Vliv vysokého tlaku na snížení alergenicity proteinů rmal d1 a rdau c1 a orientační kvantifikace jejich obsahu v jablku Golden Delicious a mrkvi

původní práce

Vliv vysokého tlaku na snížení alergenicity proteinů rMal d1 a rDau c1 a orientační kvantifikace jejich obsahu v jablku Golden Delicious a mrkvi Influence of the high pressure on reduction of allergenicity of proteins rMal d1, rDau c1 and orientation quantification of their contents in apple Golden Delicious and in carrot IVANA ŠETINOVÁ1, STANISLAVA HONZOVÁ1, ANABELA KVÁČOVÁ1, BARBORA TRNKOVÁ1, MARTINA HEROLDOVÁ2, HELENA VÁVROVÁ2, PETR KUČERA2, MILAN HOUŠKA3, MILENA KMÍNKOVÁ3, DANA GABROVSKÁ3, JAN STROHALM3, I. PAULÍČKOVÁ3, ONDŘEJ JULÍNEK4, MARIE URBANOVÁ4

1

2

Imumed, Imunologické centrum, Synlab. cz s. r. o. Praha Oddělení alergologie a klinické imunologie, FN Královské Vinohrady a 3. LF UK Praha 3 Výzkumný ústav potravinářský, Praha 4 VŠCHT, Praha

SOUHRN Cílem práce bylo ověřit hypotézu o vlivu tlaku, doby ošetření a teploty na snížení nebo odstranění alergenních účinků proteinů rMal d1, rDau c1. Alergeny rMal d1 a rDau c1 byly ošetřeny vysokým tlakem 400, 450, 500, 550 MPa při vybrané konstantní teplotě 25 °C s výdrží tlaku 3 min. a 10 min. a poté konstantním tlakem 500 MPa po dobu 10 min. při teplotách 30, 40 a 50 °C. Test aktivace basofilů (BAT) byl proveden u 20 břízových alergiků s projevy orálního alergického syndromu po jablku a mrkvi a zároveň s laboratorně prokázanou senzibilizací na alergeny rBet v 1, rMal d1 a rDau c1. Metodou Western blot bylo zjišťováno, zda reaguje sérum senzibilizovaných pacientů s ošetřenými alergeny rMal d1 a rDau c1 tlakem 500 MPa s výdrží 10 min při teplotách 30, 40 a 50 °C. Změny struktury rMal d1 a rDau c1 vlivem tlakování byly zjišťovány metodou cirkulárního dichroismu na spektropolarimetru J-810 (Jasco, Japonsko). Vliv vysokého tlaku a vliv mírné teploty na snížení alergenicity proteinů rMal d1 a rDau c1 se nepodařilo v in vitro testech prokázat. Vlivem vysokého tlaku došlo u rMal d1 ke spektrálním změnám se zvyšováním β-helikálních struktur, které však neměly vliv na jeho reaktivitu v in vitro testech. Byl proveden pokus o kvantifikaci obsahu těchto proteinů v jablcích a mrkvi. Klíčová slova: alergeny rMal d1, rDau c1, vysoký tlak, alergenicita

SUMMARY The aim of study was to verify the hypothesis of impact of the high pressure, time and moderate temperature on the reduction of allergenicity of proteins rMal d1 and rDau c1. Recombinant allergens rMal d1 and rDau c1 were treated by high pressures 400, 450, 500, 550 MPa held for 3 and 10 minutes at constant temperature of 25 °C and by the constant pressure of 500 MPa for 10 minutes at temperatures 30, 40 and 50°C. The basophile activation test was performed using cells from 20 birch allergic patients with oral allergy syndrome to apple and to carrot who have sensitisation to Bet v 1, Mal d 1 and Dau c1. The reactivity of the serum from sensitized patients with treated allergens rMal d1 and rDau c1 at pressure 500MPa for 10 minutes at 30–50°C was verified by Western blot. The modification of structures rMal d1 and rDau c1 by high pressure was determined by circular dichroism (spectropolarimetr J-810). We did not confirm the influence of high pressure and moderate temperature on allergenicity of rMal d1 and rDau c1 proteins in vitro. The high pressure of 500 MPa showed major spectral changes in protein rMal d1 without the reduction of its in vitro reactivity. We have attempted to quantify the content of these proteins in apples and carrot. Key words: allergens rMal d1, rDau c1, high pressure, allergenicity

102

Alergie 2/2009

původní práce Úvod K velmi častým inhalačním alergenům v oblasti severní a střední Evropy patří pyly břízy. V posledních letech stoupá počet pacientů se zkříženou potravinovou alergií vlivem homologie mezi alergeny pylu břízy a potravinami rostlinného původu. Jablko patří k nejčastěji konsumovanému a nejrozšířenějšímu ovoci v těchto oblastech. Jeho hlavní alergen Mal d1 je velmi často zodpovědný díky své homologii s hlavním alergenem břízy Bet v1 za alergické projevy u břízových alergiků (5,8). Přibližně 25 % pacientů s potravinovou alergií ve střední Evropě trpí projevy orálního alergického syndromu po požití mrkve. Tyto obtíže nejčastěji vyvolává hlavní alergen mrkve Dau c1 (2). Proto je snaha o přípravu potravin dobře snášených a současně minimálně zpracovaných. Do popředí pozornosti se dostávají technologie, které by vedly ke snížení alergenicity těchto potravin. V literatuře se objevují údaje o možnosti snižování alergenicity potravin, obsahujících alergeny homologní s hlavním alergenem pylu břízy Bet v1, ošetřením vysokým tlakem (7,11,12). Toto ošetření je relativně novou technologií v potravinářském průmyslu a dává naději k využití této metody pro výrobu potravin s charakterem vysloveně čerstvých produktů bez tepelného zpracování. Tímto způsobem ošetřené potraviny by měly charakter hypoalergenní a zároveň by zůstal zachován obsah vitaminů (11). Cílem naší práce bylo ověřit publikovanou a zatím neověřenou hypotézu, zda působení vysokého tlaku, doby ošetření a teploty má vliv na snížení nebo odstranění alergenních účinků proteinů rMal d1, rDau c1. Dalším cílem bylo pokusit se orientačně kvantifikovat obsah alergenu Mal d1 v jablečném extraktu a alergenu Dau c1 v mrkvovém extraktu. Byla použita semikvantitativní ELFO metoda (SDS-PAGE). Touto metodou byl stanoven obsah alergenu v jablcích odrůdy Golden delicious od různých pěstitelů. Dále byl stanoven obsah alergenu Dau c1 v mrkvi odrůda Maxima F1. Obsah alergenu Dau c 1 byl zjišťován u mrkve v závislosti na způsobu zpracování.

Metodika Metoda analýzy obsahu Mal d1 a Dau c1 v jablečném a mrkvovém homogenátu Pro elektroforetické dělení jablečných a mrkvových proteinů o různých molekulových hmotnostech byla použita SDS elektroforéza na polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE). Aniontový detergent dodecylsíran sodný (SDS) se váže na povrch proteinů, čímž je denaturuje a proteiny získávají podobný tvar a hustotu náboje. SDS se váže na bílkovinný řetězec v poměru 1,4 g SDS na 1 g bílkoviny, přičemž délka komplexu SDS-bílkovina je úměrná jeho molekulové hmotnosti. Na základě srovnání relativních mobilit neznámé bílkoviny a standardů je možné určit její relativní molekulovou hmotnost. Přidáním merkaptoethanolu ke vzorku bílkovin dochází k redukci disulfidické vazby spojující jednotlivé polypeptidové řetězce molekuly bílkovin a je možno tak stanovit jejich molekulovou hmotnost. Detekce separo-

Alergie 2/2009

vaných bílkovin byla provedena barvením Coomassie Brilliant Blue. Materiál pro přípravu roztoků rMal d1, rDau c1 Lahvičky rekombinantního alergenu rMal d1.8 a rDau c1 v lyofilizovaném stavu v množství 1 mg byly dodány firmou Biomay. Do nádobky s 2 mg lyofilisovaného alergenu byl přidán pufr na konečný objem 10 ml, získané množství bylo rozplněno do mikro-zkumavek o objemu 1,6 ml. Takto bylo připraveno 9 zkumavek po 1 ml vzorku rMal d1 a rDau c1 pro studium struktury metodou cirkulárního dichroismu (CD spekter), pro laboratorní test aktivace bazofilů a metodu Western blot. Vzorky byly skladovány při -30 °C a před použitím šetrně rozmraženy v chladničce při teplotě do 5 °C. Tlakování roztoků alergenů Vzorky roztoků alergenů byly vyjmuty z mrazicího boxu, do víčka nádobky byl propíchnut otvor 0,6 mm, pod víčko vložena pryžová membrána a nádobka uzavřena (plastová mikro-zkumavka nádobka o objemu 1,6 ml s víčkem). Pak byly vzorky vloženy do PA/PE sáčků, ty naplněny vodou, uzavřeny a temperovány na teplotu 10 °C po dobu 30 minut. K ošetření byl použit isostatický lis Žďas CYX 6/0103 o objemu komory 2 litry. K testování byly připraveny vzorky ošetřené tlakem 400 MPa s výdrží tlaku 3 minuty a 10 minut (400/3, 400/10, 450/3, 450/10, 500/3, 500/10, 550/3 a 550/10) a rovněž vzorek neošetřený (značen 000/0). Tlakovým médiem byla pitná voda o teplotě 10 °C. Před každým tlakováním byla provedena výměna vody v komoře. Teplota komory se pohybovala od 16,5° do 17,6 °C. Kompresní ohřátí těchto vzorků lze odhadnout na 3 °C/100 MPa, což znamená, že se teplota vzorků po stlačení pohybovala v závislosti na konečném tlaku v rozmezí cca 22 až 26,5 °C. Po ošetření byly vzorky okamžitě uloženy v chladničce o teplotě cca 5 °C. Po ukončení tlakování všech vzorků byly sáčky otevřeny, vylita voda a sáčky opět uzavřeny a umístěny zpět do chladničky. V chlazeném stavu byly tentýž den převezeny do laboratoří na stanovení CD spekter a k testování aktivace bazofilů. Pro tento test byly vzorky uchovány v mraženém stavu do použití v testu. Dále byl zvolen režim tlakování 500 MPa s dobou výdrže 10 minut. Doba náběhu na tlak byla 60 sekund, doba dekomprese cca 4 sekundy. Byla použita metoda temperace na cílovou teplotu. Komora byla předem temperována na cílové teploty, které měly být dosaženy u vzorků při výdrži tlaku. Výchozí teploty vzorků byly voleny tak, aby ohřátím vlivem stlačení bylo právě dosaženo cílové teploty. Pak je teplota komory i teplota tlakovací vody i vzorku v rovnováze a nedochází tudíž ke změnám teploty při výdrži na tlaku. Byly zvoleny teploty 30, 40 a 50 °C. Označení vzorků bylo 5010-30, 5010-40 a 5010-50. Byl rovněž připraven vzorek tlakem neošetřený, označený 0000-00. Test aktivace bazofilů Vliv ošetření rekombinantních alergenů vysokým tlakem na schopnost alergenů aktivovat bazofilní leukocyty

103

původní práce senzibilizovaných pacientů byl zjišťován testem aktivace bazofilů (BAT). Měření bylo prováděno na průtokovém cytometru FC 500 (Beckman-Coulter). Jako pozitivní výsledek byla považována aktivace více než 15 % bazofilů (> 15% CD203+CD63+). BAT byl proveden u 20 břízových alergiků s projevy OAS na jablko a mrkev s laboratorně prokázanou senzibilizací na hlavní alergeny rBet v 1, rMal d1 a rDau c1. Bazofily byly stimulovány rekombinantními alergeny rMal d1, rDau c1 (10 μl 0,01 mg/ml, Biomay) ve vodném roztoku a se všemi tlakem ošetřenými vzorky vždy ve dvou ředěních.

Statistika Pro statistické zpracování byl použit Wilcoxonův neparametrický test, hodnota p menší než 0,05 byla považována za statisticky významnou. Ověření snížení alergenicity metodou Western blot Metoda Western blot byla použita k průkazu, zda reaguje sérum prokazatelně citlivých pacientů s roztoky alergenu ošetřenými tlakem 500 MPa s výdrží 10 minut tlakované při teplotách 30°, 40° a 50 °C. Pro imunoreakce byla použita séra senzibilizovaných pacientů na alergen Mal d1 a Dau c1. Protilátky antihuman IgE in goat, antigoat IgG – biotin in rabbit, konjugát streptavidin-peroxidasa, substrát peroxid s TMB a chemikálie pro elektroforézu byla získána od firmy Sigma-Aldrich. Vliv záhřevu a tlaku na alergen Mal d1 a Dau c1 byl sledován na rekombinantních standardech těchto alergenů. Ověření vlivu vysokého tlaku na změnu struktury rMal d1, rDau c1 Změny struktury alergenů vlivem tlakování byly ověřovány metodou cirkulárního dichroismu. Měření spekter elektronového cirkulárního dichroismu (ECD) bylo prováděno na spektropolarimetru J-810 (Jasco, Japonsko). K proplachování přístroje byl použit tlakový dusík o čistotě 4.0. Při měření byla kyveta chlazena pomocí Peltiérova článku, jehož funkce byla ovládána řídicí jednotkou PTC-423S (Jasco, Japonsko). Jako řídicí i informační teplotní senzor byl zvolen interní senzor zabudovaný v plášti kyvetového držáku. Odvod tepla produkovaného Peltiérovým článkem byl zajišťován chladícím vodním cirkulačním systémem CTFF 06 (Labio). Všechna měření byla prováděna v křemenné kyvetě o tloušťce optického prostředí 1 mm. Zpracování spekter Absorpční spektra jsou vyjádřena jako závislost hodnoty absorbance na vlnové délce, CD spektra jsou vyjádřena v hodnotách elipticity (jednotky mdeg). U všech absorpčních a CD spekter vzorků alergenů byla provedena korekce základní linie odečtením spektra fosfátového pufru. Pro určování přibližného zastoupení jednotlivých sekundárních struktur v molekule proteinu byla spektra dále upravena: CD spektra alergenů v jednotkách elipticity byla po odečtení základní linie převedena na jednotky molární elipticity [deg.cm2.dmol-1]. Molární koncentra-

104

ce aminokyselinových zbytků v peptidu byla počítána z údaje o navážce alergenu dodané zadavatelem (1 mg do 10 ml) při použití průměrné molekulové hmotnosti peptidického zbytku 110 g.mol-1. Tento způsob určení koncentrace je zatížen nejistotou určení hmotnosti a objemu a též použitím přibližné hodnoty molekulové hmotnosti peptidového zbytku. Jablka a mrkev Ke studiu obsahu Mal d1 byla zakoupena jablka odrůdy Golden delicious ze sklizně roku 2007 od různých pěstitelů v ČR. Dále byl stanoven obsah alergenu Dau c1 v mrkvi. Jednalo se o čerstvou neskladovanou mrkev, odrůda MAXIMA F1 – hybridní, země původu ČR (Troubky).

Výsledky a diskuse Výsledky analýzy obsahu Mal d 1 v jablečném homogenátu. Tab. 1.1: Obsah proteinu Mal d 1 v jablkách Golden delicious v závislosti na lokalitě (metoda SDS PAGE) Lokalita

Obsah Mal d1 (mg/100 ml šťávy)

Libčice

10,82

Libčany

11,55

Tísmice

10,08

Jirkov

11,99

Klatovy

11,23

Těnovice

10,37

Litoměřice

10,79

V. Bílovice

12,08

Semikvantitivní metodou SDS-PAGE byl nejvyšší obsah proteinu Mal d1 zjištěn u jablečných šťáv z jablek vypěstovaných ve Velkých Bílovicích, naopak nejnižší obsah byl analyzován u šťáv z jablek z lokality Tísmice. Obsah proteinu Mal d1 v jablečných šťávách odrůdy Golden delicious klesal sestupně v řadě podle lokalit pěstování: Velké Bílovice > Jirkov > Libčany > Klatovy >Libčice > Litoměřice >Těnovice > Tismice, viz. Tab. 1.1. Je zřejmé, že mezi lokalitami nejsou významné rozdíly. Vzhledem k použité semikvatitativní metodě nelze učinit žádné závěry. Semikvantitativní metodou SDS-PAGE byl stanoven obsah proteinu Dau c1 v mrkvové šťávě v závislosti na způsobu zpracování. Výsledky analýzy jsou uvedeny v Tab. 1.2. Nejvyšší obsah proteinu Dau c1 byl zjištěn v mrkvové šťávě neošetřené. Ošetřením vysokým hydrostatickým tlakem došlo k poklesu o 58 % původního obsahu proteinu Dau c1. Vařením mrkvové šťávy se snížil obsah výše zmiňovaného proteinu o 66 %.

Alergie 2/2009

původní práce Tab. 1.2: Obsah proteinu Dau c1 v mrkvové šťávě odrůdy MAXIMA F1 Způsob zpracování mrkvové šťávy

Obsah Dau c1 (mg/100 ml šťávy)

% 60 antiͲIgE

50

rMald10neƎ rMald10Ͳ10xƎ

40

neošetřená

22,6

rMald1500/10Ͳ30°neƎ 30

ošetřená vysokým hydrostatickým tlakem

rMald1500/10Ͳ30°10xƎ

9,5

rMald1500/10Ͳ40°neƎ 20

ošetřená varem

rMald1500/10Ͳ40°10xƎ

7,7

rMald1500/10Ͳ50°neƎ

10

rMald1500/10Ͳ50°10xƎ 0

Vzhledem k tomu, že tato měření jsou založena na analyzování vzorků pouze z jednoho pokusu, nelze dělat jednoznačné závěry. Dále je nutno brát v úvahu, že výsledky byly získány semikvantitativně a ne kvantitativně. Výsledky testu aktivace bazofilů Graficky znázorněné výsledky testu aktivace bazofilů pro roztoky rMal d1, rDau c1 tlakované při 500 MPa po dobu 10 minut a při různých teplotách jsou uvedeny v grafu 1–6. Jsou zde výsledky pro neředěné vzorky (5000 ng/ml) a vzorky ředěné (500 ng/ml). Z výsledků je patrné, že vlivem vysokého tlaku a vlivem teploty při výdrži na tlaku nedošlo ke snížení aktivace bazofilů. Nepodařilo se prokázat statisticky významné snížení laboratorní senzibilizace v testu aktivace bazofilů s ošetřenými tlakovanými rekombinantními alergeny rMal d1, rDau c1 ve srovnání s neošetřenými alergeny (p < 0,05).

% 50 antiͲIgE

40

rMald1000Ͳ0

rMald1400Ͳ10

30

antiͲIgE

70

rDauc1000Ͳ0

60

rDauc1400Ͳ3

50

rDauc1400Ͳ10

40

rDauc1450Ͳ3

30

rDauc1450Ͳ10 rDauc1500Ͳ3

20

rDauc1550Ͳ3

10

rDauc1550Ͳ10

0

TlakovanéroztokyrDauc1

Graf 4: Výsledky testu aktivace bazofilů s tlakovaným rDau c 1 400–550MPa/ 3 a 10 min. neředěná forma: 5000ng/ml.

antiͲIgE

50

rDauc1000Ͳ0 rDauc1400Ͳ3

40

rDauc1400Ͳ10

rMald1450Ͳ3

25

rMald1450Ͳ10

20

rMald1500Ͳ3

15

rMald1500Ͳ10

10

rMald1550Ͳ3

5

rDauc1450Ͳ3

30

rDauc1450Ͳ10

20

rDauc1500Ͳ3 rDauc1550Ͳ3

10

rDauc1550Ͳ10

rMald1550Ͳ10 0

TlakovanéroztokyrMald1

Graf 1: Výsledky testu aktivace bazofilů s tlakovaným rMal d 1 400–550 MPa/ 3 a 10 min. neředěná forma: 5000 ng/ml.

TlakovanéroztokyrDauc1

Graf 5: Výsledky testu aktivace bazofilů s tlakovaným rDau c 1 400–550 MPa/ 3 a 10 min. ředěná forma: 500 ng/ml.

% 50

% 50 antiͲIgE

45

rMald1000Ͳ0

40

rMald1400Ͳ3

35

rMald1400Ͳ10

30

rMald1450Ͳ3

25

rMald1450Ͳ10

20 15 10 5

antiͲIgE

45 40

rDauc10neƎ

35

rDauc10Ǝ

30

rDauc1500/10Ͳ30°neƎ

25

rDauc1500/10Ͳ30° Ǝ

20

rDauc1500/10Ͳ40°neƎ

15

rMald1500Ͳ3

rDauc1500/10Ͳ40° Ǝ

10

rMald1500Ͳ10

rDauc1500/10Ͳ50°neƎ

5

rMald1550Ͳ3

0

rMald1550Ͳ10

rDauc1500/10Ͳ50° Ǝ

TlakovanéroztokyrDauc1neƎedĢnéavƎedĢní10x

TlakovanéroztokyrMald1

Graf 2: Výsledky testu aktivace bazofilů s tlakovaným rMal d 1 400–550MPa/3 a 10 min. ředěná forma: 500 ng/ml.

Alergie 2/2009

% 80

rMald1400Ͳ3

35

0

Graf 3: Výsledky testu aktivace bazofilů s tlakovaným rMal d 1 500 MPa/10min. při 30°–50 °C neředěná a ředěná forma: 5000ng/ ml a 500 ng/ml.

% 60

45

0

tlakovanéroztokyrMald1

Graf 6: Výsledky testu aktivace bazofilů s tlakovaným rDau c 1 500MPa/10min./30°–50 °C neředěná a ředěná forma: 5000 ng/ml a 500 ng/ml.

105

původní práce Výsledky metody Western blot Z výsledků tohoto testu vybíráme především výsledky, týkající se vlivu teploty vzorku při tlakování. V obr. 1 jsou uvedeny výsledky hodnocení pro rMal d1. Všechny vzorky rMal d1 ošetřené tlakem při různé teplotě při výdrži tlaku mají pás v oblasti molekulové hmotnosti Mal d1 (18 kDa). U vzorku 5, zahřátého na nejvyšší použitou

teplotu 50 °C, se objevují dva pásy v oblastech molekulové váhy Mal d1. Tlak 500 MPa a teplota 30°, 40° nebo 50 °C neodstranily reaktivitu rMal d1. Naopak, vyšší teplota 50 °C měla za následek zvýraznění alergenu tak, že se ukazuje ještě jeden proužek. V gelu, vyvolaném stříbrem, není viditelný žádný rozdíl mezi vzorky vzájemně (2–5) ani mezi nimi a kontrolou (1).

Blot

5

4

3

Gel

2

1

1

2

3

4

5

1 – kontrola rMal d1 kontrola rMal ad1tlakování (24) 21–– bez záhĜevu 2 – bez záhřevu (24) (18) 3 – 500 MPa, 10a tlakování minut, 30°C 500 MPa, 10 minut, 30 °C (18) 43–– 500 MPa, 10 minut 40°C (19) 4 – 500 MPa, 10 minut, 40 °C (19) 5 – 500 MPa, 10 minut 50°C (20) 5 – 500 MPa, 10 minut, 50 °C (20)

Obr. 1: Western blot – vliv konstantního vysokého tlaku a různé teploty na alergen rMal d1.

V obr. 2 jsou uvedeny výsledky hodnocení pro rDau c1. Nejsilnější proužek je v neošetřeném vzorku v pozici 3. Nejslabší se zdá, že je v pozici 5 při 40 °C. Ve vzorku v pozici 6 při 50 °C se už vytvářejí další proužky, které se nacházejí pod Dau c1, jsou ale vidět jen málo zřetelně. Můžeme tedy vyvodit závěr, že při těchto podmínkách byl o něco lepší účinek teploty 40 °C při konstantním tlaku 500 MPa na čistý alergen rDau c1. Ošetření roztoků rMal d1 a rDau c1 tlakem 500 MPa po dobu 10 minut v rozsahu teplot 30° až 50 °C nepřineslo významné snížení reakce při hodnocení metodou Western blot. Spektra cirkulárního dichroismu a absorpční spektra rMal d1 Spektra elektronového cirkulárního dichroismu (dále ECD) a absorpční spektra alergenu rMal d1 vykazují výrazné změny vlivem působení tlaku při době výdrže 10 minut, viz obr. 3 a 4. CD spektra jsou však znatelně zašuměná. Poskytnuté vzorky vykazují nízkou intenzitou CD signálu při poměrně vysoké hodnotě absorbance. Tvar CD spektra v oblasti pod 190 nm ukazuje, že vzorek je zřejmě kontaminován chirální nečistotou. Obecně lze říct, že u rMal d1 s rostoucí hodnotou tlaku a dobou ošetření vysokým tlakem klesá intenzita CD signálů aler-

106

2

3

4

5

6

2 – kontrola rDau c 1 – kontrola c1 3 –2bez záhĜevurDau a tlakování – bez záhřevu a tlakování 4 –3500 MPa, 10 minut, 30°C – 500 MPa, minut, 30 °C 5 –4500 MPa, 1010 minut 40°C 6 –5500 MPa, 1010 minut 50°C – 500 MPa, minut, 40 °C 6 – 500 MPa, 10 minut, 50 °C

Obr. 2: Western blot – vliv ošetření tlakem 500 MPa po dobu 10 minut za různých teplot na alergen rDau c1.

Alergie 2/2009

původní práce ECD spektra alergenu rMal d1 20

15

10

CD [mdeg]

000-0 400-10

5

450-10 500-10 550-10

0 185

195

205

215

225

235

245

255

-5

-10 vlnová délka [nm]

Obr. 3: ECD spektra tlakově ošetřených roztoků alergenu rMal d1 – desetiminutová série.

ABS spektra alergenu rMal d1

0,7

000-0

0,6

400-10 450-10 0,5

500-10 550-10

Abs

0,4

0,3

0,2

0,1

0 185

195

205

215

225

235

245

255

vlnová délka [nm ]

Obr. 4: Absorpční spektra tlakově ošetřených roztoků alergenu rMal d1 – desetiminutová série.

Alergie 2/2009

107

původní práce rMal d1

%E

50 45 40

46

42

35

43

32

30

32

25

26

20 15

31

28

24

25

10 5 0

10 min min. 10

000 MPa

400 MPa

450 MPa

33 min min. 500 MPa

550 MPa

Obr. 5.1: Zastoupení β-struktury v tlakově ošetřených vzorcích alergenu rMal d1.

rMal d1

%D

30 25 26 20 15

25 23

25

17 20

17

10 9

5

9

6 0 000 MPa

10min. min 10 400 MPa

450 MPa

3 min

500 MPa

3 min.

550 MPa

Obr. 5.2: Zastoupení α-struktury v tlakově ošetřených vzorcích alergenu rMal d1.

genu jak v záporném maximu u 216 nm, tak v kladném maximu u 190 nm. Spektra ECD a absorpční spektra alergenu rMal d1, který byl vystavený tlaku 500 MPa po dobu 10 min. při teplotách 30, 40 a 50 °C, spolu se spektrem kontrolního vzorku alergenu, který nebyl vysokému tlaku vystaven, jsou uvedena na obr. 6. Je patrné, že aplikováním tlaku

108

500 MPa na vzorek dochází oproti kontrolnímu vzorku k výrazné změně absorpčního i CD spektra. Velké spektrální rozdíly je možné pozorovat i v rámci vzorků ošetřených vysokým tlakem při různých teplotách. Obecně je možné říct, že čím nižší je teplota při aplikaci vysokého tlaku na vzorek alergenu, tím větší spektrální změny jsou pozorovány oproti kontrolnímu vzorku.

Alergie 2/2009

původní práce

Obr. 6: ECD spektra alergenu rMal d1, který byl vystavený tlaku 500 MPa po dobu 10 min. při teplotách 30, 40 a 50 °C, spolu se spektrem kontrolního vzorku alergenu, který nebyl vysokému tlaku vystaven.

Odhad zastoupení sekundárních struktur rMal d1 Zastoupení jednotlivých struktur bylo stanoveno prováděno programem Dicroprot metodou K2D (neuronová síť) (1). U alergenu rMal d1 dochází po ošetření nejnižším tlakem (400 MPa) k poklesu zastoupení β-struktury oproti neošetřenému standardu (obr. 5.1), zvyšováním tlaku pak dochází k růstu zastoupení β-struktury, a to pro obě časové série (3 min. a 10 min.). U vzorku vystaveného nejvyššímu použitému tlaku (550 MPa) dochází pro obě časové série opět k poklesu zastoupení β-struktury. Opačný trend je možné pozorovat při sledování zastoupení α-helikální struktury (obr. 5.2). Při ošetření vzorku nejnižším tlakem dochází k růstu zastoupení α-helikální struktury, zvyšováním tlaku pak klesá podíl této konformace s výjimkou nejvyššího tlaku, kdy je možné pozorovat mírný nárůst zastoupení α-helikální struktury. Při aplikaci vysokého tlaku 500 MPa a teploty 30–50 °C na alergen Mal d1 dochází ke snižování zastoupení α-helikální struktury v peptidu, zároveň dochází ke zvyšování zastoupení β-sheet struktury (obr. 7.1 a 7.2). Snižování zastoupení α-helikální struktury (a současné zvyšování zastoupení β-sheet struktury) v porovnání s neošetřeným srovnávacím vzorkem je tím vyšší, čím nižší je teplota při aplikaci vysokého tlaku. Největší změny v zastoupení jednotlivých konformací byly tak pozorovány u vzorku ošetře-

Alergie 2/2009

ného vysokým tlakem při teplotě 30 °C, naopak nejmenší změny byly pozorovány při aplikaci vysokého tlaku při teplotě 50 °C. Spektra cirkulárního dichroismu a absorpční spektra rDau c1 Změny CD a absorpčních spekter alergenu rDau c1 vyvolané působením tlaku jsou na hranici pozorovatelnosti (obr. 8). CD spektra jsou také znatelně zašuměná. Na obr. 10 jsou uvedena ECD spektra alergenu rDau c1, ošetřeného tlakem 500 MPa po dobu 10 minut při teplotách 30, 40 a 50 °C. Spektra vykazují jen minimální odlišnosti, projevující se postupným snižováním intenzity CD pásů u 193 a 216 nm v porovnání s neošetřeným srovnávacím vzorkem. Odhad zastoupení sekundárních struktur rDau c1 Zastoupení jednotlivých struktur bylo stanoveno programem Dicroprot metodou K2D (neuronová síť) (1). U alergenu rDau c1 je u tlakově ošetřených vzorků pozorovatelný mírný nárůst zastoupení β-struktury (obr. 9.1) při současném poklesu zastoupení α-helikální struktury (obr. 9.2) oproti neošetřenému srovnávacímu vzorku. V rámci jednotlivých tlakově ošetřených vzorků není pozorovatelná prakticky žádná změna sekundární struktury.

109

původní práce

10 min.

Obr. 7.1: Zastoupení β-struktury v tlakově ošetřených vzorcích alergenu rMal d1.

10 min.

Obr. 7.2: Zastoupení α-struktury v tlakově ošetřených vzorcích alergenu rMal d1.

Na obr. 11.1 a 11.2 jsou uvedeny vlivy teploty při tlakování. Po ošetření rDau c1 tlakem 500 MPa po dobu 10 minut při teplotách 30, 40 a 50 °C jsou pozorované změny velmi malé (v porovnání s neošetřeným rMal d1). Při působení tlaku dochází k mírné změně zastoupení α-helikální struktury. S rostoucí teplotou použitou při tlakovém ošetření klesá zastoupení α-helikální struktury v alergenu. S rostoucí teplotou zastoupení β-sheet struktury mírně roste.

Závěr Ošetření rMal d1 a rDau c1 tlakem v rozsahu 400 až 550 MPa s výdrží 3 až 10 minut nevedlo ke snížení labo-

110

ratorní senzibilizace v testu aktivace bazofilů u břízových alergiků s projevy OAS na jablko a mrkev. Vliv teploty v rozsahu 30–50 °C při výdrži tlaku 500 MPa po dobu 10 minut se v tomto testu rovněž nepodařilo prokázat. Ošetření tlakem 500 MPa po dobu 10 minut za teplot 30 až 50 °C při výdrži tlaku nepřineslo snížení reakce v testu Western blot u senzibilizovaných pacientů. U alergenu Mal d1 byly pozorovány po ošetření vzorku vysokým tlakem poměrně velké spektrální změny. Dochází k výrazné změně jak CD, tak absorpčních spekter vzorků, která je obecně tím větší, čím větší je aplikovaný tlak a doba působení vysokého tlaku. Po ošetření vzorku vysokým tlakem 500 MPa/10 min. při

Alergie 2/2009

původní práce

Obr. 8: ECD spektra tlakově ošetřených roztoků alergenu Dau c1 – desetiminutová série.

rDau c1 30 %E 25

27 24

20

27

28

24

27

27 26

27

26

15 10 5 0 000 MPa

10min. min 10 400 MPa

450 MPa

3 min

500 MPa

3 min.

550 MPa

Obr. 9.1: Zastoupení β-struktury v tlakově ošetřených vzorcích alergenu rDau c1.

Alergie 2/2009

111

původní práce rDau c1

%D

40 35 30

34

34 32 32

25

32 32

33

32

33 33

20 15 10 5 0 000 MPa

10 min 10 min. 400 MPa

450 MPa

500 MPa

3 min 3 min. 550 MPa

Obr. 9.2: Zastoupení α-struktury v tlakově ošetřených vzorcích alergenu rDau c1.

Obr. 10: ECD spektra alergenu rDau c1, který byl vystavený tlaku 500 MPa po dobu 10 min. při teplotách 30, 40 a 50 °C, spolu se spektrem kontrolního vzorku alergenu, který nebyl vysokému tlaku vystaven.

112

Alergie 2/2009

původní práce

10 min.

Obr. 11.1: Zastoupení β-struktury v tlakově ošetřených vzorcích alergenu rDau c 1.

10 min.

Obr. 11.2: Zastoupení α-struktury v tlakově ošetřených vzorcích alergenu rDau c 1.

teplotách 30, 40 a 50 °C dochází ke snižování zastoupení α-helikální struktury v peptidu, zároveň dochází ke zvyšování zastoupení β-sheet struktury. Největší změny byly pozorovány u vzorku ošetřeného vysokým tlakem při teplotě 30 °C, naopak nejmenší změny byly pozorovány při aplikaci vysokého tlaku při teplotě 50 °C. Tyto strukturální změny bez funkčního důsledku se pravděpodobně týkaly oblastí, kde nejsou koncentrovány imunodominantní epitopy. Změny CD a absorpčních spekter alergenu rDau c1 vyvolané působením tlaku jsou na hranici pozorovatelnosti. Zdá se, že ani výše tlaku ,doba působení a teplota 30–50 °C nevyvolá významné změny struktury. Na rozdíl od rMal d1 byly největší změny CD spekter, absorpčních

Alergie 2/2009

spekter a zastoupení jednotlivých sekundárních struktur pozorovány pro tlakovaný rDau c1 při nejvyšší použité teplotě 50 °C. Z našich výsledků je zřejmé, že se nám nepodařilo prokázat vliv vysokého tlaku, doby ošetření a mírné teploty na snížení nebo odstranění alergenních účinků proteinů rMal d1, rDau c1. Strukturální změny rMal d1 po ošetření tlakem nevedly ke změně jeho reaktivity v in vitro testech. Podpořeno v rámci výzkumného projektu MŠMT 2B06139 Inaktivace alergenů v potravinách pomocí vysokotlaké pasterizace.

113

původní práce LITERATURA 1. Andrade MA, Chacon P, Merelo JJ and Moran F. Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism spectra using an unsupervised learning neural network. Protein Engineering 1993;6:383-390. 2. Ballmer-Weber BK, Wangorsch A, Bohle B. Component – resolved in vitro diagnosis in carrot allergy: Does the use of recombinant carrot allergens improve the reliability of the diagnostic procedure? Clin Exp Allergy 2005;35: 970-978. 3. Cudowska B, Kaczmarski M, Restani P. Immunoblotting in diagnosis of cross-reactivity in children allergic to birch , Annales Academiae Medicae Bialostocensis 2005; 50:268-273. 4. Hebenstreit D, Ferreira F. Structural changes in calcium-binding allergens: use of circular dichroism to study binding characteristics. Allergy 2005;60:1208-1211. 5. Herndl A, Mrzban G, Kolarich D. Mapping of Malus domestica allergens by 2-D electrophoresis and IgE-reacitivity . Electrophoresis 2007;28:437-448. 6. Likeš J, Laga L. Základní statistické tabulky. SNTL Praha 1978; 60-61. 7. Masson P, Tonello C. Potential applications of High pressure in Pharmaceutical Science and Medicine, High Pressure Research 2000;19:223-231. 8. Montserrrat Fernandez-Rivas, Bolhaar S, Gonzales-Mancebo E. Apple allergy across Europe: How allergen senzitization profiles determine the clinical expression of allergies to plant foods. J Allergy clin immunol 2006 ;118(2):481-8.

114

9. Pelton JT, McLean LR. Spectroscopic methods for analysis of protein secondary structure, Analytic Biochemistry 2000;227:167-176. 10. Scheuer S. Improvement of the diagnosis of allergy by using purified allergens. Clin Exp Allergy 2006;36:1483-1486. 11. Scheibenzuber M. Molekulare und klinische Auswirkungen einer Hochdruckbehandlung von allergenen Lebensmitteln. Disertation 2002; Technischen Universitat München. 12. Suzuki A. High pressure – processed foods in Japan and the world. Trends in High Pressure Bioscience and Biotechnology 2002, Hayashi R, Elsevier Science B.V: 365-374. 13. Uehara M, SatoK, AbeY. Sequential IgE epitope analysis of a birch pollen allergen(Bet v 1) and an apple allergen Mal d 1, Allergology International 2001;50: 57-62. 14. Urbanova M, Malon P. Circular dichroism spectroscopy in Analytical methods in Supramolecular Chemistry (Ed.C.Schalley), Wiley-VCH, Weinheim, 2007; Chapter 8: 265-304.

MUDr. Ivana Šetinová Imumed s. r. o Mlynářská 4 110 00 Praha 1 e-mail: [email protected]

Alergie 2/2009