původní práce
Hodnocení alergenicity jablečných odrůd Assessment of allergenicity of apple cultivars STANISLAVA HONZOVÁ1, ALEXANDRA PROŠKOVÁ2, FRANTIŠEK PAPRŠTEIN3, IVANA ŠETINOVÁ1, MILENA KMÍNKOVÁ2, ANABELA KVÁČOVÁ1
1
Imunologické centrum, Imumed s. r. o., Praha 2 Výzkumný ústav potravinářský Praha v.v.i. 3 Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy s.r.o. SOUHRN Řada pacientů alergických na pyl břízy v oblastech střední a severní Evropy trpí po požití čerstvých jablek projevy orálního alergického syndromu. Tento typ alergické reakce na jablka způsobuje zkřížená reaktivita IgE protilátek mezi hlavním alergenem břízy Bet v 1 a hlavním alergenem jablka Mal d 1. Je známo, že závažnost alergické reakce na jablka závisí nejen na specifické senzibilizaci pacienta, ale je závislá i na jablečné odrůdě. Výběr jablečných odrůd se sníženým obsahem Mal d1 může přispět ke snížení rizika vzniku klinických potíží u polinotiků s alergickou reakcí na jablka a může pomoci se zařazením některých jablek do stravy. U pacientů s prokázanou alergií na jablka byla hodnocena alergenicita vybraných 17 odrůd jablek kožními testy metodou prick to prick. Pro laboratorní vyšetření, test aktivace bazofilů, byla použita vylisovaná jablečná šťáva. Intenzita alergické reakce na jednotlivé odrůdy byla potvrzena SDS-PAGE elektroforézou a imunitní reakcí krevního séra metodou Western blot. V naší práci jsme potvrdili, že různé odrůdy jablek obsahují odlišné množství alergenu Mal d1. U odrůd Boskoopské, Florina, Topaz a Angold byla prokázána nejnižší reaktivita, lze je zařadit mezi kultivary s nízkou alergenicitou. Nejvyšší alergenicita byla zjištěna u odrůd Hetlina a Resista. Klíčová slova: jablečné odrůdy, potravinová alergie, Mal d 1, prick to prick, BAT, immunoblotting
SUMMARY Many birch pollen sensitized patients in Central and Northern Europe suffer from oral allergy symptoms after eating fresh apples. This type of apple allergy is caused by cross reactivity of IgE antibodies against the major birch pollen allergen Bet v 1 with Mal d 1. It is known, that severity of allergic reaction to apples was not only related to the specific sensitivity of the individual, but also largely depended on the apple cultivar. Selection of apple cultivars could help for reduction of symptoms in patient with birch pollen-apple allergy and might offer Mal d1 reactive patients a safe way to reintroduce apples to their diets. Using 17 selected apple cultivars, the allergenicity was studied by prick to prick tests in patients. Pressed apple juice was used for laboratory evaluation, basophil activation test. Intensity of patient’s allergic reaction to particular cultivars was confirmed by SDS-PAGE electrophoresis and immunity reaction of blood serum by Western blot method. We demonstrated, that different cultivars of apples have different amount of Mal d 1. Cultivars Boskoop, Florina, Topaz and Angold were classified as cultivars with low allergenicity. Hetlina and Resista apples showed the highest allergenicity Key words: Apple cultivars, food allergy, Mal d 1, prick-to prick, BAT, immunoblotting
Úvod Jablka patří mezi nejpěstovanější a nejrozšířenější ovoce ve střední Evropě. V naší republice patří mezi ovoce s největší tradicí a produkcí. Jsou doporučována ke konzumaci z důvodů přítomnosti vitamínu C a vlákniny, ale také jako nejlépe dostupné ovoce. Jablka obsahují několik alergenů, z nichž ve střední a severní Evropě je nejrozšířenější citlivost na alergen Mal d 1 pravděpodobně vzhledem k vysoké sekvenční homologii s alergenem břízy Bet v1 (9). Alergen Mal d 1 má molekulovou váhu 18 kDa (16). Přecitlivělost na tento alergen se projevuje především otoky rtů a ústní dutiny, obrazem tzv. orálního alergického syndromu. V regionu
188
jižní Evropy je alergie na jablka méně častá a nemá vztah k alergii na břízu. Bylo zjištěno, že je způsobena reakcí na alergen Mal d 3, který patří do skupiny LPT a může vyvolávat závažnější celkové příznaky (5). Kromě uvedených byly detekovány i další alergeny Mal d 2 a Mal d 4 (8). Alergické potíže po konzumaci syrových jablek udává v oblasti střední a severní Evropy až 50 % břízových alergiků. Je známo, že některé jablečné odrůdy, které jsou hojně rozšířené v obchodní síti, jsou silně alergenní. Je to udáváno např. u odrůdy Golden delicius (7). Naopak u odrůd Santana a Topaz byla zjištěna alergenicita snížená (1,11). Alergenicitu jablek je možno sledovat u pacientů metodami in vivo a in vitro. Vzhledem k tomu, že hlavní
Alergie 3/2010
původní práce jablečný alergen Mal d1 je labilní a jeho schopnost vyvolat reakci po různém zpracování se výrazně snižuje, používají se pro kožní prick testy čerstvá jablka. Vyšetření je prováděno metodou prick to prick (1). Pro laboratorní testy je nutné provést stabilizaci jablečné šťávy tak, aby alergenicita Mal d1 byla zachována. Takto upravenou jablečnou šťávu lze použít pro laboratorní imunologické vyšetření testem aktivace bazofilů i pro další imunochemické metody (10,15). V práci jsme se zaměřili především na výskyt nejzávažnějšího jablečného alergenu v našem regionu Mal d1. Protože české tradiční odrůdy z tohoto hlediska zatím ověřovány nebyly, zařadili jsme do studie odrůdy jablek od hojně se vyskytujících v tržní síti až po tradiční české a historické odrůdy. Jablečné odrůdy byly hodnoceny pomocí kožních prick testů metodou prick to prick, testem aktivace bazofilů s jablečnými šťávami, SDS-PAGE elektroforézou a metodou Western blot. K testům prick to prick byla použita čerstvá jablka, k ostatním jablečné šťávy.
Soubor a metody Výběr jablečných odrůd Na základě hodnocení pomologických znaků bylo vybráno 17 odrůd jablek ze sklizně 2009. Jednalo se o tyto odrůdy: Angold, Boskoopské, Florina, Gala, Gloster, Golden delicius, Hetlina, Chodské, Idared, Jonagold, Meteor, Panenské české, Pinova, Resista, Rubín, Rubinstep a Topaz. Výběr byl zaměřen na odrůdy tržního sortimentu, nově vyšlechtěné odrůdy a na staré odrůdy, které byly v minulosti u nás běžně rozšířené. Jablka byla testována hned po ukončení sklizně na podzim 2009. Soubor pacientů Do studie byli vybíráni pacienti alergičtí na pyl břízy, kteří udávali současné projevy potravinové alergie po požití syrového jablka. U všech pacientů se jednalo o obraz tzv. orálního alergického syndromu, alergické reakce na jablka, která souvisí s přecitlivělostí na hlavní jablečný alergen Mal d1. U všech pacientů byla provedena vstupní vyšetření k potvrzení senzibilizace na hlavní alergen pylu břízy a hlavní alergen jablka. Byly provedeny kožní prick testy se směsným alergenem břízy (Alyostal, f. Stallergenes) a kožní test metodou prick to prick s čerstvým jablkem. Byla vybrána odrůda Golden Delicius, která je považována za zvýšeně alergenní. Dále byly provedeny laboratorní testy, stanovení specifického IgE na alergen pylu břízy a na jablko (přístroj Immulite) a test aktivace bazofilů s rekombinantními alergeny Bet v 1, Bet v 2 a Mal d 1 (f. Biomay). Z původních 40 pacientů, u kterých byla provedena vstupní vyšetření, konečný soubor tvořilo 16 pacientů. Všichni tito pacienti byli břízoví alergici, měli projevy OAS po syrovém jablku, dobře reagovali v kožním testu Golden Delicius, byli pozitivní na Bet v 1, pozitivní na Mal d 1 a negativní na Bet v 2. V době testování jablečných odrůd byli bez farmakoterapie. Kontrolní skupiny tvořilo 10 pacientů alergiků, kteří neudávali žádné klinické projevy alergie na jablka a 10 zdravých jedinců neatopiků. U kontrolních skupin pacientů byla provedena stejná vstupní vyšetření jako u pacientů.
Alergie 3/2010
Před zařazením do studie všichni pacienti podepsali informovaný souhlas. Vlastní testování jablečných odrůd proběhlo těsně po sklizni na podzim 2009. Příprava jablečné šťávy Jablka byla po sklizni krátce uchována ve skladovacích boxech (cca 1 měsíc), poté odvezena do VÚPP, zpracována na odšťavňovači Champion 2000+ (USA, Kalifornia). Uvádíme zkráceně postup přípravy jablečné šťávy. Jablka byla po umytí v chladné vodě zbavena jádřinců, rozkrájena i se slupkou na menší části a ihned ponořena do 3% kyseliny askorbové na 10 min. Byla ponechána okapat a poté vylisována na odšťavňovači. Získaná šťáva byla přefiltrována přes mulovou tkaninu, zvážena, rozdělena do sáčků po 30 až 50 g a ihned zamražena na minus 30 °C do dalšího zpracování. Kožní prick testy (SPT) Kožní prick testy byly prováděny standardně dle metodiky EAACI, negativní kontrola a pozitivní kontrola Alyostal (Stallergenes), test s čerstvými jablky metodou prick to prick (1,14). Hodnocení kožních testů proběhlo po 15 min., byla hodnocena velikost pupenu v mm. Jako pozitivní je hodnocen pupen 3 a více mm. Test aktivace bazofilů (BAT) BAT byl proveden v modifikaci uvedené v českém patentu z r. 2003 (3). Testem aktivace bazofilů se simuluje situace, která probíhá in vivo. K buňkám pacienta se přidá testovaný alergen. Pokud je pacient na alergen senzibilizován, dojde k aktivaci bazofilů (4). Aktivaci bazofilů odpovídá zvýšení exprese znaku CD 63 na jejich membráně. Vyšetření je prováděno z plné krve, protisrážlivé činidlo heparin. Pro vyšetření byly použity připravené stabilizované a následně zmražené jablečné šťávy, které byly rozmraženy bezprostředně před použitím. Součástí každého vyšetření byla negativní kontrola (roztok PBS) a pozitivní kontrola (polyklonální protilátka anti IgE) k vyloučení tzv. non reaktantů. K detekci bazofilů byla použita monoklonální protilátka anti CD 203c (Beckmann Coulter), k detekci aktivovaných bazofilů znak CD63 (Exbio). Měření probíhalo na průtokovém cytometru FC 500 (Beckmann Coulter). Výsledek vyšetření je udáván v %. Test lze hodnotit za předpokladů, že negativní kontrola je méně než 5 %, pozitivní kontrola více než 15 %. Za pozitivní, tj. zvýšenou hodnotu BAT po stimulaci bazofilů s jablečnou šťávu jsme zvolili hodnotu 24 % a více CD63 pozitivních bazofilů (cut-off hodnota při senzitivitě 74 % a specificitě 100 %). Výsledky ROC analýzy byly převzaty z našich předchozích prací, ve kterých vyšetření BAT s jablečnými šťávami probíhalo za totožných podmínek (10,15). SDS-PAGE elektroforéza a Western blot Vzorky pro elektroforézu byly připraveny tak, že ze zmrazeného vzorku šťávy bylo odebráno odpovídající množství a po opatrném rozmražení byl přidán pufr (10mM fosforečnan draselný, pH 7,0 s přídavkem 10 mM DIECA (diethyldithiocarbamat, sodná sůl), 2mM EDTAsodná sůl, 2% suspenze PVPP (polyvinyl polypyrrolidon)
189
původní práce v poměru 2:1 (extrakt:pufr) pro ochranu alergenu. Objem všech vzorků byl vždy 2 ml. Poté bylo upraveno pH z 3,2– 3,6 na 9,4–9,6 (20% NaOH). Po důkladném promíchání byl vzorek odstředěn při 18 000 ot./min., 8 °C, 15 min. Ve vzorku byly stanoveny bílkoviny. Elektroforéza byla prováděna v redukujících podmínkách, byly přidána 2 % SDS, 10 % sacharózy, 5 % mercaptoethanolu a barevné značení – bromfenolová modř. Celý objem byl zahříván při 100 °C po dobu 5 min. a po vychlazení zmražen. SDS-PAGE elektroforéza Elektroforéza probíhala na vertikálním zařízení Mini V 8.10 (f. Biometra) za použití rozdělovacího gelu 12,5 %, zaostřovacího gelu 5 % o síle 1,5 mm po dobu 110–120 min. při konstantním napětí 150V za chlazení, v pufru Tris-glycin pH 8,3. Touto elektroforézou byl identifikován mezi jednotlivými odrůdami alergen Mal d1 jednak dle standardu alergenu a jednak podle polohy standardů molekulových vah. Na elektroforetický gel byl nanesen do jamek stejný objem šťávy jednotlivých odrůd, aby bylo možno porovnat intenzitu zbarvení sledované bílkoviny. Postup vyvolání byl proveden dusičnanem stříbrným, bílkoviny byly v gelu imobilizované glutaraldehydem a obarvené vyredukovaným stříbrem. Použité chemikálie byly od firmy SIGMA- Aldrich, standard alergenu Mal d1 od firmy Biomay AG. Western blot Po elektroforéze byl gel ponořen na 20 min. do vychlazeného transfer pufru pH 8,3. Blotování bylo provedeno na celulózovou membránu o velikosti pórů 0,2 um na zařízení Mini-Twin. Podmínky blotování byly následující: pufr glycin-methanol, pH 8,3, konstantní proud 450 mA, chlazení vodou v průtoku max 1,0 l/hod, doba transferu 3 hod. K identifikaci alergenu Mal d1 byla použita směs sér pacientů dobře reagujících na Mal d1. Jako primární protilátka byla použita anti-human IgE (kozí), jako sekundární protilátka anti goat IgE-biotin (králičí) a konjugát streptavidin-peroxidása, barvení TMB se substrátem H2O2. Proužky na membránce byly ihned scannovány pro nestálost barvy.
Výsledky Testování čerstvě sklizených jablek pomocí kožních testů U všech 16 pacientů i kontrol byly provedeny kožní testy metodou prick to prick s čerstvými jablky a laboratorní vyšetření test aktivace bazofilů s jablečnými šťávami jednotlivých odrůd jablek. Průměrné hodnoty velikosti pupene u souboru pacientů i kontrol shrnuje graf 1. V kožních prick testech nejvýrazněji reagovaly pupenem odrůdy Hetlina, Idared, Jonagold a Gala (průměrná hodnota pupene 5,5 mm a více), dále Panenské, Resista a Meteor (průměrná hodnota pupene 5 až 5,4 mm), nejmenší reakci vykazovaly odrůdy Boskoopské a Gloster. Rozdíly však nebyly statisticky významné. Test aktivace bazofilů Test aktivace bazofilů (BAT) bylo možno hodnotit pouze u 15 pacientů, protože jeden z pacientů nereago-
190
val na pozitivní kontrolu (jednalo se o tzv. nonreaktanta z hlediska vyšetření BAT). U všech ostatních pacientů byly splněny podmínky vyšetření, tj. hodnoty negativní i pozitivní kontroly. Nejnižší hodnoty BAT vykazovaly odrůdy Jonagold (průměr 15,12 %, medián 14 %), Florina (průměr 15,6 %, medián 14 %), Angold (průměr 18,2 %, medián 14 %) a Topaz (průměr 18,68 %, medián 14 %). V tomto vyšetření se jako vysoce alergenní jeví odrůdy Resista, Chodské a Rubín (více než 50 % aktivovaných bazofilů) a dále odrůdy Hetlina, Gala a Gloster (více než 30 %). Výsledky vyšetření jsou uvedeny v grafu 2. SDS-PAGE elektroforéza a Western blot Vzorky šťávy z jednotlivých odrůd byly naneseny na dva gely a podrobeny rozdělení v elektrickém poli současně. Jeden gel byl blotován technikou Western blot a vyvolán imunoreakcí, druhý byl obarven stříbrem. Protože bylo zkoumáno celkem 17 odrůd, byly analyzovány postupně ve třech částech. Intenzita proužků bílkovin z gelu a aktivních bílkovin z membránky blotu byla poté vyhodnocena softwarem ELFOMAN 2.5. Jednotlivé proužky byly převedeny do podoby peaků, byla změřena jejich plocha v místě Mal d1 a vzájemně porovnána. Výsledky vyšetření Western blot a elektroforézy ukazují obrázky 1 A, B, C. Příklady grafického znázornění peaků, které odpovídají Mal d1, uvádí obrázek 2, na kterém je zobrazen nález u vysoce alergenní odrůdy Resista (horní část) a v dolní části obrázku je nález u odrůd s nízkým obsahem Mal d 1, odrůdy Boskoopské, Topaz a Jonagold. Graf 3 ukazuje množství alergenu Mal d 1 ve vzorku šťávy na jamku gelu (45 ul) u sledovaných 17 odrůd jablek. Hodnocení bylo provedeno semikvantitativně srovnáním plochy peaků bílkovin v místě Mal d1 ze šťávy odrůd jablek po blotu. Golden delicius byl použit jako srovnávací vzorek. Po analýzách vzorků jablečné šťávy SDS-PAGE elektroforézou se objevují ve vyhodnocení s nejmenším obsahem Mal d1 odrůdy Angold, Topaz, Boskoopské, Jonagold. Nejsilnější proužky byly nalezeny u odrůd Hetlina, Resista a Panenské české. Imunoreaktivní alergen Mal d1, identifikovaný metodou Western blot, byl nulový až velmi malý u odrůdy Boskoopské a velmi malý u dalších odrůd Jonagold a Topaz. Vysokým obsahem alergenu negativně vynikaly odrůdy Hetlina, Resista a Panenské české.
Diskuse Jablka jsou převážně využívána jako stolní ovoce a představují velmi důležitý zdroj vitamínů, stopových prvků a vlákniny. Vzhledem k tomu, že alergie na čerstvá jablka patří mezi velmi časté projevy potravinové alergie, jsou hledány postupy, jak pacientům s touto alergií umožnit konzumovat tuto důležitou potravinu (7,11). Jablečné šťávy a jablečné extrakty používané pro průkaz alergické reakce na jablka vykazují často nízkou senzitivitu vzhledem k labilitě alergenu Mal d1. Z těchto důvodů bylo již dříve doporučeno použít čerstvé kultivary a kožní testy provádět metodou prick to prick. I my jsme ve studii využili těchto skutečností. Pro laboratorní
Alergie 3/2010
původní práce Čerstvá jablka – SPT pupen
Graf 1: Kožní testy metodou prick to prick u pacientů a kontrol u 17 testovaných odrůd jablek
BAT jablečná šťáva – průměrné hodnoty
Graf 2: Výsledky vyšetření testu aktivace bazofilů u pacientů a kontrol u 17 odrůd jablek
testy bylo popsáno několik způsobů úpravy jablečného homogenátu a jablečné šťávy k zachování imunoreaktivity labilního alergenu Mal d 1 (1). V naší práci jsme volili postup, který se nám osvědčil v předchozích studiích (10,15), kdy jsme hodnotili možnosti ovlivnění alergenicity jablečné šťávy. Pro identifikaci alergenů se používá imunochemická metoda Western blot, kdy se proteiny, rozdělené elektroforézou, přeblotují na membránu a následně se vyvolají imunoreakcí a zviditelní obarvením. Obvykle používaná elektroforéza pro tento postup je SDS-PAGE s koncentrací separačního gelu 12–13 % a 3–5 % zaostřovacího gelu (12). Pro identifikaci proteinů v gelu se používá barvení Coomassie blue nebo barvení stříbrem, které je výrazně citlivější než za použití Coomassie blue (13). Pro blotting jablečných alergenů se používají membrány NC o velikosti porů 0,2 nebo 0,45 um, někdy také PVDF-Imobilon P (2,6,8,16). V naší práci jsme vycházeli z doporučova-
Alergie 3/2010
ných postupů. Pro identifikaci proteinů u SDS-PAGE elektroforézy byl použit dusičnan stříbrný. Blotování bylo provedeno na celulózovou membránu o velikosti pórů 0,2 um, k identifikaci imunoreaktivního alergenu Mal d1 použita směs sér pacientů, kteří ve vstupním vyšetření dobře reagovali na Mal d 1. Při hodnocení odrůd semikvantitativními metodami byl nejnižší obsah proteinu odpovídajícího Mal d1 prokázán ve šťávách jablečných odrůd Boskoopské, Angold, Jonagold a Topaz. Naopak vysoký obsah bílkoviny odpovídající Mal d 1 vykazovaly odrůdy Hetlina, Resista a Panenské české. Odrůda Golden delicius, která je běžnou tržní odrůdou a o které je udáváno, že je vysoce alergenní, byla použita jako srovnávací vzorek. Vysoká alergenicita této odrůdy v našich podmínkách nebyla potvrzena Při vyšetření pacientů nejvíce reagovaly v kožních testech odrůdy Hetlina, Idared, Jonagold a Gala. Dále Panenské české, Resista a Meteor. Nejnižší reakci v kožním testu
191
původní práce Blot 1
Gel 1
Mal d1
Mal d1
MV
2 Angold, 3 Boskoopské, 4 Mal d1-standard, 5 Florina, 6 Gala, 7 Gloster, 8 Golden delicius, 9 – blot: Hetlina; 9 – gel: mol. váha – standard, 10 – gel Hetlina
Obr. 1A: Vyšetření Western blot a SDS-PAGE elektroforéza – 1. část. Hodnocení části A: Blot: Nejsilnější proužek má vzorek odrůdy Hetlina a Golden delicius. Nejslabší Boskoopské a Angold. Gel: Zřetelně nejslabší jsou odrůdy Angold a Boskoopské. Blot 2
Gel 2
Mal d1
Mal d1
MV
1 Chodské (30 ul), 2 Chodské (45 ul), 3 Idared, 4 Mal d1-standard, 5 Jonagold, 6 Meteor, 7 Panenské české, 8 Golden delicius, 9 – blot Pinova; gel: mol. váha – standard, 10 Pinova
Obr. 1B: Vyšetření Western blot a SDS-PAGE elektroforéza – 2. část. Hodnocení: Blot: Nejsilnější proužek má vzorek odrůdy Panenské české a Chodské, nejslabší Jonagold a Idared. Gel: Zřetelně nejslabší jsou odrůdy Idared a Jonagold. Nejsilnější je proužek u odrůdy Panenské české. Blot 3
Gel 3
Mal d1
Mal d1
MV
1 Resista snížení množství (30 ul), 2 Resista (45 ul), 3 Rubín, 4 Mal d1 – standard, 5 Rubinstep, 6 Topaz, 7 Boskoopské (blot), 7 mol. váha (gel), 8 Golden delicius, 9 Jonagold (45 ul), 10 Jonagold (snížení množství 30 ul)
Obr. 1C: Vyšetření Western blot a SDS-PAGE elektroforéza jablečných šťáv – 3. část. Blot: Nejslabší alergen Mal d1 je u odrůdy Boskoopské, slabý proužek alergenu Mal d1 je dále u odrůdy Topaz. Silný je u odrůdy Resista a Rubinstep. Gel: Intenzita proužků odpovídá proužkům blotu
192
Alergie 3/2010
původní práce
Obr. 2: Grafické vyhodnocení peaků aktivních bílkovin – Western blot. Horní část obrázku: vysoce alergenní odrůda Resista, kontrolní Golden delicius. Dolní část: odrůdy s nízkým obsahem Mal d 1, Boskoopské, Topaz, Jonagold.
vykazovala odrůda Boskoopské. V testu aktivace bazofilů vysoce reagovaly odrůdy Resista, Chodské a Rubín a dále odrůdy Hetlina, Gala, Gloster. Velmi nízké hodnoty vykazovaly odrůdy Jonagold, Topaz, Florina a Angold. Naše nálezy jsou převážně ve shodě s literárními údaji. V Nizozemsku doporučovaná a nově rozšířená odrůda Santana nebyla námi studována. Potvrdili jsme ale sníženou alergenicitu odrůdy Topaz, která v práci holandských autorů byla také zařazena mezi odrůdy s nízkou alergenicitou (1,11). Je zajímavé, že Golden delicius, o kterém jsou údaje, že obsahuje nejvíce alergenu Mal d1, nebyl z tohoto hlediska v naší studii na předním místě. Odrůdy, které jsme v naší práci hodnotili jako odrůdy se zvýšenou alergenicitou (Hetlina, Resista, Panenské české), nebyly do evropských studií zařazeny. Mimo odrůdu Topaz se pro podmínky České republiky jeví jako perspektivní
Alergie 3/2010
odrůdy Boskoopské, Florina a Angold, které také vykazovaly sníženou alergenicitu. Identifikace kultivarů jablek se sníženou alergenicitou může přispět ke zlepšení kvality života pacientů přecitlivělých na pyl břízy, kteří mají současně alergické projevy na jablko ve smyslu orálního alergického syndromu. Vzhledem k tomu, že alergie na ovoce spojená s přecitlivělostí na Bet v 1 probíhá většinou mírně, někteří z pacientů pokračují v příjmu syrových jablek a vystavují se tak riziku zhoršení své alergie. Většina pacientů se ale vyhýbá příjmu syrových jablek, a tím se snižuje příjem důležitých vitamínů, minerálů a vlákniny. Znalost odrůd s nízkým obsahem Mal d1 představuje jednu z možností, jak bezpečně znovu zařadit syrová jablka do jídelníčku těchto pacientů. Tento postup je ale vhodný pouze pro oblasti střední a severní Evropy, kde je alergická reakce
193
původní práce Alergen Mal d1
Graf 3: Obsah alergenu Mal d1 ve vzorcích jablečné šťávy (45 ul) u sledovaných 17 kultivarů jablek, hodnocení metodou Western blot
na syrová jablka spojena se senzibilizací na hlavní alergen břízy Bet v1.
Závěr V práci bylo prokázáno, že různé jablečné odrůdy obsahují rozdílné množství alergenu Mal d 1. Výsledky se částečně lišily podle použité metody. Nejvyšší obsah alergenu byl prokázán u odrůdy Hetlina, a to všemi metodami. Dále lze v našich podmínkách zařadit mezi vysoce alergenní odrůdu Resista, zvýšenou alergenicitu vykazovaly i odrůdy Panenské české a Chodské. Nejpříznivější nález, tedy nejnižší obsah proteinu odpovídajícího alergenu Mal d1, vykazovaly odrůdy Boskoopské, Florina, Topaz a Angold. Výzkumný projekt bude pokračovat v následujících letech, plánujeme rozšíření souboru pacientů i rozšíření počtu hodnocených jablečných kultivarů. Práce byla podpořena výzkumným projektem NAZV, Min. zemědělství, QH 92220. LITERATURA 1. Bolhaar STHP, van de Weg EW, van Ree R et al. In vivo assessment with prick-to-prick testing and double-blind, placebocontrolled food challenge of allergenicity of apple cultivars. J Allergy Clin Immunol. 2005;116: 1080-1086. 2. Cudowska B, Kaczmarski M, Reagani P: Immunoblotting in the diagnosis of cross-reactivity in children allergic to biích. Rocz Akad Med Bialymst. 2005; 50: 268-273. 3. CS patent 292686 z 17.12.2003: Způsob měření aktivace basofilů po stimulaci alergenem pro stanovení přecitlivělosti na tento alergen a příslušný kit. Patentový spis, Věstník č.8; 2007. 4. De Weck AL, Sanz ML, Gamboa PM et al. Diagnostic Tests Based on Human Basophils: More Potentials and Perspectives than Pitfalls. Int Arch Allergy Immunol.2008; 146: 177-189. 5. Fernández-Rivas M, Bolhaar S, González-Mancebo E et al. Apple allergy across Europe: How allergen sensitization profiles determine the clinical expression of allergies to plant foods. J Allergy Clin Immunol. 2006; 118: 481-488.
194
6. Ferrer A, Cannes J, Gallego T et al: Characterization and improvement of apple extracts for diagnosis of apple IgE- mediated allergy. Ann Allergy Asthma Immunol. 2005; 95: 462-465. 7. Gaos Z, van de Weg EW, Matos CI et al. Assessment of allelic diversity in intron-containing Mal d 1 genes and their association to apple allergenicity. BMC Plant Biol. 2008; 8: 116-128. 8. Herndl A, Marzban G, Kolarich D et al: Mapping of Malus domestica allergens by 2-D electrophoresis and IgE-reactivity. Electrophoresis. 2007; 28: 437-448. 9. Holm J, Beartzen G, Gajhede M et al. Molecular basis of allergic Gross-reactivity between group 1 major allergen from birch and apple. J Chromatogr B. 2001; 756: 307-313. 10. Houška M. Inaktivace alergenů v potravinách pomocí vysokotlaké pasterace. Výzkumná zpráva. 2009. Národní program výzkumu II, MŠMT č. 2B06139. 11. Kootstra HS, Vlieg-Boerstra BJ, Dubios AEJ. Assessment of the reduced allergenic properties of the Santana apple. Ann Allergy Astma Immuno. 2007; 99: 522-525. 12. Skamstrup Hansen K, Vestergaard H et al. Double-blind, placebo-controlled food challenge with apple. Allergy. 2001; 56: 109-117. 13. Son DY, Scheurer S, Hoffmann A et al. Pollen-related food allergen; cloning and immunological analysis of isoforms and mutants of Mal d1, the major apple allergen, and Bet v 1, the major pollen allergen. Eur J Nutr. 1999; 38:201-215. 14. Šetinová I, Havranová M, Daňková E et al. Diagnostické možnosti alergie na jablko a mrkev u pacientů s projevy orálního alergického syndromu. Alergie. 2007; 9: 307-311. 15. Šetinová I, Trnková B, Honzová S et al. The influence of oxidative and polymerisation processes of apple juice on allergenicity of protein Mal d1 in apple juice. XXVIII Congress of EAACI Warsaw, Poland, June 6-10, 2009. 16. Vieths S, Janek K, Aulepp H, Petersen A. Isolation and characterization of the 18-kDa major apple allergen and comparison with the major birch pollen allergen (Bet v 1). Allergy. 2007; 50: 421-430.
prim. MUDr. Stanislava Honzová, CSc. Imunologické centrum, Imumed s.r.o. Mlynářská 4 110 00 Praha 1 e-mail:
[email protected] Alergie 3/2010
