane overleving van patiënten met dikkedarmkanker toegenomen tot twee jaar na het ontdekken van een metastase. Beide middelen zijn echter behoorlijk toxisch, waarbij de neurotoxiciteit van oxaliplatin, en febriele neutropenie en diarree (bij irinotecan) het meest belangrijk zijn. In dit proefschrift wordt onderzoek beschreven naar de effectiviteit en toxiciteit van oxaliplatin en irinotecan, in relatie tot variaties in het menselijk genoom (“single nucleotide polymorfismen”, afgekort SNPs); dit vakgebied wordt aangeduid met de term “farmacogenetica”. In hoofdstuk 1 wordt een overzicht gegeven van verschillende SNPs die door ons zijn bestudeerd in patiënten met gemetastaseerde dikkedarmkanker. We ontwikkelden een snelle en betrouwbare methode om tegelijkertijd twee SNPs te bepalen in het gen XRCC1 (nl. Arg399Gln en Tyr576Ser) door middel van de Pyrosequencing technologie. Het is mogelijk om met deze methode, die beschreven is in hoofdstuk 2, beide genotypes te bepalen binnen 3 uur na isolatie van DNA uit perifeer bloed. DNA geïsoleerd uit bloed wordt ook wel kiemcel DNA genoemd, omdat het in principe gelijk is aan het erfelijk materiaal zoals het tijdens conceptie aanwezig was. In een tumor kunnen veranderingen in het DNA optreden, hetgeen de effectiviteit van een behandeling kan beïnvloeden. Het is echter onwaarschijnlijk dat dit het geval is bij genen die geen rol hebben bij het ontstaan van een tumor, zoals genen betrokken bij het metabolisme van geneesmiddelen. Om dit te onderzoeken hebben we in hoofdstuk 3 het DNA uit bloed van patiënten met gemetastaseerde dikkedarmkanker vergeleken met DNA uit de tumor. We vonden een grote mate van overeenkomst voor 11 verschillende SNPs, alle gelegen in genen die betrokken zijn bij de effectiviteit of toxiciteit van irinotecan en oxaliplatin. Voor deze genotypes is het dus mogelijk om tumorweefsel in plaats van bloed te gebruiken voor retrospectieve (effect)studies bij patiënten met gemetastaseerde dikkedarmkanker. Alleen voor de SNP in GSTP1 (rs 1695) vonden we een klein verschil (3.0%) tussen de genotypes bepaald in DNA uit bloed en uit tumorbiopten, gefixeerd en ingebed in paraffine blokjes. Dit verschil kan mogelijk worden verklaard door het meervoudig statistisch testen. In het tweede deel van dit proefschrift ligt het accent op de farmacogenetica van irinotecan. Irinotecan is een chemotherapeuticum dat effectief is bij de behandeling van gemetastaseerde dikkedarmkanker, maar tegelijkertijd geeft het ook ernstige bijwerkingen die mogelijk lethaal zijn. Irinotecan wordt in het lichaam omgezet in de werkzame metaboliet SN38. Op zijn beurt wordt SN38 gemetaboliseerd tot het inactieve glucuronide, SN38-G; deze glucuronidering vindt plaats onder invloed van het enzym UDP-glucuronosyl transferase
NEDERLANDSE SAMENVATTING
(UGT1A1). In de Amerikaanse bijsluiter van irinotecan staat vermeld dat, ter voorkoming van neutropenie, de dosis van irinotecan verminderd dient te worden bij patiënten met een UGT1A1 genotype dat leidt tot een lage activiteit van het enzym UGT1A1. In hoofdstuk 4 van dit proefschrift wordt een overzicht gegeven van patiëntenkenmerken en farmacogenetische factoren die geassociëerd zijn met de bijwerkingen van irinotecan. Tevens worden suggesties voor dosisaanpassing gedaan voor specifieke omstandigheden en patiëntenkenmerken, en voor het UGT1A1 genotype. In hoofdstuk 5 wordt de invloed van een specifiek genotype, UGT1A1*28, besproken in relatie tot de effectiviteit en toxiciteit van irinotecan. Onze hypothese was dat patiënten die homozygoot drager zijn van het ‘mutante’ allel, dat een verminderde productie van het enzym ten gevolge heeft, een grotere kans hebben op toxiciteit en ook mogelijk een beter effect van de behandeling. De anti-tumor effecten waren gelijk voor alle UGT1A1 genotypes. Echter, het risico op febriele neutropenie was significant verhoogd voor patiënten die homozygoot zijn voor UGT1A1*28, maar dit uitte zich niet in een gemiddeld lagere dosis van irinotecan, meer dosisverlagingen of een kleiner aantal toegediende chemotherapie kuren. De voornaamste reden voor dosisverlaging of staken van de therapie bleek namelijk ernstige diarree te zijn, en niet (febriele) neutropenie. Wij vonden echter geen relatie tussen ernstige diarree en het UGT1A1*28 genotype bij het behandelschema zoals gebruikt in onze studie. Hoewel er geen relatie was tussen UGT1A1*28 en de effectiviteit van irinotecan, vonden we dat het GSTP1 codon 105 polymorfisme Ile>Val wél was geassocieerd met de tijd tot progressie bij de eerstelijns behandeling met irinotecan. GSTP1 is een enzym dat betrokken is bij de conjugatie van glutathion met verschillende geneesmiddelen zoals oxaliplatin. Het ‘normale’ GSTP1 enzym bevat isoleucine op positie 105 en heeft een hogere enzymatische capaciteit vergeleken met het ‘mutante’ eiwit (met valine op die positie). Het is niet bekend of irinotecan en SN38 substraten zijn van dit enzym, maar in vitro experimenten hebben uitgewezen dat de toxiciteit van irinotecan lager is bij een hogere concentratie GSTP1 in de celkern. We beschrijven in hoofdstuk 6 dat patiënten met het Ile/Ile genotype geen voordeel hebben, voor wat betreft tijd tot progressie, wanneer irinotecan wordt toegevoegd aan de eerstelijns behandeling met capecitabine. Patiënten met één van de andere GSTP1 codon 105 genotypes hebben echter wel degelijk een langere tijd tot progressie wanneer zowel capecitabine als irinotecan worden gebruikt. Een mogelijke verklaring voor dit verschil zou kunnen zijn dat de enzymatische capaciteit van GSTP1 voor het metabolisme van irinotecan en/of SN38 verschillend is, of dat de activatie van de c-Jun-N-terminal kinase (JNK)-cascade door de beide GSTP1 varianten verschillend verloopt. In het derde deel van dit proefschrift ligt de nadruk op oxaliplatin. In tegenstelling tot de meeste andere platinum verbindingen is oxaliplatin wel effectief bij gemetastaseerde dikkedarmkanker. In hoofdstuk 7 wordt de farmacokinetiek, -dynamiek en -genetica van oxaliplatin beschreven. Kennis van het werkingsmechanisme en het metabolisme van een geneesmiddel is van essentieel belang bij de selectie van kandidaatgenen in een farmacogenetische studie. Polymorfismen in het eerder genoemde GSTP1 en in genen die coderen voor DNA-herstel enzymen zoals ERCC1 zijn eerder bestudeerd, in meerdere groepen patiënten met gemetastaseerde dikkedarmkanker die behandeld werden met oxaliplatin. ERCC1 maakt deel uit van het zogenaamde ‘nucleotide excision repair’ systeem, en heeft een belangrijke rol bij het verwijderen van beschadigde of foutieve nucleotiden uit het DNA. ERCC1 is een gen dat tijdens de evolutie nauwelijks is veranderd, en (compleet) verlies van
201
202
ERCC1 activiteit lijkt onverenigbaar met het leven. Eén van de weinige variaties die voor dit gen bekend zijn is de AAC>AAT substitutie in codon 118. Beide varianten resulteren in inbouw van hetzelfde aminozuur, maar AAT is een codon dat weinig frequent voorkomt. Het ERCC1 enzym afkomstig van 118 AAT zou mogelijk afwijkende eigenschappen hebben als gevolg van tragere aminozuur inbouw en/of verschillen in eiwitvouwing. In hoofdstuk 8 beschrijven we daarom de in vitro experimenten die we hebben uitgevoerd met een hamstercellijn die geen ERCC1 expressie heeft (UV20 cellijn). UV20 cellen waaraan door middel van transfectie één van beide varianten van het humane ERCC1 gen waren toegevoegd bleken evenwel in gelijke mate gevoelig voor oxaliplatin. Zowel UV20 cellen met 118 AAC als met 118 AAT hadden een vergelijkbare gevoeligheid voor oxaliplatin als hamstercellen met een normale productie van ERCC1. Op basis van een COMET-assay waarbij gekeken wordt naar DNA fragmentatie patronen, konden ook geen verschillen in DNA herstelcapaciteit worden gevonden. Naast de in vitro gevoeligheid hebben we ook de klinische effecten van oxaliplatin en de expressie van ERCC1 in de tumor van patiënten met gemetastaseerde dikkedarmkanker bestudeerd. We vonden geen relatie tussen de eiwitexpressie (bepaald door middel van immuno-histochemie) van ERCC1 in tumoren en de ERCC1 codon 118 en C8092A SNPs. Beide SNPs waren ook niet geassocieerd met de tijd tot progressie of de totale overleving van patiënten met gemetastaseerde dikkedarmkanker, die behandeld waren met oxaliplatin. In hoofdstuk 9 bestudeerden we de relatie tussen het GSTP1 Ile>Val polymorfisme in codon 105 met oxaliplatin effectiviteit en toxiciteit. Hoewel in sommige studies bij gastro-intestinale tumoren is gevonden dat patiënten met het Val/Val genotype, behandeld met oxaliplatin, een langere totale overleving hebben dan patiënten met het Ile/Ile of Ile/Val genotype, vonden wij geen associatie tussen genotype en tijd tot progressie of totale overleving. Ernstig braken was (van de bijwerkingen met een incidentie van >5%) als enige geassocieerd met het GSTP1 genotype en deze bijwerking kwam vaker voor bij patiënten met het Val/Val genotype. Ook is gekeken naar neurotoxiciteit, en wel specifiek bij patiënten die een totale oxaliplatin dosis hadden ontvangen van tenminste 500mg/m2. Een eerdere studie in patiënten die minimaal deze dosering hadden gekregen liet zien dat Val/Val patiënten een groter risico hebben om graad 3-4 neurotoxiciteit te ontwikkelen tijdens de behandeling. Wij konden echter geen associatie vinden tussen neurotoxiciteit en het GSTP1 genotype, maar dit kan ook (deels) worden toegeschreven aan het gebruik van een andere methode om neurotoxiciteit vast te stellen. In dit hoofdstuk houden wij tevens een pleidooi voor een nauwkeurige selectie van patiënten in farmacogenetische studies, vooral wanneer het tweede- en derdelijns therapie bij kanker betreft. Verschillen in bijvoorbeeld de ‘performance score’ als maat voor het dagelijks functioneren, of in het aantal eerder gegeven therapieën kunnen de tijd tot progressie of de totale overleving beïnvloeden en een grote mate van vertekening (‘bias’) geven wanneer genotypes onderling worden vergeleken. Daarom is het bij de uitvoering van dit type onderzoek erg belangrijk om hierop bedacht te zijn (en er zonodig voor te corrigeren); dit is vooral van belang wanneer in een analyse patiënten worden gecombineerd die behandeld worden met verschillende vormen van chemotherapie, of wanneer zij in een andere fase van de behandeling verkeren (eerste-, tweede- of derde lijns behandeling).
NEDERLANDSE SAMENVATTING
Hoofdstuk 10 beschrijft de resultaten van ons onderzoek naar de toxiciteit en effectiviteit van oxaliplatin met behulp van een zogenaamde ‘SNP array’. Met de door ons gebruikte SNP array kunnen tegelijkertijd 100 SNPs worden bepaald worden in 55 genen, alle betrokken bij DNA herstel. Dit onderzoek leverde ons twee nieuwe markers op voor de effectiviteit van oxaliplatin, in de ATM (“ataxia teleangiectasia mutated”) en ERCC5 (“excision repair crosscomplementing group 5”) genen, maar geen markers voor toxiciteit. Een probleem bij deze studie met veel SNPs en relatief weinig patiënten, is de kans op vals-negatieve uitkomsten. De enige manier om dit op te lossen is door de studie uit te voeren met een groter aantal patiënten, maar dat is in de praktijk vaak lastig. De resultaten van deze verkennende studie vormen niettemin een goede basis voor verder onderzoek naar de rol van ATM en ERCC5 bij de effectviteit van oxaliplatin. In het laatste hoofdstuk van dit proefschrift worden de voornaamste bevindingen van ons onderzoek besproken. Hoewel chemotherapie bij gemetastaseerde dikkedarmkanker de prognose belangrijk heeft verbeterd, blijft het moeilijk om de effecten op individueel patiëntniveau te voorspellen. Er zijn verschillende initiatieven ontplooid om markers te vinden die de effectiviteit en toxiciteit van oxaliplatin dan wel irinotecan kunnen voorspellen. Een voorbeeld van dit laatste is de Invader® test, ontwikkeld voor dosisaanpassing bij irinotecan. Het GSTP1 genotype is een veelbelovende marker om de effectiviteit van irinotecan te voorspellen. Andere patiëntenkenmerken zoals leeftijd en leverfunctie kunnen daarnaast een waardevolle aanvulling vormen op de informatie van farmacogenetische markers, en ons helpen om de effecten van chemotherapie in de toekomst beter te voorspellen.
203
204
